HU226007B1 - Microballons filled with air or gas, coated with polymeric membrane, usable for diagnostic purposes, as well as process for producing same - Google Patents

Description

A találmány polimerrel burkolt, levegővel vagy gázzal töltött mikroballonokra vonatkozik, amelyek a következő lépésekkel állíthatók elő:

1) egy hidrofób szerves fázist vizes fázisban emulgeálunk, és ezáltal az említett vizes fázisban az említett hidrofób fázis cseppecskéiből „olaj a vízben emulziót képzünk;

2) az említett emulzióhoz a vizes fázisban oldhatatlan illékony oldószerben oldott legalább egy polimert adagolunk, és ezáltal a cseppecskék körül az említett polimerréteget alakítjuk ki;

3) az illékony oldószert eltávolítjuk, és ezáltal kiváltjuk a cseppecskékre határfelületi kicsapódással a polimer lerakódását, és az említett polimer membrán által kapszulázott említett hidrofób fázis magját tartalmazó buborékokat alakítunk ki, amely buborékok az említett vizes fázissal szuszpenziót alkotnak;

4) az említett szuszpenziót fagyasztva szárítás körülményeinek tesszük ki; ahol az említett hidrofób fázist úgy választjuk meg, hogy a vizes fázissal lényegében egyidejűleg párologjon el, és levegővel vagy gázzal cserélődjön ki, ily módon száraz, szabadon folyó, könnyen diszpergálható mikroballonokat kapunk;

5) ahol az említett polimert az említett hidrofób fázisban feloldhatjuk, így a 2) és 3) lépést elhagyhatjuk, és a polimer membrán a 4) lépés során határfelületi kicsapatással alakul ki.

A mikroballonok vizes közegben diszpergálva vagy szuszpendálva, élő szervezetbe orálisan, rektálisan, uretrálisan vagy injekció formájában adagolva, diagnosztikai célokra, mint például ultrahang-echográfíás képalkotásra használhatók.

A találmány tárgya továbbá eljárás fenti mikroballonok előállítására.

A találmány tárgyköréhez tartozik a fenti mikroballonokat tartalmazó, pácienseknek, diagnosztikai célra közvetlenül adagolható, stabil vizes szuszpenzió is.

Jól ismert, hogy folyadékban szuszpendált levegő vagy valamilyen gáz mikrotestei vagy mikrogömböcskéi, mint például mikrobuborékok vagy mikroballonok, az echográfiában különösen hatásos ultrahang-visszaverők. „Mikrobuborék” alatt vivőfolyadékban szuszpendált levegő- vagy gázmikrogömböket értünk, amelyek általában a vivőfolyadékban levegő vagy gáz diszpergálásával keletkeznek. A vivőfolyadék előnyösen felületaktív anyagokat vagy tenzideket is tartalmaz a buborékok felületi tulajdonságainak, illetve stabilitásának a szabályozására. A mikrobuborékokban a gáz-folyadék határfelület a vivőfolyadék lazán kötött molekuláiból áll. „Mikrokapszulák vagy „mikroballonok alatt valamilyen határolóanyaggal vagy burkolóanyaggal - amelynek molekulái nem azonosak a vivőfolyadék molekuláival -, mint például egy polimer membránfallal burkolt levegővagy gáztesteket értünk. Mind a mikrobuborékok, mind a mikroballonok hatásosan alkalmazhatók ultrahangos vizsgálat kontrasztanyagaként. Például gázmikrobuborékok vagy -mikroballonok (méret: 0,5-10 μτη) vivőfolyadékkal alkotott szuszpenzióját injekció formájában élő szervezetek véráramába juttatva, azok nagymértékben elősegítik az ultrahang-echográfiás képalkotást, és lehetővé teszik a belső szervek ultrahangos képi megjelenítését. Az anyagcsere- és keringési rendszerek elemeiről, valamint a belső szervekről kapott kép nagy segítség az orvosi diagnosztikában, mint például a kardiovaszkulárís és egyéb betegségek detektálásában. Az echográfiában használható injektálható vivőfolyadékmikrobuborék szuszpenziót a következő módokon állíthatjuk elő:

- folyadékban nyomás alatt feloldott gáz felszabadításával;

- gáz formájú terméket eredményező kémiai reakcióval;

- levegőt vagy gázt fogva tartó vagy felületén abszorbeáló, a vivőfolyadékban oldódó vagy oldhatatlan, szilárd anyag és folyadék összekeverésével.

Az US-A-4 466 442 (Schering) számú szabadalmi leírásban számos különböző eljárást ismertetnek sterilizált injekció formájában adagolható folyadékban mikrobuborékszuszpenziók előállítására, stabilizátorként (a) egy vivőfolyadékban (vizes) oldott tenzid- (felületaktív anyag) oldatot és (b) egy viszkozitást növelő anyag oldatát alkalmazva.

A buborékok előállítására az alábbi módszereket ismertetik: az (a) és (b) oldatok, valamint levegő keverékét egy kis nyíláson át nagy sebességgel átáramoltatják;

vagy használat előtt az (a) oldatot egy fiziológiailag megfelelő gázzal együtt a (b) oldatba fecskendezik;

vagy az (a) oldatba egy savat, a (b) oldatba egy karbonátvegyületet adagolnak, majd a két oldatot közvetlenül a használat előtt összekeverik; így a sav és a karbonátvegyület reakciójából szén-dioxid-buborékok képződnek;

vagy (a) és (b) oldatok elegyébe tárolás alatt túlnyomásos gázt vezetnek, mely gáz a befecskendezés alatt mikrobuborékok formájában szabadul fel.

A mikrobuborékok hátrányos tulajdonsága, még stabilizátorok jelenlétében is, hogy általában rövid élettartamúak. Az EP-A-131 540 (Schering) számú szabadalmi leírásban ismertetett eljárás szerint a mikrobuborékszuszpenziót úgy állítják elő, hogy egy stabilizált, injekció formájában adagolható vivőfolyadékot, mint például fiziológiailag megfelelő vizes sóoldatot, vagy cukrot, mint például maltóz, dextróz, laktóz és galaktóz oldatát ugyanezen cukrok szilárd, levegőt fogva tartó részecskéivel (0,1-1 pm) keverik össze. A vivőfolyadék-buborék szuszpenzió kialakítása céljából a folyadékot és a szilárd komponenst steril körülmények között néhány másodpercen át összekeverik. A kapott szuszpenziót azonnal fel kell használni, azaz az echográfiás méréshez 5-10 percen belül injekció formájában be kell adagolni. A buborékok rövid élettartama miatt az idő múlásával a buborékkoncentráció olyan kicsi lesz, hogy a szuszpenzió gyakorlatilag használhatatlanná válik.

A mikrobuborékok nem megfelelő mérete megakadályozza az echográfiai célokra történő használatukat. Közismert, hogy a kis vérereken könnyen átáramoltatható mikrobuborékok mérete 0,5-10 pm között van; a

HU 226 007 Β1 nagyobb buborékoknál fennáll az a veszély, hogy összetapadnak, rögöt képeznek, és ennek következtében embólia alakulhat ki. Például az US-A-4 466 442 (Schering) számú szabadalmi leírásban ismertetett buborékszuszpenziókban - amelyeket úgy állítanak elő, hogy felületaktív anyagok, mint például lecitin, zsírsavak és zsíralkoholok poli(oxi-etilén)-nel és poli(oxi-etilén)-nel kapcsolt poliolokkal, mint például szorbitollal, glikolokkal és glicerinnel alkotott észterei és éterei, koleszterin vagy poli(oxi-etilén)—poli(oxi-propilén) polimerek vizes oldatát alaposan összerázzák viszkozitásnövelő és stabilizálóvegyületek, mint például mono- és poliszacharidok (glukóz, laktóz, szacharóz, dextrán, szorbitol); poliolok, mint például glicerin, poliglikolok; és polipeptidek, mint például proteinek, zselatin, oxi-polizselatin és plazmaprotein oldatával - a mikrobuborékoknak csak 50%-a 40-50 μπη alatti, aminek következtében ezen szuszpenziók számos echográfiás felhasználásra alkalmatlanok.

Fenti hátrányok kiküszöbölése céljából fejlesztették ki az alábbiakban ismertetett mikrokapszulákat vagy mikroballonokat. Amint a fentiekben kifejtettük, a mikrobuborékoknak csak egy anyagtalan, gyorsan eltűnő burkolata van, azaz egy olyan folyadékfallal vannak körülvéve, amely folyadéknak a felületi feszültsége felületaktív anyagokkal van módosítva, míg a mikroballonoknak vagy mikrokapszuláknak valódi, a vivőanyagtól eltérő anyagú burkolatuk van, mint például meghatározott mechanikai szilárdsággal rendelkező polimer membrán, Másképpen kifejezve, ezek szilárd anyagú mikrogömbök, amelyekbe a levegő vagy gáz többé-kevésbé szorosan be van zárva.

