HU229672B1

HU229672B1 - Soluble lhrh antagonists, processes for their preparation and pharmaceutical compositions comprising thereof

Info

Publication number: HU229672B1
Application number: HU0200363A
Authority: HU
Inventors: Michael Bernd; Bernhard Dr Kutscher; Eckhard Guenther; Peter Romeis; Thomas Dr Reissmann; Thomas Beckers
Original assignee: Zentaris Gmbh
Priority date: 1999-03-17
Filing date: 2000-03-11
Publication date: 2014-04-28
Also published as: CZ20013318A3; ZA200107753B; US6627609B1; DE50007905D1; UA70997C2; NO20014486D0; MXPA01010052A; SI1268522T1; DE19911771A1; US20040266695A1; JP2002543045A; ATE277077T1; EP1163264A1; TWI243179B; US7148195B2; YU68702A; BG65283B1; DE19911771B4; CO5150192A1; WO2000055190A1

Description

Oldható LHRH*aniagonístáfc_s eljárás előállításukra, és sz ezeket tartalmazó gyógyszerkészítmények

A találmány tárgya, jobb oldhatósággal rendelkező LHRH-antagonisták, ezen vegyületek előállításának eljárásai, ezeket a vegyületeket tartalmazó gyógyszerek, valamint a gyógyszerek felhasználása hormonfűggö daganatok és hormonbefolyás alatt álló, nem-rosszindulatú betegségek, például jóindulatú prosztata hlpertrőfi a (BPH) és endometriözis, kezelésére.

A peptidek megnevezéséhez a lUPAC-íUB-Bízoftság Biokémiai Nómenklatúráját (European J. Bíocbem., 138: 9~37 (1984)) használjuk, miszerint, összhangban a szokásos ábrázolással, az aminoosoportok az N-végen, balra és a karboxíiosoportok a C-végen, jobbra állnak. A találmány szerinti peptid LHRHantagonlsták természetben előforduló és szintetikus aminosavakat tartalmaznak, melyek közül a legfontosabbak az Alá, Val, Leu, He, Ser, Thr, Lys, Arg, Asp, Asn, Glu, Gin, Cys, Met, Phe, Tyr, Pro, Trp és a His, Az egyes aminosavmaradékok rövidítései az aminosavak triviális nevéből származnak, így Ala-alanin, Gly-glicin, leu~leucín, LysMIzin, Pal(3)3-(3-pindH)-alanin, Nal(2}~ S-^-naftilj-aianín, Pbe-feníl-aíanin, Cpa~4-k!ór~feníl~aíanin, Pro-prolin, Ser-szerin, ?hr~treonin, Trp~triptofán, 7yr~tirozín és Saroszarkozin, Minden itt felsorolt aminosav, hacsak másként nem jelezzük, az L-sorozathoz tartozik, például a 0-Nal(2) a 3-(2~naftíl)~ D-alanln rövidítése és a Ser az L-szeriné. A lizin oldatláncának s-amlnocsoportján történő szubsztitúciót a Lys után álló zárójelbe tett jelöléssel jelezzük, adott esetben rövidítés formájában.

További felhasznált rövidítések:

Atz 3~amino~1 ,2_:4~tríazoi~S~karbönB

B 4-(4-amídino-fenil)-amino-1,4-dioxo-butH

Boa tercier-bufil-oxí-karbonií

Bop b enzo triazoF 1 ~ox:í~t r lsz( d 1 m etíl-am íno )~foszfó n ium-hexafl uo rfoszfát

DCC dioiklohexlí-karbodiimid

DCM diklór-metán

Ddz d imetoxi-f eníl-(di metií- m étiIén-oxí)-ksrboniI (dI m etoχí-díméti I ~Z)

QIC dilzopropií-karbodlímid öl P EÁ N, M~d íizoprop íl-etil-a m in

ÖMF dímelH-íormamid

Fmoc ftuorenil-metíl-oxí-karboníl

HF fluorsav (hidrogén-fluoríd)

HOBt 1 -hidroxi-benzo-tríazol

HPLC magasnyomásu-folyadékkromatográfia:

Me metil

TFA trifluor-eceisav

Z benzil-oxi-karboníl

A találmány szerinti peptídek analógiát mutatnak a Íuieinlzálö hormont felszabadító hormonnal (LHRH), és a kővetkező szerkezettel rendelkeznek:

p-GIU“HiS“Trp“Ser-Tyr-GÍy~Leu-Arg-Pro-Gly-NH₂, [LHRH, gonadorehnl.

Több mint 20 éven át folyt a kutatás az LHRH»dekapeptld szelektíven haté antagonistái után [M. Karten és d, E. Rivíer, Endocríne Reviews, 7: 44-66 (1986)}. Ezek az antagonísták a feléjük irányuló nagyfokú érdeklődést az endokrinológia, a

-megelőzés és a rákkezelés területén tanúsított hasznosságuknak köszönhetik. Vegyöietek nagy mennyiségét állították elő, mint lehetséges LHRH-antagonístát. Az eddig talált legérdekesebb vegyületek, azok, melyek szerkezete az LHRH szerkezetének módosított változatai.

