HU201682B

HU201682B - Process for producing vaccine against malaria

Info

Publication number: HU201682B
Application number: HU86506A
Authority: HU
Inventors: W Ripley Ballou; Mitchell Stuart Gross; Wayne T Hockmeyer; James Francis Young
Original assignee: Smithkline Beckman Corp; Us Army
Priority date: 1985-02-07
Filing date: 1986-02-06
Publication date: 1990-12-28
Also published as: IL77787A0; JPH0689032B2; YU18286A; OA08200A; ES551657A0; EP0192626B1; PT81974B; DK62386D0; IE860336L; DE3686178T2; DK167817B1; JPS6237A; AU8260991A; AU5293486A; CN86100428A; AU639588B2; PT81974A; ATE78869T1; EP0192626A1; ZA86874B

Description

A malária súlyos, széles körben elterjedt betegség, amely ellen - éveken át tartó erőfeszítések ellenére még nem sikerült vakcinát előállítani [Science, 226,679 (1984)]. Kísérletesen már sikerült emlősöket - beleértve az embert is - védetté tenni a malária kórokozója, a Plasmodium okozta fertőzések ellen, besugárzott sporozoitokkal végzett vakcinálással [Clyde és munkatársai: Am. J. Trop. Med. Hyg. 24, 397 (1975) és Rieckman és munkatársai: Bull. WHO 57 (Supp. 1) 261 (1979)]. Yoshidaés munkatársai [Science 207,71 (1980)] ismertették, hogy a fenti védettséget - legalábbis részben - a sporozoit felületén lévő egyik proteinnel, a circumsporozoit (CS) proteinnel szembeni antitestek mediálják. A CS-proteinek ellen termelődött monoklonális antitestek in vitro semlegesítik a fertó/.őképes,séget és in vivő védik az állatot. Úgy tűnik, hogy a CS-protcinck az egyes fajokon belül erősen megőrződnek az evolúció során, de különböző fajokban erősen eltérőek.

Négy Plasmodium fajt ismerünk, amelyek az embert fertőzhetik. Ezek a P. falciparum, a P. vivax, a P. ovale és a P. malariae, az utóbbi kettő sokkal ritkábban fordul elő. A tudományos érdeklődés szempontjából fontosak még a P. berghei és a P. knowlcsi, mivel ezen fajok gazdaszervezetei a rágcsálók, illetve a majmok.

A P. knowlcsi CS-proteinje egy 12 aminosavból álló szekvencia 12 egymás utáni ismétlődését tartalmazza. Zavalaés munkatársai [J. Exp. Med. 157,1947 (1983)] szerint az ismétlődő egység a fő immunogen a P. knowlcsi CS-protcinen, a fenti megállapítást azokra a kísérletekre alapozták, amelyek azt mutatták, hogy az ismétlődő egységek elleni antitestek blokkolják az anti-sporozoit anliszcrum hozzáférhetőségét a szolubilizált sporozoit proteinhez. Gysin és munkatársai [J. Exp. Med. 160, 935 (1984)] megállapították, hogy a P. knowlcsi CS-proteinjánek egymás utáni ismétlődő egységeit képviselő szintetikus, 24 aminosavból állc peptid semlegesíti a virulens sporozoitok fertőzőképesseget majmok esetén.

Colman és munkatársai (WO 84-2922-A, nyilvánosságra kerülés: 1984. 08. 02.) ismertették P. knowlcsi CS-protein ismétlődő egységét kódoló régió egy részének klónozását és béta-laktamázzal és béta-galaktozidázzal fuzionálva annak kifejeződését. Nussenzweig és munkatársai (US 4 466 917) ismertették a P44 proteinnek nevezett sporozoit proteint, és annak klónozását és kifejeződését É. coliban.

Eneaés munkatársai [Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 81, 7520 (1984)] is találtak egy hasonló ismétlődő egység szerkezetet P. cynomologi CS-prote:njé'.:en.

Kemp és munkatársai (W084 02917-A) leírták a P. falciparum CS-proteinjének klónozását és kifejezését E. coliban.

Dameés munkatársai [Science 22j, 593 (192-4)] leírták a P. falcipejum CS-proteinjének klónozását és kifejezését E. coliban. A protein eszerint közel 442 aminosavból áll, átlagos molekulatömege 44 000, és egy tetrapeptid 41 egymás utáni ismétlődését foglalja magában. Az ismétlődő szakaszból származó szintetikus 7-, 11 és 15-tagú peptid-töredékek kötődnek a CS-protcinnel szembeni monoklonális antitestekhez.

A találmány tárgya egyrészt a Plasmodium falciparum CS-protein 16 vagy több egymás utáni ismétlődő egységét magában foglaló immunogén polipeptid, amely képes az emlős szervezet Plasmodium falciparum fertőzéssel szembeni immunitását biztosítani.

A találmány tárgya másrészt eljárás az ember Píasmodium falciparum sporozoit okozta fertőzése elleni vakcina előállítására, amely hatóanyagként a találmány szerinti eljárással előállított polipeptid immunológiai védelmet biztosító mennyiségét tartalmazza, gyógyászatilag elfogadható hordozó- és egyéb segédanyagokkal összekeverve.

Az la. ábra a CS-proteint kódoló szekvenciát tartalmazó P. falciparum genom DNS egy régiójának részleges endonukleázos hasításával nyert géntérképe.

Az lb. ábra a pASl részleges endonukleázos hasítással nyert géntérkcpc.

A találmány szerinti eljárással előállított polipeptid Γ , coliban előállított, 16 vagy több egymás után ismétlődő CS-protein egységet tartalmaz. Ez ugyan nem azonos a CS-proteinnel, de tartalmazhatja a CS-protein. bizonyok az ismétlődő egységtől eltérő részeit is. A . falciparum. ismétlődő egysége egy tetrapeptid, amelynek szekven. ciája az alábbi:

-Asn-Ala-Asn-Pro-, a képletben Asn aszparagint, Alá alanint és Pro prolint jelent.

A találmány szerinti eljárással előállított polipcptidben a fenti tetrapeptid variációi is előfordulhatnak, feltéve, hogy nem csökkentik Jelentősen a velük szembeni antitestek reaktivitását a P, falciparum CS-protcinnel. Például Dame és munkatársai [Science 225,593 (1984)] világosan kifejtik, hogy a P. falciparum természetes CS-proteinjének 41 ismétlődő tetrapeptid egysege közül 37 szekvenciája Asn-Ala-Asn-Pro, míg 4 tetrapeptid szekvenciája Ásn-Val-Asp-Pro - az utóbbi rövidítések közül Val jelentése valin és Asp jelentése aszparaginsav. A polipeptid ismétlődő egységeinek előnyösen több, mint fele úgynevezett működő szekvenciának, azaz Asn-Ala-Asn-Pro- szekvenciának felel meg.

A találmány szerinti eljárással előállított polipeptid előnyösen 16-112 ismétlődő egysége, tartalmaz.

A találmány szerinti eljárással előállított polipeptid hibrid is lehet, vagyis ncm-CS-protcin ismétlődő egységet tartalmazó fúziós polipeptid. A fenti nem-CS-prctsi.z ismétlődő szekvencia hordozó molekulaként szolgálhat, az immup.ogén tulajdonságok fokozására, vagy ; rekombináns mikroorganizmusban a klónozás és exp rcsszió megkönnyítésére. Másik lehetőség, hogy a fenti kiegészítő szekvenciák más sporozoit-immunogénként, más Plasmodium-immnnogénként és/vagy más nemPlasmodium-immunogénként szolgáló egy vagy több helyet hordoznak. A találmány csak azokra a C2-proteinekre nem vonatkozik, amelyek gyakorlatilag hasznosítható mennyiségben nerc fejeződnek ki megbízhatóan E. coliban, és nem szükségesek a P. falciparttm elleni im rnuⁿ * z? lAshoz.

