HU212592B - Method for producing antibodies genetechnologically - Google Patents
Method for producing antibodies genetechnologically Download PDFInfo
- Publication number
- HU212592B HU212592B HU886680A HU668088A HU212592B HU 212592 B HU212592 B HU 212592B HU 886680 A HU886680 A HU 886680A HU 668088 A HU668088 A HU 668088A HU 212592 B HU212592 B HU 212592B
- Authority
- HU
- Hungary
- Prior art keywords
- functional
- protein
- proteins
- antibody
- hapten
- Prior art date
Links
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title claims description 6
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 52
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 37
- 210000001322 periplasm Anatomy 0.000 claims abstract description 10
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims abstract description 9
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims abstract description 7
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims abstract description 7
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims abstract description 7
- 239000003463 adsorbent Substances 0.000 claims abstract description 4
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 23
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 16
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 15
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims description 11
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims description 8
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 claims description 6
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 claims description 6
- 230000003204 osmotic effect Effects 0.000 claims description 5
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 4
- 238000002955 isolation Methods 0.000 claims description 3
- 239000007791 liquid phase Substances 0.000 claims description 3
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 claims description 2
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 claims description 2
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 abstract description 6
- 238000010828 elution Methods 0.000 abstract description 4
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 abstract description 3
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 abstract description 3
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 abstract description 3
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 abstract 1
- 230000008878 coupling Effects 0.000 abstract 1
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 abstract 1
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 abstract 1
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 28
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 9
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 description 6
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 5
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 5
- 229950004354 phosphorylcholine Drugs 0.000 description 5
- PYJNAPOPMIJKJZ-UHFFFAOYSA-N phosphorylcholine chloride Chemical compound [Cl-].C[N+](C)(C)CCOP(O)(O)=O PYJNAPOPMIJKJZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 4
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 4
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 4
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 4
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 4
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 4
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 4
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 108700005078 Synthetic Genes Proteins 0.000 description 3
- 210000002472 endoplasmic reticulum Anatomy 0.000 description 3
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 3
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 3
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 3
- NJNWCIAPVGRBHO-UHFFFAOYSA-N 2-hydroxyethyl-dimethyl-[(oxo-$l^{5}-phosphanylidyne)methyl]azanium Chemical class OCC[N+](C)(C)C#P=O NJNWCIAPVGRBHO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000111471 Convolvulus scoparius Species 0.000 description 2
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 2
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 2
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 2
- JOCBASBOOFNAJA-UHFFFAOYSA-N N-tris(hydroxymethyl)methyl-2-aminoethanesulfonic acid Chemical compound OCC(CO)(CO)NCCS(O)(=O)=O JOCBASBOOFNAJA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 2
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 2
- 108010090127 Periplasmic Proteins Proteins 0.000 description 2
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 2
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000007994 TES buffer Substances 0.000 description 2
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 2
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 2
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 2
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 2
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 2
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 2
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 2
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 2
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 2
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 2
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 2
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 2
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 2
- 108700012359 toxins Proteins 0.000 description 2
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 1
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101100295756 Acinetobacter baumannii (strain ATCC 19606 / DSM 30007 / JCM 6841 / CCUG 19606 / CIP 70.34 / NBRC 109757 / NCIMB 12457 / NCTC 12156 / 81) omp38 gene Proteins 0.000 description 1
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 108010077805 Bacterial Proteins Proteins 0.000 description 1
- BTBUEUYNUDRHOZ-UHFFFAOYSA-N Borate Chemical compound [O-]B([O-])[O-] BTBUEUYNUDRHOZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000003813 Cis-trans-isomerases Human genes 0.000 description 1
- 108090000175 Cis-trans-isomerases Proteins 0.000 description 1
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000206602 Eukaryota Species 0.000 description 1
- 102000017727 Immunoglobulin Variable Region Human genes 0.000 description 1
- 108010067060 Immunoglobulin Variable Region Proteins 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-Proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 125000001429 N-terminal alpha-amino-acid group Chemical group 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 108010079246 OMPA outer membrane proteins Proteins 0.000 description 1
- 108010073038 Penicillin Amidase Proteins 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000006010 Protein Disulfide-Isomerase Human genes 0.000 description 1
- 101100084022 Pseudomonas aeruginosa (strain ATCC 15692 / DSM 22644 / CIP 104116 / JCM 14847 / LMG 12228 / 1C / PRS 101 / PAO1) lapA gene Proteins 0.000 description 1
- 108700005075 Regulator Genes Proteins 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 101150042295 arfA gene Proteins 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 238000006555 catalytic reaction Methods 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- OEYIOHPDSNJKLS-UHFFFAOYSA-N choline Chemical compound C[N+](C)(C)CCO OEYIOHPDSNJKLS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960001231 choline Drugs 0.000 description 1
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 description 1
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 230000003828 downregulation Effects 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 238000011067 equilibration Methods 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 1
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 1
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 1
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 1
- 229940099472 immunoglobulin a Drugs 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 210000003000 inclusion body Anatomy 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 1
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 1
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 238000000691 measurement method Methods 0.000 description 1
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 108091005573 modified proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000035118 modified proteins Human genes 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 101150087557 omcB gene Proteins 0.000 description 1
- 101150115693 ompA gene Proteins 0.000 description 1
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 1
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 1
- 101150009573 phoA gene Proteins 0.000 description 1
- LFGREXWGYUGZLY-UHFFFAOYSA-N phosphoryl Chemical group [P]=O LFGREXWGYUGZLY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 201000005484 prostate carcinoma in situ Diseases 0.000 description 1
- 108020003519 protein disulfide isomerase Proteins 0.000 description 1
- 230000012846 protein folding Effects 0.000 description 1
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 description 1
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 230000003595 spectral effect Effects 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 230000007704 transition Effects 0.000 description 1
- 108010087967 type I signal peptidase Proteins 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002023 wood Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
- C12N15/625—DNA sequences coding for fusion proteins containing a sequence coding for a signal sequence
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
- C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
- C07K2319/035—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal for targeting to the external surface of a cell, e.g. to the outer membrane of Gram negative bacteria, GPI- anchored eukaryote proteins
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
- Steroid Compounds (AREA)
Description
A találmány tárgya eljárás antitestek géntechnológiai előállítására.
