HU227508B1 - Soluble lymphotoxin-beta receptors and anti-lymphotoxin receptor and ligand antibodies, as therapeutic agents for the treatment of immunological disease - Google Patents

Description

antitestek alkalmazásé terápiás ágensként Immunológiai betegségek kezelésére

A találmány tárgyát ^wllmfotoxin~P~receptort blokkoló ágensekét tartalmazó készítmények és olyan eljárások képezik, amelyek a llmfotoxln-0-receptor .szignáirendszert blokkolják. A iimfotoκΐη-β-receptorfc blokkoló ágensek limfociták által közvetített immunológiai betegségek kezelésére alkalmasak, pontosabban a Thlsejtek által közvetített immunválasz gátlására. Λ találmány tárgyát iimfotoxin-p-receptor extracelluláris dóménjének szolubiiis formái képezik, amelyek limfotoxin-p-reoeptort blokkoló ágensként viselkednek. A találmány tárgyát képezi olyan antitestek alkalmazása is, amelyek vagy iimfotoxin-β-receptor ellen vagy annak liganduma, a sejtfelszíni limtotoxin ellen termelődnek, és amelyek limfotoxin-^-receptort blokkoló ágensként hatnak. Sgy űj szűrési (soreening) eljárás is a találmány tárgyát képezi szóinbilis receptorok, antitestek és más olyan ágensek, szelektálására, amelyek blokkolják az L?-|$™receptor-szignálrendszert.<

Sgy immunreakciő beindulásakor felszabaduló oltok!nek öszszetéöele képet befolyásolni azt, hogy azt követően melyik lmmunef fekfor-tolyamatsor aktiválódik. Az immunét f ek.tor-mech.anizmos típusok közötti választást a CDs-pozitív helper T-limfociták (T~heiper.sejtek vagy Th-sejtek) közvetítik. A sejtek kölcsönhatásba lépnek az antigént hordozó sejtekkel (AsC), amelyek felületén a reakcióban résztvevő idegen antigén pattidfragmentumai a

II. osztályú AHC-antigénekkel asszociál tan vannak jelen. A Th~ -sejtek akkor aktiválódnak, amikor a megfelelő AAC-k felületén >frfr* frfrfrfr * frfr X * fr fr x ♦ x V frfr o > fr fr fr frfr Xfr jelen lévő Idegen antigén meghatározott epitöpjait felismerik, asoeiyre a Th-sejtek spéciéi kos receptort exp re es tálnak. át aktiválódott Τη-sejtek viszont citokineket választanak ki (iimfc— kinek)_f amelyek a megfelelő eéfefctormechanizmust aktiválják.

A sejtek különféle elfektet mechanizmusokat képetek aktiválni, beleértve a káliét T-sejt aktiválást, B-sejt antitest-termelést és makróéág-aktiválást. Az efrektor mechanizmusok közötti választást nagymértékben befolyásolja az, hogy az aktivált T-sejtek milyen oitokineket termelnek.

A Th-sejtek három alcsoportra oszthatok a citokin-szek™ réeiös jellemzőik, alapján [ Pitch et al., Ann, Rév. Immunoi, 11, 29-48 (1993)] « Ezeket as alcsoportokat Thö-, Thl- és Thz-vei jelöljük. Egérben nem-stimulált, naiv T-helper sejtek XL-2-t termeinek. Rövid ideig tartó stimuláció ThO-prekurzor sejtekhez vezet, amelyek sokféle eltekint termeinek, például XKd-y-t, IL-2-t, lL-4-t, IL-5-t és I'L-10-et. Krónikusan stimulált Thö~sejte.k differenciálódhatnak vagy Thl- vagy Th2-sejttípnssá, amelynek következtében a citokin-ezpressziös jelleg megváltozik,

Réhány eitokin-tapust mind a Thi-sejtek, mind a The-sejtek kibocsátanak, (például XL-3, GM-CSF és TKF) , Más eitokin-típust kizárólag az egyik vagy másik Th-aejt-alesöpört termei. A T-heiper sejt-alcsoportok speciális hatásait, először egérben ismerték fel, A T-helper sejtek hasonló alosztályai léteznek emberekben is [ Romagnani et al., Ann. Rév, Immunoi. 12, 227-57 (lsük)j .

A Thi-sejtek LT-a~t, IL-2~t és lEh-y-t termelnek. Emberekben a Thl-típusú cltekinszekréciö általában a celluláris immunitással és a fertőzések elleni rezisztencrával asszociált. A Thl„ 7 *·.·> ,·· ··.$'

-citokinek m&krcfágok aktiválásénál ás bizonyos gyulladásos lmmunválaszo'knái játszanak szerepet, például a XV. késleltetett típusú’¹' hipe.rszan.zitivitás esetén (lásd lentebb) . A Tb.l~c.ito~ kinek fontos szerepet játszanak a szövetátültetések (graftok) és szervtranszplantátumok kilökésében.

A Thz-sejéek 11-4-, IL~6~ és XL~10--oitokineket termelnek. A Th2-citokínek megnövelik az e.ozinoíil és „hízósejt” (mást cell) termelést, és elősegítik a B-sejtek teljes expanzióját és érését í Howard et al., T ceil-dsrived oytokines and their receptora’', fundemental Xmmunology”, 2. kiadás, Baven Press, New York (1593)) , A Th.2~citokínek .fokozzák az antitest-termelést is, beleértve ez allergiás immunválaszokkal és az antí-graít antitestekkel asszociált XgE-antitesteket, A Th2-sejtek részt vehetnek az immunszupresszióban és perzisztens antigének elleni toleranciában Is.

A Thl- és Th2-sejtekkei asszociált citokinek szerepet játszanak bizonyos hiperszenzitív immunválaszok, azaz egy korábbról már ismert antigénnel velő érintkezés esetén fellépő nem megtelő vagy aránytalan immunválaszok kialakulásában. A hiperszenzitívitásnak négy ismert típusa van { Roitt et al,, Immunology” 19.122.12. old.. (dosby-Year Book Etrope Ltd., 3. kiadás, 1553)) .

Ar X. típusú, azonnali hiperssenzitívitás”-hoz tartozik az aliergén-indckélt Th2-sejtes aktiválás és a Thr-citokin felszabadulás. A Th2-citokinak közé tartozó XX,-4 stimulálja a 3-sejteket olyan ize·típusba való átalakulásra, amelyek igb-t termelnek, amely aktiválja a ^hízósejteket akut gyulladásos reak-eiék kiváltására, amelyek ekcémához, asztmához és rhinítis-hez veret

X*

Α Π. és III. típusú hiperszenzítivitásfc azok as IgG- és IgM-antitestek okozzák, amelyek a sejt felszíne vagy szövetspeoifikus antigének {IX. típus} vagy szolubilis szérum-antigének (XXI. típus) ellen termelődtek, Ismereteink szer ifit a hiperszenzitív reakciók esen típusait nem Th~sejtek közvetítik.

A IV. ''késleltetett típusú hiperszenzitivitás (D?H) Thlsejt-közvetxtett. A Din-reakciók kifejlődése több# mint 12 órát vesz igénybe# és sejt-közvefciteét-nek tekintjük, mivel egerek között Thl-sejtekkel átvihető, de kizárólag szérummal nem. A IV, típusú D1H-immunválaszok általában három típusba osztályozhatók: kontakt, tuberkulin-tipusú és granuloma hlperszenzitlvitás.

Több olyan sejt-közvetített Immunválasz, amely megbetegqedést okoz, indukálható egészséges egerekben limfociták átjuttatásával beteg egérből (például as inzulin-függő cukorbetegség és a kísérleti autoimmun encephalitis). Ez a jelenség különbözteti meg a IV. típusú DTH-t a másik három típusú, híperszenzitivitástól, amelyek elsősorban antitestek okozta humorális immunválasszal járnak együtt, amelyek sejtmentes szérummal is átjuttathatok ,

A T-helper sejtek szintén részt vesznek as irmmunoglobuiin izotipus-átalakulásanak de novo szabályzásában- Különböző Th~al~ csoportok hatással lehetnek adott izotipusú immunoglobulinok relatív arányára a fartőrésre adott immunválasz során. Például a Th2~citokznek közé tértére IL-i képes aktivált B-sejteket IgGÍ~izo-~ típussá alakítani, és elnyomni más izotóposokat. A fentebb leírtak szerint az XL-4 szintén aktiválja ar IgE túltermelést ez X, ís.iío/ss > * Φφ X * ΦΦΦ φ φφ * φ -φφ φ φ * ♦ Φ X φφφ >

* X Φ * φφφ

ΦΧΦ #ν χ « φφ típusú hipe.rs28n2if.iv reakciók esetén. A Th2-cltokinekh.es tartozó IL~5 az IgA-izotipust indukálja< A Th2-cifok.inek izotípusátalakulásra kifejtett csen hatásait a Thl-sejtek által termeit lFb-γ ellensúlyozza,

Öcy tűnik, hogy a Thl- és Th2-sejtek által szekretált citokinek különböző összetétele at immunválaszt különböző insnuneffektor mechanizmusok felé irányítja. Az átalakítás, amely vagy sajt-közvetített, vagy humoréiis eriektormechanismust aktivál, a Thl- as Th2~sejtek közötti kereaztazuppresazieval szenzitizálődik; a Thl-sejtek által termelt IFN-y gátolja a Th2~sejtproiiferációt, és úgy tűnik, hogy a Th2~sejtek által szekretált XL---10 csökkenti a Tál-sejtek citokin-szekréciöját.

A oitokineknek célmolekuiáik irányában kifejtett relatív affinitásétól függően, a Thl és Thz negatív szaháiyzöcikiusok amplifiká!hatják a Tál- ás Th2-citokinek közötti kis koncenfe~ áráciékülönbségek hatásait. Egy amplifikált Thl- vagy Th2-ci~ tokín-szrgnál fokozhatja az átkapcsolást a sejt-közvetített vagy a humoréiis effektormechanizmusok között, a Thl- és Th2-citokinek relatív koncentrációjában bekövetkező kis változás alapján, Az átkapcsolás említett kontroll jenek képessége a Thl- és Thz-oitokinek relatív koncentrációjának modulálása. által hasznos lehet a különböző Thl- vagy Thz-sejt-függő immunválaszok kiegyensúlyozatlanságainak kezelésében, amelyek immunológia.·. rendeliensségekhez és megbetegedésekhez vezethetnek,

A patológiás Thl-immunválaszok számos szervspecifikus és szisztémás uutoimmun-áilapottal, krónikus gyulladásos betegseggei. es késleltetett típusú hiperszenzitív reakciókkal assze•V:, r^:· v *

ciáltak, A fentebb tágyaltak szerint a Thl-imunválaszok szintén hozzájárulnak azokhoz celluláris inununválaszokhos < amelyek sz átültetett szövet (graft) és a transzplantált szerv kilökődéséhez vezetnek.

Ezekben a különféle Thl-sejt-alapú immunológiái rendellenességek kezelésében napjainkig általában immonmcdulátor és iminunszup rés szív ágenseket alkalmaztak, valamint számos, alig jellemzett mechanizmussal rendelkező drogot (például aranyat vagy peniciliin-amint}. Három általános immunszupressziv ágens használatos mostanában, szteroidok, edklosporin és azatioprin.

A szteroidok pleiotropikus, gyulladásgát16 ágensek, amelyek elnyomják az aktivált makrofágokat, és gátolják az antigént hordozd sejtek aktivitását úgy, hogy ellentétes hatásúvá alakítják a Thl-'-eitokinekhez tartozó lFK~y több hatását. A oíklosporin, egy potenciális immonszuppressziv ágens, a citokintermelést elnyomja, és csökkenti ez IL-z-receptorok expressziéját límfooltákon aktiválásuk alatt. Az azatioprin egy anti~proiiferat.lv hatású ágens, amely DNS-szintézist gátol. Ezeket a nemspecifikus immun™ szuppresaziv ágenseket általában nagy dózisban kell alkalmazni, amely megnöveli toxicitásukat (például nefro- és hepatotoxloitás), és nemkivonatos mellékhatásokat okoznak. Ezek tehát nem alkalmasak hosszútávé terápiák céljára.

A nem-spéci tikos inmunszuppressziv ágenseket alkaippzó szokásos kezelések által okozott problémák megoldására sok, jelenleg is széles körben alkalmazott terápiás stratégia tűzi ki célul az immunrendszer szelektív elnyomását. Különösen vonzó cél a Thl- és Th2-citokinak közötti egyensúly befolyásolása az eey~ ss mse/se φ·» ggensúiy eltolásával a sejt-kösvetitett és a hmsoralis effekformechanizmusok között.

A se j t -közvetítő tt és a hun-orális effoktormeohan izmusok közötti egyensúly eltolása hasznos lenne, mivel képes lenne modulálni egy olyan molekula aktivitását, amely a Thi- és Th2-sejtek alosztályainak relatív aktivitását eltolja. Ilyen molekulák lehetnek például citokinek és azok receptorai. A .közelmúltban közzétett adatok, alapján feltételezhetjük, hogy az LT-α, 1L-12, IFH-o ás IFt’-γ inkább a Thl-immunválaszok kifejlődésében játszanak szerepet, míg az IL-i és az 1L-4 a T'h2~e£íaktor mechanizmus felé polarizálják az immunválaszokat ( Romagnani et al., Ann. Rév. Immunoi. 12, 227-5'? (199«)] .

Több, Th-sejfékből származó oitokán az immunitás kifeféledésének és funkciójának pleiotropikus szabályzója, és torí melésük gátlásának káros hatása lenne a nem T-sejt-közvetltstt immunválaszokra. Kívánatos és hatékony célpontot még nem azonosítottak Thi- és Th2~effektorrnechanizmusok közötti szelektív modulációra.

A találmány szerinti megoldás a fentebb leirt problémákat oldja meg olyan gyógyászati készítményekkel és eljárásokkal, amelyek immunológiai megbetegedések kezelésére alkalmasak a limfotoxín-p-receptor (ύΤ-β-R) jelzőrendszer gátlásával, limfotoxin9'

-β-reoeptor—blokkolqágensek alkalmazásával. Pontosabban az LT-β“R-feiokkolqágenseket tartalmazó készítmények és eljárások hasznosak Thl-sejtiközvetitett immunválaszok gátlására, például gyulladásos béiozináréma esetén.

A találmány egy előnyös megvalósítási módja szerint a Hm-ai- ;u:

♦ φφ * ΦΦΦ * φ <

φφφ φ fotoxin-p-receptor extracelluláris öoméajönek szelubiiis formáit ''•φ' alkalmazzuk, melyek LT-p-R-blokkoigágensként viselkednek. A találmány ezen megvalósítási módja szerint előnyös készítmények es eljárások rekombináns limrotoxin-p-receptor fúziós fehérjét tartalmasnak, amely LT---B-R extracelluláris lígandumkötő doménnel rendelkezik egy immunoglobulin konstans nehéz láncot tartalmazó doménjéhez fuzionálva. Hág előnyösebben as LT-p-R iigandumkötő dómén humán. Fc-doménhez van fuzionálva.

A. találmány másik előnyős megvalósítási módja szerint olyan antitesteket alkalmazunk, amelyek X.i-p-R-biokkoiőágensként viselkednek. A találmány esen megvalósítási módja szerint előnyös készítmények és eljárások egy vagy több iimfotoxin~p~receptorra specifikus antitestet tartalmasnak. Még előnyösebben, az antitest monoklonális antitest. A találmány ezen megvalósítási módja szerint más előnyös készítmények és eljárások egy vagy több sejtfelszíni limfotoxinra specifikus antitestet tartalmaznak. A legelőnyösebben az antitest iimfotoxin-p-ra specifikus monoklónál is antitest·.

A találmány tárgyát képezi továbbá egy új szűrési eljárás LT-p-R-blokkolő^gensek, például LT-p-R szolubílis formái, antí.•á·

I-T-Ab-k és a.nti-LT-p~R~Ab-k szelektálására. Sz a szűrési eljárás tumorsejt™eitetozmtasi vizsgálati eljárásból ári, amely az LT™ -β-Η-jelzőrendszert vizsgálja. A vizsgálati eljárás megnövelt szenzitívitású humán adenokareinóma-sejbeket használ a iicandumvagy antitest-indukált LT-p-R™jelzőrendszerhez LT-p-R akitiválő ágens (például Ι.Τ™α1/β2) jelenlétében a tumor citotoxicitási vizsgálati eljárásban.

íiUUSK

Az ΙΤ-β-R-ólokkplöágensek gázokják az LT-α/β heteromér komp piexek (vagy más ηΐ-β-R aktiváló ágensek) citotoxikus tumorseb izekre kifejtett hatásait. A feltételezett iT-p-R-biokkoiöágensek tesztelésére alkalmazott eljárást as anti-LT-p-R-eilsnysgok esetére mutatjuk te (1Τ~α1/β2, ΖΤ-β-Η aktiváló ágens jelenlétében), és a következő lépésekből áll;

1) Tumorsejteket (például RT29 humán edenokareinóea-sejtekét) tenyésztünk néhány napig ,ΙΓΝ-γ-t és tisztított LT-al/pz-t tartalmazó tápközegben, az adott, vizsgálandó anti-LT-^-R-Ab jelenlétében vagy hiányában;

2) A sejteket egy élő sejteket megfesteni képes festékkel kezeljük; és

3) A megfestett sejtek számát ügy mérjük, hegy meghatározzuk ΙΖΓ-α1/β2» IFd-g és a teszt-antí-LT-^-R-Ab jelenlétében elpusztított tumorsejtek arányát az egyes mintákban. Ezzel párhuzamosan a túlélt sejtek számát is meghatározhatjuk számos jói ismert vizsgálati eljárás valamelyikével, amelyik a sejt életképességét méri, például ^H-timidin beépülésével DóS-be. Egy olyan anti--LT-B-R--Ab (vagy Ab-komblnácié), amely legalább 20%-kal képes csökkenteni az elpusztított tumorsejtek százalékos mennyiségét a vizsgálati eljárásban, a találmány oltalmi körébe eső tl-g-R biokkolóágesnek tekintjük.

A. citoiitikna vizsgálati eljárást ΑΤ~<χ/β heteromer komplexek és más ΑΤ-β-R aktiváló ágensek alkalmazásával, egymagában vagy kombinációban végezhetjük. A vizsgálati eljárás tetszés szerint adaptálható új LT-p-R-biokkoioáeensek azonosítására is,

1. ábra- A üganönmkotö domént ködőié humán 11-)0-receptor

6$ ,Z4Z/.SZ extracelluláris részének szekvenciája.

2, ábra. Szoiubilis, humán IcsGi-Fc-doménhez (mLT-p-R-Fc) kapcsolt rágcsáló (muríne) eredetű LT-p-reoeptor blokkolja az LT-β-R-jelzőrendszert egéreredetü WRHX 164 sejtekben, amelyet szóiubiiia egéreredetű LT-α/β-ligandum Indukált, A WEH1 164 sejtek elpusztulnak az LT-ligandum (ml.T-a/p) növekvő koncentrációjának függvényében. A szoiubilis mLT-p-R-Fc (10 pg/'ml) blokkolja az LTligandum-aktiváit sejtpusztulást. Szoiubilis, rágcsáló eredetű TNF-receptor fúziós fehérje (p55-TN5'-R~Fo hozzáadása kis hatással van az LT-u/p-aktÍvéit sejfpusztulás blokkolására. A növekedést három nap után. az eireagált RTF optikai denzitásának (OD 550) mérésével tesszük számszerűvé, amely arányos a sejtssámmal.

