HU218035B - Eljárás mixobaktériumok genetikai manipulációjára - Google Patents
Eljárás mixobaktériumok genetikai manipulációjára Download PDFInfo
- Publication number
- HU218035B HU218035B HU9200680A HU9200680A HU218035B HU 218035 B HU218035 B HU 218035B HU 9200680 A HU9200680 A HU 9200680A HU 9200680 A HU9200680 A HU 9200680A HU 218035 B HU218035 B HU 218035B
- Authority
- HU
- Hungary
- Prior art keywords
- dna
- homologous
- mixobacterial
- plasmid
- integrated
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 94
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 title claims abstract description 11
- 230000008569 process Effects 0.000 title abstract description 15
- 241000863434 Myxococcales Species 0.000 title abstract 3
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 107
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims abstract description 56
- 241001532577 Sorangium Species 0.000 claims abstract description 45
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims abstract description 34
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 claims abstract description 31
- 241000862998 Polyangium Species 0.000 claims abstract description 26
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 claims abstract description 18
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 claims abstract description 18
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 194
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 92
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 72
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 58
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims description 44
- 238000012546 transfer Methods 0.000 claims description 44
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 33
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 claims description 31
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 claims description 23
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims description 21
- 238000010367 cloning Methods 0.000 claims description 16
- 230000010354 integration Effects 0.000 claims description 16
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 12
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 12
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 claims description 10
- 230000008520 organization Effects 0.000 claims description 8
- 239000013599 cloning vector Substances 0.000 claims description 6
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 claims description 5
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 claims description 4
- 241000589516 Pseudomonas Species 0.000 claims description 3
- 241000607142 Salmonella Species 0.000 claims description 3
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 claims description 2
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 2
- 238000010187 selection method Methods 0.000 claims 2
- 241000186046 Actinomyces Species 0.000 claims 1
- 230000001268 conjugating effect Effects 0.000 claims 1
- 230000002950 deficient Effects 0.000 claims 1
- 238000001890 transfection Methods 0.000 claims 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 abstract description 6
- 230000037431 insertion Effects 0.000 abstract description 6
- 238000010276 construction Methods 0.000 abstract description 5
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 abstract description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 23
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 23
- 241000862997 Sorangium cellulosum Species 0.000 description 17
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 16
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 14
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 11
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 11
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 241000863422 Myxococcus xanthus Species 0.000 description 10
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 9
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 9
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 9
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 9
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 9
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 9
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 8
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 8
- 230000006870 function Effects 0.000 description 8
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 8
- 239000000047 product Substances 0.000 description 7
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 7
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 241000863420 Myxococcus Species 0.000 description 6
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 6
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 6
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 6
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 6
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 6
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 6
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 6
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 5
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 5
- 241001131785 Escherichia coli HB101 Species 0.000 description 5
- 108700007698 Genetic Terminator Regions Proteins 0.000 description 5
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 5
- 241000894007 species Species 0.000 description 5
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 4
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 4
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 4
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 4
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 4
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 4
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 4
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 4
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 4
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 4
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 4
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 4
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 4
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 4
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- QRBLKGHRWFGINE-UGWAGOLRSA-N 2-[2-[2-[[2-[[4-[[2-[[6-amino-2-[3-amino-1-[(2,3-diamino-3-oxopropyl)amino]-3-oxopropyl]-5-methylpyrimidine-4-carbonyl]amino]-3-[(2r,3s,4s,5s,6s)-3-[(2s,3r,4r,5s)-4-carbamoyl-3,4,5-trihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2-yl]oxy-4,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)- Chemical compound N=1C(C=2SC=C(N=2)C(N)=O)CSC=1CCNC(=O)C(C(C)=O)NC(=O)C(C)C(O)C(C)NC(=O)C(C(O[C@H]1[C@@]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](CO)O1)(C)O[C@H]1[C@@H]([C@](O)([C@@H](O)C(CO)O1)C(N)=O)O)C=1NC=NC=1)NC(=O)C1=NC(C(CC(N)=O)NCC(N)C(N)=O)=NC(N)=C1C QRBLKGHRWFGINE-UGWAGOLRSA-N 0.000 description 3
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108010042407 Endonucleases Proteins 0.000 description 3
- 102000004533 Endonucleases Human genes 0.000 description 3
- 230000005526 G1 to G0 transition Effects 0.000 description 3
- LTQCLFMNABRKSH-UHFFFAOYSA-N Phleomycin Natural products N=1C(C=2SC=C(N=2)C(N)=O)CSC=1CCNC(=O)C(C(O)C)NC(=O)C(C)C(O)C(C)NC(=O)C(C(OC1C(C(O)C(O)C(CO)O1)OC1C(C(OC(N)=O)C(O)C(CO)O1)O)C=1NC=NC=1)NC(=O)C1=NC(C(CC(N)=O)NCC(N)C(N)=O)=NC(N)=C1C LTQCLFMNABRKSH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108010035235 Phleomycins Proteins 0.000 description 3
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 3
- 108700005078 Synthetic Genes Proteins 0.000 description 3
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 230000008827 biological function Effects 0.000 description 3
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 3
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 3
- 229960005091 chloramphenicol Drugs 0.000 description 3
- WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N chloramphenicol Chemical compound ClC(Cl)C(=O)N[C@H](CO)[C@H](O)C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N 0.000 description 3
- 230000002759 chromosomal effect Effects 0.000 description 3
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 3
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 3
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 3
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 3
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 3
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 3
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 3
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 description 3
- 238000007747 plating Methods 0.000 description 3
- 229920001592 potato starch Polymers 0.000 description 3
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 3
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 3
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 3
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 3
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 3
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 3
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 3
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 3
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 3
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 3
- 239000012137 tryptone Substances 0.000 description 3
- LMSDCGXQALIMLM-UHFFFAOYSA-N 2-[2-[bis(carboxymethyl)amino]ethyl-(carboxymethyl)amino]acetic acid;iron Chemical compound [Fe].OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O LMSDCGXQALIMLM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108700003860 Bacterial Genes Proteins 0.000 description 2
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000004594 DNA Polymerase I Human genes 0.000 description 2
- 108010017826 DNA Polymerase I Proteins 0.000 description 2
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 108091029865 Exogenous DNA Proteins 0.000 description 2
- 239000006142 Luria-Bertani Agar Substances 0.000 description 2
- 239000004677 Nylon Substances 0.000 description 2
- 206010029897 Obsessive thoughts Diseases 0.000 description 2
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 2
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 2
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 210000003578 bacterial chromosome Anatomy 0.000 description 2
- 239000013602 bacteriophage vector Substances 0.000 description 2
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 239000013611 chromosomal DNA Substances 0.000 description 2
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 2
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 2
- 238000013467 fragmentation Methods 0.000 description 2
- 238000006062 fragmentation reaction Methods 0.000 description 2
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 description 2
- PHTQWCKDNZKARW-UHFFFAOYSA-N isoamylol Chemical compound CC(C)CCO PHTQWCKDNZKARW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 2
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 2
- 229920001778 nylon Polymers 0.000 description 2
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 2
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 2
- 230000003032 phytopathogenic effect Effects 0.000 description 2
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 2
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 2
- SCVFZCLFOSHCOH-UHFFFAOYSA-M potassium acetate Chemical compound [K+].CC([O-])=O SCVFZCLFOSHCOH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 2
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 2
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 2
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 2
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 description 2
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 description 2
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 2
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 description 2
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 2
- 230000017105 transposition Effects 0.000 description 2
- PIEPQKCYPFFYMG-UHFFFAOYSA-N tris acetate Chemical compound CC(O)=O.OCC(N)(CO)CO PIEPQKCYPFFYMG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 1
- NKDFYOWSKOHCCO-YPVLXUMRSA-N 20-hydroxyecdysone Chemical compound C1[C@@H](O)[C@@H](O)C[C@]2(C)[C@@H](CC[C@@]3([C@@H]([C@@](C)(O)[C@H](O)CCC(C)(O)C)CC[C@]33O)C)C3=CC(=O)[C@@H]21 NKDFYOWSKOHCCO-YPVLXUMRSA-N 0.000 description 1
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- 241000589155 Agrobacterium tumefaciens Species 0.000 description 1
- 241000972773 Aulopiformes Species 0.000 description 1
- 108020000946 Bacterial DNA Proteins 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 101100402795 Caenorhabditis elegans mtl-1 gene Proteins 0.000 description 1
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 1
- 241000186031 Corynebacteriaceae Species 0.000 description 1
- 241000863003 Cystobacter fuscus Species 0.000 description 1
- 241001600177 Cystobacterineae Species 0.000 description 1
- 108010008286 DNA nucleotidylexotransferase Proteins 0.000 description 1
- 102100033215 DNA nucleotidylexotransferase Human genes 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N Epihygromycin Natural products OC1C(O)C(C(=O)C)OC1OC(C(=C1)O)=CC=C1C=C(C)C(=O)NC1C(O)C(O)C2OCOC2C1O YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000192125 Firmicutes Species 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 description 1
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 description 1
- 102100024319 Intestinal-type alkaline phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 101710184243 Intestinal-type alkaline phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 108091036060 Linker DNA Proteins 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 241000862995 Nannocystis exedens Species 0.000 description 1
- 229930193140 Neomycin Natural products 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 102000004160 Phosphoric Monoester Hydrolases Human genes 0.000 description 1
- 108090000608 Phosphoric Monoester Hydrolases Proteins 0.000 description 1
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 1
- 101100408135 Pseudomonas aeruginosa (strain ATCC 15692 / DSM 22644 / CIP 104116 / JCM 14847 / LMG 12228 / 1C / PRS 101 / PAO1) phnA gene Proteins 0.000 description 1
- 241000293869 Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhimurium Species 0.000 description 1
- 241000607715 Serratia marcescens Species 0.000 description 1
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 241001600176 Sorangiineae Species 0.000 description 1
- 241000863001 Stigmatella aurantiaca Species 0.000 description 1
- 241001655322 Streptomycetales Species 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 239000008351 acetate buffer Substances 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 238000000211 autoradiogram Methods 0.000 description 1
- 238000000376 autoradiography Methods 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 1
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 1
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 244000309466 calf Species 0.000 description 1
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 1
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 1
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 1
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 1
- 244000038559 crop plants Species 0.000 description 1
- 125000004122 cyclic group Chemical group 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 239000007857 degradation product Substances 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 235000013681 dietary sucrose Nutrition 0.000 description 1
- FFYPMLJYZAEMQB-UHFFFAOYSA-N diethyl pyrocarbonate Chemical compound CCOC(=O)OC(=O)OCC FFYPMLJYZAEMQB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- GRWZHXKQBITJKP-UHFFFAOYSA-L dithionite(2-) Chemical compound [O-]S(=O)S([O-])=O GRWZHXKQBITJKP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000012154 double-distilled water Substances 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 230000005684 electric field Effects 0.000 description 1
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 1
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 1
- 238000012869 ethanol precipitation Methods 0.000 description 1
- ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N ethidium bromide Chemical compound [Br-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960005542 ethidium bromide Drugs 0.000 description 1
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 1
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 1
- 239000003337 fertilizer Substances 0.000 description 1
- 238000011049 filling Methods 0.000 description 1
- 235000013312 flour Nutrition 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 238000012252 genetic analysis Methods 0.000 description 1
- BRZYSWJRSDMWLG-CAXSIQPQSA-N geneticin Natural products O1C[C@@](O)(C)[C@H](NC)[C@@H](O)[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](C(C)O)O2)N)[C@@H](N)C[C@H]1N BRZYSWJRSDMWLG-CAXSIQPQSA-N 0.000 description 1
- 210000002837 heart atrium Anatomy 0.000 description 1
- 229920001519 homopolymer Polymers 0.000 description 1
- 101150023479 hsdS gene Proteins 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 150000002678 macrocyclic compounds Chemical class 0.000 description 1
- 229910052753 mercury Inorganic materials 0.000 description 1
- -1 mercury ions Chemical class 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 230000003641 microbiacidal effect Effects 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 229960004927 neomycin Drugs 0.000 description 1
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 238000010915 one-step procedure Methods 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 125000002467 phosphate group Chemical group [H]OP(=O)(O[H])O[*] 0.000 description 1
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 1
- 235000011056 potassium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 1
- 238000011533 pre-incubation Methods 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 230000003449 preventive effect Effects 0.000 description 1
- 101150059159 proA2 gene Proteins 0.000 description 1
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 1
- 101150079601 recA gene Proteins 0.000 description 1
- 238000010188 recombinant method Methods 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 235000019515 salmon Nutrition 0.000 description 1
- 229930000044 secondary metabolite Natural products 0.000 description 1
- 239000006152 selective media Substances 0.000 description 1
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 1
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 239000002689 soil Substances 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 1
- 229960004793 sucrose Drugs 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 238000010361 transduction Methods 0.000 description 1
- 230000026683 transduction Effects 0.000 description 1
- 239000001226 triphosphate Substances 0.000 description 1
- 235000011178 triphosphate Nutrition 0.000 description 1
- 125000002264 triphosphate group Chemical class [H]OP(=O)(O[H])OP(=O)(O[H])OP(=O)(O[H])O* 0.000 description 1
- 101150044170 trpE gene Proteins 0.000 description 1
- 241001446247 uncultured actinomycete Species 0.000 description 1
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 description 1
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
Landscapes
- Genetics & Genomics (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
Abstract
A találmány tárgya eljárás Sorangium vagy Polyangium nemzetségbetartozó mixobaktériumok genetikai manipulálására. A találmányértelmében úgy járnak el, hogy – homológ vagy heterológ eredetűgenetikai anyagot, illetve homológ és heterológ eredetű genetikaianyag kombinációját, amely a mixobaktérium-kromoszóma megfelelőrészével homológ, illetve legalább lényegében homológ; vagy –természettől fogva sem a mixobaktérium-kromoszóma megfelelő részévelhomológ, sem azzal legalább lényegében homológ részeket nem tartalmazógenetikai anyagot, melyet önmagában ismert rDNS-technikákkal a homológvagy legalább lényegében homológ DNS-szakaszokkal összekapcsoltak úgy,hogy a bejuttatandó genetikai anyagot a homológ vagy legalábblényegében homológ DNS-szakaszok körülveszik, bevisznek amixobaktérium-sejtekbe, ahol homológ rekombinációval a mixobaktériumkromoszómájában egy, a bevitt DNS és a baktérium saját DNS-e közöttihomológiák által pontosan nmeghatározott helyre integrálódik és kívántesetben a pozitív transzformánsokat önmagában ismert szelekcióseljárással szelektálják, és a tiszta kultúrát tenyésztik. A találmánykiterjed a fenti eljárásban alkalmazott rekombináns DNS-molekula ésklónozóvektor előállítására is. ŕ
Description
A találmány tárgya eljárás a Sorangium/Polyangium nemzetségbe tartozó mixobaktériumok újszerű genetikai manipulációjára, mely által első ízben válik lehetővé rekombináns DNS-technikák célzott alkalmazása ezeknél a szervezeteknél.