A hatásos antagonisták első sorozatát aromás aminosavmaradékok 1., 2., 3. és 8. vagy 2., 3. és 6. helyre való bevitelével kapták. A vegyületek szokásos írásmódja a következő: először megadjuk azt az aminosavat mely az LHRH peptldláncában az eredetileg meglévő aminosav helyére lép, majd a felső indexbe tett számmal jelöljük a kicserélődés helyét. Továbbá, az utána írt „LHRH kifejezéssel azt jelöljük, hogy itt LHRH-anaíógről van szó, az LHRH molekulában csere [Ac-D-Cpa^5,2, D~Trp³'^e]LHRH íD. H. Coy és munkatársai, ln:Gross,E .és Melenhofer, J. (szerk.) „Peptides; Proceedings of the S^th American Peptíd Symposium”, 77S~779.oíd,_s Pierce Chem. Co.,Rockvílle (1979)1;

[Ac-Prot D-Cpa², D-Nal(2)^a,&jLHRH (US 4.419.347 számú szabadalom) és (Ac-ProT D~Cpa², D-Trp'^í'^s]LHRH [3. L.Píneda és munkatársai J. Clin. Endocrinok Metab., 56: 420 (1933)].

Az antagonisták hatásának erősítésére később bázíkus aminosavakat, például D-Arg-t vittek be 6. helyre. Például [Ac-D-Opa*·², D-TrpA D-ArgT DÁla¹⁰JLHRH (GRG-3Ö276) (D. H, Coy és munkatársai, Endocnnology, 100:1445 (1982)1; és [Ao-D~Ral(2)', D-Phe(4~F)t D-Trp³, D-Arg®]LHRH (ORF 18260) (J, E. Rivíer és munkatársai, ín: Vickery R.H., Nestor, JrJJ., Hafez, E.S.E. (szerk.) „LHRH and its analogs”, 11-22 old,, MTP Press, Lankaster, UK., 1984}.

További lehetséges LHRH-antagonístákat. írtak le a WO· 92/19651, WO 94/19370,

WO 92/17025, WO 94/14841, WO 94/13313, US-A 5,300,492, US~A 5,140,009,

EP 0 413 209 A1 és a DE 195 44 212 Al számú szabadalmi iratokban.

A legutoljára leírt vegyületek módosított ornítln vagy lizin építőelemet tartalmaznak a 8. helyen, és a következő általános képlettel rendelkeznek; Ac-D-INal(2)¹-D~Cpa²-D«Pal{3}³-Ser⁴-Tyr^s-D~Xxx^e-Leu⁷-Arg⁸~Pro⁸-D~Ala^w-NH_2í ahol D-Xxx jelentése (VI) általános képlete amlnosavcsoport.

További ismert LHRH-antagonisták az Antareííx, Ganírelix és Cetrorelix.

Antarehx:

Ac-D~Nal(2)'~D-Cpa^£~D~Pal(3)³’Ser⁴-Tyr⁵-D-Hci⁶-Leu⁷-Lys(íPr)^s-Pro^s~D-Ala¹⁰

Ganirelíx:

NH

Ao~D~Nal(2)^t~D-Cpa²D-Pal(3)³-Ser⁴-Tyr^s-D-hArg(Et)ALeu^?~hArg(Et)2^S-Pro⁹-D~

Ala'ⁱ⁰~HH₂.

Cetrorelix:

Ac-D-Nal(2)¹~D-Cpa²-D-Pa1(3)³-Ser⁴~Tyr⁵~D~Cíf^e-Leo⁷~Arg⁸-Pro^s~D-Ala^w-NH₂.

A találmány célja olyan új LHRH-antagonlsták előállítása, melyek nagyobt enzímatikus stabilitással rendelkeznek, és szignifikánsan jobb vízoldhatőságof mu tatnak.

Ezt a célt szolgálják az

Α-Χχχ'~Χχχ²-Χχχ³-Χχχ⁴~Χχχ^δ~Χχχ^δ~Χχχ⁷-Χχχ^δ~Χχχ⁹~Χχχ^1δ~ΝΗ2 (I) általános képletű - ahol

A jelentése acetil- vagy 3-(4-0οοΓ-Ιοηϋ)~ρΓορίοηΙΙ~οδοροΗ;

Xxx; jelentése D-Nal(1} vagy D-Nal(2);

Xxx²~Xxx^s jelentése D-Cpa~D~Pal(3) vagy egy egyszeres kötés;

Xxx⁴ jelentése Ser;

Xx:x^J	jelentése N-Me-Tyr
Xxx®	D~Hci
Xxx^z	jelentése Nle;
Xxx⁸	jelentése Arg vagy
Xxx⁹	jelentése Pro; és
Xxx¹⁰	jelentése Alá vagy

- vegyületek, valamint ezek gyógyszerészetHeg elfogadható sói, különösen az acetatok, embonátok és trífluor-acetátok.

További különösen előnyös találmány szerinti vegyületek: Ac~D~Nal(2')^í~D~Cpa^£-Ö-Pal(3)³-Ser⁴~N-Me-Tyr⁵DHci^e“Nle⁷»Arg^S“Pro⁸~DAla-⁰-NH_2:

Pc-D~Nal(2)’-ö--Cpa²-D-Pal(3)-Ser⁴-N“Me-Tyr^s~D-Hd^e~Nle⁷-Lys(iPr)^s~Pro⁸Sar^w-NH₂,

AC’D-Nal(2)¹-D-Cpa^a-D-Pal(3)³“Ser⁴-N-Me~Tyr⁵-D-Hci^&-Nle⁷~Arg⁸-Pro⁹~Sar^1ö~ valamint a fentiek gyégyszerészetiieg elfogadható savakkal képzett söl,

A találmány szerinti vegyületeket használhatjuk hormonfüggö daganatok, különösen prosztalakarcinóma vagy mellrák kezelésere, valamint nemrosszindulatú betegségeknél, melyek kezelése LHRH szupressziót igények Ehhez a vegyületet a szokásos hordozó- és segédanyagokhoz keverjük, és gyógyszerkészítményként alakítjuk ki.

