HK40119238A - 经修饰的抗体和其用途 - Google Patents

Description

经修饰的抗体和其用途

技术领域

本公开总体上涉及经修饰的抗体和其用途。

背景技术

目前，单克隆抗体已被用作特异性和有效的生物药物，所述生物药物可以显示出对单个靶抗原的出色特异性。然而，对于一些情况，对两种(或更多种)不同靶抗原具有特异性的单个抗体——通常被称为双特异性抗体(或多特异性抗体)，是优选的。双特异性或多特异性抗体可以同时识别两种或更多种不同的抗原，中和不同的致病性介体，募集不同类型的效应细胞并且调节信号通路，这使它们在许多方面优于单特异性抗体。在此类情况下，开发双特异性或多特异性抗体作为人类疾病的治疗剂具有重要的临床显著性，并且双特异性抗体近年来已经成为诊断和治疗应用中广泛使用的形式。

然而，双特异性或多特异性抗体的产生仍具挑战性。在双特异性抗体的情况下，对一种抗原具有特异性的重链必须与对同一抗原具有特异性的轻链配对。如果重链与对其它不同抗原具有特异性的轻链配对，那么预期的抗原特异性可能被破坏或降低。因为仍然不可能很好地控制轻链与具有天然IgG结构的对应重链之间的正确配对，所以将另外的抗体特异性引入到单个抗体的努力经常引起错误组装抗体的产生。

仍然需要产生具有多于一种特异性的新型经修饰的抗体。

发明内容

一方面，本公开提供了一种抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包括第一臂和第二臂，所述第一臂由第一重链和第一轻链以及在其间形成的链间二硫键形成，所述第二臂由第二重链和第二轻链以及在其间形成的链间二硫键形成，其中所述第一重链上的至少一个非半胱氨酸残基被半胱氨酸取代，其中所述非半胱氨酸残基位于选自由以下组成的组的位置处：所述第一重链的氨基酸位置126、128、129、136、141、168、170、173、175或187；并且所述第一轻链上的至少一个非半胱氨酸残基被半胱氨酸取代，其中所述非半胱氨酸残基位于选自由以下组成的组的位置处：所述第一轻链的氨基酸位置114、116、118、124、135、137、138、160、162或164。

在一些实施方式中，所述第一重链上被半胱氨酸取代的所述至少一个非半胱氨酸残基选自由以下组成的组：所述第一重链的氨基酸残基F126、L128、A129、S136、A141、H168、F170、V173、Q175或T187；并且所述第一轻链上被半胱氨酸取代的所述至少一个非半胱氨酸残基选自由以下组成的组：所述第一轻链的氨基酸残基S114、F116、F118、Q124、L135、N137、N138、Q160、S162或T164。

在一些实施方式中，所述第一轻链和所述第一重链包括所述第一轻链上的天然半胱氨酸和所述第一重链上的天然半胱氨酸的至少一个非半胱氨酸取代对以及至少一个选自由以下组成的组的半胱氨酸取代对：(i)位于轻链上的S114C和位于重链上的S136C；(ii)位于轻链上的F116C和位于重链上的S136C；(iii)位于轻链上的F118C和位于重链上的L128C；(iv)位于轻链上的F118C和位于重链上的A129C；(v)位于轻链上的F118C和位于重链上的A141C；(vi)位于轻链上的Q124C和位于重链上的F126C；(vii)位于轻链上的L135C和位于重链上的F170C；(viii)位于轻链上的N137C和位于重链上的F170C；(ix)位于轻链上的N138C和位于重链上的H168C；(x)位于轻链上的Q160C和位于重链上的V173C；(xi)位于轻链上的Q160C和位于重链上的Q175C；(xii)位于轻链上的S162C和位于重链上的F170C；(xiii)位于轻链上的S162C和位于重链上的T187C；以及(xiv)位于轻链上的T164C和位于重链上的F170C；其中所述至少一个半胱氨酸取代对在所述第一重链与所述第一轻链之间形成至少一个链间二硫键；其中所述第一重链和所述第一轻链上的所述天然半胱氨酸独立地被非半胱氨酸残基中的任一者取代。

在一些实施方式中，所述第一重链和所述第一轻链上的所述天然半胱氨酸独立地被丝氨酸、丙氨酸、甘氨酸或缬氨酸中的任一者取代。在一些实施方式中，待取代的所述天然半胱氨酸是所述抗体的轻链中的氨基酸残基C214和重链中的氨基酸残基C220。在一些实施方式中，所述第一轻链包括突变C214S，并且所述第一重链包括突变C220S。

在一些实施方式中，所述第一重链和所述第一轻链包括一个半胱氨酸取代对。在一些实施方式中，所述第一重链和所述第一轻链包括两个半胱氨酸取代对。

在一些实施方式中，所述两个半胱氨酸取代对选自由以下组成的组：(i)位于轻链上的S114C/Q160C和位于重链上的S136C/V173C；(ii)位于轻链上的F118C/Q124C和位于重链上的L128C/F126C；(iii)位于轻链上的F118C/Q124C和位于重链上的A129C/F126C；(iv)位于轻链上的F118C/Q124C和位于重链上的A141C/F126C；(v)位于轻链上的F116C/Q124C和位于重链上的S136C/F126C；(vi)位于轻链上的Q124C/T164C和位于重链上的F126C/F170C；(vii)位于轻链上的Q124C/N138C和位于重链上的F126C/H168C；(viii)位于轻链上的Q160C/L135C和位于重链上的Q175C/F170C；(ix)位于轻链上的S114C/S162C和位于重链上的S136C/F170C；(x)位于轻链上的F118C/S162C和位于重链上的L128C/F170C；(xi)位于轻链上的F118C/S162C和位于重链上的A141C/F170C；(xii)位于轻链上的Q124C/S162C和位于重链上的F126C/F170C；(xiii)位于轻链上的N137C/S162C和位于重链上的F170C/T187C。

在一些实施方式中，所述第一轻链包括突变Q124C/T164C/C214S，并且所述第一重链包括突变F126C/F170C/C220S。在一些实施方式中，所述第一轻链包括突变Q124C/S162C/C214S，并且所述第一重链包括突变F126C/F170C/C220S。

在一些实施方式中，所述第二重链与所述第二轻链之间的二硫键在所述第二轻链上的天然半胱氨酸与所述第二重链上的天然半胱氨酸之间形成；其中所述天然半胱氨酸在所述第二轻链上的位置与人κ链上的位置C214相对应，并且所述天然半胱氨酸在所述第二重链上的位置与人IgG1上的位置C220相对应。

在一些实施方式中，所述第二轻链和所述第二重链包括至少一个非半胱氨酸取代对，其中所述轻链上的天然半胱氨酸取代为丝氨酸和所述重链上的天然半胱氨酸取代为丝氨酸，以及至少一个选自由以下组成的组的半胱氨酸取代对：(i)位于轻链上的S114C和位于重链上的S136C；(ii)位于轻链上的F116C和位于重链上的S136C；(iii)位于轻链上的F118C和位于重链上的L128C；(iv)位于轻链上的F118C和位于重链上的A129C；(v)位于轻链上的F118C和位于重链上的A141C；(vi)位于轻链上的Q124C和位于重链上的F126C；(vii)位于轻链上的L135C和位于重链上的F170C；(viii)位于轻链上的N137C和位于重链上的F170C；(ix)位于轻链上的N138C和位于重链上的H168C；(x)位于轻链上的Q160C和位于重链上的V173C；(xi)位于轻链上的Q160C和位于重链上的Q175C；(xii)位于轻链上的S162C和位于重链上的F170C；(xiii)位于轻链上的S162C和位于重链上的T187C；以及(xiv)位于轻链上的T164C和位于重链上的F170C；其中所述至少一个半胱氨酸取代对在所述第二轻链与所述第二重链之间形成至少一个链间二硫键，并且所述第一臂上的所述半胱氨酸取代对不同于所述第二臂上的所述半胱氨酸取代对。非半胱氨酸取代对是指一对已经突变成非半胱氨酸的氨基酸的天然半胱氨酸(一个位于轻链上，并且一个位于重链上)。半胱氨酸取代对是指一对已经突变成半胱氨酸的天然非半胱氨酸氨基酸(一个位于轻链上，并且一个位于重链上)。

在一些实施方式中，所述第二轻链上取代的天然半胱氨酸位于所述人κ链上的位置C214处，并且所述第二重链上取代的天然半胱氨酸位于所述人IgG1上的位置C220处。

在一些实施方式中，所述第二重链和所述第二轻链包括两个半胱氨酸取代对。在一些实施方式中，所述两个半胱氨酸取代对选自由以下组成的组：(i)位于轻链上的S114C/Q160C和位于重链上的S136C/V173C；(ii)位于轻链上的F118C/Q124C和位于重链上的L128C/F126C；(iii)位于轻链上的F118C/Q124C和位于重链上的A129C/F126C；(iv)位于轻链上的F118C/Q124C和位于重链上的A141C/F126C；(v)位于轻链上的F116C/Q124C和位于重链上的S136C/F126C；(vi)位于轻链上的Q124C/T164C和位于重链上的F126C/F170C；(vii)位于轻链上的Q124C/N138C和位于重链上的F126C/H168C；(viii)位于轻链上的Q160C/L135C和位于重链上的Q175C/F170C；(ix)位于轻链上的S114C/S162C和位于重链上的S136C/F170C；(x)位于轻链上的F118C/S162C和位于重链上的L128C/F170C；(xi)位于轻链上的F118C/S162C和位于重链上的A141C/F170C；(xii)位于轻链上的Q124C/S162C和位于重链上的F126C/F170C；以及(xiii)位于轻链上的N137C/S162C和位于重链上的F170C/T187C；其中所述第一臂上的所述半胱氨酸取代对不同于所述第二臂上的所述半胱氨酸取代对。

在一些实施方式中，第一重链恒定区和/或第二重链恒定区包括人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4；并且第一轻链恒定区和/或第二轻链恒定区包括人κ轻链或人λ轻链。

在一些实施方式中，所述第一重链和所述第二重链形成异二聚体；并且所述第一重链恒定区的Fc区和/或所述第二重链恒定区的Fc区包括一个或多个促进异二聚体化的修饰。

在一些实施方式中，所述第一重链的Fc区通过杵/臼(Knob/Hole)结构与所述第二重链的Fc区相互作用。在一些实施方式中，所述第一重链的Fc区包括杵(Knob)突变，并且所述第二重链的Fc区包括臼(Hole)突变；或者所述第一重链的Fc区包括臼突变，并且所述第二重链的Fc区包括杵突变。在一些实施方式中，所述杵突变包括T366W，并且所述臼突变包括T366S/L368A/Y407V。

在一些实施方式中，所述促进异二聚体化的修饰包括引入能够形成二硫键的半胱氨酸残基。

在一些实施方式中，所述第一重链恒定区的Fc区和所述第二重链恒定区的Fc区分别包括CH3区中的修饰；其中两个CH3区中的所述修饰选自以下：

一个CH3区中的修饰	另一个CH3区中的修饰
		T366S/L368A/Y407V	T366W
S354C/T366W	Y349C/T366S/L368A/Y407V
		T366Y	Y407T
T366W	Y407A
		T394W	F405A
T366Y/F405A	T394W/Y407T
		T366W/F405W	T394S/Y407A
F405W	T394S
		D399C	K392C
T366W/D399C	T366S/L368A/K392C/Y407V
		T366W/K392C	T366S/L368A/D399C/Y407V
S354C/T366W	Y349C/T366S/L368A/Y407V
		Y349C/T366W	S354C/T366S/L368A/Y407V
E356C/T366W	Y349C/T366S/L368A/Y407V
		Y349C/T366W	E356C/T366S/L368A/Y407V
E357C/T366W	Y349C/T366S/L368A/Y407V
		Y349C/T366W	E357C/T366S/L368A/Y407V

在一些实施方式中，所述第一重链恒定区的Fc区和所述第二重链恒定区的Fc区分别包括CH3区中的修饰；其中两个CH3区中的所述修饰选自以下：

一个CH3区中的修饰	另一个CH3区中的修饰
		K370E/D399K/K439D	D356K/E357K/K409D
K409D	D399K
		K409E	D399K
K409E	D399R
		K409D	D399R
D339K	E356K
		E356K/D399K	K392D/K409D
E356K/D399K	K409D/K439D
		E357K/D399K	K370D/K409D
D399K/E357K/E356K	K370D/K392D/K409D
		E357K/D399K	K392D/K409D
K392D/K409D	D399K
		K360D/K409D	D399K

在一些实施方式中，所述第一臂和所述第二臂可以与选自由以下组成的组的抗原特异性结合：SIRPα、CLDN18.2、Siglec15、HER2、EGFR、CD19、CD20、CD39、CD47、PD1、PDL1、CD3、NKG2D、NKG2A、Nkp46、CD137、OX40、CD40、LILRB1、LILRB2、LILRB4、GPC3、TROP2、CD112、TIGIT、FAP、VEGFA、DLL4、ANG-2，其中所述第一臂和所述第二臂可以与不同的抗原特异性结合。

在一些实施方式中，所述第一重链恒定区的Fc区和/或所述第二重链恒定区的Fc区进一步包括改善所述抗体或所述抗原结合片段的稳定性的修饰。

在一些实施方式中，所述抗体或其抗原结合片段是人源化抗体或嵌合抗体。在一些实施方式中，所述抗体或其抗原结合片段是双特异性抗体或多特异性抗体。

在一些实施方式中，所述抗体或所述抗原结合片段连接于一个或多个缀合物部分。

在一些实施方式中，所述缀合物部分包括第二抗体片段。在一些实施方式中，所述抗体或其抗原结合片段包括Fab片段，所述Fab片段连接于所述第二抗体片段的Fc区的C末端。

在一些实施方式中，所述缀合物部分包括用于检测或分离的药剂，如清除改性剂、发光标记、荧光标记、酶底物标记或纯化部分。在一些实施方式中，所述缀合物部分包括治疗剂或药物。

一方面，本公开提供了一种分离的多核苷酸，所述分离的多核苷酸编码本文所公开的抗体或其抗原结合片段。

一方面，本公开提供了一种载体，所述载体包括本文所公开的分离的多核苷酸。

一方面，本公开提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞包括本文所公开的载体。

一方面，本公开提供了一种药物组合物，所述药物组合物包含：(i)抗体或其抗原结合片段或本文所公开的多核苷酸；以及(ii)一种或多种药学上可接受的载体。

一方面，本公开提供了一种表达本文所公开的抗体或其抗原结合片段的方法，所述方法包括在适于表达其中包含的载体的条件下培养本文所公开的宿主细胞。

一方面，本公开提供了一种在受试者中治疗、预防或减轻疾病的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的抗体或其抗原结合片段、或编码所述抗体或其抗原结合片段的多核苷酸、或载体、或宿主细胞或本文所公开的药物组合物。

在一些实施方式中，所述受试者是人。在一些实施方式中，所述施用是经口服、经鼻、静脉内、皮下、舌下或肌内施用的。

一方面，本公开提供了一种抗体或其抗原结合片段、或编码所述抗体或其抗原结合片段的多核苷酸、或载体、或宿主细胞或本文所公开的药物组合物在制备用于在受试者中治疗、预防或减轻疾病的药物中的用途。

附图说明

图1示出了筛选测定1的示意图。

图2示出了筛选测定2的示意图。

图3A至3D示出了筛选测定1和2中使用的表达载体的结构。图3A示出了具有或不具有移位的二硫键突变的轻链的表达载体的结构。图3B示出了具有或不具有移位的二硫键突变的重链的表达载体的结构。图3C示出了具有在N末端处融合的VHH结构域的野生型轻链的表达载体的结构。图3D示出了具有杵或臼残基取代的裸Fc的表达载体的结构。