A jelen találmány szerinti eljárással homológ, vagy heterológ eredetű DNS-szekvenciákat, illetve homológ, vagy heterológ eredetű DNS-szekvenciák kombinációját vezetjük be mixobaktériumok kromoszómájába homológ rekombinációval.
A találmány tárgyát képezi rekombináns DNS-molekulák, plazmid-DNS és vektorok előállítása is, amelyek alkalmasak homológ és/vagy heterológ eredetű exogén DNS-t tartalmazó Sorangium/Polyangium nemzetségbe tartozó, genetikailag módosított mixobaktériumok előállításához való felhasználásra.
A Sorangium/Polyangium nemzetségbe tartozó mixobaktériumok rendkívül nagy mértékben specializálódott szervezetek, melyek földmintákban kipusztult növényi anyagokban, illetve állati trágyában gyakran kimutathatók. A nemzetség mikroorganizmusaira jellemző, hogy kizárólagos szénforrásként cellulózt, illetve cellulóztartalmú bomlástermékeket hasznosítanak. A nemzetség további jellemző ismertetőjele a rendkívül aktív szekunder metabolitok előállításának képessége.
Ennek a nemzetségnek számos törzsét leírták, melyek például növényi mikrobicid-vegyületek szintetizálására képesek. Ezek közül különösen jelentősek az úgynevezett szorafének, amelyek makrociklusos vegyületek, és kedvező biocid-spektrumuk van fitopatogén mikroorganizmusok, különösképpen fitopatogén gombák ellen. Ezek a vegyületek rendkívül előnyös kuratív, szisztémás és különösen preventív hatással rendelkeznek, így számos kultúrnövény megvédése során alkalmazhatók (EP 0 358 606).
A mixobaktériumok rendjének más tagjai is ismeretesek, melyek rendkívül erőteljes antibiotikus hatást kifejtő anyagok szintetizálására képesek [Reinbach és munkatársai (1988)]. Ezeknek a vegyületeknek a jelentősége miatt került az érdeklődés középpontjába szintézisük genetikai alapjainak megértése, és ezáltal annak a lehetőségnek a megteremtése, hogy ezt a szintézist adott esetben célzottan befolyásolni lehessen.
Ennek feltétele egy eljárás kialakítása, mely ezeknek a szervezeteknek rekombináns DNS-technológiával végzett közvetlen, előnyösen célirányos genetikai manipulációjából áll, például új gének, génfragmentumok, vagy további DNS-szekvenciák - beleértve a teljes plazmidokat is - célirányos beépítése útján a mixobaktériumok genomjába.
A mixobaktériumok rendjének egyes tagjain már korábban is folytattak ilyen irányú vizsgálatokat. Különös érdeklődés kísérte elsősorban a Myxococcus xanthus-t, mely egy, már rendkívül sokat vizsgált mixobaktérium, és melyhez számos géntranszfereljárás leírása kapcsolódik. így például a pl kolifágot igen gyakran alkalmazták a Tn5 transzpozon bevitelére a Myxococcus xanthus-kromoszómába [Kaiser (1984); Kuner és Kaiser (1981)], majd a továbbiakban a Myxococcus xanthusban klónozott gének visszavitelére az eredeti E. coli-gazdába [O’ Conner és Zusman (1983); Shimkets és munkatársai (1983)].
Egy további géntranszfereljárás a rendkívül sok gazdaszervezetben alkalmazható RP4 plazmid alkalmazásán alapul. Breton és munkatársai (1985) kimutatták, hogy ez a plazmid az E. coli-ból a Myxococcus xanthusba konjugáció útján átvihető, és ott stabilan beépül a kromoszómába. Erre a tulajdonságra alapozva sikerült Bretonnak és munkatársainak (1985), valamint Bretonnak és Guespin-Michelnek (1987) idegen eredetű géneket integrálni a Myxococcus xanthus kromoszómájába. Jaoua és munkatársai (1987; 1989) vizsgálata szerint a megfigyelt integráció alapja nagy valószínűséggel egy úgynevezett helyspecifikus rekombináció. Ez a Myxococcus xanthus-kromoszóma bizonyos térbelileg szorosan körülhatárolt helyeire korlátozódik, és az RP4 plazmid úgynevezett „hot spot” (forró pont) helyén, illetve helyein keresztül jön létre. Ezenfelül találmányunk keretein belül végrehajtott vizsgálatok azt mutatják, hogy a fent leírt, előzőleg Myxococcus-rendszer a Sorangium/Polyangium nemzetség baktériumainak esetében nem alkalmazható. Ezeknek a szervezeteknek a kromoszómájáról feltehetőleg hiányoznak a helyspecifikus rekombinációhoz szükséges specifikus szerkezeti elemek. Ezen túlmenően azt találtuk, hogy ezeknél a szervezeteknél - például a Tn5 transzpozon alkalmazása esetén - nem következik be stabil transzpozíció sem.
A Mól. Gén. Génét. (1988) 211, 63-71. oldalain Myxococcus xanthus csg lókusza szerkezetét vizsgáló rekombináns technikákat ismertetnek. A közlemény nem terjed ki a Sorangium/Polyangium nemzetségbe tartozó baktériumokra, amelyek egyértelműen különböznek az ott említett Myxococcus fajoktól mind fiziológiai, mind szerkezeti jellemzőik tekintetében. Az ezek között a fajok között meglevő kulcsfontosságú különbségek eredményezték egyrészt a Myxococcus fajok, másrészt a Sorangium/Polyangium fajok különböző alrendekbe való taxonómiai csoportosítását. A Myxococcus fajok a Cystobacterineae alrendbe, míg a Sorangium/Polyangium nemzetség tagjai az attól jelentősen eltérő Sorangineae alrendbe tartoznak [Reichenbach és Dvorkin: The Prokaryotes, Vol. 1 (1981), Springer-Verlag, Edit. Starr M. P. et al.]. Azok az eltérések, amelyeket megállapítottak biokémiai/fizikai kémiai/szerkezeti szinten, a genetikai szinten is nyilvánvalók [Ludwig és munkatársai: Archives of Microbiology (1983) 135: 58-62]. Ludwig és munkatársai megállapítása szerint „... a Myxococcus fúlvus, a Stigmatella aurantiaca és a Cystobacter fuscus közeli rokonságban állnak..., míg a Nannocystis exedens és a Sorangium cellulosum világosan elkülönül egymástól, illetve a Myxococcus-Stigmatella-Cystobacter-csoporttól...” (a 60. és 61. oldalt áthidaló bekezdés).
A Mól. Gén. Génét. (1988) 211, 63-71. oldalain adott kitanítás DNS-transzdukcióval való átvitelére vonatkozik E. coli-ból Myxococcus xanthus-ba. Az EP 372 230 DNS-konjugációval való átvitelét tanítja Gram-pozitív baktériumokba, különösen corynebaktériumokba. A leírt konjugatív transzfer alkalmazásával a mobilizálható vektorplazmidok nagy gyakorisággal
HU 218 035 Β transzferálhatok E. coli-ból Gram-pozitív, különösen coryneform baktériumokba. A Sorangium/Polyangium nemzetség baktériumai a corynebaktériumokkal még távolabbi rokonságban állnak, mint a Myxococcus nemzetség baktériumaival.
így tehát találmányunk kidolgozása előtt egy szakember, akinek szándékában állt idegen DNS bevitele a Sorangium/Polyangium nemzetség egy baktériumába, azzal a helyzettel került szembe, hogy ezekhez a szervezetekhez sem vektorrendszer, sem konjugációs rendszer nem volt ismeretes.
Mivel a Mól. Gén. Génét. (1988) 211, 63-71. oldalain nem tanítják és nem is sugallják a mixobaktériumok transzformálását konjugálással, és az EP 372 230 számú leírásban egyáltalán nem említik, hogy az ott leírt módszer alkalmazható a Sorangium/Polyangium nemzetség mixobaktériumaira, átlagos képzettségű szakembernek rutinszerű tevékenysége során nem jutott volna eszébe ennek a két megoldásnak a kombinálása. Először a találmányunk szerinti megoldás fedte fel, hogy idegen DNS sikeresen bevihető a Sorangium/Polyangium nemzetség baktériumaiba.
Találmányunk célkitűzése elsősorban egy általánosan alkalmazható eljárás kidolgozása volt a Sorangium/Polyangium nemzetségbe tartozó mixobaktériumok genetikai manipulációjára, amely a már ismert eljárások fent említett korlátozásai nélkül működik, és amely lehetővé teszi a genetikai anyagnak mixobaktériumokba való irányítatlan vagy előnyösen célirányos bevitelét.
Ezt a célkitűzést találmányunk értelmében például úgy érjük el, hogy olyan genetikai konstrukciókat - különösen plazmidvektorokat - hozunk létre, amelyek specifikus felépítésük folytán a kromoszómán belül tetszőleges helyekre tudnak inszertálni, és amelyek a korábban ismert eljárásoktól eltérően nem kötődnek a genom előre meghatározott [a mixobaktérium-kromoszóma vagy az alkalmazott plazmid („hot spots”) funkcionális szerveződése által kijelölt] integrációs helyeihez, vagy pedig függetlenek az integrált transzpozonok transzpozíciójától.
A találmány tárgya eljárás Myxobacterales rend Sorangium/Polyangium nemzetségébe tartozó baktériumok genetikai manipulációjára; az eljárás során homológ rekombinációval homológ és/vagy heterológ eredetű genetikai anyagot viszünk be a mixobaktériumok kromoszómáiba véletlenszerűen, vagy a bakteriális genom strukturális, illetve funkcionális szerkezetének ismeretében célzottan, a bevitt DNS és a baktérium saját DNS-e között fennálló homológia alapján a mixobaktérium kromoszómájának pontosan meghatározott helyeire integrálva.
A genetikai anyag integrációja a bakteriális kromoszómába homológ rekombinációval történik, a hevítendő DNS-en belül elhelyezkedő egy, illetve több DNS-szakasz hatására, melyek a mixobaktérium-kromoszóma megfelelő részével homológok, illetve azzal legalább lényegében homológok. Ezáltal az integráció nem kötődik bizonyos kromoszomális szerkezetekhez, hanem elvben a bakteriális kromoszóma bármely előnyös helyén végbemehet.
A találmány szerinti eljárás keretein belül alkalmazható homológ DNS-szakaszoknak ezáltal nem kell 100%-osan azonosnak lenniük a mixobaktérium-kromoszóma megfelelő szakaszaival, hogy a kívánt rekombinációs eseményt elérhessük. Általában elegendő, ha az említett DNS-szakaszok a baktériumgenom megfelelő területeivel lényegében homológok, azaz a homológiafok 60-100%, előnyösen 80-100%, legelőnyösebben 90-100% között van.
Ezért a továbbiakban „homológ” NS-szakasz kifejezésen olyan szakaszokat is értünk, amelyek a mixobaktérium-kromoszóma megfelelő részeivel nem mutatnak %-os homológiát, de azzal legalább lényegében homológok.
A homológ DNS-szakaszokat vagy magából a célorganizmusból, vagy valamilyen rokon szervezetből
- így például a mindenkori genom fragmentálása útján - izolálhatjuk. A mixobaktériumkromoszóma-integrációra kiszemelt DNS-szakasza DNS-szekvenciája ismeretében a megfelelő DNS-szakaszok, melyek ezekkel a kromoszomális szakaszokkal homológok, vagy legalább lényegében homológok, természetesen szintetikus úton is előállíthatók.
A találmány szerinti eljárás keretein belül alkalmazható, homológ eredetű DNS-szakaszok alatt vagy ismert szekvenciájú DNS-szakaszokat, vagy véletlenszerűen, például homológ DNS restrikciós emésztésével kapott DNS-fragmentumokat értünk.
A bakteriális genom megfelelő részeinek strukturális és funkcionális szerveződése ismeretében a találmány szerinti eljárás első ízben teremti meg a mixobaktérium-genom génjeinek célirányos, előre megjósolható módosításának lehetőségét (in situ módosítás) a bakteriális genomon belül természetes, vagy mesterségesen módosított gének, génfragmentumok, vagy további hasznos DNS-szakaszok homológ DNS-szakaszokkal történő kicserélése által. A találmány szerinti eljárás tovább lehetővé teszi a mixobaktériumok teljes genomjában elhelyezkedő egyes gének funkciójának célzott azonosítását a gének célzott roncsolódása által („gene destruction”), illetve olyan gének komplementációja által, amelyeket előzőleg más eljárások, különösképpen mutációs eljárások alkalmazásával inaktiváltunk.
A baktériumok saját génjeinek célirányos, és ezáltal rendkívül hatásos in situ módosítása (célzott mutagenezis) mellett a találmány szerinti eljárás egy sor további alkalmazási lehetőséget biztosít, így például járulékos génkópiák beépítése tudottan magas kifejeződési arányú régiókba, illetve a nem kívánt gének eliminációja, azaz roncsolása. Ezenfelül a bekövetkező további alkalmazási területek is számításba vehetők.
- A fontos funkciójú bakteriális saját gének elé erőteljes vagy szabályozható promotorok beépítése.
- Különböző eredetű gének klónozása mixobaktériumokban, különösképpen a Sporangium/Polyangium nemzetségbe tartozó mixobaktériumokban.
- Különböző eredetű gének klónozása és expressziója.
- A bevitt DNS visszavitele egy másik mikroorganizmusba, például E. coli-ba, a további feldolgozás céljából.
