HK40096554A - 一种治疗耐碳青霉烯肺炎克雷伯氏菌感染的组合物 - Google Patents

Description

一种治疗耐碳青霉烯肺炎克雷伯氏菌感染的组合物

技术领域

本发明涉及一种由抗生素利福平和抗病毒药物齐多夫定组合而成的药物组合物，及其制备方法和应用。

背景技术

利福平与齐多夫定皆为获得FDA批准的临床药物。利福平是流感嗜血杆菌、脑膜炎球菌和结核分枝杆菌的强抑制剂。齐多夫定则是一种长期通用的对HIV病毒有很强活性的药物。齐多夫定的抗菌活性早在1987年就有所报道，现已知它对多种肠杆菌科的革兰氏阴性细菌有抗菌活性。

当前，肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)是第二大流行的革兰氏阴性细菌病原体，可引起多种感染，例如菌血症、脑膜炎、化脓性肝脓肿(PLA)、肺炎和腹腔感染等。这些感染常常威胁到一些器官移植、慢性肝病和肾功能不全等高风险群体患者。这种病原体在医院设备中具备快速传播的能力且已在全球范围内引起了多次爆发。

据研究报道，肺炎克雷伯氏菌质粒编码许多毒力因子，如参与荚膜形成、菌毛形成、抗性血清和铁载体相关的因子。这些毒力因子使肺炎克雷伯氏菌能够逃脱病人的免疫系统，并引起全身性的致命感染。

多药耐药型的肺炎克雷伯氏菌的出现已成为世界范围内的一个突出棘手问题。根据CHINET(中国抗微生物药物监测网)2021年报告(http://www.chinets.com)，中国越来越多地报道了由碳青霉烯类耐药性肺炎克雷伯氏菌(CRKP)所引起的感染病例，约占医院所有肺炎克雷伯氏菌感染的21.9％。该研究的数据显示，CRKP感染导致的死亡率非常高，28天粗死亡率达到24.2％，血流感染超过45％。肺炎克雷伯氏菌的抗生素耐药性可归因于内在分子机制，包括acrAB、kexD、oqxAB和eefABC等RND型外排泵系统相关蛋白的表达，mpK等外膜porin相关基因的抑制，以及β-内酰胺酶等多种水解酶的高效表达。这些机制帮助肺炎克雷伯氏菌产生了对包括β-内酰胺类、氟喹诺酮类和氯霉素等在内的一系列抗生素的耐药性。除了内在机制，肺炎克雷伯氏菌还可通过基因水平转移的方法获得携带抗性基因的质粒。例如，世界各地都已经报道了携带bla_NDM-1、bla_KPC和bla_OXA-48等碳青霉烯酶基因肺炎克雷伯氏菌临床分离物。

针对肺炎克雷伯氏菌的新型抗生素的发明已成为一个非常紧迫的问题。然而，抗生素开发进展远远滞后于细菌抗药性的发展。当前我们所面临的抗生素开发的主要困难包括对药物靶点和活性成分的正确选择、疗效的提升以及临床安全性的检验。这些过程将会耗费大量的时间、人力和资金，使得新型抗生素的开发成为一个巨大挑战。解决这一困境的一个方法是从已获得批准的药物中筛选出能与抗生素产生协同抗菌功能的药物。根据美国食品和药物管理局的数据，截至2020年，已有超过7500种化合物被批准供人们使用。然而，自2014年以来，只有15种新的抗菌药物获得了QIDP的批号。其他未被视为抗菌药物的化学化合物可能具有抗菌活性，应当获得进一步的探索。

发明内容

本文公开了一种新颖且出人意料的有效疗法，用于治疗由肺炎克雷伯氏菌尤其是CRKP引起的感染和表现出比CRKP高得多的死亡率的由碳青霉烯类耐药性和高毒力肺炎克雷伯氏菌(CR-HvKP)引起的感染。

本发明的药物组合包括广谱抗生素利福平和抗病毒药物齐多夫定或其药学上可接受的盐。本发明提供的抗菌药物组合方法与传统的新药开发相比，成本低且效率高，在体外和动物感染模型中均表现出优越的的抗菌活性。

在第一个方面，本文提供了一种药物组合物，所述药物组合物包含利福平和齐多夫定或其药学上可接受的盐。

在一个实施方案中，所述药物组合物中的利福平和齐多夫定或其盐的重量比为1:6-6:1。

在第二个方面，本文公开了将上述第一个方面的药物组合物用于在体外抑制肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)。

在第三个方面，本文公开了第一个方面的药物组合物在制备用于预防或治疗受试者中肺炎克雷伯氏菌所引起的感染的药物中的用途。

在上述第二或第三个方面的一个实施方案中，肺炎克雷伯氏菌为碳青霉烯类耐药性克雷伯氏菌。

在另外一个实施方案中，肺炎克雷伯氏菌为碳青霉烯类耐药性和高毒力肺炎克雷伯氏菌。

在一个实施方案中，其中药物为针粉剂或口服剂型。

在一个实施方案中，其中药物组合物中的利福平和齐多夫定以协同方式抑制肺炎克雷伯氏菌，优选碳青霉烯类耐药性肺炎克雷伯氏菌。

在又一个实施方案中，其中药物组合物中的利福平和齐多夫定以协同方式抑制碳青霉烯类耐药性和高毒力肺炎克雷伯氏菌。

在一个实施方案中，其中受试者是人。

在第四个方面，本文提供了一种方法，包括将第一个方面的药物组合物和待灭菌的物体表面接触，其中所述菌为肺炎克雷伯氏菌，优选碳青霉烯类耐药性肺炎克雷伯氏菌(CRKP)或更优选耐药性和高毒力肺炎克雷伯氏菌(CR-HvKP)。

