HU226148B1 - Method for preparing 2-hydroxy 4-methylthio butyric acid using a nitrilase - Google Patents
Method for preparing 2-hydroxy 4-methylthio butyric acid using a nitrilase Download PDFInfo
- Publication number
- HU226148B1 HU226148B1 HU9904513A HUP9904513A HU226148B1 HU 226148 B1 HU226148 B1 HU 226148B1 HU 9904513 A HU9904513 A HU 9904513A HU P9904513 A HUP9904513 A HU P9904513A HU 226148 B1 HU226148 B1 HU 226148B1
- Authority
- HU
- Hungary
- Prior art keywords
- hydroxy
- acid
- nitrilase
- prpa
- ammonium salt
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 72
- 108010033272 Nitrilase Proteins 0.000 title claims description 68
- PICCHNWCTUUCAQ-UHFFFAOYSA-N 2-hydroxypentanethioic s-acid Chemical compound CCCC(O)C(O)=S PICCHNWCTUUCAQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims description 56
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 58
- 239000002253 acid Substances 0.000 claims description 49
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 45
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 41
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 40
- 239000012528 membrane Substances 0.000 claims description 40
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 claims description 35
- 150000003863 ammonium salts Chemical class 0.000 claims description 30
- 239000012620 biological material Substances 0.000 claims description 26
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 26
- 238000000909 electrodialysis Methods 0.000 claims description 23
- VWWOJJANXYSACS-UHFFFAOYSA-N 2-hydroxy-4-methylsulfanylbutanenitrile Chemical compound CSCCC(O)C#N VWWOJJANXYSACS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 19
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 19
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 19
- VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N Ammonium hydroxide Chemical compound [NH4+].[OH-] VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 18
- 239000000908 ammonium hydroxide Substances 0.000 claims description 18
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 claims description 13
- 244000005700 microbiome Species 0.000 claims description 13
- 239000002245 particle Substances 0.000 claims description 13
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims description 12
- 239000000047 product Substances 0.000 claims description 12
- 239000000499 gel Substances 0.000 claims description 11
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 claims description 11
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 claims description 11
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 11
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 9
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 9
- 239000007787 solid Substances 0.000 claims description 9
- 239000013043 chemical agent Substances 0.000 claims description 6
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 claims description 6
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 6
- 108010068370 Glutens Proteins 0.000 claims description 5
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims description 5
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 claims description 5
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 claims description 5
- 235000021312 gluten Nutrition 0.000 claims description 5
- 102000005431 Molecular Chaperones Human genes 0.000 claims description 4
- 108010006519 Molecular Chaperones Proteins 0.000 claims description 4
- 229920002873 Polyethylenimine Polymers 0.000 claims description 4
- 241000187747 Streptomyces Species 0.000 claims description 4
- 239000012467 final product Substances 0.000 claims description 4
- 230000003100 immobilizing effect Effects 0.000 claims description 4
- 239000012948 isocyanate Substances 0.000 claims description 4
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 claims description 4
- 241000588986 Alcaligenes Species 0.000 claims description 3
- 239000005909 Kieselgur Substances 0.000 claims description 3
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N activated carbon Substances [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 229920001525 carrageenan Polymers 0.000 claims description 3
- 239000000679 carrageenan Substances 0.000 claims description 3
- 229940113118 carrageenan Drugs 0.000 claims description 3
- 239000003456 ion exchange resin Substances 0.000 claims description 3
- 229920003303 ion-exchange polymer Polymers 0.000 claims description 3
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 claims description 3
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 claims description 3
- 241000228212 Aspergillus Species 0.000 claims description 2
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 claims description 2
- 241000186216 Corynebacterium Species 0.000 claims description 2
- 241000235649 Kluyveromyces Species 0.000 claims description 2
- 241000228143 Penicillium Species 0.000 claims description 2
- 239000004952 Polyamide Substances 0.000 claims description 2
- 241000235070 Saccharomyces Species 0.000 claims description 2
- 229940072056 alginate Drugs 0.000 claims description 2
- 229920000615 alginic acid Polymers 0.000 claims description 2
- 235000010443 alginic acid Nutrition 0.000 claims description 2
- 150000001735 carboxylic acids Chemical class 0.000 claims description 2
- 230000007071 enzymatic hydrolysis Effects 0.000 claims description 2
- 238000006047 enzymatic hydrolysis reaction Methods 0.000 claims description 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 claims description 2
- 229920002647 polyamide Polymers 0.000 claims description 2
- 239000010457 zeolite Substances 0.000 claims description 2
- 108010093096 Immobilized Enzymes Proteins 0.000 claims 1
- 230000005592 electrolytic dissociation Effects 0.000 claims 1
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 22
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 20
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 20
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 18
- 241000588813 Alcaligenes faecalis Species 0.000 description 15
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 14
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 13
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 13
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 13
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 12
- 101100306202 Escherichia coli (strain K12) rpoB gene Proteins 0.000 description 11
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 11
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 11
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 10
- 125000002091 cationic group Chemical group 0.000 description 10
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 10
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 10
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 10
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 10
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 9
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 9
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 9
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 9
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 125000000129 anionic group Chemical group 0.000 description 8
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 8
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 8
- -1 2-hydroxy-methylthio-hydroxybutyronitrile Chemical compound 0.000 description 7
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 7
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 7
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 7
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 6
- 241000589776 Pseudomonas putida Species 0.000 description 6
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 6
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 6
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 6
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 5
- 229940005347 alcaligenes faecalis Drugs 0.000 description 5
- XOLXLUGLZJFTDJ-UHFFFAOYSA-N azanium;2-hydroxypentanethioate Chemical compound [NH4+].CCCC(O)C([O-])=S XOLXLUGLZJFTDJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 238000005341 cation exchange Methods 0.000 description 5
- 239000000287 crude extract Substances 0.000 description 5
- 230000005684 electric field Effects 0.000 description 5
- 239000003792 electrolyte Substances 0.000 description 5
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 5
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 5
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 5
- NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N Ammonia chloride Chemical compound [NH4+].[Cl-] NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O Ammonium Chemical compound [NH4+] QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 4
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 4
- SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N Glutaraldehyde Chemical compound O=CCCCC=O SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- PXHVJJICTQNCMI-UHFFFAOYSA-N Nickel Chemical compound [Ni] PXHVJJICTQNCMI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 4
- OSGAYBCDTDRGGQ-UHFFFAOYSA-L calcium sulfate Chemical compound [Ca+2].[O-]S([O-])(=O)=O OSGAYBCDTDRGGQ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 4
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 4
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 4
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 4
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 4
- 238000001704 evaporation Methods 0.000 description 4
- 230000008020 evaporation Effects 0.000 description 4
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 4
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 4
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 4
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 4
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 4
- 239000000463 material Substances 0.000 description 4
- 150000002825 nitriles Chemical class 0.000 description 4
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 4
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 4
- 239000012074 organic phase Substances 0.000 description 4
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 4
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 4
- BASFCYQUMIYNBI-UHFFFAOYSA-N platinum Chemical compound [Pt] BASFCYQUMIYNBI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 4
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 4
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 4
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 description 4
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 description 4
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 4
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 description 4
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 3
- YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N Epihygromycin Natural products OC1C(O)C(C(=O)C)OC1OC(C(=C1)O)=CC=C1C=C(C)C(=O)NC1C(O)C(O)C2OCOC2C1O YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- NTIZESTWPVYFNL-UHFFFAOYSA-N Methyl isobutyl ketone Chemical compound CC(C)CC(C)=O NTIZESTWPVYFNL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 241000828254 Streptomyces lividans TK24 Species 0.000 description 3
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 3
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 description 3
- 239000003011 anion exchange membrane Substances 0.000 description 3
- JFDZBHWFFUWGJE-UHFFFAOYSA-N benzonitrile Chemical compound N#CC1=CC=CC=C1 JFDZBHWFFUWGJE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000011942 biocatalyst Substances 0.000 description 3
- 239000003054 catalyst Substances 0.000 description 3
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 3
- 230000004186 co-expression Effects 0.000 description 3
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 3
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 3
- 238000004821 distillation Methods 0.000 description 3
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 238000005265 energy consumption Methods 0.000 description 3
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 3
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 3
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 3
- LELOWRISYMNNSU-UHFFFAOYSA-N hydrogen cyanide Chemical compound N#C LELOWRISYMNNSU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 3
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 3
- 229910052500 inorganic mineral Inorganic materials 0.000 description 3
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 3
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 3
- 239000011707 mineral Substances 0.000 description 3
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 3
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 3
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 3
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 3
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 3
- 238000000527 sonication Methods 0.000 description 3
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 3
- 150000003573 thiols Chemical class 0.000 description 3
- SZNYYWIUQFZLLT-UHFFFAOYSA-N 2-methyl-1-(2-methylpropoxy)propane Chemical compound CC(C)COCC(C)C SZNYYWIUQFZLLT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- VTYYLEPIZMXCLO-UHFFFAOYSA-L Calcium carbonate Chemical compound [Ca+2].[O-]C([O-])=O VTYYLEPIZMXCLO-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 241000589518 Comamonas testosteroni Species 0.000 description 2
- ZAFNJMIOTHYJRJ-UHFFFAOYSA-N Diisopropyl ether Chemical compound CC(C)OC(C)C ZAFNJMIOTHYJRJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241001198387 Escherichia coli BL21(DE3) Species 0.000 description 2
- ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N Formamide Chemical compound NC=O ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 2
- UIHCLUNTQKBZGK-UHFFFAOYSA-N Methyl isobutyl ketone Natural products CCC(C)C(C)=O UIHCLUNTQKBZGK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004698 Polyethylene Substances 0.000 description 2
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 2
- 241000187398 Streptomyces lividans Species 0.000 description 2
- PPBRXRYQALVLMV-UHFFFAOYSA-N Styrene Chemical compound C=CC1=CC=CC=C1 PPBRXRYQALVLMV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 2
- WYURNTSHIVDZCO-UHFFFAOYSA-N Tetrahydrofuran Chemical compound C1CCOC1 WYURNTSHIVDZCO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- RTAQQCXQSZGOHL-UHFFFAOYSA-N Titanium Chemical compound [Ti] RTAQQCXQSZGOHL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- WNLRTRBMVRJNCN-UHFFFAOYSA-N adipic acid Chemical compound OC(=O)CCCCC(O)=O WNLRTRBMVRJNCN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 2
- 150000001408 amides Chemical class 0.000 description 2
- 235000019270 ammonium chloride Nutrition 0.000 description 2
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 2
- 238000005349 anion exchange Methods 0.000 description 2
- 239000008346 aqueous phase Substances 0.000 description 2
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 2
- 125000006297 carbonyl amino group Chemical group [H]N([*:2])C([*:1])=O 0.000 description 2
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 2
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 2
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 description 2
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 2
- 238000013461 design Methods 0.000 description 2
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 2
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 2
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 2
- 239000008151 electrolyte solution Substances 0.000 description 2
- 238000001125 extrusion Methods 0.000 description 2
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 2
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 2
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 2
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 2
- 239000010439 graphite Substances 0.000 description 2
- 229910002804 graphite Inorganic materials 0.000 description 2
- NAQMVNRVTILPCV-UHFFFAOYSA-N hexane-1,6-diamine Chemical compound NCCCCCCN NAQMVNRVTILPCV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000000265 homogenisation Methods 0.000 description 2
- 230000003301 hydrolyzing effect Effects 0.000 description 2
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 2
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 2
- 150000002576 ketones Chemical class 0.000 description 2
- 239000004816 latex Substances 0.000 description 2
- 229920000126 latex Polymers 0.000 description 2
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 2
- XTAZYLNFDRKIHJ-UHFFFAOYSA-N n,n-dioctyloctan-1-amine Chemical compound CCCCCCCCN(CCCCCCCC)CCCCCCCC XTAZYLNFDRKIHJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229910052759 nickel Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 2
- 229910052698 phosphorus Inorganic materials 0.000 description 2
- 229910052697 platinum Inorganic materials 0.000 description 2
- 229920000573 polyethylene Polymers 0.000 description 2
- 229910052700 potassium Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000004313 potentiometry Methods 0.000 description 2
- 125000001453 quaternary ammonium group Chemical group 0.000 description 2
- 239000012429 reaction media Substances 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 229910001220 stainless steel Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000010935 stainless steel Substances 0.000 description 2
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 2
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 2
- 125000001273 sulfonato group Chemical group [O-]S(*)(=O)=O 0.000 description 2
- 239000010936 titanium Substances 0.000 description 2
- 229910052719 titanium Inorganic materials 0.000 description 2
- LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K tripotassium phosphate Chemical compound [K+].[K+].[K+].[O-]P([O-])([O-])=O LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 239000001974 tryptic soy broth Substances 0.000 description 2
- 239000011345 viscous material Substances 0.000 description 2
- CHRJZRDFSQHIFI-UHFFFAOYSA-N 1,2-bis(ethenyl)benzene;styrene Chemical compound C=CC1=CC=CC=C1.C=CC1=CC=CC=C1C=C CHRJZRDFSQHIFI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100024341 10 kDa heat shock protein, mitochondrial Human genes 0.000 description 1