HU 218 035 Β
- Egy alkalmazott vektor heterológ DNS-ének felhasználása először mint radioaktív szonda az integrációs hellyel szomszédos mixobaktérium-fragmentumok felismerése, és másodszor amplifikációra, mint templát egy polimeráz láncreakcióban (PCR).
A találmány tárgya további egy eljárás a Sorangium vagy Polyangium nemzetségbe tartozó mixobaktériumok genetikai manipulálására. A találmány szerinti eljárást az jellemzi, hogy
- homológ vagy heterológ eredetű genetikai anyagot, illetve homológ és heterológ eredetű genetikai anyag kombinációját, amely a mixobaktérium-kromoszóma megfelelő részével homológ, illetve legalább lényegében homológ; vagy
- természettől fogva sem a mixobaktérium-kromoszóma megfelelő részével homológ, sem azzal legalább lényegében homológ részeket nem tartalmazó genetikai anyagot, melyet önmagában ismert rDNS-technikákkal a homológ vagy legalább lényegében homológ DNSszakaszokkal összekapcsoltunk úgy, hogy a bejuttatandó genetikai anyagot a homológ vagy legalább lényegében homológ DNS-szakaszok körülveszik, beviszünk a mixobaktérium-sejtekbe, ahol homológ rekombinációval a mixobaktérium kromoszómájában egy, a bevitt DNS és a baktérium saját DNS-e közötti homológiák által pontosan meghatározott helyre integrálódik és kívánt esetben a pozitív transzformánsokat önmagában ismert szelekciós eljárással szelektáljuk és a tiszta kultúrát tenyésztjük.
Találmányunk ezáltal első ízben teszi lehetővé mixobaktériumok Sorangium/Polyangium nemzetsége genomjainak célirányos genetikai manipulációját, ahol a genetikai anyag beépülése a megtervezett eljárás célkitűzésétől függően vagy ismert szekvenciájú homológ DNS-szakaszok, vagy véletlenszerűen kiválasztott, ismeretlen szekvenciájú homológ szakaszok révén megy végbe.
A jelen találmány kiterjed rekombináns DNS-molekulák előállítására is, melyek speciális felépítésük alapján alkalmasak genetikai anyagok - például gének, génfragmentumok, vagy egyéb hasznos DNS-szekvenciák, melyek adott esetben új és kívánatos tulajdonságokat kódolnak - integrálására homológ rekombinációval véletlenszerűen, vagy a bakteriális genom szerkezeti és funkcionális szerveződésének ismeretében célirányosan is a bevitt DNS és a baktérium saját DNS-e közötti homológja alapján pontosan meghatározott helyekre a bakteriális genomon belül.
A jelen találmánnyal továbbá genetikailag módosított mixobaktériumokat állíthatunk elő a mixobaktériumok Sorangium/Polyangium nemzetségéből, melyek az adott esetben új és/vagy jobb tulajdonságokkal rendelkeznek, amit az említett rekombináns DNS-molekulák bevitelével hoztunk létre.
Leírásunkban az egyes, a rekombináns DNS-technika és a baktériumgenetikai területen használatos kifejezéseket az alábbi értelemben alkalmazzuk.
Heterológ eredetű gén(ek), illetve DNS-ek: olyan DNS-szekvencia, mely specifikus terméket vagy termékeket kódol, vagy biológiai funkciót tölt be, és amely más fajtól származik, mint amibe az említett gént bevittük; az említett DNS-szekvenciát idegen eredetű génnek, idegen eredetrí DNS-nek, vagy exogén DNs-nek is nevezzük.
Homológ eredetű gén(ek), illetve DNS-ek: olyan DNS-szekvencia, mely specifikus terméket, vagy termékeket kódol, vagy biológiai funkciót tölt be, és amely azonos fajtól származik, mint amibe az említett gént bevittük. Ezt a DNS-t is nevezzük exogén DNS-nek.
DNS-homológia: két vagy több DNS-szekvencia azonosságának a mértéke (foka).
Szintetikus gén(ek), vagy DNS: olyan DNS-szekvencia, mely specifikus terméket vagy termékeket kódol vagy biológiai funkciót tölt be, és amelyet szintetikus úton állítottak elő.
Promotor: a DNS-expresszió egy kontrollszekvenciája, amely bármelyik tetszés szerinti homológ vagy heterológ eredetű DNS-génszekvenciának egy gazdasejtbe történő transzkripcióját biztosítja, amennyiben az említett génszekvencia működőképes módon egy ilyen promotorral kapcsolódik össze, és ez az említett gazdasejtben aktívan működik.
Terminátor-szekvencia: egy transzkripciós egység végén elhelyezkedő DNS-szekvencia, mely a transzkripciós folyamat végét jelzi.
Túltermelő-promotor (OPP): olyan promotor, mely egy gazdasejtben bármelyik működőképesen összekapcsolt funkcionális génszekvencia expresszióját olyan mértékűre növeli (az RNS- vagy a polipeptidmennyiség formájában mérve), hogy az expresszió jóval magasabb, mint az a természetes állapotú, az OPP-vel nem transzformáit gazdasejtek esetében megfigyelhető.
375’-nem transzformálódó régió: a kódolórégiótól 375’-irányban elhelyezkedő DNS-szakaszok, amelyek ugyan átíródnak az mRNS-be, de polipeptiddé való lefordításuk nem megy végbe. Ez a régió szabályozószekvenciákat tartalmaz, mint például a roboszómakötő helyeket (5’).
DNS-expressziós vektor: klónozórészecskék, mint például egy plazmid, vagy egy bakteriofág, melyek minden szignálszekvenciát tartalmaznak, ami egy inszertált DNS-nek egy megfelelő gazdasejtbe való expressziójához szükséges.
DNS-transzfervektor: klónozórészecskék, mint például egy plazmid, vagy egy bakteriofág-vektor, melyek a genetikai anyag megfelelő gazdasejtbe való bevitelét lehetővé teszik.
Homológ rekombináció: a DNS-darabok reciprok kicserélődése a homológ DNS-molekulák között.
A jelen találmány keretein belül először sikerült a Myxobacterales rend Sorangium/Polyangium baktériumnemzetsége tagjai genomjának genetikai manipulációjára egy előnyösen célirányos eljárást létrehozni, amelynek során a genetikai anyagot véletlenszerűen vagy a bakteriális genom strukturális és funkcionális szerveződésének ismeretében célzottan a bakteriális genomon belül pontosan definiált, részben előre meghatározható helyekre integráljuk, ahol expresszálódhat.
HU 218 035 Β
A találmány szerinti eljárás alapja lényegében az a felismerés, hogy exogén genetikai anyagot homológ rekombinációval beépíthetünk a mixobaktériumok genomjába, aminek során természetes, illetve mesterségesen módosított és/vagy szintetikus gének vagy génfragmentumok vagy egyéb DNS-szekvenciák - beleértve a teljes plazmidot - alkalmazhatók, amennyiben azok olyan DNS-szakaszokat birtokolnak, vagy azokat olyan DNS-szakaszok veszik körül, melyek egy rekombinációhoz elegendő homológiát mutatnak a mixobaktérium-genom megfelelő szakaszaival.
A találmány szerinti eljárás keretein belül alkalmazható homológ DNS-szakaszoknak nem kell 100%-osan azonosnak lenniük a mixobaktérium-kromoszóma megfelelő szakaszaival ahhoz, hogy a kívánt rekombinációs eseményt ki lehessen váltani. Általában elegendő, ha az említett DNS-szakaszok a baktériumgenom megfelelő területeivel lényegében homológok, azaz a homológiafok 60-100% között van, előnyösen 80-100% között van, és a legelőnyösebben 90-100% között van.
Az említett homológ terület kiterjedése változhat, de legalább 100 bp-nyinak kell lennie. A találmány szerinti eljárás keretein belül előnyös a 0,3 és 0,4 kB közötti kiterjedésű homológja, míg a leginkább előnyös esetben a homológia kiterjedése 1 és 3 kB között van.
A találmány lényeges részét alkotja a rekombináns DNS-molekulák előállítása, melyek specifikus felépítésük alapján lehetővé teszik gének, génfragmentumok vagy egyéb érdekes DNS-szekvenciák - beleértve teljes plazmidokat is - célzott beépítését egy célsejt genomjába homológ rekombináció segítségével, a fent említett úton.
A találmány szerint előállított rekombináns DNSmolekulák különösen alkalmasak genetikai anyagoknak, például géneknek, génfragmentumoknak, vagy egyéb DNS-szekvenciáknak mixobaktériumok Sorangium/Polyangium nemzetségének genomján belül definiált helyekre való célirányos bevitelére. Ezeket a molekulákat az jellemzi, hogy integrálandó DNS-t tartalmaznak, és az említett DNS mixobakteriális genom megfelelő DNS-régiójával bizonyos homológiát mutat, vagy ilyen homológ DNS-szekvenciák veszik körül. Jellemző továbbá, hogy a homológ DNS-régiókat tartalmazó mixobaktérium-sejtek transzformációja során az integrálandó DNS-nek irányítatlan vagy előnyösen célirányos integrációját hozzák létre homológ rekombinációval a bevitt DNS és a saját bakteriális DNS közötti homológia alapján a mixobaktérium-genom pontosan definiált helyére.
Az említett rekombináns DNS-molekulák egyszerűen előállíthatok azáltal, hogy a fenti tulajdonságokkal rendelkező, integrálandó DNS-t
a) egy megfelelő forrásból izoláljuk; vagy
b) amennyiben az integrálandó DNS a mixobaktérium-kromoszóma megfelelő részével természettől fogva homológ vagy legalább lényegében homológ szakaszokat nem tartalmaz, ezeket mesterséges úton, az önmagában ismert rDNS-technika segítségével a megfelelő homológ vagy legalább lényegében homológ DNS-szakaszokkal összekapcsoljuk.
Amennyiben az integrálandó DNS egy expresszálható DNS-szekvencia, előnyös, ha ezt a baktériumsejtben működőképes módon a baktériumsejtben funkcionáló expressziós szignállal olyan DNS-szakaszok veszik körül, melyek a bakteriális genomon belül egy meghatározott régióval homológok. Ezek a határos, homológ DNS-szakaszok előnyösen egymással egységes, gyűrű formájú, zárt DNS-molekulát alkothatnak.
Amennyiben már maga az említett expresszálható DNS-szekvencia elegendő mértékű homológiával rendelkezik a bakteriális genomon belül megfelelő DNS-régiókkal ahhoz, hogy ennek a DNS-szekvenciának a közvetlen kicserélése az említett homológ, genomiális DNS-re homológ rekombináció révén bekövetkezhessen, a fent említett határolószekvenciák hiányozhatnak.
A találmány szerinti eljárás során a kétszálú DNS mellett egyszálú, valamint részben egyszálú DNS is alkalmazható.
A találmány szerinti eljárás alkalmazása során mind homológ, mind heterológ gén(eke)t, vagy DNS-szekvenciákat alkalmazhatunk, valamint szintetikus eredetű gén(eke)t vagy DNS-szekvenciákat, melyek a megadott definícióknak minden tekintetben megfelelnek.
Az integrálandó DNS-szekvenciák állhatnak csak genomiális DNS-ből, csak cDNS-ből, illetve csak szintetikus DNS-ekből. A hibrid DNS-szekvenciák megszerkesztésének másik lehetősége cDNS és genomiális és/vagy szintetikus DNS-ek alkalmazása.
Ebben az esetben a cDNS ugyanabból a génből vagy DNS-szakaszból származhat, mint a genomiális DNS, vagy mind a cDNS, mind a genomiális DNS különböző génekből vagy DNS-szakaszokból származhat. A genomiális DNS és/vagy cDNS mindkét esetben ugyanabból vagy különböző génekből vagy DNS-szakaszokból állítható elő.
Amennyiben a DNS-szekvenciarész egynél több gént vagy DNS-szakaszt tartalmaz, ezek egy és ugyanazon szervezetből vagy több szervezetből származhatnak, melyek különböző törzsekhez vagy egy adott faj különböző változataihoz vagy egy nemzetség különböző fajaihoz tartozhatnak, vagy olyan szervezetekből származhatnak, amelyek ugyanazon vagy más taxonómiai egységekhez tartozó nemzetségekhez tartoznak.
Egy struktúrgénnek a bakteriális sejtben lejátszódó expressziója biztosítása céljából a kódoló génszekvenciát adott esetben először működőképes módon a mixobaktérium-sejtben funkcionáló expressziós szekvenciához kapcsoljuk.
A jelen találmány szerinti expresszálható hibrid génszerkezetek, így a struktúrgén(ek) mellett általában expressziós szignál(oka)t is tartalmaznak, amely(ek) promoter- és terminátor-szekvenciákat, továbbá előnyösen a 3’-5’nem transzlatálódó régiók további regulátorszekvenciáit is magukba foglalják.
Mind a promoter-, mind terminátor-szekvenciákat, melyek a mixobaktériumban expresszálható DNS-szekvenciák expresszióját indukálni tudják, a hibrid génszerkezetek alkotórészeként alkalmazhatjuk.
A jelen találmány szerinti eljárás során alkalmazható promotorok például az alábbiak:
HU 218 035 Β a Myxococcus xanthus (EP 310 619) eredetű, fény hatására inkuálható promotor;
egyéb Myxococcus xanthus-promotorok;
Actynomycetes, különösképpen Streptomycetes eredetű promotorok;
E. coli-promotorok, mint például a Tac(hibrid)-, PLvagy Trp-promotorok.
A jelen találmány szerinti eljárás során alkalmazható, megfelelő terminátor-szekvenciákat például Rosenberg és Court (1979), valamint Gentz és munkatársai (1981) ismertetik.
Az így létrehozott funkcionális egységeket, melyek egy génből és a mixobaktérium-sejtekben aktívan működő expressziós szignálokból állnak, adott esetben szomszédos helyzetben egy vagy több DNS-szakasz veheti körül, melyek a mixobaktérium-genomon belüli megfelelő DNS-régióval bizonyos mértékig homológok, így a transzformáció során az említett homológ régiót tartalmazó mixobaktérium-sejtben a homológ DNS-szekvenciák által határolt génszekvencia célzott integrálódása megy végbe homológ rekombinációval, célzott integrálódásánál egy, a bakteriális genomon belüli, a bevitt DNS és a baktérium saját DNS-e közötti homológia által. A határoló homogén DNS-szakaszok így találmányunk értelmében előnyösen egy egységgé kapcsolódnak össze, ami egy gyűrű formájú, zárt DNS-molekula részét képezi.
