HU196846B

HU196846B - Process for producing biologically active derivatives of human gamma-interferon and pharmaceutical compositions comprising the same

Info

Publication number: HU196846B
Application number: HU864296A
Authority: HU
Inventors: Joachim Engels; Eugen Uhlmann; Waldemar Wetekam; Michael Leineweber; Gerhard Seipke; Wolfgang Ulmer
Original assignee: Hoechst Ag
Priority date: 1985-10-17
Filing date: 1986-10-15
Publication date: 1989-01-30
Also published as: EP0219781A2; DE3536939A1; FI864164A7; AU6397986A; IL80302A0; PT83556A; PT83556B; FI864164L; DK495486D0; FI864164A0; JPS6299399A; EP0219781A3; DK495486A; ZA867839B; KR870004139A; HUT42510A

Description

A korábban már közzétett humán^-interferon aininosav szekvenciája — a továbbiakban IFN-y-146 aminosawal rendelkezik (Devos és mtársai, NuCl. Acids. Rés. 10,(1982)2487). Egy kérőbbi közzététel szerint azonban (Rinderknecht és mtársai., J, Bioi. Chem. 259 (1984) 6790) a korábban már publikált szekvenciából az érett IFN-γ első három aminosavja hiányzik. A továbbiakban az aminosav számozásakor a Devos és mtársai. szerinti szekvenciát követjük.

A 146 944 számú európai szabadalmi bejelentésből ismert az IFN-γ származékainak géntechnológiai előállítása. Az előállításban a 9-es helyzetben lévő Lys-t Ginnel helyettesítik. Ezenkívül egyéb módosításokat is végeznek. Az egyik ilyen módosítás az N-terminális 4 illetve 7 aminosavval történő rövidítése, amelyet a DNS Bal 31- felemésztésével és expreszszióval végeznek. Ezek az IFN-γ származékok a természetes ΙΕΝ-γ-hoz hasonló vagy nagyobb aktivitásúcik

Javasolták (3 414 831 számú, NSZK-beli közrebocsátási irat) olyan ΙΕΝ-γ-származékok előállítását, amelyeknél a természetes szekvencia első négy aminosavja kiesik anélkül, hogy így az IFN-γ biológiai aktivitása számottevően megváltozna, és/vagy a 127 aminosav utáni (Alanin) aminosavat eltávolítanák és így ugyancsak biológiailag aktív termékeket állítanak elő.

Felismertük, hogy biológiailag aktív IFN-γ-1 állíthatunk elő, ha a természetes szekvencia 5-ös helyzetében lévő (Asp) aminosavat lehasítjuk.

Találmányunk tárgya olyan IFN^-részszekvenciák előállítására irányuló eljárás, amelyeknek aminosav szekvenciája a 6-os helyzettel (Pro) kezdődik és a 146-os (Gin) helyzetig, de legalább a 127 helyzetig (Alá) terjed. Felismértük továbbá, hogy a találmány szerinti eljárással rövidített IFN-γ részszekvenciákat különösen előnyösen az Asp-Pro-kötések savas hasításával (Piszkoewicz és munkatársai, Biochemical and Biophysical Research Communications 40 (1970) 1173) és renaturálásával állíthatjuk elő. Meglepő módon Ilyen drasztikus körülmények között is biológiailag aktív ΙΕΝ-γ-származékot állíthatunk elő, és ez annál meglepőbb volt, mivel az IFN-γ savas közegben labilis vegyület (például 88 540 számú európai szabadalmi bejelentés, 5. oldal, 33-36. sor).

Ebben az eljárásban kiindulási anyagként az összes olyan polipeptidet alkalmazhatjuk, amelyek a természetes ΙΕΝ-γ-nak megfelelően az 5-ös helyzetben aszparagínsavat, és a 6-os helyzetben prolint tartalmaznak. Ezt a hasítást előnyösen olyan fúziós proteinekkel végezzük, amelyek a természetes vagy átalakított ΙΕΝ-γ-szekvencia aszparaginsavja előtt és adott esetben egyéb aminosav előtt lévő N-terminális egy például bakteriális protein viszonylag hosszú aminosav-szekvenicájához kötődik.

