HK40060045B - Wee1抑制剂化合物的晶型及其应用 - Google Patents

Description

Wee1抑制剂化合物的晶型及其应用

相关申请的交叉引用

CN201910364694.X，申请日：2019年04月30日。

技术领域

本发明公开了式(Ⅰ)化合物的晶型，及其晶型在制备治疗Wee1相关疾病的药物中的应用。

背景技术

细胞周期的进程是由一系列细胞周期调控系统控制的复杂过程，细胞周期调控系统的核心成分是周期蛋白依赖性激酶(cyclin-dependent kinases,CDKs)与周期蛋白(Cyclins)结合形成的CDKs/Cyclins复合物，这些复合物能促进细胞进入增殖周期，其中CDK1(人类的同源体也称为CDC2)/Cyclin B的复合物对控制细胞进入M期起关键性的作用。

在细胞进入M期之前需要完成DNA的复制，由于受到各种内源性和外源性因素的干扰DNA经常会发生突变或损伤，这些发生异常的DNA必须完成修复，否则会引起有丝分裂灾难，造成细胞死亡。细胞周期检查点的主要功能就是暂停细胞周期，让细胞完成DNA的修复后再进入M期。位于G1末期的G1/S检查点和G2期的G2/M检查点是两个主要的细胞周期检查点，它们共同担负DNA损伤的识别和修复功能。正常细胞利用G1/S检查点在G1期就可以完成DNA的修复，而近50％的癌变细胞存在抑癌基因p53缺陷，这也同时使它们缺失了G1/S检查点功能，它们需要更多地依赖G2/M检查点完成DNA的修复。G2/M检查点很少发生突变，正是因为有了它，癌细胞可以逃过DNA损伤剂和放射的治疗。

Wee1蛋白激酶是一种细胞周期调节因子，属于核内的丝氨酸和苏氨酸蛋白激酶家族的一员，是G2/M检查点的关键激酶。人类的“Wee”蛋白激酶家族主要包括Wee1和Myt1两种，均可使CDC2上的Tyr15位点磷酸化，抑制CDC2/CyclinB复合物的激活，阻滞细胞进入M期，直到完成DNA的修复，而Myt1还可磷酸化CDC2上的Thr14位点，这也是针对CDC2活性进行的负调控。在很多种癌变细胞中Wee1激酶高表达，通过对Wee1激酶的抑制，可以使肿瘤细胞直接跳过G2期的DNA修复，提前进入有丝分裂，致肿瘤细胞死亡，达到治疗癌症的目的。

目前AstraZeneca的Wee1抑制剂AZD1775已进入临床II期，有超过30项的临床实验正在开发，并已显示出良好的治疗效果。AZD1775最早由Merck开发，因此又称为MK-1775，2013年9月Merck向AstraZeneca在全球范围内转让了该化合物，与之相关的专利主要有US20070254892、WO2007126122、EP2213673、WO2008133866、WO2011034743等。Abbott和Abbvie对Wee1抑制剂也展开过研究，相关专利主要有US2012220572、WO2013126656、WO2013012681、WO2013059485、WO2013013031、WO2013126656等。Almac公司关于Wee1抑制剂的专利包括WO2014167347、WO2015019037、WO2015092431。

WO2008133866公开了化合物AZD1775，结构如下：

发明内容

本发明提供了式(Ⅰ)化合物的A晶型，其X射线粉末衍射(XRPD)图谱在下列2θ角处具有特征衍射峰：5.71±0.2°、12.68±0.2°和15.32±0.2°。

本发明的一些方案中，上述A晶型的X射线粉末衍射图谱在下列2θ角处具有特征衍射峰：5.71±0.2°、12.68±0.2°、15.32±0.2°、19.72±0.2°、21.44±0.2°、23.61±0.2°和25.68±0.2°。

本发明的一些方案中，上述A晶型的X射线粉末衍射图谱在下列2θ角处具有特征衍射峰：5.71±0.2°、12.68±0.2°、15.32±0.2°、18.04±0.2°、19.72±0.2°、21.44±0.2°、23.61±0.2°和25.68±0.2°。