- WIIZWVCIJKGZOK-IUCAKERBSA-N 2,2-dichloro-n-[(1s,2s)-1,3-dihydroxy-1-(4-nitrophenyl)propan-2-yl]acetamide Chemical compound ClC(Cl)C(=O)N[C@@H](CO)[C@@H](O)C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 WIIZWVCIJKGZOK-IUCAKERBSA-N 0.000 description 1
- BINDPFUXHYGSSV-UHFFFAOYSA-N 2-(hydroxymethyl)butanethioic s-acid Chemical compound CCC(CO)C(S)=O BINDPFUXHYGSSV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WECIKJKLCDCIMY-UHFFFAOYSA-N 2-chloro-n-(2-cyanoethyl)acetamide Chemical compound ClCC(=O)NCCC#N WECIKJKLCDCIMY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WBMXYUCOFYSLOS-UHFFFAOYSA-N 2-hydroxy-2-methylsulfanylpropanenitrile Chemical compound CSC(C)(O)C#N WBMXYUCOFYSLOS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZJAKITOEQQTZLI-UHFFFAOYSA-N 2-methylsulfanylbutanenitrile Chemical compound CCC(SC)C#N ZJAKITOEQQTZLI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FHVDTGUDJYJELY-UHFFFAOYSA-N 6-{[2-carboxy-4,5-dihydroxy-6-(phosphanyloxy)oxan-3-yl]oxy}-4,5-dihydroxy-3-phosphanyloxane-2-carboxylic acid Chemical compound O1C(C(O)=O)C(P)C(O)C(O)C1OC1C(C(O)=O)OC(OP)C(O)C1O FHVDTGUDJYJELY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 1
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 1
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 1
- BTBUEUYNUDRHOZ-UHFFFAOYSA-N Borate Chemical compound [O-]B([O-])[O-] BTBUEUYNUDRHOZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LZZYPRNAOMGNLH-UHFFFAOYSA-M Cetrimonium bromide Chemical compound [Br-].CCCCCCCCCCCCCCCC[N+](C)(C)C LZZYPRNAOMGNLH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 108010059013 Chaperonin 10 Proteins 0.000 description 1
- 108010058432 Chaperonin 60 Proteins 0.000 description 1
- 229920001661 Chitosan Polymers 0.000 description 1
- 241000589519 Comamonas Species 0.000 description 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- 108010067770 Endopeptidase K Proteins 0.000 description 1
- 241000701867 Enterobacteria phage T7 Species 0.000 description 1
- 244000024675 Eruca sativa Species 0.000 description 1
- 235000014755 Eruca sativa Nutrition 0.000 description 1
- 102100039111 FAD-linked sulfhydryl oxidase ALR Human genes 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- 108700007698 Genetic Terminator Regions Proteins 0.000 description 1
- 241000203751 Gordonia <actinomycete> Species 0.000 description 1
- 241000203747 Gordonia terrae Species 0.000 description 1
- 101000959079 Homo sapiens FAD-linked sulfhydryl oxidase ALR Proteins 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 108010086093 Mung Bean Nuclease Proteins 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- ABLZXFCXXLZCGV-UHFFFAOYSA-N Phosphorous acid Chemical compound OP(O)=O ABLZXFCXXLZCGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091000080 Phosphotransferase Proteins 0.000 description 1
- 241000589516 Pseudomonas Species 0.000 description 1
- 241000316848 Rhodococcus <scale insect> Species 0.000 description 1
- 241000187562 Rhodococcus sp. Species 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 229910018143 SeO3 Inorganic materials 0.000 description 1
- PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L Sodium Sulfate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]S([O-])(=O)=O PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 1
- 241000187391 Streptomyces hygroscopicus Species 0.000 description 1
- NSFFHOGKXHRQEW-UHFFFAOYSA-N Thiostrepton B Natural products N1C(=O)C(C)NC(=O)C(=C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(C(C)CC)NC(C(C2=N3)O)C=CC2=C(C(C)O)C=C3C(=O)OC(C)C(C=2SC=C(N=2)C2N=3)NC(=O)C(N=4)=CSC=4C(C(C)(O)C(C)O)NC(=O)C(N=4)CSC=4C(=CC)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C(N=4)=CSC=4C21CCC=3C1=NC(C(=O)NC(=C)C(=O)NC(=C)C(N)=O)=CS1 NSFFHOGKXHRQEW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000209140 Triticum Species 0.000 description 1
- 235000021307 Triticum Nutrition 0.000 description 1
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 239000001361 adipic acid Substances 0.000 description 1
- 235000011037 adipic acid Nutrition 0.000 description 1
- 230000032683 aging Effects 0.000 description 1
- 150000001298 alcohols Chemical class 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000001491 aromatic compounds Chemical class 0.000 description 1
- 125000001870 arsonato group Chemical group O=[As]([O-])([O-])[*] 0.000 description 1
- ZFSFDELZPURLKD-UHFFFAOYSA-N azanium;hydroxide;hydrate Chemical compound N.O.O ZFSFDELZPURLKD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 230000001588 bifunctional effect Effects 0.000 description 1
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 1
- MTAZNLWOLGHBHU-UHFFFAOYSA-N butadiene-styrene rubber Chemical compound C=CC=C.C=CC1=CC=CC=C1 MTAZNLWOLGHBHU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 1
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910000019 calcium carbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- AXCZMVOFGPJBDE-UHFFFAOYSA-L calcium dihydroxide Chemical compound [OH-].[OH-].[Ca+2] AXCZMVOFGPJBDE-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000000920 calcium hydroxide Substances 0.000 description 1
- 229910001861 calcium hydroxide Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000007942 carboxylates Chemical group 0.000 description 1
- 210000004534 cecum Anatomy 0.000 description 1
- JQXXHWHPUNPDRT-YOPQJBRCSA-N chembl1332716 Chemical compound O([C@](C1=O)(C)O\C=C/[C@@H]([C@H]([C@@H](OC(C)=O)[C@H](C)[C@H](O)[C@H](C)[C@@H](O)[C@@H](C)/C=C\C=C(C)/C(=O)NC=2C(O)=C3C(O)=C4C)C)OC)C4=C1C3=C(O)C=2\C=N\N1CCN(C)CC1 JQXXHWHPUNPDRT-YOPQJBRCSA-N 0.000 description 1
- 238000001311 chemical methods and process Methods 0.000 description 1
- 239000003638 chemical reducing agent Substances 0.000 description 1
- WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N chloramphenicol Chemical compound ClC(Cl)C(=O)N[C@H](CO)[C@H](O)C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N 0.000 description 1
- 229960005091 chloramphenicol Drugs 0.000 description 1
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 1
- 239000003245 coal Substances 0.000 description 1
- 101150087945 cobA gene Proteins 0.000 description 1
- 239000003431 cross linking reagent Substances 0.000 description 1
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 1
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 238000009792 diffusion process Methods 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 125000002084 dioxo-lambda(5)-bromanyloxy group Chemical group *OBr(=O)=O 0.000 description 1
- POLCUAVZOMRGSN-UHFFFAOYSA-N dipropyl ether Chemical compound CCCOCCC POLCUAVZOMRGSN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 230000006862 enzymatic digestion Effects 0.000 description 1
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 1
- 150000002170 ethers Chemical class 0.000 description 1
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 1
- 239000004744 fabric Substances 0.000 description 1
- 239000012065 filter cake Substances 0.000 description 1
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 1
- 238000007306 functionalization reaction Methods 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 239000006481 glucose medium Substances 0.000 description 1
- 125000000879 imine group Chemical group 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 239000002440 industrial waste Substances 0.000 description 1
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 1
- 239000002198 insoluble material Substances 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- JMMWKPVZQRWMSS-UHFFFAOYSA-N isopropanol acetate Natural products CC(C)OC(C)=O JMMWKPVZQRWMSS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940011051 isopropyl acetate Drugs 0.000 description 1
- GWYFCOCPABKNJV-UHFFFAOYSA-N isovaleric acid Chemical compound CC(C)CC(O)=O GWYFCOCPABKNJV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000005647 linker group Chemical group 0.000 description 1
- 238000000622 liquid--liquid extraction Methods 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- MHWLWQUZZRMNGJ-UHFFFAOYSA-N nalidixic acid Chemical compound C1=C(C)N=C2N(CC)C=C(C(O)=O)C(=O)C2=C1 MHWLWQUZZRMNGJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960000210 nalidixic acid Drugs 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 1
- 125000002560 nitrile group Chemical group 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000002205 phenol-chloroform extraction Methods 0.000 description 1
- 125000005496 phosphonium group Chemical group 0.000 description 1
- 102000020233 phosphotransferase Human genes 0.000 description 1
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 1
- 229920002239 polyacrylonitrile Polymers 0.000 description 1
- 229920000728 polyester Polymers 0.000 description 1
- 229920001343 polytetrafluoroethylene Polymers 0.000 description 1
- 239000004810 polytetrafluoroethylene Substances 0.000 description 1
- 229920000915 polyvinyl chloride Polymers 0.000 description 1
- 239000004800 polyvinyl chloride Substances 0.000 description 1
- 229910000160 potassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011009 potassium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 239000010970 precious metal Substances 0.000 description 1
- 230000003449 preventive effect Effects 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 238000004064 recycling Methods 0.000 description 1
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 1
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 description 1
- 229960001225 rifampicin Drugs 0.000 description 1
- 101150078341 rop gene Proteins 0.000 description 1
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 1
- 238000011451 sequencing strategy Methods 0.000 description 1
- 239000000741 silica gel Substances 0.000 description 1
- 229910002027 silica gel Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000000377 silicon dioxide Substances 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910052938 sodium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011152 sodium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 238000007614 solvation Methods 0.000 description 1
- 238000000638 solvent extraction Methods 0.000 description 1
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 1
- 238000005507 spraying Methods 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- RWSOTUBLDIXVET-UHFFFAOYSA-O sulfonium group Chemical group [SH3+] RWSOTUBLDIXVET-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 1
- 229910052717 sulfur Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000003467 sulfuric acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- 150000003512 tertiary amines Chemical class 0.000 description 1
- UBCKGWBNUIFUST-YHYXMXQVSA-N tetrachlorvinphos Chemical compound COP(=O)(OC)O\C(=C/Cl)C1=CC(Cl)=C(Cl)C=C1Cl UBCKGWBNUIFUST-YHYXMXQVSA-N 0.000 description 1
- NSFFHOGKXHRQEW-AIHSUZKVSA-N thiostrepton Chemical compound C([C@]12C=3SC=C(N=3)C(=O)N[C@H](C(=O)NC(/C=3SC[C@@H](N=3)C(=O)N[C@H](C=3SC=C(N=3)C(=O)N[C@H](C=3SC=C(N=3)[C@H]1N=1)[C@@H](C)OC(=O)C3=CC(=C4C=C[C@H]([C@@H](C4=N3)O)N[C@H](C(N[C@@H](C)C(=O)NC(=C)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N2)=O)[C@@H](C)CC)[C@H](C)O)[C@](C)(O)[C@@H](C)O)=C\C)[C@@H](C)O)CC=1C1=NC(C(=O)NC(=C)C(=O)NC(=C)C(N)=O)=CS1 NSFFHOGKXHRQEW-AIHSUZKVSA-N 0.000 description 1
- 229930188070 thiostrepton Natural products 0.000 description 1
- 229940063214 thiostrepton Drugs 0.000 description 1
- NSFFHOGKXHRQEW-OFMUQYBVSA-N thiostrepton A Natural products CC[C@H](C)[C@@H]1N[C@@H]2C=Cc3c(cc(nc3[C@H]2O)C(=O)O[C@H](C)[C@@H]4NC(=O)c5csc(n5)[C@@H](NC(=O)[C@H]6CSC(=N6)C(=CC)NC(=O)[C@@H](NC(=O)c7csc(n7)[C@]8(CCC(=N[C@@H]8c9csc4n9)c%10nc(cs%10)C(=O)NC(=C)C(=O)NC(=C)C(=O)N)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)C(=C)NC(=O)[C@H](C)NC1=O)[C@@H](C)O)[C@](C)(O)[C@@H](C)O)[C@H](C)O NSFFHOGKXHRQEW-OFMUQYBVSA-N 0.000 description 1
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 1
- 108010050327 trypticase-soy broth Proteins 0.000 description 1
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P11/00—Preparation of sulfur-containing organic compounds
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N11/00—Carrier-bound or immobilised enzymes; Carrier-bound or immobilised microbial cells; Preparation thereof
- C12N11/02—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier
- C12N11/08—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier the carrier being a synthetic polymer
- C12N11/089—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier the carrier being a synthetic polymer obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N11/00—Carrier-bound or immobilised enzymes; Carrier-bound or immobilised microbial cells; Preparation thereof
- C12N11/02—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier
- C12N11/08—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier the carrier being a synthetic polymer
- C12N11/089—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier the carrier being a synthetic polymer obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds
- C12N11/096—Polyesters; Polyamides
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/78—Hydrolases (3) acting on carbon to nitrogen bonds other than peptide bonds (3.5)
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Bakery Products And Manufacturing Methods Therefor (AREA)
- Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)
- Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)
Description
A találmány tárgya új eljárás 2-hidroxi-4-metil-tiovajsav (HMTBA) és/vagy ammóniumsója (HMTBS) előállítására.
A 2-hidroxi-4-metil-tio-vajsavat és sóit régóta alkalmazzák az állattakarmányozásban metloninhelyettesítőként. A metioninnal szemben azzal az előnnyel rendelkezik, hogy folyadék, ami megkönnyíti alkalmazását a takarmánytermelő társaságok számára.
A 2-hidroxi-4-metil-tio-vajsav kémiai úton történő előállítása régóta ismert. Az EP 142 488 és EP 143 000 számú szabadalmi iratokat említhetjük meg, melyek a 2-hidroxM-metil-tio-hidroxi-butironitril (HMTBN) hidrolízisét írják le egy kétlépéses eljárással. Az első lépés során a 2-hidroxl-4-metil-tio-butironitrilt egy erős ásványi savval érintkeztetik, amilyen például a sósav vagy a kénsav. Egy későbbi lépésben, vizes oldás után, a hidrolízist megemelt hőmérsékleten teszik teljessé. A 2-hidroxi-4-metil-tio-vajsavat azután egy vízzel kevéssé elegyedő szerves oldószerrel, például egy ketonnal, előnyösen a metil-izobutil-ketonnal extrahálják, majd az oldószert bepárlással távolítják el. Ez az Ipari méretekben alkalmazott eljárás mégis rendelkezik néhány hátránnyal. Legalább a reakcióba bevitt nitril moláris mennyiségével azonos moláris mennyiségű ammónium-szulfátot termel, melyet el kell távolítani, így olyan ipari hulladék keletkezik, ami ellentétes a környezetvédelmi politikával. Az eljárás jelentős mennyiségű oldószer alkalmazását teszi szükségessé, amelyet azután újra fel kell dolgozni.
Más eljárások, mint az US 3 773 927 és az US 4 353 924 számú szabadalmi iratokban leírtak abból állnak, hogy a 2-hídroxí-4-metil-tio-butironitrilt sósavval hidrolizálják, majd a közeget a kialakult ammónium-klorid elválasztásával koncentrálják. A kapott sót ugyanolyan nehéz eltávolítani, mint az előző sót, és ezenfelül a kapott sav erősen elszíneződött.
Az EP 330 521 számú szabadalmi iratban leírnak egy eljárást a metil-tio-hidroxi-propionitril hidrolízisére, amely abból áll, hogy mint előzőleg, kénsavas közegben végeznek hidrolízist. Az elegyet részlegesen semlegesítik ammónium-hidroxiddal. Két elkülönült fázis jön létre. A szerves fázis tartalmazza a 2-hidroxi-4-metil-tio-vajsav többségét, a vizes fázis a termelt ammónium-szulfát többségét. A szerves oldatot a benne lévő víz lepárlása után úgy szűrik, hogy az oldott ammónium-szulfátot visszanyerik. Ezután a 2-hidroxi-4-metiltio-vajsavat egy kevés vízben oldják, és egy kevés kénsavval stabilizálják. A vizes oldat a víz eltávolítása után lehetővé teszi, hogy közvetlenül kereskedelmi forgalomba hozható ammónium-szulfátot kapjunk. Az eljárás részben megoldja a szakirodalomban leírt eljárások hátrányait, ami a szerves oldószer használatát illeti, de nem oldja meg egyáltalán az ásványi sók kidobásával kapcsolatos problémákat.
A 2-hidroxi-4-metil-tio-vajsav sóira vonatkozó szabadalmak közül az US 2 745 745, 2 938 053, és a 3 175 000 számú szabadalmi iratokat említhetjük meg, melyek kalcium- és/vagy ammóniumsókra vonatkoznak. A 2-hidroxi-4-metil-tio-butironitril hidrolízisével kapott elegyet kalcium-hidroxiddal vagy kalcium-karbonáttal kezelik. A kalcium-szulfát kicsapódik, felszabadítva az ammónium-hidroxidot, amely a 2-hidroxi-4metil-tio-vajsav ammóniumsóját hozza létre. Itt is találkozunk azzal a problémával, hogy el kell távolítani a fennmaradó kalcium-szulfátot.
A WO 96/01808 számon közzétett szabadalmi bejelentésben is leírtak egy eljárást, amely abból áll, hogy végeznek egy hidrolízist és egy extrakciót egy szerves oldószerrel, amint az elsőként említett, a technika állásához tartozó dokumentumban, majd a szerves oldatot semlegesítik ammónium-hidroxiddal. Ez az eljárás, amint a korábban leírt eljárások többsége, legalább egy mól ammónium-szulfát vagy ammónium-klorid kialakulásához vezet a reakcióba vitt nitril mólónként, és jelentős mennyiségű szerves oldószer újrafeldolgozását követeli meg. Nem teszi lehetővé, hogy a 2-hidroxi4-metil-tio-vajsav ammóniumsóját iparilag előnyös költségekkel kapjuk meg.
A WO 96/09403 számú iratban másrészt leírták egy nitriláz alkalmazását nitrilcsoport karboxilcsoporttá történő hidrolízisének katalizátoraként. Az ebben az iratban ismertetett eljárás mégsem alkalmas ipari méretekben, számításba véve a nitrilázokat szintetizáló mikroorganizmusok elégtelen aktivitását.
A találmány szerinti eljárásnak köszönhetően felfedeztük, hogy több specifikus lépést alkalmazva a 2-hidroxi-4-metil-tio-vajsavat és/vagy ammóniumsóját megkaphatjuk enzimatikus úton ipari méretekben, magas hozammal, oldószer alkalmazása és szennyező ásványi sók termelődése nélkül.
A találmány tárgya eljárás 2-hidroxi-4-metil-tiovajsav és/vagy a 2-hidroxi-4-metil-tio-vajsav ammóniumsója előállítására a 2-hidroxi-4-metil-tio-butironitril enzimatikus hidrolízisével, azzal jellemezve, hogy:
a) egy első lépésben előállítunk egy nitrilázaktivitással rendelkező biológiai anyagot,
b) egy második lépésben ezt immobilizáljuk,
c) egy harmadik lépésben a 2-hidroxi-4-metil-tiobutironitrilt érintkeztetjük az így immobilizált biológiai anyaggal, hogy megkapjuk a 2-hidroxí-4-metil-tiovajsav ammóniumsóját,
d) egy negyedik lépésben adott esetben a c) lépésben kapott sót átalakítjuk a megfelelő savvá, és
e) egy ötödik lépésben a c) vagy a d) lépésben kapott terméket koncentráljuk.