3, ábra. Humán ΙΤ-β-R-re specifikus antitest (BDA8 mAb) blokkolja szoiubilis LT-ligandum és humán sejtfelszinen található LT-p-R közötti kölcsönhatást. Humán WiDr tumorsejtek növekedését blokkolja IFN-γ és szoiubilis LT-al/pk-ligandum kombinációja, Az anti-LT-β-Ε. BDA8 antitest blokkolja a LT-ai/p2~ligandum h’ibrtumorsejtek növekedésére kifejtett gátié hatását. A folyamatos jelek mutatják a sejtnövekedést XgGl-kontroii mAb (10 gg/ml) jelenlétében. A megszakított jelek mutatják az anfci-LT-p-R mAb BDA8 (10 gg/.mi) hatásait.

4, ábra. Humán ηΤ-β-ta specifikus antitest (B9-mAb) blokkolja a sejtfelszíni LT-p-iiganöum és a szoiubilis LT-p-receptor (hLT-p-R-Fc? 2 pg/mi) közötti kölcsönhatást. .A sejtfelszinen kötött LT-p-R-Fc-t fikoeritrín-jeleit szamár anfci-humán-IgG és FACS-analizis alkalmazásával detektáltuk. A kapott csúcs fluoreszcencia -intenzitásának áslagét csatornaszámként ábrázoltuk. A

pontozott vonal mutatja a kötött receptor mennyiaégének. megfelelő fluoreszcencia-intenzitás átlagát Bá-mAb nélkül,

5. áfcra, Az LT-,&-R-bXokkolőágen.s ímLT-P-R-Fc) tatása egerek f ülduzzadására kontakt késleltetett típusú híperszenzitivitás modellben {DTK), A görbe a fülvastagsag növekedését mutatja be 24 érával a azenzítizáit egerek fülébe adott 0,2%-os DbFBantigénkezelés után mérve. Minden egyes jel külön mérést reprezentál. Minden egyes kísérletben 7-8 állatot használunk egy mérési ponthoz, kivéve azokat, ahol rombusz alakú jel van, Itt csak 4 állatot használunk egy mérési ponthoz, Az egereket pufferrel (R8S) és 20 mg/kg kontroll IgG fúziós fehérjével (LFA3Fc) kezeljük, amelyek negatív kontrollként szolgálnak. Az egereket 8 mg/kg anti-VLAá mAb-vei (PS/2 mAb) kezeljük, ami gátolja a kontakt OTH általi fülXduzzadást, es szolgál pozitív kontrollként.

6. ábra, Egerekben megfigyelt testtömeg-változás görbéje 14 nappal rntT-OR-lg-vel és hbFA3-Ig fúziós fehérjékkel történt kezelés után,

7. ábra. Egerekben megfigyelt vastagbél-hossz változásának görbéje 14 nappal mLT-βΗ-lg-vei ás hLS'A3-lg fúziós fehérjékkel történt kezelés után.

8. ábra, Egerek testtömegének idöfüggése a következő injekciókat kővetően.: CDatRB^^^CDá-pozitív T-sejtak; CDáoRB^ÜBá ~ pozitív T-sejtek.; CD45R8*^a'^?*^s LT^R-lg-ben; és CD4és ALFA-lg.

9. ábra. A 8-11. ábrák szerinti kezeléseket követően megfigyelt testtömegek átlagának és standard deviációjának grafikus ábrázolása.

ía. zss.-ss.

X » X φ φ Φ χ * ** X *·** * * * -* χ φ %

Φ*Φ ΦΦ φφφ φ φ \χ

10, ábra, Egerek talpvastagság-növekodésének ábrázolása negatív és pozitív konttollokksl, valamint mLTflR-ig-vei való Injekció után.

A találmány teljes megérzését szolgálja az alábbi részletes magyarázat,

A citokin' kifejezés egy olyan molekulára utal, amely sejtek közötti kölcsönhatást közvetít, A limfokín limfoclták által felszabadított citokín.

A T-belpor (Th) sejtek' kifejezés a T-sejtek funkcionális alosztályára utal,- amely citotoxikus T-sejtek képződését segíti elő, valamint a ^-sejtekkel kooperációban stimulálja az antitest-termelést. A helper T-sejtek a II, osztályú MHC-molekulákkal asszociált antigéneket ismerik, fel.

A 'Thi' kifejezés a T-holper sejtek egy alosztályára utal, amelyek LT-a-t, interferon-y-t és IL-2-t (és más oitckineket) termelnek, és amelyek a fertőzésre adott celluláris (szar nem ímmunoglobulín) immunválasszal asszociált gyulladásos reakciókat váltanak ki.

A Thr*' kifejezés a T-neloer sejtek egy alosztályára utal, amelyek olyan citoki.neket, például l.L-4-et, TL-5-t, 11-6-t és

II™ 10-et termeinek, amelyek egy immunfertőzésre adott immunoglobulin (humorális) típusú immunválasszal asszociáltak,

A sejtkösvetitető kifejezés olyan immunológiai folyamatokra utal, amelyeket a T-sejtek vagy azok termékeinek közvetlen hatásai eredményeznek az immunválasz kialakulásában. Ez a típusú immunválasz általában (de nem kizárólag) a T-sejtek Thl-osztályávai asszociált, kés: tartozik ebbe a kategóriába a T-sejtek VZ , ZVi /SS *·» X fr fr* X Xfr * * frfrfr frfrfr heiper hatása a B-sejt-dif ferenciálódasra és a B-se j t~expan~ zióra, amelyek általában a T-sejtek Thk-osztályával asszociáltak.

A késleltetett típusú hiperssenzitivitás (OTH) olyan immun válaszra utal, amelyet egy antigénre adott lassú immunválasz jellemez, teljes hatásában 1-3 napos időtartam után nyilvánul meg, Ezzel a lassú Immunválasszal szemben az immunoglobulinkőzvetitett (humorális? allergiás reakció viszonylag gyors immunválasz. A DTK-reákeióknak három típusa van; kontakthiperszenzitivitás, tuberkulín-tipusú hiperszenzitivitás és grannioma-reakeiék.

Az ”immunglobulin-immunválasz” vagy humorálís immunválasz egy állat elvan immunválaszára utal egy testidegen antigénre, amelyben az állat antitesteket termei az idegen antigénre. A T~ helper sejtek Ihl-osztályának kulcsszerepe van nagy affinitásé antitestek hatékony termelésében.

Egy antitest Fc-dómén-je kifejezés a molekula azon részére utal, amely a hingeCH2- és CH3-doméneket foglalja magában# de as antigénkötőhelyek nélkül. A kifejezés az igM vagy más antitest-!zotlpus megfelelő régióit is jelenti.

Az anti-lT-p-receptor antitest” bármilyen olyan, antitestra utal, amely specifikusan köti az LT~J>~receptor legalább egy epitdpjáf.

Az anti-I/T-antitast” bármilyen olyan antitestre utal, amely spéci £ ikusan köti az Ll-α, Ι,Τ-β vagy LT-a/B-komplex legalább egy epltópját.

áz LT-p-R-jelzőrendszer'' kifejezés olyan molekuláris reakOK-ftE dókra utal, amelyek 32 Ll-^-R-feiyamarsorrai vagy az art követő molekuláris reakciókkal asszociáltak, amelyet ezek eredményeznek.

Az dT-p-B~blokfcdő ágens kifejezés egy olyan ágensre ekei, amely képes gyengíteni liganöum kötődését L?~p~R~hez, sejtfelszíni ηΤ-β-R-klaszter kialakulását vagy az LT-^-R-jelzörenászert, vagy olyan ágens, amely képes befolyásolni, hogy az LT~p~R~ szígnál hogyan jusson tovább a sejtben.

Az LT-p-R-hiokkolóágeas, amely a ligandum-receptor kötődési lépésnél hat, képes legalább 20%~ban gátolni LT-ligandam kötődését LT-p~R~hez. Az LT-p-R-blokkolőégens, amely a iígandumz\.

receptor kötődési lépés után hat, képes legalább 20%-ban gátolni az Ll'-p-R'-sktiválás tumorsejtre kifejtett citotoxikus hatásait.

Ό' ηΤ-β-R-biokkoIdágensek például a szolubllís LT-p-R-Fc-molekniák, valamint az anti-Ll-a, anti-LT-β, aatí-LT-αΖβ és az antí-bT-β-η Abs (antitestek). Előnyösen az antitestek nem kerésztreagainak az LT-a szekretert formáival.

Az Ll-β-Η biológiai aktivitás kifejezés a következőkre utal: 1} hogy ez LT-β-η molekula vagy származéka kompétidőre képes szoiubiiis vagy sejtfelszíni LT-Iígandum-kötésért a szoltbilis vagy sejtfelszíni LT-^-R-moiekuiákkal; vagy 2) hogy képes szimuláld szabályzó immunválaszt vagy citotoxikus. aktivitást natív LT-p-R-molekulával együtt.

Az '’LT-α/β heteromer komplex vagy d/Γ hderomer komplex kifejezések legalább egy d-α- és egy vagy több LT-jj-alegység közötti stabil asszociációra arainak, beleértve egy vagy több alegység szdcbilis, mutáns, megváltozott vagy kiméra formáit.

-a. ϊίζ:·.···φζ 'ί 3

Az alegységek elektrosztatikus, van dér Waals vagy kovalens kölcsönhatás ttján asszociálődhatnak. Előnyösen az LE-α/β hetet omer komplex egy vagy több szemssádos Vf-p-aiegységgei rendelkezik, és nem fordul elé benne kát szomszédos öT~a~aiegység, Ha az LT-α/β heteromer komplex νΐ'-β-R aktiváló égésként szolgái sejtnövekedési vizsgálati eljárásban, a komplex előnyösen szoiobilis és X,T-al/P2-sztöchiometriával rendelkezik. A szolubilis LTα/β hetetemer komplexek nem rendelkeznek transzmembrán doménnel és képesek azt megfelelő olyan gazdasejtek szekretálni, amelyeket az LT-α és/vagy LT-p-alegységek expresszáiására terveztünk (Crove et al., ál Immunoi. Methods XS8, 7 9-89 (1394)j .

Az LT-ligano kifejezés egy LT heteromer komplexre vagy annak származékára utal# amely spéciiikusan képes kötődni LT-βreceptorhoz.

Az LT-B-R iigandumkötő dómén kifejezés az Χ/Γ-β-Ρ részére vagy részeire utal, amely az LT-ügandum specifikus felismerésében éa as azzal való kölcsönhatásban játszik szerepet.

A 'sejtfelszíni LT-a/B-kcmplex'¹' és a '“sejtfelszíni LTkomplex kifejezések olyan komplexekre utalnak, amelyek tartalmazzák as LT~<x- ás a membránkötött lT-8-aiegynégekat, beleértve agy vagy több alegység mutáns, megváltozott ét kiméra formált, amelyek a sejt felszínén vannak, A sejtfelszíni LT-iigandum kifejezés olyan sejtfelszíni LT-komplexre vagy annak származékára utal, amely képes specifikusan kötődni LT-p-receptorhoz,

A kísérleti alany kifejezés egy állatra vagy egy állatból származó egy vagy több sejtre utal. Előnyösen az állat omlás állat. A sejtek bármilyen fezmában lehetnek, példáéi szövetben, 6½, /.$$·>

sejtálaszterekben, immortaiizáit, transzfektált vagy transzfermáit. sejtek, és a sejtek származhatnak egy olyan állatból, amely fizikailag vagy fenotipikusan megváltozott.

Lxmfotoxin-β: A w-család egy tagja

A tumornek.rőzis-f.ak.torra.1 (TNF) rokon szerkezetű citokinek egy nagy családot alkotnak, amelyek a gazdaszervezet védelmének és as immunszabályzás pleíotropikus közvetítői. A család tagjai membrácköfbtt formákban fordulnak elő, amelyek, helyileg hatnak sejt-sejt érintkezés formájában, vagy olyan szekretált fehérjékként, amelyek jói elkülöníthető céimoiekulákra hatnak. A TNF~ei rokon szerkezetű receptorok párhuzamos családja ezekkel a oi™ tokinekkel reagál, és különféle folyamatsorokat, például sejtpusztulást, sejtproiiferációt, szövetdlfferenciálódást és gyulladásszerű immunválaszokat indítanak el.

A TNF, Ximfotoxin—<x (LT-a, ΤΝΓ-β-nek is hívják) és a llmfotoxin-β (LT-β) a TNF-ligandumok családjának tagjai, amely az Fas, CD27-, CD30-, CD40-, 0X-4Q- és 4-138-reeeptorok. ligandumait is tartalmazza ( Smith et al,, Cell 76, 759-62 (1.774)1 . A TMF-család számos tagja által elindított szignál, például TKF, LT-a, LT-β és Fás által képes tumorsejtek pusztulását indukálni nekrózissai vagy apoptózissal (programozott sejthalál). bem tumoros sejtek esetében a TMF és a TKF-csaiád főbb tagja ligandum-receptor kölcsönhatás útján hatással van az immunrendszer fejlődésére és a különféle fertőzésekre adott immunválaszokra.

A TbF-ligandumcsalád tagjai többségűkben membránkötött formában találhatók a sejt felszínén. A TNF és az LT-ö. mind székrétéit, mind membránkötött, sejtfelszíni formákban megtalálható

U ******** * ΦΦν Φ φ φ .φ φ

ΦΦΦ X X ίΦ emberekben. A sejtfelszíni TRF egy transsmembrán régióval rendelkezik, amely proteolitíkusan iehasad a szekretált forma képződésekor. Viszont a sejtfelszíni 1ϊ~α nem tartalmaz transzmemjd brán régiót. A membránaeszociáit ΰ’Γ-α heteromer komplexet alkot y

>

az LT-^-val, és LT-α/β formájában kapcsolódik a sejtfelszínhez, amelyben az LT-β egy rokon szerkezetű transzmembrán polipeptid.

A legtöbb membrános szódáit ΙΤ-α/β-komplex ( sejtfelszíni LT) LT~«.i/02-satöchiometriával rendelkezik (Browning et al., Cell 72, 347-56 (1993·] . A sejtfelszíni RT-iigandnmok nem kötődnek nagy affinitással TNF-B-nez,· és nem aktiválják a TNF-Rjeizőrendszert. .Sgy másik IFF-al rokon szerkezeté receptor, az ΑΤ-β-receptor (LT-fi-R) nagy affinitással köti ezeket a sejtfelszíni .limfotoxin komplexeket [ Crowe et al., Science 264, 707-10 (1994)] .

As Ι-Τ-β-R-jelzörends.zer, a TNF-R-jelzőrendszerhez hasonlóan anti-proliferativ hatásokkal rendekezík, és citotoxikus lehet tumorsej te'kre. Egy másik, elbírálás alatt álló, /373,963 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi bejelentésünkben készítményeket és eljárásokat közlünk az LT-β-Α szelektív stimu.láiására. LT-ö-R aktiváló ágensek alkalmazásával. Az ΑΤ-β-R aktiváló ágensek hasznosak tumorsejt-növekedés gátlására, a TNF-R“índuk.ált gydladásszerá vagy immunsz&bályzó folyamatok koaktíválása nélkül.

bem-tumorsejtökben a TAF és a TAF-d rokon szerkezetű öltökének sokféle immunválaszban aktívak. A Tök- és az LT-aiiga.nd.umok egyaránt kötik és aktiválják a TbF-reseptorokat (p.55 vagy p6u és ρ75 vagy p.30; a leírásban TNF-R) , A INF-t ás az xx* yv ♦ í , \ «*♦' ·* Φ X*

L!~a~t a ínakrefágek térrelik. mikroorganizmusok elleni korai és gyors immunválaszokban# amelyek fokozzák a makro f ágok és neutrofi lek míkróbaöíő aktivitását. A TDF-t és az ΑΤ-α-t mekrefágok vagy eitotoxikus T-limfooiták (CTL-ek vagy “kiiier T~ sejtek) termelik#· amelyek s célsejtek felszínén lévé TNF-receptorokhoz kötődnek# és az érzékeny sejtek pusztítását indítják el.

A TNF és a THF-sr rokon szerkezetű citokinek szintén képesek gyulladást okozó kaszkádfolyamatokat iníciálni a fertőzésre vagy stresszre adott válaszként, A. TdF# l=T~d és IFN-y felszabadulása megváltoztatja sz adhéziós tulajdonságokat a vaszkaláris endotél sejtek és bizonyos limfocitatípusok között. A megnövekedett adhézió elősegíti a fagocita- és a leukooitamigráoiőt a véráramból a gyulladt helyet körülvevő szövetekbe. Hasonló gyulladásos reakciók játszók a fd: szerepet a szövetátültetések (graftok) és szervtranszplantáciők cél Veláris kilökésében, és bizonyos immunológiai rendellenességekben.

A sejtfelszíni limfotoxin-(LT)komplexeket már jellemezték CDs' T-sejt hibridömasejtekben (IX-23.D7)# amik nagymértékben expresszi!jak as r/l-t { Browning et al., d. Immunoi. 147# .1230-37 (1991) ; Androlewicz et al.# a. Bioi. Chem.. 2 €7, 2542-47 (1932)1 . Az ηΤ-β-Ρ., LT~ö.iegységek és sejtfelszíni LT-komplexek expresszié ját és biológiai szerepét C, F. karé és munkatársai a következő közleményben foglalják össze:: ^A’Tbe iigancs and receptors of the lymph.otox.in system címmel Pathways fér Cytolysis, Current Tepics Mrerokiei. érmeséi ö'-baa# Soringer-Verlag, 17 5-210.. old.

(1995) ,

Az LT-tt-expresszió redukálása és ez LT-α szekréciója el2í3/3£ .* , .? ***« >«** ·>** X.< Xífcfr X X yfr

Ί '•á sősorhan aktivált. T~ és B- 1 imfociták és fcensésztes k.i.tl.er’'-' (bX)~

-sejtek által történik. Ügy tűnik, hogy a T-helper sejtek alosztályai közül az ΒΤ-α-s a Thi-sejtek termelik, nem a Thz-sejtek.

Az LT-a-t rnelanocitákfean is detektálták. Multiplex szklezőzzsban szenvedő páciensek sérüléseiben található mikroglia- és T-sejtek szintén megfesthetek anti-LT-a-antiszérummai.

A iimfotoxin-p'-t (p3 3-nak is hívják.) T-limfoeiták, Tsejtvonaiak, S-sejtvonaiak és limfokin-aktiváit kiiiersejtek (LAK) felszínén azonosították. Az ΑΤ-β-val foglalkozik több elbírálás alatt álló nemzetközi szabadalmi bejelentésünk (PÜT/US9Í/04588, 1992. január 9-én közzétéve bO 92/00329 számon; és PCT/ÜS93/11009, 1934. június 23-án közzétéve bO 94/13803 számon), amelyeket teljes egészükben hivatkozásként tekintünk.

A sejtfelszíni LT-komplexeket elsősorban aktivált T- ás 11-iimfoeiták és természetes klllersejtek (PK) expresszálják, amit FAüS-snaiizissel, vagy arti-LT-«-antitestet vagy szoiufciiis LT-β~B.~Fc fúziós fehérjéket alkalmazó immnnhisztoiögzával határozunk meg. Sejtfelszíni LT-ket humán citotoxikus T-iimfocita (ÜTL)-kiénokon, aktíváit perifériás mononukieáris iimíocitákon (PÁL), 2L-2-aktiváit perifériás vériimfocitákon (LAK-sejtek), fehér zasspábol származó mitogén-aktiváit vagy anti-CDáö-aktivált perifériás ü-iimfocitakon (BBL) és különböző T~ és B-sejtek iimfoid tumor-sejtvonalain Írtak le. Az alloantigént hordozó célsejtek összekapcsolódása. specifikusan indukál LT-expressziöt

008' és OL4 CTL-klőnok által.

