HU224610B1

HU224610B1 - Vankoreszmicin, eljárás előállítására és gyógyszerként történő alkalmazása

Info

Publication number: HU224610B1
Application number: HU0104213A
Authority: HU
Inventors: Nirogi Venkata Satya Ramakrishna; Ravi Gayanan Bhat; Eyyammadichiyil Sankaranarayanan Sreekumar; Erra Koteswara Satya Vijayakumar; Shantilal Dayaram Naker; Uttara Vinayak Oak; Rajendra Prakash Tanpure; Cordula Hopmann; Michael Kurz; Joachim Wink; Gerhard Seibert; Dominique Le Beller; Jozsef Aszodi
Original assignee: Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh
Priority date: 1998-11-09
Filing date: 1999-11-04
Publication date: 2005-11-28
Also published as: IL142848A0; ID28381A; ZA200103191B; CN1325656C; DE69903465D1; HUP0104213A2; AU761782B2; ES2181506T3; CN1325453A; KR20010086006A; DE69903465T2; JP2002529477A; AR024226A1; US6387943B1; US20020183267A1; HK1041026B; HUP0104213A3; TR200101279T2; PT1129208E; BR9915161A

Description

A leírás terjedelme 12 oldal (ezen belül 4 lap ábra)

HU 224 610 Β1

A találmány vankoreszmicin nevű vegyületre vonatkozik, amely előállítható a HIL-006734 jelű mikroorganizmus (DSM 12 216) tenyésztésével. A találmány kiterjed a fenti vegyület farmakológiailag alkalmazható sóira és származékaira. A találmány tárgya továbbá eljárás a vankoreszmicin előállítására. A találmány tárgya továbbá HIL-006734 jelű mikroorganizmus (DSM 12 216), a vankoreszmicin és ennek farmakológiailag alkalmazható sói és származékai gyógyszerként történő alkalmazása, elsősorban antibiotikumként történő alkalmazása, valamint gyógyszerkészítmények, amelyek hatóanyagként vankoreszmicint vagy ennek farmakológiailag alkalmazható sóját vagy származékát tartalmazzák.

Meticillinrezisztens Staphylococcus aureus (MRSA)-fertőzések elsősorban súlyos fertőzési körülmények között, így sebeknél és égéseknél fordulnak elő. A glikopeptidek csoportjába tartozó vankomicin és teikoplanin jelenti azt a kizárólagos két antibiotikumot, amit klinikailag alkalmaznak az MRSA-fertőzések kezelésére. A vankomicin- és teikoplaninrezisztens törzsek legutóbbi megjelenése következtében azonban ezek a fertőzések életveszélyesek, akár halálosak. Ezért intenzív kutatás indult be olyan szerkezetileg eltérő vegyületek kifejlesztésére, amelyek hatékonyak az ilyen vankomicin- és teikoplaninrezisztens törzsekre, így például az EP 0 818 539 számú iratban ismertetett metil-szulfomicin I, egy ciklusos tiopeptid, antibiotikus hatást mutat a vankomicin- és teikoplaninrezisztens törzsek ellen.

Vankoreszmicinnek nevezett új vegyületet találtunk, amely antibiotikus hatással rendelkezik. A találmány tárgyát képezi ezért az (I) képletű vankoreszmicin és ennek farmakológiailag alkalmazható sói és származékai, így észterei, éterei és nyilvánvaló kémiai ekvivalensei és ezek összes lehetséges sztereoizomer formái és tautomer formái.

A vankoreszmicin összegképlete C₇₁H₁₂₆N₂O₂₁(móltömeg 1343,80), és egy vagy több fizikokémiai és spektroszkópiai tulajdonsággal, így ¹H-NMR-spektroszkópiai adatokkal vagy ¹³C-NMR-spektroszkópiai adatokkal jellemezhető. Ilyen adatokat szerepeltetünk a 2. táblázatban.

A vankoreszmicin új antibiotikus hatású anyagként írható le a vankomicin- és teikoplaninrezisztens törzsek ellen. A vankoreszmicin eddig ismeretlen új szerkezettel rendelkezik, melybe beletartozik egy tetramer savcsoport, amely a 3-helyzetben egy acilcsoportot hordoz, és egy nagymértékben oxigénezett hosszú alkillánc, amely egy aminocukorral van szubsztituálva. A Chemical abstract irodalom a vankoreszmicint új vegyületnek minősítette. Nem ismert olyan vegyület, amely rendelkezik a vankoreszmicin szerkezeti jellemzőivel.

