HU184814B - Process for preparing cholesterine-esterase - Google Patents
Process for preparing cholesterine-esterase Download PDFInfo
- Publication number
- HU184814B HU184814B HU802067A HU206780A HU184814B HU 184814 B HU184814 B HU 184814B HU 802067 A HU802067 A HU 802067A HU 206780 A HU206780 A HU 206780A HU 184814 B HU184814 B HU 184814B
- Authority
- HU
- Hungary
- Prior art keywords
- dsm
- cholesterol
- lecithin
- streptomyces
- medium
- Prior art date
Links
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title claims description 4
- 108010055297 Sterol Esterase Proteins 0.000 claims abstract description 17
- 102000000019 Sterol Esterase Human genes 0.000 claims abstract description 17
- 244000005700 microbiome Species 0.000 claims abstract description 16
- 239000000787 lecithin Substances 0.000 claims abstract description 12
- 235000010445 lecithin Nutrition 0.000 claims abstract description 12
- IIZPXYDJLKNOIY-JXPKJXOSSA-N 1-palmitoyl-2-arachidonoyl-sn-glycero-3-phosphocholine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP([O-])(=O)OCC[N+](C)(C)C)OC(=O)CCC\C=C/C\C=C/C\C=C/C\C=C/CCCCC IIZPXYDJLKNOIY-JXPKJXOSSA-N 0.000 claims abstract description 11
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims abstract description 11
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims abstract description 11
- 229940067606 lecithin Drugs 0.000 claims abstract description 11
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 10
- 239000000411 inducer Substances 0.000 claims abstract description 7
- 241000589516 Pseudomonas Species 0.000 claims description 7
- 239000008347 soybean phospholipid Substances 0.000 claims description 5
- PZNPLUBHRSSFHT-RRHRGVEJSA-N 1-hexadecanoyl-2-octadecanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCC(=O)O[C@@H](COP([O-])(=O)OCC[N+](C)(C)C)COC(=O)CCCCCCCCCCCCCCC PZNPLUBHRSSFHT-RRHRGVEJSA-N 0.000 claims description 3
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 claims description 3
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 claims description 3
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 claims description 3
- 239000002609 medium Substances 0.000 abstract description 12
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 abstract description 4
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 abstract description 3
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 abstract description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 17
- HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N cholesterol Chemical compound C1C=C2C[C@@H](O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H]([C@H](C)CCCC(C)C)[C@@]1(C)CC2 HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N 0.000 description 11
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 10
- 241000187747 Streptomyces Species 0.000 description 6
- 235000012000 cholesterol Nutrition 0.000 description 6
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 6
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 6
- 241000222120 Candida <Saccharomycetales> Species 0.000 description 4
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000589540 Pseudomonas fluorescens Species 0.000 description 4
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 4
- 150000001840 cholesterol esters Chemical class 0.000 description 4
- 241000228212 Aspergillus Species 0.000 description 3
- 241000222122 Candida albicans Species 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N Hydrogen peroxide Chemical compound OO MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- RJECHNNFRHZQKU-UHFFFAOYSA-N Oelsaeurecholesterylester Natural products C12CCC3(C)C(C(C)CCCC(C)C)CCC3C2CC=C2C1(C)CCC(OC(=O)CCCCCCCC=CCCCCCCCC)C2 RJECHNNFRHZQKU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229940095731 candida albicans Drugs 0.000 description 3
- RJECHNNFRHZQKU-RMUVNZEASA-N cholesteryl oleate Chemical compound C([C@@H]12)C[C@]3(C)[C@@H]([C@H](C)CCCC(C)C)CC[C@H]3[C@@H]1CC=C1[C@]2(C)CC[C@H](OC(=O)CCCCCCC\C=C/CCCCCCCC)C1 RJECHNNFRHZQKU-RMUVNZEASA-N 0.000 description 3
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010089254 Cholesterol oxidase Proteins 0.000 description 2
- 229910021591 Copper(I) chloride Inorganic materials 0.000 description 2
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N Ethylene glycol Chemical compound OCCO LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N Iron Chemical compound [Fe] XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- OXBLHERUFWYNTN-UHFFFAOYSA-M copper(I) chloride Chemical compound [Cu]Cl OXBLHERUFWYNTN-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000000287 crude extract Substances 0.000 description 2