Az LT-p-receptor, a TüF-receptorcsalád egy tagja, spasztikuson kötődik a sejtfelszíni LT-1igandamokhoz.. Az ηΤ-β-R köt η;. ::n s^r d ,^v » .1' s*«‘ * » ♦ * « 9 \ ♦⁵* ψ« *·£» Λ .-· *v •\ C\

Z V

LT~hezeromer komplexeket felsősorban LT-alΖβ2-t és LT-az/pl-t), de nem köt TMF-t vagy LT-a-t ( Crowe et al., Science 284, 707-10 {'1994)1 - őz LT-β-Ρ. általi jelzőrendszer szerepet játszhat a perifériás limfoid szervfejlődésben és a humorális immunválaszokban,

Az LT-^-R-ezpressziét vizsgáló tanulmányok még korai fázisukban vannak. LT-p-R mRNS-két emberi lépben, csecsemőmirigyben és más fontosabb szervben találtak. Az LT-β-Ρ expressziős jellege hasonló a p55-?NF-R~áhez, kivéve azt, hogy sr LT-β-Η nem fordul elő perifériás vérből származó ϊ-sejtekben és T-sejtvonalakban.

Oldható {szolohilis} LT-komplexek előállítása ii <b

A szolubilis LT-aZá beteromer komplexek LT~f-alegységeket tartalmaznak, amelyek membránkötöttből szolubilis formára változtak. Ezeket a komplexeket részletesen ismertetjük, egy elbírálás alatt álló nemzetközi szabadalmi bejelentésben (PCT/US93,/'11889, 1994. június 23-án közzétéve Wö 94/13808 száν' :k mons . A szolubilis LT-<-peptideket a ii.mfotoxin~á aminosav-szekvenciája határozza meg, amelyben a szekvencia bármely ponton hasítható a transzmembrán régió vége {azaz körülbelül a 44. aminosaví és az első TNF-homoXög-régiő (azaz a 88. aminosav) között, Browning és munkatársai számozása szerint [ Cell 72, 847-S6 f/ÜÜ/j; .

ff A

A szoiutmlrs bT-a-poirpeptaoekeo az LT-á h-termanar.isanak rövidítésével is előállíthatjuk a citoplazmaéikus farok és a transzmembrán régió eltávolításával f Crcwe at el., Science 284, 707-710 {1734)]. Más módszer szerint a transzmembrán dómén inak_; tiváihatő deláorőval is vagy a normálisan hidrofób aminosavak óm··· olyan szubsztitúciójával, amely hidrofil aminosavakat tartalmazó

-j »’ .· d íh , ·* U , transzmembrán doménnei rendelkezik. Mindkét esetben egy lényegében hidrofil jellegű rész keletkezik, amely lecsökkenti a lipldaffinitást és megnöveli a vízben veié oldhatóságot. A transzmembrán dómén delécióját részesítjük előnyben a hidrofil aminosavakkal, való szubsztitúcióval szemben, .mert Így elkerülhető potenciális immunogén epitópok bevitele.

A deletált vagy inaktivált transzmembrán dómén helyettesíthető vagy kapcsolható X. típusú vezetőszekvenciával (például VCAM-l-vezetőszekvencíévai}, igy a fehérje olyan szekvenciával szekretálédík, amely a 7al40 és a Fro88 között bárhol kezdődik. A

A szolubilis LT-á-oollpeptidek jói ismert vezetőszekvenoiából bármennyit tartalmazhatnak az N-terminálisnál. Ilyen szekvencia lehetővé teszi a peptidek számára, hogy eukariőta rendszerben expresszálhaték és S2ekretálhatok legyenek [ lásd például Erest et al., 5,082.783. sz, üSA-beli szabadalmi leírás (1992)1, ρ

Szolubilis LT—e/é heteromer komplexeket alkalmas gazdasejt olyan DKS-el való kotranszfakciójavai is előállíthatunk, amely Γ

LT-a-t és szolubilis LT-á-t kódol [ Crowe et ai., o. Immunoi. Methods 1€S, 79-89 (1994)1 . As LT-α jelenlétében szekretált szóy··· lubilis LT-M nagymértékben oligom.erizált. Azonban ha az LT-a-t i

koexpresszáljuk, egy 70 kDa trimer-szerü szerkezet alakul ki, amely mindkét fehérjét tartalmazta, Úgy ia lehetséges szolubilis 0LT~«i/|2 heteromer komplexek előállítása, hogy egy normálisan csak LT-o-t expresszáló sejtvonalat (például a fentebb tárgyait HPMT 1783 sejtek) fertőzünk szolubilis LT-é-polipeptidet kódoló génnel.

Ó

Az LT~u~ és LT-á-ooilpeptidek külön-külön is szintetizálS$,2S5>/S£

X* «XX * ΦΦΦ V « X

X * Φ φ φ Λ* hatók# sgyhe detergensekkel denaturálhatők# összekeverhetők# és a detergens eltávolításával renaturálhatők LT hetéremer komplexek keletkezése közben# amelyeket elválaszthatunk (lásd lentebb)g

LT - α 1/é2-kompiex@k tisztítása 0

A szolubilis Ll’-dl,/á2 he te romé r komplexeket kromatográfiával választjuk el a koexoresszált# az alegységeket különböző >

sztöchiometriában tartalmazó komplexekből# TRF~ és LT~á~recep~ torokat alkalmazva as affinitástisztítás reagenseiként. A ΤΕΡΑ

-receptorok csak az LT-komplexek α/α-hézagarba kötnek. As LT~á~ -receptor nagy affinitással köt az á/á-hézagokba, és kisebb affinitással az az LT-a/|-komplexek α/á-hézagaifoa. Erűnek megfeA leiben as Ll-«3 és az Ll-a2/ál kötődni fog a TNF-R-hez. As LT-|^R —_k6pes ~_{tet ia}z _a/U_as3kbán), de nem köti az LT-ö3-at. Ezenkívül as LT-a-R (de nem a TNF-R) köti as LT-al/|2-t és az LT-ábbt (a vegyületek pontos szerkezete nem ismert, de nagy aggregátumok).

A receptor-affinításreagenseket úgy állíthatjuk elő, hogy vagy egy szolubilis extracelluláris domént ( lásd például Loetscher et al. # J, Bioi. Chem. 266, 18324-29 (1991)1 , vagy kimérafehérjóként immunogiobulin. Fc-doménjenes kapcsolt extraoeliuláris lígandumkötő doménnel [ Loetseher et ai.# J, Bioi. Chem.

266, 18324-29 (1991); Crowe et al.# Science 264, 707-710 •m. 2ío/ss (1994)) . A receptorokat kémiai keresztkötéssei kapcsoljuk affin.i sásmátrixhoz rutin ei látások alkalmazásával, n

A hét el járássorozat van, amellyel as LT~ai/á2~Iiqandumot b - 1 megtisztíthatjuk receptorok és immuné-affinitá-s^kromatográfiával.

Az első eljárássorosatfcan azt a felüluszőt visszük fel TNF-B9

-oszlopra, amely minő az .tT-a-t, mmö a rövidített ET~g~t koexpresszálő, megfelelő expressziős rendszerből származott. A TNF-R .·>

· :· ···>*· köti az LT-öd-at es as ET-az/ll-trimereket. A TMF~R~osz.lopon ártó ik folvt anvacr hT-sUnj-t és uT-ol/áz-t foo tartalmazná.

^{; !} jö

A második eljárássorozatban az Összes LT-a-t tartalmazó

I ' 9 fi>

torma (LT~á (n), bl-ai/ák és tT-az/ál; megkötődik az oszlophoz, amit klasszikus módszerekkel eiuáiunk az Vi’-^-R-oszloprói, például kaotropikus ágenssel vagy pk-váltotóssal. (Az LT-otó átfolyik ezen az oszlopon) ·. Az eiuátumot neutrálisaink vagy a kao~ tropikus ágenst eltávolítjuk, és az eiuátumot azután TNF-R-osz ··>

Ionra visszük, amely csak az LT~az/|i~trimereket köti meg, Ezen tó '' m az oszlopon átfolyt anyag LT-|{n)-t ás ET-ml/az-trimereket fog tartalmazná po

Mindkét esetben a tiszta LT-al/#2-trámeraket eltávolíthatjuk az LT-a-tél az előbbieket követő géistűréssel és/vagy ioncserélő kromatográfiával szakember által ismert módon, tó

Más módszer szerint, az Εϊ-α/ί heteromer komplexek különböző formái különböző, hagyományos kromatográfiás eljárással választhatók el és tisztÍrhatók, Előnyös lehet a szokásos tiszti tási eljárások sorozatát kombinálni, amelyben az egyik lépés a fentebb leírt immuneaffinitási tisztítási lépés.

S zűré a LT-β- R-b1okkoIÖágens©kr© ··' :·

A találmány egy előnyös megvalósítási módja szerint az LT-β''T

E-blokkoigágens ηΤ-β-R ellen termeltetett antitestet (Ab) tartalmas, amely gátolja az fl-p-R-jelzőrendszert, Előnyösen az antiηΤ-β-Ε-Αο monoklonális antitest (méh), Egy ilyen anti-LT-p-R mAbs

Λ tó inhibitor a BDAé mAb.

* XX* X χ X

X Λ X **χ

Az anti-LT-β-Η Ab-inhifeitorokat és más ύΤ-β-Η—biokkoiöágentokot olyan szűrési módszerekkel lehet azonosítani, amellyel detektálni leköt azt, hogy egy vagy több ágens milyen mértékben képes vagy LT-^-R-hez vagy LT-lígandumhoz kötődni, vagy milyen mértekben képes gátolni az ηΤ-β-Α-jelzőrendszer sejtekre kifejtett hatásait.

Az egyik szűrési módszer az LT-p-R-t hordozó tumorsejtekre ható LT~$~R~jelzörendszer citotoxikus hatásait használja fel. A tumorsejteket egy vagy több LT-β-Α aktiváló ágens hatásának vetjük alá az ΙΤ-β-R-jelzőrendszer indukálására. LT-β-Η. aktiváló ágensek például az LT-α/β heteromér komplexek (elsősorban szoiubilis LT-αΙ/βζ; I'FN-v jelenlétében, vagy egy aktíváié anti-LT-p-R

Ab (lásd lentebb; az elbírálás alatt levő 08/378.968 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban is közöljük)< Az LT-p-R-jelzőrendszert blokkoló antitestek és más ágensek szelektálása azon képességűk alapján történik, hogy milyen mértékben képesek gátolni as LT-^-R-jelzőrendszer citotoxikus hatását tumorsejlekre a következő vizsgalati eljárások szerint:

1) Tumorsejteket, például HTSO-sejteket tenyésztünk háromnégy napig szövettenyésztő edényekben, amelyek tápközeget és legalább egy LT-β-Έ aktiváló ágenst tartalmaznak, a tesztelendő ágens hígítási sorozatának jelenlétében vagy nélküle;

2) Az életfolyamatokban résztvevő festéket, amely a mátokonöriális funkciót méri, például MTT-t adunk a tumorsejt-keverébhez, és néhány óráig reagáltatjuk;

5} Az egyes lenyésztőheiyeken lévé keverék optikai denzifását mérjük 550 nm-es hullámhosszúságú fényben (OD 550). Az OD 550

φφφ arányos as egyes tenyésztőhelyeken maradt tumorsejtek számával az ΕΤ-·β-Η aktiváló ágens és a teszé-ET-p-R blokkolóágens jelenlétében. Egy olyan ágens vagy ágensek kombinációja, amely legalább 20%~kai képes csökkenteni az LT-P~R-aktivált tumorsejt-toxicitást ebben a vizsgálati eljárásban, a találmány oltalmi körébe eső ΕΤ-β-R blokkol óágesne'k tekintjük.

Bármilyen ágens vagy ágensek kombinációja, amely az LT-p-R-jelzőrendszert aktiválja, alkalmazható a fenti vizsgálati eix<··' •járásban ET-p-R — blokkclöágensekként. Azok az LT-p-R aktiváló ' : ^s ágensek, amelyek az tT-p~R-je.t zőrendszert indukálják (például akti válő anti-LT-p-R mAb-k), kiszelektálhatők azon képességük alapján, hogy — egyedül vagy kombinációban más ágensekkel — lehetővé teszik a tumor sejt citotoxicitást a fentebb leirt tumorsejt-vizsgálati eljárásban.

Más módszer LT-p-R-blokkoló ágens szelektálására annak megfigyelése, hogy feltételezett ágens képes-e közvetlenül beavatkozni az LT ligandum-receptor kötésbe. Egy olyan ágens vagy ágensek kombinációja, amely legalább 10%-kal képes blokkolni a

Iigandum-receptor kölcsönhatást, a találmány oltalmi körébe eső V

L T-ü-R-oi o kkoagag esnek tekintjük.

,.-é\

A iigandum-receptor kötéserősség mérésére végzett számos vizsgálati eljárás közül bármelyiknél alkalmazhatunk kompetíciós vizsgálati eljárást a feltételezett LT-p-R-blokkoi^ágensekkel.. A receptor és a ligandum közötti kötéserősség mérhető enzimkötött immunszorbens vizsgálati eljárással (SL.ISA) vagy radiaktiv immunológiai vizsgálati eljárással (RIA). Specifikus kötés mérhető fluoreszcensen jelölt antitest-antigén komplexekkel is, valamint

X X Ψ végezhetünk fluereszcencia-aktivált sej tosztályoző analízist. (FACSö, vagy más immunológiai dete'kciós eljárás alkalmazásával, amelyek a szakember által mind jól ismertek.

A ligandum-reoeptor kötési kölcsönhatás Blácore berendezés (Pharmacia Biosensor) alkalmazásával is mérhető, amely a plazmonrezonancia detektálást használja fel [ khou et al., Biochemistry 32, 8X93-98 (1993) ; Faegersfcram és 0^f Shannessy, Surface plasmon resonance detection in affinity technoiogies, Handbook of Affinity Ch roma tography -bán, 229-52. old. Harcéi De.kker, Inc., ben York (1333)] .

A BIAcore-technológiában a receptort aranyfelületre kötjük, és a ligandumot átfolyatjuk azon. Piazmonrezonancia-detekciőval a felületre kötött tömeg mennyiségét közvetlenül mérhetjük ténylegesen eltelt idő alatt. Ez az eljárás mind az asszociációs (on rate constant}, mind a disszociációs sebességeket (off rate constant) megadja, igy közvetlenül meghatározhatjuk a ligandum- receptor disszociációs és affinitást állandóját a feltételezett LT-β-Ρ. blokkölőágens jelenlétében vagy hiányában.

Ezekkel vagy más olyan eljárásokkal, amelyek a receptorligandum kölcsönhatásokat mérik, ki tudjuk értékelni, hegy az LT-β-Ε-blokkölőágens, egymagában vagy más ágensekkel való kom.•U binációban. milyen mértékben képes gátolni a sejtfelszíni vagy szolubiiis LT-iiganöumok kötődését sejtfelszíni vagy szolubiiis ΙΖΓ-β-Η molekulákhoz. Ilyen vizsgálati eljárásokat alkalmazhatunk. LT-ü-R-'biokkoléégensek vagy ilyen ágensek származékainak (például fűzték, kiméták, mutánsok vagy kémiailag megváltoztatott formák) tesztelésére, hogy — egyedül vagy kcmfornácréban — a megváltozia.usszse φ φ tatott formák ηΤ-β-R-aktiválást .blokkoló képességét opímalizálή uk.

Oldható (szolubílis) Χ,Τ-β-R-aolekulák előállítása

Az LT-p-R-blokkoióágensek a találmány egy előnyös megvalósítási mód j a szerint szo'lubiiis LT^-receptormolekulákat tartalmaznak, Az 1, ábrán látható a humán Ll-p-R extracelluláris részének szekvenciája, amely a ligandumkötő domént kódolja. Az 1, ábrán látható szekvenciainformációk és a szakember által jól ismert rekombináns DNS-technikák felhasználásával egy vektorba klónozhatjuk az LT-β-Ε ligandumkötő dóménjét kódoló funkcionális fragmentumot, és expresszálhatjuk alkalmas gazdaszervezetben szo'lubiiis LT~P~R-molekula termelése céljából. Azokat a szolubilís LT-$~R~molekulákat, amelyek képesek kompétídóba lépni natív LT-p-receptorokkal az LT-iigandum kötéséért, az itt leírt vizsgálati eljárás szerint szelektáljuk mint LT-p-R-blokkoló ágenseket Az 1. ábrán bemutatott aműnosav-szekvenoiákból szelektált aminosav-szekvenciával rendelkező szolubílis ΑΪ-β-R-receptert egy vagy több heterológ fehérjedoménhez (fúziós dómén? kapcsolhatunk, így megnöveljük a receptor-fúziós fehérje in vivő stabilitását, vagy moduláljuk biológiai aktivitását vagy lökd. izáciőját.

Előnyösen olyan stabil plazmafehérjéket használunk a reoeptor-fűzíós -fehérjék előállítására, amelyek fél-életideje több, mint 20 óra a keringésben, ilyen plazmafehérjók például: immunogrófon linók, szérum-albuminok, 1 ipoproteinek, apciipoproteinek ős a transzferrín. Azok a szekvenciák, amelyek célpontjai lehetnek íss.2tO/BK a szolubíiis Ε'Τ-β-R-molekülának egy adott sejt- vagy szövettípuson, szintén hozzákapcsolhatók az LT-β-Ε liganoemkotö doziénhez, igy specifikusan lokalizált szo.lubi.lis LT-β-Η fúziós fehérjét hozunk létre.

As LT-p-R extracelluláris régiójának egészét vagy egy funkcionális részletét (1. ábra) tartalmasó LT-β-Β. ligandumkötő domént fuzionálhatjuk agy immunogiobuiin konstans régióhoz, pé{Idául a humán IgGl nehéz láncának Fc-doménjéhez [ Browning et al., d Immunoi. 1S4, 33-46 (192511 . Szcl.ubil.is receptor-lgG fúziós fehérjék előnyösek, és szakember által ismeretesek általánosan elterjedt immunológiai reagensek és eljárások azok előállítására (lásd· például. 5.225.S38·. sz. GSA-beli szabadalmi leírás, amelyet teljes egészében a kitanítás részének tekintünk) Egy funkcionális ΕΤ-β-R iigandumkőtő domént az IgGl-töl különböző immunogiobuiin-osztáiyból vagy -alosztályból származó immunoglobulin-(lg)Fc-doménhez is fúzíonálhatunk, Más Xg-osztályba vagy alosztályba tartozó antitestek Fc-doménje képesek eltörd másodlagos effektorfunkciókat aktiválni, áz aktívádé akkor történik meg, amikor az Fc~domén rokon szerkezetű Fc-receptorhoz kötődik, A másodlagos effektorfunkciókhoz tartozik, a komplement-rendszer aktiválásának, a plaoentán való át jutásnak éa különböző mikrobíéiis fehérjék megkötésének képessége. Az lmmunoglobulinok különböző osztályainak és alosztályainak tulajdonságait Roirt és munkatársai Írták le (Immunology, 4.8, old, (Mosby-Year Book Európa ltd,, 3, kiadás, 1993)] .

A komplement-rendszer aktiválása enzimatikos reakciók kaszás .ζκο/ζζ kádjáé iniciálja, amelyek gyulladásé közvetítenek. A komplementredszer termékeinek. sokféle funkciója m, például baktériumokhoz való kötődés, endocitőzís# fagocitőzis, oitotoxioités, szabad gyök termelés és immunkomplexek szolubllizálásaA komplement enzim-kaszkádot az antigén-kötött ÍgGI···, IgG3és lgM~.antitestek Fc-domsnje képes aktiválni. Ügy tűnik, hogy az IgGz Fe-doménje kevésbé hatékony# és az IgG4_; IgA# Igu és let Fc~doménje hatástalan a komplement aktiválásban. így az alapján tudunk Fc-domént választani, hogy az azzal asszociált másodlagos effektorfunkciók kívánatosak-e az adott immunválaszban vagy az Χ,Τ-β-R-Fc fúziós fehérjével kezelt megbetegedésben.

