HU218081B - Daganatokhoz kötődő monoklónozott 88BV59 jelzésű antitest - Google Patents

Abstract

A találmány tárgya 88BV59 jelzésű transzformált humán B-sejt, amelynekATCC letéti száma CRL 10624. A találmány tárgyához tartozik a fentisejttel előállított monoklonális antitest, valamint ezzel reaktívepitóp is. ŕ

Description

A találmány tárgyát olyan új monoklónozott antitest képezi, amelyet rákos betegek, tumorantigénnel aktívan immunizált B-sejtjeiből származó transzformált B-sejtvonal segítségével állítunk elő. Az így kapott monoklónozott antitestet diagnosztikai és terápiás eljárásokban egyaránt alkalmazhatjuk humán betegek kezelésére. A találmány tárgyát képezi a nehéz és könnyű láncok variációs régióinak elkülönítése és szekvenálása, továbbá az ezekben lévő komplementer determináns régiók azonosítása is.

A találmány tárgyát képező új humán monoklónozott antitestek specifikusan reagálnak olyan antigénekre, amelyek bizonyos rákféleségekkel vannak asszociálva; a találmány szerinti megoldással olyan transzformált Bsejtvonalat állítunk elő, amelyek aktívan immunizált betegek perifériás B-vérsejtjeiből származnak.

A találmány tárgyához tartoznak ezenkívül azok a diagnosztikai és rákterápiás eljárások, amelyek során ezeket a monoklónozott antitesteket alkalmazzák.

Jelenleg a rák kezelésére elsősorban a besugárzást, valamint a kemoterápiát alkalmazzák; ezen kezelések alapfeltétele az, hogy a rákos sejtek viszonylag érzékenyebben reagálnak e kezelésekre, mint az egészséges sejtek. Azonban ezen terápiák alkalmazásánál korlátot képeznek az egészséges sejteknél fellépő, súlyosan toxikus tünetek. Ezzel szemben az antitestmolekulák az antigénnel szemben kiváló specifitást mutatnak. A kutatók ezért arra törekednek, hogy olyan antitesteket különítsenek el, amelyek specifikusak a ráksejtek vonatkozásában, és amelyeket a rég keresett „mágikus lövedékének tekinthetünk a rákterápiában [Science, 216., 283. (1982)].

Az antitestek olyan proteinmolekulák, amelyeket a csontvelő által képezett B-sejt-limfociták állítanak elő, és amelyek ezután a véráramba kerülnek, és itt találhatók meg. Bármely, a testbe kerülő antigén - például bármely idegen molekula, amely származhat akár egy egyszerű szerves vegyületből vagy akár egy bonyolult fehérjéből - hatására antitestek képződnek a szervezetben, amelyek a szervezetbejutott idegen kémiai vegyületekkel kapcsolódnak. Az antigénen lévő speciális kémiai szerkezetet, amelyhez az antitest kötődhet, antigéndeterminánsnak vagy epitópnak nevezzük. A testben lévő B-sejt-limfociták - amelyeket B-sejteknek, limfocitáknak vagy leukocitáknak is neveznek - több száz millió eltérő, genetikailag programozott sejt formájában fordulnak elő, ahol mindegyik limfocita különböző determinánsra nézve specifikus antitestet termel. Az antitesttermelést stimuláló antigének felületén többféle determináns is lehet. A B-sejt és az antigén találkozásakor, az esetben, ha a B-sejt felszínén az adott antigéndeterminánsra nézve specifikus antitest található, elindul a B-sejt megsokszorozódása. Ez a klónozott szaporodás nagyszámú leánysejt termelését eredményezi, amelyeket az antitest a véráramban választ ki.

Minthogy az antitestek képesek az antigéneket specifikusan felismerni, és erre kötődni, ezért kívánatos, hogy nagy mennyiségben állítsunk elő olyan antitesteket, amelyek specifikusak egy adott determinánsra nézve, és csak olyan antigénekhez vagy szövetekhez kötődnek, amelyek ezen speciális determinánst hordozzák.

A B-sejtek nem szaporodnak folyamatos tenyészetben, hacsak ezen sejteket valamely immortalizált (állandó fennmaradásra képes) sejttel való hibridizáció révén vagy pedig vírusos vagy tumor-DNA-transzformációval nem módosítjuk. Monoklónozott antitestek állíthatók elő olyan B-limfocita-sejtvonal segítségével, amelyet előzőleg spontán módon vagy mesterséges beavatkozással valamely limfotróp vírussal, így például Epstein-Barr-vírussal (EBV) transzformáltak. A transzformáció egyéb szerek segítségével is elvégezhető, így például vírusos eredetű DNA vagy sejtből származó DNA segítségével. Ezek a sejtek, ellentétben a hibridoma sejtekkel, normális humánkromoszóma-számmal (46) rendelkeznek.

Monoklónozott antitestek előállíthatok tiszta formában is, egyéb immunoglobulin szennyeződéstől mentesen. A monoklónozott antitesteket előállító sejtek segítségével gyakorlatilag korlátlan mennyiségben állíthatók elő olyan antitestek, amelyek egy adott antigéndeteiminánsra nézve specifikusak.

Feltételezhető, hogy ha rendelkezésre állnának adott ráksejtre nézve specifikus antitestek, ezek alkalmazhatók lennének különböző diagnosztikai és kezelési eljárásokban. Ezen antitestek a sejtdeterminánsra tapadva a ráksejteket inaktiválhatnák vagy elpusztíthatnák. Másik lehetőségként ezen antitestek a limfociták vagy makrofágok felületére tapadva ezeket a tumorantigénekre specifikus sejtkillerekké (sejtpusztítókká) alakíthatják.

Ezenkívül a monoklónozott antitestek növelhetik a kemoterápiás gyógyszerek, toxinok, radioaktív izotópok specifikus jellegét is; ily módon megnövelik ezek hálását, miközben csökkentik ezek toxicitását azáltal, hogy ezekhez kötődnek. A radionukleidokkal vagy fém nyomjelzőkkel összekapcsolt antitestek ezenkívül felhasználhatók fotonemissziós és nukleáris magnetorezonancia-felvételekhez az in vivő diagnózisoknál és a metasztázisok fekvésének megállapításánál. Az antitestek felhasználhatók tumorantigének vérben való jelenlétének kimutatására a rákdiagnosztikában és/vagy a rákprognózisánál. A monoklónozott antitestek alkalmazhatók továbbá a tumorantigének elkülönítéséhez az ezekből készült vakcina előállításánál.

Az antitestek a fajtára jellemző állandó tartományok mellett változó tartományokat is tartalmaznak mind a nehéz (V_H), mind a könnyű (V_L) láncon. Ezek az antitesten lévő változó tartományok határozzák meg a kötés specifikusságát, és az antitesten lévő, adott epitóphoz kötődő változó régió eltér az egyéb epitóphoz kötődő antitest változó régiójától. Abból a célból, hogy az antitesteket terápiás vizsgálati célra szánt gyógyszerekhez vagy izotóp fémekhez kössük, feltételezhetően elegendő az antitest azon részét alkalmazni, amely aktívan részt vesz az immunokonjugátumok képzésében. A nehéz és könnyű láncokat tartalmazó kiegészítő régiók azonosítása és szekvenálása révén olyan felvilágosítást is kaphatunk, ami a változó és multifunkciós antitestek előállításánál felhasználható. E célból elkülönítettük és szekvenáltuk a változó régiókat, és meghatároztuk az epitópok megkötésében részt vevő régiók szekvenciáját.

HU 218 081 Β

Az irodalomból ismertek olyan törekvések, amelyek célja humán rákra specifikus monoklonális antitestek előállítása; az eddigi kísérleteknél a B-sejt tekintetében két utat választottak:

1. humán ráksejttel szemben immunizált egerek lépőből extraháltak B-sejteket (4 172 124 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás);

2. rákbetegektől nyert perifériás vérből vagy rákhoz kapcsolódó nyirokcsomókból vettek le B-sejteket.

