HU228703B1

HU228703B1 - Vaccination against canine herpesvirus infection and vaccines

Info

Publication number: HU228703B1
Application number: HU0203831A
Authority: HU
Inventors: Herve Poulet
Original assignee: Merial Sas
Priority date: 2000-01-21
Filing date: 2001-01-19
Publication date: 2013-05-28
Also published as: WO2001052887A3; NZ520242A; JP2003520249A; FR2804026A1; HUP0203831A2; CA2397861A1; ATE540693T1; AU782657C; EP1248648B1; WO2001052887A2; AU3383101A; PL209070B1; EP1248648A2; FR2804026B1; PL356556A1; HUP0203831A3; CA2397861C; MXPA02007115A; AU782657B2; ZA200205830B

Description

A találmány tárgyát kntyaherpeszvirus elleni vakeinázás képezi. Közelebbről, a találmány tárgya CHV-antigén (kutyaherpeszvints-aatigérO alkalmazása katyakölyköknek kutyaherpeszvínts-fertözós ellen védefetet nyújtó, a vemhes szakának a fialás várható Időpontja előtt 1-15 nappal, előnyösen 5-15 nappal történő beadásra szolgáló vakcina előállítására, antelv vakcina loaktiváít CHV-t, attenoátó CHV-t, CHV-alegységei, rekömbináns mádon expresszit antigént vagy CíW-gllkoprotein-láwnatet és aájuvánsí tartalmaz.

A kuíyaberpeszvirusl (caníne betpesvírus, CHV) először 1965-ben írták le [Carmiehael, L. B<: Am.. J. Vet, Rés, 2ő, $63 11965)), A kutyák heq>eszvsfus~ifertőzötís8gét azóta a világ számos országában (az USAban, Franciaországban, az Egyesült Királyságban, Svájcban, Olaszországban, Japánban, Ausztráliában, ŰjZétadon stb.) kimutatták, Á CHV kutyákban szaporodást zavarokat okoz, ami leginkább az újszülött kiskutyák nagyarányú mortalitásában nyilvánul meg és egyes tenyészetekben jelentős veszteségek forrása lehet. A vírus emellett vetélést és holtellést is okozhat. A szakák csökkent terurékenyülő-képességének hátterében is & CHVfertőzés szerepe gyanttlnaó. A CHV stemi ólon, az orron és a szájon történő felvétellel és a piaeeatto keresztül fertőz.

A CHV a /'/efg-íosví'rm'ífe viruscsslád alcsaládjába tartozik. A hurkos, dupla szálú

DKS-moleknfűt tartalmazó vámsak ezldáíg csapán egy típusa ismert. A vírus burka számos viruseredettl glíköproteiot tartalmaz, A gB, gC és gD jelzésű glikoproteínek egérben aeutralizálö eilenanyagok képződését Idézik elő.

A CHV anbgsaszerkezetíleg hasonló a macska berpeszvirushoz [tmcumpao és másai.: Arch. Vhol, Ül, 1'65 (1996)], de a kettő között nem figyelhető meg lényeges mértékű kereszt-neuíralizáctö (Xnan és mtsai.: Arch. Vírol 122,359 (1992)).

A CHV kifejezetten gazdaszervezet-függő, kizárólag kutyaeredetü sejtekben képes elszaporoáfu (Pierson és ártsál.: teeueil de Med. Vet, j?4,8? (1998)).

Áz újszülött kiskutyák életük első bárom beiében reedkivőí fogékonyak a CHV-fertözésre. Fertőződésük a születéskor, vagy az azt követő néhány napban következik be. Etmek következtében a kiskutyák vakclnázására nincs lehetőség, A védekezésre kizárólag higiéniás intézkedések, pl, a kiskutyák inffalámpás melegítése valamint a széntntterápia vehető Igénybe.. A CHV azonban viszonylag gyenge immunogén, etniatí nehéz hatásos szérumot készíteni ellene [Caruúehei, L. E.: .1. Am. Vet Med. Assoe. ISő, 1714 (1970)], Természetes körülmények között a szeropozitsv szukák kölykeinek a kolosztrambelí CH V-neutralízáló ellenanyagok védettséget nyújtanak, entsek hiányában a kiskutyák nagyon fogékonyak a CHV-fertözésre [Htsxsoll, D,, L. és Kesnelt, ϊ. E.: 3. Am. Vet Med. Assoe. 156, 1766 (1970)1. A megbetegedés veszélyének leginkább & vírusürltö állatokkal érintkező, nem fertőzött szukától született kiskutyák és a látensen fertőzött, de szeronegatlv vagy gyengén szeropozitlv szukák kölykei varrnak kitéve. A CHV-ellem nsntralízáió ellenanyagok nem perzisztálsak hosszú ideig, előfordulhat szerológíai áthangolódás nélküli fertőzöttség is.

Háross hetesnél fiatalabb kölykökbets 8 vírus gyakran végzetes kimenetelű fertőzési okoz. A lappangási idő rövid, az esetek túlnyomó többségében a kölykök néhány napon belül, általában 5 napos kor előtt többAktaszámunk: 97293-27ÖIVSG nyíre csupán hirtelen hípotermia és súlyos idegrendszeri bántalmazottság tünetei msíietí elhullanak. A kevésbé heveny lefolyásé esetekben a hlpoterniiát étvágytalanság, elesettség, hradikardla, hípoglíkémia, a bőr alatti kötőszövet ödémája, a bőr kipotíása és a test alsó részén göhöcskék megjelenése, ügy, sárgásszihke bélsár ürítése, hasi fájdalom, hányás, szüntelen nyüszítés követi, majd az elhullás 24-72 órán belöl, ászó-köszó mozgásit és opislhotonus mellett következik be. Kórbonctani vizsgálattal esetenként lépmegnagyobbodás, a has- és mellhtegben savófelhalmoződás és a zslgerekben apró vérzések állapíthatók meg (Plerson és mtsaí.: recueil de Med. Vet, 174, 87 (1998)]. Ebben a cikkben említés történik arról, hogy jelenleg nincs katyaherpeszvírssfettézés elleni vakcina a piacon, pedig a vad-típusú vitás öntésének csökkentése érdekében hasznos fenne a látensen fertőzött tenyészállatok vakeinázása, ífelisle (Rec, Med. Vet 158. őő9 (1982) a szakák isakríváit vakcinával történő vemhesség előtti vakeínázását, vagy a kiskutyák szílfetéskori szérrnnkezeléset javasolta, hozzátette ugyanakkor, hogy a kórokozó ellen nincs kereskedelmi forgalomban vakcina [Iá. továbbá Carmfehael, L. Ε.: I Am, Vet, Med, Assoe, 156, 1714 (197(1)). Appel a szakák inaktivált vakcinával történő Immunizálását javasolta a vemhesség előtt vagy annak legelején [Horzinek, M. C.: Canine herpesviras, Vírus iníeeílon of vertebraíes, 1. kötet, pp. 5-15 szerk.; Appel, M. .1., kiad,: Elsevier Science Pnhlisher (1987)1.