图4A和4B示出了用SEC-HPLC表征的工程化的不对称Fab-Fc和VHH-Fab-Fc变体的相对丰度的结果。图4A示出了具有CH1-CL链间二硫键移位的不同残基取代对的不对称Fab-Fc变体，如通过筛选测定1所检测的。图4B示出了具有天然CH1-CL链间二硫键的不对称VHH-Fab-Fc分子，如通过筛选测定2所检测的。

图5示出了在两个Fab臂中具有移位的链间二硫键的对称二价单特异性抗体的示意性结构。

图6A和6B示出了具有CH1-CL链间二硫键移位的不同残基取代对的工程化的对称抗体变体的产量(图6A)和单体百分比评估(图6B)的结果。

图7A至7D示出了通过FACS测定对所有对称二价抗CLDN18.2抗体变体与过表达CLDN18.2的MC38细胞结合的结合活性评估的结果。

图8示出了使用热移位测定对具有CH1-CL链间二硫键偏移的不同残基取代对的对称二价抗体变体的热稳定性分析的结果。

图9示出了案例1研究的示意图。

图10示出了在案例1研究中测试的抗体的组装准确性和热稳定性的结果，如分别通过LC-MS测定和差示扫描荧光法测量的。

图11示出了案例2研究的示意图。

图12示出了在案例2研究中测试的抗体的组装准确性和热稳定性的结果，如分别通过LC-MS测定和差示扫描荧光法测量的。

图13A和13B示出了在案例1研究(图13A)和案例2研究(图13B)中测试的抗体的SDS-PAGE结果。

图14示出了被测抗体ACF_361的SDS-PAGE和SEC结果。

图15示出了测试抗体ACF_361的LC-MS结果。

图16A示出了通过FACS得到的抗体与MC38/CD47/CLDN18.2细胞的结合亲和力结果。图16B示出了通过FACS得到的抗体与CHO/SIRPαV1细胞的结合亲和力结果。图16C示出了抗体的吞噬活性结果。

图17示出了被测抗体ACF_389的SDS-PAGE和SEC结果。

图18和19示出了被测抗体ACF_389的Mono S色谱纯化结果。

图20示出了测试抗体ACF_389的LC-MS结果。

图21A示出了通过FACS得到的抗体与Raji/PDL1细胞的结合亲和力结果。图21B示出了通过FACS得到的抗体与CHO/SIRPαV1细胞的结合亲和力结果。

图22和23示出了被测抗体ESB07.451的Mono S色谱纯化结果。

图24示出了测试抗体ESB07.451的LC-MS结果。

具体实施方式

本公开的以下描述仅旨在说明本公开的各个实施方式。如此，所讨论的具体修改不应解释为对本公开的范围的限制。对于本领域技术人员将显而易见的是，在不脱离本公开的范围的情况下，可以做出各种等同物、改变和修改，并且应当理解，此类等同实施方式将被包括在本文中。在本文中引用的所有文献，包括公开、专利和专利申请都以全文引用的方式并入本文。本文所使用的术语仅出于描述特定实施方式的目的，而不旨在限制本发明。

如本文所使用的，除非上下文另外清楚地指示，否则单数形式“一/一个/一种(a/an)”和“所述(the)”也旨在包含复数形式。举例来说，“抗体”意指一种抗体或多于一种抗体。

此外，在具体说明书和/或权利要求书中使用术语“包含(including)”、“包含(include)”、“具有(having)”、“具有(has)”、“具有(with)”或其变体的情况下，此类术语旨在以类似于术语“包括(comprising)”的方式是包含性的。贯穿本公开，除非上下文另有要求，否则词语“包括(comprise)”、“包括(comprises)”和“包括(comprising)”将被理解为暗示包含所陈述的步骤或元素或步骤或元素组，但不排除任何其它步骤或元素或步骤或元素组。“由……组成(consisting of)”意指包含并且限于短语“由……组成”之后的任何内容。因此，短语“由……组成”表示所列元素是必需的或强制性的，并且可以不存在其它元素。“基本上由……组成”意指包含在所述短语之后所列出的任何元素，并且限于不干扰或促进本公开中针对所列元素指定的活动或行为的其它元素。因此，短语“基本上由……组成”表示所列元素是必需的或强制性的，但是其它元素是任选的并且可以存在或不存在，这取决于其是否影响所列元素的活动或作用。

术语“约(about)”或“大约(approximately)”意指在如由本领域普通技术人员确定的特定值的可接受误差范围内，这将部分地取决于所述值是如何测量或确定的，即，测量系统的局限性。例如，根据本领域的实践，“约”可以意指在1个或大于1个标准偏差内。可替代地，“约”可以意指给定值的高达20％，优选地高达10％，更优选地高达5％并且还更优选地高达1％的范围。可替代地，特别是对于生物系统或过程，所述术语可以意指在值的数量级内，优选地在5倍内并且更优选地在2倍内。当在本申请和权利要求书中描述特定值时，除非另外指出，否则应当假设术语“约”意指在特定值的可接受误差范围内。

贯穿本公开提及“一个实施方式”、“一实施方式”、“特定实施方式”、“一些实施方式”或“某些实施方式”或其组合意指结合实施方式描述的特定特征、结构或特性包含于本公开的至少一个实施方式中。因此，上述短语在贯穿本说明书的各个地方的出现不一定全部是指同一个实施方式。此外，在一个或多个实施方式中，可以以任何适合的方式组合特定特征、结构或特性。

I.抗体修饰

在一些方面，本公开提供了具有抗体的多肽链的更高组装精确性和稳定性的经修饰的抗体。

在一些方面，经修饰的抗体被设计成减少具有两个或更多个不同抗原结合位点的双特异性或多特异性抗体中的重链和轻链的错配。

在一些方面，经修饰的抗体具有氨基酸残基突变，其中非半胱氨酸残基突变为半胱氨酸残基以在抗体的重链与轻链之间形成新的二硫键。

在一些方面，经修饰的抗体具有氨基酸残基突变，其中半胱氨酸残基突变为非半胱氨酸残基以破坏半胱氨酸残基之间二硫键的形成。

术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用，以表示通过肽键相互连接的一系列线性氨基酸残基，所述肽键包括蛋白质、多肽、寡肽、肽以及其片段。蛋白质可以由天然存在的氨基酸和/或合成(例如，经修饰的或非天然存在的)氨基酸构成。因此，如本文所使用的，“氨基酸”或“肽残基”意指天然存在的氨基酸和合成氨基酸两者。术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”包括融合蛋白，包括但不限于具有异源氨基酸序列的融合蛋白；带有具有或不具有N末端甲硫氨酸残基的异源和同源前导序列的融合蛋白；免疫标记的蛋白质；具有可检测融合配偶体的融合蛋白，例如，包括荧光蛋白、β-半乳糖苷酶、荧光素酶等作为融合配偶体的融合蛋白；等等。此外，应当注意，氨基酸残基序列开头或结尾的横线表示结合至另外一个或多个氨基酸残基序列的肽键或结合至羧基或羟基端基的共价键。然而，不存在破折号不应被认为意指不存在此类到羧基或羟基端基的肽键或共价键，因为在表示氨基酸序列时通常省略横线。

如本文所使用的，术语“抗体”包括与一个或多个特异性抗原结合的任何免疫球蛋白、单克隆抗体、多克隆抗体、多价抗体、二价抗体、单价抗体、多特异性抗体、双特异性抗体或单特异性抗体。天然的完整抗体包括两条重(H)链和两条轻(L)链。哺乳动物重链被分类为α、δ、ε、γ和μ，每条重链由可变区(VH)和第一恒定区、第二恒定区、第三恒定区以及任选地第四恒定区(分别为CH1、CH2、CH3、CH4)组成；哺乳动物轻链被分类为λ或κ，而每条轻链由可变区(VL)和恒定区组成。抗体呈“Y”型，其中Y的茎部由通过二硫键结合在一起的两条重链的第二恒定区和第三恒定区组成。Y的每个臂包括与单个轻链的可变区和恒定区结合的单条重链的可变区和第一恒定区。轻链和重链的可变区负责抗原结合。两条链的可变区通常包括三个高度可变环，称为互补性决定区(CDR)(轻链CDR包括LCDR1、LCDR2和LCDR3，重链CDR包括HCDR1、HCDR2、HCDR3)。本文所公开的抗体和抗原结合片段的CDR边界可以通过Kabat、IMGT、Chothia或Al-Lazikani规则来定义或鉴定(Al-Lazikani,B.,Chothia,C.,Lesk,A.M.,《分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)》,273(4),927(1997)；Chothia,C.等人,《分子生物学杂志》12月5日；186(3):651-63(1985)；Chothia,C.和Lesk,A.M.,《分子生物学杂志》,196,901(1987)；Chothia,C.等人,《自然(Nature)》12月21-28日；342(6252):877-83(1989)；Kabat E.A.等人,《具有免疫学意义的蛋白质序列(Sequences of Proteins ofimmunological Interest)》,第5版公共卫生署(Public Health Service),马里兰州贝塞斯达国立卫生研究院(National Institutes of Health,Bethesda,Md.)(1991)；Marie-Paule Lefranc等人,《发育与比较免疫学(Developmental and ComparativeImmunology)》,27:55-77(2003)；Marie-Paule Lefranc等人,《免疫组研究(ImmunomeResearch)》1(3),(2005)；Marie-Paule Lefranc,《B细胞分子生物学(Molecular Biologyof B cells)》(第二版),第26章,481-514,(2015))。三个CDR由被称为框架区(FR)(轻链FR包括LFR1、LFR2、LFR3和LFR4，重链FR包括HFR1、HFR2、HFR3和HFR4)的侧接段间隔开，所述框架区比CDR更加高度保守并形成支架以支撑高度可变环。重链和轻链的恒定区与抗原结合无关，但表现出多种效应子功能。抗体基于其重链恒定区的氨基酸序列可以分成几类。抗体的五个主要类别或同种型是IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，其特征分别在于存在α、δ、ε、γ和μ重链。若干个主要抗体类别被分为亚类，如IgG1(γ1重链)、IgG2(γ2重链)、IgG3(γ3重链)、IgG4(γ4重链)、IgA1(α1重链)或IgA2(α2重链)。

如本文所使用的，术语“可变结构域”是指包括一个或多个CDR的抗体可变区或其片段。尽管可变结构域可以包括完整可变区(如HCVR或LCVR)，但也可能包括少于完整可变区但又仍保留与抗原结合或形成抗原结合位点的能力。

如本文所使用的，术语“抗原结合片段”是指由包括一个或多个CDR的抗体的一部分形成的抗体片段，或与抗原结合但不包括完整天然抗体结构的任何其它抗体片段。抗原结合片段的实例包括但不限于可变结构域、可变区、双功能抗体、Fab、Fab'、F(ab')₂、Fv片段、二硫键稳定的Fv片段(dsFv)、(dsFv)₂、双特异性dsFv(dsFv-dsFv')、二硫键稳定的双功能抗体(ds双功能抗体)、多特异性抗体、骆驼化单结构域抗体、纳米抗体、结构域抗体和二价结构域抗体。抗原结合片段能够与亲本抗体所结合的相同抗原结合。在某些实施方式中，抗原结合片段可以包括来自特定人抗体的一个或多个CDR，所述特定人抗体移植到来自一种或多种不同人抗体的框架区。在Spiess等人,2015《分子免疫学(Molecularimmunology)》,67(2),第95-106页(2015)和Brinkman等人,《mAbs》,9(2),第182-212页(2017)中描述了抗原结合片段(也称为抗原结合部分)的更多和详细形式，所述文献以全文引用的方式并入本文。

关于抗体的“Fab”是指抗体的由单条轻链(可变区和恒定区两者)与单条重链的可变区和第一恒定区通过二硫键结合组成的部分。

“Fab'”是指包括铰链区的一部分的Fab片段。

“F(ab')₂”是指Fab'的二聚体。

就抗体(例如，IgG、IgA或IgD同种型)而言，“Fc”是指由第一重链的第二恒定结构域和第三恒定结构域通过二硫键与第二重链的第二恒定结构域和第三恒定结构域结合组成的抗体的部分。IgM和IgE同种型抗体的Fc进一步包括第四恒定结构域。抗体的Fc部分负责各种效应子功能，如抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)和补体依赖细胞毒性(CDC)，但在抗原结合中不起作用。

就抗体而言，“铰链区”包括将CH1结构域与CH2结构域连接的重链分子的部分。此铰链区包括大约25个氨基酸残基，并且是柔性的，因此允许两个N末端抗原结合区独立移动。

如本文所使用的，“CH2结构域”是指包括使用常规编号方案从例如IgG抗体的约氨基酸244延伸到氨基酸360(氨基酸244至360，Kabat编号系统；以及氨基酸231-340，EU编号系统；参见Kabat,E.等人,美国卫生与公众服务部(U.S.Department of Health and HumanServices),(1983))的重链分子的部分。

CH3结构域从CH2结构域延伸到IgG分子的C端，并且包括大约108个氨基酸。某些免疫球蛋白类别，例如IgM，进一步包括CH4区。

就抗体而言，“Fv”是指携带完整抗原结合位点的抗体的最小片段。Fv片段由单条轻链的可变区与单条重链的可变区结合组成。已经提供了许多Fv设计，包括dsFv，其中两个结构域之间的缔合通过引入的二硫键得以增强；并且可以使用肽连接子将两个结构域结合在一起作为单个多肽来形成scFv。还已经产生了含有与对应免疫球蛋白重链或轻链的可变结构域和恒定结构域缔合的重或轻免疫球蛋白链的可变结构域的Fv构建体。Fv也已经被多聚化以形成双功能抗体和三功能抗体(Maynard等人,《生物医学工程年评(Annu RevBiomed Eng)》2 339-376(2000))。

“骆驼化单结构域抗体”、“重链抗体”或“HCAb”是指含有两个V_H结构域而不包括轻链的抗体(Riechmann L.和Muyldermans S.,《免疫学方法杂志(J Immunol Methods)》12月10日；231(1-2):25-38(1999)；Muyldermans S.,《生物技术杂志(J Biotechnol.)》6月；74(4):277-302(2001)；WO94/04678；WO94/25591；美国专利第6,005,079号)。重链抗体最初源自骆驼科(Camelidae)(骆驼、单峰骆驼和美洲驼)。虽然缺失轻链，但骆驼化抗体具有真实的抗原结合谱(Hamers-Casterman C.等人,《自然》6月3日；363(6428):446-8(1993)；Nguyen VK.等人《免疫遗传学(Immunogenetics)》.4月；54(1):39-47(2002)；NguyenVK.等人,《免疫学(Immunology)》.5月；109(1):93-101(2003))。重链抗体的可变结构域(VHH结构域)表示由适应性免疫应答产生的最小已知抗原结合单位(Koch-Nolte F.等人,《美国实验生物学会联合会杂志(FASEB J.)》11月；21(13):3490-8.电子版2007年6月15日(2007))。

“纳米抗体”是指由来自重链抗体的VHH结构域和两个恒定结构域CH2和CH3组成的抗体片段。

“双功能抗体”或“dAb”包括具有两个抗原结合位点的小抗体片段，其中所述片段包括在同一条多肽链中与V_L结构域连接的V_H结构域(V_H-V_L或V_L-V_H)(参见例如，Holliger P.等人,《美国国家科学院院刊(Proc Natl Acad Sci USA.)》7月15日；90(14):6444-8(1993)；EP404097；WO93/11161)。通过使用太短以至于不允许在同一条链上的两个结构域之间配对的连接子，结构域被迫与另一条链的互补结构域配对，由此产生两个抗原结合位点。抗原结合位点可以靶向相同或不同的抗原(或表位)。在某些实施方式中，“双特异性ds双功能抗体”是靶向两种不同抗原(或表位)的双功能抗体。