Az (!) általános képletü vegyület előállítását végezhetjük a klasszikus fragmenskondenzácíőval, vagy a Merhfíeíd féle szllárdfázís-szintézíssei, ahol a peptid egymást követó lépésekből álló felépítésnél az oidslláncán már R^-COOH általános képletü karbonsavval acilezetí D-lizint használunk, vagy a dekapeptid

D-lizin⁶ oSdallancán a megfelelő karbonsavval amidkötést alakítunk kí. Ezek szerint az R^CO-csoportot az eljárás három különböző pontján vihetjük be: az egyes építőelemek pepiiddé való kondenzációja előtt; a lizín vagy ornitin peptidláncba építése után, de az ezt követő építőelemek bevitele előtt; vagy az összes építőelem kondenzációja után.

Áz (I) általános képletö vegyületet ismert módokon állítjuk Össze, például teljes mértékben a szHárdfázísáecbmkávaí, részleges szilárdíázís-techníkávaí (úgynevezett fragmenskondenzáciőval) vagy az oldatban végzett klasszikus őszszekapcsolással ffVL Bodanszky, „Pnncíples of peptíde synthesis, Springer

A szílárdfázis-szmiézJs módjait írja le például J.M, Stewart és XÖ.Young („Solid phase peptíde synthesls” ,Piarcé Chem. Company, Rockford, Ili. 1984), valamint G, Bárány és R.B. Merriieid („The peptldes”, 1. fejezet 1-285. old., Ácademic Press inc.,1979.). A klasszikus oldatszintézist a „Methoden dér Grganischen Chemíe (Houben-Weyl), Synthese von Pepiiden”, (szerk.: E. VVünsch, 1974, Georg Thíeme Verlag, Stuttgart, NSzK) kézikönyv írja le.

A lépésenként! felépítést például úgy végezzük, hogy először a karboxilvéga aminosavat, melynek o-helyzetü amínocsoportja védett, kovalens kötéssel egy ilyenkor szokásos, nem-oldható hordozóhoz kapcsoljuk, az aminosav oaminocsoportjáf védő csoportot lehasítjuk, majd az így kapott szabad aminosavhoz a karboxicsoportján keresztül hozzákapcsoljuk a következő védett amínosavat, és így kapcsolódnak össze lépésrol-lépésre a megfelelő sorrendben a szintetizálandó peptld további aminosavmaradékai. Az összes aminosav összekapcsolódása után a kész pepiidet a hordozóról leválasztjuk, és adott esetben a további funkciós oldalcsoportok üt is lehasítjuk. A lépcsőzetes kondenzációt a megfelelő, szokásos módon védett aminosavakkal végezzük az ismert módon. Az egyes aminosavak összekapcsolását a szokásos módokon végezzük, ahol különösen az alábbi módszerek jöhetnek szóba:

- a szimmetrikus anhidridek módszere, dicíkiohexil-karbodlimid ( fi Imid (QIC) jeleni a karbodilmíd-módszer általában, a karbodilmldZhidroxí-henzotríazol-módszer (íd.: E. Gross és J. Mei (szerk.),„The peptides”, 2. kötet).

nell előnyösen a racemizáiód? azidkapcsolást, vagy a DCC/1-bidroxi~benzotríazolt, illetve a DCC/3-hidroxí“4~oxo3,4-dihidro-l ,2,3-benzotnazmt alkalmazó módszert alkalmazzuk. A aktivált észtereit is használhatjuk.

Az aminosavak lépcsőzetes h különösen alkalmasak az védett aminosavak aktíváit észterei, így például az N-hidroxi-szukoinimid-észter vagy a 2_?4_s5-fókióMeníi-észter. Az aminoüzis katalizátoraként igen alkalmasak azok az N-hidroxl-vegyülefek, melyek savassága körülbelül az ecetsavéval egyezik meg, mint például az 1Az amínoesoporíok alkalmazhatók a hidrogénézéssel eltávolítható csoportok, mint amilyen a benzil-oxi-karboni

ÍZrt) vagy a gyengén savas körű Az o-helyzetü aminocsoportok ve a tercier-butil-oxi-karbcnil-csoport,a flucrenil-metil-oxi-karboni benzoxi-csoporf, illetve karhobenzo-tío-osoport (adott esetben vagy p-nítro-benzií-csopcrttai), a trlfluor-aoetll-osopcrt. a ftalilcsoport, az o-nltrofenoxi-aoetil-csoport,. a tfitücsoport, a p-ioluolszulfonHcsoport, a benzilesöpört, benzolmagban szubsztituált benzílcsoport (p-bróm- vagy p~nitro~benzil~osoport) és az o-fenll-eiil-csoport Ide tartoznak a Jesse P. Greenstein és Milton Winitz, „Chemistry of amino aoids” ( New York, 1961, John Wlley and Sons, Inc., 2, kötet, például a 863. öld.),”Pnnciples of peptide synthesís” (Springer Verlag, 1984), J. M. Stewart és 3. D. Young, Solid phase peptide synthesis” (Pierce Chem. Company, Röckford, Hl., 1984), G. Bárány és R. B. Merrifieíd ,”The peptides” (1, fejezet 1~ 285. old., 1979, Aeademlc Press Inc.), valamint E, Gross és J. Maienhofer (szerk.)YThe peptides^íí,(2. kötet, Aeademlc Press, New York) által leírtak is. Ezek a védőcsoportok elvileg a szóban forgó amínosavak további más funkcionális oídatcsoportjainak (OH-csoportok, NHs-osoporfok) védelméül Is szolgálhatnak,