A vankoreszmicin előállítható a HIL-006734 számon tenyésztett mikroorganizmus (továbbiakban HIL-006734 jelű mikroorganizmus) tenyésztésével. A vankoreszmicin előállítására alkalmazott fenti mikroorganizmust a National Park, Borivli, Mumbai, India helyen gyűjtött talajmintából izoláltuk. A HIL-006734 jelű mikroorganizmus az Actinomycetales rendbe, és ezen belül az Amycolatopsis nembe tartozik, és 1998. június

4-én a Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und

Zellkulturen GmbH (Braunschweig, Németország) gyűjteményben a DSM 12 216 számon került letétbe.

A találmány tárgya továbbá eljárás a vankoreszmicin nevű új vegyület előállítására a HIL-006734 jelű Amycolatopsis mikroorganizmusból, ennek mutánsából vagy variánsából, melynek során a mikroorganizmust egy vagy több szén- és egy vagy több nitrogénforrást, és adott esetben szervetlen sókat és/vagy nyomelemeket tartalmazó tápközegen tenyésztjük aerob körülmények között, majd a vegyületet a szokásos módon izoláljuk és tisztítjuk.

Az ST101170 jelű mikroorganizmus mutánsai és variánsai szintén képesek lehetnek a találmány szerinti vegyület szintetizálására. Az ilyen mutánsok a szokásos fizikai eszközökkel, például besugárzással, például UV- vagy röntgenbesugárzással, valamint kémiai mutagénekkel, így etil-metilán-szulfonáttal (EMS), 2-hidroxi-4-metoxi-benzofenonnal (MOB) vagy N-metil-N’-nitro-N-nitrozo-guanidinnel (MNNG) előállíthatok a szokásos módon.

A találmány szerinti vegyület előállítására képes megfelelő mutánsok és variánsok vizsgálata megvalósítható úgy, hogy meghatározzuk a tenyészközegben felhalmozódott vegyületek biológiai hatékonyságát, például vizsgáljuk az antibakteriális hatást.

A tenyészközeg előnyösen szén- és nitrogénforrásokat, valamint szervetlen sókat tartalmaz. Szénforrásként alkalmazható például keményítő, glükóz, szacharóz, dextrin, fruktóz, melasz, glicerin, laktóz vagy galaktóz, előnyösen keményítő. Nitrogénforrásként alkalmazható például szójababliszt, földimogyoróliszt, élesztőkivonat, marhahúskivonat, pepton, malátakivonat, kukoricalikőr, zselatin vagy kazamionsavak, előnyösen pepton és élesztőkívonat. Szervetlen sóként alkalmazható például nátrium-hidrogén-foszfát, kálium-hidrogén-foszfát, nátrium-klorid, kalcium-klorid, kalcium-karbonát, kálium-nitrát, ammónium-szulfát vagy magnézium-szulfát, előnyösen kalcium-karbonát, nátrium-klorid és magnézium-szulfát.

A HIL-006734 jelű mikroorganizmus tenyésztését 25-35 °C közötti hőmérsékleten és pH=6,0-8,0 értéken, előnyösen 30±1 °C hőmérsékleten és pH=7,0 értéken végezzük.

A HIL-006734 jelű mikroorganizmus tenyésztését előnyösen 60-96 órán keresztül végezzük, amikor is a találmány szerinti antibiotikum optimális kitermeléssel nyerhető. A tenyésztést különösen előnyösen 68-96 órán keresztül végzett fermentálással valósítjuk meg elárasztásos körülmények között, például rázólombikban vagy laboratóriumi fermentorban. A fermentálás folyamata és a vankoreszmicin kialakulása HPLC eljárással követhető, és a tenyészközeg bioaktivitása Staphylococcus és Enterococcus fajokon mérhető a szokásos mikrobiológiai agarlemez diffúziós vizsgálatokkal. Előnyösen alkalmazható a Staphylococcus aureus 3066 tenyészet, amely rezisztens az irodalom szerint β-laktám antibiotikum meticillinre, valamint az

HU 224 610 Β1

Enterococcus faecium (E. faecium VR-1), amely rezisztens a vankomicinre. A kapott tenyészközegben a vankoreszmicin megtalálható a tenyészet szűrletében, valamint a micéliumban, és a szokásos elválasztási módszerekkel izolálható. A tenyészet szűrletéből feltárható például vízzel nem elegyedő oldószerrel, így etil-acetáttal, diklór-metánnal, kloroformmal vagy butanollal pH=5-8 értéken végzett extrahálással, vagy hidrofób kölcsönhatásos kromatografálással polimer gyantán, így Diaion HP-20 gyantán (Mitsubishi Chemical Industries Limited, Japán), Amberlite XAD gyantán (Rohm and Haas Industries, USA), aktív szénen vagy ioncserés kromatografálással pH=5-8 értéken. Előnyösen alkalmazható az etil-acetátos extrahálás. A hatóanyag feltárható továbbá a micéliumból vízzel elegyedő oldószerrel, így metanollal, acetonnal, acetonitrillel, n-propanollal vagy izopropanollal, vagy vízzel nem elegyedő oldószerrel, így etil-acetáttal, diklór-metánnal, kloroformmal vagy butanollal pH=5-8 értéken végzett extrahálással. Előnyösen alkalmazható az etil-acetátos extrahálás. Az extraktumok koncentrálásával és liofilizálásával kapjuk a hatóanyagot.

