HU226274B1

HU226274B1 - Process for preparing amides

Info

Publication number: HU226274B1
Application number: HU0003069A
Authority: HU
Inventors: Karen Tracey Robins; Toru Nagasawa
Original assignee: Lonza Ag
Priority date: 1997-07-22
Filing date: 1998-07-22
Publication date: 2008-07-28
Also published as: CN1450167A; CZ299166B6; ES2190098T3; CA2294621A1; EP1002122A1; DK1002122T3; NO996401D0; CZ2000153A3; EA009075B1; DE59807569D1; US6444451B1; NO996401L; US7741097B2; CA2294621C; PT1002122E; IL133754A0; CN1265154A; MX215285B; AU8978398A; US7105322B2

Description

A találmány új, az Actinomadura, Amycolatopsis és Rhodococcus nemzetségéhez tartozó mikroorganizmusokra vonatkozik. A találmány továbbá amidok előállítására szolgáló eljárásra vonatkozik, amely eljárás során az említett mikroorganizmusokat, illetve e mikroorganizmusok enzimkivonatait felhasználjuk.

Amidok, például a nikotinsavamid - a B-vitaminkomplex egyik, ember és állat egyaránt esszenciális vitaminja - előállítására már több biotechnológiai eljárás ismert. Általánosan ismert, hogy nitrilhidratázt tartalmazó mikroorganizmusok nitrileket a megfelelő amidokká alakítanak. Az EP-A-0 188 316 például a 3-cian-piridinből kiinduló eljárást ír le nikotinsavamid előállítására, amelynek során Rhodococcus, Arthrobacter vagy Microbacterium nemzetségbeli mikroorganizmusokat alkalmaznak.

Az eljárás hátránya, hogy az említett mikroorganizmusok aktivitása a 3-cian-pirimidin->nikotinsavamid reakció vonatkozásában csak csekély.

Az EP-A-0 307 926 szerint a 3-ciano-piridin nikotinsavamiddá alakítását Rhodococcus rhodochrous J1 fajtájú mikroorganizmus segítségével végzik. A mikroorganizmusokat indukálni kell, máskülönben nem katalizálják a kívánt reakciót. Hátrányos az is, hogy a Rhodococcus rhodochrous J1 törzs piros színű, így a termék elszlneződik. Emellett a mikroorganizmus hőstabilitása csekély, és például a 3-ciano-pirimidinszubsztrátum gátolja a törzs növekedését.

Nikotinsavamid előállítására irányuló, 3-ciano-piridinből kiinduló és a Rhodococcus rhodochrous J1 törzset alkalmazó eljárást az EP-A-0 362 829 is írja le. A nitrilhidratáz-tartalmú mikroorganizmusok aktivitásának növelése céljából karbamidot, illetve karbamidszármazékot adnak a tápközeghez induktorként. Mint az előzőleg leírt eljárás esetén, itt is elszíneződött termék keletkezik.

A WO 95/17 5065 tárgya eljárás aromás amidok előállítására a megfelelő nitrilekből Rhodococcus rhodochrous M33 mikroorganizmusok segítségével. Hátrányos, hogy a Rhodococcus rhodochrous M33 törzs is piros, továbbá, hogy a 3-ciano-pirimidin szubsztrátum esetén mért K_M-értéke nagy.

A találmány feladata a fenti hátrányok megszűntetése és olyan eljárás kidolgozása volt, amellyel a megfelelő amidok nagy hozamban és jó tisztaságban különíthetők el.

A fenti feladatot az új, 1., 3. és 4. igénypont szerinti mikroorganizmusokkal, valamint a 7. igénypont szerinti eljárással oldottuk meg.

A találmány szerint az eljárás során egy nitrilt mint szubsztrátumot Actinomadura, Amycolatopsis vagy Rhodococcus nemzetségű mikroorganizmusokkal vagy ezek enzimkivonatával, vagy Amycolatopsis vagy Actinomadura nemzetségű mikroorganizmusok tisztított nitrilhidratázával megfelelő amiddá alakítunk.

A biotranszformáláshoz alkalmazott nitrilek, például a 3-ciano-piridin, a kereskedelmi forgalomban kapható vegyületek.

A találmány szerinti mikroorganizmusok képesek arra, hogy nitrileket mint szubsztrátumokat a megfelelő amidokká alakítsák. A mikroorganizmusok előnyösen azzal a képességgel is rendelkeznek, hogy nitriliken vagy amidokban mint egyetlen C- és/vagy N-forráson növekedjenek.

A találmány szerinti mikroorganizmusok megfelelő szelektálással például talajmintákból, Iszapból vagy szennyvízből kaphatók a szokásos mikrobiológiai technikák segítségével. Célszerű, ha a mikroorganizmusokat nitrilek vagy amidok mint előnyösen egyetlen C- és N-forrás jelenlétében és kobaltionok jelenlétében tenyésztjük és szelektáljuk. A szelektáláshoz nitrilként, illetve amidként előnyösen a későbbi biotranszformáláshoz szubsztrátumként alkalmazott nitrileket és a megfelelő, ezekből képződő amidokat alkalmazzuk. A szaporításhoz szükséges közegeket a szakember ismeri; például az 1. táblázat szerinti közeg alkalmazható. Általában ugyanígy tenyésztjük a mikroorganizmusokat a tulajdonképpeni biotranszformálás előtt is, ugyanezekben a közegekben.

Szakember tudja, hogy nitrilhidratáz csak akkor képződik, ha a tenyészközeg kofaktorként kobaltionokat tartalmaz. Kobaltionokat adó kobaltvegyületek például Co²⁺- és Co³⁺-sók. A Co²⁺- és Co³⁺-sók példáiként a kobalt-kloridokat, kobalt-szulfátokat és kobaltacetátokat nevezzük meg.

Célszerűen kobaltvegyületként Co²⁺-sót, például CoCI₂-ot alkalmazunk. A tenyésztést azonban B12-vitamin és fémkobalt vagy más, in situ kobaltiont leadó kobaltvegyületek jelenlétében végezhetjük. A kobaltvegyületet előnyösen 1-10 mg/l, különösen előnyösen

1-3 mg/l mennyiségben alkalmazzuk.

A tenyésztés hőmérséklete általában 20-50 °C, a pH-érték 5 és 8 közötti. Előnyösen a hőmérséklet 30-45 °C, a pH 5,5 és 7,5 közötti.