A hldroxilcsoporfokaf (szerin, treonin) előnyösen benziicsoportokkal és hasonló csoportokkal védhetjük. A további, nem α-helyzetű amlnocsoportokat (például ω-helyzefű amínocsoportok vagy az arginin guanldlnoesoportla) előnyösen

Az egyes aminosav építőelemek, kivéve az R -CO-csoporttal módosított lizlnt vagy ornitinf, kereskedelemben kaphatók, A két utóbbi vegyület előállításának egyik lehetséges reakciófolyamata a következő:

1) az a-karbonsavesoportokat emidáliuk.

az ε-amir védjük, úgy hogy az amínocsoportot védő

S?a| j&mK? í

4) az ε-amínocsöportról lehasítjuk a Z-csoportot,

5) az ε-aminocsoportboz hozzákapcsoljuk a kívánt R⁴-C'O-csoportot, 6} a Boc-csoportot fehasítjuk az o-aminocsoportröl,

7) a.z σ-amlnocsoporthoz hozzákapcsoljuk a Z-csoportot.

Az R’~CG~csoport bevitelét a lizin aminocsoportja és a megfelelő karbonsav reakciójával· alapvetően az aminosavak összekapcsolása során fent említett eljárás szerint végezzük. Különösen előnyös azonban egy karbodiimid, például 1-etíl3“(3-dimetÍI-amino-propionll)”karbodiírn1d és 1 -hldroxi-benzotrlazol felhasználásával zajló kondenzáció.

Az aminosavak összekapcsolásának reakcióját egy szokásos közömbös oldószerben vagy szuszpenziös közegben (például dikiór-melánban) végezzük, amelyhez adott esetben az oldhatóság javítására dimetii-formamídot is adhatunk.

Szintetikus hordozóanyagként oldhatatlan polimereket használhatunk, például szerves oldószerekben duzzadöképes poliszfíroigyanta-gyöngyöket, (például poliszáról és 1% divínií-benzol köpoíímerlzátumát). Egy védett dakapeptidsmid metll-benzhidrllamid-gyantán {MBHA-gyanta, azaz metil-benzhidriiamid-csoporttai ellátott pollsztlrolgyanta) történő felépítését, mely folyamat a hordozóról való hídrogén-fluoridos hasítás után a pepiid kívánt C-végű armdfunkcióját eredményezi, az alábbi folyamatábra mutatja:

Folyamatdiagram A peptidszintézís protokollja

Lépés	Művelet	Oldószer/Reagens (tf/tf)	Idő
1	mosás	metanol	2x2 perc
2	mosás	DÓM	3x3 perc
3	le hasítás	DCM/TFA (1:1)	1x30 perc
4	mosás	ízopropsnoi	2x2 perc
5	mosás	metanol	2x2 perc
6	mosás	DCM	2x3 perc
7	semlegesítés	DCM/DIPEA (9:1)	3x5 perc
8	mosás	metanol	2x2 perc

A háromszoros moláris feleslegben lévő Να-δοο-védett aminosavakat szokásosan diízopropíl-karbodilmíd (DIC) és l-hidroxi-benzotrlazoí (HOöt) jelenlétében CH^CbZDMF elegyben 90 percen beiül kapcsoljuk egymáshoz, és a Bocvédőcsoportot félórás, 50%-os trlduor-ecetsavas (TFA) kezeléssel díkiórmetánban hasítjuk le, A reakció teljes vég bemenetelét a Chrisiensen-féle klóraniltesztettei és a Kalser-féle ninhidrin-tesztettel ellenőrizhetjük. A maradék szabad amínocsoportot díktór-metánban levő acetíl-imidazol ötszörös mennyiségével történő aeetilezésseí blokkoljuk. A gyantán zajló peptidfelépííés lépéseinek a sorrendjét a folyamatábra mutatja. A gyantához kötött peptid leválasztásához a szííárdfázis-szintézis adott végtermékét csökkentett nyomáson P₂O₅ fölött szárítjuk,, majd 500-szoros feleslegben lévő hidrogén-fluorid/anizol 10:1 térfogatarányú elegyében 60 percen át 0^eC hőmérsékleten kezeljük.

A RF és anlzol csökkentett nyomású lepárlása után a terméket vízmentes etil-éterben kevertetjük, mely során a peptidamíö fehér csapadékként válik ki. A pepiidet a polimer hordozóról 50%-os vizes ecetsavas mosással hasítjuk te. Az ecetsavas oldatot csökkentett nyomáson kíméletesen bepároljuk, az adott pepiidet magas viszkozitású olajként kapva meg, amely vízmentes dietlí-éter hozzáadása után alacsony hőmérsékleten fehér csapadékká alakul át,

A további tisztítást rutinszerű preparatív magasnyomású-foiyadékkromatográfíávaí (HPLC) végezhetjük el.

π

A pepiid savadd (dós sóvá történő átalakítását savas reakcióval, az ismert módon végezhetjük. A savaddiciós sókból viszont szabad peptídeket nyerhetünk a só bázissal történő reagátatásávaí. A pepid-embonátöt a pepid trifluor-ecetsavas sójának (TFA-só) és szabad embonsavnak (pamoasav) vagy az embonsav megfelelő dinátnum-sójának a reakciójával állíthatunk elő. Ehhez a pepid-TFA-sc vizes oldatát a dlnátrium-embonát poláros-aprotikus közegben, előnyösen dímetií-acetamldban készült oldatával elegyítjük, és a képződött világossárga csapadékot kinyerjük.

