HU214507B - Eljárás nagytisztaságú, fertőzőképes vírust tartalmazó készítmények előállítására - Google Patents
Eljárás nagytisztaságú, fertőzőképes vírust tartalmazó készítmények előállítására Download PDFInfo
- Publication number
- HU214507B HU214507B HU9503726A HU9503726A HU214507B HU 214507 B HU214507 B HU 214507B HU 9503726 A HU9503726 A HU 9503726A HU 9503726 A HU9503726 A HU 9503726A HU 214507 B HU214507 B HU 214507B
- Authority
- HU
- Hungary
- Prior art keywords
- virus
- sucrose
- gradient
- infectious virus
- infectious
- Prior art date
Links
- 241000700605 Viruses Species 0.000 title claims abstract description 59
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 title claims abstract description 30
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 title claims abstract description 30
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 17
- 239000000203 mixture Substances 0.000 title claims description 21
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims description 8
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 claims abstract description 37
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 claims abstract description 37
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 claims abstract description 37
- 239000000725 suspension Substances 0.000 claims description 21
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 11
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 claims description 10
- 239000000084 colloidal system Substances 0.000 claims description 9
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims description 9
- 229920001612 Hydroxyethyl starch Polymers 0.000 claims description 8
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims description 8
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 claims description 8
- 229940050526 hydroxyethylstarch Drugs 0.000 claims description 8
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 claims description 6
- 235000013601 eggs Nutrition 0.000 claims description 6
- 102000008100 Human Serum Albumin Human genes 0.000 claims description 5
- 108091006905 Human Serum Albumin Proteins 0.000 claims description 5
- 239000002577 cryoprotective agent Substances 0.000 claims description 5
- LPUQAYUQRXPFSQ-DFWYDOINSA-M monosodium L-glutamate Chemical compound [Na+].[O-]C(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O LPUQAYUQRXPFSQ-DFWYDOINSA-M 0.000 claims description 5
- 229920000036 polyvinylpyrrolidone Polymers 0.000 claims description 5
- 239000001267 polyvinylpyrrolidone Substances 0.000 claims description 5
- 235000013855 polyvinylpyrrolidone Nutrition 0.000 claims description 5
- 238000000746 purification Methods 0.000 claims description 5
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-Proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 claims description 4
- 229930182821 L-proline Natural products 0.000 claims description 4
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 claims description 4
- 229960002429 proline Drugs 0.000 claims description 4
- 238000001914 filtration Methods 0.000 claims description 3
- 238000007710 freezing Methods 0.000 claims description 3
- 230000008014 freezing Effects 0.000 claims description 3
- 229960002989 glutamic acid Drugs 0.000 claims description 3
- 239000007900 aqueous suspension Substances 0.000 claims 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 abstract description 11
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 abstract description 5
- 229960004793 sucrose Drugs 0.000 abstract description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 abstract description 2
- 235000013681 dietary sucrose Nutrition 0.000 abstract 1
- 239000004575 stone Substances 0.000 abstract 1
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 4
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 4
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 4
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 4
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 4
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 3
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 3
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000711404 Avian avulavirus 1 Species 0.000 description 2
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000010359 Newcastle Disease Diseases 0.000 description 2
- WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M Potassium chloride Chemical compound [Cl-].[K+] WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 2
- 210000000601 blood cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 2
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 2
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 2
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 2
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 2