A tulajdonképpeni biotranszformálás Actinomadura vagy Amycolatopsis nemzetségbeli mikroorganizmusokkal, azok enzimkivonatával vagy tisztított nitrilhidratázával történhet. Célszerű, ha a biotranszformáláshoz Actinomadura spadix fajtájú mikroorganizmust, például az Actinomadura spadix E3733, Actinomadura spadix E3736, Actinomadura spadix 45A32, Actinomadura spadix 4501 vagy Actinomadura spadix C15 izolátumot alkalmazunk. Előnyös, ha a biotranszformáláshoz az Amycolatopsis NE 31 és Amycolatopsis NA40 törzseket vagy funkcionálisan ekvivalens variánsait és mutánsait alkalmazzuk. Különösen előnyösen az Amycolatopsis NA40 törzset alkalmazzuk. Az említett mikroorganizmusokat 1997. 06. 03-án a Mikroorganizmusok és Sejtkultúrák Német Gyűjteményében (D-38124 Braunschweig, Mascheroderweg 1b) a Budapesti szerződés értelmében letétbe helyeztük Amycolatopsis NE31 és Amycolatopsis Na40 néven, DSMZ 11616, illetve DSMZ letétbehelyezési szám alatt. A két mikroorganizmust közelebbről megvizsgáltuk; az Amycolatopsis nemzetségnek az irodalomban eddig le nem írt törzséről van szó.

A fentiek értelmében a találmány az Amycolatopsis vagy Actinomadura nemzetséghez tartozó mikroorganizmusokra is vonatkozik, amelyek képesek nitrilt amiddá alakítani. A találmány különösen az Amycola2

HU 226 274 Β1 topsis NA40 (DSMZ 116117) és Amycolatopsis NE31 (DSMZ 11616) mikroorganizmusokra vonatkozik.

Azt találtuk továbbá, hogy a Rhodococcus nemzetséghez tartozó bizonyos mikroorganizmusok a nitril->amid átalakítás vonatkozásában jobb tulajdonságokkal rendelkeznek, mint az EP-A-0 362 829 szerinti Rhodococcus rhodochrous J1. Ezek a bizonyos mikroorganizmusok az alábbiak: Rhodococcus GF674, Rhodococcus GF578, Rhodococcus GF473, Rhodococcus GF270 (DSMZ 12211) és Rhodococcus GF376 (DSMZ 12175) vagy ezek funkcionálisan ekvivalens variánsai és mutánsai. A DSMZ 12175 mikroorganizmus 1998. 05. 15-én és a DSMZ 12211 mikroorganizmus 1998. 05. 08-án került letétbe a Mikroorganizmusok és Sejtkultúrák Német Gyűjteményében a Budapesti szerződés szerint.

A GF270, GF376, GF473, GF578 és GF674 Rhodococcus törzsek az azonosítás szerint a Rhodococcus nemzetségnek az irodalomban eddig le nem írt törzsei. Ennek értelmében a találmány a Rhodococcus GF270, Rhodococcus GF376, Rhodococcus GF473, Rhodococcus GF578 és Rhodococcus GF674.

Az Actinomadura és Amycolatopsis nemzetségbeli mikroorganizmustörzsekkel ellentétben a Rhodococcus nemzetséghez tartozó mikroorganizmusokat a biotranszformálás előtt célszerűen indukáljuk. Induktorként az EP-A-0 307 926 számú közzétett európai szabadalmi bejelentésben leírt induktorok alkalmasak, így például acetamid, butiramid, metakrilamid, propionsavamid, krotonamid és valeriánsavamid.

A „funkcionálisan ekvivalens variánsok és mutánsok” terminuszon olyan mikroorganizmusokat értünk, amelyek a fent említett eredeti organizmusokból származnak, és lényegében ugyanazokkal a tulajdonságokkal és funkciókkal rendelkeznek, mint amazok. Az ilyen variánsok és mutánsok véletlenül, például UV-besugárzás vagy mutagén vegyszerek hatására jöhetnek létre.

Amycolatopsis NA40 azonosítása Levegőmicélium színe fehér

Szubsztrátumban lévő micélium narancsszínű

Kidiffundált pigment színe -
Cukorspektrum
ARA	+
GÁL	+
MAD	-
XYL	-
GLU	tr
RIB	Ί-
Típus	Α
DAP	DL
Menakinonok (%-ban)
8/4	-
9/0	(+)
9/2	+
9/4	+++
9/6	-
9/8	-
16S rDNS-homológia	96,9%

Foszfolipidek, például PE, OH-PE, lizo-PE met PE, PC, NPG, Pl PIM,

PG, DPG, GL	nincs vizsgálva
Zsírsavak
izo 16	+++
izo 15	+
izo 17	(+)
anteizo 15	(⁺)
anteizo 17	(+)
10-Me 16	-
10-Me 17	+
2-OH 15	+
2-OH 16	+
Típus	3f
MS	-
Amycolatopsis NE31 azonosítása
Levegőmicélium színe	fehér
Szubsztrátumban lévő micélium	narancsszínű
Kidiffundált pigment színe	-
Cukorspektrum
ARA	+
GÁL	+
MAD	-
XYL	-
GLU	tr
RIB	+
Típus	A
DAP	DL
Menakinonok (%-ban)
8/4	-
9/0	(+)
9/2	+
9/4	+++
9/6	-
9/8	-
16S rDNS-homológia	96,1%
Foszfolipidek, például
PE, OH-PE, lizo-PE
met-PE, PC, NPG, Pl
PIM, PG, DPG, GL	nincs vizsgálva
Zsírsavak
izo 16	+++
izo 15	+
izo 17	(+)
anteizo 15	(+)
anteizo 17	(+)
10-Me 16
10-Me 17	+
2-OH 15	+
2-OH 16	+
Típus	3f
MS	-

Az azonosításban alkalmazott rövidítések:

(⁺)	1-5%
+	5-15%
++	15-30%
+++	>30%

HU 226 274 Β1

DAP	diamino-pimelinsav
ARA	arabinóz
GÁL	galaktóz
MAD	maduróz
XYL	xilóz
GLU	glükóz
RIB	ribóz

Cukortípusok Lechevalier és munkatársai (1971) szerint

Zsírsavtípusok Kroppenstedt (1985 és 1992) szerint

9/4	MK-9 (H₄)
9/6	MK-9 (H₆)
9/8	MK-9 (H„)
MS	mikolsavak
PE	foszfatidil-etanol-amin
OH-PE	hidroxí-PE
met-PE	foszfatidil-metil-etanol-amin
PC	foszfatidil-kolin
NPG	foszfatidil-glükóz-amin
Pl	foszfatidil-inozitol
PIM	foszfatidil-inozitol-mannozid
PG	foszfatidil-glicerin
DPG	difoszfatidil-glicerin
GL	glikolipidek
Zsírsavak izo 16	izo-hexadekánsavak vagy
10-Me-18	14-metil-pentadekánsavak tuberkulo-sztearinsav
2-OH-16	2-hidroxi-palmitinsav.

GF270, GF376, GF473, GF578és GF674 azonosítása

A fenti törzsek azonosítása öt, egymástól független tulajdonságon alapul.

1. A telepek morfológiája és színe: rövid, elágazó hífák, amelyek pálcika- és spóraszerű elemekké bomlanak. GF270 és GF376 telepei lazacpirosok (RAL 3022), GF578 és GF674 telepei világospirosak (RAL 3012).