Előnyös esetben a beviendő DNS-t egy plazmidba integráljuk, mely vagy már tartalmaz homológ DNSszakaszokat, vagy ezeket valamely későbbi időpontban klónozzuk a sejtbe.
így nem csak egyedülálló géneket vagy génfragmentumokat integrálhatunk a mixobaktérium-genomba, hanem teljes plazmid-DNS-t is, mely az említett géneket vagy génfragmentumokat tartalmazhatja, és így elegendő az említett homológ DNS-szekvenciákat a plazmidDNS tetszőleges helyére klónozni, mimellett azonban lehetőség szerint az expresszálandó géneket funkcióképes állapotban kell megőrizni. Ugyancsak ebben az esetben az integrálandó DNS-t (plazmid-DNS) elvben úgy tekinthetjük, mint homológ DNS-szekvenciák által körülvett szakaszt, ahol ezeket a homológ DNS-szakaszokat a gyűrűszerűén zárt DNS-molekulán belül egymással egy egységgé összekapcsolt résznek tekinthetjük.
A struktúrgének mellett tetszés szerint egyéb kívánt géneket vagy génfragmentumokat, illetve egyéb hasznos DNS-szekvenciákat is alkalmazhatunk, így például regulátormolekulák, promotorok, terminátor-szekvenciák stb. kötőhelyeit.
A megfelelő homológ vagy heterológ eredetű DNS-szekvenciák kiválasztásával, melyek a szóban forgó, a bakteriális genomban található szakaszokkal eléggé nagy mértékű homológiát mutatnak, és így a genetikai anyag homológ rekombináció útján történő kicserélését lehetővé teszik, először nyílik lehetőség a géneknek vagy egyéb DNS-szekvenciáknak a mixobaktérium-genom előre meghatározott helyeire való célzott integrálására, és adott esetben ott való expresszálására.
A homológ rekombinációval történő kicseréléshez szükséges homológia mértéke a homológ DNS-szakaszok és a megfelelő genomiális DNS-régió között különböző paraméterektől függ, és az alkalmazott DNS-szekvenciáktól függően mindenkor a szóban forgó igényekhez kell igazodnia. Jelenlegi ismereteink szerint egy legalább 100 bp méretet átfogó homológ régió kielégítő a kívánt rekombinációs események létrehozásához.
A jelen találmány szerinti eljárás során előnyösen 0,3-4 kB terjedelmű vagy még inkább előnyösen 1 - 3 kB terjedelmű homológ régiót alkalmazunk.
A jelen találmány homológ DNS-szakaszokként elsősorban homológ eredetű DNS-szekvenciák alkalmazhatók, melyeket az összes mixobaktérium eredetű DNS izolálása, és ezt követően a megfelelő restrikciós enzimekkel végzett hasítása által kapunk.
Az említett homológ DNS szekvenciájának ismeretében ezek természetesen szintetikus úton is előállíthatok.
Ezenfelül alkalmazhatók heterológ eredetű, homológ DNS-szakaszok is, melyeket nem közvetlenül a célszervezet genomjából izoláltunk, hanem például rokon szervezetekből, és melyek ezáltal nem szükségszerűen 100%-osan azonosak a célszervezet genomjának megfelelő DNS régióival, hanem azokkal csak lényegében homológok, azaz a homológiafok 60-100%, előnyösen 80-100% és különösen előnyösen 90-100%.
A jelen találmány szerinti eljárás lényeges részét alkotja egy eljárás a baktériumok Myxobacterales rendjébe tartozó egyedek célirányos genetikai manipulációja: az eljárást az jellemzi, hogy homológ eredetű, genetikai anyagot vagy homológ, illetve heterológ eredetű genetikai anyag kombinációját visszük be mixobaktériumsejtbe, és ott homológ rekombinációval célzottan a mixobaktérium-kromoszóma pontosan meghatározott helyeire integráljuk a fennálló homológia alapján.
A jelen találmány keretein belül először vált lehetségessé megfelelő hibrid génszerkezetek előállításával az előzőleg ismertetett módon mixobaktérium-genomon belüli baktériumgének célzott módosítása, illetve kiegészítőgéneknek vagy egyéb DNS-fragmentumoknak a mixobaktérium-genomba való beépítése. Ha az integrálódás egy funkcionális génben vagy operonban történik, az általában annak inaktiválódásához vezet, melynek következménye egy fenotípusosan megfigyelhető defektus lesz. Ennek során mixobaktérium-sejteket az előzőleg ismertetett rekombináns DNS-molekulák egyikével transzformálunk, miközben a rekombináns DNS-molekulában lévő gének, hibrid génszerkezetek vagy egyéb DNSfragmentumok homológ rekombináció útján véletlenszerűen vagy előnyösen célzottan a fennálló homológia alapján meghatározott és ezáltal előre megállapítható helyekre integrálódnak a baktériumgenomban.
A találmány egyik megvalósítási módja szerint a genetikai anyagot mixobaktériumok Sorangium/Polyangium nemzetségbe visszük be irányítatlanul egy donorsejt plazmid-DNS-ének a Sorangium/Polyangium befogadósejtekbe való konjugációs átvitele által.
A megfelelő plazmidok előállítására, melyek a homológ rekombináció útján végbemenő integrációhoz kielégítő homológiát mutatnak a mixobaktérium-kromo6
HU 218 035 Β szómával, például olyan módon járhatunk el, hogy először izoláljuk a mixobaktériumok össz-DNS-ét, majd ezt ffagmentáljuk. A fragmentálást mechanikus eljárással, nyíróerők alkalmazásával végezhetjük, vagy előnyösen a megfelelő restrikciós enzimek alkalmazásával.
A homológ DNS-fragmentumok, mint például a homológ és heterológ eredetű DNS-fragmentumok megfelelő klónozóvektorba történő ligálása standard eljárások alkalmazásával hajtható végre, mint például a Maniatis és munkatársai által leírt (1982).
A vektort és az integrálandó DNS-szekvenciát általában először a megfelelő restrikciós enzimekkel hasítjuk. Megfelelőek lehetnek például a tompa véget adó restrikciós enzimek, így például a Smal, Hpal és EcoRV vagy ragadós véget kialakító enzimek, így például az EcoRI, SacI, BamHI, Sáli, Pvul stb.
A tompa végű fragmentumokat és a ragadós végű fragmentumokat is, amelyek egymással komplementerek, megfelelő DNS-ligázok segítségével egységes, folyamatos DNS-molakulává kapcsolhatjuk.
Tompa végeket ragadós végekkel rendelkező DNSfragmentumok az E. coli DNS-polimeráz Klenow-fragmentumával végzett kezelésével is előállíthatunk a hézagok megfelelő komplementer nukleotidokkal való feltöltésével.
Másrészt a ragadó végeket is kialakíthatjuk szintetikusan, így például egy kívánt DNS-szekvencia vagy a hasított vektormolekula végeire komplementer homopolimer farok illesztésével egy terminális dezoxi-nukleotidil-transzferáz alkalmazásával vagy restrikciós hasítási helyet hordozó szintetikus oligonukleotid (linker) hozzákapcsolásával, és ezt követően a megfelelő enzimmel végzett hasítással.
A fent ismertetett szerkezetek - melyek homológ eredetű DNS-szekvenciákat, illetve a homológ és heterológ eredetű DNS-szekvenciák kombinációját tartalmazzák - előállítására és megsokszorozására alapvetően minden használatban lévő klónozóvektort alkalmazhatunk, mint például plazmid- vagy bakteriofágvektorokat, amennyiben azok a gazdasejttel kompatíbilis fajokból származó replikációs és kontrollszekvenciákat tartalmaznak.
A klónozóvektor általában tartalmaz egy origót replikációs és specifikus géneket, melyek a transzformált gazdasejt fenotípusos szelekciós jellemzőihez (marker) vezetnek, különösképpen az antibiotikumokkal szemben mutatott rezisztenciához. A transzformált vektorokat az ilyen fenotípusos jellemzők alapján egy gazdasejten végzett transzformáció után szelektálhatjuk.
A találmány keretein belül alkalmazható szelektálható fenotípusos markerek például - a korlátozás szándéka nélkül - a következők lehetnek: a rezisztencia, ampicillin, tetraciklin, klóramfenikol, higromicin, G418, kanamicin, neomicin vagy belomicin ellen. További szelektálható marker lehet például bizonyos aminosavakkal szembeni prototráfia.
A jelen találmány eljárása során elsősorban az E. coli-plazmidok előnyösek, így például a pSUP2021 plazmid.
A jelen találmány eljárásában a fent ismertetett klónozás során gazdasejtként elsősorban prokariotákat alkalmazunk, beleértve bakteriális gazdákat, így például A. tumefacienst, E. colit, S. typhimuriumot, Serratia marcescenst, továbbá pseudomonast, actinomycetest, salmonellát és magát a mixobaktériumot.
Különösképpen előnyösek az E. coli-gazdasejtek, így például a HB101 E. coli-törzs.
Ehhez a HB101 E. coli-törzs kompetens sejtjeit a szokásosan az E. coli transzformálására alkalmazott eljárással állítjuk elő (lásd: „Általános rekombináns DNS-technikák”).
A transzformálás és az azt követő, megfelelő közegen végzett inkubálás után a keletkező kiónokat differenciáló screenelésnek vetjük alá, szelektív táptalajon végzett szélesztéssel. Végül az egyes, a klónozott DNSfragmentumokat hordozó plazmidokat tartalmazó tenyészetekből a megfelelő plazmid-DNS-t izoláljuk.
Ilyen úton különböző nagyságú rekombináns plazmidokat kapunk. A restrikciós analízis után kiválaszthatjuk a megfelelő méretű plazmidokat, a plazmidDNS ezután következő bevitelére a mixobaktérium-sejtekbe. Ez a DNS-transzfer közvetlenül, vagy előnyösen egy köztigazdán keresztül (donorsejt) történhet, konjugatív transzferrel.
A jelen találmány lényeges része a plazmidok megszerkesztése, melyek a homológ szakaszok mellett egy vagy több olyan génszerkezetet is tartalmaznak, melyek egy vagy több struktúrgénből, vagy egyéb kívánt génből, illetve génfragmentumból állnak, melyekhez adott esetben működőképesen a bakteriális sejtekben funkcionáló expressziós szignálok vannak kapcsolva, vagy egyéb hasznos DNS-szekvenciákat tartalmazhatnak. így a homológ DNS-fragmentumok vagy teljes mértékben saját bakteriális (mixobaktérium) genomszakaszokból állnak, és így teljes mértékben homológ eredetűek, vagy a homológ szakaszok mellett több-kevesebb, kifejezetten heterológ eredetű részt is tartalmaznak. Tisztán heterológ eredetű, homológ DNS-szakaszok alkalmazása is elképzelhető.
Egy további eljárási lépésben ezeket a plazmidokat arra alkalmazhatjuk, hogy az előzőleg említett genetikus szerkezetet, mely az adott esetben egy struktúrgént tartalmaz, ami egy kívánt génterméket kódol, a mixobaktérium-sejtbe bevigyünk, és ott a baktérium genomjába integráljuk.
A találmány szerinti genetikai szerkezetek átvitele a mixobaktérium-sejtekbe különböző eljárásokkal történhet. A találmány keretein belül előnyös a donorsejtnek a mixobaktérium-recipiensbe történő konjugatív transzferé.
Az említett konjugatív transzfer keretein belül a transzferálandó DNS-t, mint előbb ismertettük, egy szokásos módon létrehozott klónozóvektorban klónozzuk, és ezt követően egy megfelelő köztigazdába transzformáljuk, ami donorsejtként funkcionál. A köztigazdán keresztüli eljárás elkerülhető, ha olyan gazdatörzset alkalmazunk, mely mind a DNS klónozása céljából, mind a donorsejtnek a konjugáció keretein belül történő bevitelére alkalmas.
HU 218 035 Β
A találmány keretein belül donorsejtként alkalmazható köztigazdákat lényegében a prokariota sejtek csoportjából választhatjuk ki, így például az alábbiak közül : E. coli, pseudomonas, actionomycetes, salmonella és maga a mixobaktérium.
Egy donorsejt plazmid-DNS-ének a recipiensbe történő konjugatív transzferé a feltétele az, hogy transzferára) és mobilizálófunkció (mob) álljon rendelkezésre. Emellett a mobilizálófunkciónak legalább a transzfer-origót (oriT) kell tartalmaznia, és ebbe a transzferálandó plazmidon kell elhelyezkednie. Ezzel szemben a transzferfunkció (tra) vagy a plazmidon, vagy egy segítőplazmidon helyezkedik el, vagy a donorsejt kromoszómájába integrálódva áll rendelkezésre.
A fenti előfeltételnek eleget tevő, és így a találmány keretein belül előnyösen alkalmazható plazmidok a P-, Q-, Τ-, N-, W- és Coli-inkompatibilitási csoportokba tartoznak. A P-csoport plazmidjainak prototípusa az RP4 plazmid. A találmány keretein belül különösképpen előnyös a pSUP2021 plazmid alkalmazása, ami az RP4 plazmid 1,9 kB-nyi fragmentumát tartalmazza, amelyben jelen van a mob-funkció (RP4mob) és a transzfer-origó (oriT). Más, a mob-funkcióval (RP4mob) rendelkező plazmidok például az alábbiak: pSUPlOl, pSUP301, pSUP401, pSUP202, pSUP203 vagy pSUP205 és az ezekből levezethető származékok [Simon és munkatársai (1988)], melyek szintén alkalmazhatók a találmány szerinti eljárás keretein belül.
A jelen találmány során ismertetésre kerülő kísérletek alapján megállapíthatjuk, hogy a mixobaktériumrecipienseket a konjugatív transzfer során a donortörzzsel történő inkubálás előtt előnyösen egy rövid ideig tartozó hőkezelésnek vetjük alá. Előnyös a recipienssejtek előinkubálása előnyösen 1-120 percig, különösen előnyösen 5-20 percig tart, 35-60 °C-os hőmérsékleten, előnyösen 42-55 °C-os hőmérsékleten, és különösen előnyösen 48-52 °C-os hőmérsékleten.