Az US-A-4 276 885 (Tickner és társai) számú szabadalomban ultrahangkép kialakításában használható, gázt magába záró felületi membrános mikrokapszulákat ismertetnek. A membrán nem toxikus, nem antigén szerves molekulákból épül fel. A leírás szerint a mikrobuborékok a buborékok egybeolvadásának ellenálló zselatinmembránt tartalmaznak, és méretük előnyösen 5-10 pm. Ezeknek a mikrobuborékoknak a membránja az echográfiai mérésekhez megfelelően stabil, bár a leírás szerint egy idő múlva a bennük lévő gáz a véráramba beoldódik, és így a buborékok fokozatosan eltűnnek. A jelenséget valószínűleg a zselatin lassú feloldódása okozza. Használat előtt a mikrokapszulákat zselatinoldatban tárolják, a zselatint viszont az injekcióval történő adagolása előtt fel kell melegíteni és megolvasztani, hogy folyékonnyá váljon.

Az US-A-4 718 433 (Feinstein) számú szabadalmi leírásban zselatin nélküli, javított tárolási stabilitású mikrogömböket ismertetnek. A mikrogömböket viszkózus proteinoldatok, mint például 5 tömeg%-os szérumalbumin ultrahangos kezelésével (530 kHz) állítják elő. A mikrogömbök átmérője 2-20 pm, előnyösen 2-4 pm. Az ultrahangos kezelés után a membránt képző protein denaturálásával stabilizálják a mikrogömböket. A denaturálást például kémiai módszerrel, mint például formaldehiddel vagy glutáraldehiddel történő reagáltatással végzik. Az ily módon kapott stabil mikrogömbök koncentrációja a 2-4 pm méretnél körülbelül 8*10® gömb/ml; a 4-5 pm-nél körülbelül 10® gömb/ml és az 5-6 pm méretnél kisebb, mint 5*10® gömb/ml. Ezek a mikrogömbök 48 órán át vagy még hosszabb időn át is stabilak, és intravénás injekcióval történő bevitel után segítségükkel a bal szívkamráról megfelelő képet kapnak. Például ha albumin ultrahangos kezelésével kapott mikrobuborékokat egy perifériás érbe injekcióznak, azok képesek a pulmonáris rendszeren áthaladni. Ez a bal kamra üreg, valamint a szívizomszövetek echokardiografikus opálosodását eredményezi. Hátrányos, hogy a proteinmembrán denaturálásával tömör, porozitásmentes membránt kapnak, valamint az, hogy a páciensek proteinekre (például albuminra) érzékenysége esetén a készítmény nem alkalmazható.

Az EP-A-324 938 (Vidder) számú szabadalmi leírásban ultrahang-echográfiás vizsgálathoz használható olyan javított tulajdonságú mikroballonokat tartalmazó injekció formájában adagolható oldatokat ismertetnek, amelyekben 10 pm-nél kisebb méretű, levegővel töltött proteinnel burkolt mikrogömbök koncentrációja nagy (nagyobb, mint 10® gömb/ml), és a mikrogömbök élettartama néhány hónap vagy még több. Ezen mikroballonok vizes szuszpenzióját denaturált proteinoldatok, mint például humán szérumalbimun ultrahangos kavitációjával állítják elő. Hátrányos, hogy az előállítás során a membránképző proteinek bizonyos mértékű habosodása és a hab hő hatására bekövetkező keményedése is végbemegy. Az eljárásban egyéb proteinek, mint például hemoglobin vagy kollagén is használhatók.

M. A. Wheatley és társai, a Biomaterials 11 (1990), 713-717 oldal, irodalmi helyen alginát ionotropikus gélesítésével polimer bevonatú mikrogömbök előállítását ismertetik. A szerzők számos módszert ismertetnek a mikrokapszulák előállítására. Az egyik eljárás szerint egy légfúvókában egy tűn keresztül alginátoldatot hajtanak át, ily módon naszcensz levegővel töltött kapszulák permetjét kapják. A kapszulákat 1,2 tömeg%-os vizes kalclum-klorld-oldatban keményítik.

Egy másik módszer szerint egy hármas osztású fej alkalmazásával gázbuborékokat juttatnak az éppen kialakuló kapszulákba, azaz a levegőt egy központi kapillárison átfúvatják, mialatt az alginátoldatot a kapillárist koaxiálisán körülvevő vastagabb csőben hajtják keresztül, és az ezt a csövet körülvevő köpenybe pedig steril levegőt folyatnak. Egy harmadik eljárás szerint is a permetképzés előtt gázt zárnak alginátoldatba homogenizátor vagy ultrahangos kezelés alkalmazásával. Az ily módon előállított mikroballonok átmérője 30-100 pm közötti, mely méret meghaladja azt a nagyságot, amely a tüdőkapilláriákba történő bejuttatáshoz megfelelő.

Az EP-A-324 938 számú szabadalmi leírásban tárolás folyamán stabil mikroballonszuszpenziókat ismertetnek. Ezek a készítmények a folyékony vivőfázist már tartalmazzák, ami előnyös, hiszen a használat előtt nem kell a szuszpenziót külön elkészíteni. Hátrányos viszont, hogy a bennük lévő protein érzékenyebb páciensek esetében allergiás reakciót válthat ki. A membránanyag rendkívül nagy erőssége és stabilitása is hát3

HU 226 007 Β1 rányos, mivel például a membránok ridegségük miatt nem bírják ki a hirtelen nyomásváltozást, aminek akkor vannak kitéve, amikor a mikrogömbök a véráramban közlekednek, ahol a szívverés nyomásváltozást okoz. így az ultrahangvizsgálatoknál a mikrogömbök egy része szétpattan, ami a kép reprodukálását lehetetlenné teszi. A fenti mikroballonok orális adagolásnál sem használhatók, mivel a gastrointestinalis szervekben jelen lévő emésztőenzimekkel szemben nem rezisztensek. Fentieken kívül a membránok merevsége azért is hátrányos, mert ismert az is, hogy a rugalmas fallal rendelkező mikrogömbök hangvisszaverése jobb, mint a merev falú mikrogömböké. Injekciós adagolásnál továbbá hátrányos, hogy a mikrogömbök falát alkotó anyag túl nagy stabilitása következtében lassú a szervezetben a vizsgálat alatti biodegradációs folyamat, ami anyagcsere-problémákat okozhat. így sokkal célszerűbb lágy és elasztikus membránnal - mely a nyomásváltozást átmeneti deformálódással tudja követni, és rendelkezik a fokozott ultrahang-visszaverő tulajdonsággal (echogenitás) - burkolt nyomásálló mikroballonokat kifejleszteni. Az is látható, hogy célszerű olyan mikroballonokat kifejleszteni, amelyeknek biológiai úton történő lebomlása, az emésztőrendszerben való lebomlás kivételével, szabályozható, így például faluk a biológiai folyadékok lassú penetrációját biztosító szabályozott mikroporozitású féligáteresztő biológiai úton lebontható polimerekből készül.

Az EP-A-123235 (Hilmann és munkatársai) számú szabadalmi leírásban cukrokkal, cukoralkoholokkal, sókkal és szilárd felületaktív anyagokkal, mint például lecitinnel, poli(oxi-etilén)—poli(oxi-propilén)-nel, zsírsavakkal stb. stabilizált gázmikrobuborékok szuszpenzióját tartalmazó kontrasztanyagot ismertetnek. A leírásban arra tanítanak, hogy a cukrok, cukoralkoholok és sók stabilizálóhatását felületaktív anyagok hozzáadásával lehet növelni. A leírásban olyan ultrahang-kontrasztanyagot írnak le, amely félig szilárd vagy folyadék felületaktív anyag mikrorészecskékből, egy szilárd nem felületaktív anyagból és gázmikrobuborékokból álló keveréket tartalmaz. Az ismertetett mikrorészecskék glicerinből, polietilénglikol-származékokból, lecitinből, zsírsavakból, zsíralkoholokból, ciklodextrinből, mono-, di- és triszacharidból, galaktózból, laktózból stb. készülnek. A mikrobuborékokat a mikrorészecskék stabilizálják. Hátrányos, hogy a mikrobuborékok rövid élettartamúak, a kezdeti buborékszám rosszul reprodukálható, és a mikrobuborékok kezdeti koncentrációja alacsony.

A WO 89/06978 (Stein és munkatársai) számú szabadalmi leírásban amilózt vagy szintetikus biológiailag lebontható polimert és egy 60 °C alatti forráspontú gázés/vagy folyadékot tartalmazó mikrorészecskékből álló ultrahang-kontrasztanyagot, a mikrorészecskék előállítására szolgáló eljárást és ezeknek diagnosztikai vagy terápiás anyagokként való használatát ismertetik. A leírás nem ad azonban kitanítást adott méretű és azonos szerkezetű mikroballonok készítésére, hiszen porózus, utólagos őrléssel beállítható méretű mikrorészecskék előállítását tárgyalja. Hátrányos továbbá, hogy a készítmény echogenicitása gyenge.