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 2
- 230000001524 infective effect Effects 0.000 description 2
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 2
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 2
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 230000006641 stabilisation Effects 0.000 description 2
- 238000011105 stabilization Methods 0.000 description 2
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 2
- AJDIZQLSFPQPEY-UHFFFAOYSA-N 1,1,2-Trichlorotrifluoroethane Chemical compound FC(F)(Cl)C(F)(Cl)Cl AJDIZQLSFPQPEY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001260012 Bursa Species 0.000 description 1
- 229920000742 Cotton Polymers 0.000 description 1
- 235000009161 Espostoa lanata Nutrition 0.000 description 1
- 240000001624 Espostoa lanata Species 0.000 description 1
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 208000027954 Poultry disease Diseases 0.000 description 1
- 208000035415 Reinfection Diseases 0.000 description 1
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 1
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 description 1
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000003466 anti-cipated effect Effects 0.000 description 1
- 239000008346 aqueous phase Substances 0.000 description 1
- 230000002238 attenuated effect Effects 0.000 description 1
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 230000000959 cryoprotective effect Effects 0.000 description 1
- BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L disodium hydrogen phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].OP([O-])([O-])=O BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 239000008098 formaldehyde solution Substances 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 1
- 238000009533 lab test Methods 0.000 description 1
- 230000036210 malignancy Effects 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 238000002941 microtiter virus yield reduction assay Methods 0.000 description 1
- 229910000402 monopotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019796 monopotassium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 1
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 1
- PJNZPQUBCPKICU-UHFFFAOYSA-N phosphoric acid;potassium Chemical compound [K].OP(O)(O)=O PJNZPQUBCPKICU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000001103 potassium chloride Substances 0.000 description 1
- 235000011164 potassium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 1
- 238000004062 sedimentation Methods 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000005199 ultracentrifugation Methods 0.000 description 1
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 1
- 238000010792 warming Methods 0.000 description 1
Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
Abstract
A találmány szerint úgy járnak el, hőgy a szőkásős módőn előállítőtt,ismert módőn kinyert, előtisztítőtt, fertőzésképes vírűs-tartalmútápközeget egy űltracentrifűga főlyamatős átömlésű rőt rjába NTEpűfferból és különböző kőncentrációjú szacharóz őldatőkból képzettgradiensre táplálják, a szűszpenzió vírűstartalmát a rőtőrban fellépőradiális irányú erő hatásával a gradiens legmagasabb szacharózkőncentrációjú rétegébe jűttatják, majd a nagytisztaságú fertőzőképesvírűssal feldúsűlt gradienst annak töménységénél magasabb szacharózkőncentrációjú őldatnak a főrgó rőtőrba ellenáramba valóbetáplálásával kinyerik, ezt védőkőllőiddal hígítják, kriőprőtektív ésvázképző anyagőkat adnak hőzzá és fagyasztva szárítják. ŕ
Description
A találmány tárgya: eljárás nagytisztaságú, fertőzőképes vírust tartalmazó készítmények előállítására.
A készítmények tisztaságuknál és magas vírus-koncentrációjuknál fogva alkalmasak a humán terápiában való alkalmazásra, különböző vírusbetegségek és daganatos betegségek kezelésére. Az utóbbi években számos tanulmány és szabadalmi leírás foglalkozott különböző attenuált vírustörzsek humán terápiában való felhasználásával, vírusbetegségek és rosszindulatú daganatok elleni hatásával.
A 197517 és 197846 számú magyar szabadalmi leírások fertőzőképes vírust tartalmazó készítmények második indikációját tárgyalják, ugyanis az említett műszaki megoldásokban ismertetett készítmények első indikációja különböző, vírusok okozta baromfi betegségek prevenciója, illetve azok terápiája, míg a második terápiás hatás az a felismerés, hogy ezen fertőzőképes vírus-tartalmú állatgyógyászati oltóanyagok eredményesen alkalmazhatók emberek vírus okozta betegségeinek és rosszindulatú daganatos betegségeinek gyógyítására.
A felismerés szükségessé tette azt, hogy az állatgyógyászati célokra készült, kevéssé tiszta, fertőző vírust tartalmazó készítmények olyan tisztaságban és olyan titerrel kerüljenek előállításra, hogy azok alkalmasak legyenek az embergyógyászatban való felhasználásra.