本发明的一些方案中，上述A晶型的XRPD图谱如图1所示。

本发明的一些方案中，上述A晶型的XRPD图谱解析数据如表1所示：

表1：A晶型的XRPD图谱解析数据

本发明的一些方案中，上述A晶型的差示扫描量热曲线(DSC)在34.95±3℃、174.75±3℃和219.12±3℃处分别有一个吸热峰的起始点。

本发明的一些方案中，上述A晶型的DSC图谱如图2所示。

本发明的一些方案中，上述A晶型的热重分析曲线(TGA)在70.33±3℃时失重达0.7367％；在209.42±3℃时又失重达3.123％。

本发明的一些方案中，上述A晶型的TGA图谱如图3所示。

本发明还提供了式(Ⅰ)化合物的B晶型，其X射线粉末衍射(XRPD)图谱在下列2θ角处具有特征衍射峰：5.58±0.2°、12.44±0.2°和22.16±0.2°。

本发明的一些方案中，上述B晶型的X射线粉末衍射图谱在下列2θ角处具有特征衍射峰：5.58±0.2°、11.71±0.2°、12.44±0.2°、14.48±0.2°、15.13±0.2°、18.64±0.2°、22.16±0.2°和26.33±0.2°。

本发明的一些方案中，上述B晶型的X射线粉末衍射图谱在下列2θ角处具有特征衍射峰：5.58±0.2°、11.71±0.2°、12.44±0.2°、14.48±0.2°、15.13±0.2°、17.57±0.2°、18.64±0.2°、22.16±0.2°和26.33±0.2°。

本发明的一些方案中，上述B晶型的XRPD图谱如图4所示。

本发明的一些方案中，上述B晶型的的XRPD图谱解析数据如表2所示：

表2：B晶型的XRPD图谱解析数据

本发明的一些方案中，上述B晶型的差示扫描量热曲线(DSC)在42.88±3℃、198.79±3℃和222.36±3℃处分别有一个吸热峰的起始点。

本发明的一些方案中，上述B晶型的DSC图谱如图5所示。

本发明的一些方案中，上述B晶型的热重分析曲线(TGA)在64.21±3℃时失重达3.265％；在243.05±3℃时又失重达1.516％。

本发明的一些方案中，上述B晶型的TGA图谱如图6所示。

本发明还提供了式(Ⅰ)化合物的C晶型，其X射线粉末衍射(XRPD)图谱在下列2θ角处具有特征衍射峰：5.05±0.2°、5.58±0.2°和12.44±0.2°。

本发明的一些方案中，上述C晶型的X射线粉末衍射图谱在下列2θ角处具有特征衍射峰：5.05±0.2°、5.58±0.2°、12.44±0.2°、15.91±0.2°、16.68±0.2°、17.61±0.2°、22.19±0.2°和26.37±0.2°。

本发明的一些方案中，上述C晶型的XRPD图谱如图7所示。

本发明的一些方案中，上述C晶型的的XRPD图谱解析数据如表3所示：

表3：C晶型的XRPD图谱解析数据

本发明的一些方案中，上述C晶型的差示扫描量热曲线(DSC)在37.06±3℃、189.16±3℃和218.61±3℃处分别有一个吸热峰的起始点。

本发明的一些方案中，上述C晶型的DSC图谱如图8所示。

本发明的一些方案中，上述C晶型的热重分析曲线(TGA)在64.98±3℃时失重达2.211％；在224.71±3℃时又失重达1.127％。

本发明的一些方案中，上述C晶型的TGA图谱如图9所示。

本发明还提供了式(Ⅰ)化合物的D晶型，其X射线粉末衍射(XRPD)图谱在下列2θ角处具有特征衍射峰：5.22±0.2°、15.99±0.2°和16.57±0.2°。