A DE 4004430 (Albayrak és munkatársai) számú szabadalmi leírásban polimerizálható aldehidekből (mint a poliakrolein vagy az akrolein) felépített biológiailag lebontható polimerekből álló mikrorészecskéket ismertetnek. A leírás szerinti mikrorészecskék nem gömb alakú, homogén és üreges mikroballonok, hanem inkább „mikroszivacsos” szerkezetű mikrorészecskék, így az echogenicitásuk gyengébb. Poliakrolein vagy akrolein használata továbbá toxikus is lehet.

Az US 4438239 (Rembaum és munkatársai) számú szabadalmi leírásban egymáshoz illeszkedő, érintőleges, különálló és azonos, előnyösen 10-200 nm átmérőjű mikrogömbökből álló réteggel borított szintetikus szerves gyantát ismertetnek. A mikrogömbök egy 4-20 szénatomos telítetlen aldehid addíciós polimerizációval készült polimerek, melyek a szubsztráthoz kovalensen vannak kötve nagy energiájú sugárzással történő ojtással. A mikrorészecskék nem gömb alakú, homogén és üreges mikroballonok, hanem inkább „mikroszivacsos” szerkezetű mikrorészecskék, így az echogenicitásuk gyengébb. Az említett mikrorészecskék továbbá nem alkalmasak kontrasztanyagnak, ugyanis a mikrogömbök a hordozóhoz vannak kötve.

Célul tűztük ki, hogy a fenti hátrányos tulajdonságoktól mentes, a fent felsorolt előnyökkel rendelkező mikroballonokat dolgozzunk ki.

A találmány tárgya levegővel vagy gázzal töltött polimer membránt tartalmazó mikronos vagy szubmikronos mikroballonok, amelyek folyékony vivőanyagban szuszpendálva, humán vagy állati szervezetbe adagolva diagnosztikai célokra, előnyösen ultrahangechográfiás képalkotásra használhatók, és amelyeknek a membránját alkotó polimer szintetikus, deformálható, rugalmas és határfelületre lerakódni képes polimer, amelyek a következő lépésekkel állíthatók elő:

1) egy hidrofób szerves fázist vizes fázisban emulgeálunk, és ezáltal az említett vizes fázisban az említett hidrofób fázis cseppecskéiből „olaj a vízben” emulziót képzünk;

2) az említett emulzióhoz a vizes fázisban oldhatatlan illékony oldószerben oldott legalább egy polimert adagolunk, és ezáltal a cseppecskék körül az említett polimerréteget alakítjuk ki;

3) az illékony oldószert eltávolítjuk, és ezáltal kiváltjuk a cseppecskékre határfelületi kicsapódással a polimer lerakódását, és az említett polimer membrán által kapszulázott említett hidrofób fázis magját tartalmazó buborékokat alakítunk ki, amely buborékok az említett vizes fázissal szuszpenziót alkotnak;

4) az említett szuszpenziót fagyasztva szárítás körülményeinek tesszük ki; ahol az említett hidrofób fázist úgy választjuk meg, hogy a vizes fázissal lényegében egyidejűleg párologjon el, és levegővel vagy gázzal cserélődjön ki, ily módon száraz, szabadon folyó, könnyen diszpergálható mikroballonokat kapunk;

5) ahol az említett polimert az említett hidrofób fázisban feloldhatjuk, így a 2) és 3) lépést elhagyhatjuk, és a polimer membrán a 4) lépés során határfelületi kicsapatással alakul ki.

HU 226 007 Β1

A találmány szerinti mikroballonok száraz, különálló, a folyékony vivőanyaggal összekeverve azonnal diszpergálódó ballonok.

Bár a találmány szerinti mikroballonokat bizonyos polimerek alkalmazásával általában viszonylag rövid élettartamúra, azaz biológiai úton lebonthatóvá készítjük, hogy az alkalmazásuknál anyagcsere-problémák ne lépjenek fel, ez a tulajdonság (amit az előállítási paraméterekkel lehet szabályozni) nem jelent kereskedelmi hátrányt, mivel a mikroballonok gyakorlatilag korlátlan ideig tárolhatók, és szárazon szállíthatók a stabilitásukat biztosító körülmények között, de készíthetünk olyan membránokat is, amelyek a vivőfolyadéknak ellenállnak, és így lebomlásuk csak az injekció formájában történt bevitel után indul be.

Az első esetben a száraz por formájú mikroballonokat a használat előtt egyszerűen egy vizes vivőfázis megfelelő részével, mely részt a szükségletnek megfelelően kell megválasztani, kell összekeverni. Ez további előny a technika állásából eddig ismert termékekkel szemben, mivel a koncentrációt a szükségletnek megfelelően lehet megválasztani. így a kezdeti koncentráció meghaladhatja a fentiekben említett 10® gömb/ml értéket, azaz 10⁵—10¹° gömb/ml tartományban lehet. Előnyös az is, hogy a találmány szerinti eljárással a porozitás mértékét széles tartományban állíthatjuk be, így a találmány szerinti eljárással a vivőfolyadéknak ellenálló membránburkolatú mikroballonokat lehet előállítani.

A technika állásából ismertek folyadékkal töltött polimer membrán határfelületű mikrogömbök [K. Unó és munkatársai, J. Microencapsulation 1. kötet, 1. szám, 3-8. oldal (1984)]. Ezeket úgy állítják elő, hogy egy első vizes fázist polimer szerves oldatában emulgeálják, ezáltal a vizes fázist cseppekké alakítják (a cseppek mérete az emulgeálás paramétereitől függ), majd az így kapott emulziót egy második vizes fázisban diszpergálják, és ezt követően a szerves oldószert evaporálják. Az illő szerves oldószer evaporációja folyamán a polimer a cseppek határfelületére rakódik, ott mikroporózus membránt alkotva, amely hatásosan elhatárolja magába kapszulázva az első vizes fázist az őt körülvevő második vizes fázistól.

A találmány szerinti mikroballonokat ily módon is előállíthatjuk, mindazonáltal ez az eljárás nem tartozik a találmány szerinti előnyös eljárások körébe.

Egy másik eljárás szerint egy hidrofób fázist egy vizes fázisban (amely általában emulzióstabilizátorként egy viszkozitásnövelő szert tartalmaz) egy emulgeálószer segítségével emulgeálnak, ily módon a hidrofób fázis cseppjeit „olaj a vízben” típusú emulzió formájában kapják, majd az emulzióba vízzel nem elegyedő illékony szerves oldószerben oldva beadagolják a membránképző polimert.

Ha a polimer a hidrofób fázisban oldhatatlan, a cseppek és a víz közötti határfelületen rakódik le. Az illékony szerves oldószer elpárologtatósával az emulgeált hidrofób fázis cseppjeinek határfelületén membrán alakul ki. A bekapszulázott illékony hidrofób fázis ezt követő elpárologtatósával a határfelületen lerakodott polimer membránnal körülvett vízzel töltött mikrogömbök alakulnak ki. Ezt a módszert, melyet a találmányunk szerinti előnyös eljárásban alkalmazunk, az alábbi irodalmi helyeken ismertetik: K. Unó és társai a J. Microencapsulation 1 (1984) 3-8. oldal és K. Makino és társai, Chem. Pharm. Bull. 33 (1985) 1195-1201. oldal. Az eljárásban a cseppek méretét az emulgeálás paramétereivel, mint például az emulgeálószer megválasztásával (minél hatásosabb a felületaktív anyag, azaz nagyobb a hidrofil fázis/liofil fázis egyensúlyi érték, annál kisebbek a cseppek), és a keverési körülmények megválasztásával (minél gyorsabb és minél energikusabb a keverés, annál kisebbek a cseppek) lehet szabályozni.

Egy másik eljárásváltozat szerint a határfelületi falat képző polimert magában a kiindulási hidrofób fázisban oldják fel, majd a kapott oldatot a vizes fázisban cseppekké emulgeálják. A bekapszulázott hidrofób fázis elpárologtatósa után a cseppek körül membrán alakul ki. Példaként említjük J. R. Farnand és társai által, Powder Technology 22 (1978) 11-16. oldalon ismertetett eljárást, melyben egy polimer (mint például polietilén) naftalinos oldatát forró vízben emulgeálják, az emulzió lehűtése után a polimerrel burkolt naftalinmikrocseppek a hideg vízzel szuszpenziót alkotnak. Ezután a mikrocseppekből a naftalint szublimálják. így 25 μιτι átmérőjű mikroballonokat kapnak. Az EP-A-274 961 (H. Fessi) számú szabadalmi leírásban kinyilvánított eljárás szerint egy illékony hidrofób szerves oldószert és egy vízoldható szerves oldószert tartalmazó hidrofób elegyben egy polimert oldanak fel, majd az így kapott polimeroldatot egy emulgeálószer alkalmazásával vizes fázisban emulgeálják. A folyamat alatt a vízoldható oldószer a vizes fázisban diszpergálódik, és így elősegíti a hidrofób fázis mikrocseppecskéinek emulzióképződését és a polimer kicsapódását a határfelületen.