Vizsgáltuk a találmány szerinti (I) általános képletű vegyületek receptoron való kötődését. Az eljárás nagyban támaszkodik Beckers és munkatársai [Eur. J. Bíochem, 231: 535-543. old. (1995)] által leírtakra. Az itt felfedett szintézisekkel kapott Cetroreiixet [¹²Ί] izotóppal (Amersham; specifikus aktivitás 80,5 Bq/fmol), jódozzuk IcdoGen-reagenst (Piarcé) használva. A reakoíókeveréket forditcttfázisú nagyteljesítményű-fclyadékkrcmatcgráfíával tisztítjuk, ahol a monojódozott Cetroreiixet jelöletlen peptid nélkül kapjuk meg, A f²⁵lj-Cetroreiix és a nem jelölt találmány szerinti vegyület kb. 80%-a alkalmas a specifikus receptorkötődésre.

A találmány szerinti vegyületek in vitro hatását az alábbi 2 módszerrel vizsgálhatjuk: a kötődési képességet a f ²⁵l]~Cetrorelíx~szeí végzett vizsgálati eljárással (1. módszer), míg a működési aktivitást a Trsptorelin agonssta hatásét felhasználó eljárással (2< módszer} értékeljük.

1. módszer

Beokers 7., Marheineke K., Reínlánder H„, és Hilgard P. szerinti receptorkctési-próba USelection and characterízaiíon of mammalían ceil Hnes wítb stable overexpression of humán pítultary receptors fór gonadolíbenn (GnRH)” (Eur. J. Bíochem., 231; 535.-543. (1995)}.

A receptorkötés vizsgálatához a Cefroréhxet f^2í!Q~dal (Amersham; 80,5 Bq/fmei specifikus aktivitás) jódozzuk, lodoGen-reagenst használva. A reakciókeveréket fordított fázisú magasnyomású-föiyadékkromatgráfíával tisztítjuk, ahol a monojődczott Cetroreíixet jelöletlen peptid nélkül kapjuk meg. A [^:25lj-Cetrorellx kb, 80%-a alkalmas volt a specifikus receplorkőtödésre.

A receptorkötési próbát Beckers és munkatársai (1995) által leírtak szerint Intakt sejtekkel, fiziológiás körülmények között végezzük. Az emberi LHRHrecepiort expresszálö, stabilan transzformált LTK-sejtek szubkontinens tenyészetét NaCI/R (137mmői/l NaCI, 2,7mmól/l KCI, SJmmöl/l Na₂HPOá, 11,47mmól/í KH2PO4) /immól/í EDTA közegben inkubálva leválasztjuk, és centrifugáiással öszszegyűjtjük. A sejt-peiletet kötöpufferben (DMEM H₂CO₃ nélkül, 4,5 g/1 glükóz, 10 mmóí/t Hepes, pH7,5, 0,5% (tömeg/térfogat) Β3Ά, 1 g/1 bacitracín, 0.1 g/l SBTI, 0/1 % (tömeg/térfogat) NaN₃] szuszpendáljuk, A kiszorítási próbához 0,25x10® sej 1/100 pl sejtszuszpenziőt körülbelül 225 pmöl/l f²⁵ii-Cetrorellx-szel (specifikus aktvitás 5-10x1Ö'¹ dpm/pmol) és kcmpetitorként különböző koncentrációjú, találmány szerinti jelöletlen vegyülettel ínkubáljuk. A 100 pl kőtőkőzegben levő sejtszuszpenziőt 4ÖÖ pl-es próbacsövecskékben lévő 200 pl, 84 térf% szílikonoiaj (Merck Typ 550) és 16 térf% paraffinolaj elegyére rátegezzük. A sejteket 1 órán keresztül, 37°C hőmérsékleten, lassú, folyamatos rázás mellett ínkubáljuk, majd 2 percen át 9000 percenkénti forbulatszámon (reioröpus; HTA13,8; Heraeus Sepatec, Osterode/Hémefország) centrifugáljuk, mialatt a sejtek elválnak az inkubációs közegtől, A csövecske csúcsát, mely a sejtüledéket tartalmazza, levágjuk, A sejtüledéket tartalmazó csúcsot végül gamma-sugaras számlálással mérjük. A nem-specifikusan kötött mennyiséget, beleértve a jelöletlen Cetroreíixet is, 1 pmól/l végkoncentráciőnál határozzuk meg. Ez az összes megkötött mennyiség

EBDÁ/ligandum elemzőprog emzoen < iO%~a.

rammal (Biosofl V3.0) végezzük..

2. módszer

Az antagonisztikus viselkedés vizsgálatéra szolgáló funkcionális próba

A próbát néhány módosítással Seckers T., Rellánder H., Hílgard P. szerint végezzük, a „Characlenzatíon of gonadotropín-reíeasíng hormoné analogs based on a sensitlve cellular luclferase reporter gene assay (Seckers és munkatárséi; Analyt Biocbem., 251; 17-23 (1987)j cikkben leírtak alapján. Mikrotiterlemezen bemélyedésenként humán LHRH-receptorf és egy luciferáz ríportergént kifejező TQGOO sejtet adalékanyagokkal és 1% (tf/tf) PCSrvel kiegészített DMEM közegben tenyésztünk 24 órán keresztül. Végezetül a sejteket 8 órán át lnmól/1 (D-Trp⁰] LHRH-val stimuláljuk. A találmány szerinti antagonista vegyületekel stimuiálás előtt adjuk a szuszpenzióhoz, és végül a sejtek Luc-aktivitásának mennyiségi méréséhez a sejteket lizáljuk. Az ICso-értéket a dőzis/hatás görbéről nem-lineáris regressziós analízissel határozzuk meg, Hill-modellt (C. Grunwald; Programm EDX 2,0; Arzneimíttelwerk Dresden) használva.