Pontot és Dubonrget általánosságban a szaka vemhesség végén történő megerősítő vakcínázását ajánlotta fPouleí, H. és Idübotsrget, P.; Polnt Vét. 25, Ő9 (1993)). Az említett szerzők fonualdehkidel maktivált vírusokkal vagy·· artennáll vlrusváltozsttokkal kapcsolatos vizsgalatokról Is beszámoltak, ezek azonban nem botiak meggyőző eredményt és nem eredményeztek kereskedelmi forgalomba kerülő vakcinát [Carmíehael és mtsai.; íníecíion and ímmsnity 2(1, IÖS (1978); 4213965 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi irat: kis tetjedelmS hőérzékeny knlyaherpeszvinss-változatot tartalmazó attenuáit élő vírusos vakcina],

Anvik egy közleményében kifejtette, hogy a CHV gyenge ínunünogenítása miatt az anyában kialakuló neutraiizáiő ellenanyagok mennyisége és ennek következtében az alom védettségének mértéke kiszámíthatatlan [Anvik, 1. O.: Vet. Med. 4, 394 (1991)],

A vakcínázássál kapcsolatos nehézségek miatt Pferson és mtsai. a szuka macska herpeszvírus (FHV) elleni inaktivált vakcinával történő immunizálását, vagy a kölykök születéskort antí-FHV ellenanyagokkal történő ellátását is elfogadhatónak tartották [Pierson és mtsaí.; recueil de Med, Vet, 174, 8? (1998)].

A mai napig a vakcmázással kapcsolatos hipotézisek egyikét sem sikerült igazolni, kereskedelmi forgalomban nincs vakcina a megbetegedés ellen és egy ilyen vakcina közeljövőben piacra kerülését bejelentő meggyőző vaketnázasi eredményeket sent tettek még közzé.

A vemhes szukák CHV-fertőződése a fentiek mellett embrióféíszívődást, magzati mumifíkációf, vetélést, koraeltóst, holtodért vagy fgszníöttkorí elhnllást okozhat. Az érintett magzatok piaeentája esetenként elváltozásokat tartalmaz.

Bár más állattátok, pl. macska esotéhett rendelkezésre állnak külőnléle herpeszvítusok elleni vakcinák, ezídálg nem számoltok be knfyaherpeszvírns ellent hatékony vakeinázásrói.

A találmány tárgyát kntyaherpeszvirns elleni, kőiyökkorí védettséget nyújtó vakeíná2ásl eljárás képezi.

-3 A találtnány tárgyát képezik továbbá a találmány szerinti vakcmázási -eljárásban alkalmazható hatékony és gyógyászati szempontból elfogadható vakcinák.

Megtsllapítotútk, hogy meglepő módon a vemhes szukáknak a vemfeesség alatt, közelebbről a fsalás időpontjához a lehető legközelebb adott vakcinával magas feláskoti aníi-CHV ellenanyag-koncentráció érhető el, ásni a szopás során Felvett maíernális ellenanyagokon keresztül védettséget nyújt a kiskutyáknak. Emellett az. említett ellenanyagok mennyisége a kiskutyákban életük vírasftrtözés. szempontjából kritikus időszakában, a születést követően 3-4 hétig feyegébes állandónak tekinthető, A szakában a öeutralizáló ellenanyagok litere előnyösen ő,9 lóg IS vagy attnál magasabb, közelebbről 1,2 loglő vagy több. Az említett titerértékek megállapítása a 7. példában bemutatott módon történik. A szuka va&cinázása emellett a fcőlyköket érő fertözéses nyomás csökkenéséhez ss vezet. Kimutattuk azt is, hogy a vakcinázoíí és fertőződ környezetben tartott szukák kölykeinek születéskor! testtömege magasabb volt és a szukák vemhesőlési szintje Is javuk. Ezek a jelenségek a vakéi«ázott szukák esetében a piaeenta-elváííozások számának csökkenésének vagy azok hiányának tudhatok be [Hashínroto, A. és mtsai.: Μ1. Vet, Rés. 40, 1236 (1979); Hashhnoto, A. és mtsai.: Am. .1. Vet. Rés. 43, 844 (i982)j.

A találmány már említett és több további tárgyát, vemhes szukák vakcioázására szolgáló eljárás alkalmazásával valósítottuk meg. Az eljárásban vemhes szukákat a fialás időpontjához lehető legközelebbi időpontban, előnyösen a vernhesség utolsó harmadában (a kutya átlagos vemhességi időtartama kb. 63 nap), a hálás várható időpontja élőit pl. 1-15 nappal, rnég előnyösebben 5-15 nappal, Igen előnyösen azelőtt 5-10 nappal, jellemzően azelőtt kb. 1Ö nappal vakeinázzuk, aminek hatására a vemhes szukában a íratás időpontjára magas CHV-elleni ellenanyagtiter alakul ki, ami a szopás során leivett maíernális ellenanyagokon keresztöl védelmet biztosit a kölyköknek. Az említett ellenanyagok mennyisége a kiskutyákban életük vírusfertőzés szempontjából kritikus időszakában, a szSteíÓst kővetőét) 3-4 itétig lényegében állandónak tekinthető.