Nem ipari méretekben, laboratóriumi vizsgálatokhoz állítottak elő nagytisztaságú víruskoncentrátumokat. Kardi V., Székely-Tóth K., Perényi T., és BallaÉ. szerint (Acta Veterinaria Hungaricae 55(4), 458, (1987) NDV (Newcastle Disease Virus) törzseit tenyésztettek embrionált tyúktojásokban. Hétnapos inkubálás után az allantois folyadékot learatták, 20 percen át 750 g értékkel centrifugálták, majd az így előtisztított felülúszót centrifugálták (HITACHI ISCP 854) 52000 g értékkel 2,5 órán át. Az üledéket NTE pufferben reszuszpendálták és állni hagyták 4 °C hőmérsékleten 18 órán át. A víruskoncentrátumot 30%-os szacharózpámára rétegezték és 131000 g értékkel centrifugálták 6 órán át. A szacharözpáma alatti vírusüledéket NTE pufferben reszuszpendálták és -70 °C hőmérsékleten tárolták.
Szövetvírus koncentrátum előállítását ismerteti Kardi
V., Perényi T., Kocsis Gy., Neumayer Gy., Varró Cs., Nagy B., és Pergel I. (Acta Veterinaria Hungaricae 36(1-2), 124 (1988). Eljárásuk szerint 3 hetes korú SPF csirkéket fertőztek IBD vírussal. A betegség klinikai tüneteinek megjelenése után a bursa fabriciit eltávolították, PBS-sel (összetétele: 8 g nátriumklorid; 0,2 g kálium-klorid; 1,442 g dinátrium-hidrogén-foszfát két kristályvizes; 0,2 g kálium-dihidrogén-foszfát ad 1000 ml víz) homogenizálták és 15 percen át 8000 g értékkel centrifugálták. Az üledéket reszuszpendálták 20 ml PBS-ben és az előzőek szerint ülepítették. Ezt a lépést egyszer megismételték. Az összegyűjtött felülúszó folyadékot háromszor kezelték Freon 113-mal és végül az összegyűjtött freonos fázisokat PBS-sel extrahálták. A vizes fázisból ultracentrifugával (HITACHI SCP85H, SRP 28SA rotor), 131000 g értékkel, 120 percen át a fertőzőképes vírustartalmat ülepítették. Az üledéket 0,2 M TRIS-HC1 pufferben (trisz-[hidroxi-metil]-amino-metán - HC1), (pH=7,4) reszuszpendálták és az előzőeknek megfelelően ultracentrifugálással 30%-os szacharözpáma alá ülepítették. Az így kapott üle déket ugyanazon pufferban reszuszpendálták.
Az ismertetett eljárások hátrányaként említhető, hogy ipari méretben nem valósíthatók meg, mivel centrifügálási lépésük nem folyamatos, hanem szakaszos, a tisztítandó vírusszuszpenzió betáplálása részletekben történik és a tisztított, vírus-tartalmú tápközeget centrifugacsövekben fogják fel külön-külön. A vírustisztítás szacharózpáma alá való ülepítéssel történik, így a vírustisztítás csak korlátozott mértékben valósítható meg, továbbá számolni kell jelentős mennyiségű vírus-aggregátum kialakulásával is. Ez utóbbi következtében a fertőzőképes vírust tartalmazó szuszpenzióból készített gyógyszerkészítmény hatóanyag (vírustartalom) szempontjából inhomogén lesz.
Ugyancsak az említett eljárások hátrányának kell tekinteni, hogy a szakaszosan végzett centrifugálás miatt kivitelezésük zárt rendszerben nem valósítható meg, így a feldolgozás során a vírusszuszpenzió visszafertőződésének veszélye fennáll.
Ismertek folyamatos eljárások vírusokat tartalmazó tápközegek folyamatos áramlású rotorral rendelkező centrifugával való tisztítására (Boll.Ist.Sieroter.Milan. 54,45-56 [1975]), de ez esetben a vírusok fertőzőképességének megőrzését nem kellett figyelembe venni, ugyanis inaktivált vírusszuszpenziók kerültek feldolgozásra.