A találmányt részletesen ismertetjük a következő leírásban, amelyben hivatkozunk a mellékelt ábrákra, melyeken:
az 1. ábra a fakultatív d) lépéshez alkalmazott elektrodialízis cellasémáját mutatja be; az 1A. ábra egy háromkamrás bipoláris membránnal rendelkező elektrodialízis cellát mutat be; az 1B. ábra egy kétkamrás bipoláris membránnal rendelkező elektródjai íziscellát mutat be;
a 2. ábra egy a találmány szerinti eljárás megvalósítására szolgáló berendezés sémáját mutatja be;
a 3. ábra a pRPA-BCAT1-5 plazmidok restrikciós térképét mutatja be;
HU 226 148 Β1 a 4. ábra a találmány szerinti nitrilázaktivitással rendelkező polipeptidet kódoló (az ábrán nitB-nek nevezett) DNS-szekvenciáját tartalmazó 1130 bp fragmentum szekvenálásának stratégiáját mutatja be. A számok, valamint az M13FWD és M13REV jelölések a szekvenáláshoz alkalmazott primerek azonosítására szolgálnak.
az 5. ábra a pRPA-BCAT12 és a pRPA-BCAT13 plazmidok restrikciós térképét mutatja be;
a 6. ábra a 10%-os SDS-PGE gélen végzett elektroforézist mutatja be, ami a találmány szerinti DNS-szekvenciák expresszióját mutatja E. coli BL21(DE3)/pRPABCAT12, BL21(DE3)/pRPA-BCAT13, BL21(DE3)/pRPA-BCAT12+pXL2231, BL21(DE3)/pRPA-BCAT13+pXL2231 törzsekben. Minden sáv 10 pg oldható fehérje mennyiségnek, és az oldhatatlan nyers frakció ennek megfelelő térfogatának felel meg;
a 7. ábra a 10%-os SDS-PGE gélen végzett elektroforézist mutatja be, ami a találmány szerinti DNS-szekvenciák expresszióját mutatja E. coli DH5a/pRPA-BCAT3, DH5a/pRPA-BCAT6, DH5a/pRPABCAT6+pXL2035, RPA-BIOCAT76 törzsekben. Minden sáv 10 pg oldható fehérje mennyiségnek, és az oldhatatlan nyers frakció ennek megfelelő térfogatának felel meg;
a 8. ábra a pRPA-BCAT14 plazmid restrikciós térképét mutatja be;
a 9. ábra a 10%-os SDS-PGE gélen végzett elektroforézist mutatja be, ami a találmány szerinti DNS-szekvenciák expresszióját mutatja P. putida G2081 (pRPABCAT14), G2081 (pRPA-BCAT23), G2081 (pRPA-BCAT24), A. faecalis ATCC8750 (pRPA-BCAT14), A. faecalis ATCC8750 (pRPA-BCAT23), A. faecalis ATCC8750 (pRPA-BCAT24) törzsekben. Minden sáv 10 pg oldható fehérje mennyiségnek, és az oldhatatlan nyers frakció ennek megfelelő térfogatának felel meg;
a 10. ábra a pCGL1087 plazmid restrikciós térképét mutatja be;
a 11. ábra a pOS48.7 plazmid restrikciós térképét mutatja be.
Az első lépés abból áll, hogy előállítjuk a nitrilázaktivitással rendelkező biológiai anyagot.
A biológiai anyag állhat egy enzimoldatból önmagában, vagy nitrilázaktivitással rendelkező egész, vagy roncsolt sejtekből.
Előnyösen egy nitrilázt kifejező mikroorganizmust alkalmazunk.
A nitriláz származhat többek között egy mikroorganizmusból, részletesen az Alcaligenes, Rhodococcus, vagy Gordona nemzetség mikroorganizmusaiból, amilyenek például az Alcaligenes faecalis, a Rhodococcus sp. HT 29-7, a Gordona terrae, előnyösen a
WO 96/09403 számon közzétett bejelentésben leírt törzsekből.
Előnyösen egy olyan mikroorganizmust alkalmazunk, amely a gazda-mikroorganizmussal rokon mikroorganizmus nitrilázát kódoló genetikai információ átvitelével kapott nitrilázaktivitást fejez ki. Részletesen E. colinál a Gro ESL chaperon fehérjéinek együttes expresszióját alkalmazhatjuk a rekombináns törzs képességeinek javítására.
Ehhez bármely megfelelő expressziós vektort alkalmazhatunk, többek között egy plazmidvektort.
Az ebben az esetben alkalmazott nukleotidszekvenciát tehát egy gazdasejtben annak expresszióját lehetővé tevő jelek szabályozása alá helyezzük. Az alkalmazott gazdasejtet a prokarióta rendszerek, például a Gram-pozitív vagy a Gram-negatív baktériumok, az eukarióta rendszerek, például az élesztők, gombák, vagy bármely másik rendszer közül választhatjuk. A polipeptidek expresszióját szabályozó jeleket az alkalmazott gazdasejt függvényében választhatjuk meg. Ehhez a nitrilázt kódoló DNS-t a választott gazdasejtben autonóm replikálódó vektorokba, vagy a választott gazdasejtben integratív vektorokba építhetjük be. Ilyen vektorokat a szakemberek által jelenleg alkalmazott eljárások szerint állíthatunk elő, és a keletkezett konstrukciókat a megfelelő gazdasejtbe standardeljárásokkal, például elektroporációval vezethetjük be.
Gazda-mikroorganizmusként különösen az Alcaligenes faecalist, a Pseudomonas pufidat, az Escherichia colit, vagy a Bacillus, Corynebacterium, Streptomyces, Saccharomyces, Kluyveromyces, Penicillium és Aspergillus nemzetségekbe tartozó mikroorganizmusokat említhetjük meg.
Az E. coliban történő expresszió esetében egy előnyös vektor a pRPA-BCAT6.
Az eljárás második lépése abból áll, hogy a biológiai anyagot immobilizáljuk. Az immobilizációt előnyösen egy szilárd hordozó jelenlétében végezzük, ami lehetővé teszi, hogy olyan szilárd részecskéket kapjunk, melyek mérete, formája és mechanikai ellenálló képessége szabályozható. Azt is lehetővé teszi, hogy egy időben alkalmazzuk a poliazetidin polimert és más térhálósító anyagokat.
Az immobilizációs eljárásban részt vehetnek az ép sejtek, vagy permeábilissá tett sejtek. Az eljárás alkalmazható egy sejtmentes enzimoldat esetében is.
Az immobilizáció esetében alkalmazott enzimek a nitrilázok.
Az immobilizációs eljárás abból áll, hogy az aktív biológiai anyagot például 1 pm és 3 mm közötti, előnyösen 10 pm és 2 mm közötti szemcseméretű szilárd hordozón immobilizáljuk, a biológiai anyag és a hordozó amin- (NH2, NH), karboxil- (COOH), hidroxil- (OH), tiol- (SH) vagy amid- (CONH2) csoportjaival reagáló kémiai szerek segítségével. A kémiai szerek lehetővé teszik azt is, hogy a biológiai anyag és a hordozó vízben oldhatatlanná váljon. A kapott anyag könnyen
HU 226 148 Β1 nyújtható és formálható, és a kívánt alakú és méretű részecskéket kaphatjuk belőle. A részecskék kohézióját és keménységét azután szárítással érjük el.
Az immobilizálandó biológiai anyag adott esetben tartalmazhat inaktív biológiai anyagot is, amely 0-200 tömeg% arányban van jelen. Ez az inaktív biológiai anyag lehet fehérje (albumin, zselatin), vagy poliszacharid (Chitosan, k-karragenan, alginát).
Az inért hordozó, amelyre a biológiai anyagot helyezzük, és a polimer szerves vagy szervetlen, porózus vagy nem porózus, hidrofil vagy hidrofób részecskékből állhat. A részecskék közül a következőket említhetjük meg anélkül, hogy ez korlátozó lenne:
- ioncserélő gyanták,
- alumínium-oxid,
- mesterséges kovasav vagy diatómaföld vagy szilikagél,
- zeolitok,
- szén,
- vízben oldhatatlan fehérjék, például a glutén,
- poliszacharidok, például az amidőn.
Az inért hordozót a biológiai anyaghoz 0,01-500 tömeg0/), előnyösen 10-200 tömeg% arányban adhatjuk hozzá.
A biológiai anyag oldhatatlanná tételére alkalmazott kémiai anyagok lehetnek polimerek vagy kétfunkciós csoporttal ellátott molekulák, melyek az amin- (NH2 NH), karboxil- (COOH), hidroxil- (OH), tiol- (SH), amid(CONH2) csoportokkal reagálnak. A következőket említhetjük meg:
- poliazetidin polimerek,
- poli(etilén-imin)-polimerek,
- poliamid polimerek,
- izocianát polimerek,
- aiginátgélek,
- k-karragenán-gélek,
- aminok, például a hexametilén-diamin,
- aldehidek, például a glutáraldehid,
- karboxilsavak, például az adipinsav, és
- izocianátok.
Az immobilizálási eljárásban egy vagy több ilyen kémiai anyag is részt vehet. A kémiai anyagot a biológiai anyaghoz és a hordozóhoz viszonyítva 1-50 tömeg0/) közötti koncentrációban adjuk hozzá. Előnyben részesítjük az 5-30 tömeg% közötti mennyiséget, hogy eléggé szilárd részecskéket kapjunk, melyek megőrzik lényeges aktivitásukat, és melyeknél nem jelentkezik túlzott mértékben a belső diffúziós probléma.
A térhálósítási kezelés időtartama 0,5-24 óra közötti.
Az eljárás hőmérséklete általában 4 és 65 °C közötti. A 20-40 °C közötti hőmérsékletet előnyben részesítjük. Az immobilizálási eljárás során alkalmazott hőmérséklet nagymértékben függhet az alkalmazott biológiai anyag stabilitásától.
A pH-t az immobilizálási fázis alatt 5 és 11 között tartjuk. A 6-10 közötti pH-t előnyben részesítjük, az alkalikus pH előnyben részesítésével. A választott pH függ a biológiai anyag ellenálló képességétől is, a megfelelő pH-t a szakember könnyen meghatározhatja.
A biokatalizátor formulázása lehetővé kell tegye bármilyen rendszerben, többek között egy fix ágyban történő alkalmazását.
A formulázási eljárás lehet extrúzió. Ehhez a biológiai anyagot és a hordozót egy vagy több kémiai anyag hozzáadásával térhálósítjuk. A kezelés után az oldhatatlan anyagot centrifugálással vagy kicsapás és szűrés után összegyűjtjük. Előnyös, ha legalább 10% a szárazanyag aránya. A masszát ezután extrudáljuk. Ezzel az eljárással előnyösen 0,3-0,5 mm közötti átmérőjű, 1-10 mm közötti hosszúságú szálacskákat kapunk. A szálacskákat gömb alakúvá alakíthatjuk. A kapott részecskéket azután szárítjuk.
Egy másik formulázási eljárás lehet a bevonás („spray coating”). Ehhez a biológiai anyagot egy vagy több kémiai anyaggal elegyítik. A reakció után az elegyet a vékony réteg formájában lévő hordozóra porlasztják. Ezzel az eljárással 0,1-2 mm közötti átlagos átmérőjű szemcséket kapunk.
A kapott részecskéket adott esetben ezután redukálószer, például nátrium-bór-hidrát oldatába meríthetjük a térhálósítás során létrejött imincsoportok redukálása céljából.
A kapott részecskék elegendően szilárdak és kopásállóak ahhoz, hogy egy fix ágyas, fluid ágyas vagy kevertetett reaktorban alkalmazzuk azokat.
A találmány szerinti eljárás harmadik lépése abból áll, hogy az immobilizált biológiai anyagot egy vagy több oszlopban vagy reaktorban felhasználjuk. Ennek a lépésnek az a célja, hogy folyamatosan tudjuk termelni 2-hidroxi-4-metil-tio-butironitrilből kiindulva a 2-hidroxi-4-metil-tio-vajsav ammóniumsóját.
Az oszlop(ok)at vagy a reaktor(ok)at 2-hidroxi-4metil-tio-butironitril tiszta vagy hígított oldatával vagy a 2-hidroxi-4-metil-tio-butironitrilt és a 2-hidroxi-4-metiltio-vajsav ammóniumsóját tartalmazó eleggyel tápláljuk.
Az oszlop(ok)at vagy a reaktor(ok)at előnyösen 10-60 °C közötti hőmérsékleten és 5-9 közötti pH-n használjuk fel.
A felhasznált rendszer két vagy több sorba kapcsolt oszlopból állhat. A találmány egyik megvalósítási módja szerint a 2-hidroxi-4-metil-tio-butironitril vizes oldatának betáplálását az első oszlop tetején végezzük, és ezzel egy időben a többi oszlopra a vegyületnek a reakcióelegyben való oldhatósága által korlátozott mennyiségben tápláljuk a 2-hidroxi-4-metil-tio-butironitrilt; ezt a rendszert emeletes rendszernek nevezzük. A találmány egy másik megvalósítási módja szerint egy vagy több, cirkulációs hurokban párhuzamosan kapcsolt oszlopot használunk. Ebben a felépítésben a 2-hidroxi-4-metil-tio-butironitril vizes oldatát folyamatosan tápláljuk be a hurokba, és a reakcióközeget folyamatosan pumpáljuk olyan módon, hogy a hurokban állandó térfogatot őrizzen meg; ezt a rendszert hurokrendszernek nevezzük.
A találmányban alkalmazott reaktor típusa lehet fix ágyas, fluid ágyas vagy folyamatos kevertetett reaktor. A fix ágyas reaktorokat előnyben részesítjük, mivel lecsökkentik a kopási problémákat, melyekkel az immo4
HU 226 148 Β1 bilizált sejteket tartalmazó részecskék esetében találkozhatunk. Ha a mikroorganizmust önmagában alkalmazzuk, a kevertetett, egy ultraszűrő modulhoz kapcsolt reaktort részesítjük előnyben, amellyel a kívánt terméket folyamatosan el tudjuk választani a mikroorganizmustól.
A negyedik lépés, amely fakultatív lépés, abból áll, hogy a 2-hidroxi-4-metil-tio-vajsav ammóniumsóját átalakítjuk a megfelelő savvá. Ez a lépés két módszer szerint valósítható meg:
- vagy egy két- vagy háromkamrás elektrodializátorral végzett elektrodialízissel,
- vagy a vizes oldat melegítésével, melyet egy folyadék/folyadék extrakció követhet.
Az elektródjaiízises módszer szerint egy két- vagy háromkamrás elektrodializátort alkalmazunk.
„Kamrán” értjük vagy a két membrán közötti teret, vagy egy bipoláris és egy homopoláris membrán közötti teret, vagy két szomszédos homopoláris membrán közötti teret. „Cellán” értjük a két vagy három kamra összességét. Egy sorozat 5-300 cellát tartalmaz. Az elektrodializátort egy sorozat alkotja, és természetesen egy anódot és egy katódot tartalmaz.
A találmány keretei között alkalmazható homopoláris membránokat két nagy családba oszthatjuk, előállításuk módja szerint.
fgy alkalmazhatunk heterogén membránokat, melyeket ioncserélő gyantákból állítottunk elő, egy kapcsolóval elegyítve, amilyen például a poli(vinil-klorid), a polietilén vagy mások. Az így kialakított együttes egy szövedéket hozhat létre, amilyen például egy poliészter vagy poli(akril-nitril) szövet.
Alkalmazhatunk homogén membránokat is, melyeket egy funkciós csoportnak egy inért hordozóra való felvitelével kaptunk meg, kémiai vagy sugárkémiai oltással. A gyakrabban alkalmazott kémiai eljárás általában abból áll, hogy egy aromás magokat tartalmazó polimer latexet, amilyen például a sztirol/divinil-benzol vagy a sztirol/butadién, funkciós csoportokkal látunk el. Az így funkciós csoportokkal ellátott latex azután arra szolgálhat, hogy egy szövedéket hozzon létre, mint a heterogén membránok esetében. A sugárkémiai módszer általában egy aromás vegyület, mint például a sztirol, egy inért hordozón, például egy polietilén vagy poli(tetrafluor-etilén) rétegen sugárzás hatására történő oltását foglalja magában. Az aromás magot azután funkciós csoporttal látjuk el, mint a kémiai módszerben.
