HU200203B

HU200203B - Microbiological process for producing 1,2-dehydro-steroides

Info

Publication number: HU200203B
Application number: HU255686A
Authority: HU
Inventors: Karoly Albrecht; Tibor Lang; Eva Ilkoey; Tibor Balogh; Gyoergy Somogyi; Gyoergy Dobo; Gyula Horvath; Gabor Ambrus; Emilia Simonovits; Gabriella Kordik; Kalman Koenczoel; Tibor Kovats; Gabor Hantos; Antalne Jekkel
Original assignee: Gyogyszerkutato Intezet; Richter Gedeon Vegyeszet
Priority date: 1986-06-18
Filing date: 1986-06-18
Publication date: 1990-04-28
Also published as: HUT46366A

Abstract

A találmány tárgya eljárás 4,9(1 l)-androsztadién- < 3,17-dion; 3-oxo-23,24-dinor-4,9(ll)-koladién-22sav és 1-4 szénatomos alkilésztere; 3-oxo-2324-dinor-4,9(ll),17(20)-kolatrién-22-sav és 1-4 szénatomos alkilésztere,22-hidroxi-23,24-dinor-4,9(1 l)-koladién-3-on; 27-nor-4,9(ll)-kolasztadién-3,24-dion, valamint 26,27-dinor-4,9(l l)kolesztadién-3,24-dion 12-helyzetffdehidrogénezésére mikrobiológiai úton, amely abban áll, hogy a dehidrogénezést valamely 3οχο-ΔΙ dehidrogenáz aktivitással rendelkező Arthrobacter vagy Mycobacterium nemzetségbe taitozó baktériummal vagy Fusarium nemzetségbe tartozó gombával aerob körülmények között, valamely makropórusos polisztirol típusú abszorpciós gyanta jelenlétében végezik, és a kapott 1,4,9(1 l)-androsztadién3,17-diotít; 3-oxo-23,24-dinor-l,4,9(ll)-koladién22-savat és 1-4 szénatomos alkilésztaét; 3-oxo2324-dinor-l,4^(ll),17(20)-kolatrién-22-savat és 1-4 szénatomos alkilésztere, 22-hidioxi-23,24-dinor-l,4,9(ll)-koladién-3-ont; 27-nor-l,4,9(ll)-kolasztadién-3,24-diont, vagy 26,27-dinor1,4,9(1 l)kolesztadién-3,24-diont kívánt esetben a fermentléből elkülönítik. A leírás terjedelme: 9 oldal, ábra nélkül HU 200 203 B -1-

Description

A találmány tárgya eljárás természetes eredetű szterinek mikrobiológiai lebontási termékeiből előállított kólán — vagy androsztán vázas, 4,9(1 l)-dién3- on szerkezetű, szteroid szintézisintermedierék 1,2helyzetű dehidrogénezésére mikrobiológiai úton.

Az állati és növényi eredetű szterinek (koleszterin, β-szitoszterin, kampeszterin) a szteroid-ipar fontos kiindulási anyagai, belőlük mikrobiológiai eljárásokkal olcsón előállíthatók szteroidhormonok és gyógyszerek szintézisében hasznosítható intermedierek.

A szterincket szénforrásként hasznosító baktériumok a szteránvázat és az oldalláncot egyaránt lebontják. A szterin-oldalláncok lebomlásának mechanizmusát C. J. Sih és munkatársai derítették fel [J. Am. Chem. Soc. S2.1957 (1967), 1Q2,4718 (1982), 104.4720 (1982)]. Akoleszterinta baktériumoka 26os szénatomon hidroxilezik, majd e hidroxil-csoportot karbonsavvá oxidálják és ezt követően az oldalláncot β-oxidációs mechanizmussal három helyen elhasítják, először a C24-es és a C25-ÖS, majd a C22-CS és a C23-as, végül a Ci7-es és a C20-as szénatomok között. A C24-es szénatomnál elágazó láncú β-szitoszterin és kampeszterin oldalláncúnak lebontása abban lér el a koleszterinétől, hogy az oldalláncbontó baktérium a C28-as szénatomon karboxil-csoportot alakít ki, majd a C24 és a C25-ÖS szénatomok közötti lánchasítást követően, ugyancsak β-oxidációs mechanizmussal, a C24 és a C28-SS szénatomok közötti kötést is elhasítja.

A láncbontással párhuzamosan, a szteránvázon végbemenő enzimatikus átalakítások eredményeként, a 33-hidroxi-5-én szerkezetű szterinekből 9ahidroxi-l,4-dién-3-on szerkezetű szteroid-származékok keletkeznek, majd ezek spontán átrendeződnek ipari szempontból értéktelen 9,10-szekofenol-származékokká, melyek váza a B-gyűrűben felhasadt [RM Dobson és R. D. Muir: J. Am. Chem. Soc. 83. 4627 (1961), K. Schubert és munkatársai: Z. Naturforsch. 15h, 584 (1960)].

A szterin-oldalláncok ipari szempontból kívánatos szelektív lebontását először olyan módon érték el, hogy a vázlebomlást bevezető 9a-hidroxilezést enzim-inhibitorokkal szelektívan meggátolták és így a szterin-oldallánc lehasítása után 1,4-androsztadién3,17-dionhoz jutottak (3.338.042. sz. amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leirás, 153.173. sz. és 153.831. sz. magyar szabadalmi leírások).

E munkát követően W. J. Marscheck és munkatársai genetikai úton, ultraibolya besugárzással szterinbontó Mycobacteriumokból 9a-hidroxiláz -enzim hiányos mutánsokat készítettek, melyek a természetes szterincket l,4-androsztadién-3,17-dionná bontják le. Előállították olyan mutánsokat is, melyek sem 9ahidroxiláz, sem 3-oxo-szteroid-Al-dehidrogenáz enzimmel nem rendelkeztek, ez utóbbiak a szterinekből

4- androsztén-3,17-diont képeznek [Appl. Microbiol. 22,72(1972)].

M. G. Wovcha és munkatársai N-metil-N’-nitroN-nitrozo-guanidines mutagén kezeléssel szterinbontó Mycobacteriumokból olyan mutánsokat nyertek, melyek 3-oxo-szteroid-Al-dehidrogenáz enzimmel nem rendelkeznek és így a természetes szterinekből 9a-hidroxi-4-androsztén-3,17-diont, 9a-hidroxi3-0X0-23,24-dinor-4-kolén-22-savat, 9a-hidroxi-3oxo-23,24-dinor-4-kolén-22-sav-metilésztert, 9a2 hidroxi-3-oxo-2324-dinor-4,17(20)-koladiétt-22-savat, 9a-hidroxi-3-oxo-23,24-dinor-4,l 7(20)-koladién-22-sav-metilésztert, 9a-hidroxi-3-oxo-23,24-dinor-4,17(20)-koladién-22-aldehidet és 9a,22-dihidroxi-23j24-dinor-4-kolén-3-ont állítanak elő [Biochim. Biophys. Acta531.308 (1978)]. Ugyanez a kutatócsoport készített olyan mutánst is, mellyel β-szitoszterinból 9a-hidroxi-27-nor-4-kolesztén-3,24-dion, kampeszterinből 9a-hidroxi-26,26-dinor-4-kolesztén-324-dion állítható elő.