A találmány szerinti vankoreszmicin-antibiotikum a nyerstermékből feltárható például a következő eljárással.

Frakcionálást végzünk a következő módszerek valamelyikével: normálfázisú kromatografálás (állófázisként alumínium-oxid vagy szilikagél alkalmazásával és eluensként petroléter, etil-acetát, metilén-klorid, aceton, kloroform, metanol vagy ezek elegye alkalmazásával, és amin, így Net₃ adagolásával), reverz fázisú kromatografálás [állófázisként reverz fázisú szilikagél, így dimetil-oxadecil-szilil szilikagél, más néven RP-18, vagy dimetil-oktil-szilil szilikagél, más néven RP-8 alkalmazásával, és eluensként víz, puffer, így foszfát-, acetát- vagy citrátpuffer (pH=2—8), és szerves oldószerként metanol, acetonitril, aceton, tetrahidrofurán vagy ezek elegye alkalmazásával], gélpermeációs kromatografálás, például Sephadex LH-20 gyanta (Pharmacia Chemical Industries, Svédország), TSK gél Toyopearl HW gyanta (TosoHaas, Tosoh Corporation, Japán) alkalmazásával oldószerként metanol, kloroform, aceton, etil-acetát vagy ezek kombinációja alkalmazásával, illetve Sephadex G-10 vagy G-25 gyanta és oldószerként víz alkalmazásával, ellenáramú kromatografálás, két vagy több oldószerből álló, kétfázisú eluensrendszer alkalmazásával, ahol az oldószer például víz, metanol, etanol, izopropanol, n-propanol, tetrahidrofurán, aceton, acetonitril, metilén-klorid, kloroform, etil-acetát, petroléter, benzol vagy toluol. Ezek a módszerek felhasználhatók egymás után többször, vagy egymással kombinálva. Előnyösen alkalmazható a reverz fázisú kromatografálás szilikagélen, például RP-18 szilikagélen.

A vankoreszmicinvegyület farmakológiailag alkalmazható sóvá és származékká, így észterré, éterré vagy más nyilvánvaló kémiai ekvivalenssé alakítható, amelyek a találmány oltalmi köréhez tartoznak. A sók és származékok előállítását szakember számára ismert, szokásos módszerekkel végezzük. A sók, így nátrium- és káliumsók előállíthatok például úgy, hogy a vankoreszmicint megfelelő nátrium- vagy káliumbázissal kezeljük. Az észterek és éterek előállíthatok például J. March: Advanced Organic Synthesis, 4. kiadás, John Wiley & Sons, (1992) szerint. A cukoregység aminocsoportja alkilezhető vagy acilezhető, ami megvalósítható például a szokásos módszerekkel, savkloridok alkalmazásával.

A kémiai ekvivalensekre példaként említhetők a fémionokkal, például átmenetifém-ionokkal, így La³⁺-, Sm³⁺-, Eu³⁺- vagy Gd³⁺-ionokkal képzett stabil komplexek, melyek jellemzők a tetramersavszármazékokra, és amelyek előállíthatok az irodalomból ismert módszerekkel [K. Tanaka és munkatársai: Chem. Pharm. Bull. 27, 1901 (1979); K. Matsuo: Chem. Pharm. Bull. 28, 2494, (1980)].

Az alkiloldallánc kettős kötései redukálhatok, ami megvalósítható például Ρ. N. Rylander: Hydrogenation Methods, Academic Press, New York (1985) 2. fejezete szerint, vagy hidrohalogénezhetők, például Η. O. House: Modern Synthetic Reactions, W. A. Benjámin, Inc., New York (1972) 446-452. oldal szerint. Előállíthatok továbbá hidroxilezett származékok, amelyhez a kettős kötést olyan reagensekkel reagáltatjuk, mint OSO₄ [Chem. Rév. 80, 187, (1980)].

További származékként említhetők az epoxidok, amelyhez a kettős kötéseket oxidáljuk, például MCPBA segítségével J. March: Advanced Organic Synthesis,

4. kiadás, John Wiley & Sons, (1992) szerint.