A jelen találmány egy előnyös megvalósítási módja során egy E. coli donortörzset alkalmazunk, ami az RP4 plazmidtranszfer génjét (tra) a kromoszomális DNS-be beépítve tartalmazza. A jelen találmány keretein belül előnyös a W3101 E. coli donortörzs (pME3O5) alkalmazása, ami az RP4 transzferfunkcióját (tra) birtokló pME305 segítőplazmidot tartalmazza.
A jelen találmány keretein belül eljárástechnikailag különösképpen érdekesek és ezáltal különösen előnyösek azok a baktériumtörzsek, melyek mind az integrált DNS-szekvenc iákat tartalmazó vektorok klónozása során, mind donorsejtekként a konjugatív transzferrel történő bevitelhez megfelelőek. Hasonlóan különösképpen előnyösek azok a baktériumtörzsek, melyek a restrikcióra nézve negatívok, és így a bevitt idegen DNS-t nem bontják szét. Az E. coli ED8767 (pUZ8) törzs mindkét kritériumnak megfelel, így a találmány céljaira nézve ideális, de az adott esetben más, fent említett megfelelő baktériumtörzsekkel is helyettesíthető, és így a találmány alkalmazása nem korlátozódik erre a törzsre.
A donorsejteknek egy mixobaktérium-recipiensbe történő, fent ismertetett konjugatív géntranszfere mellett magától értetődően más, megfelelő géntranszfer-eljárásokat is alkalmazhatunk genetikai anyagok bevitelére mixobaktériumokba. Ilyen például elsősorban az elektroporáció által kivitelezhető géntranszfer, melynek során a mixobaktérium-sejteket rövid ideig tartó, nagy elektromos térerősség éri [Kuspa és Kaiser (1989)]. A prokariota sejtek elektroporációjának általános feltételeit az US 4 910 140 számú szabadalmi leírás részletesen ismerteti.
Nem limitáló példák
Általános rekombináns DNS-technikák
Mivel a találmány során alkalmazott rekombináns DNS-technikai eljárások közül számos a szakemberek számára általánosan ismert, így az alábbiakban csak az általánosan alkalmazott eljárások rövid ismertetését nyújtjuk. Az összes ilyen eljárás megtalálható az alábbi helyen: Maniatis és munkatársai (1982).
A) Hasítás restrikciós endonukleázzal
A reakciókeverék általánosan 50-500 pg/ml DNS-t tartalmaz, a gyártó [elsősorban az alábbi cégek: Linie New England Biolabs, Beverly, MA (USA) és Boehringer-Mannheim (NSZK)] által javasolt pufferelegyben. A DNS-ek minden pg-nyi mennyiségéhez 2-5 egység restrikciós endonukleázt adunk, és a reakciókeveréket a gyártó által javasolt hőmérsékleten 1-3 órát inkubáljuk. A reakciót 10 perces 65 °C-ra való melegítéssel, vagy fenolos extrakcióval és a DNS ezt követő etanolos kicsapásával fejezzük be. Az eljárás Maniatis és munkatársai (1982) munkájának 104-106. oldalán található.
B) A DNS polimerázos kezelése, a tompa végek kialakítása céljából
A reakciókeverékhez 50-500 pg/ml DNS-fragmentumot adunk, a gyártó [elsősorban az alábbi cégek: Linie New England Biolabs, Beverly, MA (USA) és Boehringer-Mannheim (NSZK)] által javasolt pufferelegyben.
A reakciókeverék mind a négy dezoxi-nukleotidtrifoszfátot 0,2 mM mennyiségben tartalmazza. A reakció 15 °C-on 30 perc alatt megy végbe, majd ezután 10 perces, 65 °C-on történő melegítéssel fejezzük be. A restrikciós endonukleázos hasítással kapható, az 5’véget például EcoRI és BamHI segítségével létrehozó fragmentumok előállítása céljából a nagy fragmentumot, illetve a Klenow-fragmentumot DNS-polimerázzal hasítjuk. Olyan fragmentumokhoz, amelyeket 3-végeket létrehozó endonukleázokkal, így például a Pstl-gyel és a Sacl-gyel nyerünk, T4-DNS-polimerázt alkalmazunk. Az említett két enzim alkalmazása Maniatis és munkatársai (1982) munkájának 113-121. oldalán található.
C) Agarózgél-elektroforézis és a DNS-fragmentumok tisztítása a gélekről
Az agarózgél-elektroforézist horizontális készülékben hajtottuk végre, Maniatis és munkatársai munkájának 150-163. oldalai szerint. Pufferként az ott említett Tris-acetát puffért alkalmaztuk. A DNS-fragmentumo8
HU 218 035 Β kát 0,5 pg/ml mennyiségű etídium-bromiddal festettük meg, vagy az elektroforézis során, vagy utána hozzáadva gél-, illetve tankpufferben. A DNS-t hosszúhullámú ultraibolya fénnyel való megvilágítással tettük láthatóvá.
Ha a fragmentumokat a géltől el kell választani, akkor alacsony hőfokon gélesedő agarózt alkalmazunk, melyet az alábbi helyről szerezhetünk be: Sigma Chemical, St. Louis, Missouri, USA. Az elektroforézis után a kívánt fragmentumot kivágtuk, plasztikcsőbe helyeztük, körülbelül 15 percig 65 °C-on melegítettük, háromszor fenollal extraháltuk, és kétszer etanollal kicsaptuk. Az eljárást Maniatis és munkatársai (1982) munkájának a 170. oldalán található módszerrel szemben kissé megváltoztattuk.
Másik lehetőségként az agarózgélről a DNS-t Geneclean kitek alkalmazásával (Bio 101 Inc., La Jolla, CA, USA) izolálhatjuk.
D) Szintetikus linkerek illesztése a DNS-ek végéhez
Amennyiben a DNS-molekulák végéhez egy új endonukleázos hasítási helyet kívánunk illeszteni, a molekulákat a tompa végek kialakítása céljából adott esetben először DNS-polimerázzal kezeljük, az előzőekben már ismertetett eljárással. Ezekből a fragmentumokból körülbelül 0,1-1,0 pg mennyiséget adunk a New England Biolabs cégtől beszerezhető, körülbelül 10 ng mennyiségű, foszforilezett linker-DNS-hez, 20-30 pl mennyiségű elegyben, 2 pl mennyiségű, T4 DNSligázzal, ami a New England Biolabs cégtől szerezhető be, és 1 mM ATP-t a gyártó által javasolt pufferben.
A reakcióelegyet egy éjszakán keresztül 15 °C-on inkubáljuk, majd a reakciót 10 perces, 65 °C-on történő melegítéssel fejezzük be. A reakciókeveréket körülbelül 100 pl-re hígítjuk egy pufferben, ami a szintetikus linkerszekvenciát hasító restrikciós endonukleáznak megfelelő. Az említett endonukleázból körülbelül 50-200 egységet adunk az elegyhez. A kapott reakcióelegyet 2-6 órán keresztül a megfelelő hőmérsékleten inkubáljuk, majd a fragmentumot agarózgél-elektroforézisnek vetjük alá, és a fenti eljárással megtisztítjuk. A keletkező fragmentum olyan végződésekkel rendelkezik, amiket a restrikciós endonukleázos hasítás hozott létre. így a végek általában ragadósak, és ezáltal a keletkező fragmentum könnyedén kapcsolható össze más, azonos ragadós végződésekkel rendelkező fragmentumokkal.
E) A DNS-fragmentumok 5’-terminális foszfátjának eltávolítása
A plazmidklónozási lépések során a vektorplazmid foszfatázos kezelése csökkenti a vektor recirkularizációját (lásd Maniatis és munkatársai, 13. oldal). A DNS megfelelő restrikciós endonukleázzal történő hasítása után ahhoz egy egység mennyiségű, a BoehringerMannheim cégtől beszerezhető, borjúbél-eredetű alkalikus foszfatázt adunk. A DNS-t 37 °C-on egy órán keresztül inkubáljuk, fenollal kétszer extraháljuk, és etanollal kicsapjuk.
F) A DNS-fragmentumok összekapcsolása
Amikor a komplementer ragadós végekkel rendelkező fragmentumokat össze akatjuk kapcsolni, az egyes fragmentumokból körülbelül 100 ng mennyiséget adunk egy 20-40 pl mennyiségű elegyhez, ami körülbelül 0.2 egységnyi T4 DNS-ligázt tartalmaz (New England Biolabs) a gyártó által javasolt pufferben inkubálva. Az inkubálás 1-20 órán keresztül tart, 15 °C-on. A tompa végű DNS-fragmentumok összekapcsolásánál azokat a fenti módon inkubáljuk, de úgy, hogy a T4 DNS-ligáz mennyiségét 2-4 egységre emeljük.
G) A DNS E. coli-ba transzformálása
A legtöbb kísérlet során E. coli HB101, W3101 és ED8767 törzset alkalmaztunk. A DNS-t Maniatis és munkatársai (250-251. oldal, 1982) kalcium-kloridos eljárásával vittük be az E. coli-ba.
H) Az E. coli screenelése a plazmidon
A transzformáció után keletkező E. coli-telepeket a kívánt plazmidokkal egy gyors plazmidizolálási eljárással ellenőriztük. Két, általánosan ismert eljárást mutatnak be Maniatis és munkatársai (366-369. oldal; 1982).
I. Nagy mennyiségű plazmid-DNS izolálása
A nagy mennyiségű plazmid-DNS izolálása az E. coli-ból Maniatis és munkatársai (88-94. oldal; 1982) eljárása szerint történt.
Példák
1. példa
Sorangium esetén alkalmazott tenyésztési körülmények
A Sorangium cellulosumot G51b folyékony tápközegen tenyésztettük (lásd „Tápközegek és pufferelegyek” című rész), 30 °C-os hőmérsékleten. A tenyészeteket 180 fordulat/perces rázással levegőztettük.
A szilárd tápközegen való tenyésztéshez a „Tápközegek és pufferelegyek” részben leírt SolE tápközeget alkalmazunk. Ebben az esetben az inkubálás hőmérséklete 30 °C.
2. példa
Az E. coli tenyésztési körülményei
Az E. coli-sejteket LB tápközegben [Miller (1972)] 37 °C-on tenyésztettük.
3. példa
A Sorangium cellulosum sztreptomicin-rezisztens spontánmutánsának előállítása
Háromnapos Sorangium cellulosum-tenyészet 200 pl mennyiségét (vad típusú törzs, So ce 26), melyet folyékony táptalajon tenyésztettünk, szilárd táptalajon (SolE közeg) szélesztünk, mely 300 pg/ml sztreptomicinnel volt dúsítva. A tenyészetet 14 napig 30 °C-on inkubáltuk. Az ezen a közegen növekedő telepek spontán sztreptomicin-rezisztens mutánsok, melyeket további koncentrálás és tisztítás céljából ismét ugyanezen a tápközegen (sztreptomicinnel) tenyésztünk.
HU 218 035 Β
Egy ilyen sztreptomicin-rezisztens telepet kiválasztottunk, és SJ3 jelzéssel láttunk el. Az így kapott mutáns Sorangium cellulosum So ce 26 törzset 1991. 01. 25-én helyeztünk letétbe a Budapesti Szerződés meghatározása szerint nemzetközi letétbe helyezési intézményként elismert „Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH” (Braunschweig, BRD) intézménynél, a deponálási szám: DSM 6380.
4. példa
A Sorangium össz-DNS-előállítása
Az össz-DNS előállítása céljából egy stacioner fázisban levő Sorangium-tenyészetet 10 percig 10 000 fordulat/perccel centrifugálunk. A leválasztott sejteket STEpufferben (lásd a „Tápközegek és pufferelegyek” című részt újraszuszpendáltuk, és a sejtkoncentrációt körülbelül 109 sejt/ml értékre állítottuk be.
Az így kapott szuszpenzió 450 μΐ mennyiségét 200 pl RLM-pufferrel (lásd a „Tápközegek és pufferelegyek” című részt) és 2 μΐ dietil-pirokarbonáttal elegyítjük. Az egyenletes, alapos összekeverés céljára megfelelő készüléket alkalmazhatunk, így például Vortex-keverőt, 30 perces, 70 °C-on történő inkubálás után az anyaghoz 100 μΐ kálium-acetátot adtunk (5M). Ezt a keveréket 15 percig jégen inkubáltuk, és ötpercenként alaposan megkevertük (Vortex-keverő). Centrifugálás (15 perc, 10 000 fordulat/perc) után a maradékból a fehérjéket extraháltuk, 500 μΐ fenol/kloroform/izo-amilalkohol (25/24/1) eleggyel. Egy újabb centrifugálás (15 perc, 10 000 fordulat/perc) után a DNS-frakciót tartalmazó felső fázist eltávolítottuk, és az esetleg még benne levő fenolt dietil-éterrel (1 ml) eltávolítottuk. Ezután a DNS-t 1 ml etanol hozzáadásával kicsaptuk. 30 perces, -70 °C-on történő inkubálás után az összegyűlt anyagot 10 000 fordulat/perccel 15 percig centrifugáltuk, a pelletet 70%-os etanollal mostuk, és vákuumban megszárítottuk. A DNS-t végül TER-pufferben oldottuk fel.
5. példa
Konjugatlv transzfer a pSJB55-ből a Sorangium cellulosum SJ3-ba
5.1 Kétlépcsős eljárás
5.1.1 A Sorangium-DNS klónozása a pSUP2021 plazmidba
Az SJ3 Sorangium törzsből izolált kromoszómát Pvul restrikciós enzimmel hasítottuk. Az ilyen módon kapott fragmentumokat a pSUP2021 plazmidba klónoztuk [Simon R. és munkatársai (1983)]. Ehhez 0,2 pg plazmid-DNS-t és 1 pg kromoszomális DNS-t először Pvul-gyel emésztettünk, és etanollal kicsaptuk. A csapadékot leválasztottuk, szárítottuk, és a száraz pelleteket 14 pl kétszer desztillált vízzel újraszuszpendáltuk. Ezután 2,5 μΐ lOx koncentrált ligálópuffert (lásd a „Tápközegek és pufferelegyek” című részt), 2,5 pl szarvasmarha-szérumalbumint (0,1%), 2,5 pl ATP-t (10 mM), 2,5 pl DTT-t (0,2 M), 8 pl H2O-t és 1 pl T4 DNS-ligázt adtunk hozzá. A kapott ligálókeveréket egy éjszakán keresztül 8 °C-on inkubáltuk.
