HU205147B

HU205147B - Process for producing muramyl dipeptide derivative and pharmaceutical compostions comprising same

Info

Publication number: HU205147B
Application number: HU903880A
Authority: HU
Inventors: Louis Chedid; Peter Dukor; Pierre Lefrancier; Peter Stuetz
Original assignee: Sandoz Ag
Priority date: 1989-06-29
Filing date: 1990-06-15
Publication date: 1992-03-30
Also published as: DE69023559D1; AU5787590A; MY105727A; FI903232A0; EP0406175A2; IE902345L; ATE130313T1; PT94517A; JPH0737479B2; ES2079464T3; PL285842A1; IL94885A; US5210072A; FI903232A7; HU903880D0; HUT54180A; KR910000775A; NZ234270A; EP0406175B1; IL94885A0

Description

A találmány tárgya eljárás az © képletű, új 3-0-[Nacetil-muramil-treonil-D-izogIutaniínil]-l,2-di-O-p lamitoil-sn-glicerm-származék és ezt tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására. E származékban a csillaggal (*) jelölt szénatom - a továbbiakbanRöviden „C*” - R, illetve S konfigurációjú. Az említett származékot a továbbiakban röviden „találmány szerinti eljárással eló'állított vegyületnek” nevezzük.

Amikor a C* R konfigurációjú, a megfelelő aminosav-gyök azL-treonil; amikor pedig S konfigurációjú, az aminosav-gyök az L-alIo-treonil. A találmány szerinti eljárással előállított vegyületben előnyösen a C* R konfigurációjú. Amint az © képlet alapján látható, avegyületnekkétanomerformájavan.

Hasonló szerkezetű és hasonló immunomodulátor hatású vegyűleteket ismertet például az EP 165123 számú európai szabadalmi leírás; ezen leírás 4. oldalán látható képlet körébe tartozik a találmány szerinti eljárással előállított vegyület. Atalálmány szerinti eljárással előállítottvegyiiletet azonban kifejezetten sehol nem tárgyalják és előállítását nem ismertetik. A találmány szerinti eljárással előállított vegyületnek váratlanul előnyösebb tulajdonságai vannak, mint a szakterületen általában alkalmazott ismert vegyületeknek.

A találmány szerinti eljárással előállított vegyületet nevezhetjük L-treoníl-MDP-GDP-nek, illetve Lallo-treonil-MDP-GDP-nekis.

A találmány szerinti eljárással az © képletű vegyületet úgy állítjuk elő, hogy egy megfelelő (Π) általános képletű vegyület védőcsoportjait eltávolítjuk. A (© általános képletű vegyületben A C* esetében a fenti meghatározás érvényes, azRj, R₂, R₃, R₄ pedig - egymástól függetlenül - szokásos hidroxi-védőcsoportot jelent.

A találmány szerinti eljárás végezhető hagyományos módon, a hidroxi-védőcsoportok lehasítása céljából. A kiindulási anyag lehet az a- vagy a β-glükozid anomer, illetve ezek valamilyen keveréke. A védőcsoportok lehasítását végezhetjük egy vagy több reakciólépésben. Az © képlet szerinti vegyületet általában a két anomer forma keverékeként nyerjük. Ezen anomerek szükség esetén hagyományos eljárások segítségével szétválaszthatok. Az eljárás végezhető például redukálással, előnyösen hidrogén segítségével, palládium-szén katalizátorral, oldószerként például ecetsavat alkalmazva. Felhasználható bármilyen hagyományos, hidrogénezésre alkalmas hidroxi-védőcsoport, például benzil-oxi-karbonil- vagy benzilcsoport. Az R, és az R₂ együtt is alkothatnak közös védőcsoportot, amilyen példul abenzilidén. Avédőcsoport-lehasítás végezhető például savas körülmények között is. A savas körülmények között végzett védőcsoportlehasítás esetében például a terc-butoxi-karbonil (BOC) tekinthető előnyös védőcsoportnak.

A kiindulási anyagok is előállíthatók hagyományos eljárások segítségével, például az [A] reakciósémának megfelelően.

Az [A] reakciósémának a C*, továbbá azR_}, R₂, R₃ésR₄afenti definícióknakfelelmeg, az

R’ valamilyen amino-védőcsoport, az

-COX valamilyen aktiváltkarboxilcsoport,

BOP benztirazol-l-il-oxi-trisz-(dimetil-amino)foszfónium-hexafluoro-foszfát és a BOC tér t-butoxi-karbonil-csoport.

Az R’ lehasítását előnyösen savas körülmények között végezzük. Az R’ előnyösen henzil-oxi-karbonilcsoport. Az X előnyösen -OC(=O)O-alkil, például OC(=O)-OCH₂CH(CH₃)₂.

Atovábbiakban a találmány szerinti eljárás előnyös foganatosítási módjait példáink segítségével szemléltetjük. A hőmérséklet-értékek minden esetben Celsíus-fokban vannak megadva. Az alkalmazot(rövidítésék jelentését az alábbiakban ismertetjük;

BOC=terc-butoxi-karbonil-csoport

Bzl=benzil-csoport alIoThr=L-aIlo-treonil Thr=L-treonil

Z-D-iGIn=benziI-oxi-karbonil-D-izoglutamm

Pd/C=palládium-szén tBDMS=terc-butil-dimetil-szilil-csoport

7. példa

3-0-[N-Acetil-miraml-L-treonil-D-izoglutami nil]-l,2-di-0-palmitoil-sn-glicerin (C*R konfigurációjú)

120 mg 3-0-[l-a-0-benzil-4,6-0-benziIidén-N-acetil-muramil-O-benziI-L-treonil-D-izoglutaminilj-1,2 -di-O-palmitoil-sn-glicerint feloldunk 20 ml 100%-os ecetsavban, és hozzáadunk egy előzetesen hidrogénezett katalizátort (90 mg 10%-os Pd/C és 15 mg palládium-kloríd (PdCl₂) 20 ml 100%-os ecetsavban oldva, 45 percen keresztül hidrogénezve). A keveréket ezután két órán keresztül keverjük hidrogénatmoszférában, ezt követően a katalizátort kiszűrjük, az oldatot bepároljuk, majd toluollal még háromszor bepárolva megszárítjuk. A maradékot ezután szilikagélen kromatografáljuk eluensként 4:1:1 arányú diklór-metán/metanol/diizopropil-éter felhasználásával. Az ily módon kapott terméket Sephadex LH-20 osriopon kromatografáljuk eluensként 1:1 arányú diklór-metán/metanol alkalmazásával. Ezt követően az oldatot szárazra bepároljuk, majd az ecetsavtól liofilizáljuk. Ilymódon a címben szereplő vegyületet (mindkét anomer keverékét) nyerjük. Kitermelés: 70-75%.