Célul tűztük ki olyan eljárás kidolgozását, amely lehetővé teszi fertőzőképes vírust tartalmazó tápközegek olyan mértékben való koncentrálását és megtisztítását, valamint stabilizálását, hogy az, vagy az abból előállított gyógyszerkészítmények az embergyógyászati követelményeknek megfeleljenek.
A találmány tárgya tehát eljárás magas infektív titerű, vagyis nagy víruskoncentrációjú, nagytisztaságú, fertőzőképes vírust tartalmazó készítmények előállítására és azok stabilizálására.
A találmány tárgyát képezi továbbá az a védőkolloid rendszer, amely a készítményekben optimálisan képes a tisztított vírus fertőzőképességét hosszabb tárolás során megőrizni.
A találmány alapja az a felismerés, hogy ha a szokásos módon előállított nyers, fertőzőképes vírust tartalmazó tápközeget egy folyamatos áramlású rotorral rendelkező centrifuga rotorjában egy NTE puffer oldatból (összetétel: 8,77 g nátrium-klorid; 0,37 g Selecton B2 2H20; 1,21 g trisz-[hidroxi-metil]-amino metán; sósav 1 M-os szükség szerint; víz ad 1000 ml; pH=7,4) és szacharózból előállított, különböző szacharóz koncentrációjú gradiensbe áramoltatjuk, akkor a forgó rotorban fellépő radiális irányú erő hatására a vírus partikulák a külső, legmagasabb töménységű szacharóz réteg felé vándorolnak és a sűrűségüknek megfelelő sűrűségű szacharóz rétegben koncentrálódnak. Innen a legmagasabb koncentrációjú szacharóz gradiens rétegnél magasabb koncentrációjú NTE puffer-szacharóz elegynek a rotorba való ellenáramú betáplálásával nyerjük ki a magas koncentrációjú vírusszuszpenziót, míg a szennyezések
HU 214 507 Β (vérsejtek, sejttörmelékek, fehérje fragmentumok, fehérjék, lipidek, inkomplett vírusok) sűrűségük következtében az alacsonyabb szacharóz koncentrációjú gradiens rétegben maradnak.
A találmány alapját képezi továbbá az a felismerés, hogy a hidroxi-etil-keményítő túlmenően azon, hogy védőkolloid összetevő, aminosavakkal vagy azok származékaival kiegészítve kitűnő krioprotektív és vázképző tulajdonságokkal rendelkezik, amely további krioprotektív anyagokkal (humán albumin, polivinil-pirrolidon) lehetővé teszi a magas vírustartalmú készítmény fagyasztva-szárítással történő stabilizálását.
A találmány szerint úgy járunk el, hogy embrionált tyúktojásban vagy szövettenyészetben szokásos módon megtermelt és ismert módon kinyert vírusszuszpenziót +4 °C körüli hőmérsékleten ülepítjük, a mechanikai szennyezésektől szűréssel megtisztítjuk, majd -20 °C körüli hőmérsékleten lefagyasztjuk.
Néhány órán át ezen a hőmérsékleten tartjuk, majd hőmérsékletét fagypont fölé engedjük emelkedni. Ezt követően jól zárható centrifugapoharakban ülepítőcentrifugával 4000-5000 g értékkel 0,5-1,5 órán át ülepítjük, a kapott felülúszót vattán átszűrjük és az így kapott, szennyezéseket tartalmazó, alacsony, mintegy ΙΟ7,5-ΙΟ8,5 EID50/ml infektív titerű fertőzőképes vírust tartalmazó szuszpenziót dolgozzuk fel a találmány szerinti eljárással a következők szerint.
Egy ultracentrifuga folyamatos áramlású rotorjában rétegezéssel NTE puffer oldatból és szacharózból különböző szacharóz-koncentrációjú (0-50 tömeg%) lineáris szacharóz gradienst állítunk elő. Ezt követően a rotort beindítjuk és 20 000-40 000 ford/perc fordulatszámra felgyorsítjuk. A fordulatszám elérése után megkezdjük az előkészített, nyers vírusszuszpenziónak aratorba való betáplálását, miközben a vírusban elszegényedett felülúszót a rotorból folyamatosan elvezetjük.