2. A peptidoglikán diaminosava: mezo-diamino-pimelinsav

3. Mikolsavak: Rhodococcus-mikolsavak: a hosszú szénláncú mikolsav meghatározását nagy hőmérsékletű gázkromatográfiásán végeztük. GF270 és GF376, valamint GF473, GF578 és GF674 mikolsavainak eluálási profilja azonos volt. GF270 és GF376 mikolsavának hossza C₃₈-C₄₆, a GF473, GF578 és GF674 mikolsava hossza C₄₀-C₄₈ volt. A mikolsavmintákat összehasonlítottuk Rhodococcus törzsek mikolsavmintájával. A GF270 törzset igen kis korrelációs tényezővel (0,086) mint Rhodococcus rhodochroushoz tartozónak azonosítottuk; GF376 ezzel a módszerrel nem volt azonosítható. A többi három izolátum (GF473, GF578 és GF674) igen kis korrelációs tényezővel Rhodococcus ruberhoz került.

4. Zsírsavminták: egyenes szénláncú, telített és telítetlen zsírsavak, tuberkolosztearinsav is. A zsírsavminta jellemző minden Rhodococcus nemzetségre és közeli rokonokra (Mycobacterium, Nocardia,

Dietzia, Tsukamurella és néhány Coryne baktériumfajta). Fajtaszinten az azonosítás a GF270,

GF376, GF473, GF578 és GF674, valamint Rhodococcus fajták zsírsavmintái közötti mennyiségi és minőségi különbségek alapján történt.

5. A GF270 és GF376 16S rDNS-részszekvenciái azonosak voltak (100%), bár ezek és a Rhodococcus törzsekének összehasonlítása csak 99,1%-os hasonlóságot mutatott a legközelebbhez álló Rhodococcus rhodochroushoz. GF473 és GF578 16S rDNS-szekvenciája azonos volt (100%). GF674 GF578-tól csak egy bázispárban különbözik (500 közül; 99,8%). Mind a három izolált törzs Rhodococcus coprophilushoz csak távoli rokonságot mutat (98,4%). Kemotaxikus és molekulárbiológiai eredmények alapján a fentiekből arra lehet következtetni, hogy GF270 és GF376 egyrészt, és GF473, GF578 és GF376 másrészt két új Rhodococcus fajta törzsei. GF270 és GF376 a 16S rDNS-szekvenciája alapján közeli rokonai a Rhodococcus rhodochrousnak (99,1%), míg GF473, GF578, GF674 csak távoli rokonai a Rhodococcus coprophilusnak (98,4%).

Az enzimkivonatok a mikroorganizmusok szakember számára ismert módon történő feltárással nyerhetők. A feltárás például ultrahanggal, French-préssel vagy a lizozimes módszerrel történhet. Mind az enzimkivonat, mind természetesen az egész mikroorganizmus az eljárás megvalósítása céljából alkalmas hordozóanyagon, általában polimerbe beágyazva immobilizálható vagy alkalmas hordozóhoz adszorbeálható.

A nitrilhidratáz-aktivitással rendelkező, találmány szerinti enzimek a Amycolatopsis nemzetségben mikroorganizmusokból nyerhetők, és képesek a nitril->amid átalakításra. Az enzimek különösen az Amycolatopsis NA40 (DSMZ) törzsből nyerhetők. Ezeknek az enzimeknek főleg az alábbi tulajdonságai vannak:

a) pH-optimum 6,5±1,0

b) hőmérséklet-optimum (pH=7 mellett) 35 °C és ’C között

c) 3-ciano-piridin-szubsztrátum esetén a K_M-érték

41,7 mM±7,7 mM (20 °C 45 mM foszfátpuffer, pH=7)

d) móltömegük 106 kDa, például SDS-PAGE szerint meghatározva.

A biotranszformálás szubsztrátumai általánosan nitrilek. Célszerűen alifás, 1-10 szénatomos, adott esetben például hidroxil-, aminocsoporttal, halogénatommal vagy karboxilcsoporttal szubsztituált nitrileket, vagy szubsztituált vagy szubsztituálatlan, az aromás gyűrűrendszerben 4-10 szénatomot tartalmazó aromás nitrileket alkalmazunk. Az 1-10 szénatomos alifás nitrilek lehetnek dinitrilek, hidroxi-nitrilek, amino-nitrilek. így például n-oktan-nitril, ciano-ecetsav, izokapro-nitril, n-valeronitril, adiponitril, glutaronitril, szukcinonitril, szebaconitril, propionitril, krotonitril, akrilnitril, metakrilnitril, n-vajsavnitril vagy azelanitril. Aromás nitrilként az (I) vagy (II) általános képletű nitrilek jöhetnek számításba, amelyek képletében R¹ és R² jelentése hidrogénatom, halogénatom vagy Ci-C₄-alkil-csoport. A halo4

HU 226 274 Β1 génatom lehet fluor-, klór-, bróm- vagy jódatom. A C₁-C₄-alkil-csoport példájaként az alábbiakat soroljuk fel: metil-, etil-, propil-, izopropil-, butil-, izobutilvagy terc-butil-csoport. (I), illetve (II) általános képletű nitrilként célszerűen az alábbiakat alkalmazzuk: 2-, 3vagy 4-ciano-piridin, benzonitril, fluor-, klór-, brómbenzonitril, így például ο-, m-, p-klór-benzonitril vagy

2-klór-3-ciano-piridin. Az aromás magban 4-10 szénatomot tartalmazó aromás nitrilként előnyösen 3-cianopiridint alkalmazunk.

A biotranszformálás során a szubsztrátumot egyszerre vagy folyamatosan adjuk a reakcióelegyhez, előnyösen úgy, hogy a szubsztrátomkoncentráció ne haladja meg a 40 tömeg%-ot, előnyösen a 30 tömeg%-ot.

Az eljárást célszerűen nyugvó (nem növekvő) sejtekkel valósítjuk meg.

A biotranszformálás során közegként a szakember számára ismert közegeket alkalmazhatjuk, például: kis koncentrációjú foszfátpuffer, HEPES-puffer, citrátpuffer, borátpuffer, az 1., 2. és 3. táblázat szerinti közegek vagy ezek megváltoztatott formái, például a 8. példa 1. pontjában leírt TRIS-HCI-puffer.

A biotranszformálást célszerűen 0-50 °C-on és 4,5 és 10 közötti pH-értéken valósítjuk meg. A hőmérséklet előnyösen 20-40 ’C, a pH-érték előnyösen 4,5 és 10,0 közötti.

Az eljárás egy különösen előnyös kiviteli módja szerint a biotranszformálás C^-C^-alkoholok jelenlétében végezhetjük. C.,-C₄-alkoholként metanolt, etanolt, propanolt vagy butanolt alkalmazhatjuk. A metanolt előnyben részesítjük.

A reakció befejeztével az előállított amidokat a szokásos feldolgozási módszerekkel, például kristályosítással elkülöníthetjük.