/H-NMR: 0.90(t,J=7,6H); 1.22(dJ=7,3H);

1.25(,48©; 1.41(dJ~7,3©; 1.64(m,4H); 2.00(m,3©; . 2.22(m,lH); 2.34(m,4H); 2.48(m,2H), 3.403.98(m,6H); 4.12-4.60(m,8H); 5.20(dJ«3,lH); 5.26(m,lH).

A kiindulási anyagot az alábbiakban megfelelően állítjuk elő:

a) 740 mg Z-D-iGln-t feloldunk száraz dímetil-formamid és tetrahidrofurán 1:1 arányú keverékének 6 ml-nyi mennyiségében, és sötét környezetben reagáltatjuk 1,46 g benzitriazol-l-il-oxi-trisz-(dimetÍI-ammo)-foszfónium-hexafluoro-foszfáttal és 365 pl N-metil-morfolinnal. Harminc perc múlva 1,14 g l,2-diplamitoil-sn-glicerint és 270 mg imidazolt adunkhozzá, majdareakciókeveréket 4 napon keresztül tovább keverjük sötét környezetben.

Az oldószerkeverék bepárlását kővetően a kapott maradékot szilikagélen kromatografáljuk, eluensként 20:1 arányú diklór-metán/metanol felhasználásával. Ily módon 3-0-[(benzil-oxi-karbonil)-DÍzoglutaminil]-l,2-di-0-palmitoíl-sn~glicerint kapunk. Kitermelés: 90-95%.

‘H-NMR: 0,89(t,J=7,6H); 1.28(s,48H); 1.62(m,4H); 1.95(m,lH); 2.15(m,lH); 2.34(m,4H); 2.46(m,2H); 4.25(m,5H); 5.12(s,2H); 5.27(m,lH); 7.35(s,5H).

b) 400 mg a) pont szerint előállított vegyületet 20 ml

100%-os ecetsavban feloldunk, majd 40 mg 10%os Pd/C-vel reagáltatjuk. Ezt követően a keveréket két órán keresztül hidrogénatmoszférában keverjük, a katalizátort kiszűrjük, majd a bepárlási maradékot toluol segítségével háromszor bepárolva ecetsavmentesítjük. Ezután a maradékot 8 ml diklór-metánban oldjuk fel, és 60 μΐ metil-morfolint adunk hozzá (=A pldat).

160 mg BOC-Thr(Bzl)-OH-t oldunk fel 8 ml diklórmetán, 233 μΐ N-metil-morfolin és 73 μΐ klór-hangya sav-ízobutil-észter keverékében, melyet ezután szobahőmérsékleten 45 percen keresztül keverünk (= B oldat).

Ezt követően a B oldatot +4°-os hőmérsékletre hűtjük le, majd hozzáadjuk az A oldatot. A keveréket 18 őrán keresztül szobahőmérsékleten keverjük, az oldószert bepároljuk, eluensként 100:1 és 100:3 közötti arányú diklór-metán/metanol felhasználásával.

Ily módon 3-0-[(terc-butoxi-karbonil)-0-benzil-Ltreonil-D-izogíutaminÍI]-l,2-di-0-plamitoil-sn-glice rint kapunk. Kitermelés 50-55%.

‘H-NMR: 0.88(t,J=7,6H); 1.26(s,48H); 1.47(s,9H); 1.60(m,4H); 1.94(m,lH); 2.14-2.58(m,7H); 4.104.34(m,6H); 4.45(m,2H); 4.60(d,2H); 5.15(m,lH), 5.23(m,lH); 5.40(m,lH); 6.35(m,lH); 7.13(m,lH); 7,30(m,5H).

c) 580 mg b) pont szerint előállított vegyületet reagáltatunk +4° hőmérsékleten 20 ml trifluor-ecetsavval, majd a keveréket 30 percen keresztül keverjük. Ezt követően az oldatot bepároljuk, és toluol segítségével kétszer bepárolva szárítjuk. Ezután a maradékot 10 ml diklór-metánnal és 65 μΐ N-metil-morfolinnal reagáltatjuk (= A oldat).

278 mg a-0-benzil-4,6-benzilidén-N-acetil-muraminsavat feloldunk 10 ml diklór-metán, 259 μΐ N-metil-morfolin és 81 μΐ klór-hangyasav-izobutil-észter keverékében, majd az oldatot 35 percen keresztül szobahőmérsékleten keverjük (= B oldat).

Ezt kővetően a B oldathoz cseppenként hozzáadjuk az A oldatot +4° hőmérsékleten, majd a keveréket további két napig szobahőmérsékleten állni hagyjuk. Az oldószer bepárlását követően a maradékot szilikagélen kromatografáljuk eluensként 100:1 és 10:1 közötti arányú diklór-metán=metanol elegy felhasználásával.

Ily módon a 3-0-[l-c£-0-benzil-4,6-0-benzilidén-Nacetil-muramil-O-benzil-L-treonil-D-izoglutaminil] -1,2-di-O-palmitoÍl-sn-glicerint kapunk. Kitermelés 90-95%.

‘H-NMR: 0.88(t,J=7,6H); 1.22(d,J=7,3H);

1.37(dJ-7,3H); 1.60(m,4H); 1.98(s,3H); 2.02(m,lH);

2.30(m,4H); 2.44(m,4H); 3.66-3.94(m,4H); 4.064.46(m,10H); 4.90(d,J=4,lH); 5,25(m,lH); 5.60(s,lH); 76.78(d,lH); 7.10(d,lH); 7.40(m,10H); 7.60(d,lH).

2. példa

3-0-[N-Acetil-muramil-L-allo-treonil-D-izogl utaminil]-l,2-di-0-plamitoil-sn-glicerm (C* S konfigurációjú)

A címben ismertetett vegyületet az i. példában leírtakkal azonos módon állítjuk elő, a megfelelő L-allotroenil-vegyületből kiindulva:

‘H-NMR: 0.88(t,J«7,6H); 1.25(s,48H);

1.40(d,J=7,3H); 1.64(m,4H), 2.00(m,3H); 2.24(m,lH); 2.35(m,4H); 2.48(m,2H); 3.40-3.98(m,6H); 4.104.60(m,8H);5.23(d,J=3,lH);5.26(m,lH).