如本文所使用的，术语“价”是指给定分子中存在指定数量的抗原结合位点。术语“单价”是指仅具有一个单抗原结合位点的抗体或抗原结合片段；并且术语“多价”是指具有多个抗原结合位点的抗体或抗原结合片段。如此，术语“二价”、“三价”、“四价”和“六价”分别表示在抗原结合分子中存在两个结合位点、三个结合位点、四个结合位点和六个结合位点。在一些实施方式中，抗体或其抗原结合片段是二价的。

如本文所使用的，“双特异性”抗体是指具有源自两个不同的单克隆抗体的片段并且能够与两个不同的表位结合的人工抗体。两个表位可以存在于同一抗原上，或其可以存在于两种不同抗原上。

如本文所使用的，“多特异性”抗体是指具有源自多于两个不同的单克隆抗体的片段并且能够与多于两个不同的表位结合的人工抗体。所述多于两个表位可以存在于同一抗原上，或它们可以存在于多于两种不同抗原上。

如本文所使用的，术语“嵌合”意指具有源自一种物种的重链和/或轻链的一部分和源自不同物种的重链和/或轻链的其余部分的抗体或抗原结合片段。在说明性实例中，嵌合抗体可以包括源自人的恒定区和源自非人动物，如源自小鼠的可变区。在一些实施方式中，非人动物是哺乳动物，例如小鼠、大鼠、兔、山羊、绵羊、豚鼠或仓鼠。

如本文所使用的，术语“人源化”意指抗体或抗原结合片段包括源自非人动物的CDR、源自人的FR区以及当适用时源自人的恒定区。

如本文所使用的，术语“亲和力”是指免疫球蛋白分子(即，抗体)或其片段与抗原之间非共价相互作用的强度。

如本文所使用的，术语“特异性结合(specific binding)”或“特异性结合(specifically binds)”是指两个分子之间，例如抗体与抗原之间的非随机结合反应。特异性结合的特征可以在于结合亲和力，例如由K_D值表示，即，当抗原与抗原结合分子之间的结合达到平衡时解离速率与缔合速率的比率(k_off/k_on)。K_D可以通过使用本领域中已知的任何常规方法确定，所述方法包括但不限于表面等离子体共振法、微量热泳法、HPLC-MS法和流式细胞术(如FACS)方法。≤10^-6M(例如≤5×10^-7M、≤2×10^-7M、≤10^-7M、≤5×10^-8M、≤2×10^-8M、≤10^-8M、≤5×10^-9M、≤4×10^-9M、≤3×10^-9M、≤2×10^-9M或≤10^-9M)的K_D值可以指示抗体或其抗原结合片段与对应的抗原之间的特异性结合。

如本文所使用的，术语“表位”是指抗体所结合的抗原上的一组特定原子或氨基酸。如果两种抗体展现出针对抗原的竞争性结合，则其可以与抗原内的相同或密切相关的表位结合。表位可以是线性的或构象的(即，包括间隔开的氨基酸残基)。

关于氨基酸序列(或核酸序列)的“序列同一性百分比(％)”被定义为在比对序列，并且必要时引入空位以实现最大数量的相同氨基酸(或核酸)后，在候选序列中与参考序列中的氨基酸(或核酸)残基相同的氨基酸(或核酸)残基的百分比。换句话说，氨基酸序列(或核酸序列)的序列同一性百分比(％)可以通过将相对于其比较的参考序列相同的氨基酸残基(或碱基)的数目除以候选序列或参考序列中氨基酸残基(或碱基)的总数(以较短者为准)来计算。氨基酸残基的保守取代可以或可以不视为相同残基。可以例如使用公开可用的工具，如BLASTN、BLASTp(可在美国国家生物技术信息中心(U.S.National Center forBiotechnology Information，NCBI)的网站上获得，还参见Altschul S.F.等人,《分子生物学杂志》215:403-410(1990)；Stephen F.等人,《核酸研究(Nucleic Acids Res.)》,25:3389-3402(1997))、ClustalW2(可在欧洲生物信息研究所(European BioinformaticsInstitute)的网站上获得，还参见Higgins D.G.等人,《酶学方法(Methods inEnzymology)》,266:383-402(1996)；Larkin M.A.等人《生物信息学(Bioinformatics)》(英国剑桥),23(21):2947-8(2007))以及ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件实现用于确定氨基酸(或核酸)序列同一性百分比的比对。本领域技术人员可以使用由所述工具提供的默认参数或可以根据比对的需要适当定制参数，例如通过选择合适的算法。

如本文所使用的，关于氨基酸残基的术语“突变”、“突变的”是指一个或多个氨基酸残基的取代、插入或缺失。

如本文所使用的，关于氨基酸序列的术语“取代”或“取代的”是指用不同的氨基酸残基替换天然氨基酸残基。

关于氨基酸序列的术语“保守取代”是指用具有类似理化特性的侧链的不同氨基酸残基替换氨基酸残基。例如，可以在具有疏水侧链的氨基酸残基(例如，Met、Ala、Val、Leu和Ile)之间、具有中性亲水侧链的氨基酸残基(例如，Cys、Ser、Thr、Asn和Gln)之间、具有酸性侧链的氨基酸残基(例如，Asp、Glu)之间、具有碱性侧链的氨基酸残基(例如，His、Lys和Arg)之间或具有芳香族侧链的氨基酸残基(例如，Trp、Tyr和Phe)之间进行保守取代。如本领域已知的，保守取代通常不会引起蛋白质构象结构的显著变化，并且因此可以保留蛋白质的生物学活性。

术语“受试者”包括人和非人动物。非人动物包括所有脊椎动物，例如哺乳动物和非哺乳动物，如非人灵长类动物、小鼠、大鼠、猫、兔、羊、狗、牛、鸡、两栖动物和爬行动物。除在指出时之外，术语“患者”或“受试者”在本文中可互换使用。

抗体或其抗原结合片段可以包括引入或去除糖基化位点的一个或多个修饰。糖基化位点是具有侧链的氨基酸残基，碳水化合物部分(例如，寡糖结构)可以连接到所述侧链。抗体的糖基化通常是N连接的或O连接的。N连接是指将碳水化合物部分与天冬酰胺残基(例如，如天冬酰胺-X-丝氨酸和天冬酰胺-X-苏氨酸等三肽序列中的天冬酰胺残基)连接的侧链，其中X是除了脯氨酸之外的任何氨基酸。O连接的糖基化是指将糖N-乙酰半乳糖胺、半乳糖或木糖之一与羟基氨基酸连接，最常见的是与丝氨酸或苏氨酸连接。

二硫键的形成和断裂

在一些实施方式中，本文所提供的抗体包括第一臂和第二臂，其中所述第一臂由第一重链和第一轻链以及在其间形成的至少一个二硫键形成，并且所述第二臂由第二重链和第二轻链以及在其间形成的至少一个二硫键形成。

在一些实施方式中，形成第一臂的第一重链与第一轻链之间的连接包括人工引入的二硫键，而形成第二臂的第二重链与第二轻链之间的连接包括天然存在的二硫键。在一些实施方式中，形成第一臂的第一重链与第一轻链之间的连接包括在第一组位置处的人工引入的二硫键，而形成第二臂的第二重链和第二轻链的连接包括在与第一组位置不同的第二组位置处的人工引入的二硫键。

在一些方面，经修饰的抗体具有氨基酸残基突变，其中分别位于抗体的重链和轻链上的一对非半胱氨酸残基(其可以是除半胱氨酸以外的任何氨基酸)突变为半胱氨酸残基以在其间形成新的二硫键。在某些实施方式中，根据EU编号，重链上的非半胱氨酸残基位于氨基酸位置126、128、129、136、141、168、170、173、175或187处，并且根据EU编号，轻链上的非半胱氨酸残基位于氨基酸位置114、116、118、124、135、137、138、160、162或164处。在某些实施方式中，根据EU编号，重链上的非半胱氨酸残基是F126、L128、A129、S136、A141、H168、F170、V173、Q175或T187的氨基酸残基。在某些实施方式中，根据EU编号，轻链上的非半胱氨酸残基是S114、F116、F118、Q124、L135、N137、N138、Q160、S162或T164的氨基酸残基。

在某些实施方式中，经修饰的抗体包括一对或多对在以下位置处从非半胱氨酸残基到半胱氨酸残基的突变：

表1.将从非半胱氨酸残基突变为半胱氨酸残基的氨基酸残基。

在某些实施方式中，经修饰的抗体包括从非半胱氨酸残基到半胱氨酸残基的以下突变对中的一对或多对：

表2.将从非半胱氨酸残基突变为半胱氨酸残基的氨基酸残基。

在一些方面，经修饰的抗体具有氨基酸残基突变，其中半胱氨酸残基突变为非半胱氨酸残基以破坏半胱氨酸残基之间二硫键的形成。在某些实施方式中，突变为非半胱氨酸残基的半胱氨酸残基对是所述抗体的轻链中的氨基酸残基C214和重链中的氨基酸残基C220。

在某些实施方式中，经修饰的抗体在选自表1或表2的位置处具有一对或多对氨基酸残基突变，并且突变为非半胱氨酸残基的半胱氨酸残基对是所述抗体的轻链中的氨基酸残基C214和重链中的氨基酸残基C220。

在一些实施方式中，本公开的抗体或其抗原结合片段包括第一臂，所述第一臂由第一重链和第一轻链以及在其间形成的两个新的二硫键形成，其中所述两个二硫键由选自表1或表2中列出的突变对的从非半胱氨酸到半胱氨酸的突变对形成。

在某些实施方式中，本公开的抗体或其抗原结合片段包括第一臂和第二臂，所述第一臂由第一重链和第一轻链以及在其间形成的二硫键形成，所述第二臂由第二重链和第二轻链以及在其间形成的二硫键形成，其中所述第一轻链和所述第一重链包括至少一对选自由以下组成的组的从非半胱氨酸残基到半胱氨酸残基的突变：

(i)位于轻链上的S114C和位于重链上的S136C；

(ii)位于轻链上的F116C和位于重链上的S136C；

(iii)位于轻链上的F118C和位于重链上的L128C；

(iv)位于轻链上的F118C和位于重链上的A129C；

(v)位于轻链上的F118C和位于重链上的A141C；

(vi)位于轻链上的Q124C和位于重链上的F126C；

(vii)位于轻链上的L135C和位于重链上的F170C；

(viii)位于轻链上的N137C和位于重链上的F170C；

(ix)位于轻链上的N138C和位于重链上的H168C；

(x)位于轻链上的Q160C和位于重链上的V173C；

(xi)位于轻链上的Q160C和位于重链上的Q175C；

(xii)位于轻链上的S162C和位于重链上的F170C；

(xiii)位于轻链上的S162C和位于重链上的T187C；以及

(xiv)位于轻链上的T164C和位于重链上的F170C；

其中从非半胱氨酸残基到半胱氨酸残基的至少一对突变在所述第一重链与所述第一轻链之间形成至少一个二硫键，并且所述第一轻链上的天然半胱氨酸和所述第一重链上的天然半胱氨酸被突变为非半胱氨酸氨基酸。在某些实施方式中，所述天然半胱氨酸突变为的非半胱氨酸残基独立地选自S、A或G。

除非另有说明，否则本公开中描述的抗体的重链和轻链上的所有氨基酸残基和位置的编号都是根据EU编号系统的。如本文所使用的，术语“EU编号系统”是指抗体恒定区的EU编号惯例，如Edelman,G.M.等人,《美国国家科学院院刊》,63,78-85(1969)和Kabat等人,《具有免疫学意义的蛋白质序列》,美国卫生与人类服务部(U.S.Dept.Health and HumanServices),第5版,1991，所述参考文献中的每一个以全文引用的方式并入本文。

在一些实施方式中，在第二轻链CL区上的天然半胱氨酸与第二重链CH1区上的天然半胱氨酸之间形成的天然存在的二硫键被两个半胱氨酸上的非半胱氨酸取代破坏。在一些实施方式中，天然半胱氨酸独立地被任何一个非半胱氨酸残基取代，只要人工引入的新残基对之间没有任何相互作用。在一些实施方式中，天然半胱氨酸独立地被丝氨酸(S)、丙氨酸(A)或甘氨酸(G)取代。在一些实施方式中，天然半胱氨酸都被丝氨酸(S)取代。

在一些实施方式中，人工引入的二硫键由选自由表3中列出的突变组成的组的突变体组合形成。

表3.CH1和CL上的在CH1与CL之间形成人工引入的二硫键的突变位点。

CL中的突变体位点	CH1中的突变体位点
		S114C/C214S	S136C/C220S
F116C/C214S	S136C/C220S
		F118C/C214S	L128C/C220S
F118C/C214S	A129C/C220S
		F118C/C214S	A141C/C220S
Q124C/C214S	F126C/C220S
		Q160C/C214S	Q175C/C220S
Q160C/C214S	V173C/C220S
		L135C/C214S	F170C/C220S
N137C/C214S	H170C/C220S
		N138C/C214S	H168C/C220S
S162C/C214S	F170C/C220S
		S162C/C214S	T187C/C220S
T164C/C214S	F170C/C220S
		S114C/Q160C/C214S	S136C/V173C/C220S
F118C/Q124C/C214S	L128C/F126C/C220S
		F118C/Q124C/C214S	A129C/F126C/C220S
F118C/Q124C/C214S	A141C/F126C/C220S
		F116C/Q124C/C214S	S136C/F126C/C220S
Q124C/T164C/C214S	F126C/F170C/C220S
		Q124C/N138C/C214S	F126C/H168C/C220S
Q160C/L135C/C214S	Q175C/F170C/C220S
		S114C/S162C/C214S	S136C/F170C/C220S
F118C/S162C/C214S	L128C/F170C/C220S
		F118C/S162C/C214S	A141C/F170C/C220S
Q124C/S162C/C214S	F126C/F170C/C220S
		N137C/S162C/C214S	F170C/T187C/C220S

在一些实施方式中，形成第一臂的第一重链与第一轻链之间的连接包括两对由选自由以下组成的组的突变体组合形成的人工引入的二硫键：

(i)位于轻链上的S114C/Q160C和位于重链上的S136C/V173C；

(ii)位于轻链上的F118C/Q124C和位于重链上的L128C/F126C；

(iii)位于轻链上的F118C/Q124C和位于重链上的A129C/F126C；

(iv)位于轻链上的F118C/Q124C和位于重链上的A141C/F126C；

(v)位于轻链上的F116C/Q124C和位于重链上的S136C/F126C；

(vi)位于轻链上的Q124C/T164C和位于重链上的F126C/F170C；

(vii)位于轻链上的Q124C/N138C和位于重链上的F126C/H168C；

(viii)位于轻链上的Q160C/L135C和位于重链上的Q175C/F170C；

(ix)位于轻链上的S114C/S162C和位于重链上的S136C/F170C；

(x)位于轻链上的F118C/S162C和位于重链上的L128C/F170C；

(xi)位于轻链上的F118C/S162C和位于重链上的A141C/F170C；

(xii)位于轻链上的Q124C/S162C和位于重链上的F126C/F170C；以及

(xiii)位于轻链上的N137C/S162C和位于重链上的F170C/T187C。

在一些实施方式中，形成第一臂的第一重链与第一轻链之间的连接包括两对由选自由以下组成的组的突变体组合形成的人工引入的二硫键：

(i)位于轻链上的F118C/Q124C和位于重链上的L128C/F126C；

(ii)位于轻链上的Q124C/T164C和位于重链上的F126C/F170C；

(iii)位于轻链上的F118C/S162C和位于重链上的L128C/F170C；

(iv)位于轻链上的F118C/S162C和位于重链上的A141C/F170C；以及

(v)位于轻链上的Q124C/S162C和位于重链上的F126C/F170C。

在一些实施方式中，本文所公开的抗体或其抗原结合片段包括与人种系重链CH1区至少约70％、至少约71％、至少约72％、至少约73％、至少约74％、至少约75％、至少约76％、至少约77％、至少约78％、至少约79％、至少约80％、至少约81％、至少约82％、至少约83％、至少约84％、至少约85％、至少约86％、至少约87％、至少约88％、至少约89％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％相同的重链CH1区。在一些实施方式中，人种系重链CH1区具有本文所提供的SEQ ID NO:5中所示的氨基酸序列。