A vankoreszmicin antibakteriális hatással rendelkezik. A vankoreszmicin különböző baktériumokkal szemben mutatott minimális inhibitorkoncentrációját a 3. táblázatban adjuk meg. A vankoreszmicin és ennek farmakológiailag alkalmazható sói és származékai adagolhatok embereknek és állatoknak, elsősorban emlősállatoknak önmagukban, egymással képzett keverék formájában, vagy parenterálisan adagolható gyógyszerkészítmény formájában. Ennek megfelelően a találmány tárgyát képezi a vankoreszmicin és ennek farmakológiailag alkalmazható sói és származékai gyógyszerként történő alkalmazásra, valamint a vankoreszmicin és ennek farmakológiailag alkalmazható sói és származékai alkalmazása antibakteriális hatású gyógyszerkészítmény előállítására. A találmány tárgya továbbá gyógyszerkészítmény, amely hatékony mennyiségben vankoreszmicint és/vagy ennek egy vagy több farmakológiailag alkalmazható sóját és/vagy származékát tartalmazza gyógyszerészeti hordozóanyag mellett.

A vankoreszmicin adagolható orálisan, intramuszkulárisan, intravénásán és más adagolási módszerekkel. A vankoreszmicint vagy ennek farmakológiailag alkalmazható sóját vagy származékát gyógyszerészeti hordozóanyag mellett tartalmazó gyógyszerkészítmények előállíthatok úgy, hogy a hatóanyagot elkeverjük egy vagy több farmakológiailag alkalmazható hordozóanyaggal és/vagy segédanyaggal. Ezekre példaként említhetők a töltőanyagok, emulgeálószerek, csúsztatószerek, ízesítőanyagok, színezékek és pufferanyagok. A kapott keveréket megfelelő gyógyszerkészítménnyé alakítjuk, amire példaként említhetők a tablet3

HU 224 610 Β1 ták, bevont tabletták, kapszulák, granulátumok, porkészítmények, emulziók, szuszpenziók vagy parenterálisan adagolható oldatok.

A hordozóanyagokra és/vagy segédanyagokra példaként említhető a tragakant, laktóz, talkum, agar, poliglikolok, etanol és víz. Parenterális adagolásra alkalmazhatók és előnyösek a vízben felvett szuszpenziók vagy oldatok. A hatóanyagok adagolhatok továbbá önmagukban, hordozóanyag vagy hígítóanyag nélkül, megfelelő formában, például kapszula formájában.

A szokásos módon, a galenikus forma, az adagolás módja, valamint az adott esetben szükséges dózistartomány függ a kezelt betegtől és annak állapotától, valamint a kezelt betegségtől. A fenti körülmények meghatározását a szokásos módon végezzük. A hatóanyag átlagos napi dózisa mintegy 75 kg testtömegű felnőtt betegnél legalább 0,001 mg és legfeljebb 10 mg, előnyösen legfeljebb 1,0 mg.

A találmány tárgyát közelebbről az alábbi példákkal mutatjuk be anélkül, hogy az oltalmi kör a példákra korlátozódna.

1. példa

HIL-006734 jelű tenyészet izolálása a talajból a) Izoláló tápközeg összetétele

Kukoricakeményítő:	10,0 g
Kazein:	1,0g
Pepton:	1,0 g
Marhahúskivonat:	1,0 g
K₂HPO₄:	0,5 g
Agarpor:	13,0 g
lonmentesített víz:	1,01
pH:	7,5

b) Talajminta-feldolgozás és -izolálás g National Park, Borivli, Mumbai, India helyen gyűjtött talajt adagolunk 250 ml Erlenmeyer-lombikban lévő 90 ml desztillált vízhez, és 2 órán keresztül forgó rázóberendezésben (220 fordulat/perc) rázzuk. A kapott talajszuszpenziót 10 lépésben 10~⁵ értékig hígítjuk. Az utolsó hígításból 1 ml mintát kiveszünk, és egy steril üveg Petri-csésze (15 cm átmérő) közepére helyezzük, majd mintegy 50 ml fenti izolálóközeget adunk hozzá, ami 25 pg/ml amfotericin B gombaölő szerrel van kiegészítve. Az elegyet 45 °C hőmérsékletre állítjuk, és alaposan összekeverjük. A talajszuszpenzió és a tápközeg elegyét hagyjuk leülepedni, és 7 napon keresztül 28±1 °C hőmérsékleten inkubáljuk. A tenyészetet rendszeresen figyeljük, és a fejlődő mikroorganizmusok közül HIL-006734 jelű mikroorganizmust (tenyészet száma: Y-9439786) izolálunk.