Antitestek élesztőben történő kifejezése ismert (C. R. Wood, M. A. Boss, J. H. Kenten, J. E. Calvert, N. A. Roberts és J. S. Emtage: Natúré, 314, 446, 1985), de a kifejezett fehérjéknek csak nagyon kis része bizonyult hatásosnak. E. coliban antitest fehérjék eddig csak denaturált formában voltak előállfthatók (M. A. Boss, J. H. Kenten, C. R. Wood és J. S. Emtage: Nucleic Acids Rs. 12, 3791, 1984; S. Cabilly, A. D. Riggs, H. Pande, J. E. Shively, W. E. Holmes, M. Rey, L. J. Perry, R. Wetzel és H. L. Heyneker: Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81, 3273, 1984). Élesztőből vagy más mikroorganizmusokból nyert aktív antitestek vagy antitestfragmensek tisztítása nem ismert. Az eddigi fehérjehajtogatási kísérletek csak csekély százalékos arányban eredményeztek megfelelően hajtogatott rekombináns antitest fehérjét. A kívánt funkciós fehéije nehezen választható el a nem kívánt és nem funkciós fehérjéktől, ami a kötési állandók pontos mérését, a hajtogatott fehérje kitermelését, a spektrális tulajdonságokat lerontja és a terápiában vagy technológiában történő felhasználást megnehezíti. A hajtogatási körülmények optimalizálása ezért különösen nehéz, elsősorban azért, mert nem ismert megfelelő eljárás és mérési módszer a visszahajtogatásra.
Funkcionálisan teljes antitestek vagy antitestek funkcionális kötésterületének kifejezése bakteriális kifejező rendszerekben nem ismert és megvalósításának lehetőségeit negatívan értékelték. (S. L. Morrison: Science, 229, 1202, 1985; M. A. Boss és C. R. Wood: Immunoi. Today 6, 12, 1985).
Egy ilyen rendszer különösen előnyös volna, mivel a géntechnológiai eljárások elsősorban az E. coli vonatkozásában megfelelően ki vannak dolgozva, és a gyors növekedés lehetővé teszi a tömegtermelést, ami gazdaságilag nagyjelentőségű lenne.
A találmány tárgya eljárás funkcióképes antitestek, ezek funkcionális fragmenseinek vagy antitestdoménekből és más fehérjékből képzett fúziós fehérjék Gram-negatív baktériumokban, elsősorban E. coliban történő előállítására.
A találmány szerinti eljárás jellemző vonása, hogy az antites molekula vagy fragmens, vagy az antitest doménből és más fehérjéből álló fúziós fehéije egyes láncainak megfelelő géneket citoplazma-membrán-transzfer szignálszekvenciához kapcsoljuk, a kapott génszerkezetet szabályozható operon-rendszer formájában kapcsoljuk, és egy ismert vektorba beépítve Gram-negatív baktériumban kifejezzük és a funkciós fehérjét a periplazmatikus térből vagy közegből izoláljuk.
A találmány szerinti eljárás előnyös megvalósítási módjait az alábbiakban ismertetjük, illetve az igénypontokban definiáljuk.
A szignálszekvenciával ellátott láncoknak megfelelő gének kapcsolását előnyösen szabályozható operonrendszer kapcsolásával azonos módon végezzük, ami lehetővé teszi a közös szabályozószakasszal történő egyidejű kifejezést. Ily módon az egyes fehérjeláncok közel sztöchiometrikus arányban együtt fejeződnek ki, és a periplazmatikus térbe kerülnek, ahol funkcionális molekulává kapcsolódnak össze. A fehérjéknek a citoplazmából történő elszállítása önmagában ismert módon játszódik le (például 0 006 694 számú európai szabadalmi leírás).
Szabályozőszakaszként bármely megfelelő szabályozható génszabályozó szakasz felhasználható, például lac, tac, trp vagy szintetikus szekvenciák. Különösen előnyösek a megbízhatóan lehasítható szabályozószakaszok.