Ha az LT-Iigandumot hordozö célsejt károsítása vagy elpusztítása lenne az előnyös, egy különösen aktív Fc-domént (Igei) választhatunk az LT-p-R-Fc fúziós fehérje előállítására. Más módszer szerint, ha az ΕΤ-β-Ρ-Εο fúzió úgy lenne kívánatos a célsejt számára, hogy ne aktiválja a komplement-rendszert# akkor inaktív, IgG4-Fc-domént választanánk.

Olyan# Fc-doménfeen lévő mutációkat írtak le, amelyek csökkentik vagy megszüntetik az Fo-receptorokhoz való kötődést és a komplement aktiválást [$. Morrison, Annu. Rév. Immunoi. lö# 23965 id.úáz}] , Ilyen és más mutációkat alkalmazhatunk# egymagukban vagy komit i nációban, az ΰΤ-β-R-Fc fúziós fehérje előállítására alkalmazott Fc-dómén aktivitásának optimalizálására.

Szolúbilis# humán LT-p-R fúziós fehérje előállítását# amely ligandumkötő szekvenciát humán immunogiobuiin Fc-doménjéhez fűzfrónáivá tartalmaz hLT-p-R-Fc), az .1. példában ismertetjük. Sgy hLT-ö-R--Fc-t ssekretáló, CHO-se-jtvonalat állítottunk elő az 1.

példában leírtak szerint, amelyet hLTp;R-hClCHOálé-nek hívnak, A sejtvonalfcől mintát 1995, július 21-én deponáltunk az American Type Culture Collettion-nál (ATCC; (Reokvllie, MD) a Budapesti Szerződés cikkei yenek megfelelően, és CRL1.1965 ATCCnyilvántartási számot kapott,

Szoiubilis rágcsáló (murina) eredetű LT-p-R fúziós molekula (mLT-p-R-Fcl előállítását a 2, példában Írjuk la. Egy mLT-p-R-Fe-t szekretáló, CRO-sejtvonalat állítottunk ele s 2. példában leírtak szerint,· amelyet mLTp;M-hGICHOIl, 3 < BB -nők hívunk, A sejtvonalból mintát 1995. július 21-én deponáltunk az American Type Culture Collecfion-nál (ATCC; (Rockvíl.le, REn a Budapesti Szerződés cikkelyének megfelelően, és CRL11964 ATCC-nyiivántartási számot kapott ,

A fenti ATCC-deponálás nyilvános hozzáférhetőségének minden korlátozása visszavonhatatlanul megszűnik, ha a bejelentés elnyeri a szabadalmi oltalmat.

Eltérő aminosav-oldalláncok a receptor-lg-fűziós fehérje csatlakozási pontjainál megváltoztathatjak a szerkezetet, stabilitást és a szoiubilis LT-p-receptcr fúziós fehérje végső biológiai aktivitását. Egy vagy több aminosav hozzáadódhat a kiválasztott LT-p-R-fmomentum C-terminálisához, amely megváltoztatja a kiválasztott fúziós doménnal csat lakozó pontot..

Az LT-p-R fúziós fehérje R-termináiisa szintén módosulhat annak a pozíciónak megváltozásával, amelyél a kiválasztott ΕΤ-β-R DF3-fragmentumot az 5' -végénél hasítjuk rekombináns expressziós vektorba való beépítéskor. Minden egyes LT-p-R fúziós fehérjét tesztelhetünk stabilitására és aktivitására, és optimalizálhat-

juk rutin kísérletek alkalmazásával; as LT-p-R-blokkolóágensek szelektálására szolgáló vizsgálati eljárásokat a leírásban ismertetjük .

Az 1. ábrán bemutatott extraeelluláris doménben lévő, LT~p~.R ligandumkötő dómén szekvenciáját felhasználva, amínosavszekvenclavariációk is eiőáiiíthatók a szolubilis LT~P~receptor vagy as LT-Ilgandumhos tartozó fúziós fehérje affinitásának módosítására, A találmány szerinti, szolubilis LT-p-R-moiekulák képesek kompetícióba lépni a sejtfalszíni LT-ligéndumok kötéséért as endogén sejtfelszíni Χ/Ρ-β-receptorokkal. Előre látható, hogy bármilyen szolubilis molekula, amely olyan LT-β-η lígandumkötó domént tartalmaz, amely képes a sejtfelszíni LT-p-receptopkkal kompetícióba lépni as LT-ligandumkÖtésért, ηϊ-β-R—hlokkolóágens, amely a találmány oltalmi körébe esik.

Szolubilis, humán LT-^-receptor-immunoglobuiin fúziós fehérjét fhLT-p-n-Fc) állítottunk elő as 1. példában leírtak szerint, és teszteltük azokat abból a célból, hogy milyen mértékben képesek blokkolni as LT-p-R-indekáit cltotoxicitást humán RT29-tu~ morsejbekben. Az 1. táblásat (3. példa) összehasonlítja, hogy a szolubilis LT-ö-receptor- (hLT-p-R-Fo) és ?NF~receptor (pöó-TNFF-Fes fúziós fehérjék milyen mértékben képesek blokkolni különféle szolubilis TRF- és LT-irgandnmok HTsi-tumorsejt növekedésre kifejtett gátló hatásait,

As 1. táblázat adatai azokat a koncentrációkat tartalmazzák, amelyeknél a szolubilis LT-ö-receptor (hLT-p-R-Fc) képes 50%-ban. blokkolni azt a tumorsejt-pusztulást, amely az ΙΤ-όΙ/βζÍ-S.2«?/S?Z * φ X * χ-χ-χ ·>

-ligandum és a sejtfelszíni Ll-β receptorok kölcsönhatása okoz. Ha a szoiubiiis LT-p-reeeptor legalább 20%-ban képes blokkolni a tumorsejt~növekedést, akkor a találmány szerinti LT-p-R-blokkoló ágensnek tekintjük azt. A várakozásnak megfelelően., a szolubllís TRF-H fúziós fehérje CpóS-TPF-R-Fc} teljesen blokkolja a TRF~indukált nővekedésgátiast a TNF-hez való kötődés által, és megakadályozza annak kölcsönhatásba jutásat a sejtfelszíni TNF-reoeptorokkal.

A szoiubiiis THF-R fúziós fehérje nincs hatással az LT-lígaedum (LT-al/p2;-közvetített anti~proli.feratív hatásokra, áz l/r-p-F. fúziós fehérje viszont blokkolja az LT-iiganöum hatásait, de nem blokkolja a THF vagy az Li-α hatásait. így a szolubllís humán LT-β-Η fúziós fehérjék níncsennek hatással a TRF- és LT-cr-ligandumok általi TNF~R~aktiválásra.

Annak meghatározása céljából, hogy az LT-p-R-jelzőrendszer szintén, citotoxikus tumorsejtekre egerekben, és vajon a szolubiiis Ι/Γ-β-F. fúziós fehérjék képesek-e blokkolni az LT-p-R-indukált eitotoxioiéást, hasonló kísérletet hajtottunk végre egérből származó tumorsejteken. Szoiubiiis, egérből származó LT-p-R-Fe fúziós fehérjét (mLT-p-R-Fc; lásd a 2. példát) teszteltünk, hogy milyen mértékben képes blokkolni L?~linandummal kezeit, egérből származó WEfí'X 164 sejtek pusztulását (4. példa).

A 2, ábra bemutatja szolubllís, egérből származó Lt~p~R ímLT-p-R-Fc) hatásait LT-Iigandum-indukáit LT-p-R-jelzőrendszerre egéreredetű WEH1 164 sejtekben. Amint a vizsgálati eljárás is indikálja, a REH1 164 sejteket elpusztítja a szolubllís LT-al/pl-iigandumos kezelés. Szoiubiiis mLT-p-R-Ec hozzáadása blokkolja <u. StO/'U:

as LT-ligandum-aktívált sajtpusztuiást. Kontroli TKE’-recepfcor fúziós fehérje (p55-TNF-R~Fc) kis hatással van a sejtpusztulás blokkolására.

Esek az adatok azt mutatják, hogy szolubilis ΙΤ-β-R fúziós fehérje hatékonyan képes kompat íoí óba. lépni a sej t felszí ni LT-p-R-molekulákkal az LT-iigandum kötésért. A szolubilis mLT-p-R-Fo fúziós fehérje igy a találmány szerinti ΊΤ-β-R-blokkoló ágensként hat.

Anti-humán Χ,Τ-β-Β-antitestek forrása

A találmány egy másik előnyös megvalósítási módja szerint a humán LT-p-receptor ellen termeltetett antitestek (anti-LT-^-R Ab-k) ΐΤ-β-R blokkolóágensként működnek. A találmány szerinti anti-T-3-R Ab-k lehetnek polikionáiisak vagy monoklonálisak (mAbk> éa módosíthatók az ΑΤ-β-Η--jelzőrendszer blokkolása irányában kifejtett képességük, biológiailag megfelelő mértékű in vivő hozzáférhetőségük, stabilitásuk, vagy más kívánt tulajdonság kialakítása érdekében,

A humán LT-jj-receptor elleni poliklonális antitestet tartalmazó szérumokat szokásos eljárásokkal állítjuk elő, úgymint állatok, például kecskék, nyulak, patkányok, hörcsögök vagy egerek szubkután oltásával humán LT-p-receptor-Fo fúziós fehérjével (1. példa} komplett Éretné-féle adjuvánsban, azt követően ismétlő oltásként intraperitoneális vagy szubkután injekcióval ínkomp··· lett Freund-féie adjuvánsban. A kívánt, LT~p~receptorra specifikus antitesteket tartalmazó poliklonális antiszérumot hagyományos immunológiai eljárásokkal szűrjük.

Humán LT-ü-reeeptor-Ec fúziós fehérje elleni rágcsáló

8S.263OS-S * *·* ♦ ♦♦.)» φ * * * * φ X φ.

**♦ X» ΦΦφ φ y _φ Φ* > Λ S (műtiné) eredetű monoklonális antitesteket (mAb-k) az S. példában leírtak szerint állatunk. elő. Egy hibridóma-sejtvonalat (BB.A8.AB9), amely rágcsáld {murine) eredetű anti-humán LT-p-H mAb 3D8-at termel, 1995. január 12~én deponáltunk az American Type Csittre Collantion-nál (ATCC, Roekvilie, RD), a Budapesti Szerződés cikkelyeinek megfelelően, és BB11798 ATCC-nyilvántartási számot kapott. A fenti ATCC-deponáiás nyilvános hozzáférhetőségének minden korlátozása visszavonhatatlanul megszűnik, ha ez a bejelentés elnyeri a szabadalmi oltalmat.

Anti-LT-p-'R-antitastek különféle formáit előállíthat juk standard rekombináns DNS-technikák alkalmazásával is íWintaz and kilétéin, betűre 349, 293-9$ (1991)1 , Például olyan kiméra-antitesteket állíthatunk áld, amelyekben egy állati eredetű antiá•téétből származó antigénkőtd dómén kapcsolódik egy humán konstans doménhez ( például. Cahiily et al., 4,816,56? sz, CSA-beli szabadalmi leírás; Morrison et al., Proc. háti. Acad. Sci, USA 81,

6951-55 (1989)) . A kimérs-antitestek csökkentik az áiiateredetű antitestek esetében megfigyelhető immunválaszt, ha humán klinikai kezelésekbe;'· alkalmazzuk azokat.

Ezenkívül az LT-p-R-fc felismerő rekombináns humanizált antitestek szintetizálhatunk is - A humanizált antitestek kimérák, amelyek túlnyomórészt humán IgG-szekveneiákat tartalmaznak, ame^'3~ybe specifikus antigénkötésért felelős régiók vannak inszertárva (például dC 94/09679), Az állatokat az adott antigénnel immunizáljuk, a megfelelő antitestet izoláljuk, és a specifikus antigénkötésért felelős variábilis régió szekvenciáit tartalmazó részt eltávolítjuk. Az állati eredetű antigénkőtö régieket v . unvív.

5 azután klónozzuk olyan humán antitest-gének megfelelő pozíciójába, amelyekben előzőleg az antígénkötő régiókat deletáltuk, A. humanizált antitestek minimalizálják heterológ (más fajhői származó) szekvenciák alkalmazását humán antitestekben, és kisebb valószínűséggel váltanak ki immunválaszt a kezeit egyénben,

Különböző osztályokba sorolható rekombináns «nti-LT-p-H-antitesteket úgy is előállíthatunk, hogy anti-LT-β-Α variábilis doméneket és különböző osztályokból származó immunoglobulin humán konstans doménjeit. (CH1, CH2, CHÖ) tartalmazó kiméra vagy humanizált antitesteket állítunk elő. Például megnövelt antigénkötő-hellyel rendelkező anti-LT-p-R IgM-antiresteket ügy állíthatunk elő rekombinánsan, hogy az antigénkötöheiyet klónozzuk humán μ-lánc konstant régióit tartalmazó vektorba ( Aruianandam et al., d, Exp. Med. 177, 1439-50 (1933); Lane et al,, Eur, J,

Immunoi. 22, 2573-79 (1933); Trauneoker et al.,, Natúré 333, 63-70 (1939)]

Ezenkívül standard rekombináns DNS-technikákat alkalmazhatunk rekombináns antitestek kötési affinitásának megváltoztatására ügy, hogy aminosavakat változtatunk meg az antigénkötőhelyek szomszédságában. Humanizált antitestek antígénkötő affinitását molekuláris modellezésre alapuló mutagenezissel növelhetjük meg ( Queen et al,, Proc. Natl , Acad, Sci. USA 88, 10029-33 (1983); WO 94/04673] , (Szükségessé válhat növelni vagy csökkenteni az anti-LT-p-R Ab-k affinitását az LT-p-R irányában a megcélzott szövettípus vagy az előrelátható, adott kezelési előirat függvényében. Például előnyös lehet egy páoinest állandó szinten olyan anti-LT-p-R es.zsm/sz .:

» j**» »*»» . >>. X b, X .* ’„·

Ab-kai kezelni, amelyek képesek, csökkentve továbbítani a jelet az X.T-p-folyamatsoron keresztül szemiproíílaktikus kezelés esetén. Ehhez hasonlóan, az LT~p-R irányában megnövelt affinitásé anti-LT~p~R Ab--k gáltó hatása előnyös lehet rövid időtartamú kezelés esetén.

Anti-AT-p-R-antitestek mint AT-p-R-bXokkolöágensek 'V

LT-p-R-blokkolóagensként működő anti-LT-P-R-antítesteket úgy ,-k ' szelektálhatunk, hogy teszteljük azokat, milyen mértékben képesek gátolni az LT-p~R-indukáit citotoxicításfc tumorsejtekben (5.

példa).

A találmány agy előnyös .megvalósítási módja szerint alkalmazott készítmények és eljárások egérben termeltetett anti-humán LT-p-R-mAb-SDAS---at tartalmaznak. A .3« ábra mutatja, hogy az mAbBDA8 a találmány szerinti LT-p-R blokkoló ágensként viselkedik. biDr tumorsejtek növekedése megáll lFN-γ és szolubilis LT-al/p2-iiganöum jelenlétében. Kontroli-antitesteknek (IgGl) nincs hatása erre a nővekedesgátlásra. Viszont az anti-LT-p-R-mAb-SOAS blokkolja a szolubilis LT-«l/p2-ligandum WiOr-sejtnövekedést gátló képességét. Tehát egy humán LT-p-E-ra sepcitikos antitest a találmány szerinti LT-p-R-blokkoiőágensként működik,

Más, humán Χ,Τ-ρ--receptorra specifikus antitestek tesztelése eytén várható, hogy további, emberekben LT-p'-E-blokkcló ágensként működő anti-bT-p-R-a.ntiteste.ket lehet azonosítani az itt leírt rutin kísérletekkel és. vizsgálati eljárásokkal..

Sejtfelszíni LT-ligandumra sepcifíkus antitestek forrása

A. találmány másik előnyös megvalósítási módja szerint olyan készítményeket és eljárásokat alkalmazunk, amelyek Χ,Τ-β-Ε-blokiU. 5«'>/SS kóló ágensként működő, LT~ügandumra specifikus antitesteket tartalmaznak. Az enti-LT-B-R-Ab-kra fentebb leírtak szerint as

LT-p-R-blokkoióágensként működő ant i-LT-ligandum-anti testek lehetnek políklonálísak vagy monoklonálisak, és szokásos eljárásokkal módosíthatók antigánkótő képességük és immunogenitásuk modulálása céljából.

A találmány szerinti anti-LT-antitesteket termeltethetünk a két LT-aiegység közül akár csak az egyik ellen egyedileg, beleértve az LT-aiegység szolubilis, mutáns., megváltoztatott vagy kiméra formáit. Ha as LT-aiegységeket használjuk antigénként, akkor azok előnyösen LT-p-alegységek. Ha LT-«-alegységeket használunk, akkor a keletkezett antí~LT~«~antitestek előnyösen a sej tfelszíni LT-Ugandámhoz köbödnek, és nem keresztreagálnak a szekretáit LT-a-val vagy nem modulálják a TNF-R-aktivitást (a 3. példában leírt vizsgálati eljárások szerint).

Más módszer szerint homomer (LT-S), vagy egy vagy több LTalegységet tartalmazó heteromér (LT-a/p) komplexre specifikus antitestek termeltethetők, és szűrhetők arra, hogy LT-p-R-blokkoló ágensként aktivek-e. Előnyösen LT-oi/pl-komplexeket alkalmazunk antigénként. A fentebb tárgyaltak szerint előnyösen olyan anti-XrT~al/p2~antitestakhes jutunk, amelyek sejtfelszíni LT-iigandumokhoz kötődnek a szekretáit LT-a-hoz való kötődés nélkül, és a

TNF-R-aktivitás befolyásolása nélkül.

Poliklonális antí-humán-LT-a-antitestek előállítását ismertetjük. egy elbírálás alatt állő nemzetközi közzétételi iratban (WO 94/13808}, Monoklonális anti-LT-a- és anti-LT-p-antitestek leírását megtalálhatjuk Browning és munkatérsai közleményében

( J, Immunoi, 154, 33-46 (1395)1 .Egérben termeltetett anti-humán~LT-$~mAb~kat állítottunk elő a 6. példában leírtak szerint. Rágcsáló (marina) eredetű, anti-humán BT-^-R-mAb-Bs-et termelő hibridőmasejtvonalat (B9.C9.1) 1935. július 21-és deponáltunk sz American Type Cuiture Collection -nál (ATCC) (Rockville, MB) a Budapesti Szerződés cikkelyének megfelelően, és HB11962 ATCC-nyi Iván tartási. számot kapott.

Monoklonális, hörcsögben termeltetett anti-egér LT-a/^-antitesteket állítottunk elő a 7. példában leírtak szerint. Hörcsögeredetű, anti-egér LT-c/^-stAb-BB.Ff-ot termelő hibridóma sejtvonalat {SB.Fű.l) 1995, július 21-én deponáltunk az American Type Cuiture Collection-nál (ATCC) (Rockville, MD) a Budapesti Szerződés cikkelyének megfelelően, és HB11963 nyilvántartási számot kapott,

A fenti ATCC-deponálés nyilvános hozzáférhetőségének minden korlátozása visszavonhatatlanul megszűnik, ha a bejelentés elnyeri a szabadalmi jogot.

;ek

Anti-BT-ligandum-antítestek mint AT- β-R-b lökkel

Fluoreszcencia-aktivált sejtosztályoző (FACS) vizsgáltai eljárást fejlesztettünk ki az LT-alegységekre és LT-komplexekre specifikus antitestek szűrésére, amelyek LT-p-R-biokkoló ágensként viselkednek (6. és 7. példa). Ebben a vizsgálati eljárásban szolubiiis humán ΙΤ-β-R-Fc fúziós fehérjét adunk FMA-akt.ivá.11 11-2.3-sej tokhoz — amelyek sejtfelszíni. LT - komp lexe kot sze krétáinak ( Browning et al., J. Immunoi. 154, 33-46 (1993)] növekvő mennyiségű tesztantitest jelenlétében. Azt az antitestet szelektáljuk ki LT~j3~R~bl.o.kkol6ágensként, amelyik legalább 20%. SíO.Oe:

* *Φχ*

Φ «ί X * * * Sf φ χ _s. ψ '* * » Λ * λ χ

ΦΦ X φφ φψχ φ φ ’_φφ *

9 bán képes gátolni LT-p-receptor-ligandum kölcsönhatást.