A találmány szerinti vakcinában hatékony mennyiségben található ellenanyag a protokoll szerint alkalmazva a vemhes szukában és az újszülött kiskutyákban magas és védő hatású ellenanyag-koncentrációt alakit ki. Az antigén lehet inakliválí CMV, attenuált CHV, egy vagy több CHV-vlrusalegység vágj' rekombináns módon expresszáit egy vagy több antigén.

A vakcina a vemhes szukában a Halas idejére előnyösen (a 7. példában bemutatott módon megállapított) Ő,91oglö vagy annál magasabb, előnyösebben l,2ioglfj vagy magasabb anti-CHV ellenanyagtítert eredményez.

CHV-elleni vaké inázásban -még sosem részesült állatok esetében a lentebb említett vakcinázást megelőzően az immunválasz fokozása céljából a Cl-IV-elleni vakcina beadásának egy (vagy több) eltérő protokollja alkalmazható. A két Immunizálás között a megerősítő hatás kiváltása érdekében általában legalább 2-3 hetes időtarístmtak kell eltelnie. A2 első vaké ina beadására általában az ivarzás és a fentiekbett ismertetett vakcinázás előtti két-hárosn héten beiül kerülhet sor, közelebbről az ivarzás és a vetnhesség első harmadának vége között, ebbe a periódusba a termékenyítés előtti vakcinázás is beletartozik, A vakcirtázásra előnyösen a termékenyítést megelőzően 7-10 nappal kerül sor. A találmány egy előnyös megvalósítási módjában az említeti vakcinázás minden egyes vemhességnél megismétlődik.

Φ φ* φ*

-4CHV-ellen már korábban vakeinázott állatok «setén- elegmfö tehet a Háláshoz közeli időpontban egy alkalommal végzett immunizálás.

A vakeinázás, vagy legalább & vakeinázások egyike a fialás időpontjához lehető legközelebb alkat•$fc mázott vakcinában találhatótól eltérő antigént tartalmazó és/vagy attól eltérő kisaerelésö, más összetételű készítménnyel is elvégezhető.

A vakcina elsősorban parenterálisan, előnyösen szubkután vagy intramuszkuiárisan adható be,

A vakcina adagja 0,2-2 ml, közötíi, előnyösen kb. 1 ml.

A találmány tárgyát képezi továbbá CHV-antigén alkalmazása k»íyaherpeszvit»s-fertőzés elleni, a találmány szerinti: protokollnak megfelelően alkalmazott vakcina előállítására.

Szakember a vakcinák típusától függően képes azok adagjának pontos meghatározására.

Az állat többszöri vakcinázása esetén az alkalmazott vakcinák különbözők, pl. előnyösen a fentebb említett típusúak lehetnek.

A találmány tárgyát képezik továbbá a találmány szerinti vakelnázásl eljárásban alkalmazható inaktivált vagy alegységvakcmák is.

CHV alegységek alkalmazásáról ezldáig csak egerek esetében számoltak be (limcumpao, X A, és mtsai,: X Vet. Med. Sci. 54, 423 (1991)3· Amint azt a szerzők is megállapították, az egerek esetében kapott adatok nem vonatkoztathatók automatikusan a kutyára. Bár a tisztított gp 145/112, gpSO és gp47 jelö tisztított glikoprotemekkei kiváltott ellenanYagtitefek kimutatható mérlek» eiienanyagválaszt eredményeztek, nem ismert, hogy ez védő hatású volt-e, mivel az egér nem fogékony a CHV-val szemben igy virulens fertözéses modell kialakítására sem alkalmas. Mindemellett a CHV-fertözés kiváltotta sejtes immunválaszról sem rendelkezünk információval Az egerekben és kutyákban elért elienanyagtlterek közötti összefüggés sem ismert, lehetséges, hogy ezek eltérőek. Kimutatták például hogy a szarvasmarha herpeszvírus 1. típusú gl glikoprofelnjével immunizált nyilakban magasabb neutralizáló titer alakult ki, mint a gHI-tnal imm«ísi2áitakbas, mig szarvasmarhában a glV váltja ki a legerősebb neatr&lizálo választ és a gl a legkevésbé immtsnogén. Ezek az adatok is a iaboráliatokban kapott adatok más eéifejokra történő kivetítésének nehézségét támasztják alá.

A vemhes szakák maktivált vagy alegységvakcinával a találmány szerinti megoldásnak megfelelően történő vakcmázása az anyaállatra és utódaira nézve egyaránt veszélytelen, A vemhesség végén adott megerősítő vakeinázással a nenírahzáió ellenanyagok optimális fialáskori titere biztosítható. Ez a titerérték határozza meg a szukától a kiskutyáknak a szoptatás kezdetén átadott neutralizáló ellenanyagok által biztosított védettség mértékét.

A CHV fenntartása és elszaporfíása előnyösen elsődleges kuíyasejteken vagy -sejtvonalos történik, pl. kuiyavese-sejteken, közelebbről MDCK (Madm-Darby Caníne Kldney, CCL-34 ATCC deponálási szám) sejteken, sejtesként 50%-os szövettenyésset fertőzési dózis (fissue cultnre mfécíive dose 50%^!f, TCIDjo) 04* Ő,Ő01 fertőzési multíplieitásávál f'maltlplicíly of infeerion”, tnoi), előnyösen ö,öl TCíDjysfijt adaggal, A CHVt a fertőzést kővetően 3-4 nappal nyerik ki. A tenyésztéssel körülbelül lö^s~lö³ TCiB^/mi, rendszerint HF’⁵1Θ'-* TClDjy/ml vlrustiter érhető el.

Inaktívak vakcina előállítása érdekében előnyösen kinyerését és tisztítását követően a CHV-t kétníai[pl. formaim vagy formaldehid, β-propiohkton, etílémmm, bináris ettlét)imirí (BEí)] és/vagy hőkezeléssel iaakíiváljuk. A találmány szerbit vírus maktiválása előnyösen etílémminnel történik. A virusrészecskék feagyományos koncentrálási eljárásokkal, pl. ubraszüressel koncentrálhatok, és/vagy hagyományos tisztítási eljárásokkal pl, gélszűréssel, szacbarózgrádiensen történő ulíraeessrifugáiással vagy pl polretílén-glifcoi (PEG) jelenlétében történő szelektív preelpítác lóval íisrihhatók.