A 'lú’.mány szerinti eljárással közelebbről az r.lábbi pol'pcptidek állíthatók elő:

?.tet₃₂ polipeptidek, amelyek legalább IS :s...ef;öóő egységet tartalmaznak, és azok C-tcrminá!is végéb.'·: a pSP.372 tetraciklin-rezisztencia (tetR) génjéből származó kb, 32 N-terminális aminosav kapcsolódik;

F.tet₈₅ polipeptidek, amelyek legalább 16 ismétlődő egységet tartalmaznak, és C-terminális végükhöz egy tetR gén termék van fuzionálva;

RNS1 polipeptidek, amelyek legalább 16 ismétlődő egységet tartalmaznak, és azok C-terminális végéhez az NS1 227 aminosavja kapcsolódik;

NS1R polipeptidek, amelyek legalább 16 ismétlődő

HU 201 682 Β egységet tartalmaznak, és azok N-terminális végéhez az NS1 N-terminális 81 aminosavja van fuzionálva;

RG polipeptidek, .amelyek legalább 16 ismétlődő egységet tartalmaznak, és azok C-terminális végéhez egy glicin-aminosavmaradék kapcsolódik;

RLA polipeptidek, amelyek legalább 16 ismétlődő egységet tartalmaznak, és azok C-terminális végéhez egy leucin-arginin aminosav-maradék kapcsolódik;

RN polipeptidek, amelyek legalább 16 ismétlődő egységet tartalmaznak, és azok C-terminális végéhez egy Asn-Thr-Val-Ser-Ser- szekvencia kapcsolódik.

A CS-protein ismétlődő egységeket genetikailag kódoló szekvenciát ismert módon állítjuk elő, például szintézissel; vagy, előnyösebben, P. falciparumból a mRNS reverz transzkripciójával, például Ellis és munkatársai [Natúré 302, 536 (1983)] módszerével; vagy a P. falciparum genom DNS-éből származó érintetlen gén közvetlen klónozásával, például Dame és munkatársai fent idézett módszere szerint. Az la. ábra a CS-proteint kódoló régiót szemlélteti. A P. falciparumot és annak sporozoitjait fertőzött emberből vagy moszkitóból nyerhetjük.

A CS-proteint vagy annak egy részét kódoló szekvencia klónozása után ismert módon előállíthatjuk annak egy al-fragmentumát, amely az ismétlődő egységet vagy annak egy részét kódolja. A CS-protein génben lévő megfelelő hozzáférhető restrikciós helyeket az la. ábrán szemléltetjük. Előnyösek az Xho II helyek. Az Xho II-vei végzett hasítással egy

N-Asp-Pro-[(Asn-Ala-Asn-Pro)i₅(Asn-Val-Asp-Pro)i]„-C képletű, 16 ismétlődő egységet kódoló szekvencia válik szabaddá, a fenti képletben n értéke 1. Több tandem Xho II fragmentumot a megfelelő orientációban használva hosszabb ismétlődő egységeket kapunk, azaz a fenti képletben n értéke 1-nél nagyobb lesz.

A szintetikus eljárások jól ismertek, és kereskedelmi forgalomban lévő DNS-szintetizátorok alkalmazásával végrehajthatók. Szintézissel előállítható olyan oligonukleotid, amely lényegében a fenti aminosavaknak megfelelő kodonokat tartalmazza, és ugyanazon Xho II végeket vagy más hasítási helyeket tartalmaz a végeken. A fenti szintetikus oligonukleotidok eltérhetnek a természetes 64 kodontól, és vagy ugyanezen aminosavakat kódolhatják, vagy egy olyan polipeptidet, amelyben kis számú, előnyösen kb. nyolcnál kevesebb eltérő aminosav van, feltéve, hogy ezzel a polipeptid immunológiai védőképessége nem csökken jelentősen. A szintetikus kódoló szekvencia például a teljes működő szekvenciát kódolja, amelynek képlete (-Asn-Ala-Asn-Pro-)_n· és n értéke legalább 16.

Apolipeptidetkódoló szekvenciát egy E. coli expreszsziós vektorba illeszthetjük, amelyek többsége ismert és hozzáférhető. A találmány szerinti polipeptidek magas szintű expiessziója E. coliban meglepő, a termék szokatlan aminosav-összetétele - kb. 50% aszparagin, 25% alanin és 25% prolin - miatt. Mint azt alább ismertetjük, tapasztalataink szerint a kódoló szekvencia jól expresszálható a lambda PL promoteréből és a lambda cll riboszoma-kötőhelyéből álló regulátor elem használatával, amint azt a pASl plazmid tartalmazza [Rosenberg és munkatársai: Meth. Enzym. 101,123 (1983) és Shatzman és munkatársai: Experimental Manipulation of Géné Expression, szerk. M. Inouye, Academic Press, New York, 1982]. A pASl hordozza a replikáció pBR322 eredetét, egy ampicillin-rezisztencia markert, és a lambdából származó fragmentumok sorát, beleértve a PL-t, N-antiterminációs funkciójú felismerő helyeket (NutL és NutR), az rho-függő transzkripciós terminációs szignált (tRl) és a cll riboszoma-kötőhelyet, amely magában foglalja a cll transzlációt iniciáló helyet, amelynek G-maradékát közvetlenül egy Bam Hl hasítási hely követi. A pASl a pKC30cII-ből származtatható oly módon, hogy a pKC30cII cII-pBR322 csatlakozásánál lévő Bam Hl hely és a cll ATG közötti nukleotidokat töröljük, és a molekulát újra összekapcsoljuk, hogy a Bam Hl helyet közvetlenül az ATG-től lefelé regeneráljuk. A pKC30cII-t úgy szerkeszthetjük meg, hogy a lambda

1.3 kg-ból álló Hae fragmentumát - amely a cll gént hordozza - a pKC30 Hpa I helyébe illesztjük, Rosenberg és munkatársai, illetve Shatzman és munkatársai fent idézett módszerei szerint. A pKC30-at Shimitake és munkatársai [Natúré 292, 128 (1981)] ismertették, ez egy pBR322 származék, amely a pBR322 tetR génjében a Hind III és Bam Hl helyek közé illesztve egy

2.4 kg-ból álló lambda Hind ΙΠ-Bam Hl fragmentumot tartalmaz. A pASl-hez hasonló szerkezetet ismertettek Courtney és munkatársai [Natúré 313, 149 (1985)] is. A pASl az American Type Culture Colection-nél (Rockville, Maryland, Amerikai Egyesült Államok) van letétbe helyezve, ATCC 39262 számon. A találmány szerinti expressziós vektort úgy állítjuk elő, hogy a kódoló szekvenciát működőképes helyzetben - azaz helyes orientációban és megfelelő leolvasási rendben - ismert módszerrel egy E. coli expressziós vektor regulátor eleméhez kötjük.

A fenti módon kifejeződött polipeptidet a szokásos fehérje-elválasztási módszerekkel választjuk el és tisztítjuk az azt termelő tenyészetből. A tisztítást például az alábbi lépésekből álló eljárással végezhetjük: 1. a sejteket elroncsoljuk, 2. a sejt-törmeléktől megtisztítjuk a rendszert, 3. a találmány szerinti eljárással előállított polipeptideket elválasztjuk a megtisztított sejt-extraktumban lévő egyéb polipeptidektől, 4. a maradék szennyeződést, így a maradék polipeptidet, szénhidrátot, nukleinsavat és/vagy lipopoliszacharidot egy befejező tisztítási művelettel eltávolítjuk.

Az első lépést úgy hajthatjuk végre, hogy például lizozimet vagy más lizáló vagy permeabilizáló szert adunk a rendszerhez, vagy a sejteket mechanikusan vagy ultrahangos kezeléssel roncsoljuk el. Az extraktum tisztítására szolgáló centrifugálás vagy ultraszűrés előtt felületaktív szert adunk a rendszerhez, a találmány szerinti eljárással előállított polipeptidek oldatban tartására.