Egyik megoldás sem adott kedvező eredményt.

A humán rákkal szemben immunizált egerek igen széles spektrumú ellenanyagot adtak. Vagyis az immunizált egértől nyert monoklonális antitestek egyaránt reagáltak egészséges és rákos szöveteken lévő antigénekkel. Az előállított nagyszámú különböző antitestek közül igen nehéz elkülöníteni azokat az antitesteket, amelyek csak a rákos sejtekkel reagálnak. így például a humán tüdőrákkal immunizált egerektől 20 000 hibridomát nyertek, majd ezeknek a ráksejttel szembeni reaktív képességét vizsgálták. A vizsgálatok eredménye igen kis mértékű (<0,4%), ezzel szemben a találmány kidolgozása során az immunizált rákbetegektől nyert, immortalizált B-sejtekből 16%-os eredménnyel lehetett olyan monoklonális antitesteket kinyerni, amelyek a ráksejtekre nézve specifikusak voltak. Ezen túlmenően az egerektől nyert B-sejtből kapott monoklonális antitesteket csak korlátozott mértékben lehetett a rák kezelésére használni. Ismételt felhasználás után ugyanis a beteg immunrendszerét arra ösztönözték, hogy „antiegér” antitesteket termeljen; a klinikai vizsgálatok azt mutatták, hogy ezáltal az egerektől nyert monoklonális antitestek hatásossága lényegesen csökkent. Minthogy a találmány szerinti megoldásnál humán eredetű monoklonális antitesteket alkalmazunk, ezek a nehézségek nem merülnek fel. Ha kizárólag variábilis régiókat vagy csak a komplementer determináns régiókat (CDR) használjuk, kevésbé lép fel az immunogenitás lehetősége. A kisebb molekulák, így például V_H vagy egy egyedülálló CDR gyorsan kiürülnek a szervezetből, ezt a körülményt gyors in vivő diagnosztikai szereknél értékesíthetjük.

A humán és az egér eredetű monoklonális antitesteknél másik jól észlelhető különbség az immunohisztokémiai foltképzés jellegében van. A régebbi vizsgálatok azt mutatták, hogy az egérből származó antitestek gyakran mutatnak heterogén foltképzést a rákos sejteknél. Ez a tulajdonság némely szerző szerint a ráksejtek antigénheterogenitásának tudható be. [Hand és munkatársai: Cancer Research, 43., 728-735. (1983)]. Ezzel szemben a találmány szerint előállított monoklonális antitestek homogénen reagálnak a ráksejtekkel szemben. Az egerektől származó monoklonális antitestek heterogén foltképzése feltehetően azzal magyarázható, hogy a humán ráksejttel immunizált egereknél antigénverseny indul meg, amelynek eredményeként nagyobb mennyiségben következik be reakció a szövettípusra specifikus antigénekkel, mint a viszonylag kisebb számban jelen lévő ráksejteken lévő antigénekkel. A humán autológ immunizáció révén olyan antigénekkel szemben hatásos antitestek képződnek, amelyekkel szemben az egérben csekély immunogenitás jelentkezik. Ebből arra következtethetünk, hogy eltérő rákantigénnel szemben lép fel válasz az emberben, mint az egérben. Ezzel a feltételezéssel áll összhangban az az észleletünk, hogy az általunk előállított első 36 humán monoklonális antitest egyike sem reagált a karcinoembrionális antigénnel (CEA), amely antigént gyakran felismerik a humán ráksejtek ellen szánt, rágcsálóktól származó monoklonális antitestek.

A humán monoklonális antitestek előállítására irányuló kísérletek nagy részénél kiindulási anyagként rákos betegek perifériás véráramából vagy nyirokcsomójából extrahált B-sejteket használtak. Feltételezték, hogy rák antigén jelenlétében a rákos betegben egy immunreakció lép fel az adott rákkal szemben, amikor is specifikus immun B-sejtek képződnek. Ezért a rákos betegektől a rákos daganathoz kötődő nyirokcsomóból vagy a perifériás véráramban keringő limfocitákból B-sejteket vettek le. Azonban a találmány szerinti megoldást megelőzően csak csekély eredménnyel lehetett rákspecifikus monoklonális antitesteket előállítani.

Humán rákdaganat antigénjeivel szemben specifikus monoklonális antitestek előállításának fő problémája mindig az volt, hogy nem sikerült megtalálni a csak specifikusan immun B-sejtek forrását. [Science, 216., 285. (1982)]. Humán betegeknél a ráksejtek hosszú ideig szaporodnak a kezdeti helyen - az emberi élettartam 1- 10%-át kitevő időtartamig -, mielőtt a betegség fennforgására vonatkozóan bármilyen értékelhető klinikai bizonyíték állna rendelkezésre. Ez idő végére a betegek a rákdaganattal szemben már immunológiailag hiporeszponzívakká vagy akár immunológiailag toleránssá válnak. Ezért nem sikerülhetett a találmány szerinti megoldást megelőzően reprodukálható módon a ráksejtekkel szemben reakcióképes humán monoklonális antitesteket kinyerni.

A találmány szerinti új eljárásnál egy eredményes megoldást dolgoztunk ki monoklonális antitestek kinyerésére; eszerint perifériás B-vérsejteket veszünk le betegektől, akiket saját rákdaganatukból vett sejtekkel immunizálunk specifikus vakcinakészítmények formájában. Aktívan specifikus immunoterápiát végzünk, ennek során a betegeket a saját rákdaganatukból vett sejtekkel immunizáljuk. Ezt a megoldást azon feltételezésünk alapján választottuk; hogy a rákdaganatokban lévő sejtekben rákspecifikus antigének találhatók.

A rákdaganat sejtjeivel szemben pozitív immunválaszt adó betegek az aktivált B-sejtek kedvező forrását képezik. Azt találtuk, hogy azon betegek perifériás vérárama, amelyeket aktívan immunizálunk saját rákdaganataikkal szemben, az aktivált B-sejtek bő forrását nyújtják.

Klinikai vizsgálatokkal igazoltuk, hogy pozitív immunválaszt idézhetünk elő, ha a rákbetegeknél bőrvizsgálatokat végzünk, vagyis vizsgáljuk a késleltetett bőr-hiperérzékenységet (DCH). Az immunizált betegek késleltetett hiperérzékenységet mutatnak saját ráksejtjeikkel szemben. Ezenkívül az immunizált betegek B-sejtjeiből nyert monoklonális antitestek reagálnak más betegekben lévő azonos szövettani típusú ráksejtekkel is.

HU 218 081 Β

Immunizációs kísérleteink kezdetén csak feltételezéseink voltak, de a kísérleti eredmények messzemenően igazolták, hogy lehetséges olyan B-sejtek képzése, amelyek az antigénhez kapcsolódó ráksejteken lévő epitópokra nézve specifikusan reagáló antitesteket termelnek. Az állatkísérletek során csak az immunizáció terápiás hatását ellenőriztük és mértük; ezen eredményekre alapoztuk a humán immunizációs módszert; a rákra specifikus antitestek termelését nem állatkísérleteken végeztük.

A betegeknél jelentkező általános immunválasz, amit a beteg állapotán bekövetkező javulás követ, szolgál a sejtválasz felléptének igazolására; a sejtválasz eredményeként a makrofágok és a T-sejtek a ráksejtantigének jelenlétében aktiválódnak, és elpusztítják a ráksejteket. Noha feltételezhető volt, hogy az immunizáció hatására minden körülmények között antitestválasz lép fel, az antitestválasz és a sejtválasz időbeli lefutása minden esetben eltérő lehet. Az a körülmény pedig, hogy a beteget saját ráksejtjeivel immunizáljuk - noha a korábbi kísérletezők azt tapasztalták, hogy nem lép fel antitesttermelés vagy csak igen kis mértékű a saját ráksejttel kezelt betegnél -, nem várt kedvező előrehaladásnak tekinthető, amelynek eredményeként feltaláltuk, hogy az immunizációt követően a B-sejtek képesek a ráksejtekre specifikus antitesteket termelni.