Az Asp-Pro aminosav sorrendű polipeptid savas hasítása nem szorítkozik csak a természetes IFN-γ-πι, hanem ugyanúgy használható az összes IFN^-aminosav sorrendű polipeptid. Ezeknek a polipeptideknek rendkívül savstabilaknak kell lenniük, azért, hogy a keletkezett hasítási termékek, vagy adott esetben csak a kívánt hasítási termék - ne vagy ne irreverzibilisen alakuljon át.

Az eljárási feltételek természetesen a hasítási termékek, illetve a kívánt hasítási termék savstabilitásához igazodik és célszerűen egyszerű előkísérletekkel határozzuk meg. Savként előnyösen alkalmazhatunk hangyasavat, sósavat, vagy egyéb, hasonlóan nem oxidálódó savat, így például hígított kénsavat, foszforsavat, halogénezett ecetsavat vagy szulfonsavat,

Mivel a reakciót vizes közegben folytatjuk le, ezért a reakció hőmérsékletét körülbelül 0-120 °C hőmérséklet között végezzük. Alalcsonyabb hőmérsékleten az eljárás kíméletesebben megy végbe, de ez hosszabb időt igényel. A forráspont körüli hőmérséklet bár rövidebb időt igényel, azonban csak rendkívül stabil termékeknél használható. Ezért az előnyös hőmérsékleti tartomány 10—70 °C, különösen 20—60 °C. A vizes közeg savkoncentrációja a termék érzékenységéhez és a sav erősségéhez igazodik. Előnyösen hangyasavat alkalmazunk, amelynek koncentrációja vizes közegben 70-80 tömeg%.

A hasítási eljárást homogén vagy heterogén fázisban végezhetjük. A viszonylag kis molekulájú proteineket célszerűen vizes sav oldatban feloldjuk, vagy először szuszpendáljuk, illetve részben oldjuk, ezt követően az eljárásban többé-kevésbé teljes feloldódás végbemegy.

A specifikus savas hasítás befejeztével a reakcióelegyet célszerűen semlegesítjük, ezt előnyösen hűtés közben végezzük, majd a kívánt terméket Ismert módon elválasztjuk és renaturáljuk. Az elegyhez például adhatunk megfelelő adszorpciós anyagot, és a telített abszorbensből a kívánt terméket eluálhatjuk. Ezt követően vagy az előzőekben leírtintézkedések helyett a terméket egy vagy több kicsapásl művelettel tisztíthatjuk. A kívánt peptidet specifikus antitesttel terhelt oszlopon is izolálhatjuk.

A találmány szerinti eljárással rövidített IFN-γ-részszekvenciákat és a biológiailag aktív analógokat előnyösen géntechnológiai úton állítjuk elő. Ekkor egy gazdaszervezetben, előnyösen az E. coli-ban egy gén exprimálódik, amely a találmány szerinti aminosav-szekvenciát kódolja. Ezt a gént ismert eljárással szintetizálhatjuk, vagy gének átalakításával előállíthatjuk. Erre példák a következő irodalmi helyek: 77670, 88 540,,89 676, 95 350, 146 453, 146 944 vagy 155 590 számú európai szabadalmi iratok, illetve 3 414 835 számú NSZK-beli közzétételi irat.

Ha a találmány szerinti IFN^-származékok géntechnológiai szintézise a 3 409 966 számú NSZKbeli közzétételi irat, illetve a 155 590 számú európai szabadalmi iratban közölt eljárás szerinti történik, akkor a szintetikus génben az IFN-γ-szekvencia első 5 aminosayjára vonatkozó kódok kiesnek. A gén szintézisben így például a (II) DNS-szekvenciában az Ia-Id egységek helyén a következő ligonukleotidokat alkalmazhatjuk:

MET Pro Tyr Val Lys Glu Alá 5 AA TTC ATG CCG TAC GTT AAA GAA GCT 3’ (Eco Rí) G TAC GGC ATG CAA TTT CTT CGA

Glu Asn (Leu) (Lys) ~ 5’ GAA AAC Ϊ

3’ CTT TTG GAC TTT 5’

A géntechnológiai szintézist elvégezhetjük a 3 414 831 számú NSZK-beli közzétételi irat alapján is (161 504 európai közzétételi irat). Ebben a bejelentésben felsorolnak több olyan módosított DNS-szekvencia variációt, amelyből a megváltozott aminosavszekvenclájú ΙΕΝ-γ-analóghoz lehet jutni.