在第五个方面，本文提供了一种药盒，其中所述药盒包含第一个方面的药物组合物，以及任选的其他抗菌剂。

附图说明：

图1：在体内以及在体外齐多夫定与利福平组合治疗CR-HvKP 1感染的有效性及药物剂量的生物毒性分析。(a)单独利福平治疗的时间杀伤曲线测定的CR-HvKP 1群体分析，(b)单独齐多夫定治疗的时间杀伤曲线测定的CR-HvKP1群体分析，(c)利福平与齐多夫定组合治疗的时间杀伤曲线测定的CR-HvKP 1群体分析，(d)在不同药物治疗下CR-HvkP 1(≈3×10⁷CFU细菌)的小鼠脓毒症模型的存活曲线，对指定曲线进行Log-rank(Mantel-Cox)检验(p＝0.0031)，(e)针对CR-HvKP 1菌株的体外耐药性发展研究：监测了齐多夫定、利福平和两者组合的递增浓度情况下6次连续传代后MIC的变化。MIC的倍数变化代表每次传代后的MIC与第一次传代前的初始MIC的比率，(f)不同浓度的组合药物治疗下RBC的溶血率，(g)在用不同浓度的组合药物治疗后，通过MTT测定确定的HepG2细胞存活率。在OD_570nm处测量每个孔的吸光度(A)值，(h)用盐水或10倍治疗剂量的齐多夫定和利福平组合灌胃治疗的ICR小鼠7天后血清中的AST浓度，(i)用盐水或10倍治疗剂量的齐多夫定和利福平组合灌胃治疗的ICR小鼠7天后肾和肝的组织病理学切片染色。数据代表平均值±SD(n＝3)；通过单因素ANOVA对多组进行统计分析。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。

图2：ZDV的抑制机制分析及CR-HvKP 1毒力的调节变化。(a)149.7μM齐多夫定和14.79μM RNA聚合酶之间(摩尔比≈10:1)的代表性的等温滴定量热法(ITC)热量速率差积分和滴定结合曲线，(b)149.7μM齐多夫定和15.05μM BSA蛋白之间(摩尔比≈10:1)的代表性的等温滴定量热法(ITC)热量速率差积分和滴定结合曲线，(c)用AutoDock Vina算法软件分析的齐多夫定与大肠杆菌RNAp的β'亚基的预测结合模型，以及利福平与RNAp的β亚基的结合模型(PDB：5UAC)，(d)CR-HvKP 1菌落在含有不同药物的羊血琼脂上的串长(mm),(e)OD₆₀₀值表示不同药物治疗下CR-HvKP 1细菌培养液的黏液粘度，(f)不同药物治疗下毒力基因rmpA2的表达变化。数据代表平均值±SD(n＝3)；通过单因素ANOVA对多组进行统计分析。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。

具体实施方式

定义

本申请中所用的术语是本领域公知的，具有下面的含义：

齐多夫定为本领域熟知，其具有分子结构式：

利福平也为本领域熟知，其具有分子结构式：

本文所用的术语“受试者”是指动物。在某些方面，所述动物是哺乳动物。例如灵长类动物、牛、绵羊、山羊、马、犬、猫、兔、大鼠、小鼠等。在某些实施方案中，所述受试者是人。

本文所用的术语“抑制作用”或“抑制”是指减轻或抑制给定病症、症状或障碍或疾病、或者显著降低生物学活性或过程的基线活性、或者降低菌群的生存力、数量或生长速度。

本文所用的术语“治疗”任何疾病或障碍或者任何疾病或障碍的“治疗”在一个实施方案中是指改善所述疾病或障碍(即，减慢或阻止或减少所述疾病或其至少一种临床症状的发展)。在另一个实施方案中，“治疗”是指减轻或改善至少一种机体参数，包括可能无法被患者辨别的那些机体参数。在还有另一个实施方案中，“治疗”是指在身体上(例如，稳定可辨别的症状)、生理学上(例如，稳定身体参数)或这两方面调节所述疾病或障碍。在还有另一个实施方案中，“治疗”是指预防或延迟所述疾病或障碍的发作或发生或进展。

本文所用的术语“组合使用”包括各药物不必须通过相同施用途径或在相同时间施用的治疗方案。固定组合产品也在本发明的范围内。与仅应用其药物活性成分之一的单一药物疗法相比，施用本发明的药物组合产品导致有益作用，例如协同治疗作用。

可以将本发明的化合物与任何另外的药物一起配制。或者，为了减少给患者施用的剂型的数量，可以将本发明的化合物与任何另外的药物以任意组合一起配制。例如，可以将本发明的抑制剂化合物配制在一个剂型中，并且可以将另外的药物一起配制在另外一个剂型中。任何分开的剂型可以在相同或不同的时间施用。

或者，本发明的组合物包含本文所述的另外的药物。每种组份可以存在于各组合物、组合组合物中或存在于单个组合物中。

本发明基于与任一种单独给予时相比本文所述组合的活性大幅改善这一意外发现。此外，该组合物已出人意料地具有对耐药性肺炎克雷伯氏菌的协同抗微生物活性。除了出人意料的生物学活性，本发明的组合物还显示出低毒性。当使用该组合物时，可显著减少药物耐受微生物的出现。