„A 88BV59 jelzésű, autológ bélráksejtekkel immunizált betegből származó humán IgG monoklonális antitestszövet reaktivitását röviden ismertették a Proceedings of the American Association fór Cancer Research, 32, 261. oldalán az 1553. számú kivonatban. A 88BV59 jelzésű, technéciummal jelzett antitest in vitro és in vivő tulajdonságait ugyanezen a kiadvány 184. és a 244. oldalán az 1097. és 1453. kivonatban ismertették.”

Felismerésünk következtében olyan vakcinát sikerült előállítani, amellyel eredményesen végezhető specifikus immunizáció; ezenkívül eljárást dolgoztunk ki az immunizált humán B-sejtek kinyerésére; továbbá módszert dolgoztunk ki humán monoklonális antitesteket termelő sejtvonal, valamint monoklonális antitestek folyamatos előállítására.

A találmány feladata olyan humán monoklonális antitest előállítása, amely specifikusan reagál a rákhoz kötődő antigénekkel, és minimálisan reagál a nem rákos szöveteken lévő antigénekkel. Ezen antitestek segítségével lehetségessé vált a rák kimutatása és diagnosztizálása, valamint a beteg kezelése az adott típusú rák ellen. Találmányunk feladata továbbá ezen tulajdonságokkal rendelkező humán monoklonális antitestek azonosítása, elkülönítése, immortalizálása és ezen antitesteket termelő sejtvonal tenyésztése. Találmányunk feladata ezenkívül a kiválasztott antitest változó régióinak szekvenálása, az antigének epitopjaihoz kötődő nehéz és könnyű láncok, valamint a komplementer determináns régió elkülönítése és azonosítása.

A találmány tárgyához tartozik a CO88BV59 jelzésű EBV-vel transzformált humán B-sejtvonal, amely humán IgG₃ κ-t termel, ami specifikus reakciókészséget mutat egy humán végbélrákdaganat antigénjén talált epitóppal szemben; továbbá a találmány tárgya ezen antitest komplementer determináns régióinak azonosítása és szekvenálása.

A találmány tárgya közelebbről egy humán sejtvonal, egy immortalizált (állandó fennmaradásra képes) humán B-sejtvonal, amelyet CO88BV59 EBV-vel transzformáltunk. E sejtvonal humán IgG₃ κ antitestet termel, amely specifikusan reakcióképes egy végbélrákdaganat antigénjén lévő epitóppal szemben; ezen rákantigén-epitópot az 5338 832 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban (beadva: 1989. február 29-én) írták le. Ezen antigént először a 16-88 jelzésű IgM antitest segítségével azonosították [lásd a 4 997 762 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírást, bejelentés száma: 07 038 811, április 15. (1987)]. Mind az IgG₃ κ 88BV59, mind az IgM 16-88 képes ezt a rákdaganathoz kapcsolódó antigént elismerni, azonban az azonos antigénen eltérő epitóppal reagálnak.

A találmány szerinti megoldást az alábbi példák szemléltetik.

1. példa

Erzékenyített B-sejtek előállítása Aj A betegek kiválasztása

Az aktív specifikus immunoterápiás vizsgálatokhoz olyan betegeket választottunk, akiken vastagbél-vagy végbélrákdaganat miatt sebészeti műtétet végeztek. A véletlenszerű kiválasztásnál figyelembe vettük a betegség stádiumát, és ráksejteket vettünk le minden olyan betegtől, amelyek eleget tettek a klinikai kritériumoknak. A vizsgálatokhoz olyan bél/végbél rákos betegeket választottunk, akik előzőleg nem mutattak rákos megbetegedést, továbbá akik előzőleg nem részesültek sem besugárzásban, sem kemoterápiás kezelésben, valamint akik egészségi állapota kielégítő volt, így kórházon kívüli kezelésben részesülhettek. A kísérletekhez olyan betegeket választottunk, akiknél a rákdaganat a bélfalon átnyúlt (Astler-Coller B2), továbbá akiknél pozitív nyirokcsomók találhatók (Cl, C2-es stádium), tov ábbá akiknél a betegség metafázisban volt (D stádium). A fent definiált betegeket találomra osztottuk be kezelt és kezeletlen csoportokba. A véletlen beosztást mutató kártyát komputer adta ki az operációt követően mindkét kategóriában.

B) A ráksejtek levétele

A sebészeti műtét után a levett mintát azonnal a kórházi patológiai osztályra szállítottuk, és steril körülmények között bontottuk fel. A daganatos szövetet felszeleteltük, 50 pg/ml gentamicintartalmú Hank-féle sóoldatot (HBSS) tartalmazó steril csövekbe helyeztük; a mintákat azonnal jegeltük és fagyasztottuk.

C) A szilárd rákdaganat és rákos bélnyálka szeletelése

A Peters és munkatársai-féle [Cancer Research, 39.,

1353-1360. (1979)] szövetszeletelési módszert alkalmaztuk steril körülmények között, lamináris áramlás alatt. A rákos szövetet háromszor öblítettük, gentamicint tartalmazó HPSS-oldattal, az öblítést centrifugacsövekben végeztük, majd jegelt Petri-csészékbe vittük. A külső szövetrészt eltávolítottuk, majd a rákdaganatot felszeleteltük mintegy 2-3 mm átmérőjű szeletekre. A szövet-maradékokat 75 ml-es edénybe helyeztük (az edény

HU 218 081 Β tartalma: 20-40 ml, 0,14% (200 egység/ml) 1-es típusú kollagenáz (Sigma C-01030) és 0,1% (500 Kunitz egység/ml) 1-es típusú dezoxi-ribonukleáz (Sigma D-0876) (DNAase 1, Sigma D-0876); előzőleg 37 °C hőmérsékletre felmelegítve. Az edényeket 37 °C hőmérsékletű vízfürdőre helyezzük, az edényben működő mágneses keverő sebességét úgy állítjuk be, hogy ne okozzon habképződést. 30 perc inkubációs idő eltelte után a szabad sejteket dekantáljuk, 3 réteg steril, közepesen nedves nejlonszűrőn (166t; Martin Supply Co., Baltimore, Maryland) 50 ml-es centrifugacsövekbe. A sejteket 1200 rpm (250 xg) sebességgel centrifugáljuk hűtés közben 10 percig. A felülúszót elöntjük, majd a sejteket 5-10 ml DNAase-ba (0,1 %-os HBSS-sel készült oldat) újra szuszpendáljuk; az elegyet 5-10 percig 37 °C hőmérsékleten tartjuk. A csövet HBSS-oldattal feltöltjük, centrifugálással mossuk, HBSS-ben újraszuszpendáljuk (15 ml), majd jégen tartjuk. A műveletet mindaddig megismételjük, amíg elegendő sejtet nem kapunk; ráksejtek esetében ez háromszori öblítést igényel. Ezután a kapott sejteket egyesítjük, számláljuk, a sejtek életképességét tripánkék kizárási módszerrel vizsgáljuk. Ezután a sejteket újracentrifügálva még egyszer mossuk, majd hűtéssel konzerváljuk.