Kitermelés 70-75%.

A kiindulási anyagként használt L-allo-treonil-vegyületet az alábbiak szerint állítjuk elő:

a) 3-0-[(benzíl-oxi-karbonil)-D-izoglütaminil]-l ,2di-O-paimitoil-sn-glicerint állítunk elő az 1. példa a) lépésében leírtaknak megfelelően;

b) 3-0-[(benzíl-oxi-karbonil)-0-(terc-butil-dimetíl-s zilil)-L-allo-treonil-D-izoglutammil]-l,2-di-0palmitoil-sn-glicerint állítunk elő az 1. példa b) lépésében leírtaknak megfelelően, azzal a különbséggel, hogy Bzl-allo-Thr(tBDMS)-OH-t használunk BOC-Thr(Bzl)-OH helyett:

‘H-NMR: 0.02(s,3H); 0.04(s,3H); 0.93(m,15H);

1.16(d,J=7,3H); l,25(m,48H); l,67(m,4H);

l,90(m,lH); 2,07(m,lH); 2.28(m,4H); 2.42(m,2H); 4.03-4.40(m,7H); 5.08(m,2H); 5.13(m,lH);

7.30(m,5H);7.46(d,lH),

c) 3-0-[l-a -0-benzil-4,6-0-benzilidén-N-acetil-muramU-0-(terc-butíl-dimetil-szilíl)-L-allo-treonÍl -D-izoglutaminil]-l,2-di-0-palmitoil-sn-glicerint állítunk elő az 1. példa c) lépésében leírtaknak megfelelően:

‘H-NMR: 0.08(s,3H); 0.10(s,3H); 0.88(m,15H);

1.17(d,J-7,3H); 1.25(m,48H); 1.37(d,J-7,3H);

1.64(m,4H); 1.95(m,lH); 1.97(s,3H), 2.13(m,lH), 2.34(m,4H); 2.46(m,2H); 3.65(m,4H); 3.984.40(m,10H); 4.66(ddJ-13.40,lH); 5.15(dJ-3,lH); 5,25(m,lH); 5.60(s,lH); 7.25-7.53(m,10H);

8.23(d,lH).

A találmány szerinti eljárással előállított vegyület kitűnő farmakológiai hatékonysággal rendelkezik.

Ezért gyógyszerhatóanyagként történő alkalmazása indokoltnak tekinthető.

Pontosabban meghatározva, a vegyületnek kifejezett immunmoduláns aktivitása van. Ezen hatását különböző, a továbbiakban részletesebben ismertetett vizsgálati eljárások segítségével szemléltetjük:

Az alábbiakban használt rövidítések jelentése a következő:

A anyag: az 1. példában előállított vegyület;

B anyag: a 2. példában előállított vegyület;

ABC: haptén-specifikus antitest-képző sejtek;

BPO-BSA: benzil-penicilloil-szarvasmarha szérum albumin;

BPO-KLH: benzil-penicilloil-tengeri tapadócsiga

HU 205147 Β (keyhole limpet) hemocianin;

BSA: szarvasmarha szérum albumin;

CMI: celluláris immunitás;

ConA:konkanavalin-A;

CSF:kolónia-stimuIáló faktor;

CY: ciklofoszfamid;

DTEtkésői típusú allergiás túlérzékenység;

ELTSA: enzimhezkötöttimmunoszorhens teszt; HA: Freund-f éle inkomplett adjuváns;

ΗΓ: Immorális immunitás;

IFN-γ: gamma-interferon;

IL-1 (tL-Ιβ): interleukin-l (interleukon-ΐβ);

LAF: limfocita-aktiváló faktor; LSP:lipopoliszacharid;

MDP: muramil-dipeptid;

MDP-GDP: 3-0-|N-acetil-muramil-L-alanil-Dizoglutaminil]-l,2-di-0-palmitoil-sn-glicerin (az ANVAREP 165123 számú európai szabadalmi leírás 1. példájában szerepló' vegyület);

NBT: nitro-tetrazóliumkék;

PBL: perifériás vér fehérvérsejtjei;

PEC: peritoneális exszudátum (hasüri folyadékgyülem) sejtjei;

ΡΗΆ: fitohemmaglutinin;

PMA: forbol-mirisztát-acetát;

PMN: polimorf magvú sejtek;

TNF:tumor-nekrózis faktor.

A) Megállapítottuk, hogy a találmány szerinti eljárással előállított vegyület sokkal kevesebb mellékhatást okoz, mint a hasonló szerkezetű egyéb vegyületek, például az MDP-GDP; a találmány szerinti eljárással előállított vegyület tehát jobban tolerálható. Ezt a különösen előnyös tulajdonságát bizonyítjákpéldául az alábbiakban ismertetett vizsgáló eljárások*

1) pirogén hatás nyálaknál: A vizsgálati módszer megfelel az irodalomban - például az Amerikai Egyesült Államok Gyógyszerkönyvében (US Pharmacopeia) - leírtaknak A vizsgálat során nyert eredményeket az alábbiakban ismertetjük (1. táblázat):

1. táblázat

Pirogén hatás nyulaknál

Anyag	Lmegmagasabb nem-pirofén dózis (pg/kgiv.)	Legala- csonyabb pirogén dózis (gg/kgiv.)
A	1000	5000
B	20	50
MDP-GDP	10	20

2) Toxikus szinergista hatás LPS-sel: Ezen vizsgálat során Swiss-törzsből származó egereket kezelünk intravénásán LPS-sel és vagy MDP-GDP-vel, vagy pedig az A anyaggal, az alábbi dózisokban alkalmazva a fenti szereket (l.b táblázat), l.b táblázat

Az LPS-sel kifejtett toxikus szinergista hatás hiánya

Anyag	Kezelés	Kumulatív mortalitás (elhullott/ összes állatok száma)
Kontroll	+LPS25ps	0/18
MDP-GDP (300 pg)	+LPS25^g	17/18
Α(300μ_&)	+LPS25 μg	3/18

Valamennyi egeret 25 μgS. enteridisLPS-vel kezeltünk intravénásán önmagában vagy kombinációban alkalmazva vagy MDP-GDP-vel vagy pedig az A anyaggal.