A szintetikus géneket természetesen génkoustruk-21 ciókba is beépíthetjük, és így expressziónál fúziós proteineket állítunk elő. Több ilyen jellegű eljárás ismert. Ezek közül példaként megemlítjük az 1930 és 12 494 számú európai szabadalmi iratokat, amelyekben olyan fúziós proteineket írnak le, amelyek 0-galaktozidáz egységet tartalmaznak. Ily módon oldhatatlan fúziós proteineket állíthatunk elő, amelyek az egyéb proteinektől könnyen elválaszthatók és tisztíthatok. Ezeket a fúziós proteineket célszerűen az előzőekben leírt proteolízishez alkalmazhatjuk.

A következő példák talmányunk magyarázatára szolgálnak. A példák százalékos adatai — amennyiben egyéb megjelölés nincs - tömeg%-ra vonatkoznak.

1. példa

Közvetlen expresszió

Az I. ábra szerinti plazmidból (amely az IFN-γ-gént tartalmazza) 10 pg-ot felhasítunk Bam Hl és Sál I restrikciós endonukleázokkal. Ezt követően a maradék plazmidtól körülbelül 340 bp tatalmú gén-fragmenst elválasztunk 2%-os alacsony olvadáspontú agaróz gélen és (agaróz előállítására szolgáló utasítása szerint) izoláljuk. Az izolált génfragmens megfelel a (II) DNS-szekvenciából (35-146 aminosav)előállított IFN-I és IFN-II DNS-szekvenciáinak.

Erre a fragmensre egy új kombinált génfragmenst kötünk, amely a DNS-szekvencia.

MET Pro Tyr Val Lys Glu Ala 5’ AA TTC ATG CCG TAC GTT AAA GAA GCT 3’ (Eco Rí) G TAC GGC ATG CAA TTT CTT CGA

Glu Asn (leu) (Lys)

5’ GAA AAC . 3’

3’ CTT TTG GAC TTT 5’ és a II-DNS-szekvencia (IFN-I) lg — Ij oligonukleotidjainak ligálása után keletkezik. Ezután az így előállított és 5 aminosavval megrövidített IFN-y-gént az Eco Rí és Sál I restrikciós enzimekkel felhasítjuk és a 414 bp-t tartalmazó gént 2%-os agarózgélből gén-elektroforézissel elválasztjuk.

Az l. ábra szerinti expressziós plazmidot felnyitjuk az Eco Rí és Sál I restrikciós enzimekkel, és 0,7%os agaróz gélen elválasztjuk a benne levő IFN-y-gént, és a maradék plazmidot az újonnan létrehozott megrövidített IFN-y-génnel kötjük, amelyhez segítségül a T4-DNS-ligáz enzimet alkalmazzuk. A ligálást TRISZ-HCl-pufferban, magnézium-kloridban és DTTval, T4-DNS-ligázzaI végezzük.

A megrövidített lFN-y-gént tartalmazó hidridplazmidot E. coli sejtekbe transzformáljuk. Ehhez az E. coli K 12 törzset CaCl₂-oldattal végzett: kezeléssel kompetenssé tesszük, és a hibridplazmidok CaCl₂-t tartalmazó, 7,5 pH-jú Trisz-HCl-pufferral készített oldatával kezeljük. A transzformált törzseket ampicillint tartalmazó agarlemezeken szélesztjük. Ezután a megfelelő plazmidokban a megfelelőképpen integrált γ-intcrferon gén-szekvenicát tartalmazó kiónokat DNS-gyorsfeldolgozással (Maniatis) azonosítjuk. Transzformálás után az E. coliba egy γ-interferon-aminosavszekvenciájú és az amino-terminálisan még egy mationilcsoportot tartalmazó polipeptidet exprlmálunk.

A kívánt optikai sűrűségre tenyésztett baktériumtörzseket egy alkalmas induktorral, például lPTG-vel, viszonylag hosszú ideig, két óráig inkubáljuk. A sejteket krezol oldattal és benzil-szulfonil-kloriddal elöljük.Centrifugálásés szűrés után a sejttömeget pufferoldatban szuszpendáljuk (Trisz, EDTA, pH = 7,5) és mechanikusan feltárjuk, például French-prés, illetve DYNO-daráló (gyártó cég: Willy Bachofer, Basel) segítségével, majd az oldhatatlan alkotókat centrifugálással eltávolítjuk. A felülúszóban lévő γ-interferon aktivitású proteint szokásos eljárással tisztítjuk. A tisztítás történhet ioncserés-, adszorpciós-, gélszűrő oszlopokon vagy affinkromatográfiával.