A vírusszuszpenzió teljes mennyiségének betáplálása után a gradiens legmagasabb szacharóztartalmú rétegénél magasabb szacharóz koncentrációjú NTE puffer szacharóz-oldat elegyének ellenáramú betáplálásával kinyerjük a magas vírustartalmú frakciót, melynek infektív titere ΙΟ'θ-ΙΟ11 EIDjo/ml.
A centrifuga rotorjából folyamatosan távozó gradienst spektrofotometriásán ellenőrizzük és további feldolgozáshoz csak a 109 EID5o/ml-nél magasabb infektív titerű frakciókat használjuk fel.
A spektrofotometriásán alkalmasnak talált vírustartalmú frakciókat homogenizáljuk, majd szacharózból, hidroxi-etil-keményítőből, L-glutaminsavból vagy Na-L-glutamátból vagy L-prolinból, humán albuminból vagy polivinil-pirrolidonból álló védőkolloiddal elegyítjük és fagyasztva szárítással stabilizáljuk. A találmány szerinti eljáráshoz felhasznált minden anyag ismert és a kereskedelemben beszerezhető.
A találmány szerinti eljárás előnye, hogy így magas víruskoncentrációjú, legalább 108EID50/ml infektív titerű készítményhez jutunk, amely nem tartalmazza a humán felhasználásnál nem-kívánatos olyan szennyezéseket mint a vérsejtek, sejttörmelékek, fehérje fragmentumok, fehérjék, lipidek és inkomplett vírusok.
A fentiek alapján a találmány tárgya eljárás nagytisztaságú, fertőzőképes vírust tartalmazó készítmények előállítására szokásos módon előkeltetett tojásokból vagy szövettenyészetekből, ismert módon kinyert, fagyasztással, szűréssel és centrifugálással előtisztított fertőzőképes vírus-tartalmú tápközegekből oly módon, hogy egy folyamatos üzemű ultracentrifuga folyamatos áramlású rotorjában 50-60 tf-rész NTE pufferből, 10-15 tf-rész 10-20 tömeg%-os szacharóz oldatból, 10-15 tf-rész 25-35 tömeg%-os szacharóz oldatból, 10-15 tf-rész 40-50 tömeg%-os szacharóz oldatból gradienst képezünk, majd a 0 ±5 °C hőmérsékleten tárolt, előtisztított, 107’5-108’5 EID50/ml vírustiterű, fertőzőképes vírust tartalmazó szuszpenzió 25-35 ml/perc térfogatáramú folyamatos betáplálása mellett, 20 000-40 000 ford/perc fordulatszám alkalmazásával a szuszpenzió vírustartalmát a gradiens legmagasabb szacharóz-tartalmú rétegébe juttatjuk, miközben a vírusban elszegényedett felülúszót folyamatosan eltávolítjuk, majd a nagytisztaságú, fertőzőképes vírussal feldúsult gradienst 80-100 tf-rész, 50-60 tömeg%-os szacharóz oldatnak ellenáramban való betáplálásával, 3000 4000 ford/perc fordulatszám alkalmazásával a centrifugarotorjából eltávolítjuk, edényekbe gyűjtjük, a további feldolgozásra alkalmas összegyűjtött frakciókat homogenizáljuk. Ennek vírustitere legalább 109EID5O/ml, ezt védőkolloiddal 1:50-10:1 térfogatarányban legalább 108·0 EID5(>/ml vírustiterű szuszpenzióra hígítjuk, védőkolloid és krioprotektív anyagokat adunk hozzá, és fagyasztva szárítjuk. Védőkolloidként előnyösen fiziológiás sóoldatban készített 4-5 vegyes%os 200 000—400 000 molekulatömegű hidroxi-etil-keményítő és 0,1-2 vegyes L-glutaminsav vagy Na-L-glutamát vagy L-prolin elegyét alkalmazzuk. Krioprotektív anyagként előnyösen a fertőzőképes vírust és szacharózt tartalmazó vizes szuszpenzióhoz annak térfogatára vonatkoztatva 0,1-5 vegyes% mennyiségben humán albumint és/vagy polivinil-pirrolidont alkalmazunk.