A fent említett eljárásokat alkalmassá tehetjük ultrahangkép kialakítására használható, levegővel vagy gázzal töltött mikroballonok előállítására oly módon, hogy megfelelő körülményeket alkalmazunk a gömbök méretének szabályozására, a membrán permeabilitásának vagy átjárhatatlanságának biztosítására, valamint a bekapszulázott folyadékfázis levegővel vagy egy megfelelő gázzal történő helyettesítésére.

A mikroballonszuszpenzió adagolási módjától függően - például injekció formájában történő bevitel vagy orális adagolás - kell megválasztani a mikroballonok méretét. Az injekció formájában történő bevitelnél, amint a fentiekben tárgyaltuk, a mikroballonok átlagos méretének 0,5-10 μιτι között kell lenni. Orális adagolásnál ez a tartomány szélesebb lehet, tekintve, hogy az ultrahang-visszaverődés nagyobb a nagyobb méretű mikroballonok esetében. így a mikroballonok átlagos mérete 1-1000 μιτι között is lehet a szükséglettől függően, feltéve, hogy a membrán megfelelően rugalmas, hogy a gyomorban és a belekben történő áthaladásnál ne törjön össze. A burkolómembrán permeabilitásának szabályozása azért fontos, hogy az injekcióval történő bevitelnél a vizes vivőfázis beszűrődése egyáltalán ne történjen meg, vagy olyan lassú legyen, hogy ne rontsa az echografikus mérések minőségét, de mindenesetre

HU 226 007 Β1 elegendő sebességű legyen ahhoz, hogy biztosítsa a vizsgálat utáni viszonylag gyors biológiai lebomlást, azaz az élő szervezet gyorsan metabolizálni tudja. A mikroballonburkoló anyagok mikroporózus szerkezete (50-500 nm vastagságú mikroballonburkoló membránok esetében néhány nm-től néhány száz nm vagy még ennél nagyobb pórusok) a rugalmasság mértéke, mely rugalmasság azt jelenti, hogy a mikrogömbök roncsolódás nélkül ellenállnak a nyomásváltozásoknak. A pórusméret előnyösen 50-2000 nm közötti.

Ezeknek a követelményeknek megfelelő mikroballonokat a találmány szerinti eljárással úgy állíthatjuk elő, hogy

1) egy hidrofób szerves fázist vizes fázisban emulgeálunk, és ezáltal az említett vizes fázisban az említett hidrofób fázis cseppecskéiből „olaj a vízben” emulziót képezünk;

2) az említett emulzióhoz a vizes fázisban oldhatatlan illékony oldószerben oldott legalább egy polimert adagolunk, és ezáltal a cseppecskék körül az említett polimerréteget alakítjuk ki;

3) az illékony oldószert eltávolítjuk, és ezáltal kiváltjuk a cseppecskékre határfelületi kicsapódással a polimer lerakódását, és az említett polimer membrán által kapszulázott említett hidrofób fázis magját tartalmazó buborékokat alakítunk ki, amely buborékok az említett vizes fázissal szuszpenziót alkotnak;

4) az említett szuszpenziót csökkentett nyomásnak tesszük ki az említett kapszulázott hidrofób fázis elpárologtatósához szükséges körülmények mellett;

ahol a hidrofób fázist úgy választjuk meg, hogy a vizes fázissal lényegében egyidejűleg párologjon el, és levegővel vagy gázzal cserélődjön ki, ily módon száraz, szabadon folyó, könnyen diszpergálható mikroballonokat kapunk.

A találmány szerinti eljárás egy megvalósítási módjánál a hidrofób fázisba egy vízoldható oldószert is adagolunk, mely a vizes fázisban történő emulgeálás alatt a cseppek méretének csökkentését segíti elő.

A találmány szerinti eljárás egy másik megvalósítási módjánál a polimert a hidrofób fázisban feloldva alkalmazzuk, és a polimer membránt a 2) és 3) lépés elhagyásával a 4) lépés alkalmazásával határfelületi kicsapatással alakítjuk ki.

Az egyik tényező, amivel a mikroballonok membránjának permeabilitását szabályozni lehet, az eljárás negyedik lépésében a hidrofób fázis és a víz elpárologtatási sebességének a viszonya, például fagyasztva szárításnak megfelelő körülmények között. Így például ha az elpárologtatást -40 °C és 0 °C közötti hőmérsékleten végezzük, és hidrofób fázisként hexánt, a határfelületen lerakodott polimerként polisztirolt alkalmazunk, akkor viszonylag nagy pórusokat tartalmazó membránnal borított mikroballonokat kapunk. Ennek az az oka, hogy a választott hőmérséklet-tartományban a szénhidrogén gőznyomása sokkal nagyobb, mint a vízé, ami azt eredményezi, hogy a gömbökön belül és kívül lévő nyomáskülönbség miatt a gömbmembránban lévő pórusok - amin át a belül lévő anyag elpárolog - mérete növekszik.

Ezzel ellentétben hidrofób fázisként ciklooktánt használva (-17 °C-on a gőznyomása a vízével megegyező) nagyon szűk pórusokat kapunk, mivel az elpárologtatós alatt a gömbökön belül és kívül lévő nyomás különbsége nagyon kicsi.

A találmány szerinti mikroballonok, a membrán porozitásának mértékétől függően, a vizes vivőfolyadékban néhány órától néhány hónapon át stabilak lehetnek, és hosszú időn át reprodukálható echografikus jelzést adnak. Valójában a polimer kiválasztásával a mikroballonok membránját alapvetően át nem eresztővé is készíthetjük, a szuszpenziókészítéshez használt, megfelelő ozmotikus tulajdonságokkal rendelkező - azaz az oldott anyagot megfelelő koncentrációban tartalmazó - vizes vivőfolyadék számára. Megjegyezzük, hogy a találmány szerinti mikroballonok burkolatában a mikropórusok jelenléte kapcsolatban van az echografikus válasszal, azaz ha az összes egyéb tényező állandó, a mikroporózus membránnal burkolt mikroballonok sokkal hatásosabb echografikus jelzést szolgáltatnak, mint a megfelelő nem porózus membránnal burkoltak. Ennek az oka jelenleg még nem ismert, de lehetségesnek tartjuk, hogy ha egy zárt térben lévő gáz rezonál, a zárt tér csillapítóhatása eltérő lehet a porózus vagy nem porózus szerkezet esetében.

A találmány szerinti eljárásban hidrofób oldószerként a hexánon kívül egyéb olyan vízben nem oldódó szerves oldószereket is alkalmazhatunk, amelyeknek gőznyomása -40 °C és 0 °C között ugyanabban a nagyságrendben van. Ilyen oldószerek például az n-oktán, ciklooktán, dimetil-ciklohexánok, etil-ciklohexán, 2-, 3- és 4-metil-heptán, 3-etil-hexán, toluol, xilol, 2-metil-2-heptán, 2,2,3,3-tetrametil-bután. Észterek, mint például vajsav- és izovajsav-propil-észter és -izopropil-észter, valamint hangyasav-butil-észter is alkalmazható. A fagyasztva szárítás további előnye, hogy a levegő helyett egy gázt alkalmazva gázzal töltött mikroballonokat lehet előállítani. Fiziológiailag megfelelő gázok például a következők lehetnek: széndioxid, dinitrogén-oxid, metán, freon, hélium vagy egyéb nemesgázok. Radioaktív nyomjelzett gázokat is lehet esetenként alkalmazni. A találmány szerinti eljárásban a határfelületre kicsapódó polimer oldására vízben oldhatatlan illékony oldószerként használhatunk például halogénvegyületeket, mint például szén-tetrakloridot, metil-bromidot, metilén-kloridot, kloroformot, freont, alacsony forráspontú észtereket, mint például metil-, etil- és propil-acetátot, valamint kis szénatomszámú és vízben kis oldhatóságú étereket és ketonokat. Abban az esetben, ha olyan oldószert alkalmazunk, amelyik vízben nem teljes mértékben oldhatatlan, mint például a dietil-éter, előnyös, ha a vizes fázist a használat előtt az említett oldószerrel telítjük.