A találmány szerinti alegységvakeina előnyösen extrakclós alegységvakcina, -amely teljes vírusból vagy (pl. a burok eltávolítása alán) a vírus egyik íő frakciójából készül Közelebbről, a vakcina a különféle hurokbeli glikoproteineket vagy azok keverékét, tartalmazhatja. Az aiegységvakcinák előnyösen pl. a fentiek szerifit maktivált virusszuszpenzíóból készülnek. A főként burokbeli glikoproteinekeí tartalmazó alegységvakcina előállításához előnyösen a fentiek szerint inaktivált vírnssznszpenziöf megfelelő detergenssel, közelebbről nem-ionos detergenssel, előnyösen 12-15 közötti HLB-értékü etoxllált alkohollal kezeljük. A vírusburkot ezután előnyösen ultracentrifugálással távolttjuk el. Szakember szántára a burok eltávolítására és a burokbeit ghktsproteinek kinyerésére alkalmas más, egyenértékű eljárások is ismertek lehetnek.

ínaktivált- vagy alegységvakeina előállítása során az antigént állatgyógyászati szempontból elfogadható hordozó- vagy kötőanyaggal elegyítjük, majd a keverékhez előnyösen állatgyógyászati szempontból elfogadható adjuvánst adunk. Az antigén tnennyisége adagonként kb. lö' - kb, 1Θ⁹' fClD5Í!, előnyösen kb. lö⁵ kb. Í8^S TCÍDs» inaktiválás előtti literrel egyenértékű. Közelebbről, inaktivált vakcina esetében az inaktiválás előtti thetérték adagonként kb, lő? - kb, IÖ⁹ TCÍDjo, előnyösen kb, lő® - kb, lő® TCl&se közötti. Közelebbről alegységvakeina esetében az inaktiválás előtti tlterérték adagonként kb. ÍÖ⁶ - kb. lö⁹”' TCID505 előnyösebben kb. IO^; - kb. iö‘^? TCIDjo, még előnyösebben kb. IÖ⁷' - kb, tő*^-’ TCIDjo közötti. Az alegységvakeina előnyösen adagonként (ELISA alapján) kb, ő.öl ug - kb, 30 pg, közelebbről kb. 0,1 ng - kb. lö .gg, előnyösen kb, 0,3 μ§. - kb. 3 pg gB giikoproteint tartalmaz.

A találmány szerinti vakcinák kiszerelt alakban 5°C-ob, vagy előnyösen stabilizáiőszerrel, közelebbről SPGA-val (szacharóz, foszfát, glutamát, alhumin; EP-B1.-ÖG0825S számú európai közzétételi irat) lioíílízáítan tartósíthatok és tárolhatok. Ezek a vakcinák később (vivőanyagot vagy kötőanyagot és/vagy adjuvánst tartalmazó) oldószerben oldhatók,

A találmány szerinti vakcinák adinválására (I) alummlum-hidroxid; (2) akrilsav- vagy metakrdsavpolitner. rnalsinsavanlrtdriá-poimref vagy aikenil-számiazékat (3) imutnsíímoláló szekvencia (ÍSS), közelebbről egy vagy több nem-metilált Cpö-esoportot tartaimaző oligo-deHtxirihoKítkleotid-szekvencía alkalmazható [Klinman, D. M. és mtsal: Proc. Natl. Acad, Scí. USA 93, 2879 (1-996); WO-A-9816247 számú nemzetközi közzétételi irat]; vagy (4) az. hmnunogén- vagy vakcínakészítroény kiszerelhető olaj a vízben típusú emulzióként, amilyen pl. az SPT emulzió p'Vaccíne Design, The bábuéit and Adjuvaní Approach, ρ, 147. szerk.: Pweil, M, és Newman, M>, kiad.: Plennm Press (1995)] vagy az MF59 emulzió (ugyanott, p. 183).

Az olaj a vízben emulzió alapját képezhetik pl. a könnyű. folyékony parafílnolaj (European Pbaruiacopoea); izeprenoid olaj, pl. szkvalán vagy szkvalén; alkének, pi. izobntén vagy decéu öiigötnerizálásáfeói származó olaj; egyenes alkrlcxoportot tartalmazó savak vagy alkoholok észterei, közelebbről sövényt· olajok, efiloleát, propilénglikol ditkaprilábkaprát), glicertl trt(kaprilábkaprát) vagy propiléngldtol dioleái; elágazó láncú zsírsavak v&gy alkoholok észterei, pl. izosztearínsav-észterek. Az emulzió kialakításához az olajat enmlgeálószerekkel kombináltan alkalmazzuk. Az emulgeáiőszerek előnyösen nem-ionos szöriaktánsok, közelebbről szorhitáu-észíerek, manmd-észterek (pl. anbidromamhtoi-oieát), glicerin-észterek, políglicerin-észterek, pröpilénglikobészterek vagy adott esetben etoxílált olajsnv-, izosztearinsav-, ricioolajsavvagy hídroxísztearinsav-észterek, vagy poiioxlpropiién-poiioxíetíién kopolimer blokkok lehetnek, pk ilyenek a Pluröníc* termékek, elsősorban az L121,

Az akrilssv- vagy snetakrilsav-poiimereket cukrok vagy polialköholok polialken.il étereivel keresztkötött formában alkalmazzuk. Ezek a vegyüietek karfeomer” néven Ismertek [Fhttrmesropa &, (1996)]. Szakember számára ismert lehet a kitanitás részét képező 2W9442 számú amerikai egyesölt államokbeli szabadalmi irat, amely legalább három, de előnyösen nem több mint nyolc hidroxilcsoportot tartalmazó polihiároxílált vegyítette! keresztkötött ákrilpolimcreket ismertet, amelyekben legalább három hiöroxilesopori hidrogénatomját legalább két szénatomot tartalmazd telítetlen alifás gyökökkel helyettesítették. A gyökök előnyösen 2-4 szénntomszámd vinílek, allilek és egyéb telítetlen: etilént tartalmazd csoportok. A telítetlen gyökök maguk Is tartalmazhatnak egyéb szubszthuenseket, pl, metílcsaporíot. A találmány szerinti megoldás szempontjából Icülönösen alkalmas a Carbopol*” (BE Goodrich, Ohío, VSA) márkanév alatt forgalmazott termékek alkalmazása. Ezen alliiszaobarőzzal vagy allll-penlnerítritollal keresztkötőti készítmények közül említési érdemel a Carbopoi® 974P, a 434P és a 9I7P,