Az egérben termeltetett anti~humán~LT-|l~mAb“B3 tesztelésére végrehajtott vizsgálati eljárás eredményeit mutatjuk be a 4. ábrán. A 4. ábra szerint az anti-rT-p-máb-B?) képes szelektíven blokkolni szolubílrs LT-p-H-Fc fúziós fehérje kötődését az aktivált sejtek felszínén lévő LT-ligandumokhoz. Ezek az eredmények megerősítik azt, hogy az LT-ligandumok alegységére specifikus antitestek LT-^-R-blokkoIöágenskánt viselkednek.

A fenti leírás szerinti FACS vizsgálati eljárást alkalmaztuk hörcsögben termeltetett# szolubilís egér-LT-az^^-komplexekre specifikus mAb-k tesztelésére ·:?. példa) . A hörcsögben termeltetett# anti-egér-LT-a/p-mAb-B8.FS tesztelésére végzett vizsgálati eljárás eredményeit a 2. táblázatban mutatjuk be (7. példa) . A 2. táblázat azt mutatja# hogy az anti-L^:r~a/£~m&b-3B>'F€ hatékonyan képes szolubilís mX,T-0-R-Fc fúziós fehérjéket (2. pátiba) sejtfelszíni LT-Iigandumokhoz# amelyeket rágcsáló (murine) eredetű T-sejthibrídcma termei, ás igy a találmány szerinti hl-$~R~blokkolóá€sensnek tekintjük azt.

Az állatok immunizálásánál# antigénként LT~alegység helyett inkább LT-a/^-kompIex alkalmazása hatásosabb immunizáláshoz vezet, vagy a sejtfelszíni LT-ligandumhoz nagyobb affinitással rendelkező antitesteket eredményez. Érthető# hogy sz LT-u/fi-vai való immunizálás esetén olyan antitesteket izolálhatunk# amelyek mind az LT-α-, mind az ΙΤ-β-aiegységen található aminosavakat felismerik (például olyan csoportokat? amelyek LT-a/fi-hézagot alakítanak ki). Humán LT-α/β heteromer komplexekre specifikus antitestek tesztelésével várható? hogy rutin, kísérletekkel, és az ne rr:

χ * φ .

A,,..

itt leírt vizsgálati eljárásokkal további anti-LT-antitesteket lehet azonosítani, amelyek Χ,Τ-β-R-blokkolőágensként működnek.

Az X^T-p-R-blokkol^ágensek gátolják a Thl-sejt^örvetitett kontakt hiperszenrítivitásfc egérben

A találmány szerinti Ll-fJ-R-blokkolc-ágensek képesek gátolni ?'^χ' a Thl-sejtfközvetikett immunválaszokat. Az egyik Thl-közvetített immunválasz a késleltetett típusú hiperszenzitivitás ( DTH; Cher and Mosmann, n. Immunoi. 138, 3638-94 (1987); lásd snég 1. R.oitt et al., Immnnclogy 22.1-22.12. old., Mosbv-Year Book Serepe Ltd., 3. kiadás (1993) általos ismertetés] , A DTH akkor a'tak.ul ki, ha antigén-szenzitizáit Thl-sejtek citokineket szekretálnak, azt követően egy másodlagos kölcsönhatás is kialakul ugyanazzal az antigénnel. A Thl-citokinek vonzzák és aktiválják a makrofágokat, amelyek további effektormolekulákat szabadiénak fel, amelyek gyulladásos reakciókat indítanak el.

A DTH-reakciókat három különböző típusba osztályozzuk: kontakt hiperszenzitivitás, tuberkulín-típusú hiperszenzitivitás és granuioma reakciók, A hiperszenzitivitás (HS) három típusa az idegen antigénre adott immunválasz sebessége és természete alapján különböztethető meg, ha azt közvetlenül a azenzítizáit célpontnál alkalmazzuk, vagy a kísérleti alany bőre alá injektáljuk. A DTH reakció úgy követhető,· hogy a bőrvastagodás sebességét ás fokát mérjük,

A tuberkulin-típn;2sű Hü-reakciák olyan, foőrreakoiók, amelyek agy olyan mikroorganizmusból származó idegen antigén injektálási helyénél lápnak .fel, amelynek a pácienst sár előzőleg fertőzte ipáidon! Hyoobaofariam tnbercolosis vagy M. iaprae) . Ezu a bőr····

SS,25S/SZ reakciót, amely 48-72 óra között maximális, gyakran alkalmazzák diagnosztikai szenzltivitás-teszteknél olyan mikroorganizmusok tesztelésére, amelyek korábban a szervezetet fertőzték (például tuberkulin bőrteszt). Amint a tuberkulin-típusú sérülés fejlődik, granuloma-reakcióvá alakulhat, ha az antigén tartósan jelen van a szövetben.

A granuloma-reakciók klinikailag a legsúlyosabb DTHreakoidk, mert sokféle, Thl-sejtközvefített megbetegedéssel aszszociáit patológiás hatáshoz vezethetnek. Granuloma-reakciók akkor fordulnak elő, ha antigének vagy ímmunkomplexek nem tisztulnak meg a makr.ofágoktői, és folyamatosan stimulálják a Thloitokinszekréoiöt. Krónikus gyulladás és aktivált makrofágoknak a stimulált helynél való aggregácíója jellemzi a granulomareakciókat,

Az epiteliális sejtek magja és azok a. makrofágok, amelyek limfocitákkal és rostos lerakódásokkal Γfíbrotlc deposition”; vannak körülvéve, egy megkeményedett szerkezetet alakítanak ki, amit granulomának hívunk, Néha kiterjedt sejtpusztulás van granuioma. belsejében (például a tuberkulózissal fertőzött tüdőszövetben) , A granulomareakeió célszövetében a keményedés körülbelül 4 hét alatt jön létre.

A granuioma kialakulásának gyakoriságát befolyásoló ágenseket schistosome-indukáit egerek alkalmazásával azonosíthatjuk { Am.tr i et ai,_f Natúré 356, 604-60? (1992)) . A schistpsoma-giHozták parazitikus megbetegedést (vérméteiy) okoznak, amely granuioma képződéséhez vezet a sebtstosoma-peték körül, amelyek fertőzött máj kapuéröen d' portai vennie»; rakódnak le. Est a

«ί χ tffcv χ*

Φ * * Φ

Thl-közvetített DTH-immunvéiaszt gátlő ágnensek csökkentik a granuloma méretét, vagy granuloma kialakulásának gyakoriságát vagy sebességét sc'histosoma-fertőzött égé rmá jakban. A schistoscma-pe·tőkre adott celluláris reakció időben növekvő koncentrációjú, feltételezett LT-^i-R-blckkolőágenssel kezelt egerekben kialakult granulomák számának és méretének meghatározásával jellemezhető számsserüen<

A kontakt hiperszenzitivitás (CHS) a DTH-k az az osztálya, amelyben a bőr a célszerv. A CHS-ben egy gyulladásos immunválasz alakul ki, amelyet egy reaktív kaptán bőrbe jutása lokálisan vért ki. Az allsrgén általában legalább egy hapténmolekuiát tartalmaz, amely rendszerint kicsi ahhoz, hegy egymagában viselkedjen antigénként. A haptén behatol az epidermiszbe, es egy normális fehérjével reagál a bőr alatt, új antigénkomplexet kialakítva Ha a szenzitizált páciens újra a haptén hatása alá kerül, az DTH-immunválaszt vált ki. A haptén-bordozófehérje konjugátum az antigént hordozó sejtekkel aktiválja az effektor mechanizmusokat, amelyeket citokinfelszabaduiás (például IL-2, 1L-3, IFN-v vagy GM-CSF) indít el. A felszabadult citokin-kaszkád CDs·;· T-sejtproiiferáciőt, különféle sejtfelszíni adhéziós molekulák expressziős jellegének megváltozását, valamint T-sejbeknek és makrofágoknak a bőrben lévő gyulladási helyhez való vonzódását okozza, A crtokinkaszkáo és az eredményezett vazodiiatáciő, celluláris infiltráciő valamint a dermisz és az epidermisz ödémása a célszövet duzzadásához és gyulladásához vezet, amely felelős a bőr vastagodásában megnyilvánuló DTH-reakelőkért,

Hogy egy adott haptén milyen mértékben képes szenzitizáiní vgy egyént, sokféle faktortól függ. Ilyen faktor például, hogy a haptén mennyire képes behatolni a bőrbe, hogyan képes reakcióba lépni a gazdaszervezet hordozófehérlejével kcnjugátum kialakítására. Egy olyan haptén, amely szinte minden egyént szenzitizál, a 2,4-dinitro-fiuor-benzoi (DNFS),

A bőrnek egy hapténre, például DNEB-re adott CHS-immunválasza egy klasszikus, állatokban alkalmazott modellje a sejtközvetített immunitásnak. A CBS-immunválasz lokalizálása szenzitlzáit egér fülében a sejtkösvetltett immunválaszt in vivő könynyű, pontos és .reprodukálható mérését teszi lehetővé a fölvastagság mérése által. Az egérben végzett CBS-reakcíó részleteit és a D^ES-indukált gyulladásos immunválasz hisztopatoiógiáját már leírták [ Chrisholm et al., Eur. J. Immunoi. 23, 682-688 (1993)I ,

A DNFB kontakt hiperszenzítlv immunválasz índukálására való képességét a legtöbb egyénben alkalmazhatjuk olyan ágensek azonosítására, amelyek csökkentik vagy megszüntetik a Thl-sejt közvetített DTH-reakciókkal asszociált gyulladásos immunválaszokat. Szolubiiis egéreredetű' LT-^-F-Fc fúziós fehérje hatékonyan gátolja a uAFB-indukált kontakt hiperszenz.it Ív immunválaszokat egerekben ·8. példa). Az egereket először DAFB bejuttatásával szenzitizáljuk a hátsó láb talpába két egymás követő napon. öt nappal a kezdeti szeuzitizáiás után, még nem Irritáló mennyiségű, hordozóban oldott D'NfB-t adunk a bal fül felületeire. A. hordozó-oldatot egymagában a jobb fülbe juttatjuk kontroliként <

UUZiU/S;' ν *

X *φ Φ **

X X Φ Φ X Φ Φ φφ> ÍY * * >'

LT-p~R-blo.kkolóágensként növekvő koncentrációban adunk, azután mLT-p-R-Fc-t (2. példa) az egereknek intravénás injekció formájában <8. példa), PBS-puffer egymagában, vagy humán XgG fúziós fehérje (LFAú-Fc) szolgál negatív kontrollként# és anti~7LA4~ specifikus mAb (PS/2 mA3) injekciója szolgál pozitív kontrollként, amely ismereteink szerint gátolja a CHS-t. A fertőzés után huszonnégy órával megmerjük egerek egyes füleinek vastagságát. A füidu-zzadásban jelentkező immunválasz ΧΤ-β-R-bIokkolőágens általi gátlását úgy kapjuk meg# hogy összehasonlítjuk a kezelt csoportokat a negatív kontrollcsoportokkal.

Az 5. ábra bemutatja# hogy mLT-p~R-Fe a felduzzadásban megnyilvánuló immunválaszban szignifikáns csökkenést okoz a DNFB-kezelt egerekben# ha azokat a gátlás nélküli DNFB-keze.lt kontrollállatokhoz (PBS és LFAS-Fc? hasonlítjuk. Szolubilis hT~p~R képes blokkolni ezt a CKS-reakciót olyan hatékonyan# mint az inhibitorként alkalmazott anti-VLA4-specifikus oAh (PS/2 mAb) # amely a T-sejtöknek a fertőzési helyre való beáramlásának blokkolása által hat ( Chisholm et ai., Búr,. J. Immunoi, 23, 682-88 (1993)] <

Ezek. az adatok azt mutatják# hogy szolubilis LT-β-Η fúziós fehérje in vivő LT-p-R-blokkolóágensként működik# és hatékonyan képes gátolni a. Thl-sejtközvetített immunválaszt állatoknak való beadás esetén. A találmány szerinti# in vivő azonosított ΊΤ-β-R“blokkolóágenseket tesztelhetjük a fülduzzadást felhasználó vizsgálati eljárással, vagy más# fentebb leírt DTH-vizsgálati eljárással további LT-p-R-blokkolóágensek azonosítására# amelyek hasznosak s Thl-sejt-asszooiált immunválaszok súlyosságának in vivő csökkentésére.

Φ V φ

Az LT-p~R-feXökköló^gens®k nem gátolják a Th2~s&jgközve ti tett (humorális) immunológiai válaszokat

Ahogyan fentebb bemutattuk, a találmány szerinti LT-p~A blokkol^ágensek képesek Thl-sej^közvetített effekfcormechaniz~ must, például kontakt típusú hiperazenzitivitást gátolni (5, ábra) , Bz a T.hl-sej iközvetített immunválasz úgy gátlődik, hogy az szignifikánsan nincs hatással a Thz-sejtfüggő immunválaszokra. Az LT-p-H-blokkoidégensek Thl-sejtáüggö immunválaszokra kifejtett differenciális hatását bemutatjuk egy Th2-sejtfüggő immunválasz megfigyelésével, — például egy elsődleges antitestválaszt vagy egy izotipus-átalakulást — egy LT-p-A-blokkoI^ágens jelenlétében <

Az egereket ötször oltjuk e tiz napos kúra alatt vagy szolubilis LT-β-Β. fúziós fehérjével (mLT-p-R-Foí 2. példa), vagy kontroll IgG fúziós fehérjével (ÜFA3~Fc), vagy kezeletlenül hagyjuk azokat, A második injekció után minden egeret beoltunk a farkuk tövében 100 μΐ ovalbumint tartalmazó 100 pi komplett Freund-féie adjuvánssal. 11 nap múlva az elsődleges szérumot az anti-ovalbumi.n~speoifrk.us elleanyag-titerre vizsgáljuk IgGl-, XgG2a- és IgM-izotipusra specifikus ELISA alkalmazásával,

A S, ábra bemutatja az mLT-p-R-Bty egéreredetű LT-P-R-blokkolőégene hatását, a szérumban található anti-ovalbumin-eilenyag termelésére az ovalbuminnsl immunizált egerekben (S. példa). Az

LT-p-R··^· blokkoiöáo'ens beadása nincs szionifikáns hatással az .4-0 ovalbumln-irmsunizálást kővető elsődleges antitest-titerre, őszszehasonlitásképpen, a CD40--iigandum-indukált CG4ö~receptor jelzőrendszerrel való beavatkozás teljesen blokkolja az antigén specifikus IgG-válasst egerekben ( Eenshax eb al., J. Exp. Red, ISO, X889-19Ö0 (1994)1 » A CD40 a TAF-ossiád egy másik ligán™ dum/receptor-párja.

A teljes izvnunoglobuiin-termelés és -érés tisztán fel-sejt függő. Azonban ez is nyilvánvaló, hogy az Thl-citokinekhes tartozó IFN-y részt vesz, de nem abszolút mértékben szükséges az IgGza-alosztáiyok közötti átalakuláshoz [Huang et al., Science 259, 1742-45 (19S3jj , Az LT-O-R-blokkelőágensként viselkedő mLT-p-R-Fc nem gátolja az IgGsa-átalakulást ezekben a kísérletekben. Lehetséges, hogy a találmány szerinti LT-p-R-blokkoiőiagensek nem blokkolják a Thi-sejbközvetitett immunválasz ezen humorális részét, Ezenkívül az mET-p-R-Fe-vei kezeit egerekből származó limfociták proliferácios válaszai sem csökkennek {10, példa; 7, ábra),

Ezek a kísérletek alátámasztják azt, hogy a találmány szerinti LT-p-R-blokköldágensek beadására épülő terápia nincs ellentétes hatással egy immunválasz Thr-függő antitesttermeléssel járó funkciójára,. Az antitestválasz normál lefutását illusztráljuk a 6. ábrán, amely azt indikálja, hogy szoiubilis mLT-β-Η-Főve 1 való intenzív kezelés nem. toxikus egerekre, továbbá bemutatja a találmány szerinti készítmények és eljárások használható terápiás tulajdonságát.

T~helper~.sej tkörvetitett betegségek

Úgy tűnik, hogy sok szervspecifikus autoimmun-áilapot patológiás Tál-immunválasszal függ össze. Az eredményeket összefoglaló közlemények ismertetik ( Módiin és hutman, Current Opinion in Immunoi, S, 511-17 •'isn-u (laáöi; Romagnani et al,, Ann. Rév,

ΧΦΦ

Φ Φ >· Φ ΦΦ< X

Φ Φ X Φ Φ Φ <

φφφ Φ* ΧΦΦ X Φ Φ*

Λ ·*>

** ··'

Immunoi, 12, 227-57 (1994); , Ilyen szervspeeifikus autoimmun--állapot például: szklerézis multiplex, inzulinfüggő cukorbetegség, sympathetious ophtaImin (szemgyniladás), a középső szemhártye gyulladása (uveitis) vagy pikkelysömör (psoriasis).

Az inzulinfüggő cukorbetegség (diabetes meiiitus) egy autóimmun megbetegedés, amelyben az inzulintermele béta --hasnyálmirigy-sejtek elpusztultak a Langerhans-szigetekbe történd leukooita-infiltráciö következtében, A cukorbetegség gyorsan indukálható újszülött nonobese diabetio (KOD) egerekben aktivált predzabetikus splenooiták átültetésével, A közelmúltban Thlvagy Th2-szerű sejteket, egyébként genetikailag hasonlónkat, juttattak újszülött dOü-egerekbe, Csak a Thl-sejtek indukáltak gyorsan cukorbetegséget, szinte valamennyi reoipiensben ( Katz et al. , Science 28B, 1185-88 (1995)] , Ezt azt indikálja, hogy a találmány szerinti LT-p-R-blokkoidagensek, amelyek képesek in vivő gátolni a Thl-sejtpözvetített immunválasz hatásait, hasznosak lesznek az inzulinfüggő cukorbetegség kezelésében és megelőzésében .

héhány szisztémás autoimmun betegség, például különféle artbritiáe-e, Tbi-sejt-ssszoczáitak, A reumás Izületi gyulladás (rheumatoid arthritis) és a Sjorhren-féie szindróma egyaránt ügy tűnik, hogy a Th8- és Thl-sej bekkel függnek össze. Ellenben úgy tonik, hogy a szisztémás lupus erythematosus (SIS) abnormális

Thö/Th2~domináns immunválasszal rendelkezik, héhány krónikus gyulladással járó betegség is úgy tűnik, abnormális Thl-típusú immunválasszal rendelkezik, például a vastagbélgyuiiadás, a tüdő sarooidoslsa és az ailpgraft-kilöködss« fr * ** *

X X fr X X-X fr «frfr frfr frfrfr fr fr x* .< Λ ο

A vastagbélgyulladás (1BB) emberekben legalább kér kategóriája vsa, a fekélyes vastagbéigyuiiadás és a Crohn-féle kór. Ismereteink szerint mindkét rendellenesség immunopatoiögiás autoimmunszeré rendellenesség. Az 1BD egerekben felállított modelljében nyilvánvaló, hogy néhány ágens, amely blokkolja a Tél-immunválaszt, képes blokkolni a betegség kifejlődését vagy gyógyítja azt fit Eowrie et al,, Immun!fy 1, 553 (1594)]. Lehetséges, hogy az immunválasz Tál-komponensének gátlása jótékony hatással lenne humán rBD-ben is. Az ΪΒΏ több modelljét leírták es összefoglalták [ C, Elsőn et al., Gastroenteroiogy XG9, 1344 (1995)1 . Legalább három modellesoport létezik, a kémiailag indukált, a poiimor/mikroorganrzmns-inöukált és az immunológiai típus mutáns egerek alkalmazásával.