2. példa

HIL-006734 jelű mikroorganizmus fenntartása A HIL-006734 jelű mikroorganizmus fenntartását a következő fenntartóközegben végezzük:

Malátakivonat:	10,0 g
Glükóz:	4,0 g
Élesztőkivonat:	4,0 g
Aktidiol:	0,05 g
Agarpor:	13,0 g

lonmentesített víz: 1 liter pH: 7,0-7,5

A komponenseket melegítéssel alaposan feloldjuk, majd a kapott oldatot vizsgálati csövekbe töltjük, és 20 percen keresztül 121 °C hőmérsékleten sterilizáljuk. A vizsgálati csöveket lehűtjük, és ferde helyzetben hagyjuk megszilárdulni. A ferde agarközeg felületére dróthurokkal HIL-006734 tenyészetet kenünk, és 28±1 °C hőmérsékleten inkubáljuk a megfelelő növekedés eléréséig. A jól növekvő tenyészetet +8 °C hőmérsékletig hűtőszekrényben tároljuk.

Glicerines oltótenyészet előállítása
A tápközeg összetétele:
Élesztőkivonat:	4,0 g
Oldható keményítő:	15,0 g
K₂HPO₄:	1,0g
MgSO₄*7 H₂O:	0,5 g
lonmentesített víz:	1 liter
pH:	7,0
A fenti közeget 100 ml részletekben 300 ml-es Er-

lenmeyer-lombikokba töltjük, és 20 percen keresztül 121 °C hőmérsékleten sterilizáljuk. A lombikokat szobahőmérsékletre hűtjük, és beoltjuk a fent említett ferde agartenyészettel. Az inkubálást 5 napon keresztül forgó rázóberendezésen (180 fordulat/perc) végezzük 28 °C hőmérsékleten. A tenyészetből 1,5 ml mintát

1,5 ml glicerinnel (99%) keverünk, és -20 °C hőmérsékleten tároljuk.

3. példa

HIL-006734 jelű mikroorganizmus fermentálása rázólombikokban Az oltóközeg összetétele:

Glükóz: 15,0 g

Szójababliszt: 15,0 g

Kukoricalikőr: 5,0 g

CaCO₃: 2,0 g

NaCI: 5,0 g lonmentesített víz: 1 liter pH: 6,8-7,0

A közeg adott esetben kukoricalikőr nélkül is alkalmazható.

A fenti közeget 100 ml részletekben 500 ml Erlenmeyer-lombikokba töltjük, és 20 percen keresztül autoklávban sterilizáljuk. A lombikokat szobahőmérsékletre hűtjük, és egyenként 2. példa szerinti jól növekvő tenyészettel inokuláljuk. A tenyészetet 72 órán keresztül forgó rázóberendezésen (240 fordulat/perc) 27±1 °C hőmérsékleten rázva oltótenyészetet kapunk.

Termelőtenyészet közege:

Glükóz: 20,0 g

Szójababliszt: 10,0 g

CaCO₃: 0,2 g

COCI₂ ^x6 H₂O: 0,001 g lonmentesített víz: 1 liter pH: 6,8 vagy

Keményítő: 10,0 g

Glükóz: 10,0 g

HU 224 610 Β1

Glicerin (99%):	10,0 g
Kukoricalikőr:	2,5 g
Pepton:	5,0 g
Élesztőkivonat:	2,0 g
NaCI:	1,0g
CaCO₃:	3,0 g
lonmentesített víz:	1 liter
pH:	7,2

(sterilizálás előtt)

A fenti tenyészközeget 100 ml részletekben 500 ml Erlenmeyer-lombikokba töltjük, és 20 percen keresztül 121 °C hőmérsékleten sterilizáljuk. A lombikokat szobahőmérsékletre hűtjük, és 2 térfogat% fenti oltótenyészettel inokuláljuk. A fermentálást forgó rázóberendezésben (240 fordulat/perc) 27±1 °C hőmérsékleten végezzük 48 órán keresztül. Az antibiotikum termelését a bioaktivitás mérésével ellenőrizzük S. auerus 3066 és Ént. faecium VR-1 ellen a szokásos diffúziós módszerrel.

4. példa

HIL-006734 tenyészet tenyésztése fermentorban

Oltótenyészet előállítása rázólombikban

A 3. példa szerinti oltóközeget (150 ml) részletekben (1,000 ml) Erlenmeyer-lombikokba töltjük, és 20 percen keresztül 121 °C hőmérsékleten sterilizáljuk. Az oltótenyészetet ezekben a lombikokban tenyésztjük a 3. példában leírt módon.