Á maleinsavatthídríd és egy alkenílszámtazék kopolimerei közül az “EMA*” termékek (Monsanto) alkalmazása előnyős, amelyek nmle'msavanbidrld és etilén egyenes vagy pl. dívinil-éterreí keresztkötötí kopolimerei [ld. pl, a következő, a kitanitás részét képező referenciát: Fielás, 3, és mtsai.: Natare 186. 77S (19öö)]. Szerkezetüket tekintve az akrilsav- vagy metakrilsav polimerek és az EMA* termékek előnyösen az alábbi, I. általános képlettel leírható egységekből épülitek fel:

ahol,

- Rj és R-jelentése H vagy CFlj, ezek azonosak vagy eltérők egyaránt lehetnek

- X jelentése Ö vagy 1, előnyösen xjelentése 1,

- y jelentése 1 vagy 2, ahol x + y ~ 2,

Az EMA® termékek esetében x jelentése Ö, y jelentése 2. A karbomerek esetében x és y jelentése egyaránt I.

A végleges vakema-készitményben a polimer koncentrációja 0,01 - 1,S vegyes (W/V)%» közelebbről 0,Ö5 - 1 vegyes®!, előnyösen Ö, 1 -0,4 vegyes®!,

Különösen előnyösnek számit az anhídromnnnííol-Cíleátot, etoxíiált olajsavat és könnyű folyékony paraffátoiajaí tartalmazd olaj a vízben emulzióval kiszerelt inaktiváit- vagy aicgységvskcína. Közelebbről, a vemhes szukák vakemázására alkalmazott találmány szerinti eljárásban ilyen vakcina beadására kerül sor. A vakcinát a lentebb ismertetett sémának megfelelően két alkalommal, előnyösen bőr alá adagoljuk, az első injektálást .7pl. a vetnhesség első hattnadában, dönyösea 10 nappal a termékenyítést kővetően,, a másodikat pedig a vetnhesség utolsó harmadában, előnyösen a fialás- várható időpontja előd kb. 10 nappal adjak be.

A találmány tárgyát képszí továbbá a tslátoáay szerinti inaktiváit- vagy alegységvaketaa előállítására szolgáló eljárás ia,

A találmány tárgyát képezik továbbá az inaktiváit kntyahsrpeszvírus-vakeinííkotnponenst (vaiency”) vagy kutyaherpeszvlrns álegységv-akcina-komponensét, valamint legalább egy, egyéb, kutyát tnegbetegítő kórokozó elleni legalább sgy vakcinakomponenst állatgyógyászati szempontból elfogadható vivőanyagban vagy kötőanyagban, előnyösen adjnvánssal különösen a fentebb ismertetett adjövánsok egyikével együtt tartalmazó miilrivalens vakcinák.

Az egyéb, kutyát megbeíegííö .kórokozó többek között kutya szopornyica vtrss, kutya parvovíros vagy kutya adenovírns lehet.

A találmány szerinti inaktiváit vagy aiegységvakefoák az egyéb vakcinakomponessekksl egy időben, ugyanazon készítményben, vagy egymást kővetően adagolhatok. Az egyéb vakcmakomponensek aíteaaáft élovsrnsos vakcinák, inaktiváit-, alegység-, rekombináns- vagy polímrkleotíd vakcinák egyaránt lehetnek.

Ennek megfelelően a találmány tárgyát képezi muiíivalens vakesnakészlet vagy -csomag, amely elkülönítetten csomagolva állatgyógyászati szempontból elfogadható vivőanyagban vagy kötőanyagban, előnyösen adjnvánsssl, különösen a fentebb ismertetett adjavánsok egyikével együtt kiszerelt találmány szerinti CHVy&kcinakomponensi, valamint legalább egy, egyéb, kutyát megbetegítő kórokozó elleni vakeínakoinponensí tartalmaz. A találmány szerinti C.HV vakeinakomponens a másik kutyavakeína-kornponens, különösen egy attenuáit, rekombináns vagy polirntkleotid vakeinakomponens KoSifeált alakjának oldószereként szolgálhat.

A következőkben a találmány oltalmi körét nem korlátozó példák segítségévei részletesen ismertetjük a találmány szerinti megoldást.

Végsőm

Vizsgálatainkban az F205 jelű, az ATCC-íől VR-647 deponálási számon beszerezhető kttíyaherpeszviras-íörzseí használtuk [Carmtehael, 1... E.: Am. I, Vet. Kés. 26, 1965-803 (1965)],

KutyafeertMsszylrus elszaners'tása

Kutya sejtvonal (Madin-Darby Canine Kldhey, bíDCK, CC134 ATCC deponálási szánt) sejtjeit 2 literes forgópaiaekokban (85B cm²) 5% magzati horjúsavövai (Sayer Diagnosties) és 50 mg/L gentanaíeiraael kiegészített Dolbeceo-feie módosított Eagle-fele minimális esszenciális iápközegben (DMEM; Gíbeo BRL) '350 mi térfogatban 2ÖÖÖÖ0 sejkral koncentrációban tenyésztettük. A sejtfenyésztést'37°C-oö, 5% CO>-t tartalmasé légkörben folytattuk.

A tenyésztés 3. vagy 4, napján a sejtréteg kotíllnens állapotot ért el. A tápkőzegeí ekkor szérnmmentes, de 50 mg/L gentamicinrtel kiegészített DMBM tápközegre cseréltük, majd a sejteket 0,01 mól TCIBjt/sejt ktítyaherpeszvirussal (1, példa) fertőztük. A tenyészetet továbbra ís 3?°C-on tartottak.

g ' '*· »»»« ** *·* **·

A citopatogén hatás teljessé válásával (kb. % órával a tenyésztés kezdetét követően) a vlrusszuszpenzíót kinyertük és -TG^C-ra fagyasztottuk, A. kívánt vírusmenoyíség függvényében az ínokulácíót megelőzően be lehet iktatni több seítsekszorozó passxálást is. A sejtpasszálást és a virnstesyésztést biogenerátorban, a sejtek tnikrohordozón történő tenyésztésével is ei lehet végezni.