9a-hidroxi-4-androsztén-3,17-dionból kiindulva V. Van Rheenen és K. P. Shephard gazdaságos ipari szintézist dolgozott ki gyulladásgátló hidrokortizon szintézisére [J. Otg. Chem. 44,1582 (1979)]. A9ahidroxi-4-androsztén-3,17-dionból a hidroxil-csoport eliminációjával 4,9(ll)-androsztadién-3,17-diont állítottak elő. A kulcsintermedierből kiindulva nemcsak a kortikoid-oldallánc felépítése, hanem a 9(1 l)-es kettős kötés jelenléte folytán a gyulladásgátló kortikoszteroidokra jellemző Ιΐβ-hidroxil-csoport kialakítására is előnyös lehetőség nyílik. A szterin oldalláncok részleges mikrobiológiai lebontásával keletkező termékek, ezek közül is különösen előnyösen a 9a-hidroxi-3-oxo-23,24-dinor-kolán-származékok ugyancsak értékes kiindulási anyagok a kortikoszteroidok szintéziséhez (4.029.549. sz. amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás).

A gyógyászatban alkalmazott gyulladásgátló kortikoszteroidok rendszerint az 1-es pozícióban kettő skötést és igen gyakran 9a-helyzetben halogén atomot, előnyösen fluoratomot tartalmaznak, ilyen kortikoszteroid gyógyszerek szintéziséhez alapanyagul szolgálhatna a természetes szterinekből előállítható 1,4,9(1 l)-trién-3-on szerkezetű szteroid-származékok. Ezért kutatómunkánk során a temészetes szterinekből mikrobiológiai úton kapott ia-hidroxil-csoportot tartalmazó lebontási termékekből a 9a-hidroxil-csoport kihasításával 4,9(1 l)-dién-3-on szerkezetű származékokat állítottunk elő és mikrobiológuiai úton megkíséreltük e vegyületeket az 1,2-helyzetben dehidrogénezni.

Kísérleteink 9orán meglepő módon azt tapasztaltuk, hogy a természetes eredetű szterinek mikrobiológiai lebontási termékeiből előállított 9(1 l)-es kettős kötést tartalmazó kólán- vagy andosztán vázas szteroid-származékok, és ezek közül is különösen a 4,9(ll)-androsztadién-3,17-dion a 3-oxo-szteroidΔΙ-dehidrogenáz enzimmel rendelkező baktériumokkal és gombákkal nehezen dehidrogénezhetők, mert a belőlük képződő 1,4,9(1 l)-trién-3-on szerkezetű szteroid termékek gátolják az enzim működését

Ai. Kominek és munkatársai ugyancsak megállapították (33.22.120. sz. német szövetségi köztársaságbeli szabadalmi közrebocsátási irat), hogy a 4,9(1 l)-adrosztadién-3,17-dion Arthrobacter simplex-szel végzett fermentációval gyakorlatilag nem alakítható l,2,9(ll)-androsztatrién-3,17-dionná, az 13-helyzetű dehidrogénezés csak nagyon kis mértékben 2,6-10,4%-ban megy végbe. Levegővel vagy hővel történő szárítással előállított Arthrobacter simplex sejtkészítménnyel, elektronakceptor jelenlétében, dimetil-formamidot vagy előnyösen vízzel nem elegyedő szerves oldószert, például toluolt tartalmazó vizes közegben sikerült a 4,9(1 l)-androsztadién3,17-dion 1,2-helyzetű dehidrogénezését jó hozam-2HU 200203 Β mai elvégezniük. Eljárásuk a szokásos fermentációs eljárásnál bonyolultabb és költségesebb. A toluol jelenlétében végzett átalakítás, minthogy a reakcióelegybe oxigént is be kell vezetni, robbanásveszélyes is. (A leírás kiviteli példái csak androsztán és pregnán vázas szteroidok átalakítását szemléltetik.)

A127394. számú európai közrebocsátási irat szerzői különböző androsztán- illetve prengán-származékok mikrobiológiai úton végrehajtott 13-helyzetű dehidrogénezését ismertetik. Az átalakítást elektronakceptorok (mint például menadion, menadion-biszulfit, 1,4-naftokinon, fenazin-metoszulfát vagy Kvitamin típusú vegyületek), valamint a keletkező káros oxigén-féleségeket (mint például hidrogénperoxid, szuperoxid-anion hidroxil-gyök, oxigén-gyök) eltávolító illetve inaktiváló ún. scavangerek (kataláz, peroxidáz vagy szuperoxid-dizmutáz enzimek mannit, α-tokoferol vagy platina katalizátor) jelenlétében Arthrobacter simplex baktérium tenyészettel végzik. Az átalakítás során alkalmazott fenti adalékok az eljárás költségeit jelentős mértékben megnövelik.

A 190.784. számú magyar szabadalmi leírás eljárást ismertet különböző androsztán-, pregnán-, kolesztán- illetve sztigmasztán-vázas vagy kardenolid típusú szteroidok mikrobiológiai átalakításának intenzifikálására. Az átalakítások intenzifikálását a szerzők oly módon érik el, hogy α-, β- illetvey-ciklodextrin jelenlétében végzik a mikrobiológiai átalakítást A kiviteli példák a különböző típusú átalakítások között a hidrokortizon és a 17a-metil-tesztoszteron 13-helyzetű dehidrogénezését is ismertetik. Kolán-vázas vegyületek 13-helyzetú dehidrogénezésére a leírás semmiféle adatot nem tartalmaz.

A fentiek alapján a találmány célja olyan biztonságos és gazdaságos fermentációs eljárás biztosítása, amely lehetővé teszi androsztán és kólán-vázas veyületek 13-helyzetű dehidrogénezését s amelynél a mikrobiológiai átalakítást hátráltató termékgátlás nem lép fel.

E cél érdekében végzett kutatásaink során megfigyeltük, hogy a fermenüéhez adott makropórusos polisztirol-típusú adszorpciós gyanták elősegítik a 43(ll)-androsztadién-3,17-dion 13-helyzetű dehidrogénezését.

További kutató munkánk során természetes szterinek (koleszterin, β-szitoszterin, kampeszterin) oldalláncának részleges mikrobiológiai lebontásakor keletkező termékekből: a 9a-hidroxi-3-oxo-2334-dinor-4-kolén-22-savból, a 9a-hidroxi-27-nor-4-kolesztén-334-dionbóI és metilésztereikből, a 9a-hidroxi-27-nor-4-kolesztén-334-dionból és a 9a-2637nor-4-kolesztén-3,24-dionból 9(ll)-es kettős kötést tartalmazó származékokat készítettünk. A 9(1 l)-es kettős kötés savas dehidratálással alakítható ki, előnyösen például polifoszforsavat vagy klór-szulfonsavat használva eliminálószerkénL A 9a-hidroxilcsoportnak a fenti reagensekkel végzett lehasítása a szterin lebontási termékek többségénél közvetlenül jó hozammal elvégezhető. A 9a32-dihidroxi-2334dinor-4-kolén-3-on esetében azonban a 22-es hidroxil-csoportot meg kell védeni a 9a-hidroxil-csoport eliminációja előtt. Ez történhet oly módon, hogy a 9a,22-dihidroi-23,24-dinor-4-kolén-3-ont például piridines közegben ecetsavanhidriddel acetilezzük és a kapott 9a-hidroxi-22-acetoxi-2334-dinor-4-kolén4

3-ont vetjük alá dehidratálásnak. Az így készített 22acetoxi-2334-dinor-4,9(l l)-koladién-3-ont például kálium-hidroxiddal dezacetilezve juthatunk a22-hidroxi-2334-dinor4,9(ll)-koladién-3-onhoz.