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 2
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 2
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 2
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- RYHBNJHYFVUHQT-UHFFFAOYSA-N 1,4-Dioxane Chemical compound C1COCCO1 RYHBNJHYFVUHQT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JLPULHDHAOZNQI-ZTIMHPMXSA-N 1-hexadecanoyl-2-(9Z,12Z-octadecadienoyl)-sn-glycero-3-phosphocholine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP([O-])(=O)OCC[N+](C)(C)C)OC(=O)CCCCCCC\C=C/C\C=C/CCCCC JLPULHDHAOZNQI-ZTIMHPMXSA-N 0.000 description 1
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O Ammonium Chemical compound [NH4+] QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 1
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 description 1
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000016938 Catalase Human genes 0.000 description 1
- 108010053835 Catalase Proteins 0.000 description 1
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M Chloride anion Chemical compound [Cl-] VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N Copper Chemical compound [Cu] RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000235555 Cunninghamella Species 0.000 description 1
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 description 1
- 108090001090 Lectins Proteins 0.000 description 1
- 102000004856 Lectins Human genes 0.000 description 1
- WHXSMMKQMYFTQS-UHFFFAOYSA-N Lithium Chemical compound [Li] WHXSMMKQMYFTQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N Magnesium Chemical compound [Mg] FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001149951 Mucor mucedo Species 0.000 description 1
- 241000228143 Penicillium Species 0.000 description 1
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 1
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 1
- 241000204087 Pseudonocardia autotrophica Species 0.000 description 1
- 241000235527 Rhizopus Species 0.000 description 1
- 241000187563 Rhodococcus ruber Species 0.000 description 1
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 1
- 241000186988 Streptomyces antibioticus Species 0.000 description 1
- 241000520747 Streptomyces canescens Species 0.000 description 1
- 241000187130 Streptomyces chartreusis Species 0.000 description 1
- 241000936751 Streptomyces cyaneofuscatus Species 0.000 description 1
- 241000936713 Streptomyces griseomycini Species 0.000 description 1
- 241000936729 Streptomyces hachijoensis Species 0.000 description 1
- 241000946855 Streptomyces malachiticus Species 0.000 description 1
- 241000946864 Streptomyces michiganensis Species 0.000 description 1
- 241001468239 Streptomyces murinus Species 0.000 description 1
- 241000187179 Streptomyces tendae Species 0.000 description 1
- 241000946767 Streptomyces toxytricini Species 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 1
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 description 1
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 1
- HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N Zinc Chemical compound [Zn] HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- -1 acetone or ethanol Chemical compound 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- 229910001413 alkali metal ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 125000000217 alkyl group Chemical group 0.000 description 1
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 125000003710 aryl alkyl group Chemical group 0.000 description 1
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 1
- 238000012742 biochemical analysis Methods 0.000 description 1
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 1
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 1
- 108010023417 cholesterol dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 239000000470 constituent Substances 0.000 description 1
- 229910052802 copper Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010949 copper Substances 0.000 description 1
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 description 1
- 239000012043 crude product Substances 0.000 description 1
- 239000012531 culture fluid Substances 0.000 description 1
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 1
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- AIUDWMLXCFRVDR-UHFFFAOYSA-N dimethyl 2-(3-ethyl-3-methylpentyl)propanedioate Chemical class CCC(C)(CC)CCC(C(=O)OC)C(=O)OC AIUDWMLXCFRVDR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000008344 egg yolk phospholipid Substances 0.000 description 1
- 125000004185 ester group Chemical group 0.000 description 1