在一个方面，本发明提供了一种药物组合物，所述药物组合物包含利福平和齐多夫定或其药学上可接受的盐。

在一个实施方案中，所述利福平和齐多夫定的质量比为1:6-6:1的范围，例如1:5-5:1，1:4-4:1的范围。在一个具体的实施方案中，所述利福平和齐多夫定的质量比为1:1、1:2、2:1、1:4、4:1、4:5、5:4、5:8或8:5。

在一个实施方案中，一个剂量的组合物中包含利福平0.4克和齐多夫定0.25克，可按粉针剂或口服制剂的制备程序进行制备。

在一个实施方案中，一个剂量的组合物中包含利福平0.4克和齐多夫定0.20克，可按照冻干粉针剂或口服制剂的制备程序进行制备。

在一个实施方案中，一个剂量的组合物中包含利福平0.4克和齐多夫定0.5克，可按照粉针剂或口服制剂的制备程序进行制备。

在一个实施方案中，一个剂量的组合物中包含利福平0.2克和齐多夫定0.4克，可按照冻干粉针剂或口服制剂的制备程序进行制备。

在一个实施方案中，一个剂量的组合物中包含利福平0.8克与齐多夫定0.5克，可按照粉针剂或口服制剂的制备程序进行制备。

在一个实施方案中，一个剂量的组合物中包含利福平0.5克和齐多夫定0.8克，可按照冻干粉针剂或口服制剂的制备程序进行制备。

在一个实施方案中，一个剂量的组合物中包含利福平0.8克和齐多夫定1克，可按照粉针剂或口服制剂的制备程序进行制备。

在一个实施方案中，一个剂量的组合物中包含利福平0.3克和齐多夫定0.6克，可按照冻干粉针剂或口服制剂的制备程序进行制备。

在一个实施方案中，一个剂量的组合物中包含利福平1.6克和齐多夫定0.8克，可按照粉针剂或口服制剂的制备程序进行制备。

在一个实施方案中，一个剂量的组合物中包含利福平1.6克和齐多夫定1克，可按照冻干粉针剂或口服制剂的制备程序进行制备。

在一个实施方案中，一个剂量的组合物中包含利福平1.6克和齐多夫定2克，可按照粉针剂或口服制剂的制备程序进行制备。

在一个实施方案中，一个剂量的组合物中包含利福平2克和齐多夫定1.6克，可按照冻干粉针剂或口服制剂的制备程序进行制备。

在第二个方面，本文公开了将上述第一个方面的组合物用于在体外杀死或抑制肺炎克雷伯氏菌，例如碳青霉烯耐药性肺炎克雷伯氏菌(CRKP)或碳青霉烯耐药性和高毒力肺炎克雷伯氏菌(CR-HvKP)。

在第三个方面，本文公开了第一个方面的组合物在制备用于预防或治疗受试者中肺炎克雷伯氏菌所引起的感染的药物组合物中的用途。

在一个实施方案中，上述药物组合物用于在体外抑制耐药性肺炎克雷伯氏菌，例如碳青霉烯耐药性克雷伯氏菌(CRKP)或碳青霉烯耐药性和高毒力肺炎克雷伯氏菌(CR-HvKP)。

在人类中，克雷伯氏菌属的相互作用的范围从机会致病菌(主要在住院患者和社区获得性感染中)到频繁在肠道发生和较不频繁在鼻咽发生的无症状携带。作为医院感染，克雷伯氏菌属主要与尿道和呼吸道感染以及可能引起致命性败血病的伤口和软组织感染相关联。临床综合征的范围包括菌血症、肺炎、尿道感染(UTI)、血栓性静脉炎、上呼吸道感染、胆囊炎、伤口感染、骨髓炎、内源性眼内炎、眼内炎、心内膜炎和脑膜炎。

如本文所使用的，术语“组合物”涵盖分开和连续给予利福平和齐多夫定二者。例如，当连续给予时，可首先给予齐多夫定或首先给予利福平。当同时给予时，即将二者的组合物同时给予受试者。

在第四个方面，本文提供了一种方法，包括将第一个方面的药物组合物和待灭菌的表面接触，其中所述菌为肺炎克雷伯氏菌，例如耐药性碳青霉烯类耐药性肺炎克雷伯氏菌(CRKP)或耐药性和高毒力肺炎克雷伯氏菌(CR-HvKP)。

在第五个方面，本发明提供了包含利福平和齐多夫定的药盒，作为用于抑制或杀死肺炎克雷伯氏菌。

在一个实施方案中，药盒还任选包含其他抗菌剂。

本文还提供了包含利福平和齐多夫定，以及药学上可接受的辅药、稀释剂或载体的药物组合物。这样的组合物可用于治疗微生物感染，特别地用于抑制或杀死肺炎克雷伯氏菌。

如本文所使用的，“杀死”意指通过代谢活动的缺乏评估的活力的丧失。

如本文所使用的，术语“微生物”意指细菌。“微生物感染”意指任何细菌感染。优选地，术语“微生物的”在这些语境中意指“细菌的”。

优选地，通过本文所述组合物治疗的细菌感染为革兰式阴性感染。

优选地，细菌为克雷伯氏菌(例如肺炎克雷伯氏菌和产酸克雷伯氏菌)。本发明组合特别利于治疗药物耐受性克雷伯氏菌。本文所提供的包含利福平和齐多夫定的药物组合物可用于治疗的微生物感染为由一种或多种大肠杆菌、肺炎克雷伯氏菌或KES(克雷伯氏菌、肠杆菌和沙雷氏菌)细菌群中的一种引起的感染。本文提供的药物组合物最优选用于治疗碳青霉烯耐药性肺炎克雷伯氏菌(CRKP)或碳青霉烯耐药性和高毒力肺炎克雷伯氏菌(CR-HvKP)所引起的感染。在所有的实施方案中，本发明的组合物中的利福平和齐多夫定以协同作用耐药性肺炎克雷伯氏菌。