Egy általánosan alkalmazott polimer/mikroorganizmus-indnkáit modellben dextrán-szuifát-oldatot teszünk egerek ivóvizébe, emésztés közben a bél epiteiíális rétegét az irritálja, amely sérüléshez vezető beható immunválaszt vált ki. Az áriatokban vastagbéigyuiiadás fejlődik ki, amely hasmenésben, véres székletben, testtömeg-csökkenésben és a vastagbél falának expanziója miatt a vastagbél megrövidülésében nyilvánul meg. Ez a modell baloldali vastagbélgyuiladást és epiteiíális diszpiáziát indukál, amely rákhoz vezethet, amely fekélyes vastagbélgyailadásban nyilvánul meg.

A második modell C&4 T-sejtek szelektált készletének sóidegerekbe való átültetéséből áll, azaz olyan egerekbe, amelyekből hiányoznak a T- és B-sejtek, ízt Powrie et al., International immunology 5, 1461-1471 (1993) ; Morrisey et ai., J, Exp. Med.

»';Ue/E > * φφφ φφφ* φφφί φ ·» φ * φ φ φ ¢. φ

Φ Ϋ Λ *

Χ-ΦΦ -φ -φ φ *

Χ7Β, 2 37 (1993)} , Amint a kiszelektált sejtek, a CD4SRE'^^-sejtak expandálnak. és helyreállítják, a scd.d~egeret, az autoreaktív Tsejtek megjelenését megakadályozó normál mechanizmusok nem műkődnek, és autoreaktív sejtek fejlődnek ki, Patkányokban megfigyelték, hogy a sejtek sok szervvel reaktívak, míg egérben a reaktivitás elsősorban csak a bélben fordult elő. Olyan ágensek lesznek eredményesek ebben a modellben, amelyek vagy megváltoztatják az autoreaktív sejtek expandálását és kifejlődését, vagy as olyan ágensek, amelyek képesek blokkolni a sejteket a bél megtámadásában. Ezenfelül, mivel es a modell legalább részben .<· utánozza az autoreaktív immunrendszer sejtjeinek patológiás fep j^?lődését, azok a kezelések, amelyek blokkolják ezt a modellt, tulajdonképpen a betegségre módosító hatással lehetnek emberekben , Ebben a modellben TbF-re specifikus elleanyagok képesek blokkolni a betegséget [ F. Eoorie et al., Xmmunity X, 552 (1994)]/ és ezeket az antitesteket hatásosnak találtuk humán betegségek kezelésében is ΓΗ, M. van Süliemen et al., Gastroenterology löé, 109 (1995)1 . Tehát a modell alapján prognosztizálhatjuk, begy melyik ágens lehet terápiásán használható IBS eseten. Ezenkívül, mivel a GD4SRB-modell Thl-közvetített megbetegedés folyamatának egy példája, a modell — különösen patkány

Óvókban ·— több szervben vezet megbetegedéshez, sz LT0R-Ig eredményessége a rendszerben azt indikálja, hogy ez LTflR-Ig vagy más, as LTpR és Iigandumai közötti kölcsönhatásokat blokkoló eszközök jótékonyak lehetnek rokon tipusű immunológiai betegségek széles körében<

Általában azt, hogy az suto-antrtestek a specifikus T>·>·>

sejtekkel szemben pontosan milyen máPékben járulnak hozzá ezekhez az autoimmun betegségekhez, még nem Írták le, A celluláris immunválaszoknak lehet nagyobb hozzájárulásuk a szisztémás autoimmun betegségek patogenitásáhez, amelyekről azt tartják, hogy elsődlegesen antitestek által meghatározottak, például különböző arthritides esetén,

Néhány patogén fertőző ágens elleni normái immunválasz szintén kiválthat Thi-váiaszt, amely kiterjedtté válhat, és orvosi promlémeként merülhet fel. Olyan granaloma-reakciők (a DTHimmunvéiasz egyik osztálya fentebb leírtak szerint), amelyek súlyos orvosi problémához vezetnek, például a lepra, granuloma kialakulása tuberkulózisban szenvedő páciensek tüdejében, sarcéidosls és sohlstosomlasis [ Rozit et al,, Immunoiogy 22,5-6, old, (dosby-Year Book Európa Ltd«, 2, kiadás, 1393] , A pikkelysömör szintén valószínűleg Thl-sejtek által közvetített,

Citolitikus T-sejtek, például CTL-ek (CD$ pozitív T-sejtek) szintén feloszthatok Thl- es Thl-szerű populációkra, tgy leheséges, hogy sok minden, ami a Th-csopertckréi ismeretes, alkalmazható a CD6é sejtekre is, amelyek elsősorban antiviráiis és az átültetett szövet (graft) kilökődésénél működő Immunválaszokban játszanak szerepet,

X/T-ő-R-bXokkoldáganseket alkalmast keneXéaek

A találmány szerinte, ^készítményeket hatásos dózisban adjuk ne az adott klinikai állapot kezelésére. Az előnyös gyógyszerészeti forma és a terápiásán hatékony dózis meghatározásához adott alkalmazás esetén szakember figyelembe veszi a páciens állapotát és testtömegét, a kívánt kezelés mértékét és a páciens

φ >

φ ΧΦΦΦ φφ φ φ * ♦ ♦'χ >

* φ * *

ΧΧΛ- X * ** kezelés irányában mutatott toleranciáját. Körülbelül 1 mg/kg szolúbilis LT-p-A beadásától várható, hogy megfelelő kezdő-dózisa as optimalizált kezelési adagolásnak.

A. terápiásad hatékony dózis meghatározása történhet úgy is, hogy in vitro kísérleteket végzünk, amelyek a célsejtek burkolásához 1-14 napig szükséges LT-p-E-blokkolőágens (LT-p-R vagy LT-ligandum pozitív sejtek, a blokkol^ágenstől függően1 koncentrásióját mérik, áz itt leirt reoeptcr-ligandum kötési vizsgálati eljárást alkalmazhatjuk a sejt burkolási reakció követésére. Az LT-p-R vagy LT-ligandum pozitív sejteket FACS alkalmazásával elválaszthatjuk az aktivált limfocíta populációtól. Erre az in vitro kötési vizsgálati eljárásra alapozva kiválaszthatjuk as IT-^-R-felokkolőágens alkalmas koncentráciőtartományát az állatok tesztelésére, as itt leírt vizsgálati e.ljárásoknak megfelelően.

A találmány szerinti szolúbilis LT-p-R-molekulák, anti-LT-ligandum és anti-LT-p-R Ah-k beadása történhet egymagában vagy m kombinációban, beleértve az antitestek vagy komplexek izolált és tisztított formáit, sóit vagy gyógyászatilag elfogadható származékait, ez végrehajtható bármilyen, immunszupressziv aktivitást kifejtő ágensek szokásosan elfogadott beadási módján.

A terápiában alkalmazott gyógyászati készítményeket sokféle formában -alkalma.zhatjuk. Például szilárd, félig szilárd és folyékony adagolási formában, például tabletták, pirulák, porok, folyékony oldatok vagy szeszpenziök,, kúpok valamint injekciós és infúziós oldatok formájában. Az előnyös forma a tervezett beadási módtól és a terápiás alkalmazástól függ, A beadás módja lehet orális, parenterális, szubkután, intravénás, sérülésbe frfrfrfr fr frfrfr (íntralesional) vagy topikálísan,

A találmány szerinti szolubilis LT-p-R-molekulákst, anti-Ufllgandum éa atti-tT-β-Α Ab···kát steril, ízotóniás formákba is helyezhetjük olyan kofaktorokkal vagy azok nélkül., amelyek stimulálják. a felvételt vagy a stabilitást. Az előnyös forma folyadék, vagy lehet liofilizált por. Például a találmány szerinti szolubilis LT-^-R-moiekulákat, anti-LT-lígandum és anti-LT-0-R Ab-kat hígíthatjuk, a kiszerelt formában alkalmazott pufferrel, például 5,0 mg/ml oitromsav-monohidráttal, 2,7 mg/ml triná.tr.ium-citráttal, 41 mg/ml mannózzal, 1 mg/ml giicinnel vagy 1 mg/ml poliszorbit-20-al. Ezt az oldatot liofilízálhatjuk, hűtőszektényben tárolhatjuk és a beadás előtt újra feloldhatjuk steril vízzel U4a.ter-ror-lnjection, USB) .

A készítmények előnyösen tartalmaznak szakember által ismert, szokásos gyógyászatilag elfogadható hordozókat (lásd például Remíngton* s Bharmaceutical Sciences, 16, kiadás, 1980, Mac Bublishing Company). Ilyen gyógyászatilag elfogadható hordozók lehetnek például máé gyógyhatású ágensek, hordozók, genetikai hordozók, adjuvánsok, segédanyagok stb., úgymint humán szórum-albumín vagy plazmapreparátumok. A készítmények előnyösen dózisegységek formájában vannak, ás rendszerint naponta egyszer vagy többször adjuk be.

A találmány szerinti, gyógyászati készítmények beadhatók mikrorészecskék, liposzömák, más mikropartíkulúrnőt alkalmazó további törendszer vagy késleltetettet felszabaduló formák alkalmazásával, amelyeket a célszövetbe, közelébe helyezünk vagy más módot kapcsolatba hozzuk azzal, vagy a véráramba juttatjuk, Al

Φ ,« Φ Φφφφ ΦΦ * Φ φφ φ « φφ φ * κ φφ ί «Φά ♦ kaimat késleltetett felszabadulást biztosító hordozok például, szemipermeábilis, adott alakúra formált poiimermátrixok, például kúpok, vagy mi krokaps aulák, Beültethető vagy mikrokapszuláris késleltetett felszabadulást biztosító mátrixok például a polllaktidok (USP 3.773.319 számú szabadalmi Irat; EP 58.481), L-glutamansav és etil-L-giutamát kopolimerjel ( Sidman et al., Slopeiymers 22, 547-56 (1985)), vagy poli (2-hidroxi-etil-metakrilát) vagy etilén-vinil-acatát (hangét et al., dk Elemed. Mater. Rés. 15, 167-277 (1881); Tanger, Chem. Tech. 12, 95-105 (1882)) .

A találmány szerinti szoiubiiis ΤΤ-β-R-molekuIákat, anti-TT-ligandum és aatl-LT-p-R Ab-kát egymagában vagy kombinációban tartalmazó liposzomákat szakember képes előállítani ( lásd például DS 3.218.121; Epstein et a.l., Proc. Patt. Acad. Sci. USA 82, 3688-92 (1985); Hwang et al., Proc. háti. Acad. Sci. USA 77,

4030-34 (1980); USP 4.485,045 és 4.544.545 számú szabadalmi iratok) . Szokásosan a liposzómák kicsik (körülbelül 200-800 Angström), unila.mel.lsr.is típusúak, amelyekben a iipidtartalom nagyobb, mint 30 moi% koleszterin. A koleszterin aranyát úgy választjuk meg, hogy a szoiubiiis LT-p-R-moiekula, az anti-LT-ligandnm és az anti-TT-0~R~Ab felszabadulása optimális sebességű legyen.

A találmány szerinti szoiubiiis hT-β-Ρ-moiekulákat, anti-hl-ligandum és anti-LT-β-Η Ab~kát olyan irposzómákhcz is kapcsolhatjuk, amelyek más LT-p-R-biokkololágenseket, immunoszupresszív ágenseket vagy oitokineket tartalmaznak, az LT-h-R blokkoló aktivitásának modulálására. LT-jj-P-moiekuIák, antí-LT-Ilgandom és ant i-LT-p-R Ab-k. lipos2ómákhoz való kapcsolását elvégezhetjük κδ.ΖϊΟ/δε ♦ ί <·

X ΧΧφ Φ XX ΦΦ XX Φ χ XX Φ ΦΦχ X

X Φ y φ * φ X

Α'ΦΧ φφ Χ#Φ χ Φ * bármilyen ismert keresztkötő-ágens, példáéi heterohifunkciős keresztkötő ágensek al kalmazásával, amelyeket széles körben alkalmaznak toxinek vagy kemoterápiás ágensek antitestekhez veié kapcsolására célzott szállítás esetén. A iiposzőmákhoz való kapcsolás elvégezhető szénhidrátra irányuló keresztkötö reagens, például 4-(4~mateimido~£enil)-vajsav-hídrazid (MPBH) alkalmazásával ( Duzgunes et al., J. Cell. Biochem. Abst. SuppI. 16E 77 (1992)] .

Az Χ,Τ-β-Η-

A találmány szerinti LT-^-R-biokkoldágensek képesek szelektiven gátolni Ibi-, de nem Thz-sej t'függö immunetíektor-meoha^x>nízmusokat. Az uT-^-R-biokkoIőégensek hasznosak olyan állapotok kezelésében, amelyeket Ibi-típusú eitokinek (például IL-2 és IFR-'-v} aktivitása miatt vált súlyossá. Mivel a Thl-oitokinek képesek gátolni a Th2-se j t/függö immunválaszokat, az LT~p~R~blok~ kelóágensek közvetve stimulálhatnak bizonyos Thz-sejtfüggo immunválaszokat is, amelyeket normálisan a Thl-indukált oitokinkaszkád gátol.

A Th!-sejtes immunválaszok szelektív azupresszálásának képessége (vagy közvetve a Th2 szimulálása) hasznos a többféle típus magában foglaló sejtközvetitett immunválaszban kialakult abnormaiitások kezelésére, beleértve különböző autoimmun és krónikus gyulladt állapotokat, antigéntoleranciát, és átültetett szövetgraftok és transzplantáit szervek celluláris kilökődését.

A fentebb tágyaitak szerint a Thl-sej kekkel összefüggő rendellenes immunológiai állapot kezelése általában immunmodulátor és immunoszupressziv ágenseket alkalmaz, amelyek pieíoíenus.nm

tropikus hatásokkal rendelkeznek sokféle sejttípusra és immunválaszra. Ezek a nem-specifikus immunoszupressziv ágensek általában nagy mennyiségben, gyakran cítotíxikus dózisban szükségesek, ami ellenkező mellékhatásokat okoz.

Azt a képességet, hogy egy immunválasz jellemzőit meg lehet változtatni, alátámasztja a fentebb tárgyalt egérben jelentkező cukorbetegséggel kapcsolatos, közelmúltban megjelent tanulmány ( Katz et al«, Science 288, 1185-88 (1995}] , és egy allogén transzplantációs modellben ( Sayegh et al., J. Exp, Med. 181, 2 889-74. (1995)} . Egy nemrégiben közzétett tanulmányban CE28-E7 T-sejtes kostimulátor folyamatsort blokkoló fúziós fehérjéről kimutatták, hogy vesegraft-toleranciát indukál. A toleranciát in vivő befolyásolni lehet Thl-cítokinek csökkentésével, és Th2oítokinek növelésével. Ezek az adatok azt indikálják, hogy a találmány szerinti LT-p-R-blokkol hasznosak szö-vetgraftok és transzplantált szervek celiuláris kilökődésének elnyomására, a Thl-sejtM'Zvetített citokin-felszabadítás által.

A találmány szerinti készítmények és eljárások által alkalmazott LT-p-R-blökkoló^gensek módosíthatók úgy, hogy kívánt színtű ΕΤ-β-R-jelzőrendszerhez jutunk, a kezelt állapottól, rendellenességtől vagy betegségtől függően. Előre látható, hogy az LT-pR~jelzőrendszer tökéletes szintje finoman beállítható az 2,T-p~Rblokkoiöágensefc koncentrációjának a megfelelő molekuláris célpontjuk irányában kifejtett affinitásuk manipulálásával.

Például a találmány egy előnyös megvalósítási módja szerint, a szolubilís LT-S-R-molekuIákat tartalmazd készítményeket adjuk be a kísérleti alanynak. A szolubilís LT-β-receptor képes

νΦ

ΚνΦφ·· >*'·♦

VV A

Φ * X hatékonyan kcmpeticioha lépni a sejtfelszíni LT-β-receptorokkal a sejtfelszíni LT-lígandumok kötéséért. A sejtfelszíni 'LT-ligandómokkal való kompétleié képessége a szolubilís és a sejtfelszíni LT-p-R-molekulák relatív koncentrációjától? és ligandumkötesük relatív affinitásától függ.

Olyan mutációkat tartalmazó szolubilís 1-T-P-R-molekulák# amelyek a mutáns szolubilís LT-fi-R-nek a sejtfelszíni LT-iigandum. irányában mutatott kötési affinitását növelik vagy csökkentik# szokásos# szakember által jól ismert rekombináns DNS-technikákkal állíthatók elő. Helyspecífikus vagy random mutációkat tartalmazó nagyszámú molekulát tesztelhetünk az itt leírt rutin kísérletekkel és eljárásokkal abból a célból# hogy milyen mértékben képesek LT-^-R-blokkol^ágensként viselkedni,.

Ehhez hasonlóan# a találmány egy másik előnyös megvalósítási módja szerint# vagy az LT-^-recepfcorra# vagy egy vagy több LT-ligandum alegységére specifikus antitestek ηϊ-β-R-blokkolc· ágensként működnek. Szén antitestek LT-^-receptor-jelzőrendszert blokkoló képessége mutációval# kémiai módosítással vagy más módezerrel módosítható# amely megváltoztathatja a hatás helyéhez juttatott antitest hatásos koncentrációját vagy aktivitását.

Az ΙΤ-β-R.-jelzőrendszer teljes gátlás nélküli csökkentésének képessége fontos lehet csökkentett színtű LT-p-R-jelzőrendszer kialakítása és fenntartása érdekében# amely normál immunmuködöst segít elő# miközben gátolja a Thl-sejtkösvetitett immunválaszokat# amelyek túlzottak vagy abnormálisak.

Az LT-a-gen megszakítása egérben abnormális perifériás limfoid szervfejlődéshez vezet ( De Togni et al.# Science 2é4, •O v

ΦΦ ΐ *χφ* ΦΦΦΦ χ Φ ΦΧ Φ Φ

Φ Φ* φ Χ«φ Φ

Φ Φ χ φ φ :φ χ

X ΦΦ ΦΦ ΧΧφφΛ ΦΦ

703-7 (1994)) , Az ilyen egerekből hiányoznak a nyirokcsomók és lépükből hiányzik a rendszerint jól látható határvonal T- es Bsejtben gazdag régiók között a gennyzacskokban- Meggyőződésünk szerint ez a fenotípus a sejtfelszíni LT-indukált LT-p-Rjelzőrendszer hiányára vezethető vissza, mivel hasonló fenotipu™ sokat nem lehetett megfigyelni ’fRF- akti vitás modulálása által.