A termék dúsulását és tisztaságát nátrium-dodecil-szulfát-akril-amid gélen és HPLC analitikával ellenőrizzük.

Ily módon az JFN-γ 6-146 aminosav szekvenciájú polipeptidjét állítjuk elő, amelynek N-terminálja Mettel hosszabb.

2. Példa

a) Fúziós protein előállítása

Az 1 DNS-szekvenciájú szintetikus génből indulunk ki, és ezt a következő módon a 0-gaIaktozidáz-génhez kapcsoljuk:

Az 1. ábra szerinti plazmidot (vagy az 1. példa szerint előállított rövidített IFNT-szekvenciájú analóg plazmidot) felhasítjuk Sál 1-gyel, és a következő Sál I - Eco Rl-adaptorral kötjük:

5’ TCG ACC CGG GCT G 3'

3’ GG GCC CGA CTT A A 5’ (Sál I) (Eco Rí)

A ligáit termékből elválasztjuk az Eco Rl-vel meghosszabbított gént, amelyet most már mind a két végén Eco Rl jelzőszekvencia szegélyez. Ezután 2%-os alacsony olvadáspontú agarózgéllel tisztítjuk és izoláljuk.

A pBH 20 plazmidot (2. ábra) (E. L. Winnacker, Gene und Klone, eine Einführung in die Gentechnologie, VCH kiadó, Weinheím (1984), 233-234. oldal, 12 494 számú európai szabadalmi bejelentés, 1. ábra) ismert módon felnyitjuk az Eco Rí restrikciós enzimmel, és az IFN-7-szekvenciájú gént a linearízált plazmidba helyezzük. Az 1. példa szerint végzett transzformáció és indukció után előállítjuk a fúziós proteint. A fúziós protein a γ-galaktozidáz első, körülbelül 1000 aminosavjához van csatlakoztatva, és az 1FN-γ aminosav szekvenciát (komplett illetve rövidített) tartalmazza.

b) Fúziós protein proteolízise

A dúsított fúziós proteinből 1 g-ot feloldunk 100 ml 70%-os hangyasavban, és 6 órán keresztül 60 °C hőmérsékleten keverjük. A reakcióidő elteltével az oldatot hűtés közben 4 n nátronlúggal semlegesítjük, és vízzel ötszörös - tízszeres térfogatra hígítjuk. Azért, hogy a kívánt hasítási terméket abszorbeáljuk hozzákeverünk 100 g kovasavat. Az abszorpciót 3 óra alatt 8 °C hőmérsékleten végzett keverés közben folytatjuk le. Ezután a terhelt kovasavat kromatográfiás oszlopba töltjük, és állandó extinkció. érték eléréséig (278 nm) 50 mmól foszfát-pufferrel, 125 mmól nátrium-kloriddal (pH 7,4) mossuk. Az IFN-γ 6-146 aminosav szekvenciájú interferonjának elúcióját 7 mól guanidin-31

196.846 nel, 0,1 tenziddel (poli-oxi-etilén)-szorbitán-mono-laurát), 0,1 mól trisz-sósavval (pH = 7,4) végezzük.

Az eluátumot 0,1 mól trisz-sósavval (pH = 7,4) tizsze- 5 rés térfogatra hígítjuk, és 3—4 órán keresztül 20 °C hőmérsékleten keverjük, miközben renaturáljuk. A dialízist 1000-12000 dalton-os membránnal végezzük, és a dialízist 2 x 10—10 liter 0,6 mól ammónium-hidrogén-karbonáttal szemben, 10 mmól magnézium- . -szulfáttal szemben (pH = 8) és I x 10 liter (0,6 mól) ^uammónium-hidrogén-karbonáttal szemben (pH = 8) végezzük, majd az IFN-γ oldatot összekeverjük 1,5 g szérum albuminnal és fagyasztva szárítjuk. Ily módon 2,1 g liofilizátumot állítunk elő. A liofilizátumban radio-immuno-assay-val 205 x 10’ IFN-γ egységet ha- -jg tároztuk meg (kb 40 mg).