A találmány szerinti eljárás egyik lényeges elemét az a felismerés képezi, hogy a találmány szerinti eljárással előállított bizonyos polipeptideket úgy választhatjuk el igen nagy hatékonysággal az egyéb polipeptidektől, ha a tisztított extraktumot a protein oltatban tartására adott detergens beadagolása után közel 80 *C-ra melegítjük. Azt tapasztaltuk, hogy ha az extraktumot 80 *C-on legalább 4 percen át melegítjük, csaknem az összes bakteriális polipeptid kicsapódik, anélkül, hogy a lényegében az ismétlődő egységekből álló, vagy az ismétlődő egységek más, nem hőre denaturálódó szekvenciákhoz való kapcsolódásából álló polipeptidek denaturálódnának. A denaturált bakteriális polipeptideket centrifugálással tömöríthetjük és eltávolíthatjuk. A fenti eljárás az Rtet₃₂, RG, RLAés Rtetgí polipeptidek tisztítására használható. Közelebbről, a fenti eljárást sikeresen alkalmaztuk az

HU 201 682 Β

R16tet₃₂, R32tet₃₂, R48tet_32i R64tet₃₂, R48G, R32LA és Rlötetje tisztítására, amint azt a példákban ismertetjük, míg az R16NS1 és R32NS1 melegítése ezen polipeptidek kicsapódását okozta.

A találmány szerinti eljárással előállított polipeptidet tovább tisztíthatjuk, például szelektív kicsapószer hozzáadásával, majd egy kromatográfiás lépéssel, például ioncserélő kromatográfiával vagy fordított fázisú nagynyomású folyadékkromatográfiával.

A találmány szerinti eljárással előállított vakcinában a találmány szerinti eljárással előállított polipeptid vizes, előnyösen fiziológiás pH-η pufferolt oldatát közvetlenül használhatjuk. A találmány szerinti eljárással előállított polipeptidet - liofolizálás után vagy anélkül különféle ismert adjuvánsokon is adszorbeálhatjuk vagy azokkal keverhetjük. A fenti adjuvánsok többek között alumínium-hidroxid, muramil-dipeptid vagy szaponinok, így Quil A lehetnek. További alkalmazási módként például a polipeptid mikrorészecskékbe - például liposzomákba - való kapszulázást említhetjük. Úgy is eljárhatunk, hogy a polipeptidet egy immunstimuláló makromolekulával - például elölt Bordatellával vagy egy tetanusz toxoiddal - kapcsoljuk össze.

A vakcinák előállítását például a New Trends and Developments in Vaccines, szerk. Voller és munkatársai, University Park Press, Baltimore, Maryland, Amerikai Egyesült Államok, 1978 irodalmi helyen ismertetik általánosan. A liposzomákba való kapszulázást például Fullerton (US-PS 4 235 877) ismertette. A proteinek makromolekulákhoz kapcsolását például Likhite (USPS 4 372 945) és Aimor és munkatársai (US-PS 4 474 757) írták le. A Quil A használatát például Dalsgaard és munkatársai [Acta Vet. Scand. 18, 349 (1977)] munkájából ismerjük.

A vakcina-dózisokban a polipeptid mennyiségét úgy választjuk meg, hogy azzal az immunprotckiív válasz elérhető legyen, a szokásos vakcinák hátrányos mellékhatásai nélkül. A fenti dózis az alkalmazott specifikus polipeptidtől, valamint attól függ, hogy a vakcina adjuvánst is tartalmaz-e. Általában minden egyes dózis 11000 pg, előnyösen 10-200 pg polipeptidet tartalmazhat. Áz egyes vakcinák optimális dózisát szokásos módon, például az antitest-titer meghatározásával vagy a kezelendő alany más válaszának mérésével határozhatjuk meg. Az első vakcinálást követően a kezelt alany előnyösen kb. 4 hét múlva újabb adagot kap, és ezt követően minden 6 hónapban megismételjük az adagolást, egészen a fertőzésveszély fennállásáig.

A találmányt közelebbről - a korlátozás szándéka nélkül - az alábbi példákkal kívánjuk ismertetni. A CSproteint kódoló szekvenciát James Webertől (Walter Reed Army Institute fór Research) kaptuk, egy standard E. coli klónozó vektorba, a pUC8-ba (Bethesda Research Laboratories, Inc., Gaithersburg, MD, Amerikai Egyesült Államok) az Eco Rí helynél illesztett XmPFl (Dame és munkatársai, fent idézve) 2337 bázispárból álló Eco Rí fragmens formájában (lásd la. ábra). A kapott pUC8 származékot a továbbiakban pUC8 1. kiónnak nevezzük.

1. példa

CS-protein származék pg tisztított pUC8 1. klón plazmid DNS-t 100 egység Stul és 100 egység Rsal restrikciós endonukleázokkal emésztünk, 400 μί puffer-közegben (amelynek összetétele 50 mmól/1 Tris, pH 7,5,50 mmól/1 NaCl,

I mmól/1 ditiotreitol (DTT) és 10 mmól/1 MgCl₂), 37 °C-on, 1,5 órán át. Á kapott, a CS-protein első 18 aminosavját kódoló, 1216 bázisból álló fragmentumot 5% poli(akril-amid)-gélenelektroforézissel (PAGE) választjuk el.

pg pASl expressziós vektort (ATCC 39 262) 200 pl puffer-közegben 1,5 órán át, 37 ’C-on 25 egység Bam Hl restrikciós endonukleázzal emésztünk. A szétvágott plazmidot ezután DNS-polimeráz nagy fragmentummal (Klenow, 5 egység; 20 mmól/1 Tris-HCl, pH

7,5,7 mmól/l MgCl₂,60 mmól/1 NaCl, 6 mmól/12-mcrkapto-etanol és 0,25 mmól/1 a négy dezoxinukleotid-trifoszfát mindegyikéből; 25 ’C, 15 perc) kezeljük, a Bam Hl helynél a vég betöltésére.

A CS-gén fragmentum 1 pg-ját ezután 100 ng fenti vektorral kötjük össze, 30 pl ligáz-pufferben (50 mmól/1 Tris, pH 7,5, 1 mmól/1 DTT, 10 mmól/1 MgCl₂, 100 pmól/l rATP), 1 egység T4-DNS ligáz segítségével, 16 órás reakcióidőt alkalmazva, 4 °C-on. A ligációs elegyet E. coli MM294CI’ törzsbe (Am. Ν. X. Acad. Sci 478, 233-248.) transzformáljuk, ampicillin-rezisztens telepeket kapunk, és ezeket vizsgáljuk a CS-gén fragmentum pASl-be való beépülése szempontjából. Egy megfelelő szerkezetűnek talált plazmidot (pCSP) azonosítás után E. coli N5151 törzsbe transzformálunk (clts857) [(Mól. Cell. Bioi. 5, (5), 1015-124 (1985)] és a teljes hosszúságú CS-protein expressziója szempontjából vizsgáljuk. (Aprotein-N-terminálisánál a 18 aminosav törlése az autentikus CS-protein hasított szignálpeptidjének felelne meg.) A sejteket Luria-Bertani tápközegben (LB) tenyésztjük 32 ’C-on, amíg a tenyészet abszorpciója 650 nm-en (A₆₅₀) eléri a 0,6 értéket, majd a hőmérsékletet 2 órán át 42 ’C-on (ártjuk, az expreszsziós plazmid PL-promotere transzkripciójának beindítására és a CS-protein származék ezt követő transzlációjára. A sejttenyészetből 1 ml-es mintákat veszünk, tömörítjük, lizáló pufferben [10 mmól/1 Tris-HCl, pH 7,8, 25 térfogat% glicerin, 2% 2-merkapto-etanol, 2% nátrium-dodecil-szulfát (SDS), 0,1 % brómfenolkék] újraszuszpendáljuk és 105 ’C-os melegítő egységben 5 percen át melegítjük. A proteineket SDS-PAGE segítségével elválasztjuk [13% akril-amid, 30:0,8 akrilamid: bisz (akril-amid) arány], A proteineket nitro-ccllulózra visszük és az E. coliban termelődött CS-proteint ún. western biot analízissel mutatjuk ki, a P. falciparum tetrapeptid ismétlődő szakaszával reagáló öt monoklonális antitestet használva (Dame és munkatársai fent idézett munkája).