A fehérjéket a periplazmatikus térből előnyösen úgy izoláljuk, hogy az összegyűjtött sejtekre enyhe ozmotikus nyomást fejtünk ki és a kapott folyékony fázist ultraszűréssel vagy kicsapással, például sókkal, fgy ammónium-szulfáttal végzett kicsapással koncentráljuk.
Az enyhez ozmotikus nyomás hatására a periplazma a periplazmatikus térből kilép, míg a citoplazmatikus membrán intakt marad.
A fehérjekoncentrátumot, célszerűen dialízis után, egy adszorbensre, előnyösen affinitásoszlopra visszük, amely a megfelelő antigént vagy haptént hordozza. Megfelelő elúcióval, előnyösen az antigénnel vagy hapténnel végrehajtott elúcióval az antitestet, illetve a funkcionális antitest fragmenset kapjuk.
Eukarióta sejtekben az antitest az endoplazmatikus retikulum lumenjében - feltehetően diszulfid-izomerázok, prolin-cisz-transz-izomerázok és esetleg további enzimek vagy fehérjék közreműködésével - képződik. Meglepő, hogy baktériumsejtek is képesek a két láncot mintegy azonos sztöchiometriai mennyiségben előállítani, a két lánc előfehérjét a periplazmatikus térbe vagy az ezt körülvevő közegbe szállítani, a szignálszekvenciát pontosan lehasítani, a globuláris és oldható doméneket szabályosan hajtogatni, az intramolekuláris diszulfid kötéseket kialakítani, és a láncot heterodimérré asszociálni, mivel nem volt előre látható, hogy a baktériumsejtek rendelkeznek az ilyen vagy ezekkel egyenértékű enzimekkel. Meglepő továbbá, hogy Gram-negatív baktériumok esetén a bakteriális periplazma ebben a vonatkozásban funkcionálisan ekvivalens az eukarióta endoplazmatikus retikulum lumenjével.
A találmány szerinti eljárás egy sor előnnyel rendelkezik:
Eltekintve nagymennyiségű baktérium könnyű és gyors fermentálásától, közvetlenül funkciós fehérjék képződnek, és így elkerülhető a fúziós fehérjék hasítása, a kívánt fehérje vagy fehérjefragmens izolálása, ezek oxidálása vagy in vitro visszahajtogatása.
A találmány szerinti eljárás során a celluláris proteázok sem okoznak problémákat. Ismert ugyanis, hogy a celluláris proteázok miatt fehérjék baktériumban általában fúziós fehérje, elsősorban oldhatatlan zárványtest formájában exprimálódnak, ami magával hozza a fent említett bonyolult feldolgozási műveleteket. Ezzel szemben, a találmány szerinti eljárás során gyors és egyszerű leválasztással és tisztítással homogén terméket kapunk.
A találmány lehetővé teszi antitestek, funkcionális fragmensek, valamint a természetes antitesttől eltérő aminosavak beépítésével, kiiktatásával és/vagy kicse2
HU 212 592 Β rélésével kialakított, módosított antitestek könnyű előállítását. így például lehetővé válik a cisztein kiiktatása vagy más aminosavra történő kicserélése a nemkívánatos hajlat megszűntetésére. Lehetséges továbbá egér antitestek humán antitesttel történő összeépítése vagy más mutációk kialakítása. A farmakológiai és technológiai felhasználási területek mellett lehetővé válik az antitest szerkezetek és funkciók, valamint az enzimatikus katalízis alapjainak közelebbi kutatása (V. Raso és B. D. Stollar: Biochemistry, 14, 584, 1975; V. Raso és B. D. Stollar: Biochemistry, 14, 591, 1975; A. Tramontano, K. D. Janda és R. A. Lemer: Science, 234,1566, 1986; S. J. Pollack, J. W. Jacobs és P. G. Schultz: Science, 234, 1570, 1986; J. Jacobs, P. G. Schultz, R. Sugasawara és M. Powell: J. Am. Chem. Soc. 109, 2174, 1987).
A találmány lehetővé teszi továbbá vizsgálati rendszereknek közvetlenül az adott funkcionális antitestet előállító bakteriális sejten történő alkalmazását, és így az esetlegesen mutált antitest gyors felismerését.
Az antitest molekula egy vagy több aminosav megváltoztatásával történő módosítása mellett lehetséges az is, hogy az antitest génbe más génszakaszokat ültetünk be, vagy egyes szakaszokat inért génszakaszokra cserélünk ki. Ezáltal funkcionális antitest doménekből és más fehérjékből álló fúziós fehérjék jöhetnek létre, így beépíthetők jelzőenzimek (M. S. Neuberger, G. T. Williams és R. O. Fox: Natúré, 312, 604, 1984), toxinok (G. Möller: Antibody carriers of drugs and toxins in tumor therapy, Immuno. Rév. 62, Munksgaard, Copenhangen, 1982) vagy más osztályba tartozó immunoglobulin szakaszok (M. S. Neuberger, G. T. Williams, Ε. B. Mitchell, S. S. Jouhal, J. G. Flanagan és T. H. Rabbitts: Natúré, 314,268, 1985), illetve más fajhoz tartozó immunoglobulin szakaszok (P. T. Jones, P. H. Dear, J. Foote, M. S. Neuberger és G. Winter·. Natúré, 321,522, 1986).