Az LT-p-R-folyamatsor szelektív vagy részleges blokkolásának képessége igy hasznos lehet olyan abnormális llmfoid szervbejiödés kezelésére, amely az ΑΤ-β-R-folyamatsor jelzőrendszerének téves vagy túlzott mértéké expressziemével asszociált, héhány Thl-asszociált reakció kritikus összetevője számos sejtközvetitett immunválasznak ( Romagnsni, S., Ann, Rév. Immunoi. 12, 227-57 {1994)], és a Thl-sejt aktivitásának teljes gátlása bizonyos körülmények között nem kívánatos. Például egy egér képes hatékonyan ellenállni egy parazitafertözésnek, ha jó Thl-immunválaszt képes elindítani. Fertőző ágensek, például história és Toxoplasma szintén erős Thl-típusű immunválaszokat veit ki, Emberekben a Mycobaoterium tuberculosis-ra adott immunválasz tűnik Thl-alapon működőnek. Az egérben jellemzett teisbmanlasis patogenecitas a Thl-immunvélaszokhoz hasonló válaszokat vált ki í Reed and Scott, Cnrrent öpinion in immunoi. 5, 524-31 <1973)1 ,

A Thi-gátiás mértékét befolyásoló képesség az LT-p-Rjoizörendszer blokkolásával fontos lehet a jótékony hatású eredmények maximalizálásához, amelyeket a találmány szerinti ΤΤ-β-Ηbiokkolóágensekkeí való kezeléssel érhetünk el,

A következő példák a találmány szerinti ssoiubiiis ηΤ-β-retantorokat, anti-hT-ligandumot és anti-LT-Ö-R-antitesteket, vaiaís. 3ί3/·5ε

X >φ ♦ Α Φ * Φ Φ Φ

ΦΦΦ Φ** *Φ mint azok jellemzésére alkalmazott, módszereket illusztrálják. A példákat nem tekintjük korlátozónak: a példákkal a találmány szerinti megoldást kívánjak illusztrálni, a találmány tárgyát csak a szabadalmi igénypontok korlátozzák,

1. példa:

.Szolubí lie, humán hTyá?~xeceptorok előállítása ímmueoglobulin-Jd fériés fehérjékként

Szomatikus sejthibridhőí származó humán lap -átírt szekvenciák könyvtárából, izolált, humán cONS-klön szekvenciát ( Saens et al., Senomícs XŐ, 214-18 (1993)] deponáltuk a GenBank-ban, és később humán LT-ö-R-t kódoló szekvenciaként azonosítottuk. A. teljes hosszúságú humán LT-á-R cDNS-kión ezen szekvenciája 1992 óta rendelkezésre all az L04270 GenBank nyilvántartási számon.

A transzmembrán régióig tartó ΙΤ-β-R extraceiluláris dóménjét (1. ábra) PCR-rel ampiifikáijuk egy cDNS-klónből olyan primerek felhasználásával, amelyek Notl- és. Sall~res.trikc.iós enzimek hasifőhelyeit tartalmazzák az 5'- ül. 3' -végeken (Browning et al., d, Immunoi. 154, 33-48 (1995)) , Az árpolitikáit terméket Notl- és SalX-enzimekkel hasítjuk, tisztítjuk és NőtI-ensímme! linearizált pMDRSÖl-vektorba ligáljuk a humán Igéi Fc-régióját kódoló Gall'/Notl-f ragmentummai együtt. így olyan vektorhoz jutunk, amely dihidrofolát-reönktáz-gént és ΒΤ-β-R-Fc fúziós fehérjét tartalmaz különböző promöterek vezérlése alatt.

A vektort eie.ktroporációval juttatjuk CHO dhfr'sejtekbe, és metotrexát-rezisztens klánokat izolálunk szokásos módszerekkel.

Az LT-Ó-R-Fo a tápközegbe szekretáiódik, és S1.1SA vizsgálati el•mn-.r

** fr X fr frfrfr * X ψ « járást alkalmazunk azon sejtvonaiak kiszelektálására, amelyek a legtöbb receptor fúziós fehérjét termelik. Egy jói termelő sejtvonaiat feinövasztünk, és a tápközeget egyesítjük. A tiszta LT-'p-receptor fúziós fehérjét Protein-A-Sepharose Fást Flozö-t alkalmazó íPharmacia; affinitáskromatográfiával tisztítjuk.

2,példa;

Szolubáii-s, egóraredetű &T-/Xreceptorok ©ló&nifeása zasmznoglobilin Fó Fúziós Fehóryekánt

Az teljes oFhS-klönjat állítjuk elő két részleges oDNS-izolátumbői származó, egy 5 -Notl/ApaLi- és egy 3' .ApaLI/hoti-fragmentum ligáiásával a pGbNA3-vektor boti-haoltóhelyébe (XnVitrogén, San Diego, CA) . A eDNS-kión szekvenciája rendelkezésre áll D29Í73 GenBank nyilvántartási számon, bem találtunk szekvenoiaküiönbseget egy másik, L38423 GenBanknyilvántartási számmal rendelkező, mLT-p-R-szekvenciával való

Összehasonlításkor,

Szolahriis mLT-β-Ε (hlgGl) fúziós fehérjét állítunk elő a teljes hosszúságú mLT-^-R-kiön RCR-amplifikációjával, templátként és primőrként az 5^? AACFGCAGGGGCCGCCATGCGCGTGCCC3^f és

5' GAGTTCGTCG.AGCATFGCTCGTGGGTCTGGGGG3^Í szekvenciákat alkalmazva.

Az amplifikált terméket tisztítjuk, és Notl- valamint Sali-enzimekkel hasítjuk, és egy humán IgG-Fo SálX/Köti-fragmentummal ligáijuk boti-enzimmel iinearizált és foszfatáz-kezelt SAE132be, igy jutunk a sLB 122-hőz, Stabil expresszié céljából a Notlkazettát tartalmazó mLT-p-R-Fc-f ragmentumot a pPLDRsöl Rofl-hasitőhelyebe transzferáljuk, igy jutunk a FSnOul-hez, és a vek.ί ,”, η ν·”“5 tort CHO-sejtskbo transzfekfáljuk más leírás szerint i Browningét al., J. Immunoi. 154, 33-4 6 (1995)j . Az mLT~$-R~Fe~t székre táló. sejtklónokat ELISA vizsgálati eljárással azonosítjuk. A tisztított receptor-fúziós fehérjét a CHO-sejtek felüiúszéjáből izoláljuk Protein-A-Sepharose Fást Fiow-kromatográfiával (Pharmacia).

3.példa;

Szolubilds, humán alkalmazása LT-/í-«ceptorligandum kölcsönhatások blokkolására

Szolubiiis .hLT~P-R-Fo-t teszteltünk, hogy milyen mértékben képes blokkolni az LT-liganö.um kötődését az LT-p-receptorhoz a fentebb leírt tumorsejt oitotoxicitási vizsgálati eljárásban. Ebben a vizsgálati -eljárásban a humán tumorsejteket elpusztító LT-ligandum (hLT-al/^2) szolubiiis formáját alkalmaztuk, amely aktiválja az LT-p-R jelzőrendszert. Az .LT-β-Β jelzőrendszer képes csökkenteni az LT-p-R-indukáit tomorsejt-citotoxicitást.

Az szolubiiis LT-ai/pi-iigandnmok rövidített, vagy módosított LT-p-alegységeket tartalmasnak, funkcionális transzmembrán dómén nélkül. A szolubiiis L?~aX/jÍ2~iigandumok kötődnek ahhoz, és stimulálják az L?-{3-R~jelx<S rendszert, valamint az LT-l.iga.ndum sejtfelszíni· formáit [Browning et sí., u. Immunoi. 154, 3 3·-·-«5 (1995)] A hLT-αΙ/βζ, hTRF vagy hLT-α higítási sorozatait készítjük el 0,05 ml térfogatban, 96 lyukú tenyésztőtálcákban, és 5000 trípszinnel kezeit HT29~sejtet (ATCC) adunk hozzá 0,05 mi tápközegben, amely 50 ü/ml (antlvirális egységek) hu-lFh-v-t túrtálí J.263/SS φ

♦ ΦΦ φ máz. Négy nap múlva az MTT-festék mitokondxiélis redukcióját a következők szerint mérjük: 10 μΐ MTT-t adunk hozzá, és 3 óra múlva a redukált festéket 10 mM sósavat tartalmazó 0,09 mi izopropii-aikohollal oldjuk, és az Ő,D.~-t SSö nm-en mérjük, A sze™ lubllis receptor valamilyen formáját vagy a tiszta humán IgG—t adunk hozzá 10 μ! térfogatban a sejtek adagolása előtt, 5 pg/ml végkoncentrációt elérve.

Az 1. táblázatban találjuk a hLT-p-R-Fo és a psS-TNF-E-Fc kimérák· összehasonlítását (kontrollként humán IgG-vei), hogy milyen mértékben képesek blokkolni különféle szolubilis W és LT~ iigandumok HT29-tumorsejtnövekedésre kifejtett gátló hatásait.

1- táblázat

Az LT-p-R- és a pSS-TMF-R-immunoglobulin fúziós fehérjék összehasonlítása, hogy milyen mértékben képesek blokkolni különféle szolubilis TNF és LT-Iigandumok HT29-növekedésre kifejtett gátló hatásait,

Citotoxikus ágens ődé-on nóvakedésgátlást okozó konoent.ráoiöga fng/mlj,

Citotoxikus ágens

TNF ΐτ-α hu-Igö kontroli jelenlétében⁸ 0, 08 pSS-TNF-R-Fc jelenlétében* >ich >1000

LT-p-R-Fo jelenlétében

0,08

LT-«l/p>

>200 ^!Az egyes citotoxikus ágenseket a sejtekhez való hozzáadás előtt perccel összekevertük az lg fúziós fehérjékkel- A fúziós fehérje végkonoentráoröj3 5 ng/ml volt.

^Magasabb koncentrációban nem vizsgáltuk.

Az 1. táblázat adatai azt indikálják, hogy a szolubiiis húsúin LT-Ű-R fúziós fehérje (hLT-p-R-Fo) hatékonyan képes blokkolni az IT-ligandum (ΒΤ-α1/β2) és a sejtfelszíni LT-jl-·receptorok közötti kölcsönhatást, és így a találmány szerinti ΙΤ-β-R blokkolóágensek,

A várakozásnak megfelelően, a szolubiiis TAF-F fúziós fehérje (pSS-TAF-R-Fc) teljesen blokkolja a TNF-indukált növekedésgátlást a ThT-hez való kötődés által, és megakadályozza annak kölcsönhatásba jutását a sejtfelszíni TRR-receptorokkal< Ez a szolubiiis TAF-reoeptor nincs hatással az LT-ligandam-közvetltett anti-proliferatív hatásokra. Viszont az LT-p-F-Re blokkolja az LT-ligandum-indukált citotoxikus hatásokat, de nem blokkolja a TAF vagy az LT-α hatásait. így a szolubiiis humán LT-β-Β fúziós fehérjék n incsenne'k hatással a TAF~ és LT-a~lígandumok általi

TAF-R-akkiválásra.

Szolubiiis, egérből származó X.S*-i$-JR-Fc alkalmazása agáréraőetö £'T-/i~reeaj>£or~!igárdám kölcsönhatások blokkolására Szolubiiis, humán XgGl-Fc-doménhes kapcsolt ímLT~p~R~rc;

lásd 2. példa) egéreredetű LT-ö-receptort tesztelünk abból a célból, hogy milyen mértékben képes blokkolni LT-p-recepto.r-lígandam kölcsönhatást egérben citotoxicitási vizsgálati eljárás alkalmazásával egérsejteken íz. ábra). A citotoxicitási vizsgálati eljárást WFHX 164 sejteken végezzük, lényegében ugyanazt az eljárást alkalmazva, mint a HT29-sejtokben a 3, példában leírtak szerint ( lásd még Browning és Ribolini, ö. Immunoi. 143, 1859-6?

φ φ <1989)) .

Α 2. ábra bemutatja az mLT-S-R-Ft hatásait a lígandumindukált ζ<Τ~β~ό~ jelzőrendszerre egéreredetű WSHX 164 sejtekben. Amint a vizsgálati eljárás is jelzi# a WE.HI 184 sejtek elpusztulnak# ha LT-a/p-ligandummal kezeljük azokat 1-100 ng/mi konoenfc·

fban. A szolubilis mLT-f$-R~?e <10 pg/ml) blokkolja az LT-ligandum-aktivált sejtpusztulást. Szolubilis# egéreredetű pSS-TFF-R-Fo fúziós fehérje vagy IgG-kontrollantítest hozzáadásakor kicsi vagy semmilyen hatással sincs a sejtpusztulás blokkolására. Ezek az adatok azt mutatják# hogy az mlT-p-R-Fc fúziós fehérje hatékonyan képes kompétitióba lépni a sejtfelszíni LT-p-R-molekuiákkal az LT-Iígan.dum kötésért. Szék az adatok azt ís mutatják# hegy az LT-a/^-índukált cítotoxicítás ί-Τ-β-Rközvetitett# és gátolni lehet azt szolubilis mLT-P-R-Fc-vel# amely a találmány szerinti LT-^-R-blokkoló ágensként hat,

Anti“humán ti testek slkalmerása bT~/)~reoeptor~ ligandum kölcsönhatások blokkolására

Egérben termeltetett# humán LT-^-reoeptor elleni monoklonális antitesteket (mAbs) állítunk elő RBF-egerek ismételt iné ?

fraperitoneális immunizálásával egy CROsejtből származó hLT-ü--R~ Fc fúziós fehérjét tartalmaz ?roteín-A-Sepharose gyöngyökhöz kapcsolva, adjutáns jelenlétében. Aa állatok végül szolubilis hLT-p-R-Fc-t tartalmazó ismétlő oltást kapnak# mind i.p.

(intraperitoneális), mind i.v, (intravénás) formában# a lépeseteket klasszikus eljárások szerint fuzionáljuk# és a hibridéma φφ

-φφ φ φφφ φ ♦$ φ φ φφφ * φ

XX φ Λ Φ &

felülúszőkat EL!8A~vaÍ szkríneljük Γ Ling et el,, J, Interferon and Cytokine Rés. IS, 53-59 (1995)] , A hibridóms-feiülűszókat tovább szkríneljük abból a célból, hogy milyen mértékben képes blokkolni aktivált, sejtfelszíni LT-ai/pz-t expresszáló 11-23 hibridómasej tek kötődését ΊΤ-β-R-Fc-vel burkolt tenyésztőtálcához sejtpásztáző Cc.all panníng 5 vizsgálati eljárásban. Tiszta mAbhoz úgy jutunk, hogy a tenyészet feiüiúszóiból as IgG-t Proteín-A-Sepharose-on tisztítjuk.

Annak meghatározása céljából, hogy egy anti-LT-p-reeeetormAb képes-e blokkolni a szolubílis LT .kötődésével iniciált 1·Τ-βR-je'izőrendszert, tumorsej t-oitotexícitási vizsgálati eljárást hajtottunk végre biOr humán karcinómasejtek alkalmazásával. A citotoxicitási vizsgálati eljárásokban az LT-al/pí hígítás! sorozatát készítjük ei 0,05 ml térfogatban, 95 lyukú tenyésztőtáioákban, és vagy kontroll, egérben termeltetett IgGl-mAb vagy anti-LT-p-receptor mAb löö pg/ml-es oldatát adjuk hozzá 10 gl térfogatban. Azután 5000 trípszinnei kezelt WiDr-sejtet (ATCC) adunk mindegyik mérőhelyhez 0,95 ml tápközegben, amely 50 C/ml (antívirálís egységek) hu-IFN-v-t tartalmaz. Négy nap múlva az MTT-festék mitokondriális redukcióját a következők szerint mérjük: 10 μΐ MTT-t adnak hozzá, és 3 óra múlva a redukált festéket 10 mM sósavat tartalmazó 0,00 ml izopropii-alkoholial oldjuk, és az O.D.-t 550 nm~en mérjük. A bíbor szín mennyisége arányos a sejtnd ve kedés mennyiségével.

A 3. ábra ezt mutatja., hogy az anti-LT-O-R mAb-50A8 a találmány szerinti LT-p-R blokkoló ágensként viselkedik. Humán Wi.br karcinómasej tek növekedése megáll IFR-y és szoiabiiis 1<Τ-α1/β2m,

* * Φ φφ ΦΦ X φ X llgandum. (körülbelül ü,05-5ö ng/mi) jelenlétében. IgGi kontroliantitestnek (10 gg/mli nincs hatása erre a növekedés-gátlásra. Viszont az anti-LT-β-Κ mAb-BDA8 <10 g/m.1) visszaállítja a WiDrsejtek növekedési képességét szolubilis LT-«Í/p2~liganöum jelenlétében .

Anti -humán -XT^-an ti testek alkalmazása raeepfc or-ligandum kölcsőnha tások blokkolására

Anti-humán LT-β mAb-kat állítunk elő RBF-egér mosott protein-á-Sepharose-ÜSiö-rLT-p gyöngyökkel való immunizálásával, amelyek körülbelül 1-2 pg humán rekombináns ΰΤ-β-t tartalmaztak CFiiban, és ezt egy 'ismétlő oltás követi ugyanezzel az anyaggal IFAbán. ővele héttel az utolsó ismétlő oltás után, as egerek 30 pg tisztított, szolubilis rLT-p-t (savas elűcióval kapjuk 9E10gyantáról) kapnak i.v., ás 20 μο-et ugyanebből a szolubilis anyagból 2 nappal, később, agy nappal a második ismétlő í.v. oltás után, a lépsejteket klasszikus eljárások szerint fuzionáljuk a mAb-k előállítása céljából, A hibrídőma-felülüszókat közvetlenül ELISA-val vagy PMA-a'ktivál t 11-23 sejtek FACS--festésével sz.krínei jük. A tiszta mkb-hoz égy jutunk, hegy a tenyészet felülúszóiból származó IgG-t Frotein-A-Sepharose Fást Flovr (Pharmacia} alkalmazásával tisztítjuk.

FAC.S vizsgálati eljárást alkalmazunk azon antitestek szelektálására, amelyek az LT-β ellen termelődtek, és amelyek hatékonyan képesek blokkolni szolubilis ΒΤ-α/β-ligandumok kötődését sejtfelszíni LT-p-recepterokhot, igy két sejt közötti köicsönha* φ φ * ΦΦΦ *

Οχ /

Φ X Φ > X ον fást utánoznak in vivő. Ebben a vizsgálati eljárásban a szoiubilis humán LT-p-R-Eo-t <2 gg/mi} hagyjuk kötődni PMA-aktivált 11-23-sejtek (Browning et al ., J, immunoi. 154, 33-46 (1995(1 felszínén lévő LT - Ugandámhoz növekvő koncentrációjú teszt-anti-Lf-β mAb (0,02-20 gg/mi) jelenlétében. A sejteket mossuk és kötött LT-p-R-Ec-t £ikoeritrin-jelölt, szamárban termeltetett anti-humán IgG-vel való reakcióval detektáljuk. A kötött fluoreszcens jelölőanyag mennyiségét EACS-anaiizissel határozzuk meg, és a fluoreszcencia-intenzitások átlagát ábrázoljuk.