A találmányt a következő példákkal kívánjuk megvilágítani anélkül, hogy az oltalmi kört azokra korlátoznánk.
1. példa
Ismert módon embrionált tyúktojásban megtermelt ND (Newcastle Disease) vírusszuszpenziót +4 °C hőmérsékleten ülepítjük, gézen megszüljük, majd -20 °C hőmérsékleten lefagyasztjuk. Egy órán át ezen hőmérsékleten tartjuk, majd hőmérsékletét +4 °C-ra emeljük. Felmelegedés után steril, zárható centrifugapoharakba töltjük és ülepítőcentrifugába helyezve 4300 g-vel 60 percen át centrifugáljuk. A felülúszót steril vattán átszűrjük és ez kerül további feldolgozásra. Ennek infektív titere ΙΟ7·5-108·5 EID50/ml. Egy HITACHI ΕΡ65β típusú ultracentrifuga (gyártja: HITACHI Ltd., Japán) P32 CT jelű folyamatos áramlású rotorját a berendezésbe beszereljük és a hozzá kapcsolódó csővezetékekkel együtt 4 vegyes%-os formaldehid oldattal fertőtlenítjük, majd steril, pirogénmentes vízzel alaposan átmossuk. Ezt követően 230 ml NTE puffer és 100 ml 15 tömeg%-os, 50 ml 30 tömeg%-os és 50 ml 49 tömeg %-os szacharóz oldat felhasználásával gradiens rendszert alakítunk ki a
HU 214 507 Β centrifuga rotorjában. Ezt követően 30 ml/perc térfogatárammal a gradiensre tápláljuk az előkészített vírusszuszpenziót és 30 000 ford/perc fordulatszámmal elvégezzük a centrifugálást. A forgó rotorban fellépő erő hatására a víruspartikulák a külső, legmagasabb töménységű szacharóz rétegben koncentrálódnak, miközben a szennyezések a nekik megfelelő sűrűségű, alacsonyabb szacharózkoncentrációjú gradiens rétegben dúsulnak fel.
A centrifügálás folyamata alatt a vírusban elszegényedett felülúszót a rotorból folyamatosan elvezetjük.
így mintegy 8-10 liter nyers vírusszuszpenzió folyamatos, egyetlen lépésben való centrifugálását valósítjuk meg zárt rendszerben.
A művelet során a felhasználásra kerülő vírusszuszpenziót jéggel hűtött tartályból tápláljuk be. A centrifugálással nyert tisztított, fertőzőképes vírussal dúsított gradienst 430 ml 50 tömeg%-os szacharóz oldatnak a rotorba ellenáramban való betáplálásával, 3000 ford/perc fordulatszám alkalmazásával távolítjuk el. A folyamatosan távozó gradiens abszorbanciáját spektrofotométerrel, 254 nm hullámhossszon folyamatosan ellenőrizzük és regisztráljuk. A gradienst 20ml-enként steril kémcsövekben gyűjtjük és a készítmény előállítására alkalmas frakciókat, amelyek a mért abszorbancia alapján magas virustartalmúak, összegyűjtjük és homogenizáljuk védőkolloiddal 1:10 térfogatarányban hígítjuk és az értékmérések elvégzéséig -70 °C hőmérsékleten tároljuk. A további feldolgozáshoz a legalább lO9EID5o/ml vírustiterű homogenizátumot használjuk fel.