2. példa

R16tetg_ó polipeptid

100 pg tisztított pUC8 1. klón DNS-t 40 egység Xho

II restrikciós endonukleázzal emésztünk, 400 pl pufferközegben, 37 ’C-on, 16 órán át. A CS-protein 16 tetrapeptid ismétlődő egységét kódoló, 192 bázispárból álló fragmentumot ezután PAGE segítségével izoláljuk. A pASl expressziós vektort az 1. példában ismertetett módon Bam Hl restrikciós endonukleázzal hasítjuk. 1 pg 192 bázispárból álló Xho II fragmentumot 100 ng pÁS 1-hez kötünk, annak Bam Hl helyén, az 1. példában leírt módon. A ligációs elegyet E. coli MM294CI’ törzsbe transzformáljuk. Egy, a pASl Bam Hl helyén megfelelő orientációban egy 192 bázispárból álló Xho II fragmentumot tartalmazó kiónt azonosítottunk, a plazmid

HU 201 682 Β

Bam HI-Hind II fragmentumának poli(akril-amid) gél-elektroforézisével, amelynek Hind II helye a tetR géntől lefelé helyezkedik el, és a Bam Hl hely a cll ATG és a beillesztett fragmentum csatlakozásánál van a helyesen orientált plazmidban. A fenti pRlótetas plazmid szerkezete az alábbi:

pBR322 PL ismétlődő egység tetR S pBR322

BH BB ahol BH jelentése Bam Hl hely, B jelentése Bán Π hely és S jelentése terminációs kodon.

A pRlőtetge-tal transzformáljuk az E. coli N5151 törzset (clts857) és a CS-protein tetrapeptid ismétlődő egységének termelődése szempontjából vizsgáljuk, western biot analízissel. A képződött protein szerkezete az alábbi:

N-Met-Asp-Pro-(Asn-Ala-Asn-Pro)u-(Asn-Val- Asp-Pro)_rT86-C ahol T86 a pASl-ben levő tetraciklin rezisztencia génből származó 86 aminosavat jelenti. Az N-terminális metionin (Met) aminosav-maradck szintén a vektorból származott, közelebbről a cll protein iniciációs kodonból.

2A. példa

R32tet_ií és R48tetg6 polipeptidek pg tisztított pR lőteúe plazmid DNS-t 25 egység Bam Hl restrikciós endonukleázzal emésztünk 200 pl puffer-közegben, 37 *C-on, 2 órán át. A fenti DNS 100 ng-ját ezután 1 pg fent ismertetett 192 bázispárból álló Xho II fragmentummal kapcsoljuk össze. Előállítjuk az alábbi szekvenciájú polipeptideket kódoló expressziós vektorokat:

N-Met-Asp-Pro-[(Asn-Ala-Asn-Pro)i₅-(Asn-Val-Asp-ProXkTSŐ-C, ahol n értéke 2 (R32tete₆), vagy n értéke 3 (R48tct«(₆), és azokat E. coliban fejezzük ki. Azokat a pASl kiónokat, amelyekben n értéke 2 vagy 3, elválasztjuk azoktól a kiónoktól, amelyekben n értéke 2-től vagy 3-tól eltérő, mint azt fent ismertettük. Minden egyes vizsgált klón a helyes orientációban tartalmazza a beépült fragmentumot Mind az R32tct_gé, mind az R48tete6 közel azonos mértékben expresszálódott az Rlótet^-tal, amint azt immun-lenyomatos analízissel (immunoblotting) kimutattuk.

Az Rtettf proteinek immun-lenyomatos analízisével kimutatható volt a termékek heterogén összetétele, amelyet Coomassie Brilliant Blue R-250-es festéssel nem lehetett látni. Ezek a proteinek úgy tűnik, hogy közel fele mennyiségben az alább ismertetett Rtet₃₂ polipeptidektől állnak. Úgy tűnt, hogy a kisebb degradációs termékek mérete arányos a kiónban lévő tetrapeptid ismétlődő egységek számával. A fenti proteinek instabilitása a heterológ COOH-terminális vég degradációjának tulajdonítható valószínűleg.

3. példa

R16tet₃₂ polipeptid pg tisztított pRlótetw DNS-t 25 egység Bán II restrikciós endonukleázzal hasítunk, 200 pl puffer-közegben, 37 ‘C-on, 2 órán át. A fenti hasított DNS 100 ng-ját ezután ligázzal zárjuk. A fenti művelet eredményeként töröltünk egy 14 bázispárból álló Bán II fragmentumot, és egy terminációs kodon alakult ki éppen a megmaradt Bán II helytől lefelé. Az így kapott pR16tet₃₂ plazmidot használjuk fel E. coli N5151 törzsben az R16tct₃₂ kifejezésére, majd a tenyészetből tisztítjuk az R16tet₃₂-t. Az R16tet₃₂-t tartalmazó E. coli 30 g-ját (nedves tömeg) 200 ml A-puffcrbcn [50 mmól/1 Tris-HC1, pH 8,0,2 mmól/1 etiléndiamin-tetraecetsav (EDTA), 0,1 mmól/1 ditiotreitol, 5 térfogat% glicerin] újraszuszpendáljuk. 0,2 mg/ml végkoncentrációban lizozimet adunk hozzá, és az elegyet jégen 30 percen át inkubálva lizáljuk a sejteket Az elegyet ezután Waring homogenizátorban 3 percen át magas fordubtszámot alkalmazva kezeljük, majd 1 percen át Brason 350 szonikátorban ultrahangos kezeléssel szétnyírjuk a bakteriális DNS-t. 0,1 vegyes% végkoncentrációban nátrium-dczoxi-kolátot adunk az elegyhez, és 30 percen át 4 ‘C-on keverjük. A szuszpenziót ezután 12 000 g-vel 30 percen át centrifugálva eltávolítjuk a sejt-törmelékeket. A felülúszót egy lombikban összegyűjtjük és forró vízfürdőn 10 percen át inkubáljuk, majd 12 000 g-vel 30 percen át centrifugáljuk. Azt tapasztaltuk, hogy közel az összes E. coli protein kicsapódott a hőkezelési lépés alatt, és kiülepedett a ccntrifugáláskor, míg az R16tct₃₂ protein oldatban maradt és a felülúszóban gyűlt össze. A felülúszót összegyűjtjük és 20%-os telítettséget biztosító koncentrációban lassan ammónium-szulfátot adunk hozzá. A fenti módon szelektíven kicsapott R16tet₃₂-t centrifugálással (12 000 g, 30 perc) összegyűjtjük. Ezen a ponton az R16tet₃₂ protein 95%-nál nagyobb tisztaságú, az egyéb szennyező bakteriális proteinek tekintetében.

Az egyéb anyagok - például proteinek, szénhidrátok, nukleinsavak vagy lipopoliszacharidok - által okozott maradék szennyezést egy végső kromatográfiás tisztítással - például ioncserélős kromatográfiával, fordított fázisú nagynyomású folyadékkromatográfiával, fenilSepharose kromatográfiával, méret szerinti elválasztással stb. - távolíthatjuk el. A képződött tisztított R16tet₃₂közel 5%-át teszi ki az összes E. coli proteinnek, azaz 30-60 mg/1 koncentrációjú, amint az Coomassie Blue festéssel megállapítottuk.

Az R16tet₃₂ szekvenciája az alábbi:

N-Met-Asp-Pro-[(Asn-Ala-Asn-Pro)_ls(Asn-Val-Asp-Pro)i]_n-T32-C, ahol n értéke 1 és T32 a tetraciklin rezisztencia génből származó 32 aminosavat jelenti. Közelebbről, a T32 szekvenciája az alábbi: -Leu-Arg-Arg-Thr-His-Arg-Gly-Arg-His-His-Arg-Arg-His-Arg-Cys-Gly-Cis-Trp-Arg-Leu-Tyr-Arg-Arg-His-His-Arg-Trp-Gly-Arg-Ser—Gly-Ser—C, a megmaradt Bán Π hely a 30. és 31. aminosav között van. 3A. példa

R32tet₃₂ és R48tet₃₂ polipeptidek

Lényegében a 3. példa szerint eljárva állítjuk elő az R32tet₃₂-t és R48tet₃₂.t (azaz egy olyan R16tet₃₂-nek megfelelő szekvenciát, amelyben n értéke 2, illetve 3) E. coliban, és azonos hozammal és tisztasági fokkal izoláljuk, mint az R16tet₃₂-L Kiindulási vektorként pR32tet«j₆-ot, illetve pR48tetg₆-ot használunk.