A szterin lebontási termékekből előállított 9(11)dehidro-származékok közül a 3-oxo-23,24-dinor4,9(ll)-koIadién-22-sav és 1-4 széénatomos alkilészterei, a 3-oxo-2334-dinor-4,9(ll),17(21)-kolatrién-22-sav és 1-4 szénatomos alkilészterei, a 22-hidroxi-2334-dinor-4,9(ll)-koladién-3-on, a 27-nor4,9(ll)-kolesztadién-3,24-dion és a 2637-dinor4,9(1 l)-kolesztadién 334-dion 1,2-helyzctben történő mikrobiológiai dehidrogénezésére nem találtunk adatokat a szakirodalomban.

Kísérleteink során megállapítottuk, hogy e szteroid-származékok 3-oxo-szteroid-Ál-dehidrogenáz aktivitással rendelkező mikroorganizmusokkal, majkropórusos polisztirol típusú adszorpciós gyanták jelenlétében, előnyösen dehidrogénezhetők.

A fentiek alapján a találmány tárgya eljárás 4,9(1 l)-androsztadién-3,17-dion; 3-oxo-23,24-dinor-4,9(ll)-koladién-22-sav és 1-4 szénatomos alkilésztere; 3-oxo-2334-dinor-4,9(l l),17(20)-kolatrién-22-sav és 1-4 szénatomos alkilésztere; 22-hidroxi-23,24-dinor-4,9(ll)-koladién-3-on; 27-nor4,9(ll)-kolesztadién-334-dion, valamint 26,37-dinor4,9(ll)-kolesztadién-3,24-dion 13-helyzetű dehidrogénezésére mikrobiológiai úton, amely abban áll, hogy a dehidrogénezést valamely 3-oxo-Al-dehidrogenáz aktivitással rendelkező Arthrobacter vagy Mycobacterium nemzetségbe tartozó baktériummal vagy Fusarium nemzetségbe tartozó gombával aerob körülmények között valamely makropórusos polisztirol típusú adszorpciós gyanta jelenlétében végezzük, és a kapott 1,4,9(1 l)-androsztatrién-3,17-diont;

3-oxo-2334-dinor-l,4,9(ll)-kolatrién-22-savat és 1-4 szénatomos alkilészterét; 3-oxo-23,24-dinor1,4,9(1 l),17(20)-kolatetraén-22-savat és 1-4 szénatomos alkilészterét; 22-hidroxi-23,24-dinorl,4,9(ll)-kolatrién-3-ont; 27-nor-1,4,9(ll)-kolesztatrién-3,24-diont vagy 26,27-dinor-l,4,9(ll)-kolesztatrién-334-diont vagy 2637-dinor-l,4,9(ll)kolesztatrién-334-diont kívánt esetben a fermentléből elkülönítjük.

A találmány kivitelezéséhez bármely 3-oxo-szteroid-Al-dehidrogenáz aktivitással rendelkező mikroorganizmust alkalmazhatunk, előnyösen baktériumokat, például az Arthrobacter, Corynebacterium és Mycobacterium genusokba tartozó fajokat; vagy gombákat, pl. Fusarium-féleségeket.

A találmány szerinti eljárásban előnyösen alkalmazhatjuk például a Kertészeti és Élelmiszeripari Egyetemen a Mezőgazdasági és Ipari Mikroorganizmusok Nemzeti Gyűjteményében letétbe helyezett alábbi mikroorganizmusokat: Arthrobacter simplex [NCAI Β (P) 000066], Mycobacterium lacticola [NACAIM B(P) 000037], Mycobacterium smegmatis [NCAIM Β (P) 000038], Fusarium caucasicum [NCAIMF(P) 000090].

A mikroorganizmusok növesztését és az 13-helyzetű dehidrogénezést rázott tenyészetben [300/perc fordulatszámú, 8 cm kitérésű síkrázógépen], valamint ^mentorokban végezzük.

A tenyésztéshez használt táptalajok az átalakítást végző mikroorganizmustól függően változnak: el3

-3HU 200203 Β őnyösen alkalmazható nitrogén-forrásul a kukoricalekvár, az élesztőkivonat és az aszparagin; szén-forrásként pedig a glicerin és a glükóz. A táptalajok jellegzetes alkotórészei és alkálifém és az alkáliföldfém-foszfát, -nitrát és -szulfátsók, nyomelemként hasznosak a kobalt-, zink-, réz-, nikkel- és mangánsók.

Az 1,2-hely zetű dehidrogénezést végző baktérium törzseket célszerűen 37-37 ’C-on, a gombákat 25-30 ’C-on tenyésztjük.

Egyes 15-helyzetben dehidrogénező mikroorganizmusok esetében, például az Arthrobacter simplexnél, a 3-oxo-szteroid-Al-dehidrogenáz enzim mennyisége indukcióval jelentősen fokozható. A 3oxo-szteroid-Al-dehidrogenáz enzim képződését célszerűen 4-androsztén-3,17-dion jelenlétében végzett inkubálással váltjuk ki, de alkalmazhatunk induktorként bármely 3-oxo-4-én vagy 3-oxo-l,4-diénszerkezetű szteroidot is. Adehidrogénezést végeztethetjük az indukált törzsek tömény tenyészetével is, de előnyösebb a törzsek vízzel 10-20-szorosára hígított tenyészetét használni az átalakításhoz.

A találmány szerinti eljárás egy előnyös kiviteli módja szerint úgy járunk el, hogy makropórusos polisztirol típusú lipofil adszorpciós gyantákat (Amberliter polimer adszca-bensek, Rohm and Haas, GmbH, Frankfurt; Duolite adszorbens gyanták, Doulite International SA., Vitry-sur-Seine; Diaion adszorbens gyanták, Mitsubishi Co., Tokió) használunk az 1,2helyzetű dehidrogénezés folyamatának elősegítésére. Az adszorpciós gyantákat 1-31% mennyiségben célszerű adagolni a fermentléhez a szteroid átalakítás megkezdése előtt.

Az 15-helyzetben dehidrogénezett szteroid termékeket a fennentléből előnyösen klórozott szénhidrogénekkel, szerves észterekkel, vízzel nem elegyedő szerves ketonokkal és szerves alkoholokkal végzett extrakcióval különítjük el. A 23,24-dinor-kolánsav-származékok extrakciója előtt a fermentlét célszerű megsavanyítani a kivonás hatásfokának növelésére. Az extraktumok bepárlásával kapott nyerstermékeket átkristályosítással, szükség esetén kromatográfiás módszerekkel tisztíthatjuk.

A találmány szerinti eljárással előállított vegyületek szerkezetét infravörös, ’H-NMR és tömegspektroszkópiai módszerekkel igazoltuk.

A vékonyrétegkromatográfiás elválasztásoknak szilikagél adszorbenst [Kieselgel G (Reanal, Budapest) és Kieselgel 60 HF254+366 (Reanal, Budapest) 2:1 arányú keveréke] használunk.