A vizes fázis, amelyben a hidrofób fázist emulgeáljuk „olaj a vízben” emulzió előállítására, előnyösen tartalmazhat stabilizátorként 1-20 tömeg% vízoldható hidrofil vegyületet, mint például cukrokat és polimereket, mint például poli(vinil-alkohol) (PVA), poli(vinil-pirrolidon) (PVP) polietilénglikol (PEG), zselatin, poliglutaminsav, albumin, és poliszacharidok, mint például ke6

HU 226 007 Β1 ményítő, dextrán, agar vagy xantán. Hasonló vizes fázisok alkalmazhatók vivőfolyadékként a felhasználás előtt a mikroballonok szuszpendálására.

Ezen vfzoldható polimerek egy része a mikroballonok burkolatában maradhat, vagy a buborékok mosásával ezeket eltávolíthatjuk, mielőtt a bekapszulázott hidrofób fázist elpárologtatjuk.

A hidrofób szerves fázisnak a vizes fázisban történő emulgeálásához, vagyis az „olaj a vízben emulzió előállításához emulgeálószerként (0,1-5 tömeg%) a legtöbb fiziológiailag megfelelő emulgeálószert alkalmazhatjuk. Példaként említjük meg a következő emulgeálószereket: tojáslecitin vagy szójabablecitin, vagy szintetikus lecitinek, mint például telített szintetikus lecitinek, úgymint dimirisztoil-foszfatidil-kolin, dipalmitoilfoszfatidil-kolin vagy disztearoil-foszfatidil-kolin; vagy telítetlen szintetikus lecitinek, mint például dioleil-foszfatidil-kolin vagy dilinoleil-foszfatidil-kolin. Emulgeálószerként alkalmazhatunk felületaktív anyagokat, mint például szabad zsírsavakat, zsírsavak poli(oxi-alkilén)vegyületekkei, mint például poli(oxi-propilén)-glikollal, poli(oxi-etilén)-glikollal alkotott észtereit; zsíralkoholok poli(oxi-alkilén)-glikollal alkotott étereit; zsírsavak polioxi-alkilezett szorbitánnal alkotott észtereit; glicerinpolialkilén-sztearátot; glicerin-poli(oxi-etilén)-ricinoleátot; polialkilénglikolok homo- és kopolimerjeit; polietoxilezett szójaolajat és kasztorolajat, valamint ezek hidrogénezett származékait; szacharózt vagy egyéb szénhidrátok zsírsavakkal alkotott étereit vagy észtereit, zsíralkoholokat, vagy ezek adott esetben polioxi-alkilezett származékait; telítetlen zsírsavak mono-, divagy trigliceridjeit; glicerideket vagy szójaolajat és szacharózt.

Injekció formájában történő bevitelre alkalmas mikroballonok burkolatát vagy határolómembránját alkotó polimer hidrofil, biológiai úton lebontható, fiziológiailag megfelelő polimer lehet, mint például vízben gyengén oldódó poliszacharídok, polilaktidok és poliglikolidok, vagy ezek kopolimerjei, laktidok és laktonok, mint például ε-kaprolakton, δ-valerolakton, kopolimerjei, polipeptidek, vagy proteinek, mint például zselatin, kollagén, globulinok és albuminok. A találmány szerinti mikroballonok vagy mikrokapszulák előnye, hogy burkolatuk sokféle szintetikus polimer lehet, és így elkerülhető például allergiára hajlamos páciensek esetében a természetes proteinek (albumin, zselatin), mint például az US-A-4 276 885 és EP-A-324 938 számú szabadalomban ismertetett eljárásban alkalmazott burkolatok használata. Membránt alkotó polimerként poliortoészterek (mint például az US-A-4 093 709; US-A-4 131 648; US-A-4 138 344; US-A-4 180 646); poli(2-hidroxi-propánsav) és poliglikolsav, vagy ezek kopolimerjei, mint például DEXON [lásd J. Heller Biomaterials 1 (1980), 51. oldal], poli(DLlaktid-ko-5-kaprolakton), poli(DL-laktid-ko-5-valerolakton), poli(DL-laktld-ko-y-butirolakton), poli(alkil-cianoakrilát)-ok; poliamidok, poli(hidroxi-butirát); polidioxanon; poli(p-amino-ketonok) [Polymer 23 (1982), 1693. oldal]; polifoszfazének [Science 193 (1976), 1214. oldal]; és polianhidridek is alkalmazhatók. Biológiai úton lebontható polimereket ismertetnek például R. Langer és társai a

Macromol. Chem. Phys. C23 (1983), 61-126. oldalán. Poliaminosavakat, mint például poliglutaminsavat, vagy poliaszparaginsavat is használhatunk, csakúgy, mint ezek származékait, mint például rövid szénláncú alkoholokkal vagy glikolokkal alkotott parciális észtereket. Példaként említjük meg, mint használható polimert a poli(terc-butil-glutamát)-ot. Egyéb aminosavak, mint például metionin, leucin, valin, prolin, glicin vagy alanin kopolimerjei is használhatók. A WO 87/03891 számon közzétett nemzetközi szabadalmi bejelentésben, valamint az US 4 888 398 és EP 130 935 számú szabadalmakban új poliglutaminsav-, illetve poliaszparaginsavszármazékokat ismertetnek szabályozható biológiai úton lebontható polimerként. Ezek a polimerek (és egyéb aminosavakkal alkotott kopolimerjei) az alábbi képlettel jellemezhetők:

-(NH—CHA-CO)_x(NH-CHX-CO)_y (1) a képletben

X jelentése egy aminosavmaradék oldallánca,

A jelentése -(CH₂)_nCOOR¹R²-OCOR (II), ahol R¹ és R² jelentése hidrogénatom, vagy rövid szénláncú alkilcsoport,

R jelentése alkil- vagy arilcsoport; vagy R és R¹ egymással kapcsolódva helyettesített vagy helyettesítetlen 5 vagy 6 tagú gyűrűt képez.

A jelentése lehet még

-(CH₂)_nCOO-CHR¹COOR (I)

-(CH₂)_nCO(NH-CHX-CO)_mNH-CH(COOH)(CH₂)_pCOOH (III) vagy a megfelelő anhidridek. A képletekben n, m és p értéke 5-nél nem nagyobb egész szám, és x és y értéke 5000-nél nagyobb molekulatömegnek megfelelő egész szám.

A fent említett polimerek alkalmasak a találmány szerinti mikroballonok előállítására, az R, R¹, R² és X szubsztituensek jellegétől függően a membrán tulajdonságait, mint például erősségét, rugalmasságát vagy biológiai úton történő lebonthatóságát szabályozni lehet. X jelentése lehet például metil- (alanin), izopropil(valin), izobutil- (leucin és izoleucin) vagy benzilcsoport (fenil-alanin).

A mikroballonok polimer burkolatának fizikai tulajdonságait, mint például diszpergáltságát, rugalmasságát és vízáteresztő képességét módosíthatjuk különböző adalék anyagokkal. Ezeket az adalék anyagokat a polimervivőfázisban, mint például a hidrofób fázisban, amit a vizes fázisban emulgeálunk, oldhatjuk fel, miáltal ezek a polimerek együtt csapódnak ki a határfelületi membrán kialakulása alatt. A polimerek módosítására alkalmas adalék anyagok közül megemlítjük az olyan vegyületeket, amelyek a mikroballonok membránját „hidrofobizálják” abból a célból, hogy a vízáteresztő képességét csökkentsék. Ilyen vegyületek például a zsírok, viaszok és nagy molekulatömegű szénhidrogének. Amfipatikus vegyületek, mint például foszfolipidek, javítják a mikroballonok diszpergálhatóságát az injektálható vivőfolyadékban. Ezek az adalék anyagok a vízáteresztő képességet és a biológiai úton történő lebontás sebességét is növelik.

Az emésztőszervekben használható mikroballonok készítéséhez biológiai úton nem lebontható polimere7

HU 226 007 Β1 két használhatunk, mint például vízoldhatatlan, fiziológiailag megfelelő, biorezisztens polimereket, beleértve a poliolefineket (polisztirolt), akrilgyantákat (poliakrilátokat, poliakrilonítrilt), poliésztereket (polikarbonátot, poliuretánokat, polikarbamidot) és ezek kopolimerjeit. Előnyös kopolimer az akril-butadién-sztirol (ABS). A membrán rugalmasságát fokozó adalék anyagok a lágyítók, mint például izopropil-mirisztát. Hasznos adalék anyagok a membránt alkotó polimerhez hasonló, csak kisebb molekulatömegű polimerek, fgy például ha membránképző anyagként polilaktid-poliglikolid kopolimert alkalmazunk, akkor a membrán tulajdonságait előnyösen módosíthatjuk (a lágyságot és biológiai lebonthatóságot fokozhatjuk) adalék anyag, mint például kis molekulatömegű (1000-15 000 dalton) poliglikolidok vagy polilaktidok adagolásával. Közepes és kis molekulatömegű (például PEG 2000) polietilénglikolok is használhatók lágyító adalék anyagként.