Az így kapott ligálóelegyet a rekombináns plazmidok klónozására E. coli HB101 törzsbe transzformáljuk. Ehhez az E. coli HB101 törzs kompetens sejtjeit az E. coli transzformálására szokásosan alkalmazott eljárás segítségével állítjuk elő (lásd az „Általános rekombináns DNS-technikák” című részt).
A transzformáció és az ehhez kapcsolódó 24 órás, kanamicinnel (25 pg/ml) és klóramfenikollal (25 pg/ml) dúsított LB-agaros inkubálás eredményeképpen kapott telepeket differenciáló screenelésnek vetettük alá, párhuzamos szélesztéssel, ampicillint tartalmazó (60 pg/ml) és ampicillinmentes közegben. Ezután izolálhatok azok a telepek, amelyek a Sorangium-DNS-fragmentumok integrálódása miatt elvesztették ampicillin-rezisztenciájukat. Végül ezekből az ampicillin-szenzitív telepekből izoláltuk a plazmidokat.
Az ilyen módon kapott rekombináns plazmidok különböző méretűek. A restrikciós analízis után a plazmidok közül hármat tovább vizsgáltunk. Ezeket a plazmidokat, melyek 1 kb, 3,5 kb, illetve 4 kb méretű, inszertált Sorangium-DNS-részt tartalmaztak, pSJB50, pSJB55 és pSJB58 jelzéssel láttuk el.
5.1.2 Konjugativ transzfer a pSUP2021 plazmidböl a Sorangium cellidosumba
A pSJB55 plazmid Sorangium cellulosumba történő transzferé E. coli W3101 törzs (pME305) alkalmazásával történt [Jaoua és munkatársai (1987)], ami egy, a konjugációhoz hasonló információcserére képes a Sorangiummal. így a pME3O5 E. coli-plazmid [Rella (1984)] lesz a segítőplazmid a pSJB55 mobilizálása során.
Először az E. coli W3101 törzs (pME3O5) kompetens sejtjeit a szokásos, az E. coli transzformálására alkalmazott módszerrel, 5 pl fent izolált pSJB55 plazmid-DNS-sel transzformáltuk. A transzformált E. coli-sejtek a donorsejtek a pSJB55 plazmidhoz.
A tulajdonképpeni transzferhez 15 ml mennyiségű, stacioner fázisban található SJ3 Sorangium cellulosum-tenyészetet (4xl08 sejt/ml - l-4xl09 sejt/ml) 10 ml mennyiségű, összehasonlítható sejtmennyiséget tartalmazó, a tenyésztés késői-log-fázisában lévő E. coli donorsejttel elegyítettünk. Az elegyet 10 percig 4000-8000 fordulat/perccel centrifugáltuk, és 500 pl G51b-, vagy G51 t-közegben újraszuszpendáltuk.
Előnyösnek bizonyult a Sorangium-recipiens sejteknek az E. coli-val történő konjugáció előtt vízfürdőben végzett, rövid hőkezelése. Az SJ3 Sorangium cellulosum törzsnél a legjobb transzfereredményeket 10 perces, 50 °C-on végzett hőkezeléssel értük el. Ilyen körülmények között a transzferfrekvencia 1 -5 x 10~5 értéket érhet el, ami az előzetes hőkezelés nélküli eljáráshoz képest tízszeresére növeli az eredményt.
Az SolE szilárd táptalajt tartalmazó lemezre történő átvitel után 30 °C-on kétnapos inkubálás következett. Ezután a sejteket összegyűjtöttük, és 1 ml G51b-, vagy G51 t-közegben újraszuszpendáltuk. Ebből a baktérium-szuszpenzióból 100 pl-t szelektív SolE-tápközeget tartalmazó lemezen szélesztettünk, ami a kanamicin (25 mg/1) mellett fleomicint (20-35 mg/1) és sztreptomicint (300 mg/1) is tartalmazott mint szelektálóágenseket. A donortörzsek [E. coli W3101 (pME305)] ellentétes szelekciója sztreptomicin segítségével történt.
HU 218 035 Β
Az ezen a szelektív SolE-tápközegen 10-14 napos inkubálás után kinőtt telepek a Sorangium cellulosum transzkonjugánsaiként kezelhetők, melyekben pSJB55 plazmid konjugatív transzferjén keresztül fleomicin-rezisztencia alakult ki. A fleomicin-rezisztens telepeket további molekuláris biológiai vizsgálatoknak vetettük alá. A pSJB55 plazmid a Sorangiumra történő transzferének transzferfrekvenciája átlagosan 3x 10 6 értéket ért el az SJ3 recipienstörzsre vonatkoztatva.
A pSJB50 és a pSJB58 plazmidokat analóg eljárással transzferáltuk a Sorangiumba.
5.2 Egylépcsős eljárás
5.2.1 A Sorangium-DNS klónozása a pSUP2021 plazmidba
A Sorangium-DNS-t az 5.1.1 példa eljárása szerint klónoztuk a pSUP2021 plazmidba.
Az 5.1.1 példa eljárása szerint alkalmazott pME305 segítőplazmid a pUZ8 plazmidra [Hedges és Matthew (1979)] történő kicserélése által, melyek a fent említett plazmidokkal ellentétben nem hordoznak ampicillin-rezisztenciát, a HB101 E. coli köztigazda klónozási lépése kiesik, mivel most lehetséges közvetlen klónozás az E. coli ED8767 donortörzsben, melyet a konjugatív transzferhez alkalmazunk.
A pUZ8 plazmid a széles gazdaspektrumú RP4 plazmid származéka, melyet Datta és munkatársai (1971) ismertetnek. A módosítás az RP4 kiindulási plazmidhoz képest lényegében az ampicillin-rezisztenciára, valamint az IS21 inszerciós elemre vonatkozik, melyek deléció révén kiesnek, valamint egy járulékos gén beépítésére, ami higanyionokkal szembeni rezisztenciát közvetít [lásd Jaoua és munkatársai (1987)].
Az 5.1.1 példa szerint előállított ligálóelegy most közvetlenül transzformálható az ED8767 E. coli-törzsbe (CGSC#: 6567 számon deponálva a Coli Genetic Stock Center, Department of Biology, Yale University, 255 OML, New Haven, CT 06511, USA-intézményben). Az ED8767 E. coli-törzs kompetens sejtjeit az E. coli-törzs transzformálására szokásosan alkalmazott eljárással állítottuk elő (lásd az „Általános rekombináns DNS-technikák” című részt).
A transzformáció és az ehhez kapcsolódó 24 órás, tetraciklinnel (10 pg/ml) és klóramfenikollal (25 pg/ml) dúsított LB-agaros inkubálás eredményeképpen kapott telepeket differenciáló screenelésnek vetettük alá, párhuzamos szélesztéssel ampicillint tartalmazó (60 pg/ml) és ampicillinmentes közegben. Ezután izoláltuk azokat a telepeket, melyek a Sorangium-DNS-fragmentumok integrációja folytán az ampicillin-rezisztenciát elvesztették. Az így kapott tenyészeteket azután közvetlenül alkalmazhatjuk donorsejtekként a rekombináns plazmidok konjugatív transzferje során Sorangium cellulosum-sejtekbe.
A fent említett ligálóelegy helyett magától értetődően az 5.1.1 példa szerint létrehozott pSJB50, pSJB55, illetve pSJB58 rekombináns plazmidok is klónozhatok az E. coli ED 8767 törzsbe.
5.2.2 A rekombináns plazmidok konjugatív transzferé a Sorangium cellulosumba
A tulajdonképpeni transzferhez 15 ml mennyiségű, stacioner fázisban található SJ3 Sorangium cellulosumtenyészetet (1 -4 χ 109 sejt/ml) 10 ml mennyiségű, összehasonlítható sejtmennyiséget tartalmazó, a tenyésztés késői-log-fázisában levő E. coli-donorsejttel elegyítettünk. Az elegyet 10 percig 4000 fordulat/perccel centrifugáltuk, és 500 μΐ G51b-, vagy G51t-közegben újraszuszpendáltuk.
Ebben az esetben is előnyösnek bizonyult a Sorangium-recipiens sejteknek az E. coli-val történő konjugáció előtt vízfürdőben végzett rövid hőkezelése. Az SJ3 Sorangium cellulosum-törzsnél a legjobb transzfereredményeket 10 perces, 50 °C-on végzett hőkezeléssel értük el. Ilyen körülmények között a transzferfrekvencia 1-5 χ 10 5 értéket érhet el, ami az előzetes hőkezelés nélküli eljáráshoz képest tízszeresére növeli az eredményt.
A transzformált Sorangium-sejtek további tenyésztése az 5.1.2 példa eljárása szerint történt.
A restrikcióra nézve negatív E. coli-törzsek, például az E. coli 8767 donortörzsként történő alkalmazása [Murray és munkatársai (1977)] a transzformációs frekvencia értékét a fentiekkel ellentétben erőteljesen fokozhatja (körülbelül 103-szorosára).
Molekuláris genetikai analízis
A pSJB55 plazmidnak a Sorangium cellulosum S./3 kromoszómájába való beépülésének kimutatása
A transzformált Sorangium-sejtekből a fentiek szerint (4. példa) izolált összes-DNS-t Smal, illetve Sáli enzimmel emésztettük, és egy horizontális trisz-acetát (40 mM trisz-HCl, 20 mM nátrium-acetát, 2 mM EDTA-NA2, pH 7,8) agarózgélre (0,9%) vittük fel. Az elektroforézis után a gélt 30 percre denaturálóoldatba (1,5 M NaCl, 0,5 M NaOH), majd ezután egy neutralizálóoldatba (1,5 M NaCl, 0,5 M trisz-HCl, 1 mM EDTA-Na2, pH 7,2) helyeztük. Ezután a DNS-t egy „Southern Capillary Blottings” készülékben, 20x töménységű SSC-puffer alkalmazásával (lásd „Tápközegek, és pufferelegyek” című rész) egy nejlonmembranra (például „Amersham Hybond nylon membráné”; Amersham International plc, Amersham Piacé, Amersham, England HP7 9NA) transzferáltuk, és ott 6 percig UV-kezeléssel fixáltuk. Az eljárás egyes részleteit az alábbi kézikönyvben találhatjuk meg: „Membráné Transfer and Detection Methods” Amersham International (1985).
A hibridizációs próbának szánt DNS-t nick-transzlációval megjelöljük [Rigby DWJ és munkatársai (1977)]. Ez a pSJB55 plazmid 23P-ral jelzett, 3,5 kB mérettartományt átfogó Pvul inszertje. A tulajdonképpeni hibridizálást Denhardt [Denhardt DT (1976)] eljárásának kismértékű módosításával végeztük el. Az előhibridizálás és a hibridizálás során alkalmazott puffer összetétele az alábbi volt: 6xSSC [Maniatis és munkatársai (1982)] + 5xDenhard [Maniatis és munkatársai (1982)] + 0,5% SDS + 0,2 mg/ml denaturált lazacspermium-DNS.
Az előhibridizálás 65 °C-on 3 órát tartott, míg a tulajdonképpeni hibridizálási reakció 20 órát vett igénybe. A hibridizálás során az elegyhez a pSJB55 plazmidból származó, 32P-ral jelzett (105 cpm/cm2 szűrő), denaturált, 3,5 kB mérettartományt átfogó Pvul
HU 218 035 Β fragmentumot adtunk. A hibridizálás után a szűrőt 2x15 percig 2 χ töménységű SSC-vel, 65 °C-on mostuk, majd 30 percig 2xSSC + 0,1% SDS alkalmazásával, ugyancsak 65 °C-on mostuk, és végül még egyszer 0,5xSSC (65 °C-on 15 perc) alkalmazásával mostuk.
A kapcsolódó autoradiográfiás vizsgálatot röntgenfilm alkalmazásával (például FUJY X Rays-film) végezzük.
A transzkonjugánsok autoradiogramján nem láthatók olyan sávok, melyek a fenti pSJB55 plazmid-DNS szabad, túlspiralizált formájának megfelelnének. Ezzel szemben a szűrőmembrán kromoszomális területén egy pozitív jelet láthatunk.
A Smal enzimmel emésztett pSJB55 plazmid három sávot eredményez, 8,9, 6,7 és 1,6 kB mérettel. Az SJ3 szülőtörzs hibridizálómintája a Smal enzimes emésztés után szintén három sávot ad, melyek közül egy a pSJB55 plazmidba klónozott Sorangium-inszert intemális, 1,6 kB méretet átfogó fragmentumának felel meg.
A transzkonjugáns Smal enzimmel emésztett DNSének hibridizációs mintája 5 sávot ad (8,9 és 6,7 kB sávok a pSJB55 plazmidból, valamint az SJ3 sávok), beleértve a három közös, 1,6 kB sávot.
A Sall-emésztés után a pSJB55 plazmid egy
14.1 kB méretű sávot ad (a másik, pSJB55 eredetű,
3.1 kB-t átfogó Sall-fragmentum nem hibridizálódik a próbával). A Sáli enzimmel emésztett SJ3 DNS hibridizációs mintája szintén egy 5 kB méretű sávot ad. A transzkonjugánsokból a Sall-emésztés után eltűnt a
14.1 kB méretű, pSJB55 eredetű fragmentum, valamint az 5 kB méretű, SJ3 eredetű fragmentum. Ezeket két új sáv helyettesíti, 11,5 kB és 7,7 kB mérettel.
A Smal esetén kapott eredmények szerint az összes pSJB55 fragmentum sértetlen állapotú a transzkonjugánsok genomjában. Ez kizárja egy helyspecifikus rekombináció lehetőségét, mivel ebben az esetben legalább egy Smal-fragmentumnak el kell tűnnie.