A találmány szerinti eljárást közelebbről a foszforilkolint megkötő antitest mielóma fehérje McPC603 változtatható doménjának példáján mutathatjuk be. Az egér immunoglobulin A háromdimenziós szerkezete ismert (D. M. Segal, E. A. Padlan, G. H. Cohen, S. Rudikoff, M. Potter és D. R. Davies: Proc. Natl. Acad. Sci. 71, 4298, 1974). A példában a változtatható VL könnyűlánc és VH nehézlánc szintetikus génjét alkalmazzuk. Ezeket a géneket a 37 15 033 számú német szövetségi köztársaságbeli közrebocsátási irat, illetve a 0 290 005 számú európai közrebocsátási irat és a 15 631/88 számú ausztrál közrebocsátási irat (lásd annak 1. és 2. táblázatát) ismerteti. Az ilyen szintetikus gének különösen előnyös kialakítását ismerteti a fenti táblázat, amelyben a teljes kifejező plazmid DNS szekvenciája szerepel, és a két lánc génjeit az aminosavak adják meg. A DNS szekvencia kialakítása során az E. coli által ritkán alkalmazott kodonokat kiiktattuk. Ezenkívül szinguláris restrikciós enzim hasítóhelyeket építettünk be és figyelembe vettük az RNS szekunder szerkezetét is.
A modellként alkalmazott funkcionális antitest fehérjében minden dómén intramolekuláris diszulfid híddal rendelkezik (Cys 23-ból Cys 94-be a VL esetén és Cys 22-ből Cys 98-ba a VH esetén). Nincs azonban láncok közötti diszulfid híd vagy szabad cisztein.
Az alkalmazott pASK 22 kifejezővektort vázlatosan az 1. ábra mutatja.
Ebben a vektorban a VL és VH doméneknek megfelelő szintetikus génekhez egyrészt a külső membrán fehéije A (ompA) bakteriális szignál szekvenciájának megfelelő génfiragmensek, másrészt lúgos foszfatáz + kódoló génfragmens (phoA) kapcsolódik. A két előfehérjének megfelelő gén meseterséges operonszerű rendszerben a lac promotor mögött van elhelyezve, ami biztosítja a két gén egyidejű indukcióját, kifejezését és kiválasztását.
A génkifejezés indulálása után a sejteket begyűjtjük és enyhe ozmotikus nyomásnak tesszük ki. A keletkező folyadékfázist, amely tartalmazza a periplazmatikus fehérjéket, ultraszűréssel koncentráljuk, dializáljuk és közvetlenül egy affinitásoszlopra visszük fel, amely affinitás ligandumként foszforilkolin-származékot (B. Chesebro és H. Metzger: Biochemistry, 11, 766, 1972) tartalmaz. Foszforilkolinnal történő eluálás után homogén Fv ffagmenst kapunk, amely gélelektorforetikusan egységes. Az SDS-poliakrilamid gél eletroforézisből arra lehet következtetni, hogy a tisztított Fv fragmens mindkét lánca 1:1 mólarányban fordul elő és az érett fehérje várt móltömegét mutatja (VH: 13 600 D, VL: 12 400 D). A két szignálszekvencia korrekt lehasításának igazolására mindkét lánc hat N-terminális aminosavját szekvenáljuk. Az eredmény szerint mindkét lánc az érett fehérjének megfelelő N-terminális részt mutatja. A bakteriális szignálpeptidáz tehát mindkét heterológ előfehérjét megfelelően hasította, és nincs olyan rész, amely pontatlan folyamatra vagy N-terminális leépítési reakciókra utalna.
Az McPC603 rekombináns Fv fragmensének affinitáskonstansát egyensúlyi dialízissel mérjük. Ennek során az egér antitestből izolált természetes McPC603 antitest affinitáskonstansának meghatározásakor alkalmazottakkal azonos körülmények között dolgozunk. Az Fy fragmensre 1,21 ± 0,06 x 105 M'1 érték a kísérleti pontosságon belül azonos a természetes antitestnél mért 1,6 ± 0,4 x 105 M_1 értékkel. A Scatchardféle kötési görbe (Ann. N.Y. Acad. Sci. 51, 660, 1949) egyenes és az extrapolálás szerint minden Fv fragmens molekulához közel egy molekula haptén kötődik.
Megállapítható tehát, hogy Fv fragmensenként csak egy kötési hely típus van, és az izolált fehérjékben nem találhatók inaktív alkotórészek.