A találmány szerinti mikroballonok burkolómembránját alkotó polimerbe adagolt adalék anyagok mennyisége széles határok között változhat. Bizonyos esetekben adalék anyagot egyáltalán nem alkalmazunk, más esetekben az adalék anyag mennyisége akár 20 tömeg% is lehet.

A találmány szerinti mikroballonokat szárazon tárolhatjuk, adott esetben konzerválószer és összetapadásukat megakadályozó szer jelenlétében. Adalék anyagként használhatunk 0,1-25 tömeg% vízoldható, fiziológiailag megfelelő vegyületet, mint például mannitolt, galaktózt, laktózt vagy szacharózt; vagy hidrofil polimereket, mint például dextránt, xantánt, agart, keményítőt, PVP-t, poliglutaminsavat, poli(vinil-alkohol)-t, albumint vagy zselatint. Az injekció formájában történő adagolásnál a folyadék-vivőfázisban a mikroballonok hasznos élettartamát, azaz azt az időtartamot, ameddig értékelhető echografikus jelet szolgáltatnak, beállíthatjuk a kívánalomtól függően néhány perc és néhány hónap közé. Ezt a membrán porozitásával szabályozhatjuk, így előállíthatunk a vivőfolyadékot gyakorlatilag át nem eresztő membránt, és néhány nanométertől néhány száz nanométer méretű pórusokat tartalmazó membránokat is. A porozitás mértékét, a membránképző polimer és adalék anyag megfelelő kiválasztásán túl, szabályozhatjuk a találmány szerinti eljárás 4) lépésében az elpárologtatás sebességének és a hőmérsékletnek a beállításával, valamint a hidrofób fázist alkotó vegyület (vagy vegyületelegy) megfelelő kiválasztásával. Minél nagyobb a víz és a hidrofób fázis gőznyomásának a különbsége, annál nagyobb pórusok alakulnak ki a mikroballonok membránjában. A hidrofób fázis megfelelő kiválasztásán kívül a stabilizátorok és koncentrációjuk megfelelő megválasztásával is szabályozni lehet a pórusok méretét. Ezek a módszerek szakemberek előtt ismert és könnyen kivitelezhető módszerek.

Megjegyezzük, hogy bár a találmány szerinti mikroballonokat száraz állapotban is forgalomba lehet hozni, kívánatos lehet különösen olyan esetekben, amikor a bevitel után korlátozott élettartam a követelmény, hogy felhasználásra kész készítményeket hozzunk forgalomba, azaz injekciós vagy orális beadagolásra alkalmas vizes vivőfolyadék-mikroballon szuszpenziót. Ehhez alapvető követelmény, hogy a mikroballonok membránja a vivőfolyadéknak ellenálljon (legalább néhány hónapon át). Fentiekben részleteztük, hogy az ehhez szükséges feltételeket hogyan lehet a találmány szerinti eljárással biztosítani, vagyis a polimer és a határfelületi lerakódás paramétereinek megfelelő kiválasztásával. Az aktuális paramétereket úgy kell megválasztani [például glutaminsavból képzett 1. általános képletű polimer, ahol a képletben A jelentése (il) általános képletű csoport, és hidrofób fázisként ciklooktánt alkalmazva], hogy a hidrofób fázis elpárologtatása után a membrán a szuszpendálóközegként használt vizes vivőfolyadék számára átjárhatatlan, szűk pórusokat tartalmazzon.

Diagnosztikai célokra előnyös készítmény pufferolt vagy nem pufferolt sóoldatban (0,9 tömeg%-os vizes NaCI; puffer 10 mM tris-HCI) 10⁸—10¹° mikroballont tartalmaz ml-enként. Ilyen készítményeket az alábbi példákban, előnyösen a 3. és 4. példában bemutatott módszerek szerint lehet készíteni, a Company Boehringer, Ingelheim, Germany által forgalomba hozott poli(DL-laktid)-polimert alkalmazva.

A találmány szerinti mikroballonokat és ezek előállítási eljárását az alábbi példákban mutatjuk be.

1. példa g polisztirolt 100 °C hőmérsékleten, 19 g folyékony naftalinban oldunk fel. A kapott naftalinos oldatot 90-95 °C hőmérsékleten 200 ml 4 tömeg%-os poli(vinil-alkohol)-t és 0,1 tömeg% Tween-40 emulgeátort tartalmazó vizes oldatban emulgeáljuk. Az emulziókészítéshez Polytron PT-3000 típusú fejet alkalmazunk, 10 000 fordulat/perc sebességnél. Ezután az emulziót 15 °C hőmérsékleten, keverés közben hígítjuk fenti vizes oldat további 500 ml-ével. Ezalatt a naftalincseppek kis gömbökké szilárdulnak, melyeknek átmérője 50 pm alatti, amint azt 50 pm szitanyílású szitán való átbocsátással meghatározzuk. A szuszpenziót 1000 G-nél centrifugáljuk, majd a gömböcskéket vízzel mossuk, és ismét centrifugáljuk. Ezt a lépést kétszer ismételjük.

A gömböcskéket ezután 100 ml vízben, amelyben 0,8 g laktóz van feloldva, szuszpendáljuk, majd a kapott szuszpenziót -30 °C hőmérsékleten egy tömbbé fagyasztjuk. A tömböt -20 °C és -10 °C közötti hőmérsékleten és 266 Pa nyomáson elpárologtatjuk. 5-10 pm átlagos átmérőjű, szabályozott porozitású, levegővel töltött mikroballonokat kapunk, amelyek vízben diszpergálva (3 tömeg%-os diszperzió) 2,25 és 7,5 MHz-nél adnak echografikus jelet. A mikroballonok száraz állapotban korlátlan ideig stabilak. Vizes vivőfolyadékban szuszpendálva élettartamuk legalább 30 perc. Mivel a polisztirol biológiai úton nem lebontható, nem alkalmazható az olyan echográfiás vizsgálatoknál, ahol a szuszpenziót injekció formájában adagolják, viszont használható az emésztőszervek vizsgálatánál.

Fenti példával a találmány szerinti eljárás kivitelezhetőségét mutattuk be.

HU 226 007 Β1

2. példa

0,3 g DL-laktid és glikolid 50:50 kopolimer elegyét (gyártó cég: DuPont Medisorb) és 16 mg tojáslecitint feloldunk 7,5 ml CHCI₃-ban (1. oldat).

mg paraffinviaszt (olvadáspont: 54-56 °C) feloldunk 10 ml ciklooktánban (olvadáspont: 10-13 °C) (2. oldat). A kapott 2. oldatot 150 ml 0,13 tömeg% Pluronic F-108-at (etilén-oxidból és propilén-oxidból felépülő blokk-kopolimer) és 1,2 g CHCI₃-ot tartalmazó vizes oldatban emulgeáljuk. Az emulgeálást szobahőmérsékleten, 1 percen át végezzük, Polytron fejet 7000 fordulat/percnél alkalmazva. Az emulzióhoz keverés mellett (7000 fordulat/perc) hozzáadjuk az 1. oldatot, majd 30-60 másodperc múlva az emulgeálófejet egy spirálkeverőre cseréljük (500 fordulat/perc), és a keverést 3 órán át, szobahőmérsékleten (22 °C) folytatjuk. A szuszpenziót egy 50 pm szitanyílású szitán átszűrjük, majd tömbbé fagyasztjuk. A tömböt nagyvákuum alkalmazása mellett -20 °C és 0 °C közötti hőmérsékleten elpárologtatjuk, (-60)-(-80) °C hőmérsékletű csapdát alkalmazva. 0,264 g (88%) levegővel töltött, száraz állapotban stabil mikroballonokat kapunk.

A kapott mikroballonok vízben, stabilizátor nélkül szuszpendálva, egy órán át erős echografikus jelet adnak. Élő szervezetbe injekció formájában adagolva, néhány nap után biológiai úton lebomlanak.

3. példa

200 ml tetrahidrofuránt, 0,8 g 50:50 DL-laktid—glikolid kopolimert (gyártó cég: Boehringer AG), 80 mg tojáslecitint, 64 mg paraffinviaszt és 4 ml oktánt tartalmazó oldatot készítünk. Az így kapott oldatot lassan adagolva 400 ml 0,1 tömeg% Pluronic F-108-at tartalmazó vizes oldatban, spirálkeverő alkalmazásával (500 fordulat/perc) emulgeáljuk. 15 percen át tartó kevertetés után a tejszerű diszperziót 1,3-1,4 kPa nyomáson, 25 °C hőmérsékleten forgóbepárlót alkalmazva, körülbelül 400 ml térfogatúra bepároljuk. A diszperziót 50 pm szitanyílású szitán átszűrjük, majd -40 °C-ra fagyasztjuk, és 133 Pa nyomáson fagyasztva szárítjuk. 1,32 g nagyon finom por formájú anyagot kapunk, amit 40 ml desztillált vízben, 3 percen át kézzel elkeverünk. Mikroballonokat tartalmazó nagyon homogén diszperziót kapunk. A mikroballonok átlagos átmérője 4,5 pm (Mastersizer típusú, gyártó cég: Malvern részecskeanalizátorral meghatározva). A mikroballonok koncentrációja (Coulter Counter) 2*10⁹ mikroballon/ml. A szuszpenzió körülbelül 1 órán át erős echografikus jelzést ad.