用于本发明用途的化合物可作为原料给予，但活性成分优选以药物组合物的形式提供。

本发明制剂包括适合口服、胃肠外(包括皮下，例如通过注射或贮存制剂片、皮内、鞘内、肌肉内(例如通过贮存制剂和静脉内)、直肠的和局部(包括真皮、口腔和舌下)或以适合吸入或吹入给予的形式给予的那些。最合适的给予途径可取决于病人的病况和病症。

所述制剂可适宜地以单位剂量形式呈现，并且可通过任何药学领域熟知的方法制备，例如“Remington:The Science and Practice of Pharmacy(雷明顿：药学的科学与实践)”,Lippincott Williams和Wilkins,第21版,(2005)中所描述。合适的方法包括使活性成分与构成一种或多种赋形剂的载体结合的步骤。一般而言，制剂通过均一和密切地使活性成分与液体载体或分散良好的固体载体或两者结合，然后，如果需要，使产品成形为期需的剂型而制备。将理解的是当两种活性成分独立给予时，每一种可通过不同的方式给予。

当用赋形剂配制时，活性成分可以以总混合物重量的0.1-99.5％(例如0.5到95％)的浓度存在；适宜地对于片剂和胶囊剂30-95％，对于液体制备物0.01-50％(例如3-50％)。

适合口服给予的制剂可呈现为：离散单元例如胶囊剂、扁囊剂或片剂(例如特别地用于小儿给药的咀嚼片)，其每种均包含预定量的活性成分；粉末或颗粒；水性液体或非水性液体中的溶液或悬浮液；或水包油型液体乳剂或油包水型液体乳剂。活性成分也可呈现为大丸剂、药糖剂或糊剂。

片剂可通过压缩或模塑制成，任选含有一种或多种赋形剂。压缩片剂可通过在合适的机器中压缩制备，自由流动形式的活性成分例如粉末或颗粒，任选混合其它常规赋形剂例如粘合剂(例如糖浆、阿拉伯胶、明胶、山梨醇、黄芪胶、淀粉黏液、聚乙烯吡咯烷酮和/或羟甲基纤维素)、填充剂(例如乳糖、糖、微晶纤维素、玉米淀粉、磷酸钙和/或山梨醇)、润滑剂(例如硬脂酸镁、硬脂酸、滑石、聚乙二醇和/或二氧化硅)、崩解剂(例如马铃薯淀粉、交联羧甲基纤维素钠和/或淀粉乙醇酸钠)和润湿剂(例如十二烷基硫酸钠)。模塑片剂可通过在合适的机器中模塑粉末状活性成分与惰性液体稀释剂的混合物制成。所述片剂可任选包衣或刻痕，并且可配制以便提供活性成分的控释(例如延时、持久或脉冲释放，或速释型与控释型的组合)。

或者，活性成分可掺入口服液体制备物例如水性或油混悬剂、溶液剂、乳剂、糖浆剂或酏剂中。包含活性成分的制剂也可呈现为在使用前用水或另一种合适的载体构造的干产品。这些液体制备物可包含常规的添加剂例如混悬剂(例如山梨醇糖浆、甲基纤维素、葡萄糖/糖浆、明胶、羟甲基纤维素、羧甲基纤维素、硬脂酸铝凝胶和/或氢化可食用油)、乳化剂(例如卵磷脂、山梨聚糖单油酸酯和/或阿拉伯胶)、非水性载体(例如可食用油如杏仁油、分馏椰子油、油脂、丙二醇和/或乙醇)、和防腐剂(例如甲基或丙基对羟基苯甲酸酯和/或山梨酸)。

生产局部药物组合物例如乳剂、膏剂、洗剂、喷雾剂和无菌水溶液或混悬液的方法是本领域所熟知的。制备局部药物组合物的合适方法在，例如WO9510999、US6974585、WO2006048747以及任何这些参考所引用的文献中描述。

本发明所用的组合物可以以包装或分配装置呈现，所述包装或分配装置可包含一个或多个包含活性成分的单位剂量形式。所述包装可，例如包含金属或塑料箔，例如泡罩包装。当组合物意在作为两种分开的组合物给予时，这些可呈现为双包装形式。

药物组合物也可以以在单个包装中包含整个疗程的“病人包装”的形式开药给病人，通常为泡罩包装。病人包装具有优于传统处方的优势，其优势在于药师将病人的药用物与大量供给品分开，因为病人总是取得在病人包装中含有的包装插页，而在传统处方中病人通常将其遗失)。已经显示包装插页改善病人对医师吩咐的遵从性。

通过包含指导病人正确使用本发明的包装插页的单个病人包装或每种组合物的病人包装的方式给予本发明组合是本发明期需特征。

本发明的药物组合物或药盒还可以包含如下其他抗生素。

(1)大环内酯类或酮内酯类，例如红霉素、阿奇霉素、克拉霉素和泰利霉素；

(2)β-内酰胺类，包括青霉素类，例如青霉素G、青霉素V、甲氧西林、苯唑西林、氯唑西林、双氯西林、萘夫西林、氨苄西林、阿莫西林、羧苄西林、替卡西林、美洛西林、哌拉西林、阿洛西林、替莫西林，头孢菌素类，例如头孢噻吩(cephalothin)、头孢匹林、头孢拉定、头孢噻啶、头孢唑林、头孢孟多、头孢呋辛、头孢氨苄、头孢丙烯、头孢克洛、氯碳头孢、头孢西丁、头孢美唑(cefmetazole)、头孢噻肟、头孢唑肟、头孢曲松、头孢哌酮、头孢他啶、头孢克肟、头孢泊肟、头孢布坦、头孢地尼、头孢匹罗、头孢吡肟，和碳青霉烯类抗生素，例如多利培南、亚胺培南、美罗培南和PZ-601；