Az eredményeket 3 azonos teszt alapján nyertük melyek mindegyikében csoportonként 6 egeret használtunk

A fenti két vizsgálat során nyert eredményeket (pirogén hatás és toxikus szinergízmus -1. és 1/b táblázat) vizsgálva megállapíthatjuk, hogy azok araellékhatások jelentős csökkenését mutatják, az MDP-GDP mellékhatásával összehasonlítva.

Az alábbiakban további vizsgálati módszereket ismertetünk:

a) TNF-indukció egér csontvelötenyészetben, nyál

PBL-ben (perifériás vér fehérvérsejtjeiben), (IFN- y-val történt előzetes aktiválás nélkül), valamint emberi perifériás fehérvérsejtekben (PBL):

Az eljárás részletes ismertetését TJ. Sayers és munkatársainak közleményében találhatjuk [J. Immunoi. 136, 2935-2940 (1986)]. A TNF aktivitás mérése a litikus aktivitás mérésének alapján történtL 929 típusúsejteken.

Az eredmények, melyeket a 2. táblázat tartalmaz, azt mutatják, hogy a találmány szerinti eljárással előállított vegyületnek mind az Á, mind pedig a B típusa . TNF igen gyenge indukcióját váltja ki, és ily módon lényegesen alacsonyabb endotoxikus hatású, mint az összehasonlításra alkalmazott vegyületek. Ezek az eredmények azokkal is összhangban állnak, amelyeket az A anyag esetében nyertünk, Ficoll-lal izolált perifériás humán vagy nyúl mononukleáris vérsejtek felhasználásával (3. és 4. táblázat).

HU 205147 Β

2. táblázta

TNF-indukció egér csontvelőben és makrofág-tenyészetben

Anyag	Koncentráció (pg/ml)	INF (nemzetközi egység-NE)
INF-ynélkül	INF-y(lOONE)
A	1	<5	<5
	10	<5	25
B	1	<5	99
	10	<5	40
MDP-GDP	1	<5	205
	10	- <5	276
LPS	0,01	377	2,245
Salmonellá	0,001	17	119
abort.eqüi Csak oldószer	_w	<5	<5

5. táblázta

TND-indukció nyitlak perifériás mononukleáris vérsejtjeiben (IFN-y-val végzett előzetes aktiválás nélkül)

Anyag	Koncentráció ©g/ml)	INF (nemzetközi egység - NE)
Első kísérlet	3.nyúl	Második kísérlet 4.nyúl
l.nyúl	2.nyúl
A	1	<8	<8	39	28
	10	44	76	204	163
MDP/GDP	1	233	328	196	157
	10	571	687	643	724
LSP	0,01	989	1198	1002	637
Salmonella abort.eqüi	0,001	361	680	318	230
Csakoldószer	/	<8	<8	14	20
Csak tenyésztő közeg	<8	<8	27	26

4. táblázta

TNF-indukció perifériás humán mononukleáris vérsejtekben

Anyag	Koncentráció	TNF (pg/ml)
(pg/ml) /	Első kísérlet 1.donor	2.donor	Második kísérlet 3.donor
A	1	27	82	63
	10	248	196	163
	20	291	225	198
MDP-GDP	1	493	107	-
	10	654	94	59
LPS	0,01	. 26	1000	538
Salmonella abort.equi	0,001	18	1195	699
Csakoldószer	-	0	0	0
Csak tenyésztő közeg	-	0	0	0
b) IL-l-indukció:		meg. Az eredmények (5. táblázat) azt mutatják, hogy a
Az IL-Ιβ, illetve aLAF aktivitást!. Gery és munka-	proliferáció csak a legmagasabb -	50 ug/ml-es - kon-
társai [JJExpMed. 136 128-142 (1972)], valamint J.	centráció alkalmazása esetén fokozott szignifikánsan,
Oppenheim és munkatársai [Cellular Immunoi. 5071-	összehasonlítva az önmagában alkalmazott oldószer
81 (1980)] által leírt módszerek szerint határoztuk	hatásával:

I

HU 205 147 Β

5. táblázat

LAF aktivitás (IL-1$) indukciója egerek hasüregéből nyert makrofágokban

Anyag Koncentráció fcg/ml)	Aktivitás (cpm) Hígítás 1:4	Hígítás 1:8
A	1	446	361
	10	1014	1267
	50	2338	2701
MDP-GDP	1	691	391
	10	1220	380
	50	4491	1106
LSP	10	5809	3096
Salmonella abort.equi	1	329	326
Csak tenyésztő közeg	-	427	-
Csakfelülúszó	-	374	513
Csak oldószer	10%	1546	1645

c) Makro fág, toxicitás (egér PEC-k) indukciója tumorsejtekkel (P 815) szemben:

Az egereket intraperitoneálisan 15ml 2,9%-os tioglikolátot tartalmazó bouillonnal (Merck-Darmstadt, NSZK) előkezeltük. Négy nappal ezután a makrofágok kiválasztódnak a hashártya üregébe, és onnan, kimosással eltávolíthatók Ezt követően az ily módon nyert, könnyen tapadó egér makrofágsejteket tumor- 25 sejtekkel, LPS-sel vagy immunstimuláns anyagokkal tenyésztjük együtt, melyek aktiválni képesek a makrofágokat, amínekkövetkeztében a tumorsejtek oldódása (pusztulása), illetve szaporodásuk gátlása figyelhető meg. Ezt az aktiválást tovább fokozhatjuk IFN-γ 30 hozzáadásával. Huszonnégy órás tenyésztést követően [³H]-timidín inkorporációjának mérésével határoztukmega túlélő sejtek számát. Negatívkontrollal és az EPS pozitív kontrollal történő összehasonlítás a vizsgált anyag adott koncentrációja esetében százalékban 35 adja meg alitikus (oldási), illetve a citotoxikus aktivitás mértékét (6. táblázat):

6. táblázat

Tumorsejtekkel szembeni makrofág-citotoxicitás indukciója 40

Anyag	(μ^πύ	Koncén- AP 815 tumor-
tráció ) IFNy nélkül	sejtek gátlása(%) ΙΕΝγ IFN-γ
(1E)	(5E)
A	1	55	41	94
	10	62	28	99
MDP-GDP	1	71	40	99
	10	62	62	99
LSP	0,01	77	98	99
Salmonella
abort.equi	0,001	84	60	99
Csak oldószer	-	5	10	10
Csak tenyésztőközeg -	0	10	10

d) A LAF aktivitás indukciója egér PEC-ben, 24 órás inkubációt követően (ümocita-teszt, kostimuláció 1:50 arányú PHÁ-val):