Példák

1. példa

Actimadura és Amycolatopsis nemzetségbeli mikroorganizmusok tenyésztése

a) Különböző talajmintákat az 1. táblázat szerinti dúsítóközegben C- és N-forrásként szolgáló különböző nitrilekkel oltottunk, majd 7-10 napon át 37 °C-on vagy 45 °C-on inkubáltunk. Ezt követően a tenyészeteket azonos közegbe átoltottuk, és újból 37 °C-on 7-10 napon át inkubáltuk. Ezt háromszor megismételtük. Ezt követően a tenyészeteket hígítottuk és szélesztettük, hogy telepeket kapjunk. A lemezeket 5 napon át 37 °C-on inkubáltuk. Utána a kapott telepek aktivitását vizsgáltuk.

A fentiek szerint az Amycolatopsis NA40 (DSMZ 11617) és Amycolatopsis NE31 (DSMZ 11616) törzseket izoláltuk, majd optimált közegben (3. táblázat) 90-100 órán át rázógépen 37 ’C-on tenyésztettük.

Az Amycolatopsis NE31 (DSMZ 11616), Actinomadura spadix E3733 és Actinomadura spadix E376 törzsek számára adiponitril, az Amycolatopsis NA40 (DSMZ 11617), Actinomadura spadix 45A32 törzsek számára azelanitril, az Actinomadura spadix

4501 törzs számára n-oktánitril és az Actinomadura spadix C15 törzs számára ciano-ecetsav volt a C- és

N-forrás.

b) Az Amycolatopsis NA40 törzset a 3. táblázat szerinti közegben tenyésztettük. A tenyésztést „szubkultúrákban” (4 ml/üvegcse) és egy „főtenyészet”-ben (500 ml/lombik) aerob körülmények között, 37 ’C hőmérsékleten 2, illetve 3-4 napon át végeztük. A sejtek növekedését turbimetriásan, 610 nm hullámhosszon mértük, és a sejtek száraztömegét az m (mg/ml)=OD_{ei0 nm}*0,277 képlettel számítottuk.

1. táblázat

Dúsftóközeg
Nitril	2,0 g
KH₂PO₄	7,0 g
MgSO₄.7H₂O	0,1 g
Vitaminkeverék	1,0 ml
COCI₂.6H₂O	2,0 mg
FeSO₄.7H₂O	2,0 mg

Vízzel 1 literre feltölteni (pH=6,7-7,3)

2. táblázat

Bázisközeg
Maltóz	2,0 g
NaNO₃	1,0 g
K₂HPO₄	0,1 g
MgSO₄.7H₂O	0,05 g
Vízzel 100 ml-re feltölteni (pH=7,0)
3. táblázat
Optimált közeg
D-glükóz	4,5 g
Húskivonat	0,5 g
K₂HPO₄	0,1 g
MgSO₄.7H₂O	0,05 g
COCI₂.6H₂O	1,0 mg

Vízzel 100 ml-re feltölteni (pH=7,0)

2. példa

Actinomadura és Amycolatopsis nemzetségben mikroorganizmusokkal végzett biotranszformálás (1) A nitrilhidratáz-aktivitás meghatározására 3 cianopiridin (1,0 M; 1,0 ml), kálium-foszfát-puffer (pH=7,0; 0,1 M; 0,5 ml) és 0,5 ml sejtszuszpenzió 2 ml térfogatú reakcióelegyét 20 °C-on keverés közben 30 percen át inkubáltuk. A reakciót 0,2 ml 3 N HCI adagolásával félbeszakítottuk. Rövid centrifugálás után a keletkezett nikotinamidot nagynyomású folyadékkromatográfiásán (Shimadzu SPD 6A rendszer C18 oszloppal; Develosil ODS-HG-5, 4,6*250 cm) eluálófolyadék: KH₂PO₄/H₃PO₄ (pH=2,8) és acetonitril 9:1 térfogatarányú elegye; áramlás: 1 ml/perc; az abszorpciót 230 nm-nél mértük) meghatároztuk. A fajlagos aktivitást a képződött nikotinamid ml-re, percre és OD₆io nm’^re vonatkoztatott pmol-ban adott mennyiségeként fejeztük ki.

HU 226 274 Β1

Az 5. táblázat mutatja az elkülönített baktériumokkal dúsítóközegben elért nitrilkonvertálást, a 2. táblázat szerinti bázisközegben lévő induktorok és kofaktorok befolyását a 4. táblázat szemlélteti, míg a 6. táblázat az Amycolatopsis és Rhodococcus bázisközegben kifej- 5 tett aktivitásának összehasonlítását tartalmazza. A 4. táblázatból kivehető módon Amycolatopsis NA40 a nitrilhidratáz-enzimet termeli, de az aktivitáshoz kobalt mint kofaktor szükséges.

(2) A hőmérséklet befolyása NA40 növekedésére ml térfogatú szubkultúrákat a 3. táblázat szerinti közegben 37 °C-on 2 napon át inkubáltunk, majd rázólombikban lévő 20 ml 3. táblázat szerinti közegbe átoltottuk. A tenyésztést 37,40,45, 50, illetve 55 °C-on 3-4 napon keresztül rázás közben folytattuk. Megmértük a sejtnövekedést, és meghatároztuk - 20 °C-on - a nitrilhidratáz-aktivitást. A 7. táblázat mutatja a hőmérséklet befolyását a sejtnövekedésre és a nitrilhidratáz-aktivitásra.

4. táblázat

Induktorok és kofaktorok befolyása a bázisközegben kifejtett fajlagos aktivitásra

Induktor	Növekedés (°^D610 nm)	összaktivitás (pmol/mlperc)	Fajlagos aktivitás (pmol/ml-perc-OD)
-	1,26	20,9	16,6
ε-Kaprolaktám	0,66	9,52	14,5
Krotonamid	3,41	22,9	6,72
Metakrilamid	3,33	2,46	0,74
Butiramid	2,19	0,19	0,88
Propionamid	1,91	0,92	0,48
Karbamid	1,72	2,97	1,73
Kofaktor:
-	7,97	0,10	0,01
FeSO₄.7H₂O	8,32	3,36	0,40
CoCI₂.6H₂O	8,41	47,8	5,68

5. táblázat

Alifás nitrilek elkülönített baktériumokkal elérhető konvertálása

Törzs	Szubsztrátum	Növekedés (OD_{610 nm})	Összaktivitás (pmol/ml'perc)	Fajlagos aktivitás (pmol/ml-perc-OD)
Amycolatopsis NE31 (DSMZ 11616)	adiponitril	2,68	0,377	0,141
Actinomadura spadix E3733	adiponitril	1,62	0,347	0,214
Act. sp. E3736	adiponitril	1,36	3,00	2,21
Act. sp. 45A32	azelanitril	5,81	18,8	3,23
Act. sp. 4501	n-oktán-nitril	7,24	32,2	4,45
Act. sp. C15	ciano-ecetsav-nitril	2,04	7,01	3,43
Amycolatopsis NA4 (DSMZ 11617)	azelanitril	5,92	33,0	5,57

6. táblázat

Amycolatopsis NA40 és Rhodococcus rhodochrous aktivitásának összehasonlítása

3-cianoecetsav szubsztrátum esetén

	Amycolatopsis NA40 (DSMZ11617)	Rhodococcus rhodochrous J1
Mikroorganizmusok aktivitása (pmol/ml perc)	303	314
Tisztított enzim aktivitása (pmol/perc mg protein)	1110	371

(3) Az NA40 törzs aktivitását több szubsztrátum esetén akartuk vizsgálni, ezért 0,0388 mg száraztömegű sejteket a fent leírt pufferban inkubáltunk. A reagá60 lást a megfelelő szubsztrátum adagolásával beindítottuk, és a tenyészeteket 20 °C-on rázás közben 10 percen át inkubáltuk.