3. példa γ-Interferon savas hasítása mg (géntechnológiailag előállított) γ-interferont 3 ml 70%-os hangyasav oldatban feloldjuk és 16 órán 20 keresztül szobahőmérsékleten keverjük. Ezután az ol datot jeges fürdőben, hűtés közben ammóniás vízzé semlegesítjük és vízzel öt-tízszeres térfogatra hígítjuk. Az így kapott reakcióelegyet 64 mm x 10 mm kromatográfiás kolonnára visszük. A kolonna töltete S-SEPH ÁROSÉ (Fást Glow, Pharmica termék). A kolonnát előzőleg 50 mM HEPES-pufferral (pH = 8) egyensúlyba hozzák. Feltöltés után a kromatográfiás oszlopot állandó alapvonal jelig (280 nm) 50 nm HEPES- 0,3 M NaCl (pH = 8) oldattal mossuk. Ezután a találmány szerint előállított γ-interferont 5 M guanidinnel, 50 mM HEPES (pH = 8) pufferral eluáljuk.

Renaturáláshoz az eluátumot 50 mM HEPES-pufferral (pH = 8) tízszeres térfogatra hígítjuk és 3-4 órán keresztül 20 °C hőmérsékleten keveijük. 50 mM HEPES-pufferral szemben, 4 °C hőmérsékleten és pH « 7,5-n végzett 16 órán dialízis után a protein oldatot tisztára szűrjük, és egy dializáló csőben (ultra dializáló cső OH 100/10, Schleicher JjSchueil termék, elválasztási határ 10000 D) betöményítjük.

Az így kapott protein CPE elektroforézissel WISH-sejtekkel Vesicular Somatitis vírus (USV)-ra specifikus antivirális hatást mutat (2 x l(r egység/mg) és ugyanolyan aktivitású, mint a kiindulási anyag.

(I) DNS-szekvencia

Triplett sz.					0	1	2	3	4	5
Aminosaval	k				Met	Cys	Tyr	Cys	Gin	Asp
Nukleotid s	íz.	1				10			20
Kódoló ág.		5’	AA	TTC	ATG	TGC	TAC	TGC	CAG	GAC
Nem kódol	ó ág.	3’		G	TAC	ACG	ATG	ACG	GTC	CTG
	6	7	8	9	10	11	12	13	14	15
	Pro	Tyr	Val	Lys	G!u	Alá	Glu	Asn	Leu	Lys
		30		40			50
	CCG	TAC	GTT	AAA	GAA	GCT	GAA	AAC	CTG	AAA
	GGC	ATG	CAA	TTT	CTT	CGA	CTT	TTG	GAC	TTT
	16	17	18	19	20	21	22	23	24	25
	Lys	Tyr	Phe	Asn	Alá	Gly	His	Ser	Asp	Val
			60			70			80
	AAA	TAC	TTC	AAC	GCT	GGT	CAT	TCT	GAC	GTT
	TTT	ATG	AAG	TTG	CGA	CCA	GTA-	AGA	CTG	CAA
	26	27	28	29	30	31	32	33	34	35
	Alá	Asp	Asn	Gly	Thr	Leu	Phe	Leu	Gly	Ile
			90			100			110
	GCT	GAC	AAT	GGT	ACT	CTG	TTC	CTG	GGG	ATC
	CGA	CTG	TTA	CCA	TGA	GAC	AAG	GAC	CCC	TAG
	36	37	38	39	40	41	42	43	44	45
	Leu	Lys	Asn	Trp	Lys	Glu	Glu	Ser	Asp	Arg
			120			130			140
	CTG	AAA	AAC	TGG	A\A	GAA	GAA	TCT	GAC	CGT
	GAC	TTT	TTG	ACC	TTT	CTT	CTT	AGA	CTG	GCA
	46	47	48	49	50	51	52	53	54	55
	Lys	De	Met	Gin	Ser	Gin	Ile	Val	Ser	Phe
		150			160			170
	AAA	ATC	ATG	CAA	TCT	CAG	ATC	GTT	TCT	TTC
	TTT	TAG	TAC	GTT	AGA	GTC	TAG	CAA	AGA	AAG
	56	57	58	59	60	61	62	63	64	65
	Tyr	Phe	Lys	Leu	Phe	Lys	Asn	Phe	Lys	Asp