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 description 1
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 description 1
- 150000004665 fatty acids Chemical class 0.000 description 1
- 235000013312 flour Nutrition 0.000 description 1
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- WGCNASOHLSPBMP-UHFFFAOYSA-N hydroxyacetaldehyde Natural products OCC=O WGCNASOHLSPBMP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000007654 immersion Methods 0.000 description 1
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 1
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 1
- 229910052742 iron Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002523 lectin Substances 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 229910052744 lithium Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910052749 magnesium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011777 magnesium Substances 0.000 description 1
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 1
- 230000001590 oxidative effect Effects 0.000 description 1
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 1
- 229940066779 peptones Drugs 0.000 description 1
- 229940051841 polyoxyethylene ether Drugs 0.000 description 1
- 229920000056 polyoxyethylene ether Polymers 0.000 description 1
- 230000001376 precipitating effect Effects 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 229940083466 soybean lecithin Drugs 0.000 description 1
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 1
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 1
- 108010085346 steroid delta-isomerase Proteins 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 1
- 150000005846 sugar alcohols Polymers 0.000 description 1
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 239000011573 trace mineral Substances 0.000 description 1
- 235000013619 trace mineral Nutrition 0.000 description 1
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 1
- 229910052725 zinc Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011701 zinc Substances 0.000 description 1
- NWONKYPBYAMBJT-UHFFFAOYSA-L zinc sulfate Chemical compound [Zn+2].[O-]S([O-])(=O)=O NWONKYPBYAMBJT-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 235000009529 zinc sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 239000011686 zinc sulphate Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
- C12N9/18—Carboxylic ester hydrolases (3.1.1)
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Steroid Compounds (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Description
A találmány tárgya eljárás koleszterinészteráz előállítására mikroorganizmusok segítségével, lecitint tartalmazó táptalajban.
A koleszterinészteráz fontos szerepet játszik a klinikai és a biokémiai analitikában, mióta koleszterin enzimatikus meghatározására eljárásokat dolgoztak ki. Mivel biológiai anyagban a koleszterin nagy része észterek formájában fordul elő, koleszterinészteráz és koleszterint oxidáló enzimek, például koleszterinoxidáz vagy koleszteríndehidrogenáz együttes alkalmazása koleszterin-észterek teljesen enzimatikus meghatározását is lehetővé teszi. Ez a 2 264 847 sz. német szövetségi köztársaságbeli szabadalmi leírásból ismeretes. Á koleszterinészteráz-meghatározás keretén belül különösen előnyösnek bizonyult emellett a mikroorganizmusokból kinyert enzim. (25 06 712,3 sz. német szövetségi köztársaságbeli nyilvánosságra hozatali irat). A feldolgozásra érdemes koleszterinészteráz-tartalommal rendelkező eddig felfedezett mikroorganizmusok hátránya azonban a viszonylag alacsony kitermelés a kapott enzimaktivitásra számítva.
Az ismert eljárások esetében a tenyésztés rendszerint olyan táptalajon történik, amely valamilyen induktort tartalmaz. „Induktor”-on itt olyan anyagot értünk, amely a mikroorganizmust arra ösztönzi, hogy a kívánt enzimet kizárólagosan vagy nagyobb mennyiségben termelje, mint induktor nélkül. A mikroorganizmusoknak rendszerint nincs szükségük koleszterinészterázra, mivel elegendő más tápanyag áll rendelkezésükre, és egy szükségtelen enzim képződése a sejtnek nem gazdaságos. Az induktorok ezért koleszterin-észterek vagy kémiailag hasonló vegyületek.
Meglepő módon azt észleltük, hogy egy bizonyos, a koleszterin-észterektől kémiailag távol álló induktor alkalmazásakor többszörösen nagyobb aktivitást érhetünk el, mint ami eddig lehetséges volt. A koleszterinészteráz mikroorganizmusokból való kinyerésére szolgáló találmány szerinti eljárásra ezért az jellemző, hogy egy koleszterinészteráz-képzésre képes mikroorganizmust alkalmas táptalajban leeitin induktor jelenlétében tenyésztünk, és az enzimet a tenyészet folyadékából vagy/és a sejtekből kinyerjük.