A következő lépések végrehajtásáig a vírust 5'C-on tároltuk.

A CHV litere a kinyeréskor lő'' 'FClDCrnl volt.

CM»

A CHV bírálási 9ő üregű tálcákon, 5% magzati borjúsavóval és 50 nagÁ gemarríieirtnel kiegészített FÍ5 tápközegben végeztük. A tálca üregeiben a vírusszoszpenziö kb. háromszoros hígításait MDCK sejtszuszpenzáöval kevertük össze 0,1$ ssVörng térfogatban ő,lő ml vdnsshigités/100000 sejt aranyban. 37^:C-on, 5% CQj jelenlétében 4-5 napig tartó inkobálást követően meghatároztok a generalizált eitopatogén hatást mutató üregek számát, majd ez alapján Kárber-ísódszer szerint kíszáznkotíttk a tlterériéksí (TCID^).

V1 r «sirs a ki 1 vá iás

A 2. példában leírtak szerint elszsporkott vírust kh, 12 mM eíílénímionel 3?°C-on 6 óra alatt úmkííváituk.

Az ettienhttint a felhasználás időpontjában készítettük el: 200 ml desztillált vízben 28,0 g. nátriumhidroxid granulátumot oldotlauk, majd ehhez -68,1 g brómetilamtni (BEA-t.) adtunk, ami 1,2 M etilénimmoldatnak feleit meg [Bahsemann, H,: Arch. Virot 47, 4? (1975)]. Az Írtaktíváit vlrnsszuszpenziót ültrassíte típusú ulírafíltráeíős kazettával (Eiteon) 300000 Da küszöbérték melleit lOO-szorosára könceníráítuk, A koncentrált, inakíiváh vírus ~4Ö-'C~on tárolható.

5. pé/da

A virus-glíkooroteínek kivonása

Az- inaktívált vírust (4. példa) 2500 g-n 30 percig történt cenirí&gáiússai kitisztítottuk. A felüíúsző folyadékot ííltrasette” típusú ultraStrációs kazettával (Fíitron) 300000 Da küszöbérték mellett SG-szeresére koncentráltuk. A koncenírátumhoz 8 vegyes (vy/v)% políetilén-giikoi SÖÖO-ei (PEG 8000) és 4 vegyes% sátrittm-kioridot adtunk. 4°C-os lő órás át végzett íttkuöálást követően a precipitátódoít vírust 2500 g-n őö percig végzett centrifugálással ülspítettúk, majd foszfátpufferben oldottuk (PBS: 8 g/l NaCl; 0,2 gd KCk 0,2 gzí KííjPOiű 134 gd NsoHPöü · 2 FBO}, Az oldatot ezután az eredeti térfogat 1 századnyi mennyiségében izotóntás feszfatpníferbe.n kevertük «1. A virtjskoncenírátnmot szacbzrőzpárnán zonális vagy TÍ45 típusú állandó szögű rotoron zónák» albaeenirífügálásnak vetettük alá (35% és őö% PSS, .280000 g, 60 perc). A vírust kinyertük a határfelületről, majd PBS-ben megközelítőleg négyszeresére hígítottuk. A következő lépésként 1,5 vegyes% lö Eö eetiiaíkoholt (etoxslált alkohol, HL8 ~ 1 3) adtunk hozzá majd a keveréket 3?*€-on egy órán át Inkubáltuk. A kapszidokaí ezután 230GOÖ g-n egy órán át Ti típttsű rototral végzett uhracentrtfogálássaí kíülepítetttlk. A

-9< <·. *«ι » » * « « * *«* * * * »»«« »» glikoproíeirsekeí tartalmazó- ísíüíúszót begyűjtöttük. A giikoproíeiu -óidat adott esetben íütraszöréssel is koncentrálható.

A tisztítóit gllkoproteíneket tartalmazó oldatot a vakcina kiszereléséig -4Ö^eC-en tároltuk.

yakebafegerglfe .A kííucentráít inakúvált antigént (4. példa) vagy az alegység-oldatot (S.péída) felolvasztás után az adagonként! kívánt antigénmenayiség függvényében PBS-sel .hígítottuk.

Az adjuvánst tartalmazó vakcinát a következőképpen készítettük el: 8 ml alegységet vagy inaktiváit vírusantigént és 159 ml PBS-t tartalmazó 167 ml vizes fázist 7 vegyes?» anhldromannitol-öleátot, 8 v«gyes%- 11 EO (etílénoxíd) etoxiiált olajsavat és· 8.5 térfogaí% könnyű folyékony paraffinolajat (Eoropeau Pfearmaeopea) S3 mi olajos- fázisban Sílverson típusú emnigeáló tarbomíxsr segítségével 32^sC-on 2 percig emalgeákunk. Az olaj a vízben emulzió alakjában kiszerelt vakcinát 5^yC-on tároltuk.

A vakcina előállításának alternatív módjaként 5 vegyes% szkvslán, 2,5 vegyes% Elurome® 1.121, 0,2 vegyes?» elaisav és 20 EO-val etoxiiált bidroszorbitol észter, valamint 02,3 térfogati, a felolvasztás után 30» szoros arányban PBS-sel hígított virusantígén keverékét őöó bar nyomáson 30«40^CC hőmérséklet között Y110 típusú nagy-nyomású homegenizáló-berendézéssn (Mlcroflskfe Corp.) háromszor átbocsátva emulgeá-liak. Az olaj a vízben emulzió alakjában kiszerelt vakcinát 5“C-on tároltuk.

A vakcina kiszerelésnek egy további alternatív módjaként fiziológiás sóoldathan (9 gd NaCl) Ö,4 vegyes?» Carbopol® 974P oldatot készítettünk. Az oldat pli-ját nátrium-hídroxiddai 7,3-7,4-re állitotiuk be. Ezt a Carbopoí-cláaíoí aztdás. a felolvasztást követően lő-szorosára hígított vírusantigénnsl egyenlő arányban elkevertük. A szuszpenzlő alakjában kiszerelt vakcinát 5^flC-on tároltuk.