在一些实施方式中，本文所公开的抗体或其抗原结合片段包括与人种系轻链CL区至少约70％、至少约71％、至少约72％、至少约73％、至少约74％、至少约75％、至少约76％、至少约77％、至少约78％、至少约79％、至少约80％、至少约81％、至少约82％、至少约83％、至少约84％、至少约85％、至少约86％、至少约87％、至少约88％、至少约89％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％相同的轻链CL区。在一些实施方式中，人种系轻链CL区具有本文所提供的SEQ ID NO:4中所示的氨基酸序列。

双特异性抗体的形成

通过重新定位由来自CH1区和CL区的半胱氨酸对形成的二硫键，本公开提供了经修饰的抗体，所述经修饰的抗体的重链和轻链以高组装准确性和稳定性配对。

如本文所使用的，“双特异性抗体”是对至少两种独立抗原或同一抗原内的不同表位具有结合特异性的抗体。

在某些实施方式中，双特异性抗体包括一个表位的第一结合位点和另一个表位的第二结合位点。在某些实施方式中，两个抗原靶标选自由以下组成的组：SIRPα、CLDN18.2、Siglec15、HER2、EGFR、CD19、CD20、CD39、CD47、PD1、PDL1、CD3、NKG2D、NKG2A、Nkp46、CD137、OX40、CD40、LILRB1、LILRB2、LILRB4、GPC3、TROP2、CD112、TIGIT、FAP、VEGFA、DLL4、ANG-2。在某些实施方式中，双特异性抗体的抗原结合臂中的一个抗原结合臂可以靶向SIRPα，并且双特异性抗体的其它抗原结合臂可以靶向Claudin 18.2。

在某些实施方式中，双特异性抗体对两个独立抗原(或同一抗原上的表位)的结合亲和力大致相同。在某些实施方式中，双特异性抗体对两个独立抗原(或同一抗原上的表位)的结合亲和力不同。在一些实施方式中，双特异性抗体对两个独立抗原(或同一抗原上的表位)的亲和力可以相差1倍、2倍、3倍、4倍或更多倍。

Fc区上的突变

本文所公开的抗体或其抗原结合片段还涵盖Fc变体，所述Fc变体可以包括一个或多个在Fc区和/或铰链区处的氨基酸残基修饰或取代。

在一些实施方式中，异二聚体配对是通过工程化两条重链的Fc区使得其排他性地形成异二聚体来实现的。在一些实施方式中，Fc区的CH3区被引入突变。

在某些实施方式中，抗体或其抗原结合片段包括Fc区的作用界面中的一个或多个氨基酸取代以便于推动和/或促进异二聚体化。这些修饰包括将突起引入到第一Fc多肽中并且将空腔引入到第二Fc多肽中，其中突起可以定位于空腔中，以便促进第一Fc多肽与第二Fc多肽的相互作用以形成异二聚体或复合物。产生具有这些修饰的抗体的方法是本领域已知的，如美国专利第5,731,168号中所述。

在一些实施方式中，通过用较大的侧链(例如，酪氨酸或色氨酸)替换来自第一抗体分子的作用界面的一个或多个小氨基酸侧链来产生“杵”。通过用较小的氨基酸侧链(例如，丙氨酸或苏氨酸)替换大的氨基酸侧链，在第二抗体分子的作用界面上产生与大的侧链相同或类似大小的补偿性“臼”。用于增强异二聚体化的CH3修饰包括例如位于一条重链上的Y407V/T366S/L368A和位于另一条重链上的T366W；位于一条重链上的S354C/T366W和位于另一条重链上的Y349C/Y407V/T366S/L368A。表4提供了在一条链上产生突起而在另一条链上产生腔的此类修饰。

表4.形成Fc异二聚体化的杵和臼结构的突变。

一个CH3区中的修饰	另一个CH3区中的修饰
		T366S/L368A/Y407V	T366W
S354C/T366W	Y349C/T366S/L368A/Y407V
		T366Y	Y407T
T366W	Y407A
		T394W	F405A
T366Y/F405A	T394W/Y407T
		T366W/F405W	T394S/Y407A
F405W	T394S
		D399C	K392C
T366W/D399C	T3 66S/L368A/K392C/Y407V
		T366W/K392C	T366S/L368A/D399C/Y407V
S354C/T366W	Y349C/T366S/L368A/Y407V
		Y349C/T366W	S354C/T366S/L368A/Y407V
E356C/T366W	Y349C/T366S/L368A/Y407V
		Y349C/T366W	E356C/T366S/L368A/Y407V
E357C/T366W	Y349C/T366S/L368A/Y407V
		Y349C/T366W	E357C/T366S/L368A/Y407V

在一些实施方式中，本文所公开的抗体或其抗原结合片段包括第一CH3区和第二CH3区，其中第一CH3区或第二CH3区包括与野生型IgG氨基酸序列不同的氨基酸序列，使得野生型人IgG氨基酸序列中的一个或多个带正电荷的氨基酸(例如，赖氨酸、组氨酸和精氨酸)被CH3区中的对应位置处的一个或多个带负电荷的氨基酸(例如，天冬氨酸和谷氨酸)替换。可替代地，第一CH3区或第二CH3区包括与野生型IgG氨基酸序列不同的van氨基酸序列，使得野生型人IgG氨基酸序列中的一个或多个带负电荷的氨基酸被CH3区中的对应位置处的一个或多个带正电荷的氨基酸替换。在一些实施方式中，两个CH3区中的修饰选自表5中列出的组。

表5.改变Fc异二聚体化的电荷极性的突变。

一个CH3区中的修饰	另一个CH3区中的修饰
		K370E/D399K/K439D	D356K/E357K/K409D
K409D	D399K
		K409E	D399K
K409E	D399R
		K409D	D399R
D339K	E356K
		E356K/D399K	K392D/K409D
E356K/D399K	K409D/K439D
		E357K/D399K	K370D/K409D
E356K/E357K/D399K	K370D/K392D/K409D
		E357K/D399K	K392D/K409D
K392D/K409D	D399K
		K360D/K409D	D399K

在一些实施方式中，抗体或其抗原结合片段的重链恒定区可以源自人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。在一些实施方式中，抗体或其抗原结合片段的轻链恒定区可以源自人κ链或人λ链。

II.缀合物

在一些实施方式中，抗体或其抗原结合片段进一步包括一个或多个缀合物部分。在某些实施方式中，本文所提供的抗体或其抗原结合片段用作缀合物的基础。

缀合物部分可以连接于抗体或其抗原结合片段。缀合物部分是可以与抗体或其抗原结合片段连接的部分。设想多种缀合物部分可以连接于本文所提供的抗体或其抗原结合片段(参见例如“缀合物疫苗(Conjugate Vaccines)”,《对微生物学和免疫学的贡献(Contributions to Microbiology and Immunology)》,J.M.Cruse和R.E.Lewis,Jr.(编辑),纽约Carcer出版社(Carcer Press,New York),(1989))。这些缀合物部分可以通过共价结合、亲和力结合、嵌入、配位结合、复合、缔合、共混或添加以及其它方法连接于抗体或其抗原结合片段。在一些实施方式中，抗体或其抗原结合片段可以通过连接子连接于一种或多种缀合物。

III.制备方法

本公开提供了编码本文所提供的抗体或其抗原结合片段的多核苷酸。

如本文所使用的，术语“多核苷酸”或“核酸”是指呈单链或双链形式的脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)和其聚合物。除非另外指出，否则特定多核苷酸序列还隐含地涵盖其保守修饰的变体(例如，简并密码子取代)、等位基因、直系同源物、SNP和互补性序列以及明确指出的序列。具体地说，简并密码子取代可以通过产生序列来实现，在所述序列中，一个或多个所选的(或全部)密码子的第三位置被混合碱基和/或脱氧肌苷残基取代(参见Batzer等人,《核酸研究》19:5081(1991)；Ohtsuka等人,《生物化学杂志(J.Biol.Chem.)》260:2605-2608(1985)；以及Rossolini等人,《分子和细胞探针(Mol.Cell.Probes)》8:91-98(1994))。

编码本文所提供的抗体或其抗原结合片段的核酸或多核苷酸可以使用重组技术构建。为此，可以使用常规程序(例如通过使用能够与编码抗体的重链和轻链的基因特异性结合的寡核苷酸探针)分离编码亲本抗体的抗原结合片段(如CDR或可变区)的DNA并对其进行测序。作为实例，获得并可操作地连接编码可变结构域(VH)的多核苷酸序列和编码CH1、CH2和CH3的多核苷酸序列以允许在宿主细胞中转录和表达以产生重链多肽。类似地，编码VL的多核苷酸序列可操作地连接于编码CL的多核苷酸序列，从而允许轻链在宿主细胞中表达。

可以通过本领域已知的各种方法引入突变。在一些实施方式中，使用PCR技术，具有被设计突变(例如，包括点突变、多核苷酸片段的缺失或多核苷酸片段的插入)的引物可以用于引入某些突变。

在一些实施方式中，具有或不具有突变的多核苷酸可以通过合成方法获得。化学DNA合成方法是本领域众所周知的。通常，所述方法包括以下步骤。第一核苷酸的5'端被二甲氧基三苯甲基(DMT)保护，而二氧化硅的连接子连接OH端。所有核苷酸的反应基团都受到化学保护。之后，通过洗涤去除DMT，并且下一个核苷酸被激活并连接于3'-OH基团。使用碘，氧化5'到3'键以产生磷酸三酯键(磷酸基团的一个O被甲基化)。反应继续，直到达到所期望的链长。以此方式，可以制备约70-80种残余聚合物。所述过程也具有自动化版本，并且常规合成服务是可商购获得的。编码本文所公开的抗体或其抗原结合片段的DNA使用常规程序(例如通过使用能够与编码抗体的重链和轻链的基因特异性结合的寡核苷酸探针)容易地分离和测序。

编码多核苷酸序列可以进一步可操作地连接于一个或多个调控序列，任选地在表达载体中，使得重链和轻链的表达或产生是可行的并处于适当的控制下。

本公开提供了包括编码本文所提供的多核苷酸的载体。如本文所使用的，术语“载体”是指可以将编码蛋白质的多核苷酸可操作地插入其中以便引起所述蛋白质的表达的媒剂。通常，构建体还包括合适的调控序列。例如，多核苷酸分子可以包括位于编码引导RNA的核苷酸序列和/或编码定点修饰多肽的核苷酸序列的5'-侧接区的调控序列，所述调控序列以能够在宿主细胞中表达所期望的转录物/基因的方式可操作地连接于编码序列。载体可以用于转化、转导或转染宿主细胞，以使其携带的遗传元件在宿主细胞内产生表达。载体的实例包括质粒、噬菌粒、粘粒、如酵母人工染色体(YAC)、细菌人工染色体(BAC)或源自P1的人工染色体(PAC)等人工染色体、如λ噬菌体或M13噬菌体等噬菌体和动物病毒。用作载体的动物病毒的类别包括逆转录病毒(包括慢病毒)、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒(例如，单纯疱疹病毒)、痘病毒、杆状病毒、乳头瘤病毒和乳多空病毒(例如，SV40)。载体可以包括多种用于控制表达的元件，包括启动子序列、转录起始序列、增强子序列、可选择元件和报告基因。另外，载体可以包括复制起点。载体还可以包括辅助其进入细胞的材料，包括但不限于病毒颗粒、脂质体或蛋白质涂层。

载体的实例包括但不限于逆转录病毒(包括慢病毒)、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒(例如，单纯疱疹病毒)、痘病毒、杆状病毒、乳头瘤病毒、乳多空病毒(例如，SV40)、λ噬菌体和M13噬菌体、质粒pcDNA3.3、pMD18-T、pOptivec、pCMV、pEGFP、pIRES、pQD-Hyg-GSeu、pALTER、pBAD、pcDNA、pCal、pL、pET、pGEMEX、pGEX、pCI、pEGFT、pSV2、pFUSE、pVITRO、pVIVO、pMAL、pMONO、pSELECT、pUNO、pDUO、Psg5L、pBABE、pWPXL、pBI、p15TV-L、pPro18、pTD、pRS10、pLexA、pACT2.2、pCMV-SCRIPT.RTM.、pCDM8、pCDNA1.1/amp、pcDNA3.1、pRc/RSV、PCR 2.1、pEF-1、pFB、pSG5、pXT1、pCDEF3、pSVSPORT、pEF-Bos等。

包括编码抗体或其抗原结合片段的多核苷酸序列的载体可以被引入到宿主细胞中以供克隆或基因表达。如本文所使用的，术语“宿主细胞”是指其中已引入有外源性多核苷酸和/或载体的细胞。

用于克隆或表达本文中的载体中的DNA的合适的宿主细胞是上述原核细胞、酵母细胞或高等真核细胞。用于此目的的合适的原核细胞包括真细菌，如革兰氏阴性或革兰氏阳性生物体，例如肠杆菌科(Enterobacteriaceae)，如埃希氏杆菌属(Escherichia)，例如，大肠杆菌)、肠杆菌属(Enterobacter)、欧文氏菌属(Erwinia)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、变形杆菌属(Proteus)、沙门氏菌属(Salmonella)，例如，鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)、沙雷氏菌属(Serratia)，例如，粘质沙雷氏菌(Serratiamarcescans)和志贺氏菌属(Shigella)；以及芽孢杆菌纲(Bacilli)，如枯草芽孢杆菌(B.subtilis)和地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)；假单胞菌属，如铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)和链霉菌属(Streptomyces)。

除了原核生物之外，真核微生物(如丝状真菌或酵母)是编码抗体的载体的合适克隆或表达宿主。酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)或普通面包酵母在低等真核宿主微生物中是最常用的。然而，许多其它属、物种和菌株都比较常用且在本文中适用，如粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)；克鲁维酵母菌属宿主(Kluyveromyces host)，例如，乳酸克鲁维酵母(K.lactis)、脆壁克鲁维酵母(K.fragilis)(ATCC 12,424)、保加利亚克鲁维酵母(K.bulgaricus)(ATCC 16,045)、魏氏克鲁维酵母(K.wickeramii)(ATCC 24,178)、克鲁雄酵母(K.waltii)(ATCC 56,500)、果蝇克鲁维酵母(K.drosophilarum)(ATCC36,906)、耐热克鲁维酵母(K.thermotolerans)和马克斯克鲁维酵母(K.marxianus)；耶氏酵母属(yarrowia)(EP 402,226)；巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)(EP 183,070)；念珠菌属；里氏木霉(Trichoderma reesia)(EP 244,234)；粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)；许旺酵母属(Schwanniomyces)，如西方许旺酵母(Schwanniomyces occidentalis)；以及丝状真菌，例如，脉孢菌(Neurospora)、青霉菌属(Penicillium)、弯颈霉属(Tolypocladium)和曲霉菌属宿主，如构巢曲霉(A.nidulans)和黑曲霉菌。

用于表达本文所提供的糖基化抗体或其抗原结合片段的合适宿主细胞源自多细胞生物体。无脊椎细胞的实例包括植物和昆虫细胞。已鉴定多种杆状病毒株和变体以及对应的许可性昆虫宿主细胞，所述许可性昆虫宿主细胞来自于如以下等宿主：草地夜蛾(Spodoptera frugiperda)(毛虫)、埃及斑蚊(Aedes aegypti)(蚊子)、白纹伊蚊(Aedesalbopictus)(蚊子)、黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)(果蝇)和家蚕(Bombyx mori)。多种用于转染的病毒株为公众可得，例如苜蓿银纹夜蛾(Autographa californica)NPV的L-1变体以及家蚕NPV的Bm-5株变体，并且此类病毒都可以根据本公开用作本文中的病毒，特别是用于转染草地夜蛾细胞。棉花、玉米、马铃薯、大豆、矮牵牛、番茄和烟草的植物细胞培养物也可以用作宿主。