(3)糖肽类，例如万古霉素和替考拉宁；

(4)喹诺酮类，例如萘啶酸、奥索利酸、诺氟沙星、培氟沙星、依诺沙星、氧氟沙星、左氧氟沙星、环丙沙星、替马沙星、洛美沙星、氟罗沙星、格帕沙星、司帕沙星、曲伐沙星、克林沙星、加替沙星、莫西沙星、西他沙星、加内沙星(ganefloxacin)、吉米沙星和帕珠沙星；

(5)抗菌的磺胺类药(sulfonamides)和抗菌氨苯磺胺类药(sulphanilamides)，包括对-氨基苯甲酸、磺胺嘧啶、磺胺异唑、磺胺甲唑和酞磺胺噻唑；

(6)氨基糖苷类，例如链霉素、新霉素、卡那霉素、巴龙霉素(paromomycin)、庆大霉素、妥布霉素、阿米卡星、奈替米星、大观霉素、地贝卡星(dibekacin)和异帕米星；

(7)四环素类，例如四环素、金霉素、地美环素、米诺环素、土霉素、美他环素、多西环素、替吉环素；

(8)利福霉素类，例如利福喷汀、利福布汀、苯并嗪利福霉素和利福昔明；

(9)林可酰胺类，例如林可霉素和克林霉素；

(10)链阳性菌素类，例如奎奴普丁和达福普汀(dalfopristin)；

(11)唑烷酮类，例如利奈唑胺或泰地唑胺(tedizolid)；

(12)多黏菌素(polymyxin)、多黏菌素E(colistin)和多黏菌素E(polymyxin E)；

(13)甲氧苄啶和杆菌肽；

(14)流出泵抑制剂；

(15)β-内酰胺酶抑制剂，包括阿维巴坦及其类似物。

上述抗菌药可以与本发明的化合物组合施用，这些抗菌药在本发明的一种或多种化合物之前、同时或之后施用。当需要同时施用本发明的化合物与第二药物且施用途径相同时，则本发明的化合物可以与上述抗生素一起配制在相同的剂型中。含有本发明的化合物和其他抗生素的剂型的一个实例是静脉内施用。另一个实例口服包含本发明的化合物和第二药物的溶液。

在一些实施方案中，本发明的药物组合物包含任选至少一种药学上可接受的载体或赋形剂。

“药学上可接受的载体”是本领域公认的，包括适合用于将本发明的化合物施用给哺乳动物的药学上可接受的材料、组合物或介质。所述载体包括液体或固体填充剂、稀释剂、赋形剂、溶剂或包封材料，其参与将主题药物从一个器官或身体部分携带或运输到另一个器官或身体部分。每种载体都必须是“可接受的”，含义是与制剂中的其它成分是相容的，并且对患者无害。能用作药学上可接受的载体的材料的一些实例包括：糖类，例如乳糖、葡萄糖和蔗糖；淀粉类，例如玉米淀粉和马铃薯淀粉；纤维素及其衍生物，例如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素和乙酸纤维素；粉末状西黄蓍胶；麦芽；明胶；滑石粉；赋形剂，例如可可脂和栓剂腊；油类，例如花生油、棉子油、红花油、芝麻油、橄榄油、玉米油和豆油；二醇类，例如丙二醇；多元醇，例如甘油、山梨醇、甘露醇和聚乙二醇；酯类，油酸乙酯和月桂酸乙酯；琼脂；缓冲剂，例如氢氧化镁和氢氧化铝；海藻酸；无热原的水；等张盐水；林格氏液；乙醇；磷酸盐缓冲液；和药物制剂中使用的其它无毒的相容性物质。在一些实施方案中，药学上可接受的载体在与本发明的化合物混合之前被灭菌。

实施例

本发明筛选所用的药物化合物来自商业药物库(Selleckchem，药物库L1300)。所用的碳青霉烯类耐药性肺炎克雷伯氏菌(CRKP)和碳青霉烯类耐药性和高毒力肺炎克雷伯氏菌(CR-HvKP)菌株由发明人分离鉴定，并发表于Gu et al.,A fatal outbreak of ST11carbapenem-resistant hypervirulent Klebsiella pneumoniae in a Chinesehospital:a molecular epidemiological study.,The Lancet infectious diseases,2018,18(1):37-46，以及Yang et al.,Molecular epidemiology of carbapenem-resistant hypervirulent Klebsiella pneumoniae in China,Emerging microbes&infections,2022,11(1):841-849。菌株的信息见下表1。模式菌大肠杆菌ATCC25922和普通肺炎克雷伯氏菌MGH78578、其他细胞和实验材料都商业可得。

表1本申请所用的菌株

齐多夫定的筛选

发明人从商业药物库(Selleckchem，药物库L1300)中筛选了超过1,500种FDA批准的药物化合物(Xue et al.,Tumour cells are sensitised to ferroptosis viaRB1CC1-mediated transcriptional reprogramming.Clinical and TranslationalMedicine,2022,12(2):e747,https://doi.org/10.1002/ctm2.747)，发现了齐多夫定对革兰氏阴性细菌的各种物种都有抗菌作用，这些物种包括大肠杆菌、铜绿假单胞菌、沙门氏菌属和肺炎克雷伯氏菌。