Ebben avizsgálatban (J.Exp. Med. 136 (1972) 128155) az A és B anyagok az MDP-GDP-éhez hasonló aktivitási profilt mutatnak.

e) A találmány szerinti eljárással előállított vegyület további, a tumorok kezelése szempontjából igen jelentős aktivitást sikerült kimutatni ciklofoszfamiddal vagy röntgen-besugárzással előkezelt rágcsálókban, éspedig a csontvelőben megfigyelhető, dótisíüggöproliferáció-stimulációt és a nüeloblasztoknak érett limfocitákká történő differenciálódását.

f) Ciklofoszfamiddal kezelt egerekből nyert csontvelősejtek proliferatw válaszreakciója: Az egereknek 5 mg cüdofoszfamidot adtunk be intraperitoneálisan, egy nappal azMDP-GDP-vel, illetve az A anyaggal végzett kezelést követően. A sejteket a ciklofoszfamid kezelés 4. napján összegyűjtöttük, majd olyan megfelelő tenyésztőközegek jelenlétében inkubáltuk őket, melyeket vagy.CSF-l-et tartalmazó L929 (”L”) sejtekből (E.R. Stanley, L.G. Guilbert, J. Immunoi. Methods 42 (1981) 253), vagy pedig LPS-sel kezelt egerek tüdejéből (Sheridan, Metcalf, J. Cell Physiology 81 (1973) II) nyertünk, és különböző hígításokban alkalmaztunk. A sejteknek a CSF-re vagy a GM-CSF-re adott válaszreakcióját - kontroliokkal összehasonlítva - ³H-timidin-inkorporációs módszerrel mértük Az eredmények azt mutatják, hogy az MDPGPD-vel ellentétben az A anyag képes a sejteknek a CSF kezelésre adott, proliferatív válaszreakciójának helyreállítására (1. azábrát).

Az ábra magyarázata: CY-nd a Q.aapoaés'MDl?GDP-vel (300 μg), illetve A anyaggal (300 μ§) a -1. napon kezelt egerek csontvelósejtjeinek proliferatív válaszreakciója.

(: kontroll + CSF-et tartalmazó L-sejtek, illetve kontroll+tüdő GM-CSF;

+ CSF-et tartalmazó L-sejtek, illetve MDP-GDP + tüdő GM-CSF;

+CSF-et tartalmazó L-sejtek, illetve A anyag + tüdő GM-CSF).

g) Az egerek fertőzésekkel szembeni, nemspecifikus ellenállóképességének fokozása: Az A anyagnak azon képességét vizsgáltuk egereken végzett, bakteriális fertőzések tanulmányozására alkalmas modellen, miszerint fokozni képes az állatok fertőzéssel szembeni ellenállóképességét. Swiss-törzsből származó egereket intravénásán kezeltünk 5 MDP-GDP-vel vagy A anyaggal. Huszonnégy óra múlva az állatok a Kleibsiella pneumoniae baktérium halálos fertőzést okozó mennyiségét (8 x 10⁴organizmus) kapták. (1.7. táblázat):

7. táblázat 10

Védőhatás egerek Klebsiella-fertőzésével szemben

Anayag	Kezelés (i.v. a-1. napon) (pg/egér)	Túlélés
Semmi	-	1/32
MDP-GDP	30	14/24 (p,01)
	100.	19/24 (p,01)
A	30	10/24 (p,01)
	' 100	14/24 (p,01)

Swiss-törzsből származó egereknek a -1. napon intravénásán adtuk be a vegyületeket. Az állatok ugyancsak intravénásán kapták a 8 x 10⁴ mennyiségű baktériumot. Afertőzést követő 3 héten keresztül feljegyez- 26 tűk az elhullott állatok számát.

A 7. táblázatból láthatjuk, hogy a kezeletlen kontrolokkal összehasonlítva, az MDP-GDP és az A anyag

HU 205 147 Β drámai mértékben fokozza az egerek fertőzésekkel szembeni, nemspecifikus ellenállóképességét,

h) Adjuváns aktivitás: Az A anyagnak azon tulajdonságát vizsgáltuk ebben a tesztben, hogy képes valamely antigénre adott celluláris immunválasz kiváltására és a specifikus humoriális immunreakció fokozására. Kontroll és kísérleti, Hartley-törzsből származó, hím, 300 g súlyú tengerimalacok hátsó lábának ujjbegyébe összesen 1 mg 0,2 ml vízolaj emulzióban oldott ovalbumint (ínkomplett Freund-adjuváns, HA) adtunk be. A kísérleti csoportba tartozó állatok esetében az adjuvánst 0,1 mg-os dózisban adtuk az emulzióhoz.

Celluláris immunitásuk (CMI) megállapítása céljából az állatoknál a 21. napon bőrtesztet végeztünk oly módon, hogy 0,1 mg ovalbumin sós oldatát adtuk be, intradermális injekció formájában. A kiváltott bőrreakciót 6, 24 és 48 óra múlva ellenőriztük, és az eredményeket a 48 óra elteltével tapasztalható bőrkeményedés átmérőjében fejeztük ki. A humorális immunitás (Hl) megállapítása érdekében az állatokat a 24, napon szívpunkcióval elvéreztettük Az anti-ovalbumin antitesttitereket ELISA módszerrel mértük, standard körülmények között. Megadtuk az egyes állatok títereit, valamint az átlagértékeket. A 8. táblázatból láthatjuk, hogy az A anyag az MDP-GDP-nél nagyobb mértékben stimulálja mind a CMI, mindpedig a Hl specifikus válaszreakciókat:

8. táblázat

Adjuváns aktivitás hatása a humorális és celluláris immunválaszokra

Anyag	DTHU (átmérők) (bőrkeményedés mm-ben)	Humorális válasz²) (ELISA titerek)
Kontrollok	0	8000-21000-21500-37000-65000-95000(41250)
MDP-GDP	8-14-15-1.7(13,5)	247000-295000-641000-325000(377000)
A	15-15-18-20
	20-25(18,5)	100000-172000-780000-850000-472000-330000(450000)

UAz eredményeket a 48 óra múlva tapasztalható bőrkeményedés átmérőjében fejeztük ki. Megadtuk az egyéni mérési eredményeket, valamint a matematikai átlagértékeket (zárójelben).