196.846

180 TAC TTC AAA ATG AAG TTT	190 CTG TTC AAA	200 AAC TTT AAA GAC
GAC AAG	TTT	TTG	AAA TTT	CTG
66 67 68	69 70	71	72	73 74	75
Asp Gin Ser	Ile Gin	Lys	Ser	Val Glu	Thr
210		220		230
GAC CAG TCT	ATC CAG	AAA TCT	GTT GAA ACT
CTG GTC AGA TAG GTC	TTT	AGA CAA CTT	TGA
76 77 78	79 80	81	82	83 84	85
He Lys Glu	Asp Met	Asn	Val	Lys Phe	Phe
240		250		260
ATC AAG GAA GAX ATG	AAC GTT	AAA TTT	TTC
TAG TTC CTT	CTG TAC	TTG	CAA	TTT AAA AAG
86 87 88	89 90	91	92	93 94	95
Asn Ser Asn	Lys Lys	Lys	Arg	Asp Asp	Phe
270		280		290
AAC TCT AAC AAA AAA AAA CGT	GAC GAC TTC
TTG AGA TTG	TTT TTT	TTT	GCA	CTG CTG	AAG

96	97	98	99	100	101	102	103	104	105
Glu	Lys	Leu	Thr	Asn	Tyr	Ser	Val	Thr	Asp
		300			310			320
GAA AAG CTT	ACT	AAC TAC	TCT	GTT	ACT	GAT
CTT	TTC	GAA TGA	TTG	ATG	AGA CAA	TGA	CTA
106	107	108	109	110	111	112	113	114	115
Leu	Asn	Val	Gin	Arg	Lys	Alá	Ile	His	Glu
		330			340			350
TTA	AAC GTT	CAA CGT	AAA GCT	ATC	CAC	GAG
AAT TTG	CAA GTT	GCA	TTT	CGA	TAG	GTG CTC
116	117	118	119	120	121	122	123	124	125
Leu	Ile	Gin	Val	Met	Alá	Glu	Leu	Ser	Pro
		360			370			380
CTC	ATC	CAG	GTT	ATG	GCT	GAA CTG	TCT	CCT
GAG TAG GTC	CAA	TAC	CGA CTT	GAC	AGA GGA
126	127	128	129	130	131	132	133	134	135
Alá	Alá	Lys	Thr	Gly	Lys	Arg	Lys	Arg	Ser

390 400 410

GCA GCT AAA ACT GGT AAA CGT AAA CGT TCC

CGT CGA	TTT	TGA	CCA TTT GCA TTT	GCA AGG
136	137	138	139	140	141	142 143	144	145
Gin	Met	Leu	Phe	Arg	Gly	Arg Arg	Alá	Ser
		420			430	440
CAG	ATG	CTG	TTC	CGC	GGT CGT CGT	GCT	TCT

GTC TAC GAC AAG GCG CCA GCA GCA CGA AGA

146

Gin

450

CAG T A A. TAG 3’

GTC ATT ATC AGC T 5’

196.846

01) DNS-szekvencia

IFN-I·

Met Cys Tyr Cys Gin Asp 5’ AA TTC ATG TGC fAC TGC CAG GAC

3’ G TAC ACG ATG ACG GTC CTG

Eco Rí *---- lb-----lc

Pro Tyr Val Lys Glu Alá Glu Asn Leu Lys CCG TAC GTT AAA GAA GCT GAA AAC CTG AAA GGC ATG CAA TTT CTT CGA CTT TTG GAC TTT ld--------------r

----lg-lc— Tyr

Gly His Ser Asp Val GCTCAT TCT GAC GTT AGA CTG CAA „--_IhLys Tyr .Phe Asn Alá AAA TAC TTC AAC GCT TTT ATG AAG TTG CGA CCA GTA -If-------„

-IIAlá Asp GCT GAC CGA CTG TTA CCA

Asn Gly Thr Leu Phe Leu (Gly) AAT GGT ACT CTG TTC CTG GG

TG A GAC AAG GAC CCC TAG lj

Bam Hi

IFN-II:

(II) DNS-szekvencia

Ila (Gly) Ile G ATC

Bam Hl

Leu Lys Asn Trp CTG AAA AAC TGG GAC TTT TTG ACC

Lys Ile AAA ATC TttItag

Met .Gin Ser Gin ATG CAA TCT CAG TAC GTT AGA GTC

Tyr Phe TAC TTC

ATG AAG

->.