A kationcserélő membránok erős savas csoportokat tartalmaznak, a leggyakrabban szulfonátcsoportokat, vagy gyenge savas csoportokat, gyakran karboxilátcsoportokat. Ritkábban a savas csoportok lehetnek PO3 2-, HPO2~, AsO32_, SeO3~ csoportok is.
Az anioncserélő membránok erős bázisos csoportokat, leggyakrabban kvaterner ammóniumcsoportokat, gyenge bázikus csoportokat, leggyakrabban aminokat tartalmaznak. Ritkábban a bázikus csoportok lehetnek kvaterner foszfóniumcsoportok, vagy szulfóniumcsoportok.
A találmány szerinti eljárásban a kationcserélő membránok előnyösen erős savas csoportokat tartalmaznak, ezek közül előnyösen szulfonátcsoportokat, az anioncserélő membránok pedig előnyösen erős bázikus csoportokat, ezek között kvaterner ammóniumcsoportokat tartalmaznak.
A bipoláris membrán két membrán együttese, melyek közül az egyik kationos, a másik anionos. Mikor a membránt elegendő elektromos mezőbe helyezzük, a membrán felületén lévő szolvatációs víz H+ és OH- ionokra disszociál, melyek a kationos felületen áthaladva a katód felé, az anionos felületen áthaladva pedig az anód felé vándorolnak. Bipoláris membránra példaként említhetjük meg az Aqualytics, Tokuyama Soda vagy FuMaTech társaságok által forgalmazott membránokat.
Az elektrodializátor anódja az elektrodialízishez klasszikusan alkalmazott anyagokból állhat, például grafitból, nikkelből, vagy nemesfémekkel vagy ezek oxidjaival bevont titánból, például platinával bevont titánból. A katód szintén az elektrodialízishez klasszikusan alkalmazott anyagokból, például grafitból, rozsdamentes acélból vagy nikkelből állhat.
Az elektrodializátort a kezelni kívánt vizes oldattal tápláljuk. Az is szükséges, hogy az anódon egy anolitoldatot, a katódon egy katolitoldatot cirkuláltassunk. Alkalmazhatunk egyetlen elektrolitoldatot is. A találmány szerinti eljárásban egyetlen elektrolit áramoltatása megfelelő. Az elektrolitoldat szerepe a megfelelő vezetőképesség biztosítása. Ez a vezetőképesség előnyösen 20 mS/cm vagy annál nagyobb, anélkül, hogy ez az alsó határ kritikus lenne a találmány szerinti eljárás megvalósítása szempontjából.
Az alkalmazott elektrolit egy ionizálható vegyület, például egy só, sav vagy bázis. Az elektrolitot előnyösen a nem elektroaktív vegyületek közül választjuk. Így például előnyös, ha semleges sókat, például szulfátokat, savakat, például kénsavat, bázisokat, például nátrium-hidroxidot alkalmazunk.
Az alkalmazott áramsűrűség általában 0,2-1,5 kA/m2, előnyösen 0,4-1 kA/m2.
A találmány szerinti eljárásnál alkalmazott hőmérséklet a membránok stabilitásához megfelelő értéken helyezkedik el. Előnyösen 30 és 60 ’C közötti hőmérsékleten dolgozunk.
Az elektrodializátor különböző módokon működhet. Először is működhet folyamatosan, amikor a kezelendő oldat folyamatosan áthalad a sorozaton; ekkor több emeletet helyeznek el sorozatban, ha a kezelés kívánt mértéke ezt megkívánja. Működhet szakaszosan is, amikor a kezelendő oldat egy tartályban kering addig, míg megkapjuk a kezelés kívánt mértékét. Végül működhet közvetlen átfolyással részleges keringtetéssel.
A találmány egy változata szerint az ammóniumsó disszociációja 2-hidroxi-4-metil-tio-vajsawá és ammónium-hidroxiddá történhet egy háromkamrás, bipoláris membránnal ellátott elektródjaiízis cellában, melyet az 1A. ábrán mutatunk be sematikusan.
Az eljárás megvalósításához megfelelő elektródjai ízis készülék különböző kamrákból áll, melyeket kationos membránok (MC), bipoláris membránok (MB) és anionos membránok (MA) határolnak. Ezek a kamrák
HU 226 148 Β1 az elválasztandó vegyületben elszegényedő sókamrára (S), és a sóból regenerált savat és bázist koncentráló báziskamrára (B) és savkamrára (A) oszthatók.
Az ammóniumsót a sókamrába vezetjük be. Az elektromos mező hatására az ammóniumion a katód felé vándorol, kikerülve a sókamrából (S), ahol található, egy kationcserélő membránon (kationos membrán) keresztül, és a bipoláris membrán anionos felületéről származó OH- ionokkal vegyül, amely felületen az elektromos mező hatására a víz disszociációja megy végbe.
Ezzel egy időben a karboxil-(2-hidroxi-4-metil-tiobutirát)-ionok a kamrából (S) kikerülve egy anioncserélő membránon (anionos membrán) keresztül az anód felé vándorolnak. Miután átkerültek az (A) kamrába, a bipoláris membrán kationos felületéről származó H+ ionok által protonálódnak. A három szomszédos (B), (A), (S) kamra egy elektrodialízis cellát alkot.
A találmány egy második változatában a 2-hidroxi4-metil-tlo-vajsav regenerálását egy bipoláris membránnal ellátott kétkamrás elektrodialízis cellában végezhetjük, amilyent az 1B. ábrán mutatunk be. A két kamrát kationos és bipoláris membránok határolják. A kamrák a só/sav kamrára (S/A) és a báziskamrára (B) oszthatók.
Az ammóniumsót a só/sav kamrába vezetjük be. Az elektromos mező hatására az ammóniumion az (S/A) kamrából kikerülve a katód felé vándorol, egy kationcserélő membránon (kationos membrán) keresztül, és a bipoláris membrán anionos felületéről származó OH ionokkal vegyül, amely felületen az elektromos mező hatására a víz disszociációja megy végbe.
Ezzel egy időben az S/A kamra savasabbá válik a bipoláris membrán kationos felületéről származó H+ ionok hatására. A két szomszédos (B) és (S/A) kamra alkot egy elektrodialízis cellát.
Ez a kialakítás azzal az előnnyel rendelkezik, hogy kevesebb energiát igényel, és lehetővé teszi, hogy a kívánt só/sav arányt változtassuk.
Az elektrodializátor jó működéséhez a báziskamra elektromos vezetőképessége (valamint a háromkamrás kialakítás esetében a savkamráé is) elegendő kell legyen, ezt egy elektrolithordozó adagolásával állíthatjuk be. Igy az ammónium-hidroxid-oldat vezetőképességét egy ammóniumsó, például ammónium-szulfát hozzáadásával növelhetjük.
A találmány egy előnyös megvalósítási módjában az ammónium-2-hidroxi-4-metil-tio-butirátot alkalmazzuk.
Egy a találmány keretein belül különösen elképzelhető megvalósítási módban egy háromkamrás elektrodialízis cella sókamrájába a 2-hidroxi-4-metil-tio-vajsav ammóniumsója és a 2-hidroxi-4-metil-tio-butironitril elegyét vezetjük be. A só a korábban leírtak szerint disszociál 2-hidroxi-4-metil-tio-butiráttá, és az anód felé vándorol, ahol átalakul 2-hidroxi-4-metil-tio-vajsawá, az ammóniumion a katód felé vándorol, ahol ammónium-hidroxiddá alakul, és a sókamrában víz és nem átalakult 2-hidroxi-4-metil-tio-butironitril marad, melyet a hidrolízisoszlop felé újra visszavezetünk.
A meleg ítéses eljárást követve az ammóniumsó, szabad sav egyensúlyt eltolva nyerjük ki a savat, a HMTBS-ben gazdag vizes oldatot melegítve, és az így felszabadult ammónium-hidroxidot kivonva. Ezt elérhetjük a vákuum alatti melegítéssel, vagy az atmoszferikus nyomáson történő melegítéssel, sztripping kezeléssel vagy anélkül. CO2 alkalmazása nyomás alatt elképzelhető az egyensúly eltolásának megkönnyítése érdekében. HMTBS és HMTBA elegyét kapjuk a HMTBA és HMTBS összmennyiségéhez viszonyítva 5-99,9% HMTBA aránnyal, előnyösen 10-50% HMTBA aránnyal. Az oldat viszkozitása 1200-30 mm2s-1 (1200 és 30 cSt közötti), előnyösen 200-50 mm2s-1 (200 és 50 cSt közötti) 25 °C-on.
A vizes oldatot felbonthatjuk a sav extrakciójával vízben részlegesen oldható vagy oldhatatlan oldószertermékek alkalmazásával. Nagyszámú, az elválasztáshoz alkalmazható oldószer létezik. Az előnyös oldószerek az 5-8 szénatomszámú ketonok, részletesen a metil-izobutil-keton; az éterek, például az izopropil-éter; az alkoholok, például az izopropil-alkohol; az észterek; a tercier aminok, például a trioktil-amin. A találmány keretein belül az előnyben részesített oldószerek az aceton, a MIBK, az izopropil-alkohol, az izopropil-acetát, az izobutil-éter vagy a propil-éter, vagy a THF, a trioktilamin. A vizes fázis és a szerves fázis aránya nem kritikus. Mégis a hatásfok miatt jó, ha nem megyünk egy minimális 1/1 arány alá, és a gazdaságosság miatt nem megyünk túl az 1/3 arányon. Az 1/1,5-2,0 arányt részesítjük előnyben.
Az extrakciót végezhetjük batch vagy folyamatos üzemmódban bármely folyadék-folyadék extrakciós technológiával. Például az egyirányú áramlásos vagy az ellenáramlásos dekantálóelegyek sorozatát, az extraktor centrifugákat, a tálcás oszlopokat stb. említhetjük meg.
A szabad savban elszegényített vizes oldatot újból kezelhetjük, és ezt annyiszor tehetjük meg, ahányszor az ammónium-hidroxid teljes eltávolításáig ez szükséges, ha ez kívánatos.
A szerves fázist egy kezelésnek vetjük alá, hogy izoláljuk a HMTBA-t. Ezt előnyösen az oldószer lepárlásával végezzük, vagy meleg vizes extrakcióval. Hogy elkerüljük a HMTBA esetleges károsodását, a termikus szollicitációt a lehető legalacsonyabb szinten tartjuk vákuum alkalmazásával.
Az ammóniumsó disszociációjára szolgáló két eljárásban vizes ammónium-hidroxid-oldatot hozunk létre. Ezt kezelhetjük az ammónium-hidroxid koncentrálása céljából. Előnyben részesítjük a desztillációt és az ammónium-hidroxid koncentrációját egy vagy több fokozatban nyomás alkalmazásával vagy anélkül. Elképzelhető egy megelőző sztrippelőlépés is. A koncentrált ammónium-hidroxid-oldatot visszavezethetjük a hidrogén-cianid szintézisébe, amely a 2-hidroxi-4-metil-tiobutironitril szintézisében vesz részt.
Az ötödik lépésben a HMTBS és/vagy a szabad sav vizes oldatát koncentráljuk. Ezt előnyösen a víz lepárlásával végezzük.
A találmány tárgya egy berendezés is a találmány szerinti eljárás megvalósítására. Egy ilyen berendezést
HU 226 148 Β1 mutatunk be sematikusan a 2. ábrán, amely az 1, 2 vezetékeket tartalmazza, melyek az AMTP-ciánhidrin és a víz 3 reaktorba történő adagolására szolgálnak.
A 3 reaktor egy recirkulációs fix ágy, melyben az immobilizált törzsek vagy enzimek vannak. Az oldat egy ré- 5 szét a 3 reaktorból lefejtjük, és egy 4 végreaktorba irányítjuk. A 4 végreaktor fix ágyas típusú, amelyben az immobilizált törzsek vagy enzimek vannak. A HMTBS koncentrált oldatát azután kinyerjük a 4 reaktor kijáratánál az 5 vezeték segítségével. 10
A HMTBS koncentrált oldatát két teljesen független kezelésnek vethetjük alá a kívánt végtermék típusától függően.
Amennyiben olyan terméket szeretnénk kinyerni, amely nagy arányban tartalmaz HMTBS-t, az 5 veze- 15 tékből távozó oldatot egy 6 lepárlóba vezetjük, amely lehetővé teszi, hogy a terméket koncentráljuk, és a 8 vezetéknél egy főként HMTBS-t tartalmazó koncentrált oldatot nyerjünk ki, amely kevés szabad savat tartalmaz. A maradék vizet, valamint az ammónium-hidro- 20 xid frakcióját a 7 vezetéken távolítjuk el.
Amennyiben olyan terméket szeretnénk, amely nagy arányban tartalmaz szabad savat, az 5 vezetékből távozó koncentrált HMTBS oldatot egy 9 bipoláris elektrodial ízis rendszerbe vezetjük be. Ebben a készü- 25 lékben elektrodialízissei többé-kevésbé elválasztjuk az ammónium-hidroxidot a savtól. Az ammóniumban elszegényített elegyet a 11 vezetéknél nyerjük ki, majd a 12 lepárlóban koncentráljuk, hogy főként szabad savból álló koncentrált oldatot kapjunk, amely kevés, vagy 30 semennyi HMTBS-t tartalmaz. Az ammónium-hidroxidban gazdag oldatot a 10 vezetéknél fejtjük le. Az ammónium-hidroxidot 15 sztrippeléssel nyerjük ki.
A kifolyó ammónium-hidroxidot a 16 desztillációval koncentrálhatjuk, a vizet a 18-nál nyerhetjük ki. 35
A 17 koncentrált ammónium-hidroxid-oldatot a HCN szintézisbe vezethetjük vissza.
A következő példák mutatják be a találmányt.
Példák
1. példa
A nitriláz tisztítása és N-terminális szekvenálása A nitrilázt négy lépésben tisztítottuk. A tisztítás összefoglalását az 1. táblázatban adjuk meg.
Az Alcaligenes faecalis sejtjeit 24 órán át tenyésztettük 30 °C-on minimál táptalajon benzonitril jelenlétében (0,5 g/l). A tenyészet centrifugálása után a csapadékot TG-pufferben vettük fel [25 mM Tris-HCI, 10% (tömeg per térfogat) glicerol, pH=7,5]. A sejtszuszpenziót ultrahanggal kezeltük, majd centrifugáltuk, hogy megkapjuk a nyers kivonatot. A nyers kivonatot ezután ammónium-szulfáttal kezeltük 30% telítettségig. A kapott csapadékot TG-pufferben újraszuszpendáltuk, majd 2 liter ugyanilyen pufferrel szemben dializáltuk egy éjszakán át. A kapott oldatot azután egy Q Sepharose Fást Flow HR 26/10 anioncserélő oszlopra vittük fel, melyet előzőleg TG-pufferrel egyensúlyoztunk ki. Az aktivitást ezután 0-1 M NaCI-gradienssel eluáltuk. Az aktív frakciókat azután egy Mono Q HR 5/5 anioncserélő oszlopra vittük fel, melyet előzőleg TG-pufferrel egyensúlyoztunk ki. A nitrilázt 0-1 M NaCI-gradiens segítségével eluáltuk. Befejezésül az aktivitást tartalmazó frakciókat egyesítettük, az ammónium-szulfátkoncentrációt 1 M-ra állítottuk be. Ezt az oldatot egy Phenil-Superose HR 5/5 hidrofób kölcsönhatásokon alapuló oszlopra vittük fel, melyet előzőleg 1 M (NH4)2SO4-gyel kiegészített TG-pufferrel egyensúlyoztunk ki. Az aktivitást 1M-0M ammónium-szulfát-gradienssel eluáltuk.