A találmány szerinti eljárás kiindulási anyagául szolgáló 4,9(1 l)-dién-3-on szerkezetű szteroidok közül csupán a 4,9(1 l)-androsztadién-3,17-dion, továbbá a 27-nor-4,9(ll)kolesztadién-3,24-dion és a 26,27-dinor-4,9(l l)-kolesztadién-3,24-dion ismeretes az irodalomból. Az első vegyületet célszerűen a 189.351 sz. magyar szabadalmi leírás szerint, az utóbbiakat pedig J. C. Knight és M. G. Wovcha szerint [Steroids, 36.723 (1980)] állíthatjuk elő. Az új kiindulási vegyületek előállítását az egyes kiviteli példák kapcsán ismertetjük.

A találmány kivitelezését az alábbi példákkal szemléltetjük:

1. példa

Arthrobacter simplex [NCAIM B(000066] burgonyás-dextrózos ferdeagaron növesztett 1-2 hetes tenyészetéről 10 ml steril vízzel készített szuszpenzió 1 ml-ével 500 ml-es Erlenmeyer lombikban sterilezett 100 ml CS jelű táptalajt oltunk, melynek összetétele a következő:

kálium-dihidrogén-foszfát 4,4 g dinátrium-hidrogén-foszfát 8,8 g élesztőkivonat (szárazanyag) 10,0 g

1000 ml csapvízben.

A táptalaj pH-ját sterilezés előtt 7,0 értékre állítjuk. Atáptalaj sterilezését 121 ’C-on 25 percig végezzük.

A tenyészetet 2 napig növesztjük síkrázógépen, 37 ’C-on, majd 5-5 ml tenyészettel 5 db 500 ml-es Erlenmeyer lombikot oltunk, melyek 100-100ml KA12 jelű steril táptalajt tartalmaznak.

A KAS 12 jelű táptalaj összetétele a kövtkező:

kukoricalekvár (szárazanyag) 2,0 g aszparagin 1,0 g élesztőkivonat (szárazanyag) 0,2 g glükóz 5,0 g kálium-dihidrogén-foszfát 1,0 g nyomelem oldat* 10,0 ml

100 ml csapvízben.

. A táptalaj pH-ját sterilezés előtt 6,5-7,0 értékre állítjuk. A táptalaj sterilezését 121 ’C-on 25 percig végezzük.

* A nyomelem oldat összetétele: kalcium-klorid-víz(l:6) 1,0 g kobalt(IT)-nitrát-víz (1:6) 10,0 mg cink-szulfát-víz (1:7) 88,0 mg réz(II)-szulfát-víz (1:5) 3,9 mg nikkel-szulfát-víz(l:7) 1,0 mg nátrium-tetraborát-víz (1:10) 0,8 mg mangán(II)-klorid-víz(l:4) 0,72 mg ammónium-foszfor-molibdenát-víz(l:6) 0,37 mg vas(II)-szulfát-víz(l:7) 1,0 mg

1000 ml desztillált vízben.

A kapott tenyészeteket 37 ’C-on síkrázógépen egy napig rázatjuk, majd 1 ml acetonban oldott 10 mg 4androsztén-3,17-diont adunk mindegyik lombikba, és a rázatást 6 órán át folytatjuk. Ezután az inokulum tenyészeteket egyesítjük, és sterilen beadagoljuk 45 1 steril vízben 90 g Amberlite XAD-2 adszorpciós gyantát tartalmazó 10 literes laboratóriumi fermentorba. Ezután 75 ml tetrahidroíuránban oldott 6 g 4,9(1 l)-andiOsztadién-3,17-diont adunk a tenyészethez. Ezt követően 24 órán át végezzük a szteroidátalakítást 37 ’C-on, 500/perc fordulatszámú kevertetés közben, 180 liter/óra steril levegő átáramoltatása mellett Ezalatt a vékonyrétegkromatográfiás analízis szerint a 4,9(1 l)-androsztadién-3,17-dion teljesen átalakul l,4,9(ll)-andiosztadién-3,17-dionná. A kiindulási anyag és a tennék vékonyrétegkromatográfiás elválasztásánál n-hexán:etil-acetát (6:4) elegyet használunk kifejlesztőszerként.

A fermentáció befejezése után a fermentlevet először 15 1, majd 05 1 diklór-metánnal extraháljuk. Az egyesített diklór-metános extraktumot vízmentes nátrium-szulfáton szárítjuk, majd vákuumban bepároljuk. A kapott 5,75 g nyersterméket acetonból átkristályosítva 3,65 g tiszta l,4,9(ll)-androsztatrién3,17-diont kapunk.

-4HU 200203 Β

Op.: 164-167 ’C.

[cx]d= +102* (c= 1, kloroform).

Ultraibolya színkép (etanol): Ám» 238 nm (ε=

15900).

Infravörös színkép (KBr): vC=O 1730,1655 (17- 5 es és 3-as ketonok), vC=O 1620,1602 cm'¹ ’H-NMR spektrum: (CDCb 5): 73 (H-l), 6,2 (H2), 6,0 (H-4), AMXm (Ji^= 10Hz, J₂,4= 2Hz, J₂,₄- O Hz), 5,6 m (H-ll), 1,4 s (2H-19), 0,95 s (3H-18) ppm. 10

Tömegspektrum: Molekula-ion: 282.

Jellemző ionok (m/z): 282, 267, 249, 239, 225,

224.209.91.

Az átkistályosftási anyalúgot vákuumban bepároljuk, a bepáriási maradékot preparatív vékonyrétegk- 15 romatográfiás módszerrel—kifejlesztő oldószerként etil-acetáfn-hexán (1:1) elegyet használva—tisztítjuk. így további 1,18 g kromatográfiásan tiszta 1,4,9( 1 l)-androsztatrién-3,17-dionhoz jutunk.

2. példa

Az 1. példában leirt módon eljárva 4-androsztén3,17-dionnal indukált arthrobacter simplex [NCAIM B(P) 000066] tenyészetet készítünk. E tenyészet 1010 ml-ét sterilen 10 db 500 ml-es Erienmeyer lombik- 25 ba mérjük, és 90-90 ml 1,8-1,8 g Amberlite XAD-2 adszorpciós gyantát tartalmazó steril vízzel hígítjuk.

A kapott tenyészetekhez 2 ml etanolban oldott 100 mg 3-oxo-23,24-dinor-4,9(1 l)-koladién-22-savat adagolunk lombikonként. A tenyészeteket 37 *C-on, 30 síkrázógépen, két napig rázatjuk Ezután a tenyészeteket egyesítjük és a fermentlé pH-ját 2n kénsavval

2- es értácre állítjuk, majd háromszor 200 ml etil-acetáttal extraháljuk a fermentlét Az etil-acetátos extraktumokat egyesítjük, és vákuumban bepároljuk. A 35 kapott 1,05 g nyersterméket preparatív vékonyrétegkromatográfiás módszerrel tisztítjuk [kifejlesztőszer: benzobaceton (8:2) elegy]. Akapott720mg kromatográfiásan egységes terméket 20 ml metanolban oldjuk, majd az oldathoz 1 ml 10%-os metanolos só- 40 savat adun 0 ‘C-on. Ezután a megsavanyított oldatot

100 ml etil-acetáttal hígítjuk, kétszer 25 ml vízzel mossuk, májúd vákuumban bepároljuk. Az így kapott

3- oxo-23,24-dinQr-l,4,9(ll)-kolatrién-22-savat acetonből kristályosítjuk át 45

Op.: 220-225 ’C.

Ultraibolya színkép (etanol): Xmu 238 nm.