A felolvasztást követően PBS-sel 15-szörösére hígított, -alegységeket tartalmazó- oldat (5. példa) 0,5 mi-ét 0,5 ml SEGA hofdizáló szubszárátboz adtuk f szacharóz, foszfát, gluíamát, albínóin; EP-B Í-ÖÖÖ82S5 számú európai közzétételi irat), A keveréket palackokba töltöttük, líofilizálfek majd 5^cC-oo tároltuk. A hígító a fentebb ismerteted adjcvánsokat foglalta magában, de a vizes fázisban csak PBS paffért tartalmazott.

/. peron

A neutraiizálö anti-CHV elleanoyagok bírálása

A titrákmdó szérumokat CHV-n.eöíralszáló képességük szempontjából vizsgáltuk. Az állatoktól nyert szérumokból 96 Sregű tenyésztöíá&ákon 5% magzati botjúsavővaí kiegészített DMEM tápközeggel háromszoros sorozaíhígítást készítettünk. Megközelítőleg 200 TCíD^vml CHV-t tartalmazó ö,05 ml tápkőzegei 0,05 ml hígított szérumhoz adtunk. Ezt a keveréket 3^oC-on 2 órás át 5% Cöj-t tartalmazó légkörben inkubáltuk.

Ezután mindegyik keverékhez míffiltierenként kb. lööÖOO sejtet tartalmazó MDCK sejtszuszpenzió 0,15 mi-ét adtuk. A citopatogén hatás (CPE) meglétét 37^cC»on 5% Cöj-t tartalmazó légkörben öt napig végzett inkubáiást kővetően fáziskontmszt mikroszkóppal vizsgáltuk. A szőnmmúníák neutraiízáló tiíerértékéf a Kárber-módszerrel számítottuk ki, A tjterérfekuek a citopafogén hatás kialakulását az üregek 50%-áhan meggát-ΙΟ« * ♦ Χ'φ.φ Φ Λ ♦Χ«Φ Φ X 4 # 4 « Φ9«φ Φ« XX «φ« tó legmagasabb hígítást tekintettek. A titerértókeket ioglO VNSÖ alakban adtuk meg, Mindegyik szérummmtát legalább kei, előnyösen pedig négy alkalommal tlíráituk.

A kísérletben használt 12 nem vaké mázok FÖPS beagle szakát véletlenszerben két hatos csoportra osztottuk. Az első csoportba sorok állatokat a paratFmoláj-alapú olaj' a vízbe® típusú emulzióval (6. példa) adjuvált ClíV afegységvakcmával hmmuíizáltuk, A másik csoportba sorolt állatok piaceb© vakcinát kaptak,

A szukákat két alkalommal szubkutást vakeináztuk, először a termékeny Itest követően kb. 10 nappal, majd kb, 10 nappal a várható Halas időpontja előtt. 1 tnl olajos oldószerben feloldott liofdizátutnot adtunk be az állatoknak, az adag Í0'’^? Τ€Π>$₀ inaktiválás előtti virustiternek feleit meg,

A hálás után az újszülött kiskutyákat 3 napos korban .50-100' TCID» virulens CHV-tőmsel fertőztük, pl. a Carmiehael által izolált F205-össel [Ám, 1. Vet. Rés. 26, 803 {1965)}, vagy a CHY 270-essel [HÍI1, Hz Am, J. Vet, Rés. 35.669 { 3974}], vagy a CHV C4012SE jelövei orcmazálissu (0,5 ml szájon át, majd 0,35-0,35 ml a kát orrnyilason kérésztől). A kölyköket a fertőzést kővetően három hétig fsgyelihk meg, feljegyeztük a klinikai tüneteket és az elhullásokat, Az elpusztult kiskutyák mindegyikét felboncoltuk. A kutyaherpeszvsrusfertózés okozta jellegzetes elváltozások jelenléte szempontjából megvizsgáltuk a veséket, a iépet, a májat, az emésztőrendszeri, a szívet es a bélfodri gangllonokat, a szervekből MDCK-sejiekea történő CHY-ízolálás céljából- mintákat vettünk, A herpeszvirus okozta usegbetegedést a kiskutya elhullása, a jellegzetes makroszkópos elváltozások és a vírasizolálás pozitív eredménye alapján diagnosztizáltuk.

Mindegyük vákcinázott szuka áthangolódott szerológiailag és a Hálás időpontjában magas neutralizáiő ellsnanyaglke.n'ei rendelkezett, A titerértékekei a. 6. példában leírtak szerint állapítottak meg és logiO VN5Ő alakban fejezőik ki.

Átlagos anti-CHY SN titer	Az első vískc mázás napján	A megerősítő vak- cinázás napján	A fertőzés napján	A fertőzés után három Ítéltei
i kontroll csoport	<0,24 ±0,00	<0,24 ±0,00	<0,29 ±0,13	<1,36 ±0,65
; vákcinázott csoport	<0,35 ±i).i?	< 1,04 ± 0,34	i,7ö±O,20	2,11 ±0,53

A vákcinázott anyától született kölykök közül egy sem baltóit el kutyaherpeszvirus-fertözés következtében (0,0.7). Ezekből a kiskutyákból nem sikerült CHV-t visszaizolálmtuk.

A nem vákcinázott szukák (kontroll csoport) kölykei között 62%-os, CHV-nek tulajdonítható mortalitást tapasztaltunk (38/29). A kölykök 55%-ából (16/29) a vírust is sikeresen izoláltuk. Rét kiskutyából származó minta bííksériamokkal szennyezett volt, így ezeknél a virusisoláiást nem tudtuk elvégezni,

A két csoport közötti mortalíiáshell különbség statisztikailag lényeges mártékh volt (Fisher-íele egzakt teszt; p < 0,0001).

Yorkshire terrier szukákat véletlenszerűen két csoportra osztottunk, majd az állatokat fertőzőit környezetben tartottuk. Áz első csoportba sorolt tizennégy állatot a parafhnoisj-alapá olaj a vízben típusú emulzió*

-πvai (δ. példa) adjuvált CH V alegységvakelnával immunizáltok, a másik csoportba sorolt hat állat plaeebo vakcinát kapott. A yákcáiázási protokoll a fentiekben leírtakkal megegyezett.