Nagyléptékű fermentálás

Termelőközeg összetétele:

Glükóz: 20,0 g

Szójababliszt: 10,0 g

CaCO₃: 0,2 g

COCI₂*6 H₂O: 0,001 g lonmentesített víz: 1 liter pH: 7,0 vagy

Keményítő: 10,0 g

Glükóz: 10,0 g

Glicerin (99%): 10,0 g

Kukoricalikőr: 2,5 g

Pepton: 5,0 g

Élesztőkivonat: 2,0 g

NaCI: 1,0 g

CaCO₃: 3,0 g lonmentesített víz: 1 liter pH: 7,2 (sterilizálás előtt) liter termelőközeget töltünk két 22 l-es fermentorba, és 91 előállító közeget töltünk két 12 l-es fermentorba habosodásgátió anyagként 10 I fermentorra számítva 1 ml Desmophen hozzáadásával, majd 40 percen keresztül 121 °C hőmérsékleten sterilizáljuk. Ezután 27±1 °C hőmérsékletre hűtjük, és a 22 literes fermentorhoz 1,5 I, illetve a 12 literes fermentorhoz 0,75 I fent említett oltótenyészetet adunk.

A fermentálást a következő paraméterek között végezzük:

Hőmérséklet: 27 °C (±1 °C)

Kevertetés: 200 ford./perc

Levegőztetés: 15 l/perc (22 l-es fermentor), illetve 10 l/perc (12 l-es fermentor)

Betakarítási idő: 64 óra

Az antibiotikum termelésének meghatározásához mérjük a bioaktivitást, S. aureus 3066 és Ént. faecium VR-1 ellen, és HPLC analízist végzünk. A tenyészközeg végső értéke pH=7,0-7,5. A tenyészközeget betakarítjuk, centrifugáljuk, és az antibiotikumot a szűrletből és micéliumból az 5. vagy 6. példában leírt módon izoláljuk és tisztítjuk.

5. példa

Vankoreszmicin izolálása és tisztítása

I tenyészközeget betakarítunk, és centrifugálással elválasztunk 2,5 kg micéliumot és 501 tenyészszűrletet (pH=7,3). A micéliumot 2*201 metanollal extraháljuk, az extraktumokat egyesítjük, és csökkentett nyomáson bepároljuk. így 70 g nyersterméket kapunk. A tenyészszűrletet 2 n sósavval pH=5,5 értékre állítjuk, és 2,5 I Diaion HP-20 gyantával töltött oszlopon hajtjuk át. Az oszlopot 10 I vízzel, majd 15 I metanol/víz 1:1 eleggyel mossuk. A hatóanyag 15 I metanol/víz 3:1 elegy és 30 I metanol eluátumban található. A tisztítás mértékét biológiai vizsgálattal határozzuk meg S. aureus 3066 és Ént. faecium VR-1 ellen. Az aktív eluátomokat összeöntjük, és bepároljuk. így 15 g nyersterméket kapunk. Az egyesített nyerstermékeket Sephadex LH-20 oszlopon (2,5*90 cm) metanollal ismételten kromatografáljuk, és az aktív frakciókat egyesítjük, és bepároljuk. Ezt tovább kromatografáljuk Toyopearl TSK HW 40F oszlopon (6*35 cm) metanollal. Az aktív frakciókat egyesítjük, és csökkentett nyomáson bepároljuk. így 3 g félig tisztított anyagot kapunk. A végső tisztítást preparatív HPLC eljárással végezzük az alábbi körülmények között.

A félig tisztított anyagot Hibar-Lichospher RP-18 gyantával (10 gm) töltött preparatív HPLC oszlopra (25*250 mm) visszük, és metanol/0,01 mol/l foszfátpuffer (pH=6,5) 67,5:32,5 arányú eleggyel 23 ml/perc áramlási sebességgel eluáljuk. A detektálást 220 nm hullámhosszon végezzük. Az aktív eluátumokat egyesítjük, és csökkentett nyomáson bepároljuk. A maradékot Diaion HP-20 oszlopon (50 ml) acetonitril/víz 80:20 eleggyel eluálva sómentesítjük, és csökkentett nyomáson bepároljuk. Liofilizálás után 70 mg tiszta terméket kapunk.

6. példa

Vankoreszmicin izolálása és tisztítása

200 liter tenyészközeget betakarítunk, és centrifugálással micéliumot és tenyészszűrletet választunk szét. A micéliumot 30-40 I metanollal alaposan extraháljuk, és az extraktumot 1:10 arányban bepároljuk. A kapott színtelen csapadékot szűrve 30-50 g nyersterméket kapunk. Az anyagot HPLC eljárással tisztítjuk.