A Luc-aktlvitás mennnyiségl meghatározását lényegében a leírtak (Promega Technics! Builetins #101/181) szerint hajtjuk végre két párhuzamos mérésben az adott luclferáz-vizsgálati készlet (Promega £4030) felhasználasávaL Koenzim A (CoA) hozzáadásával előnyős kinetikai körülmények között megy végbe a luciferilCoA oxidációja. A mikrotiterlemez tenyészközegének eltávolítása után, a sejteket 100 pl lizáló-puffer (25 mmól/ trisz-foszfáf, pH 7,8, 2 mmol/l ditíotreitol, 2 mmól/i 1,2“diamlnO“Ciktohexén-N_sN,N:',N’-tetraecetsav (CDTÁ), 10% (tf/tf) glicerin, 1% (tf/tf) Triton X-100) hozzáadásával lizáljuk. 15 perces, szobahőmérsékleten zajló ínkubáiás után, 10 pl sejtíizátumot lumlnomefrikus detektálásra alkalmas fehér mikrotíteriemezre (Oynatech) viszünk át Az enzímetikus reakciót 50 yl vizsgálati puffer (20 mmól/ί Trióin. pH 7,8, 1,07 mmél/i (MgCOs^MgCOHjs, 2,87 mmől/1 MöSOa, 0,1 mmök'l etilé n-diamin-tetraecetsav (EDTA), 33,3 mmóí/í dltíotreitoL 270 pmól/l Koenzím A, 470 pmól/l szentjános-bogár (Photinus pyralis) -luciferin, 530 pmől/l rATPNas) hozzáadásával Indítjuk be. Egy perc után EG&G Berthold MIcroLumat L8 98 P készülékkel megfelelő paraméterek mellett meghatározzuk a lumineszcenciát

Ezzel a módszerrel a következő in vitro eredményeket kapjuk, ahol K_o a kötésaffinitást és ICso a funkcionális aktivitást mutatja, illetve pM jelentése

a zárójelben az egymástól független kísérletek száma

A kővetkezőkben példákat adunk meg a találmány szemléltetése céljából. A példák kizárólag szemléltető célzatúak, és a találmány oltalmi körét nem korlátoz-

Claims

1. példa

A szintézist a szilárdfázis folyamatdiagram (pepödszíntézis protokollja, 10ΤΙ. old.) szerint végezzük, DIC/HÖBt-kapcsolással, 3,3 g MBHA-gyantából (töltéssűrűség 1,08 mmol/g) kiindulva. A polimer hordozóról való HF-os hasítás után 3,4 g nyers pepiidet kapunk, melyet a szokásos preparatív HPLC eljárással tisztítunk, A végső fagyasztvaszántás után 1,43 g, HPLC szerint egységes, CsvHssNnOuCI összegképletü terméket kapunk. Az FAB-TS mért; 1458.7 (M+H*), (számított: 1457,7) érték és a ¹H-NMR spektrum a szerkezetnek megfelelő.

’H-NMR (5GÖ MHz, Dsö/DMSO-de, δ ppm-ben):8,7-7,2 (több m, aromás H és nem teljesen kicserélt HH); 6.92 és 6,58 (2d, 2x2H, aromás H, p-CI-Phe); 5,23,5 (több m, Co-H és alifás H); 3,2-2,6 (több m, aromás Cp-H); 2,1-0,7 (több m, maradék alifás H); 1,70 (s, 3H, aeetiicsoport); 1,20 (d, 3H, Οβ-Η, Alá); 0,8 (m, C8H, Leu)

2. példa

Ac-D-Nai<2)⁵-D-Cpa²-O-PaK3)³-Ser⁴-N-Me-Tyr^s-D-Lys(B)⁸-Leu⁷~Lys<tPr)⁸Pro⁹-D-Ala'^ö-NH₂

A szintézist a szllárdfázis tdlyamatdiagram (peptídszintézís protokollja, ΙΟ11. old.) szerint végezzük, DIC/HÖBt-kapcsolással, 4,0 g MBHA-gyantábe! (töltés sűrűség 1,11 mmol/gj kiindulva. A polimer hordozóról való HF-os hasítás után 4,87 g nyers pepiidet kapunk, melyet a szokásos preparatív HPLC eljárással tisztítunk. A végső fagyasztvaszáritás után 0,93 g, HPLC szerint egységes terméket kapunk, amit A-amidino-feníl-amíno-A-oxo-vajsavval, BOR kapcsolőreagens jelenlétében a kívánt vegyüietté alakítunk. Egy újabb HPLC-as tisztítással 148 mg

CgsHnsNtyOtsCI: osszegképíefü célvegyöletet kapunk. AZ ESI-TS mert: 1647,8 (M-fH*) (számított: 1645,8) érték és a ^!H-NMR-spekfrum a szerkezetnek megfelel, 'H-NMR (500 MHz, CMSO-dg, δ ppm-ben): 10,4 (s, 1H); 9,13 (s, 2H); 8,94 (s, 2H, 4~amídmo~anilín NH-ja); 8,8-7,35 (több m, aromás H és NH); 7,22 és 7,18 (2d, 4H, aromás H, (pCÍ)Pbe): 8,95 és 8,58 (2d, 4H, aromás H, Tyr); 5,2-3,5 (több m, Ca~H és alifás H); 3,3-2,4 (több m, Οβ-Η és N-CHJ; 2,1-1,1 (több m, maradék alifás H); 1,88 (s, 3H, acetí leső pori); 1,20 (d, 3H, Οβ-Η, Aia), 0,83 (dd, 6H, C8-H,