Lys Leu Phe Lys AAA CTG TTC AAA TTT GAC AAG TTT

Lys AAA

TTT CTT CTT AGA CTG CCA

Hb --He-Ile

ATC TAG IldIIc —

Asn AAC TTG

Glu Glu Ser Asp GAA GAA TCT GAC

Arg

CGT

Asp Gin GAC CAG

CTG GTC

Ser Ile Gin Lys TCT ATC CAG AAA AGA TAG GTC TTT

TAG TTC

Lys Glu Asp Met Asn AAG GAA GAC ATG AAC CTT CTG TAC TTG •—:--Val Ser Phe GTT TCT TTC CAA AGA AAG

Iig—

Ser

TCT

AGA

Phe Lys Asp TTT AAA GAC AAA TTT CTG IlfVal Glu Thr GTT GAA ACT CAA CTT TGA UhIli—

Val

GTT

CAA

Lys Phe Phe AAA TTT TTC TTT AAA AAG Ilj---61

196.846

Ilk

Asn Ser Asn AACjTCT AAC TTG AGA TTG

-----_ >

--->

Glu (Lys)

GAA A

CTT TTC Ga HindlII

-------k

Lys Lys Lys Arg Asp Asp Phe. ΑΛΑ AAA AAA CGT GAC GAC TTC TTT TTT TTT GCA CTG CTG AAG *—— ---— III ---------II. DNS-szekvencia

IFN-III:

(Lys) Leu Thr Asn Tyr AG CTT ACT AAC TAC

Hind III A TG A TTG ATG

Illa---Ser Val TCT GTT AGA CAA IHb -----------Thr

ACT

Asp

GAT

TGA CTA lile

Arg

His Glu CAC GAG

Alá Ile GCT ATC CCA TAG

Gli Arg Lys CAA CGT AAA TTG CAA GTT GCA TTT

---III d----------I„_c --------Val Met. Alá

Leu Asn Val TTA AAC GTT

AAT

GTG CTC

Leu Ile Gin CTC.ATC CAG (GAG TAG GTC

Glu

GAA

Leu

CTG

GTT ATG GCT CAA TAC CGA CTT GAC

--Ser Pro TCT CCT AGAÍGGA

--Illg Ala Alá Lys GCA GCT AAA CGT CGA TIT

Arg Lys GCT AAA

The Gly Lys ACT GCT AAA TGA CCA TTT GCA TTT Illh-^;-►

Ilii--Arg Ser CGT TCC GCA AGG

Ilii

Gin Met Leu Phe CAG ATC CTG TTC

Arg

CGC

IHkAla

GTC TAC GAC AAG GCG CCA GCA --Híj ----►

Gly Arg Arg Alá Ser GGT CGT CGT CGT GCT TCT GCA GCA CGA AGA

-Ilii-Gin Stp Stp

CAG TAA TAC 3’

GTC ATT ATC AGC T 5’

Claims

Szabadalmi Igénypontok

1. Eljárás olyan amlnosavszekvenciájú proteinek előállítására, amelyek a humán-7 interferonnak megfelelnek, azonban az N-terminálison ^Pro-val kezdődnek, azzaljellemezve, hogy egy humán-γ-ίηterferon aminosavsorrendjét tartalmazó proteint vagy fúziós proteint proteolitikusan hasítunk és a prolinnal kezdődő N-terminális polipeptidet izoláljuk és renat uraljuk.
2. Az 1. igénypont szerinti eljárás a humán-γ-ΐη55 terferon amínosavszekvencia ⁶Pro-tól ^l46Gln-ig terjedő szekvenciájával rendelkező fehérje előállítására, azzal jellemezve, hogy a megfelelő kiindulási vegyületeket hasítjuk.
3, Az 1. vagy 2. igénypont szerinti eljárás,azzal jellemezve, hogy a hasítást 10-70 °C hőmér60 sékleten végezzük.

196.846
4. Az 1., 2. vagy 3. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a hasítást 20 -60 C hőmérsékleten végezzük.
5. Eljárás az 1. vagy 2. igénypontban meghatározott protein géntechnológiai úton történő előállítására, azzal jellemezve, hogy a kívánt protein amiriosav-szekvenciáját kódoló gént megfelelő vektor5 ba beiktatjuk, ezzel a vektorral megfelelő gazdasejtet transzformálunk, a transzformált gazdasejtet tenyésztjük és a tenyészléből a fehérjét kinyeijük.