D) Fagyasztásos konzerválás

Az optimális fagyasztásos konzerválás egy elsődleges szempont. Vakcinakészítményeknél a ráksejtekből 5-8 χ 10⁷/ml HBSS szuszpenziót készítünk, ezt azonos térfogatban lehűtött kétszeres térfogatú fagyasztóközeghez adjuk; ez utóbbi 15% dimetil-szulfoxidot (DMSO) és 4% humán szérumalbumint (HSA) tartalmaz. A kapott 2-4xlO⁷ sejt/ml koncentrációjú szuszpenziót 1,2 ml-es Nunc-féle fagyasztóedénybe adagoljuk. A DCH-sejtek vizsgálatánál a fentiek szerint járunk el, azzal az eltéréssel, hogy nem alkalmazunk HSA-t. Mindkét esetben a fagyasztás előkészítésénél a Nuncféle edényeket jégre helyezve CryoMed model 990 Biological Freezer készülékbe helyezzük [ehhez csatlakozik egy Model 700-as (controller) egység a hőmérséklet szabályozására, és egy Model 500-as (temperatur recorder) a hőmérséklet feljegyzésére], így szabályozott hűtést biztosítunk a vizsgálati anyagnak. Ügyelünk arra, hogy az edényekben - beleértve a monitoredényt is - a hűtési folyamat elején azonos legyen a hőmérséklet. Az edényeket szabályozott hűtéssel 1 °C/perc sebességgel -80 °C végső hőmérsékletre lehűtjük. Ezután az edényeket folyékony nitrogénbe ágyazva helyezzük át a folyékony nitrogén alkalmazásával működő tárolóba.

E) Klinikai vizsgálatok

A megfelelő patológiás stádiumban lévő rákbetegeket találomra csoportosítva részben saját ráksejtből készült BCG-vakcinával kezeljük, a kontrollbetegek nem részesülnek vakcinakezelésben. A D stádiumban lévő betegek mindegyike 5-fluoruracil kemoterápiát kap, és azon betegek, akik végbélrák miatt műtéten estek át, 5040 R röntgensugárzást kapnak 2 héttel az immunoterápia befejezte után. A vakcinakezelést 4-5 héttel a rákműtét után kezdjük el, ily módon elegendő időt hagyva a betegeknek, hogy az anesztetizálás és a sebészeti beavatkozás okozta immunszupresszió után felerősödjenek. 3-4 héttel a műtét után mind a kontroll-, mind a kezelt csoporton bőrvizsgálatot végzünk standard emlékeztető antigént, valamint saját ráksejtet alkalmazva. Emlékeztető antigénként a következőket használjuk: mumpsz bőrvizsgálati antigén, USP, Eli Lilly, Indianapolis, Indiana; Aplisol, PPD (Tuberculin tisztítottfehéije-származék), Parke-Davis, Detroit, Micigan; Trichophyton, 1:30 hígításban, Center Laboratories, Port Washington, New York; és Candida albicans 1:100 hígításban, Center Laboratories, Port Washington, New York; minden egyes oltóanyagból 0,1 ml-t adunk be intradermálisan az alsó karra, majd 24 és 48 óra eltelte után az oltás helyén vizsgáljuk az erythema felléptét.

A kezelésre kiválasztott betegeknek háromhetente vakcinainjekciót adunk intradermálisan; az első két vakcina 10⁷ besugárzott saját ráksejtet és 10⁷ BCG-t tartalmaz; az utolsó vakcinában csak 10⁷ ráksejt van. A frissen fagyasztott BCG Tice-t (szállító Dr. Crispen Raay, University of Illinois Medical Center, Chicago, Illinois) -70 °C hőmérsékleten tároljuk. Az első vakcinát a bal csípő alsó részére, mintegy 10 cm-rel a csípő alá, a másodikat a jobb csípő megfelelő helyére, a harmadikat jobb oldalon adjuk be.

Fj Vakcina készítése

A vakcinakészítés körülményeit az 1. táblázat tartalmazza. Az első és a második vakcina beadásának napján a tartóedényt gyorsan 37 °C hőmérsékletre vízfürdő segítségével felmelegítjük, a ráksejteket lassan 15 ml HBSSoldattal meghígítjuk, centrifügálva (1200 rpm) egyszer mossuk, majd 15 ml HBSS-oldattal újraszuszpendáljuk. Sejtszámlálást végzünk, és tripánkék vizsgálattal ellenőrizzük a sejtek életképességét. Az életképesség 7-90%osnak mutatkozott, átlagérték: 80%. A sejteket centrifügá lássál (1200 rpm) még egyszer mossuk, majd 15 ml HBSS-oldattal újraszuszpendáljuk. A ráksejt-szuszpenziot jégre helyezzük, és 4020 rad/perc intenzitással 20 000 R-rel besugározzuk. A sejtszuszpenzió térfogatát úgy állítjuk be, hogy 10⁷ életképes ráksejt maradjon a csőben (1,3xlO⁷ életképes sejtet veszünk, figyelembe véve a csőben és az injekciós tűben bekövetkező veszteséget, továbbá a limfoidsejtek azonosításánál esetleg fellépő 20%-os téves azonosítást). A sejteket centrifugáljuk, a f elülúszót eltávolítjuk, és 10⁷ BCG-t adunk a sejtekhez 0,1 ml térfogatban. A térfogatot HBSS-oldattal 0,2 ml-re kiegészítjük. A harmadik vakcinát a fentiekhez hasonlóan készítjük a BCG elhagyásával.

A vakcinaszuszpenziót 20-as tűvel 1,0 ml-es fecskendőbe felszívjuk. Az intradermális injekció beadásához a 20-as tűt 27-esre cseréljük, a fecskendőt jégre téve szállítjuk a klinikára.

A betegeket a vakcina beadása után megvizsgáljuk, ellenőrizve, hogy az injekció beadásának helyén fellép-e erythema, láz, limfadenopátia vagy egyéb rendellenesség. Az első két vakcina beadási helye 2-3 hét eltelte után elfekélyesedik, de általában 10-12 hét alatt begyógyul.

2. példa

Humán monoklonális antitesteket termelő sejtek előállítása

HU 218 081 Β

A) B-sejtek levétele a betegektől, és ezen sejtek immunizálása

Egy héttel az első vakcina beadása után a második immunizáció időpontjában, majd egy héttel ezt követően, a harmadik vakcina beadásának időpontjában vért veszünk a betegektől. A vénás vért aszeptikusán fogjuk fel konzerválószertől mentes heparinban (O’Neill, Jones és Feldman, St. Louis, Missouri) oly módon, hogy a végső koncentráció 17 egység/ml legyen. A vért szobahőmérsékleten tároljuk, és haladék nélkül a laboratóriumba szállítjuk a levételtől számított néhány órán belül.

A vért 1:2 arányban meghígítjuk kalciumtól és magnéziumtól mentes HBSS-oldattal, 4 ml-t ebből 3 ml limfocita szeparációs közeghez (LSM, Litton Bionetics) adunk, majd az elegyet 15 ml-es centrifügacsőben 30 percig 400 xg sebességgel centrifugáljuk. A felületen lévő sejteket eltávolítjuk, azonos térfogatú HBSSoldattal háromszor meghígítjuk, majd centrifugálva a szilárd anyagot kicsapjuk (1000 rpm sebességgel 10 percig végezve a centrifugálást). A perifériásvérlimfocitákat 10 ml szérummentes Hepes-féle pufferoldattal (Dulbecco’s MÉM, DMEM) újraszuszpendáljuk, számláljuk majd életképességüket ellenőrizzük.

B) EBV- transzformáció

Az immunizált betegek perifériás véráramából vett B-sejteket szándékosan transzformálószerek hatásának tesszük ki, így olyan folyamatosan szaporodó sejtvonalat kapunk, amely monoklonális antitesteket termel. Transzformálószerként EBV-t használunk, noha bármely egyéb olyan limfotrop vírust vagy egyéb olyan transzformálószert is használhatunk, amely képes a Bsejteket folyamatosan szaporodóvá alakítani, amely sejtek azonban még megtartják a ráksejtekhez kapcsolódó, antigénekre nézve specifikus monoklonális antitesteket termelő képességüket.