3B. példa

R64tet₃₂ ésR80tet₃₂ polipeptid pg tisztított pR48tet₃₂ plazmid DNS-t 25 egység Bam ΗΙ-val emésztünk 200 pl puffer-közegben, 37 ’Con, 2 órán át. 100 ng fenti DNS-t ezután 1 pg fent ismertetett, 192 bázispárt tartalmazó Xho II fragmentummal kapcsolunk össze. Előállítjuk az alábbi szekven5

HU 201 682 Β ciájú polipeptidckct kódoló plazmid cxprcssziós vektorokat:

N -Met-Asp-Pro- [(Asn-Alá-Asn-Pro)u-(Asn-V al-Asp-Pro)₁]_nT32-C, ahol n értéke 4 (R64tet₃₂) vagy n értéke 5 (R80tet₃₂), és azokat E. coliban kifejezzük. Azokat a pASl kiónokat, amelyekben n értéke 4 vagy 5, azoktól a kiónoktól, amelyekben n értéke 4-től vagy 5-től eltérő, a fent leírt módon elválasztjuk. Az R64tet₃₂, és az R80tet₃₂ közel azonos mértékben expresszálódott, mint az R48tet₃₂. Az R64tet₃₂-t lényegében az R16tet_32i R32tet₃₂ és R48tet₃₂, előállításával kapcsolatban ismertetett módon tisztítjuk. 3C. példa

R96tet₃₂ és R112tet₃₂ polipeptid

Lényegében a 3B. példában leírtak szerint eljárva állítjuk elő az R96tet₃₂ és R112tet₃₂ polipeptideket (amelyek képletében n értéke 6, illetve 7), az R48-tet₃₂-vel közel azonos mennyiségben. Kiindulási vektorként pR80tet₃₂-t használunk.

Noha a tisztított Rtet₃₂ polipeptidekben észlelhető bizonyos mértékű heterogenitás immun-lenyomatos módszerrel, a reakcióképes fő foltok összhangban vannak a protein-festéssel kimutatható sávokkal. Az SDS-PAGE módszerrel meghatározott molekulatömegek a vártnál kb. kétszer nagyobbak, noha az egyes proteinek vándorlása minden egyes előállított polipeptid esetén arányos a tetrapeptid ismétlődő egységek számával. Néhány esetben meghatároztuk az Rtet₃₂ peptidek aminosav-összetételét is, amelyek a várt értékeknek megfeleltek.

4. példa

R16G polipeptid

A pASl Bam Hl helyére egy 5’-GATCCCGGGTGACTGACTGA -3’

3’ GGCCCACTGACTGACTCTAG -5’ szekvenciájú szintetikus kötőt illesztve pTerm-et állítunk elő. 10 pg pASl-et 25 egység Bam ΗΙ-vel emésztünk. 100 ng Bam ΗΙ-vel hasított pASl-et 20 ng szintetikus kötővel kötünk össze, és a pTerm plazmidot mint a pASl Bam Hl helyén egy beépült kötő-szekvenciát tartalmazó plazmidot azonosítjuk. A fenti vektorban megmarad a Bam Hl hely, és a TGA terminációs kodonoknak a cll protein ATG iniciációs kodonjától lefelé való beillesztését eredményezi, mind a három leolvasási rendszerben.

ApRlóG plazmidot úgy állítjuk elő, hogy apUC8 1. kiónjából származó 192 bázispárból álló Xho II fragmentumot a pTerm Bam Hl helyre illesztjük, és kiválasztjuk a fent ismertetett módon azokat a kiónokat, amelyek megfelelő orientációban tartalmaznak egyetlen Xho II betoldást.

A pR 16G-t lényegében a fent ismertetett módon klónozzuk és fejezzük ki E. coli N5151 törzsben.

Az R16G szekvenciája az alábbi: N-Met-Asp-Pro-[(Asn-Ala-Asn-ProX₅-(Asn-Val-Asp-Pro)i]_n-Gly-C, ahol n értéke 1.

A fenti proteinben nincs aromás gyűrűs amínosavmaradék, így a képződött polipeptid mennyiségét nem tudjuk Coomassie Brilliant Blue R-250-es festéssel vizuálisan meghatározni. A CS-proteinre specifikus 5 monoklonális antitesttel végzett immun-lenyomatos analízis (lásd Dame és munkatársai fent idézett munkája) szerint a kívánt polipeptid közel 1 %-át teszi ki az összes scjt-protcinnck, az R16tct₃₂-vcl összehasonlítva, amely utóbbinál lehetséges Coomassie Brilliant Blue R-250-es festéssel meghatározni a protein-tartalmat.

4A. példa

R32G. R48G, R64G, R80G és R112G polipeptid

Az R32G, R48G, R64G, R80G és R112G polipeptideket - amelyek szekvenciája azonos az R16G-vel, de n értéke 2, 3, 4, 5, illetve 7 - a 4. példában ismertetett módon E. coli N5151 törzsben termeljük. A fenti polipeptidek közel azonos mennyiségben képződnek, mint az R16G. Az R48G-t lényegében a 3. példában leírtak szerint tisztítjuk.

5. példa

R16LA és R32LA polipeptid

A pASl Bam Hl helyére egy 5’-GATCCGCTGCGTT -3’

GCGACGCAACTAG -5’ szekvenciájú szintetikus kötőt illesztve pTerm2-t állítunk elő, lényegében a 4. példában leírt módon. A pTerm2-ben megmarad a Bam Hl hely. A pUC8 1. klónból származó 192 bázispárból álló Xho II fragmentumot a fent ismertetett módon illesztjük be a pTcrm2 Bam Hl helyére. A pR16LA és pR32LA kiónokat, amelyek egy, illetve két Xho II beillesztést tartalmaznak a megfelelő orientációban, lényegében a fent ismertetett módon választjuk ki. Az R32LA-t lényegében a 3. példában leírt módon tisztítjuk.

A pR16LA-t és pR32LA-t a fent ismertetett módon klónozzuk és fejezzük ki E. coli N5151 törzsben.

Az R16LA és R32LA szekvenciája az alábbi: N-Met-Asp-Pro-[(Asn-Ala-Asn-Pro)!5-(Asn-Val-Asp-Pro),]„-Leu-Arg-C, ahol n értéke 1, illetve 2. A C-terminális leucin és arginin a pTerm2-ben lévő szintetikus kötőből származik.

Az R16LA közel 1%-át teszi ki az E. coli összes proteinjének, míg az R32LA az összes sejt-proteinnek közel 5%-a.

6. példa

R16NS1 polipeptid

A pASldeltaEH plazmidot úgy állítjuk elő, hogy a pASl pBR322 eredetű nem létfontosságú Eco RÍ Hind ÍII régióját töröljük. 10 pg pASl-et 20 egység Eco Rl-vel és 20 egység Hind III-mal hasítunk, 200 pl puffer-közegben, DNS-polimerázzal (Klenow) kezeljük, ligázzal zárjuk, és E. coliba Panszformáljuk, lényegében a fent ismertetett módon. Azonosítunk egy olyan kiónt, amelyből a 29 bázispárból álló Eco Rí - Hind III fragmens törölve van. A pASldeltaEH Bam Hl helyére beillesztjük a pAPR801 1236 bázispárból álló Bam Hl fragmentumát [Young és munkatársai: Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 80, 6105 (1983)], amely az influenza vírus (A/PR/8/34) NS1 kódoló régióját tartalmazza, ami 861 virális eredetű bázispárból és a pBR322-ből származó 375 bázispárból áll. A kapott pASldeltaEH/801 plazmid az autentikus NSl-et (230 aminosav) kódolja. A fenti plazmidban megmarad a Bam Hl hely, a cll transzlációt indító hely és az NS1 kódoló szekvencia között.

pg pASldeltaEH/801 plazmidot 20 egység Eco RIvel és 20 egység Sál I-gyel hasítunk, 200 pl nagy ioncrőssegű pufferben (50 mmól/1 Tris-HCl, pH 7,5, 1 mmól/1 DTT, 10 mmól/1 MgCl₂, 100 mmól/1 NaCl), 37 ’-on 2

-611

HU 201 682 Β órán keresztül, DNS-polimeráz nagy fragmentummal (Klenow) kezeljük és ligázzal zárjuk, lényegében a fent leírtak szerint. Izolálunk egy olyan kiónt, amelyből a 650 bázispárt tartalmazó Eco Rí - Sál I régió törölve van. A fenti pNS IdeltaES plazmid az autentikus NS 1-et kódolja.