HU 226 274 Β1

A reakciót 0,2 ml 2 N HCI adagolásával félbesza- natkozásában végzett teszt feltételeit tartalmazza, kilőttük, és a reakcióelegyet centrifugáltuk. A felül- míg a 9. táblázat az NA40 nyugvó sejtjeivel különúszót HPLC vagy gázkromatográfia segítségével ele- böző szubsztrátumokra kapott eredményeket tartalmeztük. A 8. táblázat a szubsztrátumfajlagosság vo- mázzá.

7. táblázat

A hőmérséklet befolyása a nitrilhidratáz-aktivitásra és a sejtnövekedésre

Hőmérséklet (°C)	Növekedés (mg/ml)	Ossza ktivitás (pmol/ml-perc)	Fajlagos aktivitás (pmol/mlperc-mg)	Relatív aktivitás (%)
37	6,16	4,69	0,761	100
40	5,79	9,89	1,71	225
45	6,56	4,83	0,736	97
50	596	1,16	0,195	26

8. táblázat

A szubsztrátumfajlagosság tesztkörülményei

Szubsztrátum	Szubsztrátum konc. (mM)	Elemzési módszer	Képződött amid
3-Ciano-piridin	1,0	HPLC	nikotinamid
2-Ciano-piridin	0,25	HPLC	2-pikolinamid
4-Ciano-piridin	0,25	HPLC	piridin-4-karboxamid
Krotonitril	0,4	HPLC	krotonamid
Benzonitril	0,03	HPLC	benzamid
Akrilnitril	0,4	HPLC	akrilamid
o-Klór-benzonitril	0,15	HPLC	o-klór-benzamid
m-Klór-benzonitril	0,15	HPLC	m-klór-benzamid
p-Klór-benzonitril	0,15	HPLC	p-klór-benzamid
2-Klór-3-ciano-piridin	0,15	HPLC	2-klór-nikotinamid
Acetonitril	0,4	GC	acetamid
Propionitril	0,4	GC	propionamid
Metakrilnitril	0,4	GC	metakrilamid
n-Butironitril	0,4	GC	n-butiramid

ο-, m-, p-Klór-benzonitrilt és 2-klór-3-ciano-piridint metanolos oldatként adagoltunk a reakcióelegyhez.

9. táblázat

NA40-nitril-hidratát szubsztrátumfajlagossága

Szubsztrátum	Relatív aktivitás (%)	Szubsztrátum	Relatív aktivitás (%)
3-Ciano-piridin	100	m-klór-benzonitril	75
4-Ciano-piridin	168	p-klór-benzonitril	16
2-Ciano-piridin	128	2-klór-3-ciano-piridin	126
Benzonitril	51	acetonitril	-
Krotonitril	52	propionitril	105
Akrilnitril	115	metakrilnitril	130
o-Klór-benzonitril	96	n-butironitril	194

HU 226 274 Β1 (4) Hőmérséklet-optimum és termikus stabilitás nyugvó sejtekkel

A reagáltatást 10 percen át a szabvány reakcióelegyben végeztük. A hőmérséklet optimuma 35 °C és 40 °C között volt (5. ábra). Ezt követően a sejteket különböző hőmérsékleten 30 percen át inkubáltuk, és az aktivitást szabványfeltételek mellett vizsgáltuk. A 4. ábrából kivehető módon a hőstabilitás határa kb. 40 °C-nál volt.

(5) pH-optimum és pH-stabilitás nyugvó sejtekkel

A reagáltatást 10 percen át olyan szabvány reakcióelegyben végeztük, amelyben a kálium-foszfát-puffer különböző 0,1 M pufferokkal ki lett cserélve. A 6. ábra azt mutatja, hogy a pH-optimum 4,5 és 10 közötti volt. Miután a sejtszuszpenziókat különböző pH-értékek mellett 20 °C-on 30 percen át inkubáltuk, a sejteket centrifugáltuk, mostuk, majd 0,1 M káliumfoszfát-pufferben (pH=7,0) újból szuszpendáltuk. A reakció 10 percen át, 3-ciano-piridin adagolása mellett, szabványkörülmények között folyt. Az enzim pH=4,5 és pH=10 között stabil volt (lásd 7. ábra).

(6) 3-Ciano-piridinből NA40 segítségével nyert nikotinamid felhalmozódása ml térfogatú reakcióelegyben végeztük a reagáltatást. Az elegy 500 nM 3-ciano-piridint, 40 mM káliumfoszfát-puffert (pH=7,0) és 2,3 mg száraztömegű nyugvó sejteket tartalmazott. Hétszer adagoltunk 3-cianopiridin (500 mM), ahányszor az elfogyott. Tizenöt óra alatt összesen 4,0 M 3-ciano-piridint adagoltunk, 3,89 M (475 g/l) nikotinamid képződött, ami 97,3%-os hozamnak felel meg. Nikotinsav nem keletkezett.

3. példa

Amycolatopsis nemzetségbeli mikroorganizmusok azonosítása

Az alábbi 5 kemotaxonomikus marker támasztja alá az azonosítást

1. a peptidoglikán diagnosztikai aminosava: mezodiamino-pimelinsav,

2. diagnosztikai cukrok: arabinóz és galaktóz,

3. mikolsavak: nincsenek minolsavak,

4. menakinonok: MK-9 (H₄),

5. zsírsavminta: izo/anteizo elágazódó és 2-hidroxizsírsavak, kis mennyiségű 10-metil-elágazódó zsírsavak. Ezt a zsírsavmintát az Amycolatopsis nemzetség összes képviselőjében találtuk (3f jelű zsírsavminta).

A fenti kémiai ismérvek kombinációja az Amycolatopsis nemzetség minden fajtájára jellemző.

A két tenyészet zsírsavadatait főkomponens-elemzés segítségével a zsírsavadatbank adataival vettettük egybe. Ezzel a módszerrel mind az NE31 törzset, mind az NA40 törzset sikerült hozzárendelni az Amycolatopsis nemzetséghez. Fajtaszinten azonban nem sikerült a további azonosítás, tekintettel arra, hogy a korrelációs tényező túl alacsony volt. A két törzs zsírsavmintájának összehasonlítása azt is mutatta, hogy a két törzs két különböző fajtához tartozik.