随后，我们测定了利福平和齐多夫定分别对上述表1中的菌株的最小抑制浓度(MIC)。方法简述如下：齐多夫定对细菌的MIC根据CLSI指南测定。将生长在MH琼脂平板上的细菌菌株重悬在在灭菌的0.85％氯化钠溶液中。细菌细胞悬浮液的浊度根据McFarland标准号0.5进行调整，并接种到含有不同浓度梯度的齐多夫定的MH肉汤(美国Sigma化学公司)中。所有测试的培养基最后在37℃下培养16小时。表1中的大肠杆菌ATCC25922和普通肺炎克雷伯氏菌MGH78578用作参考对照菌。MIC结果见下表2。

协同作用的测定

本实验检测利福平与齐多夫定的协同抗菌作用。方法如上文所述，区别在于加入不同的浓度的齐多夫定和/或利福平的组合。结果发现，当利福平与齐多夫定联合使用时，所有表1中除大肠杆菌外的所有菌株都表现出比单独的利福平和齐多夫定显著更低的MIC，即表现出协同抗菌效果。具体参见下表2。

表2.利福平(RIF)单药、齐多夫定(ZDV)单药以及RIF和ZDV组合对临床耐碳青霉烯类高毒力型肺炎克雷伯氏菌的最小抑菌浓度(MIC)。

表2-1

表2-2

时间杀伤曲线测试

试验菌株对齐多夫定和利福平的敏感性用时间杀伤实验来确定。选择CR-HvKP 1作为代表菌株。方法简述如下：将单个菌落接种到5毫升的MH肉汤中，在37℃下培养过夜。将过夜的培养物通过1％的接种量再培养到5毫升新鲜的MH肉汤中，在37℃下振荡培养，直到达到0.3的光学密度(约1×10⁸CFU/mL)。然后在培养基中分别加入一系列浓度梯度的利福平、齐多夫定以及齐多夫定和利福平的联用组合，并让其继续培养。在不同的时间间隔内取一小部分试验培养物，滴在MH琼脂板上，然后在37℃下孵育过夜。通过CFU计数法记录菌落数。使用Graphpad Prism 8.0(San Diego,CA)软件，通过绘制Log10 CFU/mL与时间的关系，绘制时间-杀伤曲线。所有的药敏试验都平行进行了三次，以确保一致性。

时间杀伤曲线测定结果表明，在20μg/mL的齐多夫定下，CR-HvKP 1的群体大小在前4小时减少，然后重新生长并且在24小时的时候达到与未处理对照相同的大小。在128μg/mL利福平的情况下，细菌群体在6小时的时候减少，但在24小时后重新生长，表明CR-HvKP 1可能在长期治疗后对齐多夫定或利福平产生耐药性(图1a，1b)。当齐多夫定和利福平分别以10μg/mL和16μg/mL同时存在时，CR-HvKP 1可在24小时内被根除，证实了这两种药物的协同抗微生物作用很强(图1c)。

小鼠实验

在鼠感染模型中进一步测试了利福平和齐多夫定的协同抗微生物作用。对ICR小鼠经腹腔内注射3×10⁷CFU的CR-HvKP 1以创建脓毒症感染模型。在感染后1小时并且每12小时间隔通过口服灌胃对小鼠施用齐多夫定和利福平的不同组合的治疗。未经任何治疗的小鼠24小时死亡率为100％。对于仅用齐多夫定(10mg/kg)治疗的实验组，小鼠36小时死亡率为100％。对于仅用利福平(8mg/kg)治疗的实验组，小鼠72小时死亡率为66％。重要的是，实验组中用齐多夫定(10m/kg)和利福平(8mg/kg)组合治疗的所有小鼠存活72小时。参见表2。这一结果表明，在小鼠模型中同时使用齐多夫定和利福平的疗效远高于单独使用这两种药剂中每一种的疗效(图1d)。

表3齐多夫定联合利福平对耐碳青霉烯和高毒性肺炎克雷伯氏菌CR-HvKP1感染的ICR小鼠的治疗效果。

耐药性发展测试

进行了耐药性发展测试，以评估利福平、齐多夫定或两者的组合对肺炎克雷伯氏菌的药物诱导性耐药率。本实验的原理是亚抑制浓度的抗生素会诱发细菌发生耐药性的突变。

材料和方法：选择CR-HvKP 1作为代表菌。细菌细胞(OD＝0.1)首先在5毫升含有利福平、齐多夫定或利福平+齐多夫定组合的亚抑制浓度(1/2MIC)的LB肉汤中生长。培养24小时后，将可能含有耐药突变细菌的培养物1:100稀释到含有两倍浓度药物的新鲜LB培养基中。这种连续的传递重复六代，即进行六天的实验(第二天的浓度是第一天浓度的两倍，逐天递增)。每一代的培养物按照CLSI指南，用MIC法测定利福平和齐多夫定或者二者联用的的MIC。

结果显示：利福平或齐多夫定与CR-HvKP 1孵育导致第一代或第二代的MIC分别增加到4096μg/mL和1280μg/mL，而这两种药物组合使用导致MIC在6天内增加到32μg/mL+20μg/mL，与单一药物使用相比，耐药性发展速度显著更慢(图1e)。