1. táblázat
A nitriláz tisztításának összefoglalása
| Frakció | összfehérje (mg) | Teljes aktivitás (pmol/h) | Specifikus aktivitás (pmol/h-mg) | Fehérjehozam (%) | Tisztítási faktor |
| Teljes sejtek | 955 | 4300 | 4,5 | 100 | 1 |
| Nyers kivonat | 2400 | ||||
| Ammónium-szulfát | 650 | ||||
| QSHL 26/10 | 3 | 360 | 120 | 0,3 | 27 |
| MonoQ HRS/S | 1,5 | 240 | 160 | 0,15 | 35 |
| Phenil-Sepharose | 1 | 120 | 110 | 0,1 | 24 |
Műveleti körülmények: (nitril)=50 mM; 100 mM foszfátpuffer, pH=7,0, 30 °C.
A fehérje molekulatömegét gélszűréssel határoztuk meg, körülbelül 260 kD. SDS-PAGE-n egyetlen 43 kD sávot figyeltünk meg (95%-os tisztaság). A fehérje tehát valószínűleg a6 szerkezetű, ahol a tömege 43 kD.
2. példa
Az Alcaligenes faecalis ATCC8750 nitrílázának klónozása
Az 1. példában bemutatott NH2 terminális szekven60 cia teljes mértékben azonos az A. faecalis JM3 nitril7
HU 226 148 Β1 ázának N-terminális szekvenciájával [Kobayashi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 247-251 (1993)], míg a bakteriális nitrilázok N-terminálisa 35-57%-ban azonos 14 maradékot figyelembe véve. A feltalálók azt a hipotézist állították fel, hogy a találmány szerinti nitriláz, melyet az ATCC8750 törzsből tisztítottak, hasonló a Kobayashi és munkatársai által leírt nitrilázhoz (korábban idézve). A klónozási stratégia tehát abból állt, hogy az ATCC8750 törzs genomiális DNS-én PCR-ral amplifikálják a nitriláz a génjét, két olyan nukleotidszonda segítségével, melyeket a Kobayashi és munkatársai (korábban idézve) által megadott szekvencia alapján határoztak meg.
A két szondát szintetizálták, melyek közül az egyik a Kobayashi és munkatársai (korábban idézve) által megadott szekvencia 5’-részével, a másik a 3’-részével tudott hibridizálódni:
5’-rész (PCRAF1): CCGGGAATTCATATGCAGACAAGAAAAATCGTCC
3’-rész (PCRAF2): TCCTTCTGCGTCCCCGATCCCGCAT
A PCRAF1 primer 12 nukleotidot tartalmaz 5'-irányban, melyek lehetővé teszik, hogy az ATG iniciációs kodon fölé az EcoRI és Ndel enzimek restrikciós helyeit vezessük be. A PCRAF2 primer lehetővé teszi, hogy a BamHI enzim restrikciós helyét bevezessük. Az A. faecalis ATCC8750 törzs genomiális DNS-ét a CTAB eljárás szerint vontuk ki, melyet Ausubel és munkatársai írtak le (Current Protocols in Molecular biology, John Willey&Sons Inc. Ed., 2.4.1-2.4.5), és ebből 100 ng-ot alkalmaztunk mindegyik PCR-reakcióhoz. Hogy játszunk az amplifikáció specifitásával, különböző MgCI2 koncentrációkat vizsgáltunk, amint azt Ausubel és munkatársai leírták (korábban idézve) 100 μΙ össztérfogatban, 2,5 egység Taq DNS-polimerázzal (Perkin-Elmer). Két kiegészítő reakciót végeztünk 1,5 mM MgCI2-vel és 5% DMSO-val vagy 5% formamiddal. Egy Perkin-Elmer 9600 thermocyclert a következőképpen programoztunk: 5 perc 95 °C, 30 ciklus (30 perc 95 °C, 30 perc 55 ’C, 45 perc 72 ’C), és 4 perc 72 ’C. A különböző amplifikációs termékeket 0,8% agarózgélen vizsgáltuk. Egy fősáv, melynek mérete a várt 1,15 kb méretnek felelt meg, mindegyik reakcióban amplifikálódott, de különösen 1,5 mM MgCI2 és 5% DMSO esetében. Tehát az ilyen körülmények között végzett reakció termékeit használtuk a későbbiekben. A mintát proteináz K-val kezeltük, etanollal kicsaptuk egy fenol-kloroformos extrakció után. A szuszpenzióba felvett csapadékot 2 órán át inkubáltuk 37 ’C-on 40 egység EcoRI enzimmel és 40 egység BamHI enzimmel. 0,7%-os agarózgélen való futtatás után az 1,15 kb sávot kivágtuk és kivontuk, hogy a nyitott EcoRI-BamHI pBSK- vektorba (Stratagene, La Jolla, USA) klónozzuk a klasszikus módszerek szerint, öt független, pRPA-BCAT1-5-nek nevezett kiónt vizsgáltunk a plazmid DNS enzimatikus emésztésével Ndel, EcoRI, BamHI, BspMI és Bglll enzimekkel (3. ábra). A kapott profilok megfelelnek az elméletileg ezzel az eljárással a Kobayashi és munkatársai (korábban idézve) által leírt szekvenciával kapott profiloknak. Az
XL1Blue(pRPA-BCAT3) törzset a CBS-nél helyeztük letétbe CBS 998-96 számon.
3. példa
Egy 1130 bp, nitrilázaktivitással rendelkező polipeptidet kódoló DNS-t tartalmazó fragmentum szekvenálása
A PRPA-BCAT3 plazmidba klónozott inszertumot a Genome Express S. A. társaság (Grenoble, Franciaország) szekvenálta egy laboratóriumban előállított DNSkészítményből (Wizzard Midi-prep kit, Promega). A fragmentum szekvenálásának stratégiáját, melyet a szakember számára ismert klasszikus eljárások szerint végeztünk, a 4. ábrán mutatjuk be. A tíz belső nukleotidprimert (melyeket a 623-629 és 681-682 számok jelölnek a 4. ábrán) az A. faecalis JM3 nitrilázának szekvenciája (Kobayashi et al., korábban idézve) alapján szintetizáltuk. Ezt az együttest az M13Reverse és az M13Forward univerzális primerekkel egészítettük ki. Minden területet legalább egyszer leolvastunk mindegyik DNS-szálon.
A kapott DNS-szekvencia két eltérést mutat a közölt szekvenciához képest: egyiket abban a struktúrában, mely feltételezhetően transzkripciós terminátorként szolgál, a másikat a nitB-nek nevezett nitriláz génjében, amely Asn279-»Asp helyettesítéshez vezet. Ezt a két területet tehát a laboratóriumban szekvenáltuk a pRPA-BCAT1, 2, 4 és 5 plazmidokon, a két 710 és 682 specifikus primerrel (vö. 4. ábra). A 1412. helynek megfelelő (Kobayashi számozásának megfelelően) (korábban idézve) C->T cserét a terminátor területen mindegyik kiónban megtaláltuk. Olyan mutációról van szó, amely a két A. faecalis törzset megkülönbözteti. A 1138. helyen lévő A-*G csere csak a pRPABCAT3 plazmidban van jelen. Ez tehát a PCR során a Taq DNS-polimerázzal bevezetett mutáció.
4. példa
A nitriláz kifejezése E. coli BL21(DE3)-ban
Hogy megerősítsük, hogy a klónozott DNS-szekvencia azonos a tisztított nitriláz génjével, a nitB gént a Φ10 fág T7 génje promoterének irányítása alá helyeztük az itt leírt módszer szerint: a pRPA-BCAT3 és pRPA-BCAT4 plazmidok 1,13 kb Ndel-BamHI inszertumait a pXL2432 vektorba klónoztuk, és így a pRPABCAT12 és pRPA-BCAT13 vektorokat kaptuk, melyeket az 5. ábrán mutatunk be. A pXL2432 szülővektor egy hibrid a pET9 plazmid [Studier et al., Methods in Enzymol. 185, 60-89 (1990)] replikációs origót (ŐRI) és a kanamicinrezisztenciát (Kan) hordozó szelekciós markert magában foglaló Accl és EcoRI helyei közötti területe, és a pET11a plazmid (Novagen Inc., Madison Wl, USA) expressziós kazettát és a lacl represszor gént, és a kópiaszámot szabályozó ROP gént magában foglaló EcoRI és Accl helyei közötti területe között.
A tenyészeteket indukciós körülmények közé helyeztük az itt leírt eljárás szerint: A pRPA-BCAT 12 plazmidot tartalmazó BL21 (DE3) törzset (Novagen Inc., Madison, Wl, USA), a pRPA-BCAT13 plazmidot tartalmazó BL21(DE3) törzset, valamint a pXL2432 plazmidot tartal8
HU 226 148 Β1 mazó BL21(DE3) törzset 16 órán át tenyésztettük 50 gg/ml kanamicint tartalmazó LB közegben 37 °C-on [Miller, Expresiments in Molecular Genetics - Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N. Y. (1982)], majd 100-szorosára hígítottuk ugyanabban a közegben, ugyanazon a hőmérsékleten. Amint a tenyészet elérte a 0,5-1 közötti OD600 értéket, IPTG-t adtunk hozzá 1 mM végső koncentrációban. 6 óra tenyésztés után a baktériumokat összegyűjtöttük. Hasonló eljárást alkalmaztunk a pRPA-BCAT12 és a pXL2231 plazmidot tartalmazó BL21(DE3) törzs, a pRPA-BCAT13 és a pXL2231 plazmidot tartalmazó BL21(DE3) törzs, valamint a pXL2432 és a pXL2231 plazmidot tartalmazó BL21(DE3) törzs tenyésztéséhez, a tenyészközeget 12 pg/ml arányban tetraciklinnel kiegészítve. A pXL2231 plazmid, ami a pXL1635 vektorból származik (FR 90/05185 számon nyilvánosságra jutott szabadalmi bejelentés, 1990. 04. 24.), az IncP inkompatibilitási csoporthoz tartozik, tehát kompatibilis a pRPABCAT12 és 13 plazmidokkal, melyek a ColEI plazmid replikációs origójával rendelkeznek. Szelekciós markere a tetraciklinrezisztencia, és egy 2,2 kb EcoRI-HindlII fragmentumot hordoz, amely az E. coli molekuláris chaperonjait kódoló GroES és GroEL géneket tartalmazza [Fayet et al., Mól. Gén. Génét. 202, 435-445 (1986)].
A nitrilázexpressziót 10% SDS-PA gélen vizsgáltuk a nyers frakcióban, a sejtek ultrahangos kezelése után, és centrifugálás után a csapadékban és a felülúszóban. Az eredményeket a 6. ábrán mutatjuk be, melyek azt mutatják, hogy a nitriláz (NitB) magas szinten kifejeződik azokban a sejtkivonatokban, ahol a plazmidok legalább egyike tartalmazza a nitB inszertumot, a fehérje azonban alapvetően oldhatatlan formában van, bár a pXL2231 plazmid jelenléte lehetővé teszi, hogy a nitriláz polipeptid mennyiségét az oldható frakcióban megnöveljük.
A 6. ábrán M a molekulatömeg-markert jelenti; a molekulatömegeket kD-ban adtuk meg. Másrészt a sá5 vök a következők:
-A, D, G a BL21(DE3)+pRPA-BCAT12, pRPABCAT13 és pXL2432 nyers kivonatait jelölik;
- Β, E, H az ugyanezen törzsekből kapott felülúszókat jelölik;
- C, F, I az ugyanezen törzsekből kapott csapadékot jelölik;
- J, N, Q a BL21(DE3)+pXL2231+pRPA-BCAT12, pRPA-BCAT 13 és pXL2432 nyers kivonatait jelölik;
- K, O, R az ugyanezen törzsekből kapott fefülúszókat jelölik;
- L, P, S az ugyanezen törzsekből kapott csapadékot jelölik.
A BL21(DE3)/pRPA-BCAT12+pXL2231 törzset 20 RPA-BIOCAT126-nak neveztük el. A BL21(DE3)/pRPABCAT13+pXL2231 törzset RPA-BIOCAT127-nek neveztük el. Az RPA-BIOCAT126, RPA-BIOCAT127, és a BL21(DE3)/pXL2432-nek megfelelő RPA-BIOCAT66 tenyészetek nitrilázaktivitását a következő mó25 dón határoztuk meg: a tenyészeteket centrifugáltuk, és a sejtes csapadékot 10 ml 100 mM kálium-foszfát-pufferben (pH=7) vettük fel. A HMTBN hidrolízisét 500 μΙ szuszpenzióval végeztük, melyet 200 mM HMTBN (pH=7) oldat 500 μΙ-éhez adtunk hozzá. A hidrolízis ki30 netikáját 100 μΙ elegynek 900 μΙ 0,1 M foszfonsawal történő elegyítésével kaptuk meg. A termelt HMTBA mennyiségét HPLC-vel vizsgáltuk, a WO 96/09403 számon közzétett szabadalmi bejelentésben leírt módon. Az eredményeket a 2. táblázatban csoportosítottuk.
2. táblázat
Az RPA-BIOCAT66, 126 és 127 törzsek aktivitása
| RPA-BIOCAT | Közeg | Indukció | Tenyészidő | ODggg | Aktivitás |
| 66 | LB Km | 0,1 mM IPTG | 24 óra | 2,5 | 0 |
| 126 | LB Km Te | 0,1 mM IPTG | 24 óra | 2,4 | 15 |
| 127 | LB Km Te | 0,1 mM IPTG | 24 óra | 1,9 | 10 |
Rövidítések: Km: 50 pg/ml kanamicin; Te: 12 pg/ml tetraciklin; h: óra; U: óránként és száraztömeg-kilogrammonként előállított HMTBA kg.
A kifejezett nitriláz polipeptid oldhatóságának javítására a pRPA-BCAT37 plazmidot hoztuk létre az itt 50 következő módon. A pXL2391 plazmidot úgy kaptuk, hogy a pDSK519 plazmid [Keen et al., Gene 70, 191-197 (1988)] 5,9 kb EcoRI-Pvull fragmentumát, melyet Klenow-polimerázzal kezeltünk, a pHP45QSp plazmid [Prentki et Krisch, Gene 29, 303-313 (1984)] 55 Mung Beán nukleázzal kezelt 2056 bp Hindlll fragmentumával ligáltuk. Ezután a pXL2381 plazmidot Smal-gyel és Sacl-gyel emésztettük, és beleépítettük a pXL2231 plazmidból kivont, Hindlll-mal emésztett, Kienow-val kezelt és Sacl-gyel emésztett, a GroESL 60 operont hordozó 2,3 kb inszertumot. A pRPABCAT37 plazmid tehát az RSF1010 plazmid származéka, nagyobb kópiaszámmal, mint a pXL2231 plazmid, kompatibilis a ColEI origót hordozó plazmidokkal, és sztreptomicinrezisztencia-markert hordoz. Ezt a plazmidot bevezettük a BL21(DE3)/pRPABCAT12 törzsbe, és így az RPA-BIOCAT171 törzset kaptuk. Meghatároztuk a fentebb leírtakhoz hasonló körülmények között előállított tenyészet aktivitását, ahol a tetraciklint 100 pg/ml streptomicinnel helyettesítettük, az eredményeket a 3. táblázatban mutatjuk be.
HU 226 148 Β1
3. táblázat
Az RPA-BI0CAT171 törzs aktivitása
| RPA-BIOCAT | Közeg | Indukció | Tenyészidő | ODggo | Aktivitás (U) |
| 171 | LB Km Sm | 0,1 mM IPTG | 24 óra | 3,2 | 14 |
Rövidítések: Km: 50 pg/ml kanamicin; Sm: 100 pg/ml sztreptomicin; h: óra; U: óránként és száraztömeg-kilogrammonként előállított HMTBA kg.