Az eredményt a 16S rDNS-szekvencia elemzése is alátámasztotta. Ezzel is az Amycolatopsis nemzetséghez lehetett hozzárendelni a két törzset, a már leírt Amycolatopsis fajtákhoz azonban nem. A 16S rDNSszekvenciát a PCR-amplifikált 16S rDNS-gén közvetlen szekvenálásával határoztuk meg. A 16S rDNS-szekvencia jellemző részét az Amycolatopsis nemzetség típusfajtáinak és hasonló taxonok szekvenciájával összehasonlítottuk. Az eredmény azt mutatta, hogy a törzs az Amycolatopsis nemzetséghez tartozik. A legnagyobb egybeesést, azaz 96,9%-ot (NA40), illetve 96,1 %-ot (NE31) az Amycolatopsis methanolica mutatta. A két izolátum szekvenciája 99,0%-ban egyezett egymással. Az Amycolatopsis nemzetség képviselőivel végzett vizsgálataink azt mutatta, hogy jó fajtaazonosításhoz a korrelációs tényezőnek 99,5%-nál nagyobbnak kell lennie. Tekintettel arra, hogy a 96,9% 99,5%-nál határozottan kisebb, abból indulhatunk ki, hogy a két izolátum egyike sem ismert Amycolatopsis fajta képviselője.

A fenti adatok alapján a két izolált törzset az ismert Amycolatopsis fajtákhoz hozzárendelni nem sikerült. Abból indulunk ki, hogy NA40 és NE31 két új, eddig le nem írt Amycolatopsis fajta törzsei.

Az Amycolatopsis nemzetségben mikroorganizmusok azonosítása

Levegőmicélium színe

Szubsztrátumban lévő micélium színe

Kidiffundált pigment színe

Cukorspektrum

ARA +

GÁL +

MAD

XYL

GLU v

RIB +

Típus A

DAP DL

Menakinonok (%-ban)

8/4

9/0 (+)

9/2 +

9/4 +++

9/6

9/8

16S rDNS-homológia >99,5%

Foszfolipidek

PE +

OH-PE + lizo-PE met-PE

PC

NPG

Pl +

PIM v

PG +

DPG +

GL

Típus ll+OH-PE

Zsírsavak izo 16 +++ izo 15 +

HU 226 274 Β1

izo 17	(⁺)
anteizo 15	+
anteizo 17	(+)
10-Me 16	(⁺)
10-Me 17	+ 5
2-OH 15	+
2-OH 16	+
Típus	3f
MS	-
	10
4. példa
A NA40 mikroorganizmustörzsből nyert
nitrilhidratáz tisztítása
A törzset három napon át a 3. táblázat szerinti kő-
zegben 37 °C-on tenyésztettük.	Két liter térfogatú te- 15

nyészet sejtjeit centrifugálással elkülönítettük, majd 0,85%-os NaCI-oldatban újraszuszpendáltuk. Utána a sejteket 44 mM n-vajsavat tartalmazó 0,1 mol-os kálium-foszfát-pufferbe (pH=7,0) vittük át, és a szuszpenziót ultrahanggal kezeltük. Centrifugálással a sejtkivo- 20 natot a sejttörmeléktől tisztítottuk, és a kapott extraktumot az enzimtisztításhoz használtuk. Az egész tisztítás alatt 44 mM n-vajsavat tartalmazó kálium-foszfát-puffert (pH=7,0) alkalmaztunk. A 10. táblázatból kivehetően az enzimet 3 lépésben homogenitásig tisztítottuk.

Paraméter/lépés	Sejtmentes kivonat	DEAE- Sephacel	Phenyl- TOYO- PEARL
Összaktivitás (egységek)	73 300	68 000	64 800
összprotein (mg)	1 020	110	61,4

Paraméter/lépés	Sejtmentes kivonat	DEAE- Sephacel	Phenyl- TOYO- PEARL
Fajlagos aktivitás (egység/mg)	71,9	620	1 105
Dúsítás	1	8,62	15,4

egység: az az enzimmennyiség, amely 20 °C-on 1 pmol nikotinamid/perc képződését katalizálja.

5. példa

A nitrilhldratáz jellemzése (1) A móltömegnek, alegységek szerkezetének és kobaltion-tartalomnak meghatározása

A móltömeget TSK-géloszlopon (G3000 SW, 0,75*60 cm) kromatográfiásan határoztuk meg 0,2 M kálium-kloridot és 44 mM n-vajsavat tartalmazó 0,1 M kálium-foszfát-puffer (p_H=7,0) alkalmazásával. A móltömeg 106 kDa volt. Megállapítást nyert, hogy az enzim két különböző alegységből (a és β) áll, az egyiknek a móltömege 30 000, a másiké 26 000.

Az 1. ábra mutatja a móltömeg TSK-gél G3000 SW segítségével történő meghatározását.

A 2. ábra a móltömeg SDS-SPADE segítségével történő meghatározását szemlélteti.

A 3. ábra a tisztított enzim abszorpciós spektrumát mutatja. 300-400 nm-nél igen széles abszorpció tűnik fel.

(2) A tisztított enzim szubsztrátumfajlagossága

A szubsztrátumfajlagosságot a 2. példa 1. pontja szerint határoztuk meg. Az eredményeket a 11. táblázat mutatja.

11. táblázat

A tisztított nitrilhidratáz szubsztrátumfajlagossága

Szubsztrátum	(M)	Összaktivitás (pmol/ml-perc)	Relatív aktivitás (%)
enzimmel	nyugvó sejtekkel
3-Ciano-piridin	1,0	17,7	100	100
2-Ciano-piridin	0,25	39,1	221	128
4-Ciano-piridin	0,25	31,6	179	168
Krotonitril	0,4	11,9	67	52
Benzonitril	0,03	11,3	64	51
Akrilnitril	0,4	16,6	94	115
o-Klór-benzonitril	0,15	22,4	127	96
m-Klór-benzonitril	0,15	15,9	90	75
p-Klór-benzonitril	0,15	2,30	13	16
2-Klór-3-ciano-piridin	0,15	16,0	90	126
Acetonitril	0,4	-	-	-
Propionitril	0,4	39,3	222	105
Metakrilnitril	0,4	22,1	125	130
n-Butironitril	0,4	17,9	101	194

A 2 ml-es reakcióelegyhez 1,7 egységnyi enzimet adtunk. A reakcióelegy az adott szubsztrátumot 45 mM foszfátpufferben (pH=7,0) tartalmazta.

HU 226 274 Β1

12. táblázat

Különböző inhibitorok hatása a tisztított enzimre (3) A K_M-érték meghatározása

A K_M-értéket a Lineweaver-Burk-diagram alapján határoztuk meg. 3-Ciano-piridin esetén 41,7 mM, akrilnitril esetében 3,7 mM adódott. A Rhodococcus rhodochrous J1 törzshöz viszonyítva (K_M-érték 3-ciano-piridin esetében 200 mM) az NA40 K_M-értéke lényegesen kisebb. Ez az NA40 egyik fő előnye.