Infravörös színkép (KBr): v OH 3500-2500, vC=O 1705 (COOH), 1660 (3-as keton), vC=C 1620,

1600 cm'¹. 50 ’H-NMR spektrum: (CDCb δ: 7,4 (H-l), 6,2 (H2), 6,0 (H-4), AMXm (Ju=10Hz, J2,4= 2Hz, J2.4OHz), 5,5 m (H-ll), 1,4 s (3H-19), 1,15 d (3H-21),

0,7 s (3H-18) ppm.

TÖmegspektnim: Molekula-ion: 340. 55

Jellemző ionok (m/z): 340, 325, 323, 312, 174,

105.93.91.

A fermentáció kiindulási anyagául használt 3-oxo23,24-dinor-4,9(l l)-koladién-22-savat 9a-hidroxi3-oxo-23,24-dinor-4-kolén-22-savból például az 60 alábbi módon állíthatjuk elő:

g 9a-hidroxi-3-oxo-23,24-dinor-4-kolén-22-savat feloldunk 20 ml diklór-metánban, az oldathoz - 5 ‘C-on, keverés közben 1/2 ml klór-szulfonsavat csepegtetünk, majd az oldatot 30 percig ezen a hőmér- 65 sékleten kevertetjük. Ezután 25 ml vizet adagolunk a reakcióelegyhez keverés közben, majd a fázisokat szétválasztjuk. A vizes fázistkétszer 10 ml diklór-metánnal extraháljuk. Ezután a diklór-metános kivonatokat egyesítjük és vákuumban bepároljuk. A 2,05 g bepáriási maradékot preparatív vékonyrétegkromatográfiás módszenei [kifejlesztő elegy: benzol:aceton (8:2)] tisztítjuk. A kapott kromatográfiásan egységes temiéket 30 ml metanolban oldjuk és 2 ml 10%os metanolos sósavat adunk hozzá. Ezután a megsavanyított metanolos oldatot 120 ml etil-acetáttal hígítjuk, a nyert elegyet kétszer 25 ml vízzel mossuk, majd vákuumban bepároljuk. Az így kapott 13 g 3oxo-23,24-dinor-4,9(ll)-koladién-22-savat metanolból kristályosítjuk át

Op.: 225-230’C.

Ultraibolya színkép (etanol): λ«« 238 nm.

Infravörös színkép (KBr): vOH 3500-2400, vC=O 1720 (COOH), 1650 (3-as keton), vC=C 1610 cm'¹.

’H-NMR spektrum: (CDCb δ): 5,7 s (H-4), 5,5 m (H-ll), 1/2 d (3H-21), 135 s (3H-19), 0,7 s (3H-18) ppm.

TÖmegspektrum: Molekula-ion: 342.

Jellemző ionok (m/z): 342, 327, 300, 269, 176,

105,93,91.

3. példa

Az 1. példában leírt módon eljárva 4-androsztén3,17-dionnal indukált Arthrobacter simplex [NCAIM B(P) 000066] tenyészetet készítünk. E tenyészet 1010 ml-ét sterilen 10 db 500ml-es Erienmeyer lombikba méljük, és 90-90 ml 1Λ-13 g Amberlite XAD-2 gyantát tartalmazó steril vízzel hígítjuk A kapott tenyészetekhez 2 ml etanolban oldott 100 mg 3-oxo2334-dinor-4,9(ll),17(20)-kolatrién-22-savat adagolunk lombikonként A tenyészeteket síkrázógépen, 37 ’C-on, két napig rázatjuk Ezután a tenyészeteket egyesítjük és a fermentlé pH-ját 2 n kénsavval 2-es értékre állítjuk majd háromszor 200 ml etil-acetáttal extraháljuk a fermentlét Az etil-acetátos extraktumokat egyesítjük és vákuumban bepároljuk. A kapott 960mg nyersterméket preparatív vékonyrétegkromatográfiás módszard tisztítjuk [kifejlesztőszer benzohaceton (8:2) elegyben]. A 710 mg kromatográfiásan egységes terméket 20 ml metanolban oldjuk majd az oldathoz 1 ml 10%-os metanolos sósavat adunk 0 ‘C-on. Ezután a megsavanyított oldatot 100 ml etil-acetáttal hígítjuk, kétszer 25 ml vízzel mossuk majd vákuumban bepároljuk Az igy kapott 3oxo-2334-dinor-l,4,9(ll),17(20)-kolatetraén-22-savat metanolból kristályosítjuk át

Op.: 240-244 ’C.

Ultraibolya színkép (etanol): Xnux 235 nm.

Infravörös színkép (KBr): vOH 3600-2500, vC=O 1690 (COOH), 1665 (3-as keton), vC=C 1630, 1610 cm'¹.

‘H-NMR spektrum: (CDCb δ): 1/2 (H-l), 6,3 (H2), 6,1 (H-4), AMXm (Ju= 10Hz, J₂,4=2Hz, Ji,4~ 0Hz), 5,5 m (H-ll), 1,95 s (3H-21), 1,4 s (3H-19), 035 s (3H-18) ppm.

TÖmegspektrum: Molekula-ion: 338.

Jellemző ionok (m/z): 338, 323, 310, 211, 165,

145,121,91.

A fermentáció kiindulási anyagául használt 3-oxo-5HU 200203 Β

23.24- dinor-4,9(ll),17(20)-kolatrién-22-savat 9αhidroxi-3-oxo-2334-dinor-4,17(20)-koladién-22-sav bői például az alábbi módon állíthatjuk elő:

g 9a-hidroxi-3-oxo-2334-dinor-4,17(20)-koladién-22-savat feloldunk 20 ml diklór-metánban és az oldathoz -5 C-on, keverés közben 1(2 ml kíór-szulfonsavat csepegtetünk, majd az oldatot 30 percig a fenti hőmérsékleten kevertetjük. Ezután 25 ml vizet adagolunk a reakcióelegyhez keverés közben, majd a fázisokat szétválasztjuk, a vizes fázist kétszer 10 ml diklór-metánnal extraháljuk. Ezután a diklór-metános kivonatokat egyesítjük és vákuumban bepároljuk. A 2,05 g bepárlási maradékot preparatív vékonyrétegkromatogidfiával [kifejlesztöszen benzokaceton (8:2) elegy] tisztítjuk. A kapott kromatográfiásan egységes terméket 30 ml metanolban oldjuk és 2 ml 10%-os metanolos sósavat adunk hozzá, ezután a megasavanyított metanolos oldatot 120 ml etil-acetáttal hígítjuk és a nyert elegyet kétszer 25 ml vízzel mossuk, majd vákuumban bepároljuk. Az így kapott

1,6 g 3-oxo-2334-dinor-4,9(ll),17(20)-kolatrién22-savat metanolból kristályosítjuk áL

Op.: 238-239 ’C.

Ultraibolya színkép (etanol): Xmax 236 nm.

Infravörös színkép (KBr): vOH 3400-2400, vC=O 1675 (COOH és 3-as keton), vC=C 1610 cm¹.

Ή-NMR spektrum: (CDCb δ): 5,7 s (H-4), 55 m (H-ll), 2,0 s (3H-21), 13 s (3H-19), 0,9 s (3H-18) ppm.

Tömegspektrum: Molekulaion: 340.

Jellemző ionok (m/z): 340, 325, 307, 295, 227,

213,105,91.