A pR 16NS1 plazmidot úgy állítjuk elő, hogy a pUC8

1. kiónjából származó 192 bázispárt tartalmazó Xho II fragmentumot a pNS IdeltaES plazmid Bam Hl helyére illesztjük, és lényegében a fent ismertetett módon kiválasztjuk azokat a kiónokat, amelyek megfelelő orientációban tartalmaznak egyetlen Xho II betoldást.

ApR 16NS 1-et E. coliban klónozzuk és kifejezzük, és az R16NSl-et lényegében a fentiek szerint tisztítjuk, azzal az eltéréssel, hogy a forralást elhagyjuk.

Az R16NS1 szekvenciája az alábbi: N-Mct-Asp-Pro-[(Asn-Ala-Asn-Pro)i5-(Asn-Val-AspPro)i]_n-N227, ahol n értéke 1 és N227 az NS 1-ből származó 227 aminosavat jelenti.

A fenti módon előállított R16NS1 készítményben az R16NS1 a protein-tartalom több, mint 80%-ára becsülhető, a forralás vagy ioncserélős lépés nélkül. Az R16NS1 meglepően magas, közel 25%-át képezi az összes sejt-proteinnek.

6A. példa

R32NS1 .R48NS1 ésR64NSl polipeptid

Az R32NSl-et (amelynek szekvenciája az R16NS1ével azonos, és n értéke 2) lényegében a 3. példában leírtak szerint fejezzük ki E. coliban és tisztítjuk abból, a fonalas elhagyásával. Az R32NS1 az R16NSl-gyel közel azonos mértékben képződik, és tisztasága is közel azonos.

Az R48NSl-et (amelynek szekvenciája az R16NS1ével azonos, és n értéke 3), és az R64NS 1-et (n értéke 4 az R16NS1 képletében) lényegében a fentiek szerint eljárva állítjuk elő E. coliban. Az R48NS1 közel 10%-át, az R64NS1 közel 5%-át teszi ki az E. coli összes protein-tartalmának.

7. példa

NS1R48 polipeptid

A pR48tetg₆ plazmidot Bam Hl-vei hasítjuk és NDSpolimerázzal (Klenow) töltjük be a véget, lényegében a fent leírt módon. A plazmidot ezután Bán II-vei hasítjuk, a fent ismertetett módon, ily módon egy 672 bázispárból álló, 3 Xho fragmentumot hordozó fragmentum és 96 bázispár válik szabaddá a tetraciklin rezisztencia génből.

gg pASldeltaEH/801 plazmidot 20 egység Nco I-gyel hasítunk 200 gl nagy ionerősségű pufferben, 37 ’C-on 2 órán át, és a véget DNS-polimeráz nagy fragmentummal (Klenow) töltjük be, a fent ismertetett módon. Az NS 1-ben az Nco I hely a 81. aminosavnak megfelelő kodonban van. A plazmidot ezután Bán II-vel hasítjuk a fent ismertetett módon, ezáltal töröljük a megmaradt NS 1 kodonokat és a tetraciklin rezisztencia gén egy részét, és pASldeltaEH/801-1 plazmidot kapunk.

A 672 bázispárból álló Bam Hl (betöltött végű) Bán II fragmentumot a pASldcltaEH/801-1 plazmidba illesztve állítjuk elő a pNSlR48 plazmidot. A fenti plazmidot az előzőekben ismertetett módon fejezzük ki E. coliban. A kapott NS1R48 szekvenciája az alábbi:

N-81N-Asp-Pro-[(Asn-Ala-Asn-ProX₅-(Asn-Val-Asp-Pro)₁]_n.T32-C, ahol 81NazNSl N-tcrminális 81 aminosavját jelenti, n értéke 3, és T32 jelentése a fent megadott. Az NS1R48 az összes sejt-protein közel 5%-át képezi.

8. példa

R32N polipeptid gg pR32NSl plazmidot 25 egység Hind III-mal hasítunk, 200 gl puffer-közegben, 2 órán át, 37 °C-on, cs a véget DNS-polimcrázzal töltjük be, a fent ismertetett módon, pR32NSl-l plazmidot kapunk. A Hind III hely az NS1 kódoló régiójában az 5. aminosav-maradékot kódoló kodonban van. 100 ngpR32NSl-l-et ezután a fent ismertetett módon ligázzal zárunk. A kapott pR32N plazmid most egy TAA terminációs kodont tartalmaz az NS1 kódoló szekvencia 5. kodonjában. A pR32N plazmidot a fentiekben ismertetett módon használjuk az R32N polipeptid előállítására E. coliban.

Az R32N szekvenciája az alábbi: N-Met-Asp-Pro-[(Asn-Ala-Asn-Pro),5-(Asn-Val-Asp-Pro),]_n-N5-C, ahol n értéke 2 és N5 az NS 1 génből származó 5 aminosavat jelenti. Közelebbről, az N5 az alábbi szekvenciának felel meg:

-Asn-Thr-Val-Ser-Scr-C.

Az R32N az E. coli összes proteinjének közel 5%-át teszi ki.

9. példa

Antitest-válasz - ELISA

Az R16tet₃₂, R32tet₃₂ és R48tet₃₂ rekombináns proteineket a fentiek szerint tisztítjuk, 0,01 mol/1 koncentrációjú foszfáttal pufferolt sóoldattal (pH 7,0) szemben (PBS) dializáljuk, alikvotokra osztjuk és -80 ’C-on tároljuk. Az előállított proteineket PBS-sel, alumíniumhidroxiddal (alum) vagy komplett Freund-féle adjuvánssal (CFA) összekeverve 0,5 ml-es dózisokat készítünk, amelyek protein-tartalma 50 gg. A CFA-t (GIBCO, Grand Island, New York, USA) és antigént PBS-ben 1 : 1 arányban emulgeáljuk, 30 perces keveréssel, mechanikus keverőberendezésben. Az alumot gyógyszerkönyvi tisztaságú alumínium-hidroxid-gélből készítjük, PBS-sel végzett hígítással. Az antigént 4 ’C-on, 12 órán át rotációs keverőben keverve adszorbeáljuk az alumon. A szuszpenziót további 12 órán át ülepedni hagyjuk, majd a felülúszó megfelelő mennyiségét leöntjük, hogy 0,80 mg Al-t és 50 gg rekombináns proteint kapjunk dózisonként.

6-8 hetes C57B1/6 egereket (Jackson Laboratories, Bar Harbor, Maine, USA) (csoportonként 5 állatot) szubkután vagy intraperitoncális úton összesen 50 gg proteinnel immunizálunk. Az állatoknak az első immunizálás után 4 héttel ugyanezen módon újabb dózist adunk, azzal az eltéréssel, hogy azoknak az állatoknak, amelyek az immunogént CFA-ban kapták, az proteint nem-komplett Freund-féle adjuvánsban (IFA) emulgeálva adjuk. Egy hét elteltével a farok véreztetésével kapott teljes vért összegyűjtjük, 4 ’C-on megakasztjuk és centrifugálással elkülönítjük és a felhasználásig -80 ’C-on tároljuk a szérumokat.