1. Oszlop: Fractogel TSK-HW 40 (41,

500*100 mm)

Eluens: metanol

Áramlási sebesség: 20 ml/perc Detektálás: 204 és 236 nm

HU 224 610 Β1

Az aktív frakciókat 125 perc után eluáljuk. Az egyesített frakciókat csökkentett nyomáson bepároljuk, és liofilizáljuk.

2. Oszlop: Silica Gél 60 (Merck), Erimatech (300*20 mm, 100 ml)

Eluens: A) CH₂CI₂:MeOH 9:1

B) CH₂CI₂:MeOH 3:1 + 1% Net₃

C) MeOH

Gradiens: perc % A % B % C

93

100

Áramlási sebesség: 25 ml/perc Detektálás: 236 és 288 nm

A vankoreszmicint tartalmazó frakciókat 32 perc után eluáljuk. Az egyesített frakciókat csökkentett nyomáson bepároljuk, és liofilizáljuk. A két tisztítóoszlop kitermelése 50%.

A vankoreszmicin fizikokémiai és spektroszkópiai adatait az 1. és 2. táblázatban adjuk meg, a különböző baktériumokkal szemben mutatott minimális inhibitorkoncentrációt (MIC) a 3. számú táblázatban adjuk meg.

Az 1. és 2. ábra az 1. táblázatra vonatkozik. Az

1. ábra a vankoreszmicin HPLC detektálásának eredményét, a 2. ábra a vankoreszmicin metanolban mutatott UV-spektrumát adja meg.

1. táblázat

Megjelenés

Oldékonyság

Olvadáspont

Wd

HPLC fehér szilárd anyag metanol, DMSO 141-143 °C -13° (c=0,2, metanol)

Vékonyréteg-kromatográfia [szilikagél (E. Merck 5554), n-BuOH/MeOH/víz (4:1:2)], Rf=0,6 retenciós idő=14,70 perc [oszlop: LiChrocart (250*4 mm) RP Select B (5 pm), eluens 0,1% vizes ortofoszforsav (pH=2,5) CH₃CN-gradiens 20 perc alatt, áramlási sebesség ml/perc, detektálás 220 nm] lásd

1. ábra, vagy [oszlop: Purospher Star RP 18e (Merck), 55*4 mm, pm, eluens: CH₃CN/0,01% H₃PO₄(85%)]

Gradiens: idő % CHoCN

0,00	5,0
3,00	95,0
5,00	95,0
6,00	5,0
10,00	5,0	55
Áramlási sebesség:	2 ml/perc
Hőmérséklet:	40 °C
Detektálás:	210, 254,280, 320 és 380 nm
Retenciós idő:	2,19 perc
ESI-MS:	1342 (M+H)^-	60

HR-FAB-MF: 1343,89142 (M+H)⁺ [számolt érték a θ7ΐ^Ηΐ27^Ν2θ2ΐ összegképlet alapján: 1343,889915 (M+H)-]

Összegképlet: C₇₁H₁₂₆N₂O₂₁

UV/látható: MeOH, X_max (Ioge)=234 nm (4,39), 280 nm (4,29) lásd 2. ábra

IR: KBr, v=3384 (br), 2934 (m), 1674 (m), 1616 (s), 1456 (s), 1381 (m), 1064 cm^-1, lásd 3. ábra ¹H-NMR: lásd 2. táblázat ¹³C-NMR: lásd 2. táblázat

2. táblázat

Vankoreszmicin ^{* 1 * 3}H- és ¹³C-NMR-spektroszkópiai adatai MeOD, 300 K

	¹H	«C
1	0,85	14,76
2	0,97	20,83
3	1,86	31,20
4	3,40	82,19
5	1,69	39,54
6	0,77	13,64
7	3,53	80,19
8	1,65	36,40
9	0,86	12,75
10	1,43	31,20
11	1,43	36,52
12	3,74	72,03
13	1,60/1,54	44,90
14	3,75	72,03
15	1,57/1,38	36,61
16	1,49/1,16	30,18
17	1,94	15,04
18	0,92	15,04
19	3,86	81,67
20	4,59	103,48
21	3,83	72,03
22	2,48	57,61
23	-	-
24	3,08	75,08 \|
25	3,21	74,66
26	1,27	18,29
27	1,52/1,42	39,35
28	3,96	65,82
29	1,49	42,39
30	3,79	72,47
31	4,31	73,26
32	6,61	142,09
33	-	138,52 \|

HU 224 610 Β1

2. táblázat (folytatás)