A Sall-emésztés esetén kapott eredmények alapján világossá válik, hogy a pSJB plazmid integrálódott a Sorangium-genomba, éspedig azon a helyen, ahol a pSJB55-tel homológ DNS-szakasz elhelyezkedik ( = 3,5 kB méretű Pvul-fragmentum). Ez az integráció homológ rekombináció folyamán a pSJB55 plazmidból származó, 3,5 kB méretű Sorangium-inszert és a Sorangium-genomon belüli hasonló inszert között következik be.
Tápközegek és pufferelegyek
G51b tápközeg (pH 7,4)
Glükóz 0,2%
Keményítő 0,5% (Burgonyakeményítő, Typ Noredux;
CERESTAR ITALIA S.p.a., Milánó,
Olaszország)
Pepton (DIFCO Laboratories, USA) 0,2%
Probion S 0,1% (Single Cell Protein; HÖCHST AG,
Frankfurt, NSZK)
| CaCl2x2H2O | 0,05% |
| MgSÖ4x7H2O | 0,05% |
| HEPES (FLUKA) | 1,2% |
| G51t tápközeg (pH 7,4) Glükóz | 0,2% |
| Keményítő | 0,5% |
| (Burgonyakeményítő, Typ Noredux; CERESTAR ITALIA S.p.a., Milánó, Olaszország) Trypton | 0,2% |
| (MARCO, Hackensack, NJ USA) Probion S | 0,1% |
| (Single Cell Protein; HÖCHST AG, Frankfúrt, NSZK) CaCl2x2H2O | 0,05% |
| MgSÖ4x7H2O | 0,05% |
| HEPES (FLÜKA) | 1,2% |
| G52c tápközeg (pH 7,4) Glükóz | 2,0 g/1 |
| Keményítő | 8,0 g/1 |
| (Burgonyakeményítő, Typ Noredux; CERESTAR ITALIA S.p.a., Milánó, Olaszország) Szójaliszt, zsírtalanított | 2,0 g/1 |
| (MUCEDOLA S.r.l., Settimo Milanese, Olaszország) E lesztőextraktum | 2,0 g/1 |
| (FOULD & SPRINGER, Maison Alfort, Franciaország) CaCl,x2H,O | 1,0 g/1 |
| MgSÖ4x7H2O | 1,0 g/1 |
| Fe-EDTA (8 g/1 törzsoldat) | 1,0 ml |
| HEPES (FLUKA) | 2,0 g/1 |
| Desztillált vízzel | 1000 ml-ig |
| A pH-értékeket sterilezés előtt (20 perc 120 °C-on) | |
| NaOH-dal 7,4 értékre állítjuk. A pH-érték sterilezés | |
| után 7,4. SoE tápközeg (pH 7,4) Glükóz* | 0,35% |
| Trypton | 0,05% |
| (MARCO, Hackensack, NJ USA) MgSO4x7H2O | 0,15% |
| Ammónium-szulfát* | 0,05% |
| CaCl2x2H2O* | 0,1% |
| K2HPO4* | 0,006% |
| N átrium-ditionit* | 0,01% |
| Fe-EDTA* | 0,0008% |
| HEPES (FLUKA) | 1,2% |
| Sterilezett, stacioner S. cellulosum-tenyészet feldolgozásával nyert anyag* | 3,5% |
| Agár | (térfogat%) 1,5% |
| * Hozzáadás a sterilezés után A pH-értékeket sterilezés előtt (20 perc 120 °C-on) | |
| NaOH-dal 7,4 értékre állítjuk. LB-tápközeg Trypton | 10,0 g/1 |
| El esztőextraktum | 5,0 g/1 |
| NaCl | 5,0 g/1 |
HU 218 035 Β
| STE-puffer (pH 8,0) | |
| Szacharóz | 25% |
| EDTA-Na, | 1 mM |
| tris-HCl | 10 mM |
| RLM-puffer (pH 7,6) | |
| SDS | 5% |
| EDTA-Na2 | 125 mM |
| tris-HCl | 0,5 mM |
| TER-puffer | |
| tris-HCl (pH 8,0) | 10 mM |
| 1 mM EDTA-Na2 | 1 mM |
| RNS-áz | 10 pg/ml |
| Ligáló-puffer | |
| MgCl2 | 0,1 M |
| tris-HCl (pH 7,8) | 0,5 M |
Táblázatok
1. táblázat
Baktériumtörzsek és plazmidok
| Törzs | Jellemző tulajdonságok |
| Escherichia coli | |
| W3101 Nal B101 | RecA13, trpE, Na ÍR F-, hsds20 (r-, m-) recA13, ara 14, proA2, lacYl, galK2, rpsL20 (SmR), xyl-5, mtl-1, sup E 44, lambda- |
| ED8767 | recA, supE, supF, hsdS |
| Sorangium cellulosum | |
| So ce 26 | Vad típusú törzs |
| So ce 26/SJ3 | SmR spontán mutáns |
| Plazmid | |
| pSUP2021 | Ap, Cm, Hm, Ph |
| pSJB50 | Cm, Km, Ph |
| pSJB55 | Cm, Km, Ph |
| pSJB58 | Cm, Km, Ph |
| pME305 | Ap, Te |
| pUZ8 | Te, Km, Hg |
Letétbe helyezés
A jelen találmány keretein belül az alábbi mikroorganizmusokat, illetve plazmidokat a Budapesti Szerződés meghatározása szerint nemzetközi letétbehelyezési intézményként elismert Nemzetközi Lerakatban, „Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH” (Braunschweig, BRD) intézménynél deponáltuk a mikroorganizmusok szabadalmazás céljára való letétbe helyezésének elismerésére vonatkozó nemzetközi követelmények szerint.
| Mikroorganizmus/ plazmid | Letétbe helyezés időpontja | Letétbe helyezés száma | Az életképesség igazolásának dátuma |
| pSJB55 (E. coliba klónozva) | 1991.01. 25 | DSM 6321 | 1991.01.25 |
| Sorangium cellulosum So ce 26/SJ3 | 1991.01. 25 | DSM 6380 | 1991.01.25 |
Irodalomjegyzék
Breton, AM. és munkatársai, J. Bacteriol., 161:523-528 (1985)
Breton, AM. és munkatársai, J. Biotechnoi., 4:303-311 (1986)
Breton, AM. és Guespin-Michel JF. FEMS Microbiol. Lett., 40:183-188 (1987)
Datta, N. és munkatársai, J. Bacteriol., 108:1244-1249 (1971)
Denhardt, DT„ Biochem. Biophys. Rés. Commun., 23:641-646(1976)
Hedges, RW. és Matthew, M., Plasmid, 2:269-278 (1979)
Gentz, R. és munkatársai, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78:4926-4940(1981)
Jaoua, S. és munkatársai, Plasmid, 18:111-119 (1987) Jaoua, S. és munkatársai, Plasmid, 23:183-193 (1990) Kaiser, D., Genetics of Myxobacteria, in: „Myxobacteria: Development and Cell Interactions”, ed Rosenberg, pp. 163-184, Springer-Verlag, Berlin/New York (1984)
Kuner, JM. és Kaiser, D„ Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 78:425-429(1981)
Kuspa, A. és Kaiser, D., J. Bacteriol., 171:2762-2772 (1989)
Maniatis és munkatársai, „Molecular Cloning” Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1982)
Miller, JH., „Experiments in Molecular Genetics”, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1972)
Murray, Ne. és munkatársai, Mól. Gén. Génét., 150:53 (1977)
O’Conner, KA. és Zusman, DR., J. Bacteriol. 155:317-329 (1983)
Rella, M„ Dissertation ETH Zürich, No. 7601.SFITZ Reichenbach, H. és munkatársai, Trends in Biotechnology, 6:115-121 (1988)
Rigby, DWJ. és munkatársai, J. Mól. Bioi., 113:237-251 (1977)
Rosenberg, M. és Court, D., Ann. Rév. Genetics, 13:319-353 (1979)
Shimkets, LJ. és munkatársai, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 80:1406-1410(1983)
Simon, R. és munkatársai, Bio/Technol., November 1983:784-791 (1983)
EP0310619 EP 0 358 606 US-P4 910 140
HU 218 035 Β
Claims (28)
- SZABADALMI IGÉNYPONTOK1. Eljárás Sorangium vagy Polyangium nemzetségbe tartozó mixobaktériumok genetikai manipulálására, azzal jellemezve, hogy- homológ vagy heterológ eredetű genetikai anyagot, vagy homológ és heterológ eredetű genetikai anyag kombinációját, amely a mixobaktérium-kromoszóma megfelelő részével homológ, vagy legalább lényegében homológ; vagy- természettől fogva sem a mixobaktérium-kromoszóma megfelelő részével homológ, sem azzal legalább lényegében homológ részeket nem tartalmazó genetikai anyagot, melyet önmagában ismert rDNS-technikákkal a homológ vagy legalább lényegében homológ DNSszakaszokkal összekapcsoltunk úgy, hogy a bejuttatandó genetikai anyagot a homológ vagy legalább lényegében homológ DNS-szakaszok körülveszik, beviszünk a mixobaktérium-sejtekbe, ahol homológ rekombinációval a mixobaktérium kromoszómájában egy, a bevitt DNS és a baktérium saját DNS-e közötti homológiák által pontosan meghatározott helyre integrálódik és kívánt esetben a pozitív transzformánsokat önmagában ismert szelekciós eljárással szelektáljuk és a tiszta kultúrát tenyésztjük.
- 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a beviendő genetikai anyag expresszálható DNS-t tartalmaz, ami működőképes módon kapcsolódik a mixobaktérium-sejtekben funkcionáló expressziós szekvenciákhoz.
- 3. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a genetikai anyag bevitelét a donorból a mixobaktérium-recipiensbe egy olyan donorszervezet alkalmazásával végezzük, amely a mixobaktérium-célszervezettel konjugációszerű információcserére képes.
- 4. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogyi) előállítjuk a mixobaktérium-célszervezet vagy egy azzal rokon szervezet össz-DNS-ét, ii) az i) lépés szerint elkülönített össz-DNS-t fragmentáljuk;iii) az ii) lépés szerint előállított fragmentumokat megfelelő plazmidvektorokba klónozzuk, és ezeket a vektorokat klónozási célokra szokásosan alkalmazott gazdaszervezetek valamelyikébe transzformáljuk;iv) szelektáljuk azokat a telepeket, amelyek egy integrálódott mixobaktérium-DNS-fragmentumot hordozó plazmidot tartalmaznak, és ezeket a plazmidokat elkülönítjük;v) az iv) lépés szerint elkülönített plazmid-DNS-t egy, a mixobaktérium-célszervezettel konjugációszerű információcserére képes donorszervezetbe transzformáljuk;vi) a rekombináns plazmid-DNS-t konjugatív transzferrel átvisszük a mixobaktérium-célszervezetbe;vii) a transzformált mixobaktérium-sejteket tenyésztjük, és a pozitív transzformánsokat szelektáljuk.
- 5. Az 1. vagy 4. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy beviendő genetikai anyagként olyan plazmidot alkalmazunk, amely adott esetben egy vagy több expresszálható DNS-szakaszt tartalmaz, és amely a homológ vagy lényegében homológ DNS-részeket beleklónozva tartalmazza.
- 6. Az 1. vagy 4. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a homológiafok a homológ DNS-szakaszok és a mixobaktérium-kromoszómán belüli megfelelő részek között 80 és 100% között van.
- 7. Az 1. vagy 4. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a homológ DNS-szakaszok mérete legalább 100 bp.
- 8. Az 1. vagy 4. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a homológ DNS-szakaszok mérete 0.3 és 4 kb között van.
- 9. A 4. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy gazdaszervezetként a mixobaktérium-DNS-fragmentumok klónozásához, és/vagy donorszervezetként a konjugatív DN S-transzfemél a következő prokarioták valamelyikét alkalmazzuk: E. coli, Pseudomonas, Actinomyces, Salmonella, valamint maga a mixobaktérium.
- 10. A 4. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy gazdaszervezetként a mixobaktérium-DNS-fragmentumok klónozásához, és/vagy donorszervezetként a konjugatív DN S-transzfemél egy, a restrikcióra nézve negatív vagy a restrikcióra nézve deficiens baktériumtörzset alkalmazunk.
- 11. A 10. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a mixobaktérium-DNS-fragmentum klónozását közvetlenül egy olyan donorszervezetbe végezzük, aini a mixobaktérium-célszervezettel konjugációszerű információcserére képes.
- 12. A 4. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a mixobaktérium-sejteket közvetlenül a konjugatív transzfer előtt egy rövid hőkezelésnek vetjük alá.
- 13. A 12. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a hőkezelést 1-120 percig végezzük 35-60 °C hőmérsékleten.
- 14. Eljárás rekombináns DNS-molekula előállítására, ami lehetővé teszi genetikai anyagnak egy meghatározott helyre való integrálását Sorangium vagy Polyangium nemzetségbe tartozó mixobaktériumok genomjába, azzal jellemezve, hogy önmagában ismert módon olyan rekombináns DNS-molekulát állítunk elő, ami tartalmazza az integrálandó DNS-t, mely DNS bizonyos fokú homológiát mutat a megfelelő DNS-régiókkal a mixobakteriális genomon belül, vagy egy vagy több ilyen homológ DNS-szekvenciával van körülvéve, így a homológ DNS-régiókat tartalmazó mixobaktérium-sejtek transzformálásánál az integrálandó DNS homológ rekombinációval integrálódik egy, a beviendő DNS és a baktérium saját DNS-e közötti homológiák alapján pontosan meghatározott helyre a mixobakteriális genomon belül.
- 15. A 14. igénypont szerinti eljárás rekombináns DNS-molekula előállítására, azzal jellemezve, hogy a homológiafok a homológ DNS-szakaszok és a mixobaktérium-kromoszómán belüli megfelelő részek között 80 és 100% között van.
- 16. A 14. igénypont szerinti eljárás rekombináns DNS-molekula előállítására, azzal jellemezve, hogy a homológ DNS-szakaszok mérete legalább 100 bp.HU 218 035 Β
- 17. A 14. igénypont szerinti eljárás rekombináns DNS-molekula előállítására, azzal jellemezve, hogy az integrálandó DNS-szekvencia már önmagában is elegendő nagy mértékben homológ a bakteriális genomon belüli megfelelő DNS-régiókkal, így a homológ genomiális DNS homológ rekombinációval közvetlenül kicserélhető az integrálandó DNS-szekvenciára.