Az egyes szérumok reakcióképességét egy 16 aminosavból álló szintetikus peptiddel szemben - amely a P. falciparum CS-protein négy ismétlődő egységének f(Asn-Ala-Asn-Pro)₄] felel meg - enzimhez kötött im7

-713

HU 201 682 Β mun-szorbens vizsgálattal (ELISA) vizsgáljuk, Dame cs munkatársai [Science 225, 593 (1984)] módszere szerint. A mikrotitrátor lemezek lyukainak bevonására marha-szérumalbuminhoz (BSA) kapcsolt szintetikus peptid antigént használunk. 50 μΐ (0,1 gg) 0,01 mól/1 koncentrációjú foszfáttal pufferolt sóoldattal (pH 7,0) (PBS) hígított vizsgálandó antigént pipettázunk a polísztirol mikrotitrátor lemezek (Immunion 2 Dynatech Laboratories, Alexandria, VA, USA) lyukaiba, és egy éjszakán át szobahőmérsékleten (kb. 22. ’C) tartjuk. A lyukak tartalmát ezután leszivatjuk, gátló pufferral (BB, amelynek összetétele: 1,0% BSA, 0,5% kazein, 0,005% timerszol és 0,0005% fenolvörös PBS-ben) töltjük fel és 1 órán át szobahőmérsékleten tartjuk. Az egérszérumot sorozathígításos módszerrel BB-vel hígítjuk, és minden egyes lyukba 50 μΐ-t mérünk belőle. A lemezeket szobahőmérsékleten 2 órán át inkubáljuk, majd a lyukakat leszivatjuk, háromszor mossuk PBS-0,05% Tween 20 (PBS-TW20) eleggyel és 50 μΐ, 10% hővel inaktivált emberi szérumot tartalmazó PBS-sel 1/500szorosára hígított kecske anti-egér IgG-vel konjugált torma-peroxidázt. (H+I) (Bio-Rad Laboratories, Richmond, CA, USA) mérünk az egyes lyukakba. Egy óra elteltével a lyukak tartalmát leszivatjuk, háromszor mossuk PBS-TW20-szal és 150 μΐ szubsztrátot [1 mg 2,2’-azino-di(3-etil-benztiazolin-6-szulfonsav)/l ml

O, 005% hidrogén-peroxidot tartalmazó 0,1 mól/1 koncentrációjú citrát-foszfát puffer, pH 4,0, a hidrogén-peroxidot közvetlenül felhasználás előtt adjuk a pufferhez] mérünk minden egyes lyukba. Egy óra elteltével 414 nm-cn meghatározzuk az abszorpciót, ELISA lemez-leolvasó (Titertek Multiskan, Flow Laboratories Inc., McLean, VA) segítségével.

Az R16tet_32> R32tet₃₂ és R48tet₃₂ polipeptidek mindegyike olyan antitest-termelést váltott ki, amely ELISA tesztben reakcióképes volt. Az R16tet₃₂, önmagában alkalmazva, kevésbé volt immunogén tulajdonságú, mint az R32tet₃₂ vagy az R48tet₃₂. Az alum és a CFA növelte mind a három találmány szerinti eljárással előállított protein immunogén tulajdonságát, és még 102 000-en felüli titer esetén is észlelhető antitest legalább egy vizsgálatban.

10. példa

Antitest-válasz - IFA

A 9. példa szerinti antiszérum vizsgálataink szerint erősen reagált autentikus P. falciparum CS-proteinnel, indirekt immunofluoreszcens antitest vizsgálatban (IFA). P. knowlesi, P. cynomologi, P. viva és P. gallinaceum elleni reaktivitást nem tapasztaltunk. Az R32tet₃₂vel szembeni antiszérum csekély reaktivitást mutatott P. berghei ellen. Ez az eredmény összhangban van Hockmeyerés munkatársai [Proc. 3d Int’l. Symp. Immunobioi. Proteins Peptides, szerk. Atassi, Μ. Z., Plenum New York (nyomdában)] azon megfigyelésével, miszerint a

P. falciparummal szembeni bizonyos Mab-ok reagálnak a P. berghei sporozoitokkal IFA vizsgálatban.

A sporozoitokat fertőzött moszkitók nyálmirigyéből preparáljuk, lényegében Bosworth [J. Párásítói. 61,769 (1975)] módszere szerint, sóoldattal vagy 0,5% BSA-t tartalmazó Médium 199-cel (GIBCO) hígítjuk, hemacitométert alkalmazva számoljuk és 2000-5000 sporozoit/10 μΐ értékre hígítjuk. 10 μΐ-es alikvotokat mérünk a többlyukú, nyomott IFA-lemez minden egyes lyukába, szobahőmérsékleten, levegővel szárítjuk és -80 ’C-on tároljuk.

Az IFA-vizsgálatot azzal kezdjük, hogy 20 μΐ térfogatú, BB-vel 1/100-szorosára hígított szérumot szélesztünk a szárított sporozoitokat tartalmazó IFA-lemez lyukaiba. Nedves kamrában, szobahőmérsékleten, 20 percen át végzett inkubálás után a szérumoldatokat leszivatjuk és a lyukakat 2 csepp PBS-sel mossuk. Az egyes lyukakba ezután 20 μΐ, BB-vel 1:40-szeresére hígított, fluoreszcein-izotiocianáthoz kapcsolt kecske anti-egér antitestet (Kirkegard és Perry, Gailhersburg, MD, USA) adunk. Szobahőmérsékleten 20 percen át tarló inkubálás után a lyukakat ismét kimossuk 2 csepp PBS-sel, glicerinben tárgylemezre helyezzük és UV-fényben 500-szoros nagyítással meghatározzuk a fluoreszcenciát.

11. példa

CSP-reakció

R16tet₃₂-vel, R32tet₃₂-vel és R48tet₃₂-vel immunizált egerekből származó szérumok erős CSP-pozitív reakciókat adnak, amint az az 1. táblázat adataiból látható. Adjuváns nélkül alkalmazva csak az R16tet₃₂-re nem termelődik olyan antitest, ami pozitív CSP-reakciót adna, míg CFA-val vagy alummal együtt adva mind a három találmány szerinti eljárással előállított protein olyan antitest-termelést indukál, amely erős CSP-reakciókat ad.

1. táblázat: R16tet₃₂, R32tet₃₂ és R48tet₃₂elleni antiszérum CSP-reaktivitása

Adjuváns	Antiszérum
R16tet32	R32tet32	R48tet32
0/25(-) CFA 23/25(4+) alum 25/25(4+)	17/25(2+) 21/25(4+) 25/25(4+)	21/25(4+) 21/25(4+) 16/27(2+-4+)

A CSP-reakciókat lényegében Vanderberg és munkatársai [Mii. Med. 134 (Supp. 1), 1183 (1969)] módszere szerint hajtjuk végre. 5 μΐ mintát, amely 500-1000 moszkitó nyálmirigyből származó P. falciparum sporozoitot tartalmaz Médium 199-ben újraszuszpendálva, mikroszkóp tárgylemezen 5 μΐ szérummal keverünk össze, vazelinnal szegélyezett zárólemezzel lefedjük és 37 ’C-on 1 órán át inkubáljuk. A reakciót fázis-kontraszt mikroszkóppal értékeljük ki, 400-szoros nagyítást alkalmazva. Minden egyes szérum-mintában 25 véletlenszerűen választott sporozoitot vizsgálunk meg, és feljegyezzük a CSP-pozitív organizmusok számát A CSPreaktivitás mértékét - Vanderberg és munkatársai fenti idézett módszere szerint meghatározva - zárójelben tüntetjük fel. A (-) érték azt jelenti, hogy nem észlelhető CSP-reaktivitás; (2+) szemcsés csapadék megjelenését jelenti a sporozoitok felületén; (4+) hosszú, fonalszerű filamcntum megjelenését jelzi a sporozoitok egyik végén. A normál egérszérum, vagy a csak CFA-val immunizált egérből származó szérum nem vált ki kimutatható mértékű CSP-reakciót, párhuzamos vizsgálatokban.

-815

HU 201 682 Β

12. példa

Ilepatocita-blokkolás

A 9. példa szerinti szérumokat in vitro invázió-gátlás szempontjából is megvizsgáljuk, az eredményeket a 2. táblázatban ismertetjük.

2. táblázat: P. falciparum sporozoitok HepG2 - A16 i hcpatoma sejtek elleni inváziójának gátlása

Adjuváns	Antiszérum
R16	R32	R48
	46	95	92
CFA	76	92	94
alum	100	100	96

Az eredmények szerint az R32tet₃₂ és R48tet₃₂ proteinek erősen blokkoló hatású antitestek képződését indukálják, még adjuváns nélkül is. Az R16tet₃₂ kevésbé hatásos erősen blokkoló hatású antitestek kiváltásában, csak alumhoz adszorbeálva fejt ki megfelelő hatást. A fenti eredmény összhangban van az R16tet₃₂-re termelt antiszérum esetén megfigyelt gyenge CSP-reaktivitással és alacsony ELISA-titcrekkel.