5. példa
A nitriláz expressziója E. coli DH5a-ban
A pRPA-BCAT6 plazmidot úgy állítottuk elő, hogy a pBCAT3-ba klónoztuk (vö. 3. ábra) a pXL2158 0,6 kb Scal-Ndel fragmentumát, amely a Ptrp promotert és az RBScII riboszóma kötőhelyet tartalmazza [Levy-Schill et al., Gene 161, 15-20 (1995)]. Az expressziót a pRPABCAT6 plazmidot és/vagy a pXL2035 plazmidot (LevySchill et al., korábban idézve) tartalmazó DH5a törzsben végeztük a következő eljárás szerint: az előtenyészetet 16 órán át inkubáltuk 37 °C-on, 0,4% kazaminosavakat, 100 pg/ml triptofánt, 100 pg/ml karbecillint tartalmazó M9 glükózközegben [Miller, J. H., Experiments in Molecular Genetics. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N. Y. (1972)]. A pXL2035-öt tartalmazó törzsek esetében 50 mg/l arányban kanamicint adtunk hozzá. Az expresszió az azonos, de triptofánmentes közegben telített tenyészet 1/100-szoros hígítása, és 8-16 órás 37 °C-on történő inkubálása után jön létre.
A különböző törzsek kivonatainak SDS-PAGE-analízisét az előző példában leírt módon végeztük, ezt a 7. ábra mutatja be.
Az ábrán M jelentése molekulatömeg-marker; a molekulatömegeket kD-ban adtuk meg. Másrészt a sávok jelölése a következő:
- L, I, F, C a DH5a+pRPA-BCAT3, pRPA-BCAT6, 15 pRPA-BCAT6+ pXL2035, RPA-BIOCAT76 törzsekből kapott nyers frakciókat jelölik;
- K, Η, E, B az ugyanezen törzsekből kapott felülúszókat jelölik;
- J, G, D, A az ugyanezen törzsekből kapott csapa20 dókot jelölik.
A pRPA-BCAT6 plazmid egy nagyrészt oldhatatlan 43 kD polipeptid gyenge felhalmozódását teszi lehetővé. A GroE pXL2035 plazmidból származó együttes expressziója lecsökkenti az expressziót, de a
DH5a(pRPA-BCAT6+pXL2035) törzs három egymás utáni újraoltása után szelektált RPA-BIOCAT76 törzs a kiindulási szinten expresszálja a nitriláz polipeptidet, amely szinte teljesen oldható. A fentebb és az előző példában leírt módon megvalósított tenyészetekben mért aktivitását a 4. táblázatban mutatjuk be.
4. táblázat
DH5a(pRPA-BCAT3), DH5a(pRPA-BCAT6), DH5a(pRPA-BCAT6+pXL2035) és RPA-BIOCAT76 törzsek aktivitása
| Törzs | Közeg | Tenyészidő | 0^660 | Aktivitás (U) |
| DH5a(pRPA-BCAT3) | M9 Cb | 24 óra | 4 | 0 |
| DH5a(pRPA-BCAT6) | M9 Cb | 24 óra | 4 | 0,6 |
| DH5a(pRPA-BCAT6+pXL2035) | M9 Cb Km | 24 óra | 3 | 1,6 |
| RPA-BIOCAT76 | M9 Cb Km | 24 óra | 3,8 | 5 |
Rövidítések: Km: 50 pg/ml kanamicin; Cb: 100 pg/ml karbecillin; h: óra; U: óránként és száraztömeg-kilogrammonként előállított HMTBA kg.
Az adatok azt mutatják, hogy a GroE együttes expressziója lehetővé teszi, hogy a nitriláz expresszióját javítsuk, és hogy egy egymást követő újraoltásokkal történő klasszikus törzs szelekció szintén a rekombi- 50 nánsok aktivitásának javulásához vezet.
6. példa
A nitriláz expressziója Pseudomonas putidaban és
Alcaligenes faecalisban 55
Az 5. példában leírt expressziós rendszert használtuk a nitriláz termeltetésére Pseudomonas putida és A. faecalis esetében. A pRPA-BCAT6 nitB gént tartalmazó 1,14 kb Ndel-Xbal fragmentumát a pXL1289 vektor Ndel-Xbal helyeire vezettük be. A pXL1289 vektor a 60 pKT230 [Bagdasarian etal., Gene 15, 237-247 (1981)] származéka, amely Gram-negatív baktériumoknál sokgazdás replikációs origót (oriV) hordoz, és amely tartalmaz egy 120 bp, a pXL534 [Latta et al., DNA and Cell Biology 9, 129-137 (1990)] Ptrp promoterét és RBScII-t hordozó EcoRI-Ndel fragmentumot, egy a cobA gént kódoló Ndel-Xbal inszertumot [Crouzet et al., J. Bacteriol. 172, 5968-5979 (1990)], és egy 500 bp Xbal-BamHl inszertumot, amely a pXL534 [Latta et al., DNA and Cell Biology 9 129-137 (1990)] TrrnB terminátorát tartalmazza. A kapott pRPA-BCAT14 plazmid tehát egy pKT230 származék, amely tartalmaz egy kanamicinrezisztenciát biztosító gént (Kan) és a Ptrp:RBScII irányítása alatt álló nitB gént (8. ábra).
HU 226 148 Β1
A plazmid E. coli DH5a törzsbe történő bevezetése során szelektáltunk egy különleges kiónt: ez olyan nitrilázt fejezett ki, melynek molekulatömege SDS-PAGE gélen 44 kD a 43 kD helyett. A klón által hordozott plazmid ugyanolyan restrikciós profillal rendelkezik, mint a pRPA-BCAT14, és pRPA-BCAT24-nek neveztük el. Végül a pRPA-BCAT23 plazmidot ugyanúgy állítottuk elő, mint a pRPA-BCAT14-et, a következő módosítással: a pRPA-BCAT16 136 bp Stul-Bsml fragmentumát a pRPA-BCAT4 Stul-Bsml fragmentumával helyettesítettük. A pRPA-BCAT23 tehát egy olyan nitB nitrilázt fejez ki, amelynek 279. helyzetében Asn maradék van.
A pRPA-BCAT14, 23 és 24 plazmidokat elektroporációval bevezettük a Pseudomonas putida G2081 törzsbe. A G2081 törzs a KT2440 törzsből [Bagdasarian and Timmis, in: Horschneid and Goebel, Topics in Microbiology and Immunology, 47, Springer Verlag, Berlin (1981)] származik nalidixsav és rifampicin spontán rezisztenciára szelektálással. Kontrollként a pKT230 vektort alkalmaztuk.
A pRPA-BCAT14, pRPA-BCAT23, pRPABCAT24 és pKT230 plazmidokat kivontuk a P. putida törzsekből, hogy elektroporációval az A. faecalis ATCC8750 (=RPA-BIOCAT1) törzsbe vezessük be.
A G2081(pRPA-BCAT14), G2081(pRPA-BCAT23), G2081(pRPA-BCAT24) G2081(pKT230), és az RPABIOCAT1(pRPA-BCAT14), RPA-BIOCAT1(pRPABCAT23), RPA-BIOCAT1(pRPA-BCAT24), RPA-BIOCAT1(pKT230) törzseket egy éjszakán át tenyésztettük 30 °C-on 50 mg/l kanamicint tartalmazó LB közegben. Az előtenyészeteket azután 1/100-szorosára hígítottuk 50 mg/l kanamicint tartalmazó M9 közegben, és 20 órán át inkubáltuk 30 °C-on.
A sejtek ultrahangos kezelése után a nitriláz expresszióját 10%-os SDS-PAGE gélen mértük a sejtek ultrahangos kezelése után kapott nyers frakcióban, és centrifugálás után a csapadékban és a felülúszóban. Az eredményeket a 9. ábrán mutatjuk be. Az RPA-BIOCAT1(pKT230) és a G2081(pKT230) törzs esetében csak a nyers kivonatokat vizsgáltuk (A és I sávok). Az ábrán M jelentése a molekulatömeg-marker; a molekulatömegeket kD-ban adtuk meg. Másrészt a sávok jelölése a következő:
- B, D, F a RPA-BIOCAT1(pRPA-BCAT14), RPABIOCAT1(pRPA-BCAT23), RPA-BIOCAT1 (pRPABCAT24) törzsekből kapott nyers frakciókat jelölik;
- C, E, G az ugyanezen törzsekből kapott felülúszókat jelölik;
-Ha RPA-BIOCAT1(pRPA-BCAT24)-ből kapott csapadékot jelöli;
- J, L, O a G2081(pRPA-BCAT14), G2081(pRPABCAT23), G2081(pRPA-BCAT24) törzsekből kapott nyers frakciókat jelölik;
- K, N, P az ugyanezen törzsekből kapott felülúszókat jelölik;
- Q a G2081(pRPA-BCAT24)-ből kapott csapadékot jelöli.
A kísérlet azt mutatja, hogy a P. putida törzsek jelentős mennyiségben fejezik ki a három oldható nitriláz polipeptidet, és hogy az A. faecalis törzs csak a 44 kD nitriláz polipeptidet fejezi ki. A tenyészetekben mért aktivitások, melyeket a 4. példában leírt eljárás szerint mértünk, azt mutatják, hogy a G2081(pRPA-BCAT23), G2081(pRPA-BCAT24), és RPA-BIOCAT1(pRPABCAT24) törzsek rendelkeznek nitrilázaktivitással HMTBN-en.
7. példa
A nitriláz exprassziója Corynebactarium glutamicumban
A nitriláz expresszióját CGL1010 (=ATCC 14752) törzsben a PcspB promoter [Peyret et al., Molecular Microbiol. 9, 97-109 (1993)] segítségével valósítottuk meg. A pCGL815 plazmidból (Peyret et al., korábban idézve) amplifikáltunk egy a PcspB promotert tartalmazó 530 fragmentumot, a következő KS1 és KS2 primerek segítségével:
KS1: 5’-ACGCGTCGACCAGATCGTCAAGTTGTGG-3'
KS2: 5 -CATAGAGGCGAAGGCTCCTTG-3’
Sáli emésztés után az amplifikált 530 bp fragmentumot a Sall-gyel és EcoRV-tel felnyitott pBSK plazmidba (Stratagene, La Jolla, USA) klónoztuk, és így a pCGL1084 plazmidot kaptuk. A következő két KS8 és KS9 oligonukleotidot hibridizálva létrehoztunk egy EcoNl/Ndel adaptert:
KS8. 5-TCAAGGAGCCTTCGCCTCA-3’
KS9: 5 -TATGAGGCGAAGGCTCCTTG-3’
A nitriláz génjét kivontuk a pRPA-BCAT6 plazmidból egy 1,1 kb Ndel-Sbal fragmentum formjában. Ezt bevezettük az EcoNI-gyel és Sbal-gyel felnyitott pCGL1084-be, a fentebb leírt EcoNI/Ndel adaptert alkalmazva, és így a pCGL1086 plazmidot kaptuk. A pCGL1086 PcspB::nitB-t tartalmazó Sall-BamHI fragmentumot ezután a pXGL482 vektorba (Peyret et al., korábban idézve) klónoztuk, a Sáli és BamHI helyekre, ami a pCGL1087 plazmidhoz vezetett. A PCGL1087 (10. ábra) tehát egy pBII [Santamaria et al., J. Gén. Microbiol. 130, 2237-2246 (1984) alapú ingázó vektor, amely tartalmazza az E. coli által felismert pACYC184 replikációs origót, egy kloramfenikolrezisztencia-gént (Cm) és a PcspB::nitB fúziót.
A pCGL1087 és pCGL482 plazmidokat elektroporációval bevezettük a CGL1010-be, amint azt Bonnamy és munkatársai leírták [FEMS Microbiol. Lett. 66, 263-270 (1990)]. 20 óra 30 °C-on, 5 mg/l kloramfenikollal kiegészített 3,7% Brain Heart Infusion közegben végzett tenyésztés után a nitrilázaktivitás mérését a 4. példában leírt módon végeztük a tenyészetmintákon. Az eredmények azt mutatják, hogy a CGL1010(pCGL1087) törzsnek van nitrilázaktivitása, míg a CGL1010(pCGL482)nek nincs.
8. példa
A nitriláz expressziója Straptomyces lividansban
A nitriláz expresszióját a S. lividans TK24 törzsben valósítottuk meg [Hopwood et al., Genetic Manipulation of Streptomyces; A Laboratory Manual, The John Innes Foundation, Norwich (1985)], a plJ6021 plazmid [Takano et al., Gene 166, 133-137 (1995)] segítségével, a
HU 226 148 Β1
PtipA promotert [Holmes et al., EMBO J. 12, 3183-3191 (1993)] alkalmazva.
A pUC19 plazmidot [Yanish-Perron et al., Gene 33 103-119 (1985)] úgy módosítottuk, hogy Tfil-emésztéssel deletáltuk a 140 bp Tfil fragmentumot, Klenowval kezeltük, és önmagába ligáltuk. A kapott plazmidot EcoRI-gyel és BamHI-gyel felnyitottuk, hogy a pRPABCAT3 nitB gént tartalmazó 1,15 kb EcoRI-BamHI fragmentumát klónozzuk. Az így kapott pOS48.4 plazmid egy Tfil hellyel rendelkezik, amely a nitB gén és a BamHI hely között található. Ezt a helyet használtuk a pHPQ45hyg plazmidból [Blondelet-Rouault et al., Gene, közlésre benyújtva] BamHI emésztés és Klenow-kezelés után kivont 2,3 kb Ohyg fragmentumának beépítésére. Az Qhyg fragmentum a Streptomyces hygroscopicus higromicin foszfotranszferáz (hyg) génjét tartalmazza [Zalacain et al., Nucl. Acids Rés. 14, 1565-1581 (1986)], amely a S. lividansnak higromicinrezisztenciát biztosít. Az így kapott pOS48.4 plazmidot használtuk egy 3,45 kb Ndel-BamHI fragmentum izolálására, amely egymás után tartalmazza a hyg és a nitriláz géneket, és ezt az Ndel-gyel és BamHI-gyel felnyitott plJ6021 plazmidba (Takano et al., korábban idézve) klónoztuk. A plJ6021 plazmid csak Streptomycesben replikálódik, ezért a ligációs elegyet S. lividans TK24-be transzformáltuk a klasszikus eljárások szerint [Hopwood et al., korábban idézve], és a 200 mg/l higromicinre (Boehringer Mannheim) rezisztens kiónokat szelektáltuk. A kiónok plazmid DNS-ét klasszikus eljárásokkal kivontuk (Hopwood et al., korábban idézve), ezek restrikciós profilja a pOS48.7-nek nevezett várt konstrukciójénak megfelelt (11. ábra).
Két S. lividans kiónt, amely tartalmazta a pOS48.7-et, valamint egy kiónt, amely tartalmazta a plJ6021 plazmidot, 50 ml TSB (Tryptic Soy Broth, Difco) közegben tenyésztettünk 30 °C-on 72 órán keresztül 5 mg/l kanamiclnszelekcióval, majd tiosztreptont adtunk hozzá 5 mg/l koncentrációban, és a tenyésztést még 18 órán át folytattuk a leírt körülmények között (Hopwood et al., korábban idézve). A tenyészetet learattuk, és az aktivitás mérése, melyet a 4. példában leírt módon végeztünk, azt mutatja, hogy a S. lividans TK24(pOS48.7) törzs a TK24(plJ6021) törzzsel szemben kifejez nitrilázaktivitást.
9. példa
A HMTBN hidrolízise más nitrilázokkal
A Comamonas testosteronl sp. nitrilázának primer szekvenciája, melyet Lévy-Schill és munkatársai írtak le (korábban idézve), 31 %-os homológiát mutat a találmányban leírt nitriláz primer szekvenciájával. A rekombináns E. coli TG1(pXL2158, pXL2035) törzset, amely a C. testosteroni nitrilázát fejezi ki, a LévySchill és munkatársai (korábban idézve) által leírt körülmények között tenyésztettük, és a sejtes csapadékot 100 mM foszfátpufferben (pH=7) inkubáltuk 50 mM HMTBN-nel 30 °C-on. A mért aktivitás 2,3 kg/hkg száraz sejttömeg. Mint a találmány szerinti nitriláz, a C. testosteroni nitriláza is képes a HMTBN-t hidrolizálnl.
Ezenfelül a 4. példában a pBCAT12 és pBCAT13 plazmidok esetére bemutatott adatok azt mutatják, hogy az Asn279->Asp279 helyettesítés az A. faecalis ATCC8750 nitrilázán lehetővé teszi, hogy megőrizzük az aktivitást HMTBN-n.