A 4, ábra azt mutatja a FACS vizsgalati eljárás eredményeit, amelyben azt mérjük, hogy az anti-LT-β mAb B9 milyen mértékben képes blokkolni a fentebb leírt ΙΤ-β-receptor-ligandum kölcsönhatást, Ez a kísérlet azt mutatja, hogy az anti-LT-β mAb 59 (0,02-5 gg/ml( képes spécifikusan és hatékonyan kompétlciőba lépni a sejtfelszíni LT-iigandum kötésért a. szoiubilis ΙΤ-β-R fúziós fehérjével (2 pg/mi) , és igy találmány szerinti LT-p-R v ÓZ,· biokkoiqágensnek minősí-tá—az'bj

4-> ^s

7.pálöaj

Anti-egér LT-<z,//?-an ti testek aí&aJá&axása rsceptor-ligandum kdicsbnha teaok hlöJrkolásara

Szoiubilis, egéréredetü LT-a/á~kompIexeket állítunk elő a humán, szoiubilis LT-a/p-komplexek esetén fentebb leírtak szerint. A szoiubilis, egéreredetü LT-á-aiegységet a korábban már közölt szekvenciainformáciők alapján állítjuk elé [ Lavton et al., J. Immunoi. 154, 239-40 (1995(1 . Szoiubilis, egérből szár; { mázó LT-m/á-kcmoiexeket bacaiovirus/rovarsejf-exoressziös rend4_?·ν.< ...

m. í<mnm

X X * X-XX* x*x *

XXX X X X X. X

X Χχ -X_W >X > X 4 χ X * szer alkalmazásával expresszáljuk, és affinitáskromatográfiával izoláljuk humán p55-TN?-R és LE-á-R oszlopok alkalmazásával, lényegében fentebb, a humán LT-azá-komplexek expressz léje és tisztítása esetén leírtak szerint, örmény hörcsögöket immunizálunk a tisztított, szoluniiis egéreredotü LT-α/β-komplexekkel, lényegében a 6. példában leírtak szerint. A hörcsögökből származó lépsejteket egereredetü R3R~hibridomasejtvonallal fuzionáljuk a leírtak szerint ( Sanchez-Radrid et al., Methods of Enzymology 121, 239-44 (198-6)) - & hibridámákat anti-ml/f-a- vagy anti-mLE-aként csoportosítjuk LE-o/a-komplex vagy egyedül LE-d irányában mutatott kötési karakterisztikájuk alapján. A hibridómasejtetet expandáljuk, és az antitesteket a tenyészet felelészőjáből tisztítjuk Arofein-A affinitáskromatográfla (Fharmacia) alkalmazásával ,

Annak meghatározása céljából, hogy vajon a hörcsögben termeltetett anti-egér-LT-a és -LE-^-mAb-k képesek-e blokkolni LEUgandám kötődését mLE-á-R-hez, TIMI-4 sejteket (ATCC) használtank, amely olyan egéreredetű E-sejtvonal, amely sejtfelszíni LE-i.iganöumot expresszél ? árával a PHA-aktiválás után. A hörcsögben termeltetett anti-mLE-α vagy anti-mLE-β mAb-kat 30 percig 4®C-on élőinkénéljuk a sejtekkel, azután kétszer mossuk. A mosott sejteket í yg/ml mLE-b-R-Eo-val inkubáijuk á^C-on. 30 pere múlva a sejteket szabad a kötetlen mLT-^-R-Fc-töi mentesre mossuk, és azután 30 percig inkubáijuk 10 μο/ml fikoeritrin-jelölt szamárban termeltetett anti-hnmán IgG-vel, a kötött mLE-p-R-Fo detektálása érdekében, A megkötött fluoreszcens jelölőanyagot FACS-analizissel meghatározzuk és a fiuoreszoenora-intenzitások átlagát enuóvsm számoljuk λ

Az analízis alkalmazásával azt találtűk# hogy a hörcsögbe termeltetett anti~m.LT~á mAS. hatékonyan képes blokkolni a szolu bilis LT-β· receptor kötődését T~sej tfelssíni LT-Xigaadumhoz. A eredményeket a 2. táblázatban mutatjuk be.

2„ táblázat

Antí-egér-LT-β monoklonális antitest által kifejtett gátlás! ké pesség az mLT-p-E-Fc kötődésére egéréredetü sejtfelszíni LT Ugandámhoz.

Anti-mLT-á (88.FS) mAb koncentrációja MFC1“ % inh.	Anti-mLT-a (AF.B3) “ MFCIfc % inh.N
jug/mi)
0“	6		6
o	05	0	SS	0
0,01	71	18	84	2
0, 03	07	23	36	0
0, 1	51	44	80	0
0,3	30	02	84	'7
1,0	23	7.1	39	0
3,0	17	86	88	0
10,0	ii	34	95	0
30,0	10	95	94	0
100,0	8	98	92	0

³ recept őrt. nem adtunk 'fluoreszcencia átlag csatornaszám “százalékos gátlás μ

*

V φ φφφ <

φ φφφ

ΧΧ··φ φ φ Φ χ β, példa ν

LT-//-R-'hlokáolé'ágenaek gá tolják a Thl -kör:wti tetfc kontakt &íperss«« ssiti vi tá s fc egerekben g-os nőstény Salb/c egereknek (Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME) kezdeti szenzitizáláskent 25 ni 0,5%-os 2,4-diniére-fluor-benzolt (DdFS) adunk 4:1 v/v arányú eceten:olívaolaj elegy formájában mindegyik hátsó láb talpába. A kezdeti szenzltizáiáa után huszonnégy órával újra szenzltizálunk minden egeret 25 pl ugyanezzel az oldattal. A szanzitlzálást az anesztéziáiétlan egér lefogása közben hajtjuk végre. Az 5. napon (120 órával a kezdeti szenzitizalás után), az egereket 90:10 mg/kg ketamln:zilaz in (i,p.) keverékkel anesztéziáijuk, és 10 pl, még nem irritáló mennyiségű 0,21 óMFB-t adunk a bal fűi hátsó és hasi felületére, A jobb fül hasonló kezelést kap 4:1 v/v arányú aceton:olívaolaj hordozóban,

Négy órával az immunválasz kiváltása után, növekvő koncentrációban adunk mLT-p-R-Fo-t (0,05-5,0 mg/kg; 2. példa) az egereknek 0, 1 ml foszfát-purfereit söoldatban (FBS) intarvénás injekció formájában. FBS-puffer egymagában, vagy 20 mg/kg humán IgG fúziós fehérje (LFA3-Bo) (Miller et el., J. Exp. Med, 17B, 21122 (1002)] szolgál kontroliként. Anti-VLA4-specifikus máb ( FS/2 mAS; Chisoim et al., Eur, dl Immunoi, 23, 882-88 (1993)1 8 mg/kg-os Injekciója szolgál pozitív kontrollként, amely ismereteink szerznt gátolja a CHS-t a Τ-sejtek fertőzési helyre való áramlásának blokkolása által, Négytől nyolc egeret tartalmazó csoportokat kezelőnk a megfelelő koncentrációjé antitesttel,

A fertőzés után huszonnégy órával, az egereket újra

ΦΧ

Φ > X x X Φ * φφφ *

X φ φφ φ φ

X Φ φφ φ χφφ φ

Φ Φ X φ φ > *

ΧΦΦ ΦΦ φφχ φ Φ φφ agszteziá!juk ketaminixiiarin keverékkel, és megmérjük mindkét fül vastagságát mérnöki mikrométerrel, lö’ inch pontossággal, Az egyes egerek füldnzzadásában jelentkező immunválasz a OFFB-vei immunizált füivastagsag és a megfelelő kontroll közötti különbség- Tipikusan gátlás nélküli duzzadásban jelentkező immunválasz 95-110 x 10“' inch. A. füicuzzaöásban jelentkező immunválasz gátlását úgy kaptuk meg, hegy összehasonlítjuk a kezelt csoportokat a negatív kontrollcsoportokkal. A kezelt csoportok közötti különbség statisztikus szigniflkánoá.áját a szórás egyszerű analízisével értékeljük ki, amit lukey-Kramet-féle Honestly Signifioant Differenoe számítás követ (ÖMF,· SAS Institute), p<0,05-t alkalmazva,

As 5, ábra bemutatja, hogy növekvő koncentrációban adagolt mbl-p-R-Fo a füiöuzzaöásban megnyilvánuló immunválaszban szignifikáns csökkenést okoz a BhFB-kezelt egerekben, ha azokat a gátlás nélküli DEFB-kezelt kontrollállatokhoz (PBS és LFAÜ-Foi hasonlít juk, Szolubilis LT-β-Έ (körülbelül 1-5 mg/kg) képes blokkolni ezt a. kontskt-DTH-reakciőt olyan hatékonyan, mint az

Inhibitorként alkalmazott. anti-VLAi-specif inas mAb, A fülduzzaöást alkalmazó vizsgálati eljárás az a része, amely nem gátolt, valószínűleg nem-specifikus granuiocita infiltráciőnak tulajdoni thatő.

trón-arai.fát-oldatot alAalmaró XSP-sjodel 1

Egereket kezelünk az ábra jelmagyarázata szerint hLFA3~igG~ vei, azaz egy kontroll lg~fúziós fehérjével, vagy mLTpR-ig-vel fr X intraperitoneális injekció formájában, A 0, napon az ivóvizet 5%-os dextrán-szulfát-oldatra cseréljük, és az egereket szar. a folyadékon hagyjak egy hétig. Egy hét múlva, azaz két héttel a USS-beadás kezdete után az egereket elpusztítjuk, és a testtömeg-változást, valamint a vastagbél hosszát (az anus-től a ceciim-lg) mérjük.

Az ábra a testtömeg-változást és a vastagbél hosszát mutatja be különféle kezelések után. A megrövidült bélhoss2, valamint a testtömeg-veszteség indikálja az IBD-t. Látható, hogy az mLT^RXg~kezelés drámai módon meggátolja a vastagbél megrövidülését és a testtömeg-veszteséget, amely a hatékonyságát mutatja, ú, ábra;

A OSS/ivóviz-kezelés megkezdése után 14 nappal megfigyelt testtömeg-változás, különböző kezelésket követően. A Veh” a hordozóra, az LTBr és LFA3 az mLTpR-Ig- és hLBA3~lg~fúztös fehérjékre utal, amelyeket 100 gg-os intraperitoneális injekcióval adunk be, 1 héttel a USS-beadás előtt, a DBS-beadás alkalmával és 1 héttel, később (azaz 3 injekció a -1», 0. és 1« héten). 10 állat volt egy csoportban.

7, ábra

A vastagbél hossza a DSS-beaöást követő 14. napon a 6. ábránál leirt különféle kezelés után,

IÖ . példa.;

Az XBD modellje

φ* φ *$

X

Φ χφφ ΦΦν < * φ

X Φ φ φ $ * φ φ φφ

CD4 pozitív T-sejtekét izolálunk C.S-I? nőstény egerekből mágneses gyöngyöket alkalmazó eljárással, egy korábbi leírásnak megfelelően [ ?. Poerle et al.# International Immunology 5# 1481™ 1471 (1993)1 . Azután a CDS pozitív T-sejtek deflációjával kapott CDá-sejteket, a sej teker, és a monocitákat CD4 és

CDiSRfh^'^· populációkba osztályozzuk fluoreszcencia-aktivált sejtésztáiyozással, szintén lényegében a fentebb leírtak szerint. 5 x le CD45R8-sejtét injektáltuk intravénásán nőstény 0,3-17 sóid egerekbe, és az egerek testtömegét követjük. Láthatjuk, hogy a CDs5RS^3iá''^<'^C!'^>' sejtekkel kezelt egerek testtömege normális módon növekszik. Ellenben azok az egerek# amelyeket. CDáSRb*^-*⁹**sejtekkei kezeltünk# végül veszítenek testtömegükből, és a lehetőn az elpusztuláshoz közel állnak. Amikor a kontroli-egerek durván 20%-ct vesztenek kiindulási testtömegükből, elpusztítjuk azokat, és különféle szerveiket hisztoiógiával analizáljuk. Tipikusan a beteg állatok leromiottan néznek ki, hasmenésük és drámaian meghosszabbodott vastagbelük ás ceoa-juk ven. Az ábra magyarázatának megfelelően, hlFAe-lg-vei .kezelt állatok hasonlóak lettek a kezeletlen állatokhoz, míg ez mí-TpR-lg-vel kezeit állatok testtömege nem csökkent, viszonylag normális méretű vastagbelük lett, és hiányzott az erős gyulladásos infiltrácíó, amely egyébként jellemző módon megfigyelhető volt a vastagbélben- A 3. ábrán látható a CD45Rbb^is:ííS-injekcióval különböző módon kezelt állatok testtömeg-csökkenésének idefaggéee, ét a 9, ábra matatja be végső testtömeget δ héttel az injekció után- Az mLTpR-Ig hatékonysága két igen különböző lED-modeliben, azaz a C845R8- és a DSS-modeblben alátámasztja azt a nyilvánvaló tényt, hogy a kezelésnek mélyreható hatása van az immnnrenóazerre.

8« ábra;

A testtömeg időfüggése CO45RB Cöá-pozitív T-sejtek injektálását követően sóid egerekben< Az egyes görbék egy-egy állatot reprezentálnak? és a panelekben lévő jelölés arra utal# milyen sejteket injektáltunk# azaz CDáS.RB^m§*^{s víi5? Αϊ}»^Λ«^ΛΛ>·_{# a} kezelés természetét , Az állatokat 100 pg fehérjét tartalmazó intrsperitoneális injekcióval kezeltük hetente. A kezelés 2 héttel a sep jtek injektálása előtt kezdődött# és folyamatosan tovább tartott a kísérlet alatt.

9. ábra:

A megfigyelt testtömegek átlaga és standard deviációja különböző kezeléseket követően# 10 héttel a transzplantáció után (5-»S állatokból álló csoportok).

Λ késleltetett típusú bíperszenzi ti vitás SKBC-wdell je Nőstény balb/o-egereket szenzitizáltunk 2 x 10' mosott# birkából származó# PBS-ben lévő vörösvértest (SRBC) szubkután injekciójával, 5 nap múlva as egereket FBS-ben lévő, 1 x 10^s SRBC injekciójával fertőztünk? melyet a jobb talpba adtunk (szubplantáris injekció). A. talpba adott injekció után különböző idő elteltével mértük a talp vastagságát mérőkörzővel. A 10. ábrán látható a talp duzzadáséban megnyilvánuló immunválasz azokban az egerekben? amelyeket mLT^R-Ig intraperitoneális injekíí-USS/SK »*·** φφφζ ΦΦς. Φ dójával is kezeltünk. Az mLTpR-lg-vel való kezelés mind a szeneit!sáláékor, vagy mind a szenzltizáláskor mind a fertőzödség különböző állapotaiban adva gátolja az SBBC-indukált DTKválaszt.

10. ábra:

A talpvastagság növekedését mutatjuk be 18 érával az SRBCfertőzést adó Injekció után mérve. A kezelés negatív kontrolija RBS-injekdo, a pozitiv kontroli PS/2-antitest, amely blokkolja a VLAdkölesönhatásókat, és ennélfogva a sejtek kölcsönhatását, és mLTpR-ig-t ílOO μο intravénás injekciók formájában) adunk vagy közvetlenül a szenzitizáiő szubkután SRBC-injekcio előtt, vagy a fertőzéskor, vagy mindkét alkalommal.

6S.2ÍO/SZ

X

Síekveaciák (ί) AZ X.CZÁMŐ SZEKVENCIA ADATAI;

ii) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

(A) HOSSZ; 137 aminosav (B) TÍPUS; aminosav (C; SZÁLAK SZÁMA;

(D) TOPOLÓGIA: lineáris (11) MOLEKULATÍPUS: peptid (xi) AC i.SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

Ser I

Gin

Pro Gin

Alá Vei 5

Pro

Pro Tyr Aie Ser Cin Asn Gin Thr Gye

10

15

Arg

Asp

Gin

Glu

ny s

G1 u

Tyr

Tyr

Glu

Pro

Cin

His

Arg

lls

Cys

Cys

30

25

30

Bar

Arg

Cys

Pro

Pro

Gly

Thr

Tyr

Vei

Ser

Alá

Lys

Gys

Ser

Arg

Ile

35

90

95

Aro

Aso

Thr

Vei

Cvs

Aie

Thr

Cys

Aie

Gin

Asn

Ser

Tyr

Asn

Glu

His

50

55

50

Trp

Asn

Tyr

Len

Thr

Ile

Cys

Gin

Leu

Cys

Aro

Pro

Gys

Asp

Pro

Val

65

70

75

80

Met

Gly

Len

Cin

Cin

Ile

Alá

Pro

Cys

Thr

Ser

Lys

Arg

Lys

Thr

Gn

S5

90

95

Cys

Arg

Cys

Gin

Pro

Gly

Met

Pho

Cys

Alá

Ara

Trp

Aie

Leu

Glu

Cys

100

105

1.10

Thr

Bis

Cvs

Glu

Leu

Len

Ser

Asp

Cys

Pro

Pro

Giy

Thr

Gin

Aie

Glu

115

120

125

Lee

Lys

Asp

Cin

Var

Gly

Lys

Giy

Asn

Asn

His

Cys

Vei

Pro

Cys

Lys

130

135

ián

Alá

ο x y

His

Phe

Cin

Asn

Thr

Ser

Ser

Pro

Ser

Alá

Arg

Cys

Gin

Pro

19 5

150

155

160

His

Thr

Arg

c.· y

Glu

Asn

Gin

Giy

Leu

Val

e r n

Alá

Alá.

Pro

Glv

Thr

155

170

175

Alá

Gin

Ser

Asp

Thr

Thr

Cys

Lys

Asn

Pro

1:00

Glu

Pro

Leu

Pro

Pro

ISO

185

100

Gin

(hot

Sor

Gly

Thr

195

C.5 A 2 <: :>/ :>L ♦ ΦΦΦ φφ φ * * X Φ Φ*Φ

Φ ΧΦΦΦ

ΧΦΦ Φ ΦΦΦ

Claims (8)

1. X. Egy .limfotoxin-béta-receptor (LT-8-R)-blokkoló ágens alkalmazása gyógyszerkészítmény előállítására immunológiai betegségek kezelésére egy állatban, melyek, a következő csoportból kerülnek kiválasztásra: multiplex szklerőzis, szimpatikus optaimia, uveitisz, pszorlázis, gyulladásos belszinőrdma>

   reuma told arthritisz, szövet kilökődés és szerv kilökődés.
2. 2. Az I. igénypont szerinti alkalmazás, amelyben az LT-Ő-R-blokkoiő ágens a kővetkező csoportból kerül kiválasztásra:

   (a; egy oldható iimfoioxin-h-recsotor, amely előnyösen az

   1. számú szekvencia aminesavaibői kiválasztott aminosavakból álló funkcionális szekvenciát tartalmaz;

   <b> agy LT-ü-reneptorra specifikus antitest; és (c) egy eejtfelszini LT-iigandnmra specifikus antitest.
3. 3, Az i. vagy 2. igénypont szerinti alkalmazás, amelyben az

   LT-k-R-biokkoiö ágens tartalmaz egy LT-3-receptorra specifikus monoklónális antitestet.

   i. Az 1-3, igénypontok bármelyike szerinti alkalmazás, amelyben az lii-li-B-bio kiölő ágens az anti-humán-LT-h-R-miib-BEAu-at tartalmazza,
4. 5. Az 1-4. igénypontok bármelyike szerinti alkalmazás, amelyben az LT-3-R-biokkoiö ágens tartalmaz egy sejtfelszíni 1,1ligandumra specifikus monoklonális antitestet.

   é. Az 1-5, igénypontok bármelyike szerinti alkalmazás, amelyben ez LT-b-R-biokkoió ágens az anti-humán-LT-5-mAb-Bs-et tarί

   Φ Φ S * Φ

   ΦΦ Φ Φ φ φ φ ΦΦΛ Φ

   Φ Φ*ΦΦ Φ Φ * / ,.· ΦΧΦ Φ ΦΦΦ «ΧΦ * talmazza,

   ?. Αζ 1-8. igénypontok bármelyike szerinti alkalmazás, amelyben az LT-h-R-bickkoió ágens egy LT-B-R fúziós fehérje.

   S< A 7. igénypont szerinti alkalmazás, amelyben az Ll-k-R fúziös fehérje továbbá tartalmaz egy. az 1. számú szekvencia aminossvaibói kiválasztott aminosavakbél álló funkcionális szekvenciát és egy gyógyászatilag elfogadható hordozót.
5. 9. A 7. igénypont szerinti alkalmazás, amelyben az LT-k-R fúziós fehérje tartalmaz egy LT-k-R-ligandumkotő domént, amely képes szelektíven kötődni egy sejtfelszíni LT-ligan.dumhoz>
6. 10, A 7. igénypont szerinti alkalmazás, amelyben az LT-k-R fúziós fehérje továbbá tartalmas egy vagy több heterológ fehérje -dómé ni ,
7. 11, A 10, igénypont szerinti alkalmazás, amelyben az említett heterológ fehérje-dómén tartalmaz egy hómén immunglobulin-Fedőmé nt ,
8. 12, A 11. igénypont szerinti alkalmazás, amelyben az említett heterológ dómén szérum-albumán.

   a következő csoportból kerül kiválasztásra:

   lipopreteimek, apolipoproteinek és transzfer r in,