Eljárásunk szerint a heparinizált vért elkülönítjük LSM-gradiensen, a mononukleáris sejteket a felületről leszedjük. A kapott mononukleáris sejteket felhasználhatjuk azonnal, vagy további transzformációhoz félretehetjük fagyasztott állapotban.

A limfocitákat friss vagy fagyasztott állapotban frakcionálatlanul vagy a nem B-sejtektől elkülönítve alkalmazzuk. Sejtszámlálást végzünk és 2-6 χ 10⁶ sejtet centrifügálással lecsapunk. A lecsapott sejteket 5 ml, frissen tenyésztett Epstein-Barr-vírust tartalmazó oldattal újraszuszpendáljuk; ezen folyadékot úgy nyerjük, hogy B95-8 sejteket 4-6 napig tenyésztünk, a tenyészetet leszüreteljük, a felülúszót hígítás nélkül 4 °C hőmérsékleten 15 percig tartó centrifügálással tisztítjuk (2000 rpm), majd 0,8 mikronos szűrővel a sejteket eltávolítjuk. A felhasznált B95-8-as sejtet Dr. Tostado Gtől (Division of Biologics, FDA) szereztük be. A sejteket és az EBV-t 37 °C hőmérsékleten 90 percig inkubáljuk, ezen idő alatt a vírus adszorbeálódik. Az adszorpciós idő alatt a sejteket időnként felrázzuk.

A sejteket vizsgálati nyílásokba helyezzük, a nyílások besugárzott tápsejteket tartalmaznak (így J774-et). A J774 (ATCC, Rockville, Md.) egerektől származó makrofág vonal, előzőleg 20 000 R-rel lett besugározva, majd fagyasztva. A találmány szerinti eljárásnál a fagyasztott sejteket felmelegítjük, majd 96 vizsgálati nyílást tartalmazó lemezre helyezzük 1 nappal a B-sejtvonal EBV transzformációja előtt. Lyukanként 5xl0³ sejtet viszünk fel a lemezre.

A sejttenyészetnél a táptalajt hetente kétszer cseréljük mintegy 6-8 hétig. Azokból a vizsgálati nyílásokból, amelyek intenzív sejtszaporodást mutatnak, a felülúszó folyadékból mintát veszünk, ezt megvizsgálva elkülönítjük azokat a tenyészeteket, amelyek humán immunoglobulint termelnek; a kiválasztott sejtvonalakat továbbtenyésztjük a 4 828 911 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban ismertetett módszer szerint, ahol a monoklonális antitesteket termelő sejtek elkülönítését és szaporítását írják le.

A kiválasztott humán immunoglobulinokat termelő sejteket továbbtenyésztjük, és kiválasztjuk azokat, amelyek rákkal szemben aktívak; ezen vizsgálatokhoz humán tumorxenograftot használunk. A 88BV59-et olyan blokk segítségével vizsgáljuk, amelyen négy, humán végbélkarcinómával beoltott fagyasztott egérbőrmetszet található. Az antitesteket megjelöljük.

Cj Monoklonális antitestek termelése

Humán monoklonális antitesteket termelő sejteket Rl’MI 1640 táptalajban tenyésztünk (Gibco, Grand Island, New York), a táptalajt kiegészítjük 10%-os botjúembrió-szérummal, 3 mmol L-glutaminnal és 5 pg/ml gentamicinnel. Némely esetben a táptalajhoz 25% D-glükózt is adunk (végső koncentráció: 0,25%). A sejteket 37 °C hőmérsékleten (35-38 °C) 7,5% CO₂-tartalmú nedveslevegő-atmoszférában tartjuk. A metabolitokat tartalmazó elhasznált táptalajtól az antitesteket elkülönítjük a táptalajmentes sejtek kicsapása révén (például 500 rpm fordulattal, 15 percig centrifugálást végezve).

3. példa

A monoklonális antitesteknek a normális és rákszövetekkel szemben mutatott reakcióképességének vizsgálata

Az antitestek nagy része lényegesen csökkent mértékű kötődést mutatott a normális bélnyálkával szemben. A paraffinszekcióval szemben reakcióképes antitestekkel vizsgálatokat végeztünk, a normális szövetekkel szembeni reakciókészségüket ellenőrizve. A 88BV59 negatív reakcióképességet mutatott az alábbi normális humán szövettel szemben: petefészek, méh, vagina, mellékvesekéreg, prosztata, tiroid, thymus, nyirokcsomók, lép, csontvelő, miokardium, agyhártyasejtek, bőr, szövetsejtek. A 88BV59 csekély reakcióképességet mutat az alábbi szövetekkel szemben: vastagbél (kefeszegély és felszíni mirigyek), vékonybél (kefeszegély és felszíni mirigyek), gyomor (szívgödör és felszíni mirigyek), nyelőcső (mirigyek), hasnyálmirigy (vezeték és exokrin mirigyhám), vese (a gyűjtőcsatomácskák 50%-a), nyak [hámbevonat (a szövetek 2/3-a pozitívnak mutatkozott)], mell (vezeték és mirigyhám), tüdő (alveolaris és hörgősejtek), agy [csillagsejtek (a szövetek 2/3-a pozitívnak mutatkozott], gerincvelő (neuropilema), bőr (a bőrben lévő mirigyek 50%-a) és máj (epevezeték).

A 88BV59-nek a humán ráksejtvonalakkal szembeni reakciókészségét a 2. táblázat szemlélteti. A 3. táb6

HU 218 081 Β lázatban a 88BV59-nek a rákszövetféleségekkel szemben mutatott reakcióképessége látható.

A találmány szerinti megoldással a ráksejtek felszínén lévő antigénekkel szemben reakcióképes monoklonális antitestek előállítását dolgoztuk ki, amely antitestek alkalmazhatók in vivő körülmények között; diagnózisokhoz és a rák immunoterápiájához; ezenkívül a találmány szerinti eljárással előállított monoklonális antitesteket a humán rákimmunitással kapcsolatos antigének elkülönítésére és jellemzésére használhatjuk. Az elkülönített antigének felhasználhatók ezenkívül a rákvakcina előállításához is. A találmány szerinti megoldásnál antitestet termelő sejteket állítottunk elő, ami a genetikai stabilitás új lehetőségeit nyitja meg olyan humán monoklonális antitestek előállítására, amelyek a ráksejt felszínén lévő antigénekkel reagálnak.

A fentiekből kitűnik, hogyan állítunk elő bizonyos rákféleségekkel szemben specifikus monoklonális antitesteket, továbbá monoklonális antitesteket termelő sejtvonalakat. Magától értetődik, hogy a fentiekben ismertetett eljárást számos módosítással és változtatással is elvégezheti a szakember, azonban a módosításokkal és változtatásokkal végzett műveletek is a találmány tárgyához tartoznak.

A találmány célja elsősorban a 88BV59 jelzésű humán monoklonális antitestet termelő IgG₃ κ sejtvonal, ami az American Type Culture Collection-nál (Parklawn Drive 12301, Rockville, Maryland, 20852, USA) lett letétbe helyezve 1990. december 13-án. A 88BV59 azonosításához a humán IgM 16-88-cal szemben reakcióképes antigént alkalmazunk; ezt a LiCo 16-88 diploid sejtvonal termeli (lásd az amerikai egyesült államokbeli 4 997 762 számú szabadalmi leírást; ennek bejelentési száma 038 811, és 1987. április 15-én lett benyújtva; ez a bejelentés a 697 078 számú amerikai egyesült államokbeli 1985. január 31 -én benyújtott szabadalmi bejelentésből lett kiválasztva).

A letétbe helyezett sejtvonal azonosítási száma: humán B-sejtet termelő sejtvonal, CO 88BV59-1; letéti száma: CRL 10624.