毒性测试

体外方法：

1.溶血实验：通过心脏抽血法收集新鲜ICR小鼠的血液，保存在K2-EDTA管中(BDK2 EDTA，Becton-Dickinson)并暂时保存在4℃。将全血样本离心(500g，10分钟)，去除血浆，然后用PBS缓冲液清洗三次。最后一次洗涤后，从底部小心地吸出100μL剩余的红细胞(RBC)，用4.9mL PBS缓冲液稀释，以制备2％的血液溶液。然后将50μL稀释的RBC与药物(单独的利福平(32、16、8μg/mL)或利福平与齐多夫定组合的PBS溶液(100μL))混合。50μL稀释的RBC与100μL milli-Q H20(100％溶血)或100μL不含药物的PBS混合，分别作为阳性和阴性对照。应该注意的是，利福平本身为红色，因此在计算中使用了不同浓度药物的PBS的吸光度作为背景校正。将混合物轻轻混合并在37℃下孵育30分钟。在2000xg下离心6分钟，得到80μL上清液，用微板阅读器(SpectraMax 190,Moleclar Devices)测量上清液在541nm处的光密度。

2.MTT实验：本研究选择HepG2细胞(人类肝癌细胞系，通常用于测量药物代谢)作为模型细胞系。细胞在含有10％胎牛血清(FBS；Gibco，Grand Island，NY，USA)和1％100×抗生素-抗霉菌剂(Gibco)的Dulbecco改良的Eagle培养基(DMEM)中，在37℃和5％二氧化碳条件下培养。使用MTT细胞增殖检测试剂盒(CyQUANTtm；Invitrogen,Carlsbad,CA)来测量细胞活力。简而言之，将2.0×10⁴个细胞/孔的HepG2细胞在96孔板中接种培养4小时，然后在每个孔中加入10μL 12-mM MTT储备溶液和100μL新鲜DMEM培养基，并在37℃下培养4小时。然后加入100μL SDS-HCl溶液，在37℃下孵育18小时。用微孔板阅读器(SpectraMax190,Moleclar Devices)在570nm处测量每孔的吸光度(A)值。

体内方法：

为了进一步评估不同药物组合的临床潜力，我们进行了生化检测和组织学分析，以评估它们在体内的毒性。ICR小鼠被称重并随机分为2组。对照组和ZDV+RIF组。100mg/kg齐多夫定和80mg/kg利福平每天灌胃给ZDV+RIF组，持续1周，而对照组只灌胃生理盐水。每组由3只小鼠组成。在治疗结束后，小鼠被处死，并收集其血液、肝脏和肾脏。肝功能的评估按以下方法进行。将血液样本在2000rpm下离心5分钟，获得血清样本。对血清进行天门冬氨酸转移酶(AST)活性检测。使用检测试剂盒(MAK055，Sigma Aldrich)测定血清的AST含量。每个样品的450nm吸光度(A)值由微板阅读器(SpectraMax 190,Molecular Devices)测量。血清中AST(U/L)的升高代表了肝脏的异常。

组织病理学分析(HE染色)按以下方法进行。肾脏和肝脏用10％的甲醛溶液固定过夜，然后用石蜡包埋。然后将样品送到香港城市大学兽医诊断实验室(VDL)进行切片，用苏木精-伊红(H&E)染色，并对组织学特征进行评估。

上述体外和体内毒性测试的结果表明利福平和齐多夫定的单一使用和组合使用导致低水平的溶血和HepG2细胞裂解，并且7天10倍治疗剂量治疗后肝肾未见明显损伤(图1f，1g，1h，1i)。

ITC测定

齐多夫定是一种HIV药物，通过干扰病毒逆转录酶的活性来抑制HIV病毒的传播。已有研究表明齐多夫定的抑菌作用可能是其在磷酸化后干扰了细菌的DNA复制过程。而我们假设齐多夫定的抗细菌作用还可能是其作为尿嘧啶类似物结合在细菌RNA聚合酶复合物上，从而抑制细菌RNA转录过程。为了验证该假设，我们进行了ITC测定以测试齐多夫定与肺炎克雷伯氏菌RNA聚合酶的直接结合。我们通过双质粒表达系统pACYC-Duet和pET-Duet成功地共表达了肺炎克雷伯氏菌RNAp的亚基以制备所需核心酶。方法简述如下：

使用Gibson组装方法构建含有RNAP不同亚单位(rpoA、rpoB、rpoC、rpoD、rpoZ)的重组质粒。首先，所有需要的片段都是通过PCR扩增获得的，分别来自肺炎球菌MGH78578基因组和两个Duet质粒。然后将所有片段、Gibson Assembly Master Mix(NEB，#E2611S)和去离子水混合，并在50℃下孵育60分钟。用热休克法将重组质粒转化到大肠杆菌DH5α中。经测序验证后再将重组质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)。将质粒pACYC Duet rpoA-rpoZ-Amp(编码α亚单位和ω亚单位)和pET Duet rpoB-rpoC-Kana(编码β亚单位和β'亚单位)一起转入大肠杆菌BL21，通过体内组装制备RNA核心聚合酶。σ因子σ亚单位由单独含有质粒pET-Duet-rpoD-Kana的大肠杆菌BL21过表达所获得。重组菌首先在含有50μg/mL卡那霉素和100μg/mL氨苄青霉素的LB琼脂中培养，然后在37℃，250rpm下接种到含有相同抗生素浓度的LB肉汤中。细菌浊度达到OD600 0.6后，加入0.5mM IPTG，在16℃，200rpm下培养16小时。通过离心(5000rpm，4℃下20分钟)收获细胞。然后按照亲和层析法纯化蛋白质。为了进一步获得细菌RNAp全酶，RNAp核心酶与sigma亚单位以1：1的摩尔浓度比在37℃下孵化15分钟，然后用于随后的ITC检测。