Előnyösen a találmány szerint hozzáadott induktort szénforrásként, főleg egyedüli szénforrásként is alkalmazzuk. Lehet azonban külön szénforrásokat is hozzáadni, például kukorica áztatóvizet, peptonokat, élesztőextraktumot valamint kevésbé alkalmasan, cukrokat vagy polialkoholokat, például glicerint. A különböző lecitinek közül különösen alkalmasnak bizonyult a szójalecitin, de más lecitinféleségek. például tojáslecitin vagy agyvelőlecitin is jó eredményeket adtak.
A hozzáadott lecitinmennyiség általában a táptalaj térfogatára vonatkoztatott 0,1 és 5 súly% között van. Leeitin induktorként és egyedüli szénforrásként való alkalmazásakor különösen jó eredményeket 0,5—2 súly%nyí mennyiségnél kaptunk.
A találmány részére elvileg minden olyan mikroorganizmus megfelel, amely feldolgozásra alkalmas mennyiségben képes koleszterinészterázt termelni. Ilyen mikroorganizmusok nagy számban ismertek. Alkalmasak például a következők:
Candida rugósa ATCC 14830
Rhizopus spec. DSM 695
Aspergillus spec. DSM 698
Streptomyces aureoverticillium DSM 40080
| Streptomyces cyaneofuscatus | DSM 40148 |
| Streptomyces griseomycini | DSM 40159 |
| Streptomyces longisporus-fl. | DSM40165 |
| Streptomyces malachiticus | DSM40167 |
| Streptomyces roseoius | DSM 40174 |
| Streptomyces toxytricíni | DSM40178 |
| Streptomyces variábilis | DSM40179 |
| Streptomyces spec. | DSM 687 |
| Streptomyces autotrophicus | DSM40011 |
| Streptomyces canescens | DSM 40528 |
| Streptomyces chartreusis | DSM 40085 |
| Streptomyces michiganensis | DSM40015 |
| Streptomyces murinus | DSM40091 |
| Streptomyces hachijoensis | DSM 40114 |
| Streptomyces caelestes | DSM 40084 |
| Streptomyces tendae | DSM40101 |
| Nocardia rubra | DSM 43008 |
| Candida myeoderma | DSM 688 |
| Candida albicans | DSM 689 |
| Candida albicans | DSM 690 |
| Candida albicans | DSM 691 |
| Candida spec. | DSM 692 |
| Cunninghamella elegáns | DSM 693 |
| Mucor mucedo | DSM 694 |
| Penicillium spec. | DSM 696 |
| Aspergillus spec. | DSM 697 |
| Pseudomonas fluorescems | ATCC 31156 |
| Pseudomonas fluorescens | IÁM 1051 |
| Pseudomonas fluorescens | ATCC 948 |
| Pseudomonas fluorescens | KY 4032 |
| Pseudomonas fluorescens | IF0 3081 |
| Pseudomonas spec. | IÁM 18002 és 180001 |
Különösen előnyös a Pseudomonas spec. DSM 1280 és 1281.
Egy különösen előnyös táptalaj, amely különösen a Pseudomonas fajok részére alkalmas, ezenkívül még szokásosan hozzáadott sókat és nyomelemeket tartalmaz, és pH-ját alkalmas puffer hozzáadásával 5 és 9 közötti pH-értékre, előnyösen 6 és 8 közötti pH-értékre kell beállítani. Pufféiként foszfátpuffer előnyös. A táptalaj ezenkívül még ammónium-, klorid-, vas-, réz-, cink-, magnézium- és kalcium-ionokat is tartalmaz, eltekintve a foszfátpuffer alkálifém-ionjaitól. A foszfát célszerűen 0,4 és 2 súly% közötti koncentrációban fordul elő, alkalmazható azonban nagyobb vagy kisebb koncentráció is.