4. példa

A 88BV59 klónozása és szekvenálása

A 88BV59 (diploid) sejtekből össz-RNS-t izolálunk Chomczynski és Sacchi módszerével [Analytical Biochemistry, 162, 156-159 (1987)]. Röviden a sejteket ülepítjük, majd 4 mol/1 guanídium-izotiocianát, 25 mmol/1 nátrium-citrát pH=7,0, 0,5% szarkozil és 0,1 mol/1 β-merkapto-etanol összetételű oldattal feltárjuk, az RNS-t 0,02 mol/1 nátrium-acetát pH=4,0, 1 térfogat fenol és 0,2 térfogat kloroform hozzáadásával extraháljuk. A mintákat 10 000 χ g-vel centrifugáljuk 20 percig 4 °C-on, majd a vizes fázist friss csőbe visszük át és újra kicsapjuk egy térfogat izopropanollal egy óra hosszat -20 °C-on. A guanídium-izotiocianát alapú oldatban való szuszpendálás és izopropanollal való kicsapás után a sejtüledéket 75% etanollal mossuk és 0,5% SDS-ben szuszpendáljuk. Oligo dT-cellulóz kromatográfiát hajtunk végre [Aviv and Leder, Proceedings of the National Academy of Sciences, USA,

69., 1408-1412. (1972)] a poli A(⁺) mRNS szelektálására, standard módszerek alkalmazásával.

A) cDNS-szintézis

1,2 pg 88BV59 poli A(+) mRNS-t kombinálunk 1 pg Promega NotI oligo dT primer adapterrel (5’ CAATTCGCGGCCGC(T)_IS3’) oly módon, hogy 70 °C-ra melegítjük, majd gyorsan jégbe hűtjük. 500-500 pmol/1 dNTP-t és 200 egység Life Technologies Inc. Moloney Murine Leukémia Vírus RNáz H~ reverz transzkriptázt (Superscript™) adunk hozzá, és 50 mmol/1 TRIS-HC1 pH = 8,3, 75 mmol/1 K.C1, 3 mmol/1 MgCl₂ és 10 mmol/1 DTT összetételű oldatban inkubáljuk 60 percig 37 °C-on. A második szál szintézisét 187 pmol/1 dNTP-k, 40 egység Escherichia coli DNS-polimeráz 1, 15 egység Escherichia coli DNSligáz és 1,4 egység Escherichia coli RNáz H hozzáadásával végezzük 19 mmol/1 TRIS-HC1 pH=6,9, 90 mmol/1 KC1, 4 mmol/1 MgCl₂, 125 pmol/1 β-Nad és 50 mmol/1 ammónium-szulfát összetételű oldatban. 16 °C-on két óra hosszat végzett inkubálás után a reakciót 50 mmol/1 EDTA hozzáadásával állítjuk le, és a cDNS-t fenolos extrakcióval és etanolos kicsapással tisztítjuk. A kétszálú cDNS 5’-végét feltöltjük, 10 egység T4 DNS-polimeráz hozzáadásával 225 pmol/1 dNTP-k jelenlétében 0,3 χ második cDNS-szálat szintetizáló pufferben. Miután tíz percig inkubáltuk 37 °C-on, a reakciót 20 mmol/1 EDTA hozzáadásával állítjuk le, 0,2%-os SDS-fenol-oldattal extraháljuk, majd etanollal kicsapjuk. A kapott tompa végű kétszálú cDNS-t vízben szuszpendáljuk, és a továbbiakban használjuk.

A Promega Ribaclone™ I-es EcoRI linker ligálórendszert használjuk bármely belső EcoRI hasítási hely metilezésére a kétszálú cDNS-en, majd ezután EcoRI hasítási helyeket adunk a kétszálú, tompa végű cDNS-hez. A cDNS-hez 10 egység EcoRI metilázt és (100 pmol/l)_f S-adenozil-L-metionint adunk 100 mmol/1 TRIS-HC1 pH =8,0, 10 mmol/1 EDTA összetételű oldatban, és 15 percig 37 °C-on inkubáljuk. Hővel való inaktiválás (70 °C, tíz perc) és fenolos extrahálás után a metilezett cDNS-t etanollal kicsapjuk. A metilezett cDNS feléhez EcoRI linkereket adunk 30 mmol/1 TRIS-HC1 pH=7,8, 10 mmol/1 MgCl₂, 10 mmol/1 ATP, 1 mmol/1 DTT, 100 pg/ml BSA, 25 Weiss egység T4 DNS-ligáz összetételű oldatban, ezzel katalizáljuk az EcoRI linkerek hozzáadását, amelyek ötvenszeres fölöslegben vannak jelen, a cDNS-végekhez, egy éjszakán át 15 °C-on inkubálva. A ligáló reakcióelegy hővel való inaktiválása után (70 °C, tíz perc) a cDNS-t 20-20 egység EcoRI és NotI restrikciós enzimmel emésztjük 37 °C-on 2 óra hosszat. EDTA-t és SDS-t adunk hozzá (20 mmol/l)_f, illette 0,2% koncentrációban, majd a fenolos extrakciót követően a vizes fázist Sephacryl S-400-as centrifugálható oszlopon engedjük keresztül, hogy eltávolítsuk a fölöslegben maradt linkereket és a kis mennyiségű cDNSeket. 2 mmol/1 ammónium-acetát és 2 térfogat etanol hozzáadása után a cDNS-t kicsapjuk és 10 pl desztillált vízben szuszpendáljuk.

B) Könyvtárkészítés pl 88BV59 cDNS-t Egálunk 1 pg Promega Coiporation-től származó lambda-gtl 1 NotI-EcoRI ka7

HU 218 081 Β rokkal, és a keletkező DNS-t in vitro fágrészecskékbe pakoljuk, Gigapak Gold™ (Stratagene Corporation, La Jolla, CA) kit alkalmazásával, a gyártó előírásai szerint. A fágba pakolt DNS-t 15 mm-es agarlemezekre szélesztjük körülbelül 50 000/lemez sűrűségben.

A humán IgG₃ nehézlánc-konstans régiójára specifikus próba közvetlenül a nem ligáit 88BV59 cDNS-ből származik. Milligen szintetizátoron szintetizáljuk az IgG₃ nehéz lánc CH_t régiójának 115 -121-es aminosavjaival komplementer oligonukleotidot, azaz az 5’TCCACCAAGGGCCCATCGGTC3’ szekvenciát, amely 3’-irányban benyúlik, és egy másik, a 222-217 aminosavakkal komplementer oligonukleotidot, azaz az 5’TTTCTTGTCCACCTTGGTGTT3’ szekvenciát, amely 5’-irányban benyúlik, és a gyártó előírásai szerint megtisztítjuk. Az oligonukleotidokból 100 pmol/l-t használunk egy standard polimeráz láncreakcióban (PCR™), Cetus-féle Ampli-Taq™ polimerázt használva 1 pl 88BV59 cDNS-sel együtt, egy percig 94 °C-on denaturálva az elegyet, majd 52 °C-on egy percig hagyva kialakulni a duplexeket, és a hosszabbítást 72 °C-on egy percig végezzük. A PCR-módszerrel egy 291 bp méretű humán IgG₃ CH,-re specifikus ffagmentet kapunk. A fragmentet radioaktí van jelezzük a Boehringer Mannheim random priming kittel (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN) a gyártó előírásainak alkalmazásával, és 500 000 fágot vizsgálunk át a ³²p-vel jelzett IgG₃ fragmenttel. A tarfolt-hibridizálást 6xSSC, 1 χ Denhardt-oldat, 0,01 SDS és 50 μ/ml denaturált lazacsperma DNS összetételű oldatban végezzük 18 óra hosszat 65 °C-on. A végső mosásokat 0,1 xSSC, 0,1% SDS összetételű oldattal végezzük 61 °C-on.