基于等温滴定量热法(ITC)测试确定RNAp和齐多夫定之间的相互作用。为了验证我们关于齐多夫定能抑制细菌RNA聚合酶活性的假设，通过ITC测量验证了齐多夫定与RNAp的结合亲和力。该测试在25℃下进行，使用Malvern MicroCal PEAQ-ITC自动超灵敏等温滴定热量计(MicroCal(Malvern Instruments)，Malvern，UK)。RNA聚合酶全酶、牛血清白蛋白(Sigma，美国)和齐多夫定(大连美伦生物技术有限公司，中国大连)在20：150mM Tris-NaCl缓冲液(pH＝7.9)中制备溶液。然后将149.7μM齐多夫定滴入分别含有14.79μM RNA聚合酶和15.05μM BSA蛋白的缓冲液中(摩尔比≈10:1)；程序为：第一次注入0.5μL，随后注入2μL。溶液以750rpm的速度搅拌。使用MicroCal PEAQ-ITC分析软件将数据拟合为一个位点结合模型。

结果表明，齐多夫定的K_d为7.8μM，反应化学计量(N个位点)和焓(ΔH)分别为0.239±0.273和-335±520kJ/mol(图2a，2b)。这表明齐多夫定小分子从热力学方面对RNAp具有高亲和力。使用AutoDock Vina进行齐多夫定与大肠杆菌RNA聚合酶(4YG2)的分子对接模拟。显示齐多夫定与RNAp的β'亚基(由rpoC基因编码)相互作用，与β'亚基的J链中的残基Asn⁴⁹⁵形成紧密接触而利福平与RNAp的β亚基(由rpoB基因编码)结合(图2c)。齐多夫定和利福平两者的结合口袋都位于RNAp的在活性中心附近的主要通道中。这一观察结果表明，齐多夫定通过类似于利福平的机制抑制细菌生长，但涉及替代途径。

我们最后检查抑制RNAp是否可以抑制CR-HvKP的毒力表达。方法简述如下：

1.串联试验按以下方法进行。将CR-HvKP 1接种到含有5％羊血和不同药物的琼脂平板上，在37℃下培养过夜。串联试验是指用标准的细菌学接种环拉伸单个菌落时，形成长度大于5毫米的粘性串，可视为高粘性表型的毒力菌株。

2.粘液度测定：将CR-HvKP 1的过夜培养物重新接种到新鲜的LB肉汤中，产生OD₆₀₀为0.3的菌液。然后加入不同的药物，在37℃下振荡培养6小时。然后将培养物稀释到OD₆₀₀为1.0，并在1,000x g下离心2分钟，然后得到上清液进行OD₆₀₀测量。

数据结果显示，单独使用利福平或齐多夫定可以降低串长和高黏液粘度(图2d、2e)以及根据qRT-PCR显示了细菌毒力因子rmpA2的表达受到抑制(图2f)。

总之，本研究通过药物再利用方法开发了一种药物组合物，其用于治疗由肺炎克雷伯氏菌尤其是CRKP引起的感染和表现出比CRKP高得多的死亡率的由碳青霉烯类耐药性和高毒力肺炎克雷伯氏菌(CR-HvKP)引起的感染。。

Claims (15)

1.一种药物组合物，所述药物组合物包含利福平和齐多夫定或其药学上可接受的盐。

2.根据权利要求1所述的组合物，所述利福平和齐多夫定的质量比为1:6-6:1。

3.根据权利要求1或2所述的组合物在体外抑制肺炎克雷伯氏菌(Klebsiellapneumoniae)的用途。

4.根据权利要求1或2所述的组合物在制备用于预防或治疗受试者中肺炎克雷伯氏菌所引起的感染的药物中的用途。

5.根据权利要求3或4所述的用途，其中肺炎克雷伯氏菌为碳青霉烯类耐药性肺炎克雷伯氏菌(CRKP)。

6.根据权利要求3或4所述的用途，其中肺炎克雷伯氏菌为碳青霉烯类耐药性和高毒力肺炎克雷伯氏菌(CR-HvKP)。

7.根据权利要求4的用途，其中药物为针粉剂或口服剂型。

8.根据权利要求5的用途，其中组合物中的利福平和齐多夫定以协同方式抑制肺炎克雷伯氏菌。

9.根据权利要求5的用途，其中组合物中的利福平和齐多夫定以协同方式抑制碳青霉烯类耐药性肺炎克雷伯氏菌(CRKP)。

10.根据权利要求6的用途，其中组合物中的利福平和齐多夫定以协同方式抑制碳青霉烯类耐药性和高毒力肺炎克雷伯氏菌(CR-HvKP)。

11.根据权利要求4所述的用途，其中受试者是人。

12.一种方法，包括将权利要求1或2的药物组合物和待灭菌的物体表面接触，其中所述菌为肺炎克雷伯氏菌。

13.根据权利要求12的方法，其中肺炎克雷伯氏菌为碳青霉烯类耐药性肺炎克雷伯氏菌(CRKP)。

14.根据权利要求12的方法，其中肺炎克雷伯氏菌为碳青霉烯类耐药性和高毒力肺炎克雷伯氏菌(CR-HvKP)。

15.一种药盒，其中所述药盒包含权利要求1或2的组合物，以及任选的其他抗菌剂。