在某些实施方式中，宿主细胞是脊椎动物细胞。在培养物(组织培养物)中繁殖脊椎动物细胞已变成常规程序。有用的哺乳动物宿主细胞系的实例是由SV40(COS-7，ATCCCRL 1651)转化的猴肾CV1系；人胚胎肾系(针对悬浮培养物中的生长亚克隆的293或293细胞，Graham等人,《普通病毒学杂志(J.Gen.Virol.)》36:59(1977))；小仓鼠肾细胞(BHK，ATCC CCL 10)；中国仓鼠卵巢细胞/-DHFR(CHO，Urlaub等人,《美国国家科学院院刊》77:4216(1980))；小鼠支持细胞(TM4,Mather,《生殖生物学(Biol.Reprod.)》,23:243-251(1980))；猴肾细胞(CV1 ATCC CCL 70)；非洲绿猴肾细胞(VERO-76，ATCC CRL-1587)；人宫颈肿瘤细胞(HELA，ATCC CCL 2)；犬肾细胞(MDCK，ATCC CCL 34)；布法罗大鼠肝细胞(BRL3A，ATCC CRL 1442)；人肺细胞(W138，ATCC CCL 75)；人肝细胞(Hep G2，HB 8065)；鼠类乳腺肿瘤(MMT 060562，ATCC CCL51)；TRI细胞(Mather等人,《纽约科学院年鉴(AnnalsN.Y.Acad.Sci.)》383:44-68(1982))；MRC 5细胞；FS4细胞；以及人肝癌系(Hep G2)。在一些实施方式中，宿主细胞是哺乳动物培养的细胞系，如CHO、BHK、NS0、293和其衍生物。

用上述用于抗体产生的表达或克隆载体转化宿主细胞，并将所述宿主细胞在常规营养培养基中培养，所述常规营养培养基被改性成适于诱导启动子、选择转化子或扩增编码期望序列的基因。

本公开还提供了一种表达本文所提供的抗体或其抗原结合片段的方法，所述方法包括在表达本公开的载体的条件下培养本文所提供的宿主细胞。用于产生本文所提供的抗体或其抗原结合片段的宿主细胞可以在各种培养基中培养。可商购获得的培养基如Ham'sF10(西格玛公司(Sigma))、最低必需培养基(Minimal Essential Medium，MEM)(西格玛公司)、RPMI-1640(西格玛公司)和杜氏改良伊氏培养基(Dulbecco's Modified Eagle'sMedium，DMEM)(西格玛公司)适于培养宿主细胞。另外，在以下文献中描述的培养基中的任何培养基都可以用作宿主细胞的培养基：Ham等人,《酶学方法》58:44(1979)；Barnes等人,《分析生物化学(Anal.Biochem.)》102:255(1980)；美国专利第4,767,704号；第4,657,866号；第4,927,762号；第4,560,655号；或第5,122,469号；WO 90/03430；WO87/00195；或美国专利复审程序30,985。这些培养基中的任何培养基都可以根据需要补充激素和/或其它生长因子(如胰岛素、转铁蛋白或表皮生长因子)、盐(如氯化钠、钙、镁和磷酸盐)、缓冲液(如HEPES)、核苷酸(如腺苷和胸苷)、抗生素(如GENTAMYCIN^TM药物)、痕量元素(定义为最终浓度通常在微摩尔范围内的无机化合物)和葡萄糖或等效能量源。也可以以本领域技术人员已知的适当浓度包括任何其它必要的补充物。如温度、pH等培养条件是先前与被选定用于表达的宿主细胞一起使用的那些条件，并且对于本领域技术人员而言将是显而易见的。

当使用重组技术时，抗体可以在胞内、周质间隙中产生，或者直接分泌到培养基中。如果在胞内产生抗体，那么作为第一步骤，可以例如通过离心或超滤来去除宿主细胞或溶解的片段的微粒状碎片。Carter等人,《生物/技术(Bio/Technology)》10:163-167(1992)描述了一种用于分离分泌到大肠杆菌的周质间隙的抗体的程序。简而言之，将细胞糊剂在存在乙酸钠(pH 3.5)、EDTA和苯甲基磺酰氟(PMSF)的情况下经约30分钟解冻。细胞碎片可以通过离心去除。当抗体被分泌到培养基中时，通常首先使用可商购获得的蛋白质浓缩过滤器(例如，Amicon或Millipore Pellicon超滤单元)对来自此类表达系统的上清液进行浓缩。如PMSF等蛋白酶抑制剂可以包括在上述步骤中的任何步骤中以抑制蛋白水解，并且可以包括抗生素以防止外来污染物的生长。

在某些实施方式中，本公开提供了一种产生本文所提供的抗体或其抗原结合片段的方法，所述方法包括：a)向宿主细胞中引入：编码第一重链的第一多核苷酸、编码第一轻链的第二多核苷酸、编码第二重链的第三多核苷酸和编码第二轻链的第四多核苷酸，其中所述第一轻链和所述第一重链包括位于所述第一轻链上的C214X和位于所述第一重链上的C220X的非半胱氨酸取代对和至少一个半胱氨酸取代对；b)允许所述宿主细胞表达多肽复合物。在某些实施方式中，所述至少一个半胱氨酸取代对选自由以下组成的组：(i)位于轻链上的S114C和位于重链上的S136C；(ii)位于轻链上的F116C和位于重链上的S136C；(iii)位于轻链上的F118C和位于重链上的L128C；(iv)位于轻链上的F118C和位于重链上的A129C；(v)位于轻链上的F118C和位于重链上的A141C；(vi)位于轻链上的Q124C和位于重链上的F126C；(vii)位于轻链上的L135C和位于重链上的F170C；(viii)位于轻链上的N137C和位于重链上的F170C；(ix)位于轻链上的N138C和位于重链上的H168C；(x)位于轻链上的T164C和位于重链上的F170C；(xi)位于轻链上的Q160C和位于重链上的V173C；(xii)位于轻链上的Q160C和位于重链上的Q175C；以及(xiii)位于轻链上的S162C和位于重链上的F170C。

在某些实施方式中，所述方法进一步包括分离所述抗体或其抗原结合片段。术语“分离”旨在意指所关注的化合物已经从自然界或制备过程中伴随其的组分中分离或纯化，并以富集的形式提供。

由细胞制备的抗体或其抗原结合片段可以使用例如羟基磷灰石色谱、凝胶电泳、透析、DEAE-纤维素离子交换色谱、硫酸铵沉淀、盐析和亲和色谱来分离。

在某些实施方式中，固定在固相上的蛋白A用于抗体和其抗原结合片段的免疫亲和纯化。蛋白A是否合适作为亲和配体取决于抗体中存在的任何免疫球蛋白Fc结构域的类型和同种型。蛋白A可以用于纯化基于人γ1、γ2或γ4重链的抗体(Lindmark等人,《免疫学方法杂志》62:1-13(1983))。蛋白G被推荐用于所有小鼠同种型和人γ3(Guss等人,《欧洲分子生物学学会杂志(EMBO J.)》5:1567 1575(1986))。亲和配体附着的基质最常为琼脂糖，但其它基质也是可用的。与可以用琼脂糖实现的流速和处理时间相比，机械稳定的基质(如可控孔度玻璃或聚(苯乙烯二乙烯)苯)可实现更快的流速和更短的处理时间。当抗体包含CH3结构域时，Bakerbond ABX^TM树脂(新泽西州菲利普斯堡的马林克罗特贝克有限公司(J.T.Baker,Phillipsburg,N.J.)可用于纯化。根据待回收的抗体，用于蛋白质纯化的其它技术也是可用的，如在离子交换柱上进行分级分离、乙醇沉淀、反相HPLC、在二氧化硅上进行色谱法、在肝素SEPHAROSE^TM上进行色谱法、在阴离子或阳离子交换树脂(如聚天冬氨酸柱)上进行色谱法、色谱聚焦、SDS-PAGE以及硫酸铵沉淀。

在任何初步纯化步骤之后，可以使用盐浓度的梯度洗脱对包括所关注的抗体或其抗原结合片段和污染物的混合物进行疏水相互作用色谱或离子交换色谱。

在某些实施方式中，本文所提供的抗体或其抗原结合片段可以使用常规方法以高产量容易地纯化。抗体或其抗原结合片段的优点之一是重链可变结构域序列与轻链可变结构域序列之间的错配显著减少。这减少了不需要的副产物的产生，并使得使用相对简单的纯化过程以高产量获得高纯度产物成为可能。

IV.药物组合物和施用

本公开进一步提供了药物组合物，所述药物组合物包含抗体或其抗原结合片段和一种或多种药学上可接受的载体。

本公开进一步提供了一种药物组合物，所述药物组合物包含编码抗体或其抗原结合片段的多核苷酸以及一种或多种药学上可接受的载体。本文所提供的抗体也可以通过递送编码本文所提供的抗体或其抗原结合片段的多核苷酸(例如，体外转录的mRNA或表达载体)而在体内产生。用于体内抗体表达的多核苷酸递送的方法是本领域已知的，参见例如Rybakova,Y.等人,《分子疗法(Molecular Therapy)》,第27卷(8),第1415-1423页(2019)；Deal,C.E.等人,《疫苗(Vaccines)》,2021,9,108。

本公开进一步提供了药物组合物，所述药物组合物包括包含编码抗体或其抗原结合片段的多核苷酸的表达载体以及一种或多种药学上可接受的载体。

在某些实施方式中，所述表达载体包括病毒载体或非病毒载体。病毒载体的实例包括但不限于腺相关病毒(AAV)载体、慢病毒载体、逆转录病毒载体和腺病毒载体。非病毒载体的实例包括但不限于裸DNA、质粒、外来体、mRNA等。在某些实施方式中，所述表达载体适用于人类的基因疗法。用于基因疗法的合适载体包括例如腺相关病毒(AAV)或腺病毒载体。在某些实施方式中，所述表达载体包括DNA载体或RNA载体。在某些实施方式中，所述药学上可接受的载体是聚合物赋形剂，如但不限于微球、微胶囊、聚合物胶束和树枝状聚合物。本公开的多核苷酸和/或多核苷酸载体可以通过本领域已知的方法包封、粘附或涂覆在基于聚合物的组分上(参见例如W.Heiser,《非病毒基因转移技术(Nonviral genetransfer technologies)》,由胡玛纳出版社(Humana Press)出版,2004；美国专利6025337；《先进药物递送评论(Advanced Drug Delivery Reviews)》,57(15):2177-2202(2005))。

用于本文所公开的药物组合物的药学上可接受的载体可以包括例如药学上可接受的液体、凝胶或固相载体、水性媒剂、非水性媒剂、抗微生物剂、等渗剂、缓冲液、抗氧化剂、麻醉剂、悬浮剂/分配剂、多价螯合剂或螯合剂、稀释剂、佐剂、赋形剂或无毒辅助物质、本领域已知的其它组分或其各种组合。

合适的组分可以包括例如抗氧化剂、填料、粘结剂、崩解剂、缓冲液、防腐剂、润滑剂、调味剂、增稠剂、着色剂、乳化剂或稳定剂，如糖和环糊精。合适的抗氧化剂可以包括例如甲硫氨酸、抗坏血酸、EDTA、硫代硫酸钠、铂、过氧化氢酶、柠檬酸、半胱氨酸、硫代甘油、巯基乙酸、硫代山梨糖醇、丁基化羟基茴香醚(butylated hydroxanisol)、丁基化羟基甲苯和/或没食子酸丙酯。如本文所公开的，在包括本文所提供的抗体或其抗原结合片段和缀合物的组合物中包括一种或多种如甲硫氨酸等抗氧化剂降低了抗体或其抗原结合片段的氧化。这种氧化降低可防止或减少结合亲和力的丧失，从而提高抗体稳定性并最大化保质期。因此，在某些实施方式中，提供了药物组合物，所述药物组合物包含如本文中所公开的一种或多种抗体或其抗原结合片段和一种或多种如甲硫氨酸等抗氧化剂。进一步提供了用于通过将抗体或抗原结合片段与一种或多种如甲硫氨酸等抗氧化剂混合来防止本文所提供的抗体或抗原结合片段的氧化、延长保质期和/或提高疗效的方法。

为了进一步说明，药学上可接受的载体可以包括例如：水性媒剂，如氯化钠注射液、林格氏注射液(Ringer's injection)、等渗右旋糖注射液、无菌水注射液或右旋糖和乳酸林格氏注射液；非水性媒剂，如植物来源的固定油、棉籽油、玉米油、芝麻油或花生油；细菌抑制或真菌抑制浓度下的抗微生物剂；等渗剂，如氯化钠或右旋糖；缓冲剂，如磷酸盐或柠檬酸盐缓冲剂；抗氧化剂，如硫酸氢钠；局部麻醉剂，如盐酸普鲁卡因；悬浮和分散剂，如羧甲基纤维素钠、羟丙基甲基纤维素或聚乙烯吡咯烷酮；乳化剂，如聚山梨醇酯80(TWEEN-80)；多价螯合剂或螯合剂，如EDTA(乙二胺四乙酸)或EGTA(乙二醇四乙酸)；乙醇；聚乙二醇；丙二醇；氢氧化钠；盐酸；柠檬酸或乳酸。可以将用作载体的抗微生物剂添加到多剂量容器中的药物组合物中，所述抗微生物剂包括苯酚或甲酚、汞剂、苯甲醇、氯丁醇、对羟基苯甲酸甲酯和对羟基苯甲酸丙酯、硫柳汞、苯扎氯铵和苄索氯铵。合适的赋形剂可以包括例如水、盐水、右旋糖、甘油或乙醇。合适的无毒辅助物质可以包括例如润湿剂或乳化剂、pH缓冲剂、稳定剂、溶解度增强剂或如乙酸钠、脱水山梨糖醇单月桂酸酯、三乙醇胺油酸酯或环糊精等药剂。

药物组合物可以是液体溶液、悬浮液、乳液、丸剂、胶囊、片剂、缓释调配物或粉末。口服调配物可以包括标准载体，如医药级的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、聚乙烯吡咯烷酮、糖精钠、纤维素、碳酸镁等。

在某些实施方式中，将药物组合物调配成可注射组合物。可注射药物组合物可以以任何常规形式制备，所述常规形式例如液体溶液、悬浮液、乳液或适用于产生液体溶液、悬浮液或乳液的固体形式。注射制剂可以包括准备注射的无菌和/或无热原溶液、准备在使用前与溶剂组合的无菌干燥可溶性产品(如冻干粉末，包括皮下注射片剂)、准备注射的无菌悬浮液、准备在使用前与媒剂组合的无菌干燥的不溶性产品以及无菌和/或无热原乳液。溶液可以是水性的或非水性的。

在某些实施方式中，单位剂量肠胃外制剂被包装在安瓿、小瓶或带有针头的注射器中。正如本领域已知和实践的一样，所有用于肠胃外施用的制剂都应该是无菌且无热原的。

在某些实施方式中，通过将如本文所公开的抗体或其抗原结合片段溶解在合适的溶剂中来制备无菌冻干粉末。所述溶剂可以包括赋形剂，所述赋形剂可改善粉末或由粉末制备的重构溶液的稳定性或其它药理学组分。可以使用的赋形剂包括但不限于水、葡聚糖、山梨糖醇、果糖、玉米糖浆、木糖醇、甘油、葡萄糖、蔗糖或其它合适的药剂。溶剂可以包括缓冲剂，如柠檬酸盐、磷酸钠或磷酸钾、或本领域技术人员已知的其它此类缓冲剂，在一个实施方式中，所述缓冲剂为约中性pH。随后对溶液进行无菌过滤，然后在本领域技术人员已知的标准条件下冻干，从而提供期望的调配物。在一个实施方式中，将所得溶液分配到小瓶中以冻干。每个小瓶可以含有单剂量或多剂量的抗体或其抗原结合片段或其组合物。用略微高于每次剂量所需或多次剂量所需的量(例如约10％)过填充小瓶是可接受的，以便促进取样精确和给药精确。可以在适当的条件下(如在约4℃至室温下)储存冻干粉末。