A védőkolloid összetétele: hidroxi-etil-keményítő (mól. tömeg:
200 000-400 000) 5,5 g
Na-L-glutamát 0,55 g fiziológiás sóoldat ad 100 ml
Az infektív titer és a szacharóztartalom ismeretében összeállítjuk a liofilizálandó készítményt úgy, hogy annak következő legyen az összetétele (az infektív titer maghatározása embrionált tyúktojáson történik vírustitrálással, a szacharóztartalom meghatározása enzimatikus-kolorimetriás eljárással történik):
vegyes% szacharóz, vegyes% hidroxi-etil-keményítő (mól. tömeg 200 000-400 000),
0,5 vegyes% humán albumin,
0,5 vegyes% Na-L-glutamát, vírusszuszpenzió, titere min. 108 EID5o/ml, ad 100 ml fiziológiás sóoldat
Az összetevőket alaposan összekeverjük, majd 3 mles liofilizálásra alkalmas üvegekbe 1 ml-enként adagoljuk és fagyasztva szárítjuk.
2. példa
Az 1. példa szerint előállított tisztított, koncentrált vírusszuszpenzió felhasználásával a következő összetételű, liofilizálásra alkalmas készítményt állítjuk össze:
vegyes% szacharóz, vegyes% hidroxi-etil- keményítő (mól. tömeg:
200 000-400 000),
0,5 vegyes% L-prolin,
0,5 vegyes% polivinil-pirrolidon, vírusszuszpenzió, titere min. 108 EID50/ml ad 100 ml fiziológiás sóoldat.
Claims (5)
10 SZABADALMI IGÉNYPONTOK
1. Eljárás nagytisztaságú, fertőzőképes vírust tartalmazó készítmények előállítására szokásos módon előkeltetett tojásokból vagy szövettenyészetekből ismert
15 módon kinyert, fagyasztással, szűréssel és centrifugálással előtisztított, fertőzőképes vírus-tartalmú tápközegekből, azzal jellemezve, hogy egy folyamatos üzemű ultracentrifuga folyamatos áramlású rotorjában 50-60 tf-rész NTE pufferből, 10-15 tf-rész 10-20 tömeg%-os szacha20 róz oldatból, 10-15 tf-rész 25-35 tömeg%-os szacharóz oldatból, 10-15 tf-rész 40-50 tömeg%-os szacharóz oldatból gradienst képezünk, majd a 0 ±5 °C hőmérsékleten tárolt, előtisztított, fertőzőképes vírust tartalmazó szuszpenzió 25-35 ml/perc térfogatáramú folyamatos
25 betáplálása mellett, 20 000-40 000 ford/perc fordulatszám alkalmazásával a szuszpenzió vírustartalmát a gradiens legmagasabb szacharóz-tartalmú rétegébe juttatjuk, miközben a vírusban elszegényedett felülúszót folyamatosan eltávolítjuk, majd a nagytisztaságú, fertőző30 képes vírussal feldúsult gradienst 80-100 tf-rész, 50-60 tömeg%-os szacharóz-oldatnak ellenáramban való betáplálásával, 3000-4000 ford/perc fordulatszám alkalmazásával a centrifuga rotorjából folyamatosan eltávolítjuk, edényekbe gyűjtjük, a legalább 109·0 EID5o/ml
35 vírustiterű frakciókat összegyűjtjük, homogenizáljuk, majd védőkolloiddal 1:50-10:1 térfogatarányban legalább ΙΟ8·0 EID50/ml vírustiterű szuszpenzióra hígítjuk, védőkolloid és krioprotektív anyagokat adunk hozzá, és fagyasztva szárítjuk.
40
2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az előtisztított, fertőzőképes vírust tartalmazó kiindulási tápközeg infektív titere 107,5-108’5 EID5o/ml.
3. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy védőkolloidként fiziológiás sóoldatban
45 készített 4-6 vegyes%-os hidroxi-etil-keményítő és 0,1-2 vegyes% L-glutaminsav vagy Na-L-glutamát, vagy L-prolin elegyét alkalmazzuk.
4. A 3. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy 200 000-400 000 molekulatömegű hidroxi-etil50 -keményítőt alkalmazunk.