Abban az esetben, ha a példa szerinti eljárást a membrán polimer adalék anyagainak elhagyása mellett végezzük, azaz csak 800 mg laktid/glikolid kopolimert tartalmazó, tetrahidrofurán/oktán oldatot alkalmazunk, akkor a membránburkolat permeabilitásának jelentős csökkenése figyelhető meg; a diszperzió echografikus jele 3 napon át sem mutat jelentős csökkenést.

Az adalék anyagokat, paraffinviaszt 0-64 mg és tojáslecitint 0-80 mg közötti mennyiségben alkalmazva közbülső porozitású és élettartamú mikroballonokat kapunk.

4. példa

Polimerként olyan (1) általános képletű poliglutaminsavszármazékot alkalmazunk, amely (I) általános képletű oldalcsoportot tartalmaz, ahol a képletben R¹ jelentése hidrogénatom, n=2, X jelentése glutaminsavmaradék-oldallánc és R jelentése terc-butil-csoport. A polimert (a későbbiekben poly-POMEG) az US-A-4 888 398 számú szabadalomban ismertetett eljárás szerint állítjuk elő.

A 3. példában ismertetett eljárás szerint járunk el, 0,1 g poly-POMEG-et, 70 ml tetrahidrofuránt, 1 ml ciklooktánt és 100 ml 0,1 tömeg%-os Pluronic F-108-at tartalmazó vizes oldatot alkalmazva. Lecitint vagy nagy molekulatömegű szénhidrogént nem adagolunk. A kapott tejszerű emulziót 27 °C hőmérsékleten és 1,3 kPa nyomáson 100 ml térfogatúra bepároljuk, majd 50 pm szitanyílású szitán átszűrjük és fagyasztjuk. A fagyott tömb elpárologtatását 60-133 Pa nyomáson levegőatmoszférában száraz maradék képződéséig végezzük. Hozam: 0,18 g a felületaktív anyag jelenléte következtében. A kapott anyagot 10 ml desztillált vízben diszpergáljuk, és a koncentrációt (Coulter Counter alkalmazásával) meghatározzuk. 1,43*10⁹ mikrokapszula/ml koncentrációjú diszperziót kapunk, az átlagos részecskeméret: 5,21 pm (Mastersizer típusú, gyártó cég: Malvern részecskeanalizátorral meghatározva). A diszperziót 100-szorosára hígítjuk, azaz körülbelül 1,5*10⁷ mikrogömb/ml koncentrációjúra, majd mérjük az echogenitást. A visszavert jel amplitúdója 7,5 MHz-nél ötször nagyobb, mint 2,25 MHz-nél.

Ezek a jelek hosszú idő (24 óra) eltelte után is reprodukálhatók.

Az echogenitásvizsgálatot egy pulzusechorendszer alkalmazásával végezzük, amely rendszer tartalmaz egy plexiüveg mintatartót (30 mm átmérőjű) 20 pm vastagságú Mylar akusztikus ablakkal, egy állandó hőmérsékletű vízfürdőbe süllyesztett jelátalakítót (transzduktort), impulzusvevőt (Accutron M3010JS) egy 40 dB erősítésnél rögzített külső erősítővel és egy (-40)-(+40) dB között állítható belső erősítővel, és cserélhető 13 mm-es fokuszálatlan jelátalakítókat. A zaj-jel arány javítása érdekében a vevőrészbe egy 10 MHz-es kis áteresztésű szűrőt helyezünk. Az IBM PC-ben Sonotek STR 832 típusú A/D panelt használunk. A méréseket 2,25; 3,25; 5 és 7,5 MHz-en végezzük.

Ha a példában alkalmazott polimer helyett laktidlakton kopolimereket, ahol a laktonok γ-butirolakton, δ-valerolakton vagy ε-kaprolakton [lásd Fukuzaki és társai, J. Biomedical Mater. Rés. 25 (1991), 315-328. oldal], alkalmazunk, hasonlóan kedvező eredményeket kapunk. Ugyancsak kitűnő eredményt kapunk poli(alkilciano-akrilát)-ok és különösen 90:10 poli(DL-laktid-koglikolid) kopolimerek esetében. Előnyös polimer a poli(DL-laktid), márkanév: Resomer R-206 vagy Resomer R-207, gyártó cég: Boehringer-lngelheim.

5. példa

Kétdimenziós echokardiográfiás vizsgálatot végzünk Acuson-128 készülék alkalmazásával a 4. példa szerint Poly-POMEG polimerből előállított 1,43*10®

HU 226 007 Β1 mikroballon/ml koncentrációjú készítmény alkalmazásával, kísérleti kutya vénájába 0,1-2 ml diszperziót injekciózva. A jobb szívkamra képének echografikus észlelése után intenzív és állandó jelzéserősödést lehet megfigyelni a bal szivkamrából a szívbelhártya tiszta körvonalával együtt. Ez bizonyítja, hogy a poli-POMEG-ből készített mikroballonok (vagy legalábbis jelentős részük) a tüdő hajszáleres keringési rendszerén át tud jutni, és elegendő ideig marad a véráramban ahhoz, hogy megfelelő echografikus analízist lehessen végezni.

Egy másik kísérletsorozatban nyulak és patkányok szisztémás artériáiból és kapuvisszeréből állandó, fokozott Doppler-jelzés figyelhető meg, miután a perifériás érbe 0,5-2 ml, a 4. példa szerinti eljárással előállított [polimerfázisként poli(DL-tejsav)-at alkalmazva] mikroballonkészítményt injekciózunk.

A 4. példa szerinti eljárással poli(terc-butil-glutamát)-ot használva polimerfázisként, készítményt állítunk elő. 5 ml 3,4*10® mikroballon/ml hígítású készítményt patkányok kapuvisszerébe injekciózva állandó, kontrasztos májsejtszövetképet kapunk.

6. példa

Az 1. példa szerinti eljárással (polimer=polisztirol) 1,1 *10⁹ mikroballon/ml koncentrációjú mikroballonszuszpenziót készítünk. 1 ml szuszpenziót 100 ml 300 mmol-os mannitololdattal hígítunk, majd a kapott oldatból 7 ml-t vizsgálati patkányba intragasztrikálisan beadagolunk. Az állat emésztőrendszerének kétdimenziós echográfiás képét Acuson-128 készülékkel vizsgáljuk, a képen tisztán látszanak a vékonybél és a vastagbél kanyarulatai.

Claims (27)

SZABADALMI IGÉNYPONTOK

1) egy hidrofób szerves fázist vizes fázisban emulgeálunk, és ezáltal az említett vizes fázisban az említett hidrofób fázis cseppecskéiből „olaj a vízben” emulziót képezünk;

1) egy hidrofób szerves fázist vizes fázisban emulgeálunk, és ezáltal az említett vizes fázisban az említett hidrofób fázis cseppecskéiből „olaj a vízben emulziót képzünk;

1. Levegővel vagy gázzal töltött polimer membránt tartalmazó mikronos vagy szubmikronos méretű mikroballonok, amelyek folyékony vivőanyagban szuszpendálva, humán vagy állati szervezetbe adagolva diagnosztikai célokra, előnyösen ultrahang-echográfiás képalkotásra használhatók, azzal jellemezve, hogy a membránt alkotó polimer szintetikus, deformálható, rugalmas és határfelületre lerakódni képes polimer, amely mikroballonok a következő lépésekkel állíthatók elő:

2) az említett emulzióhoz a vizes fázisban oldhatatlan illékony oldószerben oldott legalább egy polimert adagolunk, és ezáltal a cseppecskék körül az említett polimerréteget alakítjuk ki;

2. Az 1. igénypont szerinti, élő szervezetek véráramába injekciós úton beadagolható, főként 0,5-10 pm mérettartományba eső méretű mikroballonok, amelyekben a membrán a biológiai lebomlás sebességét fokozó biológiailag aktív folyadékok számára átjárhatatlan vagy átjátható.