Egy olyan oligonukleotidot szintetizálunk, amely a humán C_K génben levő 109-114-es pozíciókkal komplementer, azaz az 5’ACTGTGGCTGCACCATCT 3’ szekvenciát, majd az 5’-végen megjelezzük T4 polinukleotid-kinázzal (New England Biolabs, Beverly, MA), majd arra használjuk, hogy 150 000 tarfoltot vizsgálunk át vele. A hibridizációs körülmények azonosak, azzal amit e nehézláncnál alkalmaztunk, azzal a különbséggel, hogy 42 °C-on végezzük 16-18 óra hosszat. A könnyűlánc-próbához a végső mosásokat 1 χ SSC 0,1 % SDS összetételű oldattal végezzük 42 °C-on.

Mindkét könyvtár pozitív kiónokat azonosítunk az autoradiográfia után, és a könnyű lánc esetében hét, a nehéz lánc esetében nyolc egyedi tarfoltot izoláltunk háromszoros tarfolttisztítási lépés után. PCR-amplifikálást végzünk Promega Corporation-től származó lambdagtl 1 előrevivő és reverz indítómolekulákkal, amelyek 42 °C-on párosodnak, az egyes klónokból származó 1-1 ml-es lambda-lizátumot alkalmazva. Az inszertek méretét agarózgél-elektroforézissel határozzuk meg.

C) A fág DNS-szubklónozása

Azokat a független fágokat, amelyek a teljes hosszúságú IgG₃-nak, illetve a kappa-könnyűláncnak megfelelő inszertet tartalmazzák, 40 ml-es tenyészetekben növesztjük 6 óra hosszat 37 °C-on százas infekciós multiplicitási érték mellett. A törmelék eltávolítása után a felülúszókat 1 pg/ml DNáz-zal és RNáz-zal emésztjük 37 °C-on 2 óra hosszat, majd a fágokat 5% polietilénglikol és 0,5 mol/1 NaCl-lel kicsapjuk 2 óra hosszat 4 °C-on tartva az elegyet. A fágokat ülepítjük, majd a kloroformos extrakciót követően, amely a fölöslegben maradt polietilénglikolt távolítja el, a fág-DNS-t kétszer extraháljuk azonos térfogatú fenollal, majd egyszer extraháljuk kloroformmal. Két térfogat etanol hozzáadása megkönnyíti a lambda-DNS feltekerését, és átjuttatását, majd oldatba vitelét 10 mmol/1 TRIS-HC1 pH = 7,4, 1 mmol/1 EDTA összetételű oldatba. A lambda-DNS-eket EcoRI és NotI restrikciós enzimmel emésztjük (mindegyikből 20-40 egységet használunk) 37 °C-on 2 óra hosszat. Az lg cDNS-inszerteket 0.7%-os alacsony olvadáspontú agarózból tisztítjuk az FMC Bioproducts, Rockland ME megfelelő előírásai szerint. A pGEMll_fz(-) vektort (Promega Corporation, Madison, WI) EcoRI és NotI restrikciós enzimmel emésztjük, majd az enzimek hővel való inaktiválása urán az 5’ terminális foszfátokat borjúbél alkalikus foszfatázzal (CIAP) távolítjuk el (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN) oly módon, hogy 0,5 egység CIAP-ot inkubálunk 37 °C-on 30 percig 10 mmol/1 TRIS-HC1 pH = 8,0, 0,1 mmol/1 EDTA összetételű pufferben. Az eianolos kicsapást követően a vektort a gélen tisztított inszerthez Egáljuk szobahőmérsékleten 2-3 óra hosszat, majd a ligáló elegyet transzformáljuk kompetens TG-1 sejtekbe (Amersham Corporation, Arlington Heights, IL) [Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1982)]. Az immunoglobulin nehéz- és könnyűlánc-inszerteket tartalmazó kiónokat azonosítjuk kis mennyiségű plazmidpreparátumot készítve, és EcoRI majd NotI restrikciós enzimmel emésztve, valamint agarózgélen elválasztva a termékeket [Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1982)].

Dl PCR-ből származó fág DNS-szubklónozása

A lambda-gtll előrefutó és reverz indítómolekuláit alkalmazva, PCR-rel amplifíkáljuk a független fág inszerteket (Promega Corporation, Madison, WI), 42 °C-on illeszkedni hagyjuk őket, így olyan fágokat kapunk, amelyek az immunoglobulin nehéz és könnyű lánca cDNS-ének megfelelő, várt hosszúságú cDNS-eket tartalmazzák. A PCR-termékeket EcoRI és NotI restrikciós enzimmel emésztjük, tisztítjuk, és EcoRI-NotI restrikciós enzimmel emésztett pGEMllfz(-) vektorba ligáljuk. Akár az lg H akár az lg L inszertet tartalmazó transzformánsokból származó DNS-t Maniatis és munkatársai szerint állítjuk elő [Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1982)], majd szekvenáljuk a didezoxi-módszer segítségével, a Sequenase™ kitet alkalmazva (US Biochemical Corporation, Cleveland, OH), a gyártók előírásait figyelembe véve. A Promega Corporation T₇ polimeráz promoterspecifikus oligonukleotidja az immunoglobulin inszertek 5’-végének közvetlen közelében helyezkedik el, ezt használjuk mind a V_H, mind a V_L cDNS-ek 5’ szekvenciájának meghatározására. A humán J_H 113-110-es aminosavjainak megfelelő oligonukleo8

HU 218 081 Β tidot, azaz az 5’ TGAGGAGACGGGTGACC 3’-szekvenciát használjuk a V_H régió további szekvenálására. Ezt követően különböző olyan oligonukleotidokat szintetizálunk, amelyek mind a V_H, mind a V_L+l-+6-os aminosavjainak megfelelnek. A PCR-szubklónozáshoz a C_K konstansrégió 214-219 aminosavjaival komplementer kappa könnyűlánc-oligonukleotidot használunk egy PCR-reakcióban a megfelelő V_K 1-6 aminosavakra specifikus oligonukleotiddal együtt. Az 1-241 aminosavakat tartalmazó módosított Fab’ nehézlánc-fragment PCR-reakcióból származik, olyan oligonukleotidot alkalmazva, amely a 241-236-os aminosavakkal komplementer, illetve az egyik a V_H-ban levő 1-6 aminosavaknak felel meg. A Fab konstrukcióhoz hasonlóan egy Fd nehézlánc-fragmentet is PCR-rel állítunk elő, olyan oligonukleotidot alkalmazva, amely a 222-216-os aminosavaknak felel meg, valamint az előbb említett 5’ V_H 1-6-os aminosavaknak megfelelő oligonukleotidot. Az aminosavakat Kábát és munkatársai konvenciója szerint számozzuk (Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fourth Edition, NIH, 1987). A megfelelő restrikciós enzim hasítási helyeket az egyes oligonukleotidok 5’- és 3’-végére helyeztük el, hogy megkönnyítsük klónozásukat a pSWV_HPOLY bakteriális expressziós rendszer módosított verziójába (Greg Winter, MRC, Cambridge, Anglia).

Az egyes szubklónokat, kettőt a Fab és kettőt a Fab’ kiónok közül elemzünk, majd a didezoxi-módszerrel, Sequenase™ kit alkalmazásával szekvenálunk.

A pSWV_HPOLY-ban levő Fab’ cDNS-nek mind a 3’-, mind az 5’-végét módosítjuk, a megfelelő restrikciós hasítási helyek PCR útján való beépítésével, és a pSWV_HPOLY Fab’ cDNS-t használjuk arra, hogy PCR segítségével a cDNS-nek ezt az egész kódoló részét a ρΕΤ-rendszerbe átvigyük (Novagen Corporation, Madison, MI).