Meglepő módon azt találtuk tehát, hogy az McPC603 antitest Fv fragmense E. coliban teljes mértékben funkcionál és stabil fehérjeként előállítható. Ezt bizonyítja, hogy a baktériumsejt periplazmájába történő szállítás funkcionálisan ekvivalens az eukarióta sejtek endoplazmatikus retikulumának lumenjébe történő szállítással. Ez az ekvivalencia eddig nem ismert és nem volt várható, mivel az eddig legjobban jellemzett bakteriális fehérje, amely a periplazmában oldható heterodimer fehérjeként jelentkezik, vagyis az E. coli penicillin aciláz, az egyláncú előfehérjéből proteoliti3
HU 212 592 B kus folyamat során a periplazmában képződik (G. Schumacher, D. Sizmann, H. Hang, P. Buckel és A. Böck: Nucleic Acids Rés. 14, 5713, 1986). Ezenkívül utaltunk már arra, hogy jelenlegi ismereteink alapján a baktériumok nem rendelkeznek olyan enzimekkel, vagy fehérjékkel, amelyek eukariótákban részt vesznek a hajtogatásban.
Meglepő volt továbbá, hogy az McPC603 Fv fragmense foszforilkolin vonatkozásában lényegében azonos affinitáskonstanst mutat, mint maga az intakt McPC603 antitest. Ez az eredmény nem volt előre várható, mivel az irodalomban vitatják az Fv fragmens funkcionalitását (J. Sen és S. Beychok: Proteins, 1,256,1986). Kimutatható, hogy a konstans domének módosítása, vagy akár teljes kiiktatása megtartja a funkcionalitást.
Az Fv fragmensek előállítására eddig ismert egyetlen módszerrel, vagyis az antitest proteolízisével szemben a találmány szerinti eljárás során nem kell számolni nemfunkcionális, nem megfelelően hajtogatott, nem megfelelően reasszociált vagy kémiailag módosított fehérjékkel. Az izoláláshoz előnyösen alkalmazott antigén vagy haptén tartalmú adszorbens felhasználható az ismert eljárással előállított Fv fragmens előállítására, mivel az ilyen szennyezőanyagok vagy nem kötődnek meg, vagy nem eluálódnak.
1. példa pASK22 plazmid előállítása
A pASK22 kifejező plazmidot a pUC12 nagy EcoRI-HindlII-fragmensből (C. Yanisch-Perron, J. Vieira és J. Messing: Gene 33, 103, 1985), a pIN III-OmpAl vektorok fragmenséből (Y Hasúi, J. Coleman és M. Inouye: Experimental Manipulation of Gene Expression, M. Inouye, ed. Academic Press, 1983) és pHI61ből (H, Inouye, W. Bames és J. Beckwith: J. Bacteriol. 149, 434, 1982), valamint különböző szintetikus DNS fragmensekből több lépésben önmagában ismert módon (T. Maniatis, E. F. Fritsch és J. Sambrook: Molecular Cloning, Cold Spring Harbor, 1982) állítjuk elő. A kapott pASK22 vektor teljes DNS szekvenciáját a 2. ábra mutatja. A szintetikus DNS fragmensek szekvenciáit a 3. és 4. ábrák mutatják, ahol megjelöltük az egyes hasítási helyeket és a komplementaritást meghatározó CORI-CDRÜI szakaszokat. A nukleotid szekvencia alatt megadjuk az aminosav szekvenciát is, amikor is a nehéz VH lánc változó szakaszát ábrázoló 3. ábrán az egybetűs kódokat, míg a könnyű VL lánc változó szakaszát ábrázoló 4. ábrán a hárombetűs kódokat használjuk.
A ligáló eleggyel kompetens E. coli sejteket transzformálunk, és ampicillin rezisztenciára kiválogatjuk. A kívánt génszerkezetű plazmidot restrikciós analízissel, valamint a kritikus átmenetek szekvenálásával jellemezzük.
2. példa
Fv fragmens előállítása pASK22-vel transzformált W3110E. coli törzsek 100 mg/ml ampicillint tartalmazó LB közegben történő tenyészetét ÓD55() = 0,5 értékig tenyésztjük. A kifejeződést 1 mmól/1 végkoncentrációjú IPTG adagolással indukáljuk. 45 perc elteltével a sejteket centrifugálással 4000 g mellett (10 perc, 4 *C) begyűjtjük. A sejtpelletet TES-pufferben (0,2 mól/1 Tris-HCl, pH = 8,0,0,5 mmól/I EDTA, 0,5 mól/1 szacharóz) az eredeti tenyészetre számolva 10 ml/1 értékben szuszpendáljuk, majd sejtfrakcionálást hajtunk végre. A sejteket az eredeti tenyészetre vonatkoztatott 15 ml/1 TES-puffer, amelyet 1:4 arányban vízzel előzetesen hígítunk és amely 2 mmól/1 foszforilkolint tartalmaz, hozzáadásával enyhe ozmotikus nyomásnak teszünk ki. Jégen 30 percen keresztül inkubáljuk, majd a szuszpenziót 10 percen keresztül 5000 g mellett centrifugáljuk és a felülúszót ismét 15 percen keresztül 48 000 g mellett centrifugáljuk. Az így kapott felülúszót, amely az összes oldható periplazmatikus fehérjét tartalmazza, ultraszűréssel (AMICON YMS membrán) az eredeti tenyészetre vonatkoztatva mintegy 2,5 ml/1 térfogatra bekoncentráljuk és BBS pufferrel (0,2 mól/1 borát/NaOH, pH = 8,0, 0,16 mól/1 nátrium-klorid) szemben dializáljuk. A koncentrált oldatot foszforilkolin-származékot (B. Chesebro és H. Metzger: idézett műve) tartalmazó affinitásoszlopra visszük (1-4 ml oldat 1 ml töltetre számolva), BBS pufferrel mossuk és a tiszta Fv ffagmenst 1 mmól/1 foszforilkolint tartalmazó BBS pufferral eluáljuk.