3. példa

Ao-D-Naí(2)¹-D~Cpa²-D-Pal(3)^s~Ser⁴-N~Me-Tyr'-D-Lys(B)⁶-Leu⁷-Arg^s~Pro²-DA szintézist a sziíárdfázis folyamatdíagram (peptidszinfézis protokollja, 10ΤΙ. old.) szerint végezzük, DIC/HQBf-kapcsolássaí, 4,0 g MBHA-gyantáből (töltés sűrűség 0,97 mmol/g) kiindulva. A polimer hordozóról való HF-os hasítás után 4,0 g nyers pepiidet kapunk, melyet a szokásos preparatív HPLC eljárással tisztítunk. A végső fagyasztvaszárítás után 1,39 g, HPLC szerint egységes terméket kapunk, amit 4-amídino4enil-amino-4-oxo~vajsavvaí, BOR kapcsolóreagens jelenlétében a kívánt vegyületté alakítunk. Egy újabb HPLC-ás tisztítással 440 mg CgsH.ösN-isöisCí összegképlete céivegyüJetet kapunk. AZ ESI-TS mért; 1832,7 (M-rH) (számított; 1631,7) érték és a ’H-NMR-spektrum a szerkezetnek megfelel.

WNMR (500 MHz, DMSO~eU, δ ppm-ben): 10,4 ($, IH); 9,15 (s, 2H); 9,0 (s, 2H, 4-amidino-anllin NH-ja); 8,8 (m, 2H_S aromás H); 8,3-7,2 (több m, aromás H és NH); 7,27 és 7,20 (2d, 4H, aromás H, (pCÍ)Phe); 6,96 és 8,80 (2d, 4H, aromás H, Tyr); 5,2-3,5 (több m, Co-H és alifás H); 3,2-2,4 (több m, Οβ-Η és N-CH_S); 2,13?

1,1 (több m, maradék alifás H); 1,70 (s, 3H, acetiícsoport); 1,20 (d, 3H, Οβ~Η, Alá); 0,85 (dd, 8H, C8-H Leu)

4. példa

Ao-D~Nal(2)'~D-Cpa²-D-Pal(3)³-Ser⁴-N-Me-Tyr^s-D-Hcí⁸-Nle⁷

Ala¹⁰-NH₂

-Pro—

A szintézist a szilárdfázis folyamatdiagram (peptldszintézis protokollja, 1011. old.) szerint végezzük, DIC/HOBt-kapcsoíássai, 2,5 g MBHA-gyantából (töltés sűrűség 1,08 mmol/g) kiindulva. A polimer hordozóról való HF~os hasítás után 2,78 g nyers pepiidet kapunk, melyet a szokásos preparativ HPLC eljárással tisztítunk, A végső fagyasztvsszántás után 400 mg, HPLC szerint egységes C?s.Hic2Ní5Ö^:uCÍ összegképíetö terméket kapunk. AZ ESI-7S mért; 1472,8 (M+H*) (számított; 1471.7) érték és a ^H-NMR-spektrum a szerkezetnek megfelel.

(500 MHz, D₂O/DMSO~d_g, δ ppm-ben): 8,82 (m, 2H); 8,30 (m, 2H); 7,80 (m, 4H); 7,66 (s, 1H); 7,47 (m, 2H); 7,38 (d, IH, aromás H); 7,25 és 7,20 (2d, 4H, aromás H, (pCí)Phe); 6,98 és 8,83 (2d, 4H, aromás H, Tyr); 5,10-4,0 (több m, Co-H és alifás H); 3,75-2,85 (több m, Cp-H és N~CH₃): 2,1-1,05 (több m, maradék alifás H); 1,74 (s, 3H, acetiícsoport): 1,23 (d, 3H, Cp~H, Aia); 1,20 (m, CH₃Izoprop! leső port); 0,8 (m, 3H, CS-K, Nle).

ÁC“D~Nal(2)¹~D-Cpa²-D~Pal(3)³~Ser⁴-N~Me~Tyr^s-D~Hci⁶-Nle⁷~Lys(iPr)^s~PrQ^sSar^-MHa

A szintézist a szilárdfázis fői

11. old.) szerint végezzük, DIC/HOSf(peptid szintézis Hassal 2.5 q MBHA-gvantából (töltés

IS sűrűség 1,08 mmol/g) kiindulva, A polimer hordozóról való HF-os hasítás után 2,74 g nyers pepiidet kapunk, melyet a szokásos preparatív HPLC eljárással tisztítunk. A végső fagyasztvaszádtás után 840 mg, HPLC szerint egységes CysH'SösNísO^Ci összegképletü terméket kapunk. AZ ESI-TS mért: 1472,8 (M+H*) (számított: 1471,7) érték és a 'H-NMR-spektrum a szerkezetnek megfelel.

^H-MMR (500 MHz, D₂O/'DMSÖ«d_&í 6 ppm-ben): 8,8 (m, 2H); 8,3 (m, 2H); 7.85 (m, 2H); 7,8 (m, 2H); 7,65 (s, 1H); 7,76 (m, 2H); 7,35 (d, 1H, aromás H); 7,23 és 7,17 (2d, 4H, aromás H, (pCI)Phe); 7,0 és 8,8 (2d, 4H, aromás H, Tyr); 5,103,8 (több m, Co-H és alifás H); 3,75-2,8 (több m, Cp-H és M~CH₃); 2,2-1,05 (több m, maradék alifás H); 1,70 (s, 3H, aoetHosoport); 1,23 (d, 3H, Οβ-Η, Alá); 1,20 (m, CK₃ izopropitosoporf); 0,8 (m, 3H, C8-H Nle).