5. Az 1-4. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a fertőzőképes vírust és szacharózt tartalmazó vizes szuszpenzióhoz annak térfogatára vonatkoztatva krioprotektív anyagként 0,1-1 vegyes%
55 mennyiségben humán albumint és/vagy polivinil-pirrolidont adagolunk.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| HU9503726A HU214507B (hu) | 1995-12-22 | 1995-12-22 | Eljárás nagytisztaságú, fertőzőképes vírust tartalmazó készítmények előállítására |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| HU9503726A HU214507B (hu) | 1995-12-22 | 1995-12-22 | Eljárás nagytisztaságú, fertőzőképes vírust tartalmazó készítmények előállítására |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| HU9503726D0 HU9503726D0 (en) | 1996-02-28 |
| HUT76620A HUT76620A (en) | 1997-10-28 |
| HU214507B true HU214507B (hu) | 1998-03-30 |
Family
ID=10987502
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| HU9503726A HU214507B (hu) | 1995-12-22 | 1995-12-22 | Eljárás nagytisztaságú, fertőzőképes vírust tartalmazó készítmények előállítására |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| HU (1) | HU214507B (hu) |
-
1995
- 1995-12-22 HU HU9503726A patent/HU214507B/hu not_active IP Right Cessation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| HUT76620A (en) | 1997-10-28 |
| HU9503726D0 (en) | 1996-02-28 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| AU673827B2 (en) | Vaccine containing live virus for therapy of viral diseases and malignancies | |
| KR100593235B1 (ko) | 인플루엔자백신 | |
| US4165370A (en) | Injectable gamma globulin | |
| US4093606A (en) | Method of producing intravenously injectable gamma globulin and a gamma globulin suitable for carrying out the method | |
| CA1100872A (en) | Method of producing intravenously injectable gamma globulin | |
| EP0298280B1 (en) | Animal derived cell with antigenic protein introduced therein | |
| AU701024B2 (en) | Method for preparing an influenza virus, antigens obtained and applications thereof | |
| Kohama et al. | Changes in conformation and charge paralleling proteolytic activation of Newcastle disease virus glycoproteins | |
| JP2012214518A (ja) | 安定かつ濾過可能なエンベロープで覆われたウイルス処方物 | |
| JP2000507825A (ja) | 細胞培養におけるインフルエンザウイルスの複製の方法、および本方法によって入手可能なインフルエンザウイルス | |
| US4317811A (en) | Herpes simplex type 1 subunit vaccine | |
| JPS58183628A (ja) | インフルエンザウイルスワクチンの安定化 | |
| US5602023A (en) | Pharmaceutical product containing live, stabilized virus for the therapy of viral and malignant diseases and process for preparing the same | |
| Harris et al. | Reticulocyte HL-A Antigens | |
| JPS6013718A (ja) | Ｂ型肝炎ワクチン | |
| FI72143C (fi) | Foerfarande foer framstaellning av maenniskointerferon. | |
| JPH04502410A (ja) | ウイルスの生産およびワクチン使用のためのウイルスエンベロープタンパク質の精製 | |
| JP2005508158A (ja) | 癌治療のための組成物および方法 | |
| US3892627A (en) | Feline panleukopenia vaccine | |
| HU214507B (hu) | Eljárás nagytisztaságú, fertőzőképes vírust tartalmazó készítmények előállítására | |
| WO2013095965A1 (en) | Stable storage of enveloped viruses in histidine aqueous solution | |
| JP2719443B2 (ja) | ウィルス性疾患及び悪性疾患の治療のための安定化された生ウィルスを含む薬剤生成物及びその製造方法 | |
| JPS63185997A (ja) | 生理活性ポリペプチド、その製法及び用途 | |
| RU2180592C1 (ru) | Полипептидный препарат из бурсы кур, способ его получения и фармацевтическая композиция на его основе | |
| JPS62249927A (ja) | 蛋白物質および抗腫瘍剤 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | Lapse of definitive patent protection due to non-payment of fees |