²^Az anti-ovalbumin antitest-titereket ELISA-módszerrel mértük, standard körülmények között. Megadtuk az egyes állatok titereit, valamint az átlagértékeket.

i) A nyúl perifériás limfocitáinak mitogén szerekre adott válaszreakciójára gyakorolt hatás:

Az A anyagot intravénásán adtuk be a nyulaknak,

100 ^g-os dózisban. Ezt megelőzően és három órával a beadást követően vérmintákat vettünk az állatoktól. A limfocita-transzformációs tesztet oly módon végeztük el, hogy mononukleáris sejteket ConA-val vagy PHAval inkubáltunk, A mitogén hatást a ³H-timidin inkorporációjának növekedése segítségével mértük, és a percenként beütésszámban (cpm) fejeztük ki. Az eredményeket a 9. táblázat szemlélteti:

HU 205147 Β

9. táblázat

Mitogén szerek által kiváltott limfocita-transzformáció in vitro körülmények kozott, az A anyaggal végzett, in vivő kezelést követően

Nyulak	Só	In vitro ConA-val	inkubáció PHA-val
(1 pg/ml)	(10 pg/ml)	(1 Pg/ml)	(10 pg/ml)
Kontroll 1	T0	1086	3782	6190	3078	2423
	T3	1612	5570	6844	6880	5905
Kontroll 2	T0	577	3354	2459	3316	1610
	T3	383	5194	428	2095	1206
A-val kezelt 1	T0	2926	3132	5204	2479	2591
	T3	983	22241	39469	17754	30270
A-val kezelt 2	T0	412	6342	2778	10149	2936
	T3	324	10721	118597	15734	91434
A-valkezelt3	T0	487	15521	6917	10020	12482
	T3	239	55690	50572	32228	37538
A	TO	732	951	1287	600	569
	T3	1327	9252	6493	4570	2648

A 9. táblázatból láthatjuk, hogy a kezeletlen nyulak sejtjeivel összehasonlítva, azA anyaggal végzett in vivő kezelés szignifikánsan fokozta a Iimföciták azon képességét, hogy in vitro válaszreakcióval reagálnak a mitogén anyagokszuboptimális dózisaira, j) A polimorf magvú vérsejtek (PMN) válaszreakciója in vitro vagy in vivő kezelést követően

Az oxidatívválaszreakciót és a Candida-ölő képességet klasszikus módszerek segítségével vizsgáltuk.

Emberi és tengerimalac-vérből nyert, tisztított PMN-t A anyag jelenlétében tenyésztettük, majd mértük alökésszerű oxidatívválaszreakciót, a PMA, illetve Candida albiacans sejtek hozzáadását követő egy órán belül, illetve a Candida albicans szaporodását 18 órán keresztül. Az eredmények (10. táblázat) azt mutatják, hogy az A anyagnak ezen sejtekre gyakorolt, stimuláló hatása független a sejtek eredetétől (emberi vagy tengerimalac-sejtek):

10. táblázat

AzA anyaggal végzett, előzetes inkubálás hatása az emberi- és tengerimalac PMN válaszreakciókra

Vérsejtek	Előzetes inkubálás³) azAanyaggal (pg/ml)	Oxidatívválaszreakciót PMA-ra- élesztőgomba-	Candida-ölő képességé
(20nmól)	sejtekre (30:1 arányban)	30:1 (PMN: élesztő- gomba)	100:1 arányban (PMN: •.élesztő- gomba)
Emberi PMN	-	30,3	4,2	2,5	58,1
	0,1	-	-	0	47,6
	I	-	-	3,3	75,6
•	10	69,2	29,7	21,2	92,9
TengerimalacPMN	-	•42,9	18,9	-	42,4
	0,1	-	-	-	61,8
1	-	-	-	84,9
	10	52,6	24,3	-	93,3

a) Előzetes inkubálás 1 órán keresztül.

b) AzNBT redukáló sejtek százalékában kifejezve, egy órával a PMA, illetve a C. albicans sejtek hozzáadását követően.

c) A Candida albicans szaporodás gátlása, az élesztőgomba-sejtekbe történő ³H-gIükóz-inkorporáció csökkenésével mérve.

k) Az ex vivő vizsgálatokat tengerimalacokon végeztük. Az állatoknak szubkután injekcióban (500 pg/kg) adtuk be az Aanyagot 3, illetve 18 órával a szívpunkcióval történő vérvételt megelőzően.

A tisztított vér PMN válaszreakcióját közvetlen módon határoztuk meg, in vitor körülmények között a PMA, illetve a C. albicans sejtek hozzáadását követően. Amint azt a 11. Táblázat mutatja, a 60 tengerimalacoknak 18 órával korábban történő előkezelése a PMN erősebb válaszreakcióját váltja ki, amikor ezt követően PMA vagy C. albicans sejtek hatásának tesszük kí. Az állatoknak a vérvétel előtt 3 órával történő előkezelése azonban hatástalannak bizonyult.

11. táblázat

Az A anyaggal (250 pg/kg) végzett előkezelés hatá8

HU 205 147 Β 2 'ί sa a tengerimalac PMN válaszkészségére

Előkezelés PMA Oxidatív	Candida-
válasz-	ölöké-
(20 nmól) reakció	pesség^b) 5
élesztő-
gomba-
sejtekre	30:1 100:1
a) (30:1
arányban)	arányban 10

Sóoldat	55,8	33,3	17,2	25,6
Aanyag	61,1	35,2	15	17,2
(3 órával
korábban)
Aanyag	84,9	62,7	60,1	82,1

(18 órával korábban)

a) AzNBT redukáló fejtek százalékában kifejezve [ld.

E. Piek és mtsai, J. Reticuloendothelial Soc. 30 (1981)581], egy órával a PMA, illetve a C. albicans 20 sejtek hozzáadását követően, 30:1 arány esetén (PMN: élesztősejtek).

b) A C. albicans szaporodásának százalékos gátlása az élesztőgomba-sejtekbe történő ³H-glükóz inkorporáció csökkenésével mérve. 25

A fenti A) pontban ismertetett vizsgálati eredmények alapján arra a következtetésre juthatunk, hogy a találmány szerinti eljárással előállított vegyűlet farmakológiái aktivitása sokkal előnyösebb, mint a ha- 30 sonló szerkezetű vegyületeké

-például az MDP-GDP-é.

A találmány szerinti eljárással előállított vegyűlet a nemspecifikus, mikrobákkal szembeni ellenállóképesség modulátoraként alkalmazható, az immunválasz és 35 a nemspecif ikus immunitás szisztémás fokozása céljából.