3. példa
Egyensúlyi dialízis
A membrán mindkét oldalán mintegy 100 mikroliter térfogatú dializáló kamrában az egyik oldalra 50 mikroliter tisztított Fv fragmens BBS pufferben felvett elegyét és a másik oldalra 50 mikroliter foszforil(metil-14C)-kolin (50 mCi/mmól) BBS pufféiban felvett oldatát töltjük. Az OD20S = 6,85 értéknél az Fv fragmens 0,22 mg/ml koncentrációt mutat (R. K. Scopes: Protein Purification-Principles and Practice, Springer-Verlag, New York, 1982, 241. oldal). Az egyensúlyt hagyjuk 22 óra alatt szobahőmérsékleten beállni, majd mindkét oldatból 20 mikroliteres mintát szcintillációs számlálóban (Beckmann LS 1801) mérünk és az adatokat Sctachard (lásd idézett mű) szerint feldolgozzuk. A kapott egyenes meredekségből számítható affinitás konstans Kj, = 1,21 ± 0,06 x 103 M-1.
Claims (4)
1. Eljárás funkcionális fehérjeként funkcionális antitestek, antitestek funkcionális fragmenseinek vagy funkcionális antitest doménekből és más fehéijékböl álló fúziós fehérjék előállítására, azzal jellemezve, hogy a funkcionális antitest vagy az antitest funkcionális fragmensének láncait vagy az antitest doménekből és más fehéijékböl álló fúziós fehérjét kódoló géneket citoplazma membrántranszfer szignálszekvenciával kapcsoljuk, a kapott génszerkezeteket szabályozható operon-rendszer formájában kapcsoljuk, és egy ismert vektorba beépítve Gramnegatív baktériumban kifejezzük, és a funkciós fehérjét a periplazmatikus térből vagy közegből izoláljuk.
2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy baktériumsejtként E. coli sejtet alkalmazunk.
3. Az 1-2. igénypontok szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a funkcionális fehérjének a periplazmati4
HU 212 592 Β kus térből történő izolálását úgy végezzük, hogy a leválasztott baktériumsejteket szabályozott ozmotikus nyomásnak tesszük ki, majd a keletkező folyadékfázist centrifugálással dúsítjuk és a koncentrátumból a kívánt fehérjét kinyerjük. 5
4. Az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a funkciós fehérjét tartalmazó oldatot megfelelő antigént vagy haptént tartalmazó adszorbensre visszük és a kívánt fehérjét az antigént vagy haptént tartalmazó oldattal eluáljuk.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE19873744595 DE3744595A1 (de) | 1987-12-31 | 1987-12-31 | Verfahren zur gentechnischen herstellung von antikoerpern |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| HUT49169A HUT49169A (en) | 1989-08-28 |
| HU212592B true HU212592B (en) | 1996-08-29 |
Family
ID=6343878
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| HU886680A HU212592B (en) | 1987-12-31 | 1988-12-30 | Method for producing antibodies genetechnologically |
Country Status (12)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0324162B1 (hu) |
| JP (1) | JP2771204B2 (hu) |
| KR (1) | KR970007861B1 (hu) |
| AT (1) | ATE102651T1 (hu) |
| AU (1) | AU628310B2 (hu) |
| DE (2) | DE3744595A1 (hu) |
| DK (1) | DK732988A (hu) |
| ES (1) | ES2063022T3 (hu) |
| HU (1) | HU212592B (hu) |
| IE (1) | IE62257B1 (hu) |
| PT (1) | PT89362B (hu) |
| ZA (1) | ZA889711B (hu) |
Families Citing this family (28)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4816567A (en) | 1983-04-08 | 1989-03-28 | Genentech, Inc. | Recombinant immunoglobin preparations |
| US5618920A (en) * | 1985-11-01 | 1997-04-08 | Xoma Corporation | Modular assembly of antibody genes, antibodies prepared thereby and use |
| US5576195A (en) * | 1985-11-01 | 1996-11-19 | Xoma Corporation | Vectors with pectate lyase signal sequence |
| US6172197B1 (en) | 1991-07-10 | 2001-01-09 | Medical Research Council | Methods for producing members of specific binding pairs |
| US6916605B1 (en) | 1990-07-10 | 2005-07-12 | Medical Research Council | Methods for producing members of specific binding pairs |
| US7063943B1 (en) | 1990-07-10 | 2006-06-20 | Cambridge Antibody Technology | Methods for producing members of specific binding pairs |
| GB9015198D0 (en) | 1990-07-10 | 1990-08-29 | Brien Caroline J O | Binding substance |