4. példa

Az 1. példában leírt módon eljárva 4-androsztén3,17-dionnal indukált Arthrobacter simplex [NCAIM B(P) 000066] tenyészetet készítünk. E tenyészet 1010 ml-ét sterilen 5 db Erlenmeyer lombikba májük, és90-90 ml 1,8-1,8 g Amberlite XAD-2 gyantát tartalmazó steril vízzel hígítjuk. A kapott tenyészetekhez 2 ml etanolban oldott 100 mg 3-oxo-2334-dinor4,9(ll)-koladién-22-sav metilésztert adagolunk lombikonkénL A tenyészeteket 37 *C-on, síkrázógépen, két napig rázatjuk. Ezután a tenyészeteket egyesítjük, és a fermentlét kétszer 100 ml etil-acetáttal extraháljuk. Az etil-acetátos kivonatokat egyesítjük, vízmentes nátrium-szulfáton szárítjuk, majd vákuumban bepároljuk. A kapott nyersterméket preparatív vékonyrétegkromatográfiás módszerrel tisztítjuk [kifejlesztőszer: benzol:aceton (8:2) elegy]. így 370 mg kromatográfiásan egységes 3-oxo-23,24-dinorl,4,9(ll)-kolatrién-22-sav metilésztert kapunk.

Op.: 174-176 C.

Ultraibolya színkép (etanol): λη»« 238 nm.

Infravörös színkép (KBr): vC=O 1738 (észter), vC=O 1661 (3-as keton), vC=C 1626,1603 cm'¹.

Ή-NMR spektrum: (CDCb 5): 7,15 (H-l), 63 (H-2), 6,0 (H-4), AMXm (J^= 10Hz, J₂,4= 2Hz, Jl,4-OHz), 5,4 m (H-ll), 135 s (3H-19), 1,15 d (3H21),0,7s(3H-18)ppm.

TOmegspektrum: Molekula-ion: 354.

Jellemző ionok (m/z): 345,339,121,93,91,59.

Afermentáció kiindulási anyagául használt 3-oxo23.24- dinor-4,9(ll)-koladién-22-sav-metilésztert a

2. példában leüt módon készített 3-oxo-2334-dinor4,9(1 l)-koladién-22-savból diazometános észterezéssel állítottuk elő.

Op.: 194-200’C.

Ultraibolya színkép (etanol): Xmax 238 nm. infravörös színkép (KBr): vC=O 1735 (észter), vC=O 1670 (3-as keton), vC=C 1618 cm¹.

Ή-NMR spektrum: (CDCb δ): 5,7 s (H-4), 5,4 m (H-ll), 135 s (3H-19), 1,18 d (3H-21), 0,7 s (3H18) ppm.

5. példa

Az 1. példában leírt módon eljárva 4-androsztén3,17-dionnal indukált Arthrobacter simplex (MNG 66) tenyészetet készítünk. E tenyészet 10-10 ml-ét sterilen 5 db Erlenmeyer lombikba mérjük, és 90-90 ml 13-15 g Amberlite XAD-2 gyantát tartalmazó steril vízzel hígítjuk. A kapott tenyészetekhez 2 ml etanolban oldott 100 mg 3-oxo-23,24-dinor4,9(ll),17(20)-kolatrién-22-sav-metilésztert adagolunk lombikonkénL A tenyészeteket 37 ’C-on, síkrázógépen, két napig rázatjuk. Ezután a tenyészeteket egyesítjük, és a fermentlét kétszer 100 ml etil-acetáttal extraháljuk. Az etil-acetátos kivonatokategyesítés után vízmentes nátrium-szulfáton szárítjuk, majd vákuumban bepároljuk. A kapott nyersterméket preparatív vékonyrétegkromatográfiás módszerrel tisztítjuk [kifejlesztőszer benzol:aceton (8:2) elegy], így 405 mg kromatográfiásan egységes 3-oxo-2334-dinor-1,4,9(11), 17(20)-kolatetraén-22-sav-metilésztert kapunk.

Op.: 130’C.

Ultraibolya színkép (etanol): λ<η*χ 235 nm.

Infravörös színkép (KBr): vC=O 1710 (észter), 1670 (3-as keton), vC=C 1625,1605 cm'¹.

Ή-NMR spektrum: (CDCb 5): 73 (H-l), 63 (H2), 6,05 (H^t), AMXm (Ji^=10Hz, J2,4=2IIz, Jl,4~0Hz), 55 m (H-ll), 3,7 s (OCH3), 1,9 s (3H-21),

1,4 s (3H-19), 0,95 s (3H-18) ppm.

Tömegpsektrum: Molekula-ion: 352.

Jellemző ionok (m/z): 352, 337, 324, 321, 305, 293,211,147.

Afermentáció kiindulási anyagául használt 3-oxo2334-dinor-4,9(ll),17(20)-kolatrién-22-sav-metilész tért a 3. példában leírt módon készített 3-oxo-2334dinor-4,9(l 1); 17(20)-kolatrién-22-savból állítottuk elő diazometános észterezéssel.

Op.: 143 *C.

Ultraibolya színkép (etanol): Xmax 237 nm.

Infravörös színkép (KBr): vC=O 1705 (észter), vC=O 1670 (3-as keton), vC=C 1630,1610 cm'¹.

Ή-NMR spektrum: (CDCb δ): 5,7 s(H-4), 5,45 m (H-ll), 3,65 s (OCH3), 1,9 s (3H-21), 135 s (3H19) , 0,9 s (3H-18) ppm.

6. példa

Az 1. példában leírt módon eljárva 4-androsztén3,17-dionnal indukált Arthrobacter simplex tenyészetet készítünk. E tenyészet 10-10 ml-ét sterilen 10 db 500 ml-es Erlenmeyer lombikba mérjük, és 90-90ml

1,8-1,8 g Amberlite XAD-2 adszorpciós gyantát tartalmazó steril vízzel egészítjük ki. A kapott tenyészetekhez 2 ml etilalkoholban oldott 100 mg 22-hidroxi2334-dinor-4,9(ll)-koladién-3-ont adagolunk lombikonkénL a tenyészeteket 37 *C-on síkrázógépen 2

-6HU 200203 Β napig rázatjuk. Ezután a tenyészeteket egyesítjük és a fermentlevet háromszor 200 ml etil-acetáttal extraháljuk. Az etil-acetátos extraktumokat egyesítés után vákuumban bepároljuk, majd a nyersterméket vékonyrétegkromatográfiás módszerrel [kifejlesztőszer: n-heptán:etil-acetát (1:1) elegy] tisztítjuk. Az így nyert 750 mg 22-hidroxi-2324-dinor-l,4,9(11)kolatrién-3-ont metanolból kristályosítjuk át

Op.: 192-196 ’C.

Ultraibolya színkép (etanol): 239 nm.

Infravörös színkép (KBr): vOH 3439, vOO1666, vC=C 1622,1605 cm.

’H-NMR spektrum: (CDCb δ): 7,15 (H-l), 62 (H-2), 6,05 (H-4), AMXm (Jt^= 10Hz, J₂,4= 2Hz, Jl,4~0Hz), 5,45 m (H-ll), 3,45 ABXm (2H-22), 1,35 s (3H-19), 1,05 d (3H-21), 0,7 S (3H-18) ppm.

Tömegspektrum: Molekula-ion: 326.

Jellemző ionok (m/z): 326,121,107,105,93,91, 55,41.