(4) Hőstabilitás és hőmérsékleti optimum

A tisztított enzimet pH=7,0 mellett 30 percen át különböző hőmérsékleteken inkubáltuk, utána a 3-ciano-piridin->nikotinsavamid reakciót határoztuk meg 20 °C-on, 1 percen át. Az enzim 40 °C feletti hőmérsékleten Ínaktiválódott. A hőstabilitás határa - akár a nyugvó sejtek esetén is - kb. 40 °C volt. A hőmérsékleti optimum 35 °C és 40 °C közötti (5. ábra).

(5) pH-optimum és pH-stabilitás

A 3-ciano-piridin->nikotinsavamid reakciót végeztük 20 °C-on 2 ml-es reakcióelegyben, amely különböző puffért (42,5 mM), 1,71 egységnyi tisztított enzimet és 500 mM 3-ciano-piridint tartalmazott. A pH-optimum kb. pH=6,5±1,0 volt (8. ábra).

A pH-stabilitás meghatározására 4,2 egység tisztított enzimet 20 °C-on különböző pufferokkal (42,5 mM) 1 órán át inkubáltunk. Az inkubált oldat egy részét, 1,71 egységet a szabvány reakcióelegyhez (lásd 2. példa (1) pontja) adtuk. A maradék aktivitást meghatároztuk. Az enzim 5-9 közötti pH mellett stabil volt. Az eredményeket a 9. ábra mutatja.

(6) Inhibitorok

Különböző inhibitorok hatását vizsgáltuk. Az eredményeket a 12. táblázat mutatja.

Inhibitor	mM	Relatív aktivitás (%)
-		100
N-Etil-malein-imid	1	97
Jódecetsav	1	39
4-Klór-merkuro-benzoesav	0,1	69
Nátrium-azid	1	59
Hidroxil-amin	1	37
Fenil-hidrazin	1	8
Szemikarbazin	1	82
Tiron(4,5-dihidroxi-1,3benzol-diszulfonsav dinátriumsója)	1	110
o-Fenantrolin	1	89
α,α'-Dipiridil	1	100
8-Hidroxi-kinolin	1	110
EDTA (etilén-diamin-tetraecetsav)	1	115
Dietil-ditiokarbamát	1	89

6. példa

Metanol NA40 nyugvó sejtjeire gyakorolt hatása A reagáltatást 0-20 térfogat% metanol jelenlétében

10 percen át a 13. táblázat szerint végeztük. Ahogy a

14. táblázat mutatja, 5-15 térfogat% metanol adagolása az aktivitást fokozza.

13. táblázat

Alkotó	Módszerek
(1)	(2)	(3)	(4)	(5)
1,0 M 3-ciano-piridin	1,0 ml	1,0 ml	1,0 ml	1,0 ml	1,0 ml
0,1 Μ KPB* (pH=7,0)	0,9 ml	0,8 ml	0,7 ml	0,6 ml	0,5 ml
Metanol	-	0,1 ml	0,2 ml	0,3 ml	0,4 ml
Sejtszuszpenzió (0,388 mg/ml)	0,1 ml	0,1 ml	0,1 ml	0,1 ml	0,1 ml
össztérfogat	2,0 ml	2,0 ml	2,0 ml	2,0 ml	2,0 ml

*KPB=kálium-foszfát-puffer

14. táblázat

Metanol hatása Amycolatopsis NA40 aktivitására

Módszer	Metanol (térfogat%)	Relatív aktivitás (%)
(1)	0	100
(2)	5	123
(3)	10	128
(4)	15	130
(5)	20	105

7. példa

Rhodococcus nemzetségben mikroorganizmus feldúsítása

Különböző talajmintákhoz az 1. táblázat szerinti dúsítóközegben C- és N-forrás gyanánt ciano-ecetsavat adtunk, és az 1. példa szerint a Rhodococcus GF270, GF578, GF473 és GF376 mikroorganizmusokat izoláltuk.

8. példa

Rhodococcus nemzetségbeli mikroorganizmusokkal végrehajtott biotranszformálás

HU 226 274 Β1 (1) Rhodococcus GF674, Rhodococcus GF578, Rhodococcus GF270 és Rhodococcus GF376 hőstabilitása a Rhodococcus rhodochrous J1 törzséhez viszonyítva

A hőstabilitás meghatározására a fent említett mikroorganizmusokat az alábbi közegekben tenyésztettük. Rhodococcus rhodochrous J1: az EP-A 0 307 926 leírásban megadott közegben, 72 órán át. A Rhodococcus GF674, GF578, GF270 és GF376 mikroorganizmusokat az alábbi közegekben pH=7,0 mellett akár 96 órán át tenyésztettük.

Rhodococcus GF674: 1,0 g/l élesztőkivonatot, 5,0 g/l fruktózt, 10,0 g/l malátakivonatot, 5,0 g/l acetamidot, 2,0 g/l KH₂PO₄-ot, 0,5 g/l MgSO₄.7H₂O-t és 10,0 mg/l COCI₂.6H₂O-t tartalmazó közegben.

Rhodococcus GF578: 1,0 g/l élesztőkivonatot, 15,0 g/l fruktózt, 10,0 g/l malátakivonatot, 25,0 g/l acetamidot, 2,0 g/l KH₂PO₄-ot, 0,5 g/l MgSO₄.7H₂O-t és 5,0 mg/l COCI₂.6H₂O-t tartalmazó közegben.

Rhodococcus GF270:12,5 g/l élesztőkivonatot, 5,0 g/l nátrium-citrátot, 7,5 g/l metakrilamidot, 2,0 g/l KH₂PO₄-ot, 0,5 g/l MgSO₄.7H₂O-t és 30,0 mg/l COCI₂.6H₂O-t tartalmazó közegben.

Rhodococcus GF376: 1,0 g/l élesztőkivonatot, 10,0 g/l nátrium-citrátot, 15,0 g/l malátakivonatot, 7,5 g/l butiramidot, 2,0 g/l KH₂PO₄-ot, 0,5 g/l MgSO₄.7H₂O-t és 15,0 mg/l COCI₂.6H₂O-t tartalmazó közegben.

A nyugvó sejteket különböző hőmérsékleteken 15 percen át inkubáltuk, utána a maradandó aktivitást a 2. példa (1) pontja szerinti szabvány reakciókörülmények között meghatároztuk.

Ennek során bebizonyosodott, hogy a Rhodococcus GF674 törzs relatív aktivitása 50 °C-on majdnem 100% volt, és 60 °C-on még mindig 10%. Rhodococcus GF578 50 °C-on szintén 100% relatív aktivitással rendelkezett, 60 °C-on még 20% volt az aktivitása. Rhodococcus GF376 relatív aktivitása 50 °C-ig 100% volt, 60 °C-on 70% és 70 °C-on még mindig közel 5%. Rhodococcus GF270 relatív aktivitása 60 °C-ig majdnem 100% volt, 70 °C-on az aktivitás még 5% volt. Ezekkel összehasonlítva Rhodococcus rhodochrous J1 relatív aktivitása 50 ’C-ig 100% volt, 60 ’C-on 80%, 70 ’C-on nulla.