A találmány szerint egyik különösen előnyös táptalaj körülbelül a következő összetételű, 1 liter folyadékra vonatkoztatva:
5-10 g, előnyösen 6-8 gNa2HPO4 · 2 H2O;
1-5 g, előnyösen 2-4 g KH2PO4 ;
0,2-2 g, előnyösen 0,8-1,2 g NH4C1;
0,01-0,1 g, előnyösen 0,03-0,07 gNaCl;
0,01-1 ml 1 %-os Fedj -oldat;
0,01-1 m! 0,2 %-os CuCl2-oldat;
0,01—1 ml 1 %-os cink-szulfát oldat;
0,1—10ml 10%-os CaCi2-oldat;
1-20 ml, előnyösen 3—10 ml 12 %-os MgS04-oldat;
0,1—5 súly%, előnyösen 0,5—2 súly% szójalecitin.
A különösen előnyös mikroorganizmusok tenyésztését a fenti táptalajokban aerob körülmények között végezzük. Megfelelők mind rázatott tenyészetek mind levegőztetett merített tenyészetek. A hőmérséklet körülbelül 15 és 45 °C között lehet, előnyösen 25—35 °C-on.
184 814
Maximális enzimkitermelést általában már 1-2 napos tenyésztés után kapunk.
A koleszterinészteráz lehet mind a fermentiében mind a sejtekben. Felületaktív anyagok, különösen nem íonogén szerek - amelyek előnyösen alkil- és aralkil-csoportokat tartalmazó poiioxietilén-éter és -észter típusokhoz tartoznak — hozzáadásával sok mikroorganizmusnál befolyásolható a fermentlé és a sejtek közötti megoszlási arány, rendszerint az extracelluláris aktivitásnak az intracelluláris aktivitás terhére való növekedése irányában, ionogén felületaktív szerek esetében a megoszlás változása viszont általában fordított irányban megy végbe.
A befejezett tenyésztés után a koleszterínészterázt szokásos módszerekkel különítjük el a sejttömegből és/vagy a fermentlé szűrletéből, és adott esetben tisztítjuk. Számos célra megfelel azonban már egy tisztítatlan nyerstermék is, amely lényegében csak feltárt sejttömegből áll. Feltárás céljára a szakemberek által ismert módszerek alkalmasak, amelyek itt közelebbi magyarázatot nem igényelnek. Mind a fermentlé szűrletéből mind a feltárt sejttömegből az oldatlan alkotórészek elválasztása után az enzim szokásos lecsapószerekkel, például sókkal, így ammónium-szulfáttal, vagy szerves oldószerekkel, így acetonnal vagy etanollal kicsapható, és utána a szokásos frakcionálási módszerek, például kromatográfia és kicsapás, alkalmazásával tovább tisztítható.
A következő példák a találmányt tovább magyarázzák.
1. példa
Mélyhűtött ampullából, ferde táptalajról vett Pseudomonas spec. DSM 128O-at főtenyészet-táptalajon (rázólombikban) két napon át 30 °C-on aerob előtenyésztünk, és azután 10 %-nyit áttoltunk egy olyan táptalajra, amely literenként a következő összetevőket tartalmazza:
7g Na2HP04 · 2H2O,
3g KH2PO4, g NUtCl,
0,05 g NaCl,
0,1 ml 1 %-os FeCl3 oldat, , 0,1 ml 0,2 %-os CuCl2 oldat,
0,1 ml 1 %-os ZnSO4 oldat,
1,0 ml 10 %-os CaCl2 oldat,
5,0 ml 12 %-os MgSO4 oldat,
1,5 % szója-lecitin, pH 7,0.