10. példa
Hordozó hozzáadása g száraz sejtet adtunk 20 g pH=7-re beállított vízhez. Ezután hozzáadtuk a megadott hordozó mennyiséget (CELITE 545, Prolabo, Franciaország), és teljes homogenizálás után a szuszpenziót a teljes száraztömegre vonatkoztatva 15% glutáraldehid, majd 10% poli(etilén-imin) (SEDIPUR, BASF, Németország) hozzáadásával térhálósítottuk. A szuszpenziót szobahőmérsékleten kevertettük 1 órán át.
Ezután a szuszpenziót 0,001% anionos flokkulálószer, Superfloc A100 hozzáadásával kicsaptuk. A térhálósított masszát szűréssel gyűjtöttük össze.
A masszát azután a teljes száraztömegre vonatkoztatva 10% poliazetidin (KYMENE 557, Hercules, USA) hozzáadásával újból térhálósítottuk. A még nedves masszát azután 0,5 mm átmérőjű nyíláson keresztül extrudáltuk, és szárítottuk.
A kapott részecskék aktivitását a WO 96/09403 számú szabadalomban leírt eljárás szerint határoztuk meg.
| g Hordozó | Aktivitás (%-ban) |
| 0 | 100 |
| 2,5 g | 215 |
| 5g | 250 |
A hordozó hozzáadása a sejtekhez jelentősen javítja az aktivitást.
A kísérletet megismételtük úgy, hogy a CELITE-et búzagluténnel (Roquette, Franciaország) helyettesítettük, amely részlegesen oldható vízben, vagy zselatinnal (SBI, Franciaország) helyettesítettük, amely teljesen oldható vízben.
| Hordozó | % Aktivitás |
| 0 | 100 |
| 5 g glutén | 160 |
| 5 g zselatin | nd* |
• A sejtszuszpenzió nem csapódott ki, és nem szűrhető.
A példa azt mutatja, hogy a glutén helyettesítheti a CELITE-et. Ezzel ellentétben, ha zselatint (teljesen oldható) adtunk hozzá, a katalizátort nem tudtuk formulázni a korábban leírt módszerrel (extruzió).
11. példa
A 4. példa szerinti Escherichia coli BIOCAT171-ből 10 g-ot, melyet aerob tenyésztéssel állítottunk elő LB közegben, elegyítünk 10 g CLARCEL78-cal (CECA, Franciaország) 500 g 100 mM foszfátpufferben (pH=7). Homogenizálás után 6 g 25% glutáraldehidet adtunk hozzá,
HU 226 148 Β1 és a szuszpenziót 15 percig kevertettük szobahőmérsékleten. Ezután hozzáadtunk 2 g poli(etllén-imin)-t, valamint 6 g 25%-os glutáraldehidet. Az egészet kevertettük egy órán keresztül szobahőmérsékleten. Az elegyet 5 ml 2%-os SUPERFLOC A100 (CYTEC, Franciaország) hozzáadásával kicsaptuk. A masszát szűrtük, és a kapott szűrőpogácsát 16 g 12,5% poliazetidinnel (KYMENE 557, Hercules) elegyítettük, majd 0,5 mm átmérőjű nyíláson keresztül extrudáltuk. A kapott szálacskákat szárítókamrában 35 °C-on szárítottuk, majd 30 percre 50 mM borátpufferben (pH=10,0) készített 1%-os NaBH4 fürdőbe merítettük. Ezután a biokatalizátort mostuk desztillált vízzel. A katalizátort 5 °C-on vagy szobahőmérsékleten tároltuk 500 mM foszfátpufferben (pH=8,0).
cm belső átmérőjű, 45 cm magas termosztált oszlopot 100 g biokatalizátorral töltöttünk meg. Az oszlopot egy recirkulációs hurkon keresztül egy pumpához kötöttük. A reaktor össztérfogata 430 ml. A hurkot hidroximetil-tio-vajsav ammóniumsójának 25%-os oldatával töltöttük meg. Az oldatot az oszlop tetején tápláltuk be, 20 l/h átfolyási sebességgel. A víz, amely az oszlop kettős burkában és a hőcserélőben kering, lehetővé tette, hogy a hőmérsékletet 35 °C-on tartsuk. A hurokba 81 g/h sebességgel ionmentes vizet adagoltunk. A 2-hidroxi-4-metil-tio-butironitrilt 20 g/h sebességgel adagoltuk. A reakcióközeg többlettérfogatát az oszlop alján távolítottuk el úgy, hogy a hurok térfogata állandó maradjon, fgy folyamatos áramlást kaptunk 95%-os nitrilátalakítási aránnyal. Ezenfelül a 2-hidroxi-4-metil-tiovajsav ammóniumsója vizes oldatának koncentrációja a reaktor kimeneténél 25%.
12. példa
Az alkalmazott elektrodializátor 9 db 2 dm2 aktív felületű cella egymásutánjából állt, melyek mindegyike kettő, a következők szerinti kamrából állt:
- só/sav kamra: a katód oldaláról a Tokuyama Soda Neosepta CMB kationcserélő membránja határolta, az anód oldaláról egy Aqualytics bipoláris membrán kationos oldala,
- báziskamra.· az anód oldaláról a kationos membrán, a katód oldaláról a bipoláris membrán anionos oldala határolta.
Az anódot platinával bevont titán alkotta. A katód rozsdamentes acélból készült.
Az elektrolitot 40 °C-on 100 mS/cm vezetőképességü nátrium-szulfát vizes oldata alkotta. A keringés sebessége az elektródoknál 2*100 l/h. A térfogat 5 I.
A báziskamrát kezdetben 5 liter 1 %-os ammóniumszulfát-oldattal töltöttük fel.
A só/sav kamrát kezdetben 5 literrel töltöttük fel 2-hidroxi-4-metll-tio-vajsav ammóniumsójának 1,44 mol/l-es oldatából.
Az oldatok keringési sebességét kezdetben 130 l/h-ra állítottuk be a só/sav kamra esetében, és 190 l/h-ra a báziskamra esetében.
Az elektrodial ízist szakaszosan végeztük (recirkulációs működés), 40 °C-os átlaghőmérsékleten. Az áramerősséget 9 A-ra állítottuk be, azaz az áramsűrűség 0,45 kA/m2.
155 perc működés után a só/sav kamra vezetőképessége 59-ről 7,8 mS/cm-re változott.
A só/sav kamra 1,35 mol/l 2-hidroxi-4-metil-tiovajsavat tartalmazott, 100%-ban sav formájában.
A Faraday-hatásfokot 71%-ra becsültük, az energiafogyasztást 0,53 kWh képzett sav kg-onként.
13. példa
Az elektrodializátort 8, a 12. példa szerintivel azonos felépítésű cella alkotta.
A báziskamrát kezdetben 5,27 liter 1%-os ammónium-szulfát-oldattal töltöttük fel.
A só/sav kamrát kezdetben 4,85 literrel töltöttük fel 2-hidroxi-4-metil-tio-vajsav ammóniumsójának 1,39 mol/l-es oldatából.
Az oldatok recirkulációs sebességét kezdetben 60 l/h-ra állítottuk a só/sav kamra esetében, és 150 l/h-ra a báziskamra esetében.
Az elektrodial ízist szakaszos módon végeztük (recirkulációs működés), 40 °C-os átlaghőmérsékleten. Az áramerősséget 9 A-ra állítottuk be, azaz az áramsűrűség 0,45 kA/m2.
172 perc működés után a só/sav kamra vezetőképessége 59-ről 9,5 mS/cm-re változott.
A só/sav kamra végső térfogata 4,67 liter.
Az összetétel a következő:
2-hidroxi-4-metil-tio-vajsav: 1,24 mol/l, ammónlum-2-hidroxi-4-metil-tiobutirát: 0,148 mol/l.
Az átalakítás aránya 86%. A végső termék 89%ban sav formájában található.
A Faraday-hatásfok 74%. Az enerigafogyasztást 0,58 kWh-ra becsültük kialakult sav kg-onként.
14. példa
A 13. példához hasonló berendezést használtunk.
A báziskamrát kezdetben 5,23 liter 1%-os ammónium-szulfát-oldattal töltöttük fel.
A só/sav kamrát kezdetben 5,23 literrel töltöttük fel 2-hidroxi-4-metil-tio-vajsav ammóniumsójának 1,24 mol/l-es oldatából.
Az oldatok keringési sebessége kezdetben 90 l/h-ra van beállítva a só/sav kamra esetében, és 150 l/h-ra a báziskamra esetében.
Az elektrodialízist szakaszosan végezzük (recirkulációs működés), 40 °C-os átlaghőmérsékleten. Az áramerősséget 14 A-ra állítottuk be, azaz az áramsűrűség 0,7 kA/m2.
105 perc működés után a só/sav kamra vezetőképessége 57,6-ról 9,8 mS/cm-re változott.
A só/sav kamra végső összetétele a következő:
2-hidroxi-4-metil-tio-vajsav: 1,28 mol/l, ammónium-2-hidroxi-4-metil-tiobutirát: 0,14 mol/l.
A termék tehát 90%-ban sav formájában található.
15. példa
A 13. példához hasonló berendezést használunk.
A kísérletet a 14. példa végén kapott báziskamratartalommal végeztük.
HU 226 148 Β1
A só/sav kamrát kezdetben 5,2 literrel töltöttük fel 2-hidroxi-4-metil-tio-vajsav ammóniumsójának 1,44 mol/l-es oldatából.
Az oldatok recirkulációs sebességét kezdetben 50 l/h-ra állítottuk a só/sav kamra esetében, és 150 l/h-ra a báziskamra esetében.
Az elektrodialízist szakaszos módon végeztük (recirkulációs működés), 42 °C-os átlaghőmérsékleten. Az áramerősséget 19 A-ra állítottuk be, azaz az áramsűrűség 0,95 kA/m2.
perc működés után a só/sav kamra vezetőképessége 59-ről 27 mS/cm-re változott.
A só/sav kamra végső térfogata 4,85 liter.
Az összetétel a következő:
2-hidroxi-4-metil-tio-vajsav: 0,87 mol/l, ammónium-2-hidroxi-4-metil-tiobutirát: 0,56 mol/l.
Az átalakítás aránya 56%. A végső termék 61 %bán sav formájában található.
A Faraday-hatásfok 83%. Az energiafogyasztást 0,7 kWh-ra becsültük kialakult sav/kg-onként.
16. példa
200,1 g HMTBS-oldatot egy rotációs bepárlóban batchban koncentráltunk körülbelül 1,5 M-re. A fürdő hőmérséklete 45+5 °C. A környezet nyomását 2,5-103 Pa-ra állítottuk be (25 mbar). A forralóedényben a hőmérséklet a kezdeti 25 °C-ról végül 40 °C-ra nőtt. Három óra elteltével begyűjtöttünk 41,9 g sárga viszkózus anyagot, melynek jellemzői a következők:
| Viszkozitás 25 °C-on | 1150 |
| % HMTBA (Br/BrO3-) | 83,3 |
A titer beállítása után (oldás H2O-ban) a következő tulajdonságokkal rendelkező terméket kaptuk:
| Viszkozitás 25 °C-on (mm2-s~1) | 396 |
| % HMTBA (Br/BrO3-) | 79,5 |
Potenciometriával a következő tömegeloszlást kaptuk:
| % HMTBS | 81,6 |
| % HMTBA | 6,0 |
HPLC-vel mértük a monomer/(monomer+dimer) felületek vagy a dimer/(monomer+dimer) felületek arányát monomer/(monomer+dimer) 100 dimer/(monomer+dimer) (*) 0 (*) nem figyeltünk meg dimereket.
17. példa
200,1 g HMTBS-oldatot egy rotációs bepárlóban batchban koncentráltunk körülbelül 1,5 M-ra. A fürdő hőmérséklete 121±5 °C. A környezet nyomását 9,5-104 Pa-ra állítottuk be. A forralóedényben a hőmérséklet a kezdeti 100 °C-ról végül 113 °C-ra nőtt. Három óra elteltével begyűjtöttünk 41,5 g barna viszkózus anyagot, melynek jellemzői a következők:
| Viszkozitás 25 °C-on (mm2 s-1) | - |
| % HMTBA (Br/BrO3-) | 90,7 |
A titer beállítása után (oldás H2O-ban) a következő tulajdonságokkal rendelkező terméket kaptuk:
| Viszkozitás 25 °C-on (mm2-s-1) | 117 |
| % HMTBA (Br/BrO3~) | 78,8 |
Potenciometriával a következő tömegeloszlást kaptuk:
| % HMTBS | 52,2 |
| % HMTBA | 28,7 |
HPLC-vel mértük a monomer/(monomer+dimer) felületek vagy a dimer/(monomer+dimer) felületek arányát monomer/(monomer+dimer) 95 dimer/(monomer+dimer)(*) 5
18. példa
100,0 g a 17. példában leírt anyaghoz hozzáadtunk 40,0 g H2O-t. A közeget 75,0 g diizopropil-éterrel extraháltuk. A fázisok elválasztása után a szerves fázisban a lepárlás után 25,6 g HMTBA-t gyűjtöttünk össze, melynek jellemzői a következők:
| Meghatározás | |
| Monomer/(monomer+dimer) (% felület) | 97 |
| Dimer/(monomer+dimer) (% felület) | 3,0 |
| Viszkozitás 25 °C-on (mm2-s 1) | 55 |
19. példa
Az előző példákban leírt oldatok öregedése
| 16. példa | 17. példa | 18. példa | |
| Tárolási idő 25 °C-on | 40 nap | 40 nap | 100 nap |
| Viszkozitás 25 °C-on (mm2 s-1) | 387 | 116 | 66 |
| Dimer/(mono- mer+dimer) | 100,0 | 95,0 | 82 |
| Monomer/(mono- mer+dimer) | 0,0 | 5,0 | 18 |
A 16. és 17. példa szerinti oldatok dimertartalma 40 nap tárolás után nem nőtt.
Claims (23)
- SZABADALMI IGÉNYPONTOK1. Folyamatos eljárás 2-hldroxi-4-metil-tio-vajsav és/vagy 2-hidroxi-4-metil-tio-vajsav ammóniumsójának előállítására 2-hidroxi-4-metil-tio-butironitril iparilag alkalmazható enzimatikus hidrolízisével, azzal jellemezve, hogy:HU 226 148 Β1a) első lépésben előállítunk egy nitrilázaktivitással rendelkező biológiai anyagot,b) második lépésben ezt immobilizáljuk,c) harmadik lépésben a 2-hidroxi-4-metil-tiobutíronítrílt az így immobilizált biológiai anyaggal érintkezésbe hozva a 2-hidroxi-4-metil-tio-vajsav ammóniumsójává alakítjuk át,d) negyedik lépésben adott esetben a c) lépésben kapott sót átalakítjuk a megfelelő savvá, ése) ötödik lépésben a c) vagy a d) lépésben kapott terméket koncentráljuk.
- 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a nitrilázaktivitást egy Alcaligenesből, előnyösen Alcaligenes faeca/isból származó nitrilázból nyerjük.
- 3. Az 1. vagy a 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy egy nitrilázt kódoló genetikai információt alkalmazunk, melyet egy gazda-mikroorganizmusban fejezünk ki.
- 4. A 3. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a gazda-mikroorganizmust az Escherichia coli vagy a Bacillus, Corynebacterium, Streptomyces, Saccharomyces, Kluyveromyces, Penicillium és Aspergillus nemzetségek valamelyik tagja közül választjuk.
- 5. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a nitrilázaktivitást a CBS-nél CBS 998-96 számon letétbe helyezett pRPA-BCAT3 plazmidban klónozott gén által kódolt nitrilázból nyerjük.
- 6. A 3-5. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a nitrilázt egy chaperon fehérjével együtt fejezzük ki.
- 7. A 6. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a chaperon fehérje a GorESL E. coliban.
- 8. Az 1-7. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az a) lépés szerinti biológiai anyagot egy szilárd hordozón immobilizáljuk.
- 9. A 8. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a szilárd hordozó részecskemérete 1 pm és 3 mm, előnyösen 10 pm és 2 mm közötti, és azt a biológiai anyag tömegére számított 0,01-500%, előnyösen 10-200% mennyiségben adagoljuk.