A vegyűlet alkalmazási javallatai közé sorolható például a csökkent immunválasszal jellemezhető állapotok - különösen a csökkent celluláris és humorális 40 immunválasszal jellemezhetőek - és az elhúzódó típusú, csökkent túlérzékenységi reakciókkal jellemezhető állapotok gyógykezelése, illetve fenntartó kezelése (további specifikus vagy fenntartó kezelési formákkal kombinálva), valamint általában az olyan állapotok 45 kezelése, melyekben az immunválasz befolyásolása válik szükségessé.

A találmány szerinti eljárással előállítható vegyűlet különösen előnyösen alkalmazható a geriátriai betegek, a súlyos égésekben, illetve a generálizált infekci- 50 ókban szenvedő betegeknél előforduló típusú, továbbá az idiopátiás immunhiányos állapotokhoz csatlakozó kóros állapotok gyógykezelésében, illetve fenntartó kezelésében.

Avegyület alkalmazási javallataiközé tartoznak továbbá különböző vírusfertőzések - például a disszeminált herpes és a disszeminált varicella fertőzések továbbá a Hodgkin-kór és egyéb rosszindulatú daganatok gyógykezelése és fenntartó kezelése.

A fenti alkalmazási javallatok esetében a beadandó dózis természetesen a kezelendő betegség természetének és súlyosságának, az adagolás módjának és a használt gyógyszerformának a függvénye. Az alkalmazott parenterális dózis előnyösen körülbelül 0,1 mg és 70 mg között van, melyet például egyszer adunk be az adjuváns hatás elérése céljából, például fenntartó kezelés során, illetve naponta alkalmazhatunk. Áz ismételt adagolás előnyösen naponta 2-4 alkalommal vagy pedig késleltetett hatóanyagleadású formában történhet. Ismételt adagolás esetén a találmány szerinti eljárással előállított vegyületet körülbelül 0.025 mg és 35 mg közötti egységnyi adagolási formákban alkalmazhatjuk, illetve - amennyiben adjuváns kezelés válik szükségessé - a szer egyszeri adagját körülbelül 70 mg-ig emelhetjük.

B) A találmány szerinti eljárással előállított vegyűlet immunmoduláns aktivitása révén alkalmas vakcinákban adjuvánsként történő alkalmazásra. Ezen felhasználási mód esetén a javasolt dózis körülbelül 0,1 mg és 50 mg között, előnyösen körülbelül 0,5 és 10 mg között van, például körülbelül 7 mg, a vakcináció napján beadva. Előnyösen ugyanezen dózis második alkalmazására az ELSŐ után 2-4 héttel kerülsor.

C) Azt is megállapítottuk továbbá, hogy a találmány szerinti eljárással előállított vegyűlet egereknél módosítja a haptenspecífikus immunglobulin izotipus válaszreakciót. Ezt az aktivitást a hapténspecifikus anti testképző sejtek (ABC) mennyiségének meghatározására alkalmas vizsgálóeljárás segítségével bizonyíthatjuk. Áz immunizációs séma a következő: Balb/c egereknek intraperitoneális injekcióban 10 pg BPO-KLH-t adunk be, 0,2 ml alumínium-hidroxid gélben oldva, a 0., 21. és a 42. napon. Ezt követően az egereket két csoportra osztjuk; az ELSŐ csoportban minden egérnek 10 pg találmány szerinti eljárással előállított vegyületet (A anyagot) adtunk be orálisan a 44. és a 45. napon, a második (kontroll) csoport pedig sóoldatot kapott. Az állatokat a 46., 51., illetve a 70. napon öltük le, és a limfocitákat kivontuk a Peyer-plakkokból, a mezenteriális nyirokcsomókból és a lépből, Hathat állatból származó sejteket összegyűjtve ex vivő körülmények között meghatároztuk az ABC-számot, BPO-BSA-vál rétegzett plakkok felhasználásával végzett Elispot-módszer segítségével. Az eredményeket a 12. táblázat ismerteti:

HU 205147 Β

12. táblázat

Hapténspecifikus immunglobulin izotípus válaszreakció egerekben

Aleölés Szerv Hapténspecifikus antitest-képző sejtek (ABC/10⁷ sejt) napja IgM IgC IgE IgA

	Co	A	Co	A	Co	A	Co	A
46	PP	1	1	1	1	1	1	1	1
ML	221	218	181	315	315	1	104	89
	SP	303	410	395	485	288	1	143	123
51	PP	1	1	1	1	l	1	1	1
	ML	197	320	273	362	286	5	98	lll
	SP	630	795	718	812	193	15	77	94
70	PP	1	1	1	1	1	1	1	1
	ML	187	174	235	347	133	lll	62	53
	SP	1316	918	943	1012	188	164	84	77

PP =Peyer-plakkok; ML=mezenteriális nyirokcsomók; SP=lép; Co = kontroll (fiziológiás sóoldat)

A fenti eredmények azt mutatják, hogy az egereknek az ismertetett módon történő immunizálását követően a mezenteriális nyirokcsomókban és a lépben valamennyi lg izotípusosztály ABC-i megtalálhatók. Az IgM- és azIgG-képző sejtek száma szignifikánsan magasabb volt a lépsejtekben, mint a mezenteriális nyirokcsomó-sejtekben, míg az IgA és az IgE ABC-k mindkét szervben nagyjából azonos számban fordultak elő. A fenti séma szerint a találmány szerinti eljárással előállított vegyülettel (A anyag) végzett kezelés eredményeképpen mindkét szervben növekedett az IgG ABC-tartalma, az IgE-antitest-képző sejtek (ABC) száma azonban csökkent. A megfigyelt hatás átmenetinek bizonyult.

Á46. napon a vizsgáltkétszerv egyikében sem találtunk IgE-képző ABC-ket, az 51. napon az értékek továbbra is igen alacsonyak voltak. A 70. napon nem találtunk különbséget a kontrollokhozképest.

A fentiek alapján arra következtethetünk, hogy a 25 találmány szerinti vegyület szabályozó funkciót tölt be allergiás megbetegedésekben.