A tenyésztés 30 °C-on aerob körülmények között, rázólombikban történik. 1—3 nap múlva körülbelül 15000 egység/liter aktivitást kapunk. (Felülúszó és biomassza; szubsztrát: koleszteril-oleát).
Amennyiben lecitint nem alkalmazunk, úgy 20 egység/liter a kapott aktivitás.
Körülbelül hasonló kitermeléseket kapunk, ha azonos körülmények között Pseudonionas spec. DSM 1280 helyett Pseudomonas spec. DSM 1281-et alkalmazunk.
2. példa
Az 1. példa szerint kapott fermentlébÖl az oldatlan sejttömeget leceutrifugáljuk, és koleszterinészter-meghatározáshoz elkészítjük, A meghatározás a következő reakcióegyenletek szerint történik·
1. koleszterin-észter + H20 -—-'——-—-^koleszterin + zsírsav .
2. koleszterin +1/2 0, kol-'oxldáz/k^g»kole5ztenon + H2O2 (A kolesztenon képződés mérése 240 nm-nél.) A méréshez a következő oldatokat használjuk:
1. 0,5 mólos, 7,5 pH-jú foszfátpuffer, 0,4 % Thesit;
2. koleszterin-oleát, c=4, Thesit/dioxán (v/v - 1/1)ben,
3. kb. 0,6 mólos lűdrogén-peroxid oldat (5 ml perhidrol/100 ml);
4. kataláz(0,01 mgprotein/ml);
5. koleszterin-oxidáz (legalább 50 egység/ml);
6. fermentlé (körülbelül 5000 egység/liternél 1:5 hígítás vízzel, vizsgálatra 0,01 ml).
A meghatározáshoz 2,95 ml 1. oldatot 0,02 ml 3. oldattal elegyítünk. Hozzáadunk 5 perc múlva 0,01 ml 6. oldatot és 0,02 ml 5. oldatot, és 1 perc múlva 0,1 ml 2. oldat hozzáadásával beindítjuk a reakciót.
A számítást a következőképp végezzük:
3’^,5^ θΤ ' R/Perc ~ egység/liter fermentlé.
3. példa
Mélyhűtött ampullából, ferde táptalajról vett Candida rugósa ATCC 14830-at okunk az alábbi összetételű táptalajra, ás 48 órán át 28—30 °C-on aerob körülmények között (rázólombik20/100) tenyésztjük.Utána 10% inokulummal beoltjuk a következő összetételű táptalajt (adatok 1 literre):
g szójaliszt GeFu 988 SUP, g oldható keményítő,
5g K2HPO4-3H2O, g MgSO4 · 7 H2O, lg (NH,)2SO4,
1,5 g szójalecitín, pH 6,6-6,8.
A tenyésztést körülbelül 28 °C-on végezzük, aerob körülmények között. 3—4 nap múlva 1500-2000 egység/’iter aktivitást kapunk. (Felülúszó; szubsztrát: koleszteril-oleát).
Amennyiben a táptalaj lecitint nem tartalmaz, úgy az elért aktivitás 200 egység/liter.
4. példa
Streptomyces antibioticus ATCC 14 888 alkalmazásá,val végezve a tenyésztési kísérleteket, lecitin jelenlétében 163 egység/liter aktivitást kapunk. Lectin nélkül végezve a tenyésztést, aktivitás nem mutatható ki.
J. példa
Aspergillus spec. DSM 698-at tenyésztünk 500 ml-es Eríenmeyer-lombikban 100 ml táptalajon, amit Saboraund-agarral oltunk be. A tenyésztést 7 napig végezzük, 28 °C-on, rázás közben.
A táptalaj összetétele, 1 literre:
3,0 g NaN03
0.5 g MgSO4
0,5 g KC1
0,01 g FeSO4
1,0 g K2HPO4
10,0 g szója-lecitin (Roíh-cég gyártmánya), pH: 7,2-7,4.