| GB9206318D0 (en) * | 1992-03-24 | 1992-05-06 | Cambridge Antibody Tech | Binding substances |
| SE9101433D0 (sv) * | 1991-05-13 | 1991-05-13 | Marianne Hansson | Recombinant dna sequence and its use |
| US5858657A (en) * | 1992-05-15 | 1999-01-12 | Medical Research Council | Methods for producing members of specific binding pairs |
| US5962255A (en) * | 1992-03-24 | 1999-10-05 | Cambridge Antibody Technology Limited | Methods for producing recombinant vectors |
| US6225447B1 (en) | 1991-05-15 | 2001-05-01 | Cambridge Antibody Technology Ltd. | Methods for producing members of specific binding pairs |
| US6492160B1 (en) | 1991-05-15 | 2002-12-10 | Cambridge Antibody Technology Limited | Methods for producing members of specific binding pairs |
| US5871907A (en) | 1991-05-15 | 1999-02-16 | Medical Research Council | Methods for producing members of specific binding pairs |
| WO1993006217A1 (en) * | 1991-09-19 | 1993-04-01 | Genentech, Inc. | EXPRESSION IN E. COLI OF ANTIBODY FRAGMENTS HAVING AT LEAST A CYSTEINE PRESENT AS A FREE THIOL, USE FOR THE PRODUCTION OF BIFUNCTIONAL F(ab')2 ANTIBODIES |
| US5837491A (en) * | 1991-11-04 | 1998-11-17 | Xoma Corporation | Polynucleotides encoding gelonin sequences |
| US5621083A (en) * | 1991-11-04 | 1997-04-15 | Xoma Corporation | Immunotoxins comprising ribosome-inactivating proteins |
| US6146850A (en) * | 1991-11-04 | 2000-11-14 | Xoma Corporation | Proteins encoding gelonin sequences |
| DE69233782D1 (de) | 1991-12-02 | 2010-05-20 | Medical Res Council | Herstellung von Autoantikörpern auf Phagenoberflächen ausgehend von Antikörpersegmentbibliotheken |
| WO1993012246A1 (en) * | 1991-12-18 | 1993-06-24 | The University Of Calgary | Expression-secretion vectors for the production of biologically active fv fragments |
| US5733743A (en) * | 1992-03-24 | 1998-03-31 | Cambridge Antibody Technology Limited | Methods for producing members of specific binding pairs |
| US7368111B2 (en) | 1995-10-06 | 2008-05-06 | Cambridge Antibody Technology Limited | Human antibodies specific for TGFβ2 |
| GB9705376D0 (en) * | 1997-03-14 | 1997-04-30 | Harris William J | Antibody fragment formulations and assay formats for detecting the presence an d concentration of analytes |
| US6492497B1 (en) | 1999-04-30 | 2002-12-10 | Cambridge Antibody Technology Limited | Specific binding members for TGFbeta1 |
| EP1908769A1 (en) * | 2001-08-27 | 2008-04-09 | Genentech, Inc. | A system for antibody expression and assembly |
| MXPA04001566A (es) * | 2001-08-27 | 2004-05-17 | Genentech Inc | Un sistema para expresion y ensamblado de anticuerpos. |
| JP5226697B2 (ja) * | 2007-01-12 | 2013-07-03 | ダウ グローバル テクノロジーズ エルエルシー | 浸透圧によって細胞にショックを与えるための装置および方法 |
| EP3080629B1 (en) | 2013-12-12 | 2023-11-08 | Koninklijke Philips N.V. | Method to enable standard alternating current (ac)/direct current (dc) power adapters to operate in high magnetic fields |
Family Cites Families (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB8308235D0 (en) * | 1983-03-25 | 1983-05-05 | Celltech Ltd | Polypeptides |
| EP0196864A3 (en) * | 1985-03-25 | 1988-03-23 | Cetus Corporation | Alkaline phosphatase-mediated processing and secretion of recombinant proteins, dna sequences for use therein and cells transformed using such sequences |
| EP0234592A1 (en) * | 1986-02-28 | 1987-09-02 | Teijin Limited | Plasmid containing DNA fragment coding for human immunoglobulin G Fc region protein and use thereof for production of said protein |
| JPS62201581A (ja) * | 1986-02-28 | 1987-09-05 | Rikagaku Kenkyusho | 新規プラスミド、微生物細胞及びヒト免疫グロブリンＧ Ｆｃ領域蛋白質の製造方法 |
| WO1989000605A1 (en) * | 1987-07-16 | 1989-01-26 | Codon | Transfected cells containing plasmids having genes oriented in opposing directions and methods of obtaining the same |
| CA1341235C (en) * | 1987-07-24 | 2001-05-22 | Randy R. Robinson | Modular assembly of antibody genes, antibodies prepared thereby and use |
-
1987
- 1987-12-31 DE DE19873744595 patent/DE3744595A1/de not_active Ceased
-
1988
- 1988-12-24 EP EP88121675A patent/EP0324162B1/de not_active Revoked