A fermentáció kiindulási anyagául használt 22hidroxi-23,24-dinor4,9( 1 l>koladién-3-ont az alábbi módon állíthatjuk; elő:

g 9a,22-dihidroxi-2324-dinor-4-kolén-3-ont feloldunk 10 ml absz. piridinben majd hozzáadunk 3 ml ecetsavanhidridet Az elegyet 3 órán keresztül hagyjuk szobahőmérsékleten állni, majd 100 ml vízre öntjük és extraháljuk háromszor 50 ml etil-acetáttal. Az etil-acetátos extraktumot egyesítés után vákuumban bepároljuk. Az így nyert terméket Ketonból átkristályosítva 2,6 g 9a-hidroxi-22-acetoxi-2324dinor-4-kolén-3-onhoz jutunk.

Op.: 150-153 ’C.

Ultraibolya színkép (etanol): Xmn 242 nm.

Infravörös színkép (KBr): vOH 3481, \C=O 1734 (acetát), vC=O 1659 (3-as keton), vC-C 1620 cm .

Ή-NMR spektrum: (CDCb 5): S# s (H-4), 3,9 ABXm (2H-22), 2,1 s (3H-acttát), 155 s(3H-19), 1,05 d (3H-21), 0,78 s (3H-18) ppm.

g 9a-hidroxi-22-acetoxi-2324-dinor-4-koléft·

3-ont feloldunk 30 ml diklór-metánban és az oldatot -10 *C-ra hűtjük. Majd keverés közben 15 ml kltírszulfonsavat csepegtetünk az oldathoz és a keverést 30 percen át folytatjuk -10 ’C-on. Ezután 20 ml vizet adunk a reakcióelegyhez, majd a fázisokat szétválasztjuk. A vizes fázist kétszer 10 ml diklór-metánnal extraháljuk, a diklór-metánoe extraktumokat egyesítjük és vákuumban bepároljuk. Abepáriási maradékot vékonyrétegkromatográfiás módszerrel [kifejlesztőszer n-heptán:etil-acetát (6:4) elegy] tisztítjuk. A kromatográfiásan tiszta terméket metanolból kristályosítjuk át így 1,9 g 22-acetoxi-2324-dinor4,9(ll)-koladién-3-onho jutunk.

Op.: 89-91 ’C.

Ultraibolya színkép (etanol): λ™χ 238 nm.

Infravörös színkép (KBr): vC=O 1742 (acetát), vC=O 1659 (3-as keton), vC=C 1610 cm'¹.

Ή-NMR spektrum: (CDCb 8): 5,75 s (H-4), 5,45 m (H-ll), 3,9 ABXm (2H-22), 2,05 s (3H-acetát), 155 s (3H-19), 1,0 d (3H-21), 0,7 s (3H-18) ppm.

g 22-acetoxi-2324-dinor4^(ll)-koladién-3ont feloldunk 10 ml etilalkoholban és az oldathoz 5 ml 2 n etilalkoholos kálium-hidroxidot adunk. A reakcióelegyet 30 percig szobahőmérsékleten kevertetjíik, majd vákuumban epároljuk. Anyersterméket vékonyrétegkromatográfiás módszerrel (kifejlesztő12 szer. n-heptán:etil-acetát (6:4) elegy] tisztítjuk. A kromatográfiásan tiszta terméket metanolból kristályosítjuk át így 1,3 g 22-hidroxi-23,24-dinor4,9(1 l)-koladién-3-ont kapunk.

Op.: 160-165 ’C.

Ultraibolya színkép (etanol): λ«η»χ 236 nm. Infravörös színkép (KBr): vOH 3466, vC=O 1664 (3-as keton), vC=C 1614 cm'¹.

Ή-NMR spektrum: (CDCb 8): 5,7 s (H-4), 5,45 m(H-ll), 152s(3H-19), l,0d(3H-21),0,65s(3H18) ppm.

7. példa

Az 1. példában leírt módon eljárva 4-androsztén3,17-dionnal indukált Arthrobacter simplex tenyészetet készítünk. E tenyészet 10-10 ml-ét sterilen 10 db 500 ml-es Erlenmeyer lombikba mérjük, és 90-90 ml 15-1.8 g Amberlite XAD-2 adszorpció gyantát tartalmazó steril vízzel kiegészítjük. A kapott tenyészetekhez 2 ml etilalkoholban oldott 100 mg 27-nor4,9(ll)-kolesztadién-3,24-diont adagolunk lombikonként. A tenyészeteket 37 ’C-on sikrázógépen két napig rázatjuk. Ezután a tenyészeteket egyesítjük és a fermentlevet háromszor 200 ml etil-acetáttal extraháljuk. Az etil-acetátos extraktumokat egyesítés után vákuumban bepároljuk. Az igy kapott 12 g nyersterméket vékonyrétegkromatográfiás módszerrel [kifejlesztőszer. N-heptán:etil-acetát (1:1) elegy] tisztítjuk. A kromatográfiásan tiszta 27-nor-l,4,9(ll)-kolesztatrién-3,24-diont metanolból átkristályosítva 580 mg termékhez jutunk.

Op.: 118-120 ’C.

Ultraibolya színkép (etanol): Xoua 239 nm. Infravörös színkép (KBr): vC=O 1718 (24-es ket^n), vC=O 1657 (3-as keton), vC=C 1620,1600 cm' ' *H-NMR spektrum: (CDCb 8): 72 (H-l), 625 (H-2), 6.0 (H-4), AMXm (Ji^=10Hz, J2,4=2Hz, Jl,4~0Hz), 5,45 m (H-ll), 155 s (3H-19), 1,05 t (3H-26), 058 d (3H-21), 0,65 s (3H-18) ppm.

Tömegspektrum: Molekulaion: 380.

Jellemzó ionok (m/z): 380, 365, 265, 253, 225,

212,121,57.

8. példa

Az 1. példában leírt módon eljárva 4-androsztén3,17-dionnal indukált Arthrobacter simplex tenyészetet készítünk. E tenyészet 10-10 ml-ét sterilen 10 db 500ml-es Erlenmeyer lombikba mérjük, és 90-90 ml 15-1.8 g Amberlite XAD-2 adszorpció gyantát tartalmazó steril vízzel egészítjük ki. A kapott tenyészetekhez 2 ml etilalkoholban oldott 100 mg 2627-dinor42(ll)-kolesztadién-3,24-diontadagolun lombikonként. A tenyészeteket 37 ’C-on sfloúzógépen két napig rázatjuk. Ezután a tenyészeteket egyesítjük, és a fermentlevet háromszor 200 ml etil-acetáttal extraháljuk. Az etil-acetátos extraktumokat egyesítés után vákuumban bepároljuk. így 950 mg nyersterméket kapunk, melyet vékonyrétegkromatográfiás módszerrel [kifejlesztőszer: n-heptán:etil-acetát (1:1) elegy] tisztítunk. Akromtogiúfiásan egységes 2627dinor-l,4,9(ll)-kolesztatrién-324-diont metanolból átkristályosítva 620 mg termékhez jutunk

Op.: 130-132‘C.

Ultraibolya színkép (etanol): Xm«x 239 nm.

-7HU 200203 Β

Infravörös színkép (KBr): vC=O 1718 (24-es ketyn), vC=O 1661 (3-as keton), vC=C 1624,1603 cm* ' ’H-NMR spektrum: (CDCb δ): 7,15 (H-l), 62 (H-2), 6,0 (H-4), AMXm (Ju=10HZ; J2,4=2Hz, Jl.4~0ríz), 5,4 m (H-ll), 2,4 s (3H-25), 1,4 s (2H19), 0,88 d (3H-21), 0,7 s (3H-18) ppm.