A nyers extraktum felülúszóból 95 egység/liter koleszterinészterázt (illetve a tenyészet felülúszóból 63 egység/liter koleszterinészterázt) kapunk. A nyers extraktum előállítására 2 ml össz-tenyészetet 2 ml üveggyönggyel 2 percig kezelünk Omnimixeren, majd centrifugáljuk.
A lecitin nélküli (+2 % szacharóz) tenyésztéseknél nem találtunk aktivitást.
814 2
Claims (4)
1. Eljárás koleszterinészteráz előállítására, mikroorganizmusok segítségével, azzal jellemezve, hogy a koleszte5 rinészteráz-képzésre képes mikroorganizmust alkalmas, előnyösen foszfátot is tartalmazó táptalajon 0,5-2 súly% lecitin induktor jelenlétében tenyésztjük, és az enzimet a fermentléből vagy/és a sejtekből kinyeijük.
2. Az 1. igénypont szerinti eljárás foganatosítási
10 módja, azzal jellemezve, hogy szója-lecitint adunk a táptalajhoz.
3. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti eljárás foganatosítási módja, azzal jellemezve, hogy a táptalajhoz 0,4-2 súly% foszfátot is adunk.
1g
4. Az 1-3. igénypont bármelyike szerinti eljárás foganatosítási módja, azzal jellemezve, hogy mikroorganizmusként Pseudomonas spec. DSM 1280-at vagy DSM 1281-et alkalmazunk.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE19792933646 DE2933646A1 (de) | 1979-08-20 | 1979-08-20 | Verfahren zur gewinnung von cholesterinesterase |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| HU184814B true HU184814B (en) | 1984-10-29 |
Family
ID=6078850
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| HU802067A HU184814B (en) | 1979-08-20 | 1980-08-19 | Process for preparing cholesterine-esterase |
Country Status (10)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4343903A (hu) |
| EP (1) | EP0024345B1 (hu) |
| JP (1) | JPS5642587A (hu) |
| AT (1) | ATE4326T1 (hu) |
| DD (1) | DD154021A5 (hu) |
| DE (2) | DE2933646A1 (hu) |
| DK (1) | DK148362C (hu) |
| HU (1) | HU184814B (hu) |
| IL (1) | IL60448A (hu) |
| ZA (1) | ZA805073B (hu) |
Families Citing this family (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE3200274A1 (de) * | 1982-01-07 | 1983-07-14 | Boehringer Mannheim Gmbh, 6800 Mannheim | Verfahren zur stabilisierung waessriger loesungen von cholesterinesterase aus pseudomonaden |
| DE3340950A1 (de) * | 1983-11-11 | 1985-05-23 | Boehringer Mannheim Gmbh, 6800 Mannheim | Verfahren zur gewinnung von cholesterinesterase |
| DE3447390A1 (de) * | 1984-12-24 | 1986-07-03 | Boehringer Mannheim Gmbh, 6800 Mannheim | Verfahren zur gewinnung von cholesterinesterase |
| JPH0714342B2 (ja) * | 1990-08-10 | 1995-02-22 | 田辺製薬株式会社 | エステラーゼの製法 |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE2315501C3 (de) * | 1973-03-28 | 1980-02-21 | Boehringer Mannheim Gmbh, 6800 Mannheim | Verfahren zur Bestimmung von Cholesterin |
| JPS50157588A (hu) * | 1974-06-17 | 1975-12-19 | ||
| US4052263A (en) * | 1975-12-11 | 1977-10-04 | Eastman Kodak Company | Production of cholesterol esterase using Nocardia cholesterolicum |
| JPS55113074A (en) * | 1979-02-24 | 1980-09-01 | Konishiroku Photo Ind Co Ltd | Developing device for electrophotographic copier |