	¹H	”C
34	1,82	12,75
35	-	206,04
36	4,20	41,01
37	1,14	17,77
38	5,36	128,35
39	-	138,72
40	1,67	12,75
41	3,98	80,53
42	1,63	41,30
43	0,88	8,10
44	3,58	73,85
45	1,48	36,52
46	1,62/1,32	23,51
47	1,55/1,32	33,36
48	3,79	75,08
49	1,73	42,71
50	0,77	11,91
51	3,40	77,82
52	1,61	36,28
53	0,85	12,70
54	1,54/1,33	31,34
55	1,61/1,44	36,28
56	3,77	71,38
57	1,67/1,62	44,53 I
58	3,9	71,28
59	2,29	37,53
60	5,75	129,78
61	-	141,66
62	1,82	13,98
63	-	195,36
64	-	174,52
65	3,22	27,78
66	-	136,51
67	-	183,80
68	-	100,31
69	5,35	116,05
70	3,07	26,50
71	1,09	24,46
72	1,09	24,46

A 2. táblázatban megadott sorszámok a molekulának az (la) képletben ábrázolt részeit jelölik.

3. táblázat

Organizmus	MIC (pg/ml)
Staphylococcus aureus 209P	0,05
I S. aureus 20 240	0,05
S. aureus E-710	0,10
S. aureus SG511	0,05
S. aureus 3066	0,10
S. warneri 6563 II (2)	0,10
S. aureus E-712	0,10 \|
S. aureus 20 424	0,10
S. aureus Chantot 31 153	0,05
S. aureus Wein 11	0,05
S. aureus Wein 12	0,05
S. aureus 503 (Mers)	0,025
S. aureus Brussel 4115	0,05
S. aureus MLS-16	0,39
S. haemolyticus 809	0,05
S. epidermidis 825	0,10
S. epidermidis 823	0,20
S. epidermidis 607	0,10
S. epidermidis 5747 IW	0,10
Enterococcus faecalis ATCC 29 212	0,39
Ént. faecalis D 21 777	0,39
Ént. faecalis D 23 241	0,39
Ént. faecalis D 756	0,39
Ént. faecalis D 26 777	0,39
Ént. faecalis D 7F	0,39
Ént. faecium D-65	0,39
Ént. faecium 5601 (H)	0,39 I
Ént. faecium P-1	0,39 I
Ént. faecium P-2	0,39
Ént. faecium VR-1	0,39
Ént. hirae 55	0,39 I
Ént. durans 4939H	0,39 \|
Escherichia coli 9632 I	>100
E. coli super sen. 2231	>100
Pseudomonas aeruginosa M35	>100

Claims

SZABADALMI IGÉNYPONTOK

1. (I) képletű vankoreszmicin és ennek farmakológiailag alkalmazható sói és származékai, ezek valamennyi szetereoizomer és tautomer formájában. 5
2. HIL-006734 jelű Amycolatopsis fajba tartozó mikroorganizmus (DSM 12 216) vagy ennek mutánsa szén- és nitrogénforrást tartalmazó tápközegen aerob körülmények között történő tenyésztésével és a szokásos izolálással és tisztítással előállítható 10 C₇₁Hi₂₆N₂O₂₁ összegképletű vankoreszmicin és ennek farmakológiailag alkalmazható sói és származékai, ezek valamennyi sztereoizomer és tautomer formájában.
3. Eljárás az 1. vagy 2. igénypont szerinti vanko- 15 reszmicin vagy ennek sói, vagy származékai előállítására, azzal jellemezve, hogy a HIL-006734 jelű, Amycolatopsis fajba tartozó mikroorganizmust (DSM

12 216) vagy ennek mutánsát szén- és nitrogéntartalmú tápközegen tenyésztjük aerob körülmények között, majd a szokásos módon izoláljuk és tisztítjuk.
4. A 3. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy további lépésként a vankoreszmicint megfelelő reagenssel reagáltatva farmakológiailag alkalmazható sóvá vagy származékká alakítjuk.
5. HIL-006734 jelű, Amycolatopsis fajba tartozó mikroorganizmus (DSM 12 216) vagy ennek mutánsai.
6. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti vankoreszmicin vagy ennek farmakológiailag alkalmazható sói, vagy származékai gyógyszerként történő alkalmazásra.
7. Gyógyszerkészítmény, amely hatékony mennyiségben 1. vagy 2. igénypont szerinti vankoreszmicint vagy ennek farmakológiailag alkalmazható sóját, vagy származékát tartalmazza gyógyszerészeti hordozóanyag mellett.
8. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti vankoreszmicin és ennek farmakológiailag alkalmazható sói vagy származékai antibiotikumként történő alkalmazásra.