Amennyiben a fenti kísérletet - aleírtaknak megfelelően - megismételjük, azzal a különbséggel, hogy a vizsgált anyagot a 44. napon adjuk be, az állatokat pe30 dig a 45., 46., 58. és a 70. napon öljük le, az alábbi eredményeket nyerjük: (Id. 13. táblázat):

13. táblázat

Az IgE-képzö ABC-k (antitestképzö sejtek) csökkenése egerek lépésben

Aleölés napja	Vizsgált dózis (A anyag, mg/kg)	IgE-képző ABC-k IgA-képző ABC-k száma (/10⁷ sejt) 1 2 1,2 vizsgálat
45	-	317	239	139	131
	0.1	251	215	207	93
	1	264	231	66	lll
	10	270	201	170	106
	100	253	216	202	119
46	-	313	291	156	166
	0.1	177	115	103	191
	1	70	94	158	202
	10	82	64	217	289
	100	54	72	140	218
58	-	277	189	93	56
	0.1	201	152	88	76
	1	196	155	73	90
	10	138	119	61	81
	100	56	64	78	43
70	-	166	108	34	112
	0.1	136	95	122	74
	1	144	92	99	85
	10	153	121	130	105
	100	129	113	108	101

HU 205 147 Β

A fent ismertetett aktivitása következtében a találmány szerinti eljárással előállított vegyületet alkalmazhatjuk továbbá az IgE-képződést gátló szerként is, előnyösen azl. típusú allergiák és atopiás dermatitisek kezelésében.

A fenti javallatok esetében az ajánlott napi pareneterális dózis körülbelül 3 ^g/kg és körülbelül 20 μg/kg között van, előnyösen naponta 2-4 alkalommal beadva, előnyösen elhúzódó hatőanyagleadású formákban, két vagy többnapos időszakonként alkalmazva. Az egységnyi dózisadagok körülbelül 2 mg és 15 mg közöttimennyiséget tartalmaznak. A teljes napi adag körülbelül 4 mg és 60 mg között van.

D) Az egereken végzett CSF-indukciós vizsgálatban, amelynek során párhuzamosan adagoltuk az A anyagot és azLPS-t, azt tapasztaltuk továbbá, hogy ellentétben az MDP-GDP-vel, a találmány szerinti eljárással előállított vegyület bizonyos mértékű szinergista aktivitást fejt ki az LPS-sel.

Afenti indikációk esetén történő alkalmazásra a legelőnyösebbnek az 1. példában ismertetett vegyület bizonyult, azaz az A anyag, vagyis az olyan (I) képletű vegyület, ahol C* R konfigurációjú, éspedig 3-0-[Nacetil-muramil-L-treonií-D-izoglutammil]-l,2-di-0 -palmitoil-sn-glicerin.

A találmány tárgyát képezik továbbá a találmány szerinti eljárással előállított vegyületet tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítása is, melyekben a hatóanyaggal együtt legalább egy gyógyszerészetileg elfogadható vivőanyagot, illetve oldószert is találhatunk. Ezen gyógyszerkészítmények hagyományos eljárások segítségével állíthatók elő, például azon eljárással, melynek során a fenti ismertetett vegyületet azaz az (Ϊ) képletű vegyületet, melyben C* R, illetve S konfigurációjú - valamely gyógyszerészetileg elfogadható vivőanyaggal, illetve oldószerrel keverjük Össze.

További ajánlott gyógyszerkészítmények állíthatók elő például a liposzómákban és a kevert micellumokban előforduló lizofoszfatidü-kolinból, n-oktil-glükózból vagy dezoxikolátból. Az ilyenfajta gyógyszerkészítmények előállítása történhet hagyományos eljárások segítségével, például injekciós oldatok formájában, Ezen készítmények előállítása szintén a találmány tárgyához tartozik.

A találmány ismerteti továbbá a fent felsorolt kóros állapotok gyógykezelésének, illetve fenntartó kezelésének lehetőségeit, melyek során az ilyenfajta kezelésre szoruló egyéneknek a találmány szerinti eljárással előállított vegyület terápiásán hatékony mennyiségét adagoljuk.

A találmány szerinti eljárással előállított vegyület felhasználható továbbá a fenti javallatok esetén, előnyösen például immunmodulátorként, vírusellenes szerként és allergiaellenes szerként.

Claims

SZABADALMIIGÉNYPONTOK

1. Eljárás az (I) képletű 3-0-|N-acetü-muramü-treonil-D-izoglutaminil]-l,2-di-0-palmitoil-sn-glicerin-s zármazék előállítására, ahol a csillaggal (*) jelölt szénatom R, illetve S konfigurációjú, azzal jellemezve, hogy egy (Π) általános képletű vegyület, ahol a csillaggal (*) jelzett szénatom a fenti definíciónak felel meg, Rj, R₂, R₃ és R₄ egymástól függetlenül a peptidkémiában szokásos hidroxi-védőcsoportokat jelentenek, védőcsoportjait eltávolítjuk. (Elsőbbsége: 1989.07.27.)
2. Azl. igénypont szerinti eljárás olyan. (I) képletű vegyület előállítására, amelyben a csillaggal (*) jelölt szénatom R konfigurációjú, azzal jellemezve, hogy megfelelő konfigurációjú (H) általános képletű vegyületből indulunk ki. (Elsőbbsége: 1989.06.29.)
3. Az 1. igénypont szerinti eljárás olyan (I) képletű vegyület előállítására, amelyben a csillaggal (*) jelölt szénatom S konfigurációjú, azzal jellemezve, hogy megfelelő konfigurációjú (H) általános képletű vegyületből indulunk ki. (Elsőbbsége: 1989.06.29.)
4. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a védőcsoport-eltávolítást palládium-katalizátor jelenlétében hidrogénezéssel végezzük. (Elsőbbsége: 1989.07.27.)
5. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzaljellemezve, hogy olyan (I) általános képletű kiindulási vegyületeket használunk, amelyekben Rj és R₂ együttesen benzilidén-csoportot alkotnak, R₃ benzil-, R₄ pedig benzilvagy terc-butil-dimetil-szÍlilcsoport. (Elsőbbsége: 1989.07.27.)
6. Eljárás hatóanyagként (I) képletű vegyületet - a csillaggal (*) jelzett szénatom R, illetve S konfigurációjú - tartalmazó gyógyszerkészítmény előállítására, azzaljellemezve, hogy az L, 4. vagy 5. igénypontok bármelyike szerinti eljárással előállított hatóanyagot legalább egy, gyógyszerészetileg elfogadható vivőanyaggal vagy oldószerrel összekever jük és gyógyszerkészítménnyé feldolgozzuk. (Elsőbbsége: 1989.07.27.)
7. A 6. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy hatóanyagként a 2. vagy 3. igénypont szerinti eljárással előállított (I) képletű vegyületet alkalmazunk.