用注射用水重构冻干粉末提供了用于在肠胃外施用的调配物。在一个实施方式中，为了重构，将无菌和/或无热原水或其它合适的液体载体添加到冻干粉末中。精确的量取决于给予的所选疗法并且可以根据经验确定。

本文所描述的包含药学上可接受的载体(如其加成盐或水合物)的药物组合物可以通过多种途径或施用方式递送于患者。合适的施用途径包括但不限于吸入、透皮、口服、直肠、经粘膜、肠道和肠胃外施用，包括肌内、皮下和静脉内注射。优选地，包含作为靶向部分的抗体或抗体片段的本发明的药物组合物经胃肠外施用，更优选地静脉内施用。

如本文所使用的，术语“施用(administering)”和“施用(administration)”旨在涵盖将药物组合物直接和间接递送到其预期作用部位的所有方式。

本文所描述的药物组合物或其药学上可接受的盐和/或水合物可以单独施用，和/或与其它治疗剂组合施用。当然，可以与本公开的药物组合物共同施用的治疗剂的选择将部分取决于所治疗的病状。

例如，当向患有由依赖于自诱导物的生物体引起的疾病状态的患者施用时，本公开的药物组合物可以以含有用于治疗疼痛、感染和通常与疾病相关的其它症状和副作用的药剂的混合物的形式施用。此类药剂包括例如镇痛剂、抗生素等。

当向经受癌症治疗的受试者施用时，药物组合物可以以含有抗癌剂和/或辅助增效剂的混合物的形式施用。药物组合物也可以以含有治疗放射疗法的副作用的药剂(如止吐药、放射保护剂等)的混合物的形式施用。

V.试剂盒

另一方面，本公开提供了一种试剂盒，所述试剂盒包括本文所提供的抗体或其抗原结合片段。

在某些实施方式中，本公开提供了一种试剂盒，所述试剂盒包括本文所提供的抗体或其抗原结合片段和第二治疗剂。在某些实施方式中，第二治疗剂选自下组：化学治疗剂、抗癌药物、放射疗法、免疫治疗剂、抗血管生成剂、靶向疗法、细胞疗法、基因疗法、激素疗法、抗病毒剂、抗生素、镇痛剂、抗氧化剂、金属螯合剂和细胞因子。

如将对本领域的技术人员显而易见的是，如果需要，此类试剂盒可以进一步包括各种常规药物试剂盒组件中的一个或多个，例如具有一种或多种药学上可接受的载体的容器、另外的容器等。试剂盒中还可以包括指示待施用的组分的量的说明书(作为插入物或作为标签)、施用指南和/或用于混合组分的指南。试剂盒还可以包括一个或多个小瓶、试管、烧瓶、瓶或注射器。

试剂盒的其它形式对于本领域技术人员来说将是显而易见的，并且在本公开的范围内。

VI.医疗用途

治疗用途

另一方面，本公开提供了一种用于治疗需要此类治疗的受试者的疾病或病状的方法，所述方法包括：向所述受试者施用药物组合物，所述药物组合物包含治疗有效量的本公开的抗体或其抗原结合片段或其药学上可接受的盐以及药学上可接受的载体。

需要治疗的疾病或病状与抗体或其抗原结合片段靶向的抗原有关。在一些实施方式中，所靶向的抗原选自由以下组成的组：SIRPα、CLDN18.2、Siglec15、HER2、EGFR、CD19、CD20、CD39、CD47、PD1、PDL1、CD3、NKG2D、NKG2A、Nkp46、CD137、OX40、CD40等。

在一些实施方式中，本文所公开的药物组合物的用途包括制备用于治疗受试者(如人类)的疾病(如癌症)的药物。本文中的“癌症”是指人类的病理学病状，其特征在于不受调节的细胞增殖。

在一些实施方式中，所述疾病是SIRPα相关疾病、病症或病状，其特征在于表达或过表达SIRPα和/或SIRPα特征基因。在某些实施方式中，SIRPα相关疾病、病症或病状包括但不限于癌症、实体瘤、慢性感染、炎性疾病、多发性硬化症、自身免疫性疾病、神经系统疾病、脑损伤、神经损伤、红细胞增多症、血色沉着症、创伤、败血性休克、纤维化、动脉粥样硬化、肥胖症、II型糖尿病、移植功能障碍或关节炎。

在一些实施方式中，所述疾病是Claudin 18.2相关疾病、病症或病状，其特征在于表达或过表达Claudin 18.2。Claudin 18.2相关疾病的非限制性实例包括癌症。在一些实施方式中，所述癌症是上皮细胞源性癌症。在一些实施方式中，所述癌症是肛门癌、阑尾癌、星形细胞瘤、基底细胞癌、胆囊癌、胃癌、肺癌、支气管癌、骨癌、肝和胆管癌、胰腺癌、乳腺癌、肝癌、卵巢癌、睾丸癌、肾癌、肾盂和输尿管癌、唾液腺癌、小肠癌、尿道癌、膀胱癌、头颈癌、脊柱癌、脑癌、宫颈癌、子宫癌、子宫内膜癌、结肠癌、结直肠癌、直肠癌、食道癌、胃肠癌、皮肤癌、前列腺癌、垂体癌、阴道癌、甲状腺癌、喉癌、胶质母细胞瘤、黑色素瘤、骨髓增生异常综合征、肉瘤、畸胎瘤、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、慢性髓性白血病(CML)、急性淋巴细胞白血病(ALL)、急性髓性白血病(AML)、霍奇金淋巴瘤(Hodgkin lymphoma)、非霍奇金淋巴瘤(non-Hodgkin lymphoma)、多发性骨髓瘤、T或B细胞淋巴瘤、GI器官间质瘤、软组织肿瘤、肝细胞癌或腺癌或其转移。在一些实施方式中，所述癌症是胃癌、胰腺癌、食道癌、卵巢癌或其转移。

术语“治疗(treating)”或“治疗(treatment)”在本文中意指治疗性处理和预防性或预防性处理，其中目的是减少或预防目标病理学病症或病状。在某些实施方式中，“治疗(treatment)”或“治疗(treating)”包括(1)抑制经历或表现出疾病的病理学或症状的受试者的疾病；(2)改善正在经历或表现出疾病的病理学或症状的受试者的疾病；和/或(3)实现正在经历或表现出疾病的病理学或症状的受试者或患者的疾病的任何可测量的减少。

术语“治疗有效量”在本文中意指本文所提供的药物组合物的活性成分(即，抗体或其抗原结合片段)有效“治疗”受试者或哺乳动物的病症的量。适用于本公开的药物组合物包含其中活性成分以治疗有效量，即以有效实现其预期目的的量包含的组合物。对于特定应用有效的实际量将尤其取决于所治疗的病状。有效量的确定完全处于本领域技术人员的能力范围内，特别是根据本文的详细公开。

在癌症的情况下，药物的治疗有效量可以减少癌细胞的数量，减小肿瘤大小，抑制癌细胞浸润到外周器官中，抑制肿瘤转移，在某种程度上抑制肿瘤生长和/或在某种程度上缓解与癌症相关的一种或多种症状。

在一些实施方式中，本文所提供的抗体或其抗原结合片段可以单独施用或与治疗有效量的第二治疗剂组合施用。例如，本文所公开的抗体或其抗原结合片段可以与第二治疗剂组合施用，例如化学治疗剂、抗癌药物、放射疗法、免疫治疗剂、抗血管生成剂、靶向疗法、细胞疗法、基因疗法、激素疗法、抗病毒剂、抗生素、镇痛药、抗氧化剂、金属螯合剂或细胞因子。

在这些实施方式中的某些实施方式中，可以与一种或多种另外的治疗剂同时施用与一或多种另外的治疗剂组合施用的本文所提供的抗体或其抗原结合片段，并且在这些实施方式中的某些实施方式中，抗体或其抗原结合片段和另外的治疗剂可以作为同一药物组合物的一部分施用。

诊断用途

另一方面，本公开提供了一种诊断受试者的疾病、病症或病状的方法，所述方法包括：a)使从所述受试者获得的样品与本文所提供的抗体或其抗原结合片段接触；b)确定样品中抗体或其抗原结合片段靶向的抗原的存在或量；以及c)将相关抗原的存在或量与所述受试者的疾病、病症或病状的存在或状态相关。

术语“诊断(diagnosis)”、“诊断(diagnose)”或“诊断(diagnosing)”是指对病理学状态、疾病或病状的鉴定，如对特异性抗原相关疾病的鉴定，或者是指对可以受益于特定治疗方案的患有特异性抗原相关疾病的受试者的鉴定。在一些实施方式中，诊断包括鉴定特异性抗原的异常量或活性。在一些实施方式中，诊断是指鉴定受试者的癌症或自身免疫性疾病。

如本文所使用的，术语“样品”是指从所关注的受试者获得或源自所关注的受试者的生物组合物，所述生物组合物含有例如待基于物理、生化、化学和/或生理特性表征和/或鉴定的细胞和/或其它分子实体。样品包括但不限于受试者的通过本领域技术人员已知的任何方法获得的细胞、组织、器官和/或生物体液。

另一方面，本公开提供了试剂盒，所述试剂盒包括本文所提供的抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段任选地与可检测部分缀合，所述试剂盒可用于检测疾病、病症或病状。试剂盒可以进一步包括使用说明书。

提供以下实施例以更好地说明所要求保护的发明并且不应将所述实施例解释为限制本发明的范围。下文描述的所有具体组合物、材料和方法全部或部分地落入本公开的范围内。这些具体组合物、材料和方法不旨在限制本发明，而仅用于说明落入本发明范围内的具体实施方式。本领域技术人员可以在不运用发明能力和不脱离本发明范围的情况下开发出等效的组合物、材料和方法。应当理解，可以在本文所述的程序中做出许多变化，同时仍然保持在本公开的界限内。本发明的发明人的意图是此类变化都包括在本发明的范围内。

以下实施例中所有氨基酸位置的编号都是根据EU编号系统的。

实施例：

实施例1：具有移位的CH1-CL链间二硫键的不对称单价抗体的构建与分析

鉴定了抗体上新二硫键形成的多个潜在位点。潜在的位点选自轻链的CL区中和重链的CH1区中的氨基酸残基。一对非半胱氨酸残基(一个位于CL区中，而另一个位于CH1区中)都被半胱氨酸替换，以在其间形成新的二硫键。为每个设计选择一对或两对可能形成新的链间二硫键的此类残基，并突变为半胱氨酸。

此外，CH1中的Cys220与CL中的Cys214之间保守的天然二硫键通过用丝氨酸替换两个残基而被破坏。为了进行初始筛选，设计了易于通过SEC-HPLC读出的测定系统(图1和图2)。

具体而言，所述系统由4条多肽链组成。链1是全长HC，所述全长HC在CH1区中具有半胱氨酸突变(从非半胱氨酸残基到半胱氨酸残基)(链1a用于筛选测定1，图1)或没有半胱氨酸突变(链1b用于筛选测定2，图2)，并且每个链1在Fc区中具有杵或臼突变。链2是全长LC，所述全长LC在CL区中具有相容的半胱氨酸突变。链3是野生型LC，所述野生型LC具有在N末端处融合的单结构域抗体(VHH)。链4是空Fc，所述空Fc具有与全长HC(即，链1a或链1b)中的杵或臼突变相容的臼或杵突变。在此系统的情况下，主要产物(其为单价异二聚体)由两种可能的分子物种组成，这两种分子物种大小不同，并且可在SEC-HPLC谱中容易地辨别且和容易地定量(图1和图2)。在两种筛选测定中，在突变体与野生型肽链之间形成的异二聚体被认为是错配的异二聚体，而设计的突变体链之间或野生型链之间的异二聚体被认为是正确配对的异二聚体。因此，定义为的不同异二聚体的相对丰度(RA)是不同CL和CH1链的配对偏好的直接测量结果。

下表6中列出了两种测定系统的不同多肽链的序列。VH(SEQ ID NO:3)和VL(SEQID NO:2)序列源自人源化抗CLDN18.2抗体。包括CH1区(SEQ ID NO:5)和Fc区(SEQ ID NO:6)的重链恒定区源自人IgG1。轻链恒定区CL(SEQ ID NO:7)源自人κ轻链。VHH结构域(SEQID NO:1)在VL区的N末端处通过连接子(SEQ ID NO:9)连接。所有的DNA片段都是通过化学方法合成的。将四条多肽链中的每一条克隆到pcDNA3.4载体中(图3A至3D)。将四种质粒混合，并共转染到ExpiCHO-S细胞(生命科技公司(Life Technologies))中。然后使用24孔板生产系统在ExpiCHO-S细胞中产生经表达的蛋白质变体。转染后7天通过离心收集培养上清液，并将其与蛋白A磁珠(金斯瑞公司(GenScript))一起温育。用0.05M柠檬酸缓冲液(pH3.4)洗脱结合的抗体，并立即用Tris缓冲液(pH9.0)中和。经纯化的抗体通过SDS-PAGE和SEC-HPLC(安捷伦公司(Agilent))进行评估。

表6.用于筛选测定1和2的多肽链的氨基酸序列

在链2的CL区中的各个位置(包括位置114、116、118、121、124、135、137、138、160、164)处的一个或两个非半胱氨酸残基被突变为半胱氨酸，并且在链1的CH1区中的各个位置(包括位置126、128、129、136、141、168、170、173、175、187)处的一个或两个非半胱氨酸残基被突变为半胱氨酸。使用上述突变位点形成链1与链2之间的多个突变对，并将所述多个突变对用于筛选测定1。

在筛选测定1中，野生型和突变体CL竞争突变体CH1。在链2(具有突变体CL)与链1a(具有突变体CH1)之间形成正确的配对，而在链3(具有野生型CL)与链1a(具有突变体CH1)之间形成错配。

在筛选测定1中，测试了VL-CL(在CL区中具有突变)和VH-CH1-Fc(在CH1区中具有突变，并且在Fc区中具有杵/臼突变)的许多突变组合。表7和图4A示出了产生高RA值的一些突变体对的RA值。ACF_003在此筛选测定1中用作基准。ACF_003(包括轻链上的S121C和重链上的F126C的突变组合)在CL区和CH1区中具有如美国专利第9,527,927号中公开的V12的对应突变。

表7筛选测定1中测试的示出高RA值的突变组合

在筛选测定2中，突变体和野生型CL竞争野生型CH1。通过与筛选测定1中相同的方程计算筛选测定2中使用的突变体对的RA值，除了正确配对仅在链3(具有野生型CL)与链1b(具有野生型CH1)之间形成，并且错配在链2(具有突变体CL)与链1b(具有野生型CH1)之间形成之外。

表8中列出了产生高RA值的突变对。ACF_245在此筛选测定2中用作基准。ACF_245(包括轻链上的S121C突变和重链上没有突变)除了重链上没有突变之外，在CL区中具有与ACF_003相对应的突变。表8和图4B示出了产生高RA值的一些突变体对的RA。