Tömegspektrum: Molekulaion: 366.

Jellemző ionok (m/z): 366. 351. 349, 225, 212,

173,121,43.

9. példa

Mycobacterium lacticola [NCAIM B(P) 000037], illetve Mycobacterium smegmatis [NCAIM B(P) 000038] burgonyás-dextrózos ferdeagaron növesztett 1-2 hetes tenyészeteiről 10-10 ml steril vízzel készített sejtszuszpenziók 1-1 ml-ével 500 ml-es Erlenmeyer lombikokban sterilezett 100-100 ml MFG jelű táptalajt oltunk, melynek összetétele a következő, kukoricalekvár (szárazanyag) 15,0 g glicerin 10,0 g

100 ml csapvízben.

A táptalaj pH-ja sterilezés előtt 6,5. A táptalaj sterilezését 121 *C-on, 25 percig végezzük.

Az inokulum tenyészeteket 37 ’C-on, két napig növesztjük síkrázógépen, majd a tenyészetek 5-5 miével beoltunk 500 ml-es Erlenmeyer lombikokban sterilezett 100-100 ml MKA2 jelű táptalajt, melynek összetétele a következő

aszparagin	1,0 g
kálium-dihidrogén-foszfát	1,0 g
glicerin	5,0 g
kukoricalekvár (szárazanyag)	10,0 g
az 1. példában megadott
nyomelem oldat	1,0 ml
1000 ml csapvízben.

A táptalaj pH-ja sterilezés előtt 6,3. A táptalaj sterilezését 121 *C-on, 25 percig végezzük.

A tenyészeteket 37 ’C-on, síkrázógépen két napig rázatjuk, majd mindkét lombikba 1,8 g Amberlite XAD-2 adszorpciós gyantát és 12 ml tetrahidrofuránban oldott 100 mg 4,9(ll)-androsztadién-3,17-diont adagolunk. Ezután a tenyészetek rázatását három napon át folytatjuk, majd a tenyészetben keletkezett 1,4,9( 11 )-androsztatrién-3,17-dion mennyiségét kvantitatív vékonyrétegkromatográfiás módszerrel meghatározzuk. Kifejlesztőszerként n-heptán:etilacetát (4:6) elegyet alkalmazunk. A kromatográfiás elválasztás után a rétegről leoldott tennék mennyiségét ultraibolya spektrofotometriás módszerrel állapítjuk meg. A mycobacterium lacticola tenyészetben 65 mg, a Mycobacterium smegmatis tenyészetben 48 mg, l,4,9(ll)-androsziatrién-3,17-dion keletkezett.

HLpélda

A Fusarium caucasicum [NCAIM F(P) 00009] burgonyás ferdeagaron növesztett 1-2 hetes tenyészetéről 10 ml steril vízzel készített sejtszuszpenzió 1 ml-ével 500 ml-es Erlenmeyer lombikban sterilezett 100 ml Richard táptalajt oltunk, melynek összetétele a következő:

glükóz 50,0 g kálium-dihidrogén-foszfát 0,5 g magnézium-szulfát-víz (1:7) 2,5 g kálium-nitrát 1,0 g ammónium-nitrát 10,0 g

1000 ml csapvízben.

A táptalaj pH-ja sterilezés előtt 5,0. A táptalajt 121 *C-on, 25 percig sterilezzük.

Az inokulum tenyészetet 28 ’C-on, egy napig nfvesztjük síkrázógépen rázatva, majd a tenyészet 5 miével beoltunk 500 ml-es Erlenmeyer lombikban sterilezett 100 ml F-jelű táptalajt, melynek összetétele a következő:

glükóz 0,5 g pepton 15,0 g kukoricáiéivá (szárazanyag) 6,0 g

1000 ml csapvfzben.

A táptalaj pH-ját sterilezés előtt 6,9-rc állítjuk. A táptalaj sterilezését 121 ’C-on 25 percig végezzük.

A tenyészetet 28 ’C-on, süaázógépai, egy napig rázatjuk. Ezután a tenyészet 10 ml-ét sterilen 500 mles Erlenmeyer lombikba mérjük, és 90 ml 1,8 g Amberlite XAD-2 adszorpciós gyantát tartalmazó steril vizet, majd 12 ml tetrahidrofuránban oldott 100 mg 4,9(ll)-androsztadién-3,17-diont adagolunk hozzá. Két napi rázatás után a tenyészetben 72 mg 1,42(11)androsztatrién-3,17-dion-keletkezik a 9. példában leüt vékonyrétegkromatográfiás meghatározás szerint

Claims

SZABADALMI IGÉNYPONTOK

1. Eljárás 4,9(1 l)-androsztadién-3,17-dion; 3oxo-23,24-dinor-4,9(ll)-koladién-22-sav és 1-4 szénatomos alkilésztere; 3-oxo-23,24-dinor4,9(11), 17(20)-kolatrién-22-sav és 1-4 szénatomos alkilésztere, 22-hidroxi-23,24-dinor-4,9(ll)-koladién-3-on; 27-nor-4,9(ll)-kolasztadién-3,24-dion, valamint 2627-dinor-4,9(ll)kolesztadién-324-dion 12-helyzetű dehidrogénezésére mikrobiológiai úton, azzal jellemezve, hogy a dehidrogénezést valamely 3οχο-ΔΙ dehidrogenáz aktivitással rendelkező Arthrobacter vagy Mycobacterium nemzetségbe tartozó baktériummal vagy Fusarium nemzetségbe tartozó gombával aerob körülmények között, valamely makropórusos poliszáról típusú abszorpciós gyanta jelenlétében végezik, és a kapott 1,42(1 l)-androsztadién3,17-diont; 3-oxo-23,24-dinor-l,4,9(ll)-koladién22-savat és 1-4 szénatomos alkilészterét; 3-oxo2324-dinor-1,4,9(11), 17(20)-kolatrién-22-savat és 1-4 szénatomos alkilésztere, 22-hidroxi-2324-dinor-l,42(ll)-koladién-3-ont; 27-nor-l,42(ll)-kolasztadién-324-diont, vagy2627-dinor-l,4,9(ll)kolesztadién-324-diont kívánt esetben a fermentléből elkülönítjük.
2. Az 1. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy a milőobiológiai átalakítást Arthrobacter simplex (NCAIM B(P) 000066] tenyészettel végezzük.
3. Az 1. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy a mikrobiológiai átalakítást Mycobacterium lacticola [NCAIM B(P) 000037] tenyészettel végezzük.
4. Az 1. igénypont szerinti eljárás αζζαί jellemezve, hogy a mikrobiológiai átalakítást Microbacterium smegmatis [NCAIM B(P) 000038] tenyészettel végezzük.
5. Az 1. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy a mikrobiológiai átalakítást Fusarium caucasicum [NCAIM B(F) 000090] tenyészettel végez-8HU 200203 Β

15 16 zük. tást megelőzően a mikroorganizmus tenyészeteket 4- 6. Az 1-5. igénypontok bármelyike szerinti eljá- androsztén-3,17-dionnal indukáljuk. rás, azzaljellemezve, hogy a mikrobiológiai átalakí- 5 7