Összefoglalva tehát megállapíthatjuk, hogy a Rhodococcus GF270 és GF376 törzsek hőstabilitása meghaladja a J1 törzs hőstabilitását, és a legjobb hőstabilitást a GF270 törzs mutatja.

A Rhodococcus törzsek pH-optimuma

A pH-értéknek a GF674, GF578, GF270 és GF376 Rhodococcus törzsek nitrilhidratáz-aktivitására gyakorolt befolyását a 2. példa (5) pontja szerint vizsgáltuk. Rhodococcus GF674 pH-optimuma pH=7,5-9,5; GF578: pH=8-8,5; GF270: pH=6-7,0 és GF376: pH=6-8.

A Rhodococcus törzsek szubsztrátumfajlagossága

A szubsztrátumfajlagosságot relatív aktivitásként a

15. táblázatban tüntettük fel.

(4) Nikotinamid felhalmozódása (Rhodococcus törzsek)

A 2. példa (6) pontja szerint eljárva a GF674, GF578, GF270 és GF376 Rhodococcus törzseket kb. 500 mM 3-ciano-piridinnel inkubáltuk. Ennek során Rhodococcus GF674 25 óra alatt 6 M, GF578 10 óra alatt 5,5 M, GF270 20 óra alatt mintegy 8,5 M és GF376 20 óra alatt 7,5 M nikotinamidot termelt.

(5) A Rhodococcus törzsek 3-ciano-piridin-tűrő képessége

Megvizsgálva azt, hogy milyen mértékben képesek a törzsek a 3-ciano-piridint tolerálni, nyugvó sejteket 20 ’C-on 15 percen át 1-10 vegyes% közötti különböző szubsztrátumkoncentrációk mellett inkubáltunk, majd a sejteket centrifugáltuk, 0,85%-os NaCI-oldattal mostuk, majd a megmaradt aktivitást mértük.

Megállapítást nyert, hogy 2 vegyes% szubsztrátumkoncentráció esetén a Rhodococcus rhodochrous J1 mikroorganizmus nitrilhidratáz-aktivitása 1,4 tényezővel, Rhodococcus GF674 nitrilhidratáz-aktivitása 4 vegyes% szubsztrátumkoncentráció esetén 1,4 tényezővel csökkent, Rhodococcus GF578 nitrilhidratázaktivitása 8 vegyes% szubsztrátumkoncentráció esetén majdnem állandó maradt, Rhodococcus GF270 nitrilhidratáz-aktivitása 4 vegyes% szubsztrátumkoncentráció esetén 1,17 tényezővel és Rhodococcus GF376 nitrilhidratáz-aktivitása 10 vegyes% szubsztrátumkoncentráció esetén 1,25 tényezővel csökkent.

A többi Rhodococcus törzzsel összehasonlítva a Rhodococcus rhodochrous J1 törzs a 3-ciano-piridint a legrosszabban tolerálta.

15. táblázat

Szubsztrátumfajlagosság, a törzsek relatív aktivitása %-ban

Szubsztrátum	J1	GF674	GF578	GF270	GF376
3-Ciano-piridin	100	100	100	100	100
2-Ciano-piridin	45	308	200	15,7	54,3
4-Ciano-piridin	70	231	167	55,6	79,8
Benzonitril	27	138	85,1	13,4	57,2
2-Klór-benzonitril	2,8	64,8	49,0	0	0
3-Klór-benzonitril	43	27,8	28,9	8,41	8,63
4-Klór-benzonitril	13	0	0	0	0
Acetonitril	608	1,49	347	659	806
Propionitril	434	274	132	37,3	245

HU 226 274 Β1

15. táblázat (folytatás)

Szubsztrátum	J1	GF674	GF578	GF270	GF376
n-Butironitril	352	491	368	181	195
Akrilnitril	478	147	101	192	257
Krotonitril	78,2	98,0	124	37,1	110
Metakrilnitril	86,9	176	122	0	0

SZABADALMI IGÉNYPONTOK

Claims

SZABADALMI IGÉNYPONTOK

1. Amycolatopsis vagy Actinomadura nemzetségbeli mikroorganizmusok, azzal jellemezve, hogy képesek nitrilt amiddé alakítani.
2. Az 1. igénypont szerinti mikroorganizmusokból nyert enzimkivonatok, azzal jellemezve, hogy nitrilhidratáz-aktivitással rendelkeznek.
3. Az 1. igénypont szerinti mikroorganizmusok Amycolatopsis NA40 és Amycolatopsis NE31 törzse, letétbe helyezve DSM 11617 és DSM 11616 szám alatt, valamint e mikroorganizmusok nitrilamiddá alakítására képes variánsai és mutánsai.
4. A Rhodococcus nemzetségbeli Rhodococcus GF270 és GF376 törzs, letétbe helyezve DSM 12211 és DSM 12175 szám alatt, valamint azok nitrilamiddá alakítására képes variánsai és mutánsai.
5. A 4. igénypont szerinti mikroorganizmusokból nyert enzimkivonatok, azzal jellemezve, hogy nitrilhidratáz-aktivitással rendelkeznek.
6. Az 1. vagy 4. igénypont szerinti mikroorganizmusokból nyert enzim, azzal jellemezve, hogy nitrilhidratáz-aktivitással rendelkezik, és

a) pH-optimuma pH=6,5±1,0,

b) hőmérséklet-optimuma pH=7,0 mellett 35-40 °C,

c) 3-ciano-piridin-szubsztrátum mellett K_M-értéke

41,7 mM±7,7 mM.
7. Eljárás amidok előállítására, azzal jellemezve, hogy egy nitrilt mint szubsztrátumot az 1., 3. vagy 4. igénypontok bármelyike szerinti mikroorganizmusokkal

15 vagy e mikroorganizmusokból nyert enzimkivonattal, vagy a 6. igénypont szerinti enzimmel a megfelelő amiddá alakítunk.
8. A 7. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy nitrilként adott esetben szubsztítuált alifás,

20 1-10 szénatomos nitrilt alkalmazunk.
9. A 7. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy nitrilként adott esetben szubsztítuált, az aromás gyűrűrendszerben 4-
10 szénatomot tartalmazó aromás nitrilt alkalmazunk.

25 10. A 9. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy aromás nitrilként (I) vagy (II) általános képletű nitrilt alkalmazunk, amelyek képletében

R¹ és R² jelentése hidrogénatom, halogénatom vagy C₁-C₄-alkil-csoport.

30
11. A 7-10. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a reagáltatást 0-50 °C-on, 4,5-10 pH mellett valósítjuk meg.
12. A 7-11. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a reagáltatást Amycolatopsis

35 NA40 (DSMZ 11617) vagy Amycolatopsis NE31 (DSMZ 11616) mikroorganizmusokkal, vagy ezek nitrilamiddá alakítására szintén képes variánsaival és mutánsaival végezzük.