- 18. A 14. igénypont szerinti eljárás rekombináns DNS-molekula előállítására, azzal jellemezve, hogy a beviendő DNS kétszálú DNS.
- 19. A 14. igénypont szerinti eljárás rekombináns DNS-molekula előállítására, azzal jellemezve, hogy a beviendő DNS egyszálú DNS.
- 20. A 14. igénypont szerinti eljárás rekombináns DNS-molekula előállítására, azzal jellemezve, hogy a beviendő DNS expresszálható DNS, ami működőképes módon össze van kapcsolva a mixobaktérium-sejtben működőképes expressziós szekvenciákkal.
- 21. A 14. igénypont szerinti eljárás rekombináns DNS-molekula előállítására, azzal jellemezve, hogy az integrálandó DNS-t körülvevő DNS-szakaszok egymással egy egységgé összekapcsolódva egy gyűrű alakú, zárt DNS-molekula egy részét képezik.
- 22. A 14. igénypont szerinti eljárás rekombináns DNS-molekula előállítására, azzal jellemezve, hogy a homológ DNS-szakaszok magából a mixobaktérium-genomból származnak.
- 23. Eljárás klónozóvektor előállítására, azzal jellemezve, hogy önmagában ismert módon a 14-22. igénypontok bármelyike szerinti rekombináns DNS-molekulát tartalmazó klónozóvektort állítunk elő.
- 24. Eljárás plazmid-DNS előállítására konjugatív transzferhez egy gazdaszervezetből egy Sorangium vagy Polyangium nemzetségbe tartozó mixobaktériumrecipiensbe, azzal jellemezve, hogy önmagában ismert módon olyan plazmid-DNS-t állítunk elő, amely a beviendő DNS mellett homológ vagy legalább lényegében homológ DNS-szakaszokat, valamint egy, a mixobaktérium-sejtekbe való transzferhez alkalmas transzfer(tra) és mobilizálófunkciót (mob) tartalmaz.
- 25. A 24. igénypont szerinti eljárás plazmid-DNS előállítására, azzal jellemezve, hogy a 14-22. igénypontok bármelyike szerint előállított rekombináns DNSmolekulát tartalmazó plazmid-DNS-t állítunk elő.
- 26. A 14. igénypont szerinti eljárás rekombináns DNS-molekula előállítására, azzal jellemezve, hogy az integrálandó DNS-t - ami bizonyos fokú homológiát mutat a megfelelő DNS-régiókkal a mixobakteriális genomon belül, így a homológ régiókat tartalmazó mixobaktérium-genom transzformálásánál az integrálandó DNS homológ rekombinációval integrálódik egy, a beviendő DNS és a baktérium saját DNS-e közötti homológiák alapján pontosan meghatározott helyre a mixobakteriális genomon belül — egy megfelelő forrásból izoláljuk, ha az integrálandó DNS homológ vagy lényegében homológ DNSszakaszokat tartalmaz; vagy amennyiben az integrálandó DNS természettől fogva sem a mixobaktérium-kromoszóma megfelelő részével homológ, sem azzal legalább lényegében homológ szakaszokat nem tartalmaz, önmagában ismert rDNStechnikákkal a megfelelő homológ vagy legalább lényegében homológ DNS-szakaszokkal összekapcsoljuk.
- 27. A 26. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a beviendő DNS egy plazmidon helyezkedik el, és a homológ DNS-szekvenciák tetszőleges helyre vannak a plazmid-DNS-be klónozva a beviendő DNS funkcionális integritásának csorbítása nélkül.
- 28. Az 1. igénypont szerinti eljárás Sorangium vagy Polyangium nemzetségbe tartozó, genetikailag módosított mixobaktériumok előállítására, azzal jellemezve, hogy- homológ vagy heterológ eredetű genetikai anyagot, vagy homológ és heterológ eredetű genetikai anyag kombinációját, amely a mixobaktérium-kromoszóma megfelelő részével homológ, vagy legalább lényegében homológ; vagy- természettől fogva sem a mixobaktérium-kromoszóma megfelelő részével homológ, sem azzal legalább lényegében homológ szakaszokat nem tartalmazó genetikai anyagot, melyet önmagában ismert rDNS-technikákkal a homológ vagy legalább lényegében homológ DNS-szakaszokkal összekapcsoltunk úgy, hogy a bejuttatandó genetikai anyagot a homológ vagy legalább lényegében homológ DNS-szakaszok körülveszik, beviszünk a mixobaktérium-sejtekbe, ahol homológ rekombinációval a mixobaktérium kromoszómájában egy, a bevitt DNS és a baktérium saját DNS-e közötti homológiák által pontosan meghatározott helyre integrálódik és a pozitív transzformánsokat önmagában ismert szelekciós eljárással szelektáljuk és a tiszta kultúrát tenyésztjük.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CH62691 | 1991-03-01 |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| HU9200680D0 HU9200680D0 (en) | 1992-05-28 |
| HUT63875A HUT63875A (en) | 1993-10-28 |
| HU218035B true HU218035B (hu) | 2000-05-28 |
Family
ID=4191394
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| HU9200680A HU218035B (hu) | 1991-03-01 | 1992-02-28 | Eljárás mixobaktériumok genetikai manipulációjára |
Country Status (17)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5686295A (hu) |
| EP (1) | EP0501921B1 (hu) |
| JP (1) | JP3932517B2 (hu) |
| KR (1) | KR100229152B1 (hu) |
| AT (1) | ATE203275T1 (hu) |
| AU (1) | AU655797B2 (hu) |
| CA (1) | CA2062095C (hu) |
| DE (1) | DE59209908D1 (hu) |
| DK (1) | DK0501921T3 (hu) |
| ES (1) | ES2161213T3 (hu) |
| GR (1) | GR3036885T3 (hu) |
| HU (1) | HU218035B (hu) |
| IE (1) | IE920654A1 (hu) |
| IL (1) | IL101097A (hu) |
| NZ (1) | NZ241786A (hu) |
| PT (1) | PT501921E (hu) |
| TW (1) | TW201792B (hu) |
Families Citing this family (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0658201B1 (en) * | 1992-08-31 | 2003-06-04 | Syngenta Participations AG | Dna sequences involved in soraphen biosynthesis by myxobacteria |
| US6121029A (en) | 1998-06-18 | 2000-09-19 | Novartis Ag | Genes for the biosynthesis of epothilones |
| US6410301B1 (en) | 1998-11-20 | 2002-06-25 | Kosan Biosciences, Inc. | Myxococcus host cells for the production of epothilones |
| NZ511722A (en) | 1998-11-20 | 2004-05-28 | Kosan Biosciences Inc | Recombinant methods and materials for producing epothilone and epothilone derivatives |
| GB0003753D0 (en) * | 2000-02-17 | 2000-04-05 | Biochemie Gmbh | Organic compounds |
| WO2002059294A1 (en) * | 2001-01-26 | 2002-08-01 | Commonwealth Scientific And Industrial Research O Rganisation | Methods and means for producing efficient silencing construct using recombinational cloning |
| US7138279B2 (en) * | 2002-08-13 | 2006-11-21 | Kosan Biosciences, Inc. | Transposon-based transformation system |
| WO2004053065A2 (en) * | 2002-12-06 | 2004-06-24 | Kosan Biosciences, Inc. | Disorazole polyketide synthase encoding polynucleotides |
Family Cites Families (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB8615263D0 (en) * | 1986-06-23 | 1986-07-30 | Warwick University Of | Light inducible promoter |
| EP0317509A3 (de) * | 1987-11-16 | 1990-01-31 | Ciba-Geigy Ag | Gezielter Einbau von Genen ins pflanzliche Genom |
| US4910140A (en) * | 1988-04-18 | 1990-03-20 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | Electroporation of prokaryotic cells |
| EP0358606A3 (de) * | 1988-09-09 | 1990-10-31 | Gesellschaft für Biotechnologische Forschung mbH (GBF) | Mikrobiologisches Verfahren zur Herstellung agrarchemisch verwendbarer mikrobizider makrozyklischer Lactonderivate |
| DE3841453A1 (de) * | 1988-12-09 | 1990-06-13 | Degussa | Verfahren zum konjugativen transfer von mobilisierbaren vektoren aus e.coli in gram-positive bakterien und dafuer geeignete vektoren |
-
1992
- 1992-02-21 DE DE59209908T patent/DE59209908D1/de not_active Expired - Fee Related
- 1992-02-21 EP EP92810128A patent/EP0501921B1/de not_active Expired - Lifetime
- 1992-02-21 PT PT92810128T patent/PT501921E/pt unknown
- 1992-02-21 DK DK92810128T patent/DK0501921T3/da not_active Application Discontinuation
- 1992-02-21 ES ES92810128T patent/ES2161213T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1992-02-21 AT AT92810128T patent/ATE203275T1/de not_active IP Right Cessation
- 1992-02-24 TW TW081101349A patent/TW201792B/zh active
- 1992-02-28 AU AU11328/92A patent/AU655797B2/en not_active Ceased
- 1992-02-28 HU HU9200680A patent/HU218035B/hu not_active IP Right Cessation
- 1992-02-28 NZ NZ241786A patent/NZ241786A/en not_active IP Right Cessation
- 1992-02-28 IL IL10109792A patent/IL101097A/xx not_active IP Right Cessation
- 1992-02-28 IE IE065492A patent/IE920654A1/en not_active IP Right Cessation
- 1992-02-28 CA CA002062095A patent/CA2062095C/en not_active Expired - Fee Related
- 1992-02-29 KR KR1019920003364A patent/KR100229152B1/ko not_active Expired - Fee Related
- 1992-03-02 JP JP08046092A patent/JP3932517B2/ja not_active Expired - Fee Related
-
1994
- 1994-07-18 US US08/276,752 patent/US5686295A/en not_active Expired - Lifetime
-
2001
- 2001-10-16 GR GR20010401755T patent/GR3036885T3/el not_active IP Right Cessation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| NZ241786A (en) | 1993-12-23 |
| DK0501921T3 (da) | 2001-10-15 |
| JPH05199876A (ja) | 1993-08-10 |
| EP0501921B1 (de) | 2001-07-18 |
| EP0501921A2 (de) | 1992-09-02 |
| IL101097A (en) | 2003-02-12 |
| HU9200680D0 (en) | 1992-05-28 |
| HUT63875A (en) | 1993-10-28 |
| US5686295A (en) | 1997-11-11 |
| EP0501921A3 (en) | 1992-11-19 |
| DE59209908D1 (de) | 2001-08-23 |
| ES2161213T3 (es) | 2001-12-01 |
| IL101097A0 (en) | 1992-11-15 |
| CA2062095C (en) | 2003-11-11 |
| TW201792B (hu) | 1993-03-11 |
| KR100229152B1 (ko) | 1999-12-01 |
| GR3036885T3 (en) | 2002-01-31 |
| PT501921E (pt) | 2001-12-28 |
| KR920018216A (ko) | 1992-10-21 |
| JP3932517B2 (ja) | 2007-06-20 |
| AU655797B2 (en) | 1995-01-12 |
| ATE203275T1 (de) | 2001-08-15 |
| AU1132892A (en) | 1992-09-03 |
| CA2062095A1 (en) | 1992-09-02 |
| IE920654A1 (en) | 1992-09-09 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| RU2124053C1 (ru) | Способ получения генетически модифицированных бактерий sorangium / polyangium и рекомбинантная плазмидная молекула днк | |
| US8334429B2 (en) | Auxotrophic Agrobacterium for plant transformation and methods thereof | |
| US20250354158A1 (en) | Cis conjugative plasmid system | |
| US20120100616A1 (en) | Method of double crossover homologous recombination in clostridia | |
| JP2004236637A (ja) | 多糖類生成に関与する遺伝子及びその利用 | |
| JP5512177B2 (ja) | 胞子形成能低下納豆菌株および該株を用いて製造した胞子数の少ない納豆 | |
| HU218035B (hu) | Eljárás mixobaktériumok genetikai manipulációjára | |
| SK43196A3 (en) | Fragment dna, vector and microorganism containing genes for butyrobetaine/crotonobetaine-l-carnitine metabolism and process for producing of l-carnitine | |
| CN110819620B (zh) | 一种对类球红细菌进行基因突变的方法 | |
| IE83441B1 (en) | Process for the genetic manipulation of myxobacteria | |
| CN111201314A (zh) | 驱动所需基因表达的质粒成瘾系统 | |
| AU2011201470A1 (en) | Reduction of spontaneous mutation rates in cells | |
| US7049097B2 (en) | Antibiotics-independent vector for constant high-expression and method for gene expression using the same | |
| Jeong et al. | Improvement of fibrinolytic activity of Bacillus subtilis 168 by integration of a fibrinolytic gene into the chromosome | |
| HK1079994A1 (zh) | 大肠杆菌菌株dsm 6601的无质粒的克隆 | |
| KR102856547B1 (ko) | CRISPR/Cas9 시스템을 이용한 리팜피신 저항성 대장균 제조 방법 | |
| CN101137743A (zh) | 能够将XMP转化成GMP并保持与GMP降解有关的基因为失活状态的Escherichia菌株及其使用方法 | |
| KR20220145784A (ko) | CRISPR/Cpf1 시스템을 이용한 유전체 단일염기 편집 방법 및 이의 용도 | |
| CN1946844B (zh) | 通过利用两个染色体外元件在原核细胞中产生重组基因 | |
| DE69333022T2 (de) | DNS-Sequenzen beteiligt an der Soraphen-Biosynthese durch Myxobakterien | |
| Brehm | Strategies to Improve CRISPR-Cas9 Genome Editing in Clostridioides Difficile | |
| WO2025247976A1 (en) | Engineered cryptic plasmids from c. butyricum | |
| MXPA06009807A (en) | Reduction of spontaneous mutation rates in cells |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| DGB9 | Succession in title of applicant |
Owner name: NOVARTIS AG, CH |
|
| HPC4 | Succession in title of patentee |
Owner name: SYNGENTA PARTICIPATIONS AG, CH |
|
| MM4A | Lapse of definitive patent protection due to non-payment of fees |