A fislásííát lemértük a született kiskutyák testtömegét.

A v&keinázott. anyától szíüeíatt 28 kiskutya testtömege (átlagosan 141,8 g) lényeges mértékben magasabb volt,, mint a kontroli csoportban született 14 kiskutyáé (átlagosan 85,0 g). A vakeinázotf csoportba» született kiskutyák testtömege iöó,8%-kal magasabbnak adódott. Az. említett különbség statisztikailag lényeges mértékű vek (Kruskal-Wallis-teszt, p < 0.01}.

Az eredmények alapján fertőzött környezetben a vakcinázás javította a szukák vemhesülési szintjét (Jevel of gestat ion”),

Á vakcinázott anyaállatokban a vemhesülé.si szint 82% volt (50/öi), míg a nem vakeinázotf szakák esetében az ő8%-nak adódott (' 19/28) (Fisber-féle egzakt teszt, p - 0,11).

A csatolt igénypontok által megbatározott találmány szerinti megoldás nem korlátozódik csupán a fentiekben bemutatott specifikus megvalósítási módokra, hanem magában foglalja azok találmány hatókörébe és szellemiségébe tartozó változatait is.

Claims

SZÁBAIMLW IGÉNYPONTOK

L CHV-antigén (k^afeejpeszvfrw-sastfgé»}· alkalmazása katyakölyköfassk kutyaherpeszvirosíertöxés ellen védelmet nyújtó, a vemhes szakának a flsíás várható időpontja előtt 1-15 nappal, előnyösen 5-15 nappal történő beadásra szolgáló vakcina előállítására, amely vakcina inakhvák CHV-fc, atíenuált CHY-í, CHValegységet, rekombináns mádon expresszált antigént vagy CHY-giikoproíein-kivonatot és adjhvánst tartalmaz,
2. Az {. igénypont szerinti alkalmazás, amely szerint a vemhes szakában a fsalás Időpontjára 0,9 ioglö vagy annál magasabb, előnyösen 1,2 lóg 10 vagy annál magasabb CHY-efleni ellenanyagtkert kialakító vakcinát alkalmazunk.
3. Az i. vagy 2. igénypontok: bármelyike szerinti alkalmazás, korábban CHV vakcinával immunizált szuka vakcmáiására,
4. A 3. igénypont szerinti alkalmazás, amely szerint a vakcmázásökal legalább 2-3 hét különbséggel végezzük, vagyis az első vakcina beadására az ivarzás és. az előző vakclnázás előtti két-három héten belül, közelebbről az ivarzás és a vemhesség első harmadának vége között, előnyösen a termékeny ítést kővető 7-10 nappal kerül sor.
5. A 3. vagy 4. igénypont szerinti alkalmazás, amely szerint a vakcinák megegyezöek, ő. A 3. vagy 4. igénypont szerinti alkalmazás, amely szerint a vakcinák eltérőek,
7, Az 1. igénypont szerinti alkalmazás, amely szerint a vakcina CHV alegységeket tartalmazó extrakciös alegységvakcína,
8, Az 1, vagy 7. igénypötst szerinti alkalmazás, amely szerint a vakcina CHV burok-giikoproteíneket vagy azok keverékét tartalmazó vakcina, amely keverék előnyösen nem tartalmazza a kapszidfehérjét.
9, Az 1-8, igénypontok bármelyike szerinti alkalmazás, amely szerint a vakcina állatgyógyászati szempoötixM elfogadható vivöanyagot vagy kötőanyagot és adjuvásst tartalmaz.
10. A 7-9. igénypontok bármelyike szerinti alkalmazás, amely szerint a vakcina adagonként kb. IQ⁵ 1 θ’-⁵ TCIDso inaktiválás előtti titerrel egyenértékű antigénmennyiséget tartalmaz,
11. Az 1 -lö. igénypontok bármelyike szerinti alkalmazás, ahol az adjuváns aiamíninm-hídroxid.
12. Az l-IÖ, igénypontok bármelyike szerinti alkalmazás, ahol az adjaváas akrilsav- vagy metakrilsav-polimer vagy maleinsav-anlnárid és alkenil-származék polimerje.
13. A12. igénypont szerinti alkalmazás, ahol az sdjuváns allil-szaeharózzal vagy allil-pentaerítritollal keresztkőfőtt akrilsav egy vagy több polimerje.
14, Az l-IÖ, igénypontok bármelyike szerinti alkalmazás, ahol az adjnváns immunstimuiáló szekvencia.
15, A 7-10. igénypontok bármelyike szerinti alkalmazás, amely szerint a vakcina „olaj a vizber?” emulzió vagy karlmmer-szuszpeozió formájában kiszerelt vakcina.

lő. A 15, igénypont szerinti alkalmazás, amely szerint a vakcina vagy' anitidromannitol-oiedtot, etoxiláit olajsavat és könnyű folyékony parairsnoiajat, poiioxipropilén-pölioxietiién kopoiimer blokkok, Pluronic ®~ot, szorbitán-, etoxiláit olajsav- és szkvalán-esztert, vagy Carbopol®-szuszpenziöt tartalmazó emulzió formájában kiszerelt vakcina.
17. Az 1-10, igénypontok bármelyike szerinti alkalmazás, amelyben a vakcina kémiai és/vagy hőkezeléssel inaktívak CHV-vímsból állítható elő,

Í8. Áz 1-10. igénypontok bármelyike szerinti alkalmazás, amelyben a vakcina CHV-tenyészet detergenssei történd reagáitatásávai állitható elő.
19. Á 18, igénypont szerinti alkalmazás, amelyben a áeíetgens nem-ionos detergens.
20. A 19. igénypont szerinti alkalmazás, amelyben a detergens 1.2-15 HLB értékű etoxiláií alkohol, előnyösen IS EO cetilalkohol,
21. Az 1-1Ö. igénypontok bármelyike szerinti-aikabnazás, amelyben vakcina0,Öl pg~3Ö pgíELÍSAval megállapított) titerű .gB gíikoproteto tartalmaz.