- 10. A 9. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a szilárd hordozót:- ioncserélő gyanták,- alumínium-oxid,- szintetikus kovaföld vagy diatómaföld, és- szilikagélek,- zeolitok,- aktív szenek,- részlegesen vízoldható fehérjék és- poliszacharidok közül választjuk.
- 11. A 10. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy szilárd hordozóként glutént alkalmazunk.
- 12. A 8. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a biológiai anyag és a hordozó térhálósítására és/vagy oldhatatlanná tételére egy vagy több kémiai ágenst alkalmazunk.
- 13. A 12. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a kémiai ágenseket:- poliazetidinpolimerek,- poli(etilén-imin)-polimerek,- poliamidpolimerek,- izocianátpolimerek,- alginátgélek,- k-karragenán-gélek,- aminok,- aldehidek,- karbonsavak és- izocianátok közül választjuk.
- 14. A 10-13. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a biológiai anyagot és a hordozót kémiai ágensek jelenlétében olyan masszává keverjük, melyet extrudálunk, és utána megszárítunk.
- 15. A 10-13. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a biológiai anyagot és a kémiai ágenseket összekeverjük, és utána a hordozóra vékony réteg formájában visszük fel.
- 16. Az 1-15. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a megfelelő ammóniumsó elektrolitikus disszociációjával a 2-hidroxi-4-metil-tiovajsav ammóniumsójának és 2-hidroxi-4-metil-tiovajsavnak olyan elegyét kapjuk, amely legalább 60% 2-hidroxi-4-metil-tio-vajsavat, előnyösen legalább 80% 2-hidroxi-4-metil-tio-vajsavat tartalmaz, a fennmaradó rész pedig a 2-hidroxi-4-metil-tio-vajsav ammóniumsójából áll.
- 17. A 16. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a disszociációt egy háromkamrás, bipoláris membránnal rendelkező elektrodializátorban hajtjuk végre.
- 18. A 16. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a disszociációt egy kétkamrás, bipoláris membránnal rendelkező elektrodializátorban hajtjuk végre.
- 19. Az 1-15. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a 2-hidroxi-4-metil-tiovajsav ammóniumsójából és a 2-hidroxi-4-metil-tiovajsavból álló elegyet az ammóniumsó oldatának melegítésével kapjuk.
- 20. A 16-19. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a felszabaduló ammóniumhidroxidot ledesztilláljuk, koncentráljuk, és a HCN-szintézisbe visszavezetjük.
- 21. A 16-19. igénypontok bármelyike szerint kapott vizes oldat, amely 2-hidroxi-4-metil-tio-vajsav és 2-hidroxi-4-metil-tio-vajsav ammóniumsójának elegyét tartalmazza, amelynek sav/(sav+só) tömegaránya 5-99,9%, előnyösen 10-50%.
- 22. Berendezés a találmány szerinti eljárás kivitelezésére, amely tartalmaz:- egy vagy több reaktort (3,4), amely(ek) nitrilázaktivitással rendelkező immobilizált enzimekkel vagy nitrilázaktivitású enzimet kifejező immobilizált gazda-mikroorganizmusokkal vannak töltve;- adott esetben egy vagy több elektrodialíziseszközt (9);- eszközöket (6,12) a végtermék koncentrálására.
- 23. A pRPA-BCAT3 plazmid, amely a CBS-nél CBS 998-96 számon lett letétbe helyezve.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FR9613077A FR2755143B1 (fr) | 1996-10-25 | 1996-10-25 | Procede de preparation de l'acide 2-hydroxy-4-methylthio-butyrique par utilisation d'une nitrilase |
| PCT/FR1997/001913 WO1998018941A1 (fr) | 1996-10-25 | 1997-10-24 | Procede de preparation de l'acide 2-hydroxy 4-methylthio butyrique par utilisation d'une nitrilase |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| HUP9904513A2 HUP9904513A2 (hu) | 2000-05-28 |
| HUP9904513A3 HUP9904513A3 (en) | 2001-03-28 |
| HU226148B1 true HU226148B1 (en) | 2008-05-28 |
Family
ID=9497056
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| HU9904513A HU226148B1 (en) | 1996-10-25 | 1997-10-24 | Method for preparing 2-hydroxy 4-methylthio butyric acid using a nitrilase |
Country Status (21)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US6180359B1 (hu) |
| EP (2) | EP1411126B1 (hu) |
| JP (1) | JP4350801B2 (hu) |
| KR (1) | KR100557404B1 (hu) |
| CN (1) | CN1181204C (hu) |
| AT (2) | ATE345384T1 (hu) |
| AU (1) | AU738160B2 (hu) |
| BR (1) | BR9712558A (hu) |
| CA (1) | CA2268869A1 (hu) |
| CZ (1) | CZ298403B6 (hu) |
| DE (2) | DE69725999T2 (hu) |
| DK (2) | DK1411126T3 (hu) |
| ES (2) | ES2210504T3 (hu) |
| FR (1) | FR2755143B1 (hu) |
| HU (1) | HU226148B1 (hu) |
| IL (3) | IL129395A0 (hu) |
| NZ (1) | NZ335332A (hu) |
| PL (1) | PL190773B1 (hu) |
| PT (2) | PT934419E (hu) |
| RU (1) | RU2216594C2 (hu) |
| WO (1) | WO1998018941A1 (hu) |
Families Citing this family (22)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5905171A (en) | 1995-06-22 | 1999-05-18 | Novus International, Inc. | Process for the preparation of 3-(methylthio)propanal |
| JPH10179183A (ja) * | 1996-12-20 | 1998-07-07 | Daicel Chem Ind Ltd | カルボン酸の製造方法 |
| US6265201B1 (en) | 1997-01-17 | 2001-07-24 | Regents Of The University Of Minnesota | DNA molecules and protein displaying improved triazine compound degrading ability |
| FR2780416B1 (fr) * | 1998-06-10 | 2002-12-20 | Rhone Poulenc Nutrition Animal | Procede industriel de production de proteines heterologues chez e. coli et souches utiles pour le procede |
| FR2787121B1 (fr) * | 1998-12-11 | 2003-09-12 | Aventis Cropscience Sa | Nouvelle methode d'isolement et de selection de genes codant pour des enzymes, et milieu de culture approprie |
| FR2791668B1 (fr) * | 1999-04-02 | 2001-05-04 | Rhone Poulenc Animal Nutrition | Procede de preparation d' beta-hydroxy acides |
| US6368804B1 (en) * | 1999-07-12 | 2002-04-09 | E. I. Du Pont De Nemours & Company | Method for stabilizing nitrilase activity and preserving microbial cells |
| FR2800749B1 (fr) * | 1999-11-08 | 2004-07-16 | Rhone Poulenc Animal Nutrition | Procede de modulation de la selective des nitrilases, nouvelles nitrilases obtenues par ce procede et leur utilisation |
| US6673582B2 (en) | 2000-01-25 | 2004-01-06 | Regents Of The University Of Minnesota | Microbes and methods for remediation |
| EP1167521A1 (en) * | 2000-06-30 | 2002-01-02 | Aventis Animal Nutrition S.A. | Coated enzyme-containing catalyst |
| FR2824823A1 (fr) * | 2001-05-21 | 2002-11-22 | Aventis Animal Nutrition Sa | Procede de preparation d'acides carboxyliques aliphatiques par hydrolyse enzymatique de composes nitriles aliphatiques |
| JP4884863B2 (ja) * | 2006-07-18 | 2012-02-29 | 国立大学法人岐阜大学 | ニトリラーゼおよびニトリラーゼを用いるカルボン酸の製造方法 |
| WO2009013909A1 (ja) * | 2007-07-25 | 2009-01-29 | Nippon Soda Co., Ltd. | α－ヒドロキシ酸アンモニウム塩からのα－ヒドロキシ酸の製造方法 |
| EP2338987A1 (en) | 2009-11-16 | 2011-06-29 | ZYRUS Beteiligungsgesellschaft mbH & Co. Patente I KG | Whole cell biocatalyst |
| MX342139B (es) * | 2010-12-30 | 2016-09-14 | Metabolic Explorer Sa | Produccion fermentativa de analogo de hidroximetionina (mha). |
| CN102517274B (zh) * | 2011-12-13 | 2013-12-25 | 重庆大学 | 一种制备固定化腈水解酶的方法 |
| CN103933861B (zh) * | 2013-08-02 | 2017-04-26 | 浙江赛特膜技术有限公司 | 一种双极膜电渗析制备蛋氨酸和氢氧化钠的方法 |
| CN103497131B (zh) * | 2013-10-08 | 2015-05-13 | 重庆紫光化工股份有限公司 | 2-羟基-4-甲硫基丁酸金属螯合物的制备方法 |
| WO2017223172A1 (en) * | 2016-06-24 | 2017-12-28 | Novus International Inc. | Hydroxy methionine analog formulations suitable for specialty chemical applications |
| CN113274882B (zh) * | 2021-06-09 | 2022-05-17 | 温州大学新材料与产业技术研究院 | 基于高温双极膜电渗析的己二酸铵废液回收方法及其装置 |
| CN115975999B (zh) * | 2022-12-07 | 2025-06-03 | 万华化学集团股份有限公司 | 一种腈水解酶及其在2-羟基-4-甲硫基丁酸合成中的应用 |
| EP4600368A1 (en) | 2024-02-09 | 2025-08-13 | Adisseo France S.A.S. | A method for enzymatic production of an amide compound |
Family Cites Families (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5356385A (en) * | 1976-10-29 | 1978-05-22 | Ajinomoto Co Inc | Preparation of immobilized |
| US4732851A (en) * | 1982-03-16 | 1988-03-22 | Purification Engineering, Inc. | Immobilization of cells with a polyazetidine prepolymer |
| DK152764C (da) * | 1985-06-14 | 1988-10-03 | Novo Industri As | Fremgangsmaade til fremstilling af et immobiliseret enzymprodukt |
| DE3542861A1 (de) * | 1985-12-04 | 1987-06-11 | Huels Chemische Werke Ag | Verfahren zur gewinnung von l-aepfelsaeure |
| US4800162A (en) * | 1987-04-01 | 1989-01-24 | Sepracor, Inc. | Method for resolution of steroisomers in multiphase and extractive membrane reactors |
| DK589389D0 (da) * | 1989-11-23 | 1989-11-23 | Novo Nordisk As | Immobiliseret enzympraeparat |
| US5629190A (en) * | 1992-08-10 | 1997-05-13 | Rhone-Poulenc Chimie | Polypeptides possessing a nitrilase activity and method of converting nitriles to carboxylates by means of said polypeptides |
| DK0663010T3 (da) * | 1992-10-02 | 2000-11-13 | Res Corp Technologies Inc | Fremgangsmåde til forøgelse af sekretion af overudtrykte proteiner |
| HU220860B1 (en) * | 1994-09-22 | 2002-06-29 | Rhone Poulenc Nutrition Animal | Process for enzymatic hydrolysis of alpha-substituted 4-methyl-thiobutyronitriles |
| TW375594B (en) * | 1995-03-08 | 1999-12-01 | Daicel Chem | Process for producing a carboxylic acid |
-
1996
- 1996-10-25 FR FR9613077A patent/FR2755143B1/fr not_active Expired - Fee Related
-
1997
- 1997-10-24 DE DE69725999T patent/DE69725999T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1997-10-24 DE DE69736961T patent/DE69736961T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1997-10-24 PT PT97912254T patent/PT934419E/pt unknown
- 1997-10-24 ES ES97912254T patent/ES2210504T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1997-10-24 PT PT03078492T patent/PT1411126E/pt unknown
- 1997-10-24 AU AU49513/97A patent/AU738160B2/en not_active Ceased
- 1997-10-24 AT AT03078492T patent/ATE345384T1/de not_active IP Right Cessation
- 1997-10-24 CZ CZ0145499A patent/CZ298403B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1997-10-24 NZ NZ335332A patent/NZ335332A/xx unknown
- 1997-10-24 DK DK03078492T patent/DK1411126T3/da active
- 1997-10-24 EP EP03078492A patent/EP1411126B1/fr not_active Expired - Lifetime
- 1997-10-24 HU HU9904513A patent/HU226148B1/hu not_active IP Right Cessation
- 1997-10-24 RU RU99111763/13A patent/RU2216594C2/ru not_active IP Right Cessation
- 1997-10-24 WO PCT/FR1997/001913 patent/WO1998018941A1/fr not_active Ceased
- 1997-10-24 BR BR9712558-0A patent/BR9712558A/pt not_active Application Discontinuation
- 1997-10-24 CA CA002268869A patent/CA2268869A1/fr not_active Abandoned
- 1997-10-24 PL PL332958A patent/PL190773B1/pl unknown
- 1997-10-24 EP EP97912254A patent/EP0934419B1/fr not_active Expired - Lifetime
- 1997-10-24 JP JP52011298A patent/JP4350801B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1997-10-24 DK DK97912254T patent/DK0934419T3/da active
- 1997-10-24 IL IL12939597A patent/IL129395A0/xx active IP Right Grant
- 1997-10-24 CN CNB971990255A patent/CN1181204C/zh not_active Expired - Fee Related
- 1997-10-24 AT AT97912254T patent/ATE253638T1/de not_active IP Right Cessation
- 1997-10-24 ES ES03078492T patent/ES2277027T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1997-10-24 US US08/957,621 patent/US6180359B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1997-10-24 KR KR1019997003532A patent/KR100557404B1/ko not_active Expired - Fee Related
-
1999
- 1999-04-11 IL IL129395A patent/IL129395A/en not_active IP Right Cessation
-
2006
- 2006-01-26 IL IL173394A patent/IL173394A0/en unknown
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| HU226148B1 (en) | Method for preparing 2-hydroxy 4-methylthio butyric acid using a nitrilase | |
| JP3710497B2 (ja) | Ｄ−パント酸、ｄ−パントテン酸およびそれらの塩の製造法 | |
| JP4708677B2 (ja) | 微生物触媒を用いたアミド化合物の製造方法 | |
| JP3827420B2 (ja) | 微生物を用いたアミド化合物の製造方法 | |
| KR100323899B1 (ko) | 니트릴히드라타제의 활성에 관여하는 단백질 및 이것을 코딩하는 유전자 | |
| PT1412226E (pt) | Processo de isolamento acústico de um corpo oco como, por exemplo, uma parte da carroçaria de um veículo automóvel | |
| KR20000052815A (ko) | 디-아스파르트산의 제조방법 및 이의 제조를 위한 조성물 | |
| CN108239664B (zh) | 一种制备4-羟基-l-苏氨酸的工艺 | |
| WO2001053253A1 (en) | Method of purifying amide compound | |
| WO2002072841A1 (en) | Dna encoding hydantoinase, dna encoding n-carbamyl-l-amino acid hydrolase, recombinant dna, transformed cells, process for producing protein and process for producing optically active amino acid | |
| JP3768309B2 (ja) | Ｄ−α−アミノ酸の改良製造法 | |
| EP0261836A1 (en) | Immobilised enzyme preparation and its use | |
| KR100589121B1 (ko) | 효소반응을 이용한 ｌ-오르니틴의 제조방법 | |
| MXPA99003403A (en) | Method for preparing 2-hydroxy 4-methylthio butyric acid using a nitrilase | |
| HK1022170B (en) | Method for preparing 2-hydroxy 4-methylthio butyric acid using a nitrilase | |
| JP4709186B2 (ja) | 微生物触媒を用いたアミド化合物の製造方法 | |
| CN120888582A (zh) | 一种产l-左旋多巴的重组谷氨酸棒杆菌、其构建方法及应用 | |
| CN102348797A (zh) | 新表达载体 | |
| JP2007295933A (ja) | 微生物触媒を用いたアミド化合物の製造方法 | |
| HK1003230B (en) | Immobilised enzyme preparation and its use |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| FH91 | Appointment of a representative |
Free format text: FORMER REPRESENTATIVE(S): BELICZAY LASZLO, S.B.G. & K. BUDAPESTI NEMZETKOEZI SZABADALMI IRODA, HU Representative=s name: RATHONYI ZOLTAN, S.B.G. & K. SZABADALMI UEGYVI, HU |
|
| FH92 | Termination of representative |
Representative=s name: BELICZAY LASZLO, S.B.G. & K. BUDAPESTI NEMZETK, HU |
|
| MM4A | Lapse of definitive patent protection due to non-payment of fees |