表8筛选测定2中测试的示出高RA值的突变组合。

实施例2：具有偏移的CH1-CL二硫键的对称二价单特异性抗体的构建与分析

为了进一步评估在还原论系统中所选突变体的表达水平和稳定性，将从实施例1的实验中选择的一些突变体对转化为对称二价单特异性抗体(图5，表9)以进行产量和纯度测试。

所有突变都是基于亲本抗体hu28产生的。hu28的VL区和VH区的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:2和3所示。hu28的CL区的氨基酸序列如SED ID NO:4所示。hu28的CH1区的氨基酸序列如SED ID NO:5所示。hu28的Fc区的氨基酸序列如SED ID NO:6所示。

表9.用于测试的二价单特异性抗体中的突变组合。

合成所有DNA片段并将其克隆到pcDNA3.4载体中。使用24孔板生产系统将含有所选残基取代对的LC和HC载体共转染到ExpiCHO-S细胞中，并用蛋白A珠进行纯化。首先通过SDS-PAGE和HPLC-SEC评估经纯化的抗体的纯度。图6A和6B中分别示出了每种抗体的产量和纯度。将医学免疫公司(MedImmune)在美国专利第9,527,927号中报告的含有残基取代对的ACF-hu28_001用作参考进行比较。

如图6A和6B中的结果所示，ACF-hu28_025、ACF-hu28_038、ACF-hu28_029、ACF-hu28_037、ACF-hu28_002、ACF-hu28_031、ACF-hu28_034、ACF-hu28_032、ACF-hu28_014、ACF-hu28_016、ACF-hu28_012、ACF-hu28_011、ACF-hu28_004、ACF-hu28_015、ACF-hu28_020、ACF-hu28_035、ACF-hu28_022、ACF-hu28_018、ACF-hu28_036、ACF-hu28_010、ACF-hu28_030、ACF-hu28_039、ACF-hu28_019、ACF-hu28_024、ACF-hu28_028、ACF-hu28_023,、ACF-hu28_005、ACF-hu28_003具有与参考单克隆抗体ACF hu28_001(S121C/C214S，F126C/C220S)相当或更高的产量和单体百分比。

实施例3.二价单特异性抗体的抗原结合测量和热稳定性比较

3.1通过FACS测定评估结合活性

使用过表达CLDN18.2的MC38细胞，通过FACS比较所有所选二价变体与CLDN18.2的结合(图7A至7D)。将所有蛋白质的缓冲液更换为PBS(pH 7.2)，并用FACS缓冲液(BD)稀释成不同浓度(100nM、20nM、4nM、0.8nM)。Hu28 mAb用作阳性对照。

在变体与阳性对照mAb之间没有观察到抗原结合活性的显著差异。

3.2突变体mAb的热稳定性分析

使用热偏移测定评估经纯化的变体的热稳定性(图8)。在与新鲜稀释的蛋白质热偏移染料(赛默飞世尔科技公司(Thermo Fisher Scientific))混合之前，首先将抗体变体的缓冲液更换为PBS(pH 7.2)中。然后将混合物转移到384孔板中，并装载到QuantStudio实时PCR系统(赛默飞世尔科技公司)上以进行Tm测量。温度从25℃扫描至99℃，其中斜升速率为1.6℃/秒，并且保持时间为2分钟。用蛋白质热偏移软件分析所获得的熔融曲线。数据表明，所有变体都具有与野生型单克隆抗体相当的热稳定性。

实施例4.不对称双特异性抗体的产生和LC-MS分析

为了定量评估在双特异性背景下同源CH1和CL链配对的效率，产生了两个系列的双特异性抗体并用LC-MS进行分析。

在两个系列中，双特异性抗体的一个臂源自抗CLDN 18.2抗体(hu28)，并且另一个臂源自抗SIRPα抗体(hu25)。将杵突变引入到hu28臂的CH3区中，并且将臼突变引入到hu25臂的CH3区中。此外，消除蛋白A结合的突变被引入到hu25臂中以简化系统。

hu25的VH区和VL区的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:10和11所示(如表10中所示)。hu28的VH区和VL区的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:2和3所示。hu25或hu28的非突变CL区的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示。hu25或hu28的非突变CH1区的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示。hu25或hu28的Fc(具有“臼”突变)的氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示。hu25或hu28的Fc(具有“杵”突变)的氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示。

表10.hu25的氨基酸序列。

在案例1研究中，移位的二硫键形成的不同突变对被引入到hu28臂的CH1区和CL区中，并且野生型序列保留在hu25臂中(图9和10，表11)。

在案例2研究中，同一组突变对被引入到hu25臂中，并且野生型序列保留在hu28臂中(图11和12，表11)。

表11.案例1和案例2中的不同构建体设计

表12中示出了为测试构建的所有突变组合。

表12.用于测试的案例1研究和案例2研究中的突变组合。

为了产生双特异性抗体，在共转染之前，将hu28 HC和LC的质粒与hu25 HC和LC的质粒混合。使用24孔板生产系统在ExpiCHO-S细胞(生命科技公司)中生产变体。转染后7天通过离心收集培养上清液，并将其与蛋白A磁珠(金斯瑞公司)一起温育。用0.05M柠檬酸缓冲液(pH 3.4)洗脱结合的抗体，并立即用Tris缓冲液(pH 9.0)中和。首先用SDS-PAGE分析经纯化的抗体(图13A和13B)。

为了定量评估同源CH1和CL链配对的效率，通过LC-MS在非还原条件下分析经纯化的抗体。由于LC-MS分析中样品处理条件的变性性质，含有错配HC-LC(CH1突变的HC与野生型LC配对，或未经CH1修饰的HC与CL突变的LC配对)的分子将被解离，并在LC-MS谱中仅示出LC峰。因此，理论上，所有含有异二聚体HC的分子都将被检测到。具有两个正确配对的LC的异二聚体HC是期望的双特异性完整抗体。具有错配的LC的异二聚体HC通过LC-MS谱中的错配和解离的LC峰来检测。通过评估源自CH1-CL错配的仅LC峰的MS信号的强度，可以对不同突变对的同源CH1和CL链配对效率进行排序(图9和11)。

通过差示扫描荧光法评估抗体的热稳定性。

在病例1研究中，与基准ACF_326(医学免疫公司设计)相比，ACF_329、333、337、338和339的hu025 LC展现出较低的信号，并且hu028 LC展现出相等的信号(图10)。这些数据指示，ACF_329、333、337、338和339中引入的突变对在此情况下提供了更高的同源CH1和CL链配对效率。

在病例2研究中，ACF_356、359、361、364、365、366、367、368展现出hu025 LC和hu028 LC的信号与基准ACF_355(医学免疫公司设计)相当(图12)。这些数据指示，ACF_356、359、361、364、365、366、367和368中引入的突变对提供了高同源CH1和CL链配对效率。

值得注意的是，下面列出的突变对在两种情况下都提供了高同源CH1和CL链配对效率：(i)位于轻链上的F118C/Q124C和位于重链上的L128C/F126C；(ii)位于轻链上的Q124C/T164C和位于重链上的F126C/F170C；(iii)位于轻链上的F118C/S162C和位于重链上的L128C/F170C；(iv)位于轻链上的F118C/S162C和位于重链上的A141C/F170C；以及(v)位于轻链上的Q124C/S162C和位于重链上的F126C/F170C。

实施例5.不对称双特异性抗体的进一步产生和分析

5.1蛋白质表达和纯化

5.1.1被测抗体的构建体和氨基酸序列

表达并纯化了三种双特异性抗体，即抗体1、抗体2和抗体3。

在抗体1研究中，位于轻链上的Q124C/T164C/C214S和位于重链上的F126C/F170C/C220S的突变对被引入到hu25臂中，并且野生型序列保留在hu28臂中。抗体1具有与实施例4中的抗体ACF_361相同的结构和氨基酸序列。因此，下文中将其指示为ACF_361或ACF361。

在抗体2研究中，位于轻链上的Q124C/T164C/C214S和位于重链上的F126C/F170C/C220S的突变对被引入到hu25臂中，并且野生型序列保留在hu29(源序列：阿特珠单抗(Atezolizumab)，一种抗PDL1抗体)臂中。下文中将抗体2指示为ACF_389或ACF389。

hu25的VH区和VL区的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:10和11所示(表10)。hu29的VH区和VL区的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:12和13所示(表11)。hu25或hu29的非突变的CL区的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示。hu25或hu29的非突变的CH1区的氨基酸序列如SEQ IDNO:5所示。hu25或hu29的Fc(具有“臼”突变)的氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示。hu25或hu29的Fc(具有“杵”突变)的氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示。

表11.hu29的重链可变区和轻链可变区的氨基酸序列

在抗体3研究中，位于轻链上的Q124C/S162C/C214S和位于重链上的F126C/F170C/C220S的突变对被引入到H95臂中，并且野生型序列保留在H43臂中。下文中将抗体3指示为ESB07.451。

H95的VH区和VL区的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:14和15所示。H43的VH区和VL区的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:16和17所示。H95或H43的非突变的CL区的氨基酸序列如SEQ ID NO:19所示。H95或H43的非突变的CH1区的氨基酸序列如SEQ ID NO:18所示。H43的Fc(具有“臼”突变)的氨基酸序列如SEQ ID NO:21所示。H95的Fc(具有“杵”突变)的氨基酸序列如SEQ ID NO:20所示。

表12.H95和H43的氨基酸序列

5.1.2被测抗体的表达和纯化

为了产生双特异性抗体，在共转染之前，将hu28 HC和LC的质粒与hu25 HC和LC的质粒混合，将hu29 HC和LC的质粒与hu25 HC和LC的质粒混合，并将H95 HC和LC的质粒与H43HC和LC的质粒混合。

变体是在ExpiCHO-S细胞(生命科技公司)中产生的。转染后7天，通过离心收集培养上清液，并将其与耐碱蛋白A培养基(AT蛋白ADiamond，博格隆生物技术有限公司(bestchrom))一起温育。用0.05M柠檬酸缓冲液(pH 3.4)洗脱结合的抗体，并立即用Tris缓冲液(pH 9.0)中和。首先用SDS-PAGE和SEC分析经纯化的抗体。图14、图17和图22分别示出了ACF_361、ACF_389和ESB07.451的结果。

对于ACF_389和ESB07.451，为了获得更纯的样品，使用Mono S色谱(5/50GL，思拓凡公司(Cytiva))。装载抗体并用缓冲液A(10mM乙酸钠，pH 5.2)洗涤，然后用缓冲液B梯度(10mM乙酸钠，pH 5.2，250mM NaCl)洗脱。图18和19中示出了ACF_389的结果。图22和23中示出了ESB07.451的结果。

为了定量评估同源CH1和CL链配对的效率，通过LC-MS在非还原条件下分析经纯化的抗体。图15、图20和图24分别示出了ACF_361、ACF_389和ESB07.451的结果。根据LC-MS结果，145KD附近的峰是同源CH1/CL配对，这表明三种抗体被正确组装。

5.2结合亲和力测定

5.2.1与过表达CLDN18.2和SIRPα的细胞的结合亲和力

通过FACS分析双特异性抗体ACF_361与细胞的双重结合特性。

将每孔1×10⁵个表达CLDN18.2的MC38细胞与100nM至0.05nM的各经纯化的抗体一起温育1小时，并且然后与第2抗体Alexa Flour 647抗人IgG(H+L)一起温育。

在此测定中，ES028-h26、ES028-h28、AE016-201和ES028-005-08-26H1L2-201用作阳性对照，并且hIgG1(不与CLDN18.2或SIRPα特异性结合的同种型对照，下同)用作阴性对照。图16A中示出了每种被测抗体的信息。ES028-h26和ES028-h28两者都是靶向CLDN18.2的单特异性IgG抗体。AE016-201是靶向CLDN18.2和SIRPα的双特异性抗体(其中scFv连接于IgG)。ES028-005-08-26H1L2-201是靶向CLDN18.2和SIRPα的双特异性抗体(其中scFv连接于IgG)。

图16A中示出了抗体与MC38-CLDN18.2细胞的结合曲线。

将每孔1×10⁵个CHO/SIRPαV1细胞与100Nm至0.05Nm的各经纯化的抗体一起温育1小时，并且然后与第2抗体Alexa Flour 647抗人IgG(H+L)一起温育。

在此测定中，ES001-025.201-IgG1LALA、ES028-005-08-26H1L2-201、AE016-201用作阳性对照，并且hIgG1同种型用作阴性对照。图16B中示出了每种被测抗体的信息。ES001-025.201-IgG1LALA是靶向SIRPα的单特异性IgG抗体，其中在抗体的Fc区上具有LALA突变。ES028-005-08-26H1L2-201和AE016-201两者都是靶向CLDN18.2和SIRPα的双特异性抗体(其中scFv连接于IgG)。

图16B中示出了抗体与CHO/SIRPαV1细胞的结合曲线。

5.2.2与过表达PDL1和SIRPα的细胞的结合亲和力

通过FACS分析双特异性抗体ACF_389对细胞的双重结合特性。将每孔1×10⁵个表达PDL1的Raji细胞与100nM至0.05nM的各经纯化的抗体一起温育1小时，并且然后与第2抗体Alexa Flour 647抗人IgG(H+L)一起温育。

在此测定中，阿特珠单抗用作阳性对照，并且ES004-025.201-IgG4、hIgG1和hIgG4(不与CLDN18.2或SIRPα特异性结合的同种型对照，下同)用作阴性对照。阿特珠单抗是一种已知的抗PDL1抗体，其详细信息可以在例如US9873740B2中找到。ES004-025.201-IgG4是靶向SIRPα的单特异性抗体。

图21A中示出了抗体与Raji/PDL1细胞的结合曲线。

将每孔1×10⁵个CHO/SIRP V1细胞与100nM至0.05nM的每种经纯化的抗体一起温育1小时，并且然后与第2抗体Alexa Flour 647抗人IgG(H+L)一起温育。

在此测定中，ES004-025.201-IgG4用作阳性对照，并且阿特珠单抗、hIgG1和hIgG4用作阴性对照。上文中描述了抗体的信息。

图21B中示出了抗体与CHO/SIRPαV1细胞的结合曲线。

5.3双特异性抗体的吞噬活性

本测定中测试了ACF_361的吞噬活性。

为了获得单细胞悬浮液，用细胞消化液在37℃下消化小噬细胞10分钟，然后添加细胞培养基以停止消化。在400g下离心5分钟后，将巨噬细胞以3×10⁴/孔重新接种于96孔板，并在37℃下回收过夜。用CD11b和F4/80对小鼠BMDM细胞进行染色以评估质量和纯度。第二天，添加25μl浓度为0.05nM至10nM的稀释的Abs和50μl 6×10⁴Violet CSFE标记的Raji-CLDN18.2细胞/孔，并在37℃下温育3小时。用DPBS洗涤细胞，并且用细胞消化液在37℃下消化10分钟，并且然后用FACS缓冲液洗涤经消化的细胞。将细胞与抗小鼠F4/80APC在4℃下温育30分钟。用FACS缓冲液洗涤和悬浮染色的细胞。通过FACS确定吞噬作用的百分比。

在此测定中，ES028-005-08-26H1L2-201和AE016-201用作阳性对照，并且hIgG1+hIgG4、抗SIRPα单特异性抗体、两种抗CLDN18.2抗体(抗CLDN18.2.h26和抗CLDN18.2.h28)和组合用作阴性对照。ES028-005-08-26H1L2-201和AE016-201两者都是靶向CLDN18.2和SIRPα的双特异性抗体(其中scFv连接于IgG)。添加等摩尔的抗CLDN18.2 hu26(hIgG1)和抗SIRPαhu25.060(hIgG4)作为组合治疗组(即，组合)。添加等摩尔的hIgG1和hIgG4作为同种型对照组(即，hIgG1+hIgG4)。

图16C中示出了汇总数据。

5.4疏水性评估

HIC-HPLC测定中的保留时间是评价抗体疏水性的因素。将15μl 0.25mg/ml抗体注入安捷伦公司1260系统中的MacPac-10 HIC柱中，并且检测280nm/214nm处的信号。如表13所示，ACF_361、ACF_389和ESB07.451在MacPac-10 HIC中的保留时间分别为8.413分钟、13.583分钟和9.9分钟，这表示三种双特异性抗体的疏水性低。