-
1979
- 1979-08-20 DE DE19792933646 patent/DE2933646A1/de not_active Withdrawn
-
1980
- 1980-06-30 IL IL60448A patent/IL60448A/xx unknown
- 1980-07-24 DK DK319180A patent/DK148362C/da not_active IP Right Cessation
- 1980-08-06 US US06/175,808 patent/US4343903A/en not_active Expired - Lifetime
- 1980-08-13 EP EP80104796A patent/EP0024345B1/de not_active Expired
- 1980-08-13 AT AT80104796T patent/ATE4326T1/de not_active IP Right Cessation
- 1980-08-13 DE DE8080104796T patent/DE3064409D1/de not_active Expired
- 1980-08-18 DD DD80223375A patent/DD154021A5/de unknown
- 1980-08-19 JP JP11307580A patent/JPS5642587A/ja active Granted
- 1980-08-19 ZA ZA00805073A patent/ZA805073B/xx unknown
- 1980-08-19 HU HU802067A patent/HU184814B/hu unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| DK148362C (da) | 1985-11-04 |
| ATE4326T1 (de) | 1983-08-15 |
| DD154021A5 (de) | 1982-02-17 |
| IL60448A (en) | 1983-05-15 |
| ZA805073B (en) | 1981-09-30 |
| EP0024345A1 (de) | 1981-03-04 |
| JPS5642587A (en) | 1981-04-20 |
| DE3064409D1 (en) | 1983-09-01 |
| JPS5733946B2 (hu) | 1982-07-20 |
| DE2933646A1 (de) | 1981-03-26 |
| DK319180A (da) | 1981-02-21 |
| US4343903A (en) | 1982-08-10 |
| EP0024345B1 (de) | 1983-07-27 |
| DK148362B (da) | 1985-06-17 |
| IL60448A0 (en) | 1980-09-16 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| IL34956A (en) | Production of lipase | |
| US4052263A (en) | Production of cholesterol esterase using Nocardia cholesterolicum | |
| US4985364A (en) | Preparation of cyclopropanecarboxylic acids | |
| US4387163A (en) | Process for producing the enzyme cholesterol esterase and for hydrolyzing cholesterol esters of fatty acids by using the enzyme itself | |
| US4698306A (en) | Process for producing peroxidase | |
| HU184814B (en) | Process for preparing cholesterine-esterase | |
| JP2788174B2 (ja) | 新規なクレアチンアミジノハイドロラーゼ及びその製造法 | |
| US4420562A (en) | Method for producing creatinase | |
| US4062731A (en) | Production of uricase from micrococcus luteus | |
| US4360596A (en) | Process for the preparation of cholesterol esterase | |
| JP2926249B2 (ja) | アルギン酸リアーゼの製造法 | |
| JPS6362195B2 (hu) | ||
| JP3076856B2 (ja) | 細菌によるアルギン酸の分解法 | |
| DE3025424C2 (de) | Verfahren zur Herstellung von Galactoseoxidase | |
| US4275162A (en) | Process for the production of sphingomyelinase | |
| JPS6243671B2 (hu) | ||
| JP3152855B2 (ja) | 新規なソルビトールデヒドロゲナーゼ、その製造方法並びに該酵素を用いたソルビトールの定量のための試薬及び方法 | |
| KR0136299B1 (ko) | 미생물세포벽 용해효소와 그의 생산 미생물 | |
| JPS58152481A (ja) | 新規なホスホリパ−ゼｄ−ｐおよびその製造法 | |
| US3813319A (en) | Process for the manufacture of proteases | |
| JPH07227276A (ja) | リパーゼ、これを産生する微生物及び該微生物の取得方法 | |
| JPH0614772A (ja) | 新規エステル分解酵素ａおよびその製造方法 | |
| SU958498A1 (ru) | Способ получени @ -маннаназы | |
| JPH0789913B2 (ja) | リパ−ゼａｍｌの製造法 | |
| KR930008972B1 (ko) | 신균주 슈도모나스속 y-132 및 이로부터 생산되는 글루타릴-7-아미노세팔로스포린산 아실라아제 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| HU90 | Patent valid on 900628 |