2) az említett emulzióhoz a vizes fázisban oldhatatlan illékony oldószerben oldott legalább egy polimert adagolunk, és ezáltal a cseppecskék körül az említett polimer rétegét alakítjuk ki;

3) az illékony oldószert eltávolítjuk, és ezáltal kiváltjuk a cseppecskékre határfelületi kicsapódással a polimer lerakódását, és az említett polimer membrán által kapszulázott említett hidrofób fázis magját tartalmazó buborékokat alakítunk ki, amely buborékok az említett vizes fázissal szuszpenziót alkotnak;

3. A 2. igénypont szerinti mikroballonok, amelyekben a polimer membrán pórusai 50-2000 nm méretűek.

3) az illékony oldószert eltávolítjuk, és ezáltal kiváltjuk a cseppecskékre határfelületi kicsapódással a polimer lerakódását, és az említett polimer membrán által kapszulázott említett hidrofób fázist magként tartalmazó buborékokat alakítunk ki, amely buborékok az említett vizes fázissal szuszpenziót alkotnak;

4) az említett szuszpenziót csökkentett nyomásnak tesszük ki az említett kapszulázott hidrofób fázis elpárologtatásához szükséges körülmények mellett;

ahol a hidrofób fázist úgy választjuk meg, hogy a vizes fázissal lényegében egyidejűleg párologjon el, és levegővel vagy gázzal cserélődjön ki, ily módon száraz, szabadon folyó, könnyen diszpergálható mikroballonokat kapunk.

4. A 2. igénypont szerinti mikroballonok, amelyekben a membrán rugalmas, 50-500 nm vastagságú, és a véráramban a szívverés által okozott nyomásváltozásoknak ellenáll.

4) az említett szuszpenziót fagyasztva szárítás körülményeinek tesszük ki; ahol az említett hidrofób fázist úgy választjuk meg, hogy a vizes fázissal lényegében egyidejűleg párologjon el, és levegővel vagy gázzal cserélődjön ki, ily módon száraz, szabadon folyó, könnyen diszpergálható mikroballonokat kapunk; vagy a 2) lépésben alkalmazott polimert az 1) lépésben említett hidrofób fázisban feloldjuk, (gy a 2) és 3) lépést elhagyva a polimer membránt a 4) lépés során határfelületi kicsapatással alakítjuk ki.

5. Az 1. igénypont szerinti mikroballonok, amelyekben a membránt alkotó polimer egy biológiai úton lebontható polimer, amely poliszacharidok, poliaminosavak, polilaktidok és poliglikolidok vagy ezek kopolimerjei, laktidok és laktonok kopolimerjei, polipeptidek, poliortoészterek, polidioxanon, poli(p-amino-keton)-ok, polifoszfazének, polianhidridek és polialkil-(ciano)-akrilátok közül megválasztott.

6. Az 1. igénypont szerinti mikroballonok, amelyekben a membránt alkotó polimer poliglutaminsavvagy poliaszparaginsavszármazék és ezeknek egy másik aminosawal alkotott kopolimerjei közül megválasztott.

7. A 6. igénypont szerinti mikroballonok, amelyekben a poliglutaminsav- és poliaszparaginsavszármazék

-(CH)_nCOO-CHR¹COOR (I) vagy

-(CH₂)_nCOOR¹R²-OCOR (II) vagy

-(CH₂)_nCO(NH-CHX-CO)_mNHCH(COOH)(CH₂)_pCOOH (III) általános képletű karboxilált oldal funkciós csoportokat tartalmazó észterek és amidok közül megválasztott, ahol a képletekben R jelentése alkil- vagy arilcsoport, R¹ és R² jelentése hidrogénatom vagy rövid szénláncú alkilcsoport, vagy R és R¹ egy helyettesített vagy helyettesítetlen gyűrűtaggal összekapcsolva 5 vagy 6 tagú gyűrűt képez, n értéke 1 vagy 2; p értéke 1, 2 vagy 3; m értéke 1—5-ig terjedő egész szám; és X jelentése egy aminosavmaradék oldallánca.

8. Az 1. igénypont szerinti mikroballonok, amelyekben a membránt alkotó polimer a rugalmasság mértékének és a permeabilitást szabályozó pórusok méretének és sűrűségének szabályozására adalék anyagokat tartalmaz.

9. A 8. igénypont szerinti mikroballonok, amelyek adalék anyagként lágyítót, amfipatikus anyagokat és hidrofób vegyületeket tartalmaznak.

HU 226 007 Β1

10. A 9. igénypont szerinti mikroballonok, amelyek lágyítóként izopropil-mirisztátot, glicerin-monosztearátot és hasonló vegyületeket a rugalmasság szabályozására, amfipatikus anyagként felületaktív anyagokat és foszfolipideket, előnyösen lecitineket a permeabilitás szabályozására a porozitás növelésével, és hidrofób vegyületként nagy molekulatömegű szénhidrogéneket, előnyösen paraffinviaszokat a porozitás csökkentésére, tartalmaznak.

11. A 9. igénypont szerinti mikroballonok, amelyek adalék anyagként kis molekulatömegű, előnyösen 1000-15 000 tartományba eső molekulatömegű polimert tartalmaznak a mikroballonmembrán lágyságának és rugalmasságának szabályozására.

12. A 11. igénypont szerinti mikroballonok, amelyekben a kis molekulatömegű polimer adalék anyagok polilaktidok, poliglikolidok, polialkilénglikolok, előnyösen polietilénglikol és polipropilénglikol, és poliolok, előnyösen poliglicerín közül megválasztott.

13. Az 1. igénypont szerinti, legfeljebb 1000 pm méretű, orális, rektális és uretrális felhasználásra alkalmas mikroballonok, amelyekben a membránt alkotó polimer az emésztőrendszerben biológiai úton nem lebomló és a biológiai folyadékok számára átjárhatatlan polimer.

14. A 13. igénypont szerinti mikroballonok, amelyekben a polimer poliolefinek, poliakrilátok, poliakrilnitril, nem hidrolizálódó poliészterek, poliuretánok és polikarbamidok közül megválasztott.

15. Az 1-14. igénypontok bármelyike szerinti mikroballonok diagnosztikai célra injektálható vizes szuszpenziója, azzal jellemezve, hogy 1O⁶-1O¹⁰ mikroballon/ml koncentrációjú, és legalább harminc napon át stabil.

16. A 15. igénypont szerinti vizes szuszpenzió, amelyben a mikroballonok határfelületen kicsapódott poli(DL-laktid)-polimerből kialakult membránnal vannak burkolva.

17. Eljárás levegővel vagy gázzal töltött mikroballonok előállítására, amelyek folyékony vivőanyagban szuszpenzióként orális, rektális és uretrális felhasználásokra vagy injekciós adagolással élő szervezetekben használhatók, azzal jellemezve, hogy

18. A 17. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az említett polimert az említett hidrofób fázisban feloldjuk, így a 2) és 3) lépést elhagyva a polimer membránt a 4) lépés során határfelületi kicsapatással alakítjuk ki.

19. A 17. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a 4) lépésben a hidrofób fázis elpárologtatását olyan hőmérsékleten kivitelezzük, ahol a hidrofób fázis parciális gőznyomása a víz gőznyomásával azonos nagyságrendű.

20. A 17. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a 4) elpárologtatólépésben fagyasztva szárítás körülményeit alkalmazzuk.

21. A 20. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a fagyasztva szárítást -40 °C-tól 0 °C-ig terjedő hőmérséklet-tartományban kivitelezzük.

22. A 17. vagy 19. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a hidrofób fázist olyan szerves vegyületek közül választjuk meg, amelyeknek gőznyomása -40 °C-tól 0 °C-ig terjedő hőmérséklet-tartományban körülbelül 133 N/m² (1 torr).

23. A 17. vagy 18. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a vizes fázis feloldva 1-20 tömeg % stabilizátort tartalmaz, amely cukrok, poli(vinil-alkohol), poli(vinil-pirrolidon), zselatin, keményítő, dextrán, polidextróz, albumin és ezekhez hasonló vegyületek közül megválasztott hidrofil vegyület.

24. A 18. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a mikroballonokat határoló membrán permeabilitásának szabályozására a hidrofób fázisba adalék anyagokat adagolunk.

25. A 24. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy adalék anyagként hidrofób szilárd anyagokat, előnyösen zsírokat, viaszokat és nagy molekulatömegű szénhidrogéneket alkalmazunk, amelyek jelenléte a mikroballonok polimer membránjában csökkenti a vizes folyadékokkal szembeni permeabilitást.

26. A 24. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy adalék anyagként amfipatikus vegyületeket, előnyösen foszfolipideket vagy kis molekulatömegű polimereket alkalmazunk, amelyek jelenléte a mikroballonok polimer membránjában növeli a vizes folyadékokkal szembeni permeabilitást.

27. A 18. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a hidrofób fázisba, amelyet az említett vizes fázisban emulgeálunk, egy vízoldható oldószert adagolunk az emulgeálás alatt.