表13.HIC-HPLC测定中抗体的保留时间

样品名称	RT-HIC-UPLC(分钟)
		ACF_361	8.413
ACF_389	13.583
		ESB07.451	9.9

5.5稳定性测试

5.5.1热稳定性评估

检测双特异性抗体在PBS缓冲液中的熔融温度(Tm)值以预测其热稳定性。简而言之，将双特异性抗体在10mM PBS缓冲液(pH 7.2-7.4)中溶解。然后使用QuantStudio 7Flex实时PCR系统通过差示扫描荧光法(DSF)检测Tm值。如表14中所示，ACF_361、ACF_389和ESB07.451的Tm值指示双特异性抗体具有良好的热稳定性。

表14.抗体的Tm值

样品名称	Tm1-DSF(℃)	Tm2-DSF(℃)
			ACF_361	68.7	80.7
ACF_389	68.7	84.8
			ESB07.451	69.2	74.3

5.5.2低pH稳定性评估

在低pH条件下良好的稳定性对抗体而言是重要的，因为纯化过程通常涉及暴露于酸性溶液条件和常用的低pH病毒灭活。低pH值通常会产生可溶的、不可溶的聚集体，并加速碎裂。因此，为了评估蛋白质在低pH条件下的稳定性，用乙酸将PBS缓冲液中的双特异性抗体滴定至pH 3.0-3.5。然后通过监测暴露于低pH值溶液2小时前后的总可溶性蛋白(回收率)和纯度的变化来评估抗体的稳定性。

表15中示出了结果，其中T0指示原始样品的数据，并且低pH 2小时表示2小时后在低pH下的数据。可以看出，暴露于低pH溶液2小时使总纯度几乎没有变化，表示所有三种抗体ACF_361、ACF_389和ESB07.451在低pH条件下都具有良好的稳定性。

表15.抗体的低pH稳定性

5.5.3冻融应力下的稳定性

经常探索冻融稳定性，以确定产品经常暴露的抗体对温度循环的敏感性。例如，药物物质通常被冷冻以使得能够长期储存。作为冻干过程的一部分，药物产品可能会暴露于冷冻温度。冻融的主要降解路经是聚集体，包括沉淀物、颗粒和可溶性颗粒。因此，通过监测重复冻融处理前后的纯度变化来评估双特异性抗体的冻融稳定性。简而言之，将20mM PBS(pH 6.0-6.2)中的抗体冷冻至-80℃超过12小时，并且然后在室温下解冻。在5次重复的冻融循环后，测定应激处理的样品的浓度和纯度。

表16中示出了结果，其中T0指示原始样品的数据，并且FT5指示冻融五次后的数据。可以看出，ACF_361、ACF_389和ESB07.451在多次冻融循环后均未出现明显的聚集和碎裂增加，指示所有三种抗体均具有良好的冻融稳定性。

表16：抗体在冻融应力下的稳定性

5.5.4热应力下的稳定性

在超过正常储存条件的温度下的热应力可能加速降解，由此增加潜在降解通路的可检测性，以提供关于在预期储存条件下长期降解的信息。双特异性抗体在PBS中的热应力测试在25℃和/或40℃下进行4周。检测SEC纯度以监测不溶性或可溶性聚集体。

表17中示出了结果，其中T0指示原始样品的数据，25C-2W指示在25℃以下持续2W的数据，并且其它命名规则类似。可以看出，在25℃下温育4周后，PBS中的ACF_361和ACF_389的纯度变化不大，并且在25℃和40℃下温育4周后，PBS中的ESB07.451的纯度变化不大。

表17.抗体在热应力下的稳定性

Claims (38)

1.一种抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包括第一臂和第二臂，所述第一臂由第一重链和第一轻链以及在其间形成的链间二硫键形成，所述第二臂由第二重链和第二轻链以及在其间形成的链间二硫键形成，

其中所述第一重链上的至少一个非半胱氨酸残基被半胱氨酸取代，其中所述非半胱氨酸残基位于选自由以下组成的组的位置处：所述第一重链的氨基酸位置126、128、129、136、141、168、170、173、175或187；并且

所述第一轻链上的至少一个非半胱氨酸残基被半胱氨酸取代，其中所述非半胱氨酸残基位于选自由以下组成的组的位置处：所述第一轻链的氨基酸位置114、116、118、124、135、137、138、160、162或164。

2.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其中

所述第一重链上被半胱氨酸取代的所述至少一个非半胱氨酸残基选自由以下组成的组：所述第一重链的氨基酸残基F126、L128、A129、S136、A141、H168、F170、V173、Q175或T187；并且

所述第一轻链上被半胱氨酸取代的所述至少一个非半胱氨酸残基选自由以下组成的组：所述第一轻链的氨基酸残基S114、F116、F118、Q124、L135、N137、N138、Q160、S162或T164。

3.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述第一轻链和所述第一重链包括对所述第一轻链上的天然半胱氨酸和所述第一重链上的天然半胱氨酸的至少一个非半胱氨酸取代对以及至少一个选自由以下组成的组的半胱氨酸取代对：

(i)位于轻链上的S114C和位于重链上的S136C；

(ii)位于轻链上的F116C和位于重链上的S136C；

(iii)位于轻链上的F118C和位于重链上的L128C；

(iv)位于轻链上的F118C和位于重链上的A129C；

(v)位于轻链上的F118C和位于重链上的A141C；

(vi)位于轻链上的Q124C和位于重链上的F126C；

(vii)位于轻链上的L135C和位于重链上的F170C；

(viii)位于轻链上的N137C和位于重链上的F170C；

(ix)位于轻链上的N138C和位于重链上的H168C；

(x)位于轻链上的Q160C和位于重链上的V173C；

(xi)位于轻链上的Q160C和位于重链上的Q175C；

(xii)位于轻链上的S162C和位于重链上的F170C；

(xiii)位于轻链上的S162C和位于重链上的T187C；以及

(xiv)位于轻链上的T164C和位于重链上的F170C；

其中所述至少一个半胱氨酸取代对在所述第一重链与所述第一轻链之间形成至少一个链间二硫键；

其中所述第一重链和所述第一轻链上的所述天然半胱氨酸独立地被非半胱氨酸残基中的任一者取代。

4.根据权利要求3所述的抗体或其抗原结合片段，所述第一重链和所述第一轻链上的所述天然半胱氨酸独立地被丝氨酸、丙氨酸、甘氨酸或缬氨酸中的任一者取代。

5.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述第一重链和所述第一轻链包括一个半胱氨酸取代对。

6.根据权利要求5所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述第一重链和所述第一轻链包括两个半胱氨酸取代对。

7.根据权利要求6所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述两个半胱氨酸取代对选自由以下组成的组：

(i)位于轻链上的S114C/Q160C和位于重链上的S136C/V173C；

(ii)位于轻链上的F118C/Q124C和位于重链上的L128C/F126C；

(iii)位于轻链上的F118C/Q124C和位于重链上的A129C/F126C；

(iv)位于轻链上的F118C/Q124C和位于重链上的A141C/F126C；

(v)位于轻链上的F116C/Q124C和位于重链上的S136C/F126C；

(vi)位于轻链上的Q124C/T164C和位于重链上的F126C/F170C；

(vii)位于轻链上的Q124C/N138C和位于重链上的F126C/H168C；

(viii)位于轻链上的Q160C/L135C和位于重链上的Q175C/F170C；

(ix)位于轻链上的S114C/S162C和位于重链上的S136C/F170C；

(x)位于轻链上的F118C/S162C和位于重链上的L128C/F170C；

(xi)位于轻链上的F118C/S162C和位于重链上的A141C/F170C；

(xii)位于轻链上的Q124C/S162C和位于重链上的F126C/F170C；

(xiii)位于轻链上的N137C/S162C和位于重链上的F170C/T187C；

(xiv)位于轻链上的Q124C/T164C/C214S和位于重链上的F126C/F170C/C220S；以及

(xv)位于轻链上的Q124C/S162C/C214S和位于重链上的F126C/F170C/C220S。

8.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述第二重链与所述第二轻链之间的所述链间二硫键在所述第二轻链上的天然半胱氨酸与所述第二重链上的天然半胱氨酸之间形成；

其中所述天然半胱氨酸在所述第二轻链上的位置与人κ链上的位置C214相对应，并且所述天然半胱氨酸在所述第二重链上的位置与人IgG1上的位置C220相对应。

9.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述第二轻链和所述第二重链包括至少一个非半胱氨酸取代对，其中所述轻链上的天然半胱氨酸取代为丝氨酸和所述重链上的天然半胱氨酸取代为丝氨酸，以及至少一个选自由以下组成的组的半胱氨酸取代对：

(i)位于轻链上的S114C和位于重链上的S136C；

(ii)位于轻链上的F116C和位于重链上的S136C；

(iii)位于轻链上的F118C和位于重链上的L128C；

(iv)位于轻链上的F118C和位于重链上的A129C；

(v)位于轻链上的F118C和位于重链上的A141C；

(vi)位于轻链上的Q124C和位于重链上的F126C；

(vii)位于轻链上的L135C和位于重链上的F170C；

(viii)位于轻链上的N137C和位于重链上的F170C；

(ix)位于轻链上的N138C和位于重链上的H168C；

(x)位于轻链上的Q160C和位于重链上的V173C；

(xi)位于轻链上的Q160C和位于重链上的Q175C；

(xii)位于轻链上的S162C和位于重链上的F170C；

(xiii)位于轻链上的S162C和位于重链上的T187C；以及

(xiv)位于轻链上的T164C和位于重链上的F170C；

其中所述至少一个半胱氨酸取代对在所述第二轻链与所述第二重链之间形成至少一个链间二硫键，并且所述第一臂上的所述半胱氨酸取代对不同于所述第二臂上的所述半胱氨酸取代对。

10.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其中在所述第二轻链上取代的天然半胱氨酸位于所述人κ链上的位置C214处，并且在所述第二重链上取代的天然半胱氨酸位于所述人IgG1上的位置C220处。

11.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述第二重链和所述第二轻链包括两个半胱氨酸取代对。

12.根据权利要求11所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述两个半胱氨酸取代对选自由以下组成的组：

(i)位于轻链上的S114C/Q160C和位于重链上的S136C/V173C；

(ii)位于轻链上的F118C/Q124C和位于重链上的L128C/F126C；

(iii)位于轻链上的F118C/Q124C和位于重链上的A129C/F126C；

(iv)位于轻链上的F118C/Q124C和位于重链上的A141C/F126C；

(v)位于轻链上的F116C/Q124C和位于重链上的S136C/F126C；

(vi)位于轻链上的Q124C/T164C和位于重链上的F126C/F170C；

(vii)位于轻链上的Q124C/N138C和位于重链上的F126C/H168C；

(viii)位于轻链上的Q160C/L135C和位于重链上的Q175C/F170C；

(ix)位于轻链上的S114C/S162C和位于重链上的S136C/F170C；

(x)位于轻链上的F118C/S162C和位于重链上的L128C/F170C；

(xi)位于轻链上的F118C/S162C和位于重链上的A141C/F170C；

(xii)位于轻链上的Q124C/S162C和位于重链上的F126C/F170C；以及

(xiii)位于轻链上的N137C/S162C和位于重链上的F170C/T187C；

其中所述第一臂上的所述半胱氨酸取代对不同于所述第二臂上的所述半胱氨酸取代对。

13.根据权利要求1至12中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中

第一重链恒定区和/或第二重链恒定区包括人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4；并且

第一轻链恒定区和/或第二轻链恒定区包括人κ轻链或人λ轻链。

14.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述第一重链和所述第二重链形成异二聚体；并且所述第一重链恒定区的Fc区和/或所述第二重链恒定区的Fc区包括一个或多个促进异二聚体化的修饰。

15.根据权利要求14所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述第一重链的Fc区通过杵/臼(Knob/Hole)结构与所述第二重链的Fc区相互作用。

16.根据权利要求15所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述第一重链的Fc区包括杵(Knob)突变，并且所述第二重链的Fc区包括臼(Hole)突变；或者所述第一重链的Fc区包括臼突变，并且所述第二重链的Fc区包括杵突变。

17.根据权利要求16所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述杵突变包括T366W，并且所述臼突变包括T366S/L368A/Y407V。

18.根据权利要求14所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述促进异二聚体化的修饰包括引入能够形成链间二硫键的半胱氨酸残基。

19.根据权利要求14所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述第一重链恒定区的Fc区和所述第二重链恒定区的Fc区分别包括CH3区中的修饰；其中两个CH3区中的所述修饰选自以下：

。

20.根据权利要求14所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述第一重链恒定区的Fc区和所述第二重链恒定区的Fc区分别包括CH3区中的修饰；其中两个CH3区中的所述修饰选自以下：

。

21.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述第一臂和所述第二臂能够与选自由以下组成的组的抗原特异性结合：SIRPα、CLDN18.2、Siglec15、HER2、EGFR、CD19、CD20、CD39、CD47、PD1、PDL1、CD3、NKG2D、NKG2A、Nkp46、CD137、OX40、CD40、LILRB1、LILRB2、LILRB4、GPC3、TROP2、CD112、TIGIT、FAP、VEGFA、DLL4、ANG-2，其中所述第一臂和所述第二臂可以与不同的抗原特异性结合。

22.根据权利要求14所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述第一重链恒定区的Fc区和/或所述第二重链恒定区的Fc区进一步包括改善所述抗体或所述抗原结合片段的稳定性的修饰。

23.根据前述权利要求中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其是人源化抗体或嵌合抗体。

24.根据前述权利要求中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其是双特异性抗体或多特异性抗体。

25.根据前述权利要求中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其连接于一个或多个缀合物部分。

26.根据权利要求25所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述缀合物部分包括第二抗体片段。

27.根据权利要求26所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包括Fab片段，所述Fab片段连接于所述第二抗体片段的Fc区的C末端。

28.根据权利要求25所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述缀合物部分包括用于检测或分离的药剂，如清除改性剂、发光标记、荧光标记、酶底物标记或纯化部分。

29.根据权利要求25所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述缀合物部分包括治疗剂或药物。

30.一种分离的多核苷酸，其编码根据前述权利要求中任一项所述的抗体或其抗原结合片段。

31.一种载体，其包括根据权利要求30所述的分离的多核苷酸。

32.一种宿主细胞，其包括根据权利要求31所述的载体。

33.一种药物组合物，其包含：

(i)根据权利要求1至29中任一项所述的抗体或其抗原结合片段或根据权利要求30所述的多核苷酸；以及

(ii)一种或多种药学上可接受的载体。

34.一种表达根据权利要求1至29中任一项所述的抗体或其抗原结合片段的方法，所述方法包括在适于表达根据权利要求32所述的宿主细胞中所含的载体的条件下培养所述宿主细胞。

35.一种在受试者中治疗、预防或减轻疾病的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的根据权利要求1至29中任一项所述的抗体或其抗原结合片段、或根据权利要求30所述的编码所述抗体或其抗原结合片段的多核苷酸、或根据权利要求31所述的载体、或根据权利要求32所述的宿主细胞，或根据权利要求33所述的药物组合物。

36.根据权利要求35所述的方法，其中所述受试者是人。

37.根据权利要求35或36所述的方法，其中所述施用经口、经鼻、静脉内、皮下、舌下或肌肉内施用进行。

38.一种根据权利要求1至29中任一项所述的抗体或其抗原结合片段、或根据权利要求30所述的编码所述抗体或其抗原结合片段的多核苷酸、或根据权利要求31所述的载体、或根据权利要求32所述的宿主细胞或根据权利要求33所述的药物组合物在制备用于在受试者中治疗、预防或减轻疾病的药物中的用途。