A teljes könnyű lánc és a Fab’ nehéz lánc szekvenciáját meghatározzuk a pET-rendszer Fab-ra, és a Fab teljes szekvenciáját két különböző szubklónra egymástól függetlenül meghatározzuk a pSWV_HPOLY-rendszerben. A használt stratégia sematikus leírását ezeknek a kiónoknak az esetében az 1. ábrán mutatjuk be. A 4. táblázatban látható az aktuális nukleotidszekvencia és azoknak a oligonukleotidoknak a szekvenciája, amelyeket a 88BV99 nehéz- és könnyűlánc-szekvenciájának meghatározásához használunk. Az 1. ábrán a teljes nehéz lánc szekvenciáját bemutatjuk a vezető a („leader”) szekvenciától kezdve a 242-es aminosavig. A 88BV59 használja a V_HIII és a D régiót, ami egy intraD-D rekombinációból és/vagy génkonverzióból származhat szomatikus mutációval együtt. Ez radikálisan különbözik bármely, ivarsejtben található D mutációtól. Ez a J_H3 ivarsejtvonalat használja.

A 2. ábrán a 88BV59 kappa könnyűlánc-szekvencia a CDR-ek pozíciójával és a konstansrégió exonjával van jelezve. A 88BV59 a V_KI és a J_K5 régiókat használja. Az első 22 N-terminális csoportot aminosav szekvenálással erősítettük meg.

Megemlítendő, hogy az 59-es aminosav-pozícióban egy cisztein található a 88BV59 V_H régióban. Ennek a ciszteinnek a jelenlétét több kiónban megerősítettük mind a PCR eredetű szekvenciákban, mind a biológiailag amplifikált lambda-fág szubklónokban. Nincs egyéb humán variábilis régió nehéz lánc, amely ebben a pozícióban ciszteint tartalmazna, azaz a Kabat-féle 59-es pozícióban. Más ritka immunoglobulinok, azaz körülbelül 1%-nál kevesebb tartalmaz ciszteint a CDRjén belül, amit akár aminosav, akár DNS-szekvencia meghatározásával meg lehet állapítani.

1. táblázat

Adjuváns

a) BCG (Phipps, Tice, Connaught); liofilezett, fagyasztott (dózisfüggés > ΙΟ⁶ (ΙΟ⁷-10⁸)

b) C. parvum (Wellcome Labs) (dózisfüggés >7 pg (70 pg-700 pg)

Tumorsejtek

a) Enzimatikus disszociáció

1. Kollagenáz I típusú (1,5-2,0 E/ml HBSS)

2. DNáz (450 D. U./ml HBSS)

3. Kevertetés 37 °C-on

b) Fagyasztva tárolás

1. Ellenőrzött sebességű fagyasztás (-1 °C/perc) (7,5% DMSO, 5% HSA, HBSS)

2. 80%-os életképesség

c) Röntgenbesugárzás

1. Tumormentes j ellegűvé téve 12 000-20 000 R-rel

Komponensek és adagolás¹

a) Az adjuváns és a tumorsejt aránya 10:1-1:1 (optimum)

b) 10⁷ tumorsejt (optimum)

c) 2-3 i. d. vakcinálás hetenként. A harmadik vakcinálás csak tumorsejteket tartalmaz.

' A BCG fertőzés Isoniazid kcmoprofilaxisa opcionális;

BCG - Bacillus Calmcttc Gucrin;

HBSS - Hank-fcle kiegyensúlyozott sóoldat;

DMSO - Dimetil-szulfoxid;

HSA - Humán szérumalbumin;

R Rád;

PBS - Foszfáttal pufferolt sóoldat;

EDTA - Etiléndiamin-tetraecetsav.

2. táblázat

A 88BV59 humán monoklonális antitest reaktivitása Indirekt immunfluoreszcencia acetonos tumorsejtvonalakkal

Sejtvonal	Tumortipus	Fluoreszcen- ciaintenzitás11
Ht-29	Vastagbél-karcinóma	3 +
SKCO-F	V astagbél-karcinóma	3 +
LSI 74	Vastagbél-karcinóma	4+
WiDr	V astagbél-karcinóma	N. V5
HCT-8	Vastagbél-karcinóma	-

HU 218 081 Β

2. táblázat (folytatás)

Scjtvonal	Tumortípus	Fluoreszcen- ciaintenzitás3
Bt-20b	Emlőkarcinóma	3+
EPb	Emlőkarcinóma	2+
MCF-7	Emlőkarcinóma	4+
SKBR-III	Emlőkarcinóma	-
CaLu- lc	Tüdő-adenokarcinóma	4+
A2780	Petefészek-karcinóma	-
Ovear3c	Petefészek-karcinóma	4+(30%)d
WI-38	Normál fibroblasztok	-

a) Fluoreszccncia-intcnzitás: 4+: erős; 3+: közepes; 2+: gyenge vagy közepes 1 + : gyenge; negatív. A 88BV59 koncentrációja 10 pg/ml. Egy kontroll humán IgG-vcl 10 pg/ml koncentrációban végzett festés eredménye negatív minden sejtre.

b) Főleg a mitózisban levő sejtek fcstődésc.

c) A festés fonalas citoskcletális festési mintázatot mutat.

d) A jelzett fluoreszccnciaintcnzitást mutató sejtek százaléka kisebb 100%-nál, hacsak külön nem jelezzük.

ej N. V.; nincs vizsgálva.

3. táblázat

A 88BV59 reaktivitása a különböző tumortípusokkal

Tumortípus	A reaktív szövetek száma	A vizsgált szövetek teljes száma	Százalék
Vastagbél	74	84	88
Emlő	22	23	99
Petefészek	16	20	80
Hasnyálmirigy	14	17	88
Tüdő-adeno- karcinóma	6	6	100
Pikkelyes sejt	7	8	88
Kis sejt	0	1	0
Prosztata	4	6	67
Melanóma	0	9	0

4. táblázat

Név	Szekvencia	Nukleotidok (VH = +1)	Aminosavak (VH= +1)
H15-1	5 OGAGTTTGGGCTGAGCTG3 ’	-55->-38	— 19—> — 13 in VH leader
H15-C	5 ’ ACCTCCCAGGCTGGACCAC3 ’	4(θ28	17—>11 inVH
H15-A	5 ’ GC AGGTAC AGCGTGTTCTTG3 ’	244->224	81—>74 in VH
H15-B	5 ’GG A AGT AGTCCTTGACC AGG3 ’	474—>455	149-+142 in CH2
CH1-5’	5 ’TCC ACC A AGGGCCC ATCGGT3 ’	379->399	115—>121 in CH2
H204—>208	5 ’ CTACACCTGCAACGTGAATC3 ’	614—>633	205—>212 in Hinge
VK 48-43	5’TAGATCAGGAGCTTAGGGGC3’	146->127	49-+43
VK 10-16	5 ’ GTCTG ATCTGTAGGAGAC AG3 ’	33->53	11-+18
VK 82-88	5 ’ GC A ACTTATT ACTGTC AAC AG3 ’	250—>270	84-+90
K 170-177	5 ’AGC AAGGACAGCACCTACA3 ’	507—>526	168-+175

SZABADALMI IGÉNYPONTOK

Claims (6)

1. SZABADALMI IGÉNYPONTOK

   1. CO88BV59-1 jelzésű transzformált humán Bsejt, amelynek ATCC letéti száma CRL 10624.
2. 2. A 1. igénypont szerinti transzformált humán B- 50 sejt alkalmazásával előállított 88BV59 jelzésű monoklonális antitest.
3. 3. Fehérje, amely a 2. ábra szerinti 1-113. aminosavból álló VH variábilis régiót vagy ennek CDR alegységét tartalmazza.
4. 4. A 3. igénypont szerinti fehérje, amely a 2. ábra szerinti CDR1, CDR2 és CDR3 aminosavszekvenciák bármelyikét tartalmazza.
5. 5. Fehérje, amely a 3. ábra szerinti 1-108. aminosavból álló VH variábilis régiót vagy ennek CDR alegységét tartalmazza.
6. 6. Az 5. igénypont szerinti fehérje, amely a 3. ábra szerinti CDR1, CDR2 és CDR3 aminosavszekvenciák bármelyikét tartalmazza.