- 1988-12-24 AT AT88121675T patent/ATE102651T1/de not_active IP Right Cessation
- 1988-12-24 ES ES88121675T patent/ES2063022T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1988-12-24 DE DE88121675T patent/DE3888337D1/de not_active Revoked
- 1988-12-28 JP JP63335695A patent/JP2771204B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1988-12-29 KR KR1019880017762A patent/KR970007861B1/ko not_active Expired - Fee Related
- 1988-12-29 ZA ZA889711A patent/ZA889711B/xx unknown
- 1988-12-29 PT PT89362A patent/PT89362B/pt not_active IP Right Cessation
- 1988-12-30 HU HU886680A patent/HU212592B/hu not_active IP Right Cessation
- 1988-12-30 DK DK732988A patent/DK732988A/da not_active Application Discontinuation
- 1988-12-30 AU AU27617/88A patent/AU628310B2/en not_active Ceased
- 1988-12-30 IE IE389388A patent/IE62257B1/en not_active IP Right Cessation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| DK732988D0 (da) | 1988-12-30 |
| ATE102651T1 (de) | 1994-03-15 |
| ES2063022T3 (es) | 1995-01-01 |
| PT89362A (pt) | 1989-12-29 |
| HUT49169A (en) | 1989-08-28 |
| DE3744595A1 (de) | 1989-07-13 |
| AU628310B2 (en) | 1992-09-17 |
| DE3888337D1 (de) | 1994-04-14 |
| KR890010203A (ko) | 1989-08-07 |
| EP0324162A1 (de) | 1989-07-19 |
| JP2771204B2 (ja) | 1998-07-02 |
| DK732988A (da) | 1989-07-01 |
| IE62257B1 (en) | 1995-01-11 |
| PT89362B (pt) | 1993-08-31 |
| JPH02799A (ja) | 1990-01-05 |
| IE883893L (en) | 1989-06-30 |
| ZA889711B (en) | 1989-09-27 |
| EP0324162B1 (de) | 1994-03-09 |
| AU2761788A (en) | 1989-07-06 |
| KR970007861B1 (ko) | 1997-05-17 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| HU212592B (en) | Method for producing antibodies genetechnologically | |
| Melchers et al. | Growth control of activated, synchronized murine B cells by the C3d fragment of human complement | |
| Terzaghi et al. | Change of a sequence of amino acids in phage T4 lysozyme by acridine-induced mutations. | |
| Shapiro et al. | Expression of Met-(− 1) angiogenin in Escherichia coli: conversion to the authentic< Glu-1 protein | |
| Shapiro et al. | Identification of functional arginines in human angiogenin by site-directed mutagenesis | |
| GB2272698A (en) | Fusion peptides which bind to streptavidin | |
| JPH06500006A (ja) | ユビキチン特異的プロテアーゼ | |
| US11390652B2 (en) | Transcriptional regulatory fusion polypeptide | |
| JPH0753118B2 (ja) | 原核宿主生物によるジスルフィド架橋された蛋白質の分泌の際に天然蛋白質の立体配座の形成を向上させる方法 | |
| Gray et al. | Pseudomonas aeruginosa secretes and correctly processes human growth hormone | |
| KR870000501B1 (ko) | 사람의 프로인슐린의 아미노산 배열을 함유하는 단백질의 제조방법 | |
| JPH02501108A (ja) | 微生物によるヒト副甲状腺ホルモンの生産 | |
| US5037744A (en) | Process for the microbiological preparation of human serum albumin | |
| CA2159079C (en) | Methods and dna expression systems for over-expression of proteins in host cells | |
| JP4333880B2 (ja) | コンドロイチン合成酵素および該酵素をコードするｄｎａ | |
| Emerick et al. | Expression of a β-lactamase preproinsulin fusion protein in Escherichia coli | |
| JP4338038B2 (ja) | コンドロイチン合成酵素および該酵素をコードする核酸 | |
| KR950010817B1 (ko) | 사카로미세스 세레비시아에에서 재조합 인간 psti의 제법 | |
| JP2540039B2 (ja) | プラスミドベクタ− | |
| RU2143492C1 (ru) | Рекомбинантная плазмида, кодирующая гибридный белок - предшественник инсулина человека (варианты), штамм бактерий e.coli - продуцент гибридного белка - предшественника инсулина человека (варианты), способ получения инсулина человека | |
| CN110607304A (zh) | 肝细胞生长因子的重组表达方法 | |
| JP2637392B2 (ja) | 遺伝子操作による生物活性β−ＮＧＦの生産方法 | |
| JPH06311884A (ja) | プラスミド及びそれで形質転換されたエ シェリチア・コリ | |
| RU2144082C1 (ru) | Рекомбинантная плазмида, кодирующая гибридный белок-предшественник инсулина человека (варианты), штамм бактерий e.coli - продуцент гибридного белка-предшественника инсулина человека (варианты) и способ получения инсулина человека | |
| Ribó et al. | Production of Human Pancreatic Ribonuclease inSaccharomyces cerevisiaeandEscherichia coli |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| HMH4 | Cancellation of final prot. due to relinquishment |