A sporozoit-invázió gátlásának vizsgálatát tenyésztett sejteken lényegében Hollingdale és munkatársai [J. Immunoi. 32, 909 (1984)] módszere szerint végezzük. Az R16tet₃₂-vel, R32tet₃₂-vel és R48tet₃₂vel immunizált egerekből nyert szérumot azon képessége szempontjából vizsgáljuk, hogy milyen mértékben tudja meggátolni A P. falciparum sporozoitok invázióját tenyésztett sejtek ellen. A szérumot a tápközeggel hígítjuk és 1 : 20-szoros végső hígításban (térfogat/térfogat) HepG2-A16 sejttenyészethez t(Am. J. Trop. Med. Hyg. 32,682-684 (1983)] adjuk. A tenyészetekhez ezután 12 000-40 000 moszkitó nyálmirigyből nyert P. falciparum sporozoitot adunk és 5% széndioxidot tartalmazó atmoszférában 37 ’Con 3 órán át inkubáljuk, Dulbecco-féle foszfáttal pufferolt sóoldattal (PBS) öblítjük, metanolban fixáljuk és PBS-sel kétszer öblítjük.

Azokat a sporozoitokat, amelyek bejutottak a sejtbe, immunperoxidáz antitest vizsgálattal (IPA) teszszük láthatóvá (Hollingdale és munkatársai fent idézett munkája szerint). Az IPA vizsgálatot úgy végezzük, hogy a fixált tenyészetet először P. falciparummal szembeni Mab-bal (2F1.1, lásd Dame és munkatársai fent idézett munkája) kezeljük, majd torma-peroxidázhoz kapcsolt nyúl anti-egér immun-globulinnal inkubáljuk és 3,3-diamino-benzidinnel megfestjük. A tenyésztett sejtekbe bejutott sporozoitok számát úgy határozzuk meg, hogy megszámoljuk a teljes preparátumban a sejten belüli parazitákat, Leitz mikroszkópot használva, 250-szeres nagyítás mellett, sötétkék színszűrővel. A vizsgálatokat vagy két, vagy három párhuzamos mintát vizsgálva hajtjuk végre, és minden egyes sejttenyészethez azonos számú sporozoitot adunk egy kísérletsorozaton belül. A gátlást a találmány szerinti polipeptidekkel szembeni immunszérum által kifejtett sporozoit-invázió%-os csökkentésével adjuk meg, normál egérszérum kontrollokhoz viszonyítva, ahol a CS-reaktív Mab 2F1.1 100%-os gátlást fejt ki a sporozoit-invázió ellen, 1/20-as hígításban.

A találmány szerinti eljárással előállított RLA, R16NS1 és R32NS1 rekombináns polipeptideket is hasonlóképpen vizsgáltuk, ELISA és IFA vizsgálatokkal, és azt tapasztaltuk, hogy azok hasonlóképpen olyan antitestet indukálnák, amely reagál a 16 aminosavból álló szintetikus polipeptiddel, és így pozitív CSP-reakciót adnak. Előnyösek az R32tet₃₂ és R32LA proteinek, viszonylagos homogenitásuk, képződési szintjük és könnyű előállításuk következtében.

A szintetikusan előállított vakcinák esetén elsődleges fontosságú, hogy a szintetikus immunogénnel szemben termelődő antitest felismeri-e az autentikus molekulát, és vajon az antitest rendelkezik-e a megfelelő védelem kialakításához szükséges biológiai tulajdonságokkal. Az immunflureszcencia vizsgálat és a CSP-reakció eredménye szerint az E. coliban termelt polipeptidekkel szemben képződő antitest reagál a sporozok felületével, és így felismeri az autentikus CS-proteint. Állatkísérletekben és emberben is kimutatták, hogy a CSP-antitest jelenléte jelentősen összefügg a proteklív immunitással. Az a tény, hogy a találmány szerinti eljárással előállított proteinek ellen termelődő antitestek gátolják a humán hepatoma sejtek sporozoitok általi invázióját in vitro, igen jelentős. Hollingdale és munkatársai (lásd fent idézett munkájuk) kimutatták, hogy mind a P. falciparum, mind a P. vivax elleni Mab-ok, valamint a fenti maláriafajok ellen immunis emberekből nyert poliklonális szérum is gátolják a sporozoit-inváziót. Ezért a sporozoitok invázió-gátlásának in vitro vizsgálata megfelelő vizsgálati módszert jelent a protektív antitestek kimutatására. A fent ismertetett vizsgálatok eredményei összességükben azt mutatják, hogy a találmány szerinti eljárással előállított vakcinát a humán gyógyászatban P. falciparum által okozott fertőzések elleni védelemre használhatjuk.

A találmány szerinti eljárással előállított rekombináns proteinek imm un-válasza Freund-féle komplett adjuvánssal vagy alummal egyaránt növelhető, amint azt ELISA-titerük, felületi reaktivitásuk (IFA és CSP) és sporozoit-inváziót gátló hatásuk vizsgálatakor megállapítottuk. A Freund-féle komplett adjuváns emberben nem használható, mivel lázat okoz, granulomákat vált ki és tuberkulin-túlérzékenységet eredményez. Az alumot jelenleg már bevezetett vakcinákban - például a diftéria és a tetanusz toxoid, valamint az egyik legújabb vakcina, a Hepatitis B esetén - is használják adjuvánsként. Hatékonysága és a humán gyógyászatban régóta tartó biztonságos használata bizonyított.

13. példa

Vakcina előállítása

A találmány szerinti eljárás értelmében például az alábbi módon készíthetünk vakcinát.

%-os vizes, pufferolt alumínium-hidroxid-oldathoz (10 mmól/1 nátrium-foszfát, 150 mmól/1 NaCl, pH 6,8; szűréssel sterilizálva) ugyanezen összetételű pufferben oldva adjuk keverés közben a találmány szerinti eljárással előállított polipeptidet, a pepiidre nézve 100 pg/ml, az AL³⁺-ra nézve 1,0 mg/ml végkoncentrációban. A pHt, 6,6 értéken tartjuk. Az elegyet egy éjszakán át 0 ’C körüli hőmérsékleten tartjuk. 0,005% végkoncentrációban timerszolt adunk hozzá. A pH-t ellenőrizzük, és szükséges esetben 6,8-ra állítjuk.

Noha a találmány szerinti eljárást a fentiekben részletesen ismertettük, beleértve az előnyös megoldásokat

-917

HU 201 682 Β is, nyilvánvaló, hogy a találmány oltalmi körét nem kívánjuk a fenti megoldásokra korlátozni, hanem az ismertetett megoldások összes módosításai is a találmány oltalmi körébe tartoznak.

Claims

SZABADALMI IGÉNYPONTOK

1. Eljárás az ember Plasmodium falciparum fertőzése ellen védő vakcina előállítására, azzal jellemezve, hogy Plasmodium falciparum CS-protein 16-112 Asn- Ala(VaI)-Asn(Asp)-Pro ismétlődő egységét - ahol az Asn-Ala-Asn-Pro ismétlődő egység az összes ismétlődő egység legalább 80%-át teszi ki - és kívánt esetben ehhez fuzionálva egy heterológ peptidet tartalmazó polipeptidet gyógyászatilag elfogadható hordozóanyaggal összekeverünk.
2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy polipeptidként a Rtet₃₂ polipeptidet, RNS 1 polipeptidet, NS1R polipeptidet, Rtet_M polipeptidet, RG polipeptidet, RLA polipeptidet vagy RN polipeptidet keverjük a hordozóanyaggal.

3. A 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy polipeptidként a

Rlőtetaj, R32G, R32tet_M, R48G, R48tet86, R64G, R16tet₃₂, R80G, R32tet₃₂, R112G, R48tet₃₂, R16LA, R64tet₃₂, R32LA, R80tet₃₂, R16NS1, R96tet₃₂, R32NS1, R112tet₃₂, R48NS1, R16G, R64NS1, vagy NS1R48, R32N

polipeptidet keverjük a hordozóanyaggal.

4. A 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy polipeptidként a R32tet₃₂ vagy R32LA polipeptidet keverjük a hordozóanyaggal.