3-(4-flüor-fenii)-propíonil-D-Nal(1)⁵~Ser⁴-N-Me-Tyr⁵-D-Lys(Atz)^$-Leu⁷la'

A szintézist a szilárdfázis folyamatdiagram (peptídszintézis protokollja, ΙΟ11. old.) szerint végezzük, DIC/MOBí-kapcsolással, 9,2 g MBHA-gyantából (töltés sűrűség 1,08 mmof/g) kiindulva, A polimer hordozóról való HF-os hasítás után

5,8 g nyers pepiidet kapunk, melyet a szokásos preparatív HPLC eljárással tisztitünk, A végső fagyasztvaszárítás után 2,0 g, HPLC szerint egységes, nemszubsztituáit öktapeptidet kapunk, amelynek 0,4 mmólját 0,5 mmól 3-amino-1,2,4triazof~5~karbonsavval PyBOP kapcsolóreagens jelenlétében reagáítatva, 790 mg nyerstermékhez jutunk. Egy újabb HFLC-ás tisztítás 200 mg C^HssNízO^.F őszszegképiefü kívánt oéívegyüfetet eredményez. ESI-TS mért: 1304,6 (PRH Ί (számitott:

Ή-NMR (500 MHz, D₂O/OMSO-d_s, δ ppm-ben): 8,14 (m, ÍH); 7,90 (m, 1H>; 7,80 (m, 1H); 7,50 <m, 2H); 7,35 (m, 2H); 7,0 (m, 6H); 7,63 (m, 2H, aromás H); 5,0 (m, 1H): 4,83 Cm.

I); 4,41 (m, 1H); 4,30-4,05 (több m, 4H, Ca-H>; 3,86-2,25 (több m, alifás és aromás oldaliánc H); 2,95 (s) és 2,75 (s, 2,05-1,1 m, maradék alifás H); 1,20 (d, Οβ-H, Aia); 0,75 (m, OH, C8~H, Leu).

IGÉNYPONTOK

1. Áz (I) általános képletü vegyületek, valamint ezek gi lég elfogadható savakkal képzett sói,

A-Xxx -Xxx Χχχ~-Χχχ^-ΧχχΧΧχχΚΧχχΑχχ_ΧΚχχχΑχχ_Χ ¹⁰„|\|Η·>

íö

Xxx^z~}

Xxx⁴ jelentése acetil- vagy 3-(4-f'luor~fenll)-prcplonl jelentése D~Nal(1) vagy D~Na!{2); jelentése D-Cpa~D~Pal(3) vagy egy egyszeres k jelentése Ser;

jelentése N-Me-Tyr;

lése jelentése Nie; jelentése Arg vagy Lys

Xxx' ientése Pro: és jelentése Alá vagy Sár.

2. Az 1.. Igénypont szerinti vegyületek, ahol a só egy ecetét, trifluor; vagy

3, Áz í. igénypont szerinti vegyület, melynek képlete:

Ac-D-Nal(2)’-D~Cpa²-D-Pal(3}³-Ser⁴~N-Me-Tyr⁵~D-Hd⁶~tMle^?-Arg⁸~Prö⁹-DAlá ''-ΝΗσ.

4. Az 1, igénypont szerinti vegyűlet, melynek képlete:

Αο-Ο-Ν3ΐ(2)^!-Ο-Όρ3^Λ-Ο-Ρ3ΐ(3)^Λ-δβΓ-N-Me-Tyr’-D-Hcr-Nle -Lys(IPr) -Pro Ala^1ö-NH₂.

5. Az 1. igénypont szerinti vegyűlet, melynek képlete: AO“D-Nal(2)¹-D~Cpa²-OPal(3)³~Ser⁴“N-Me“Tyr^s~D~Hci^s~Nle⁷-Lys(iPr)^s-Pro^sSar¹⁰-NH₂.

6. Az 1. igénypont szerinti vegyűlet, melynek kei

Ac-D-Nal(2)¹~D~Cpa²~O~Ral<3)³~Ser⁴~H-Me-Tyr⁵-D~Hcí^e~Nle⁷-Arg⁸-Pro^s ,w

7. Gyógyszerészeti készítmény, mely az 1-6. igénypontok egyike szerinti vegyűíetet tartalmaz.

3 Eljárás az 1. igénypont szerinti (!) általános képletű vegyűlet előállítására, ahol a megfelelő védőosoporttai ellátott, Xxx^m általános képletű ~ ahol m jelentése 1 és 10 közötti egész szám, és Xxx¹ acilezett - alkotóelemekből álló fragmenseket szilárd fázison vagy oldatban a szokásos eljárással építjük fel, végül a fragmenseket a szilárd fázison szegmenskapcsolással összekötjük, és a kapcsolás befejeztével az (I) általános képletű vegyűíetet a szokósós eljárás szerint, az Xxx’° építőelem amldáíása mellett, a szilárd fázisról leválasztjuk.

9. Az 1—6, igénypontok szerinti vegyöletek alkalmazása hormonfüggő daganatok, különösen a prösztatakarcínoma vagy mellrák, valamint LHRHszupresszióf igénylő, nem-rosszindulatú betegségek kezelésére szolgáló gy óg y szerek e lóéi Iítá sá ra.

10, Eljárás gyógyszerek előállítására, ahol az 1.-6. igénypontok szerinti vegyületeket a szokásos vivő- és segédanyagokkal keverjük össze, és a keveréket gyógyszerként feldolgozzuk.

Imazott