本发明的一些方案中，上述D晶型的X射线粉末衍射图谱在下列2θ角处具有特征衍射峰：5.22±0.2°、15.99±0.2°、16.57±0.2°和21.22±0.2°。

本发明的一些方案中，上述D晶型的X射线粉末衍射图谱在下列2θ角处具有特征衍射峰：5.22±0.2°、15.18±0.2°、15.99±0.2°、16.57±0.2°、17.08±0.2°、18.60±0.2°、21.22±0.2°和21.89±0.2°。

本发明的一些方案中，上述D晶型的X射线粉末衍射图谱在下列2θ角处具有特征衍射峰：5.22±0.2°、15.18±0.2°、15.99±0.2°、16.57±0.2°、17.08±0.2°、17.90±0.2°、18.60±0.2°、21.22±0.2°、21.89±0.2°、25.24±0.2°和27.00±0.2°。

本发明的一些方案中，上述D晶型的XRPD图谱如图10所示。

本发明的一些方案中，上述D晶型的的XRPD图谱解析数据如表4所示：

表4：D晶型的XRPD图谱解析数据

本发明的一些方案中，上述D晶型的差示扫描量热曲线(DSC)在56.07±3℃、193.93±3℃和216.54±3℃处分别有一个吸热峰的起始点。

本发明的一些方案中，上述D晶型的差示扫描量热曲线(DSC)在56.07±3℃、193.93±3℃和216.54±3℃处分别有一个吸热峰的起始点；在206.82±3℃有一个放热峰的峰值。

本发明的一些方案中，上述D晶型的DSC图谱如图11所示。

本发明的一些方案中，上述D晶型的热重分析曲线(TGA)在79.35±3℃时失重达1.977％；在223.66±3℃时又失重达1.589％。

本发明的一些方案中，上述D晶型的TGA图谱如图12所示。

本发明还提供了式(Ⅰ)化合物的E晶型，其X射线粉末衍射(XRPD)图谱在下列2θ角处具有特征衍射峰：8.65±0.2°、14.22±0.2°和24.58±0.2°。

本发明的一些方案中，上述E晶型的X射线粉末衍射图谱在下列2θ角处具有特征衍射峰：8.65±0.2°、11.41±0.2°、13.13±0.2°、14.22±0.2°、17.35±0.2°、18.34±0.2°、20.39±0.2°、20.94±0.2°和24.58±0.2°。

本发明的一些方案中，上述E晶型的XRPD图谱如图13所示。

本发明的一些方案中，上述E晶型的的XRPD图谱解析数据如表5所示：

表5：E晶型的XRPD图谱解析数据

本发明的一些方案中，上述E晶型的差示扫描量热曲线(DSC)在121.57±3℃、197.26±3℃和217.23±3℃处分别有一个吸热峰的起始点；在168.31±3℃和212.95±3℃分别有一个放热峰的峰值。

本发明的一些方案中，上述E晶型的DSC图谱如图14所示。

本发明的一些方案中，上述E晶型的热重分析曲线(TGA)在143.31±3℃时失重达6.775％；在213.62±3℃时又失重达0.3184％。

本发明的一些方案中，上述E晶型的TGA图谱如图15所示。

本发明还提供了式(Ⅰ)化合物的F晶型，其X射线粉末衍射(XRPD)图谱在下列2θ角处具有特征衍射峰：5.06±0.2°、15.91±0.2°和16.68±0.2°。

本发明的一些方案中，上述F晶型的X射线粉末衍射图谱在下列2θ角处具有特征衍射峰：5.06±0.2°、8.34±0.2°、10.98±0.2°、15.13±0.2°、15.91±0.2°、16.68±0.2°、17.63±0.2°和18.87±0.2°。

本发明的一些方案中，上述F晶型的X射线粉末衍射图谱在下列2θ角处具有特征衍射峰：5.06±0.2°、8.34±0.2°、10.98±0.2°、15.13±0.2°、15.91±0.2°、16.68±0.2°、17.63±0.2°、18.87±0.2°、20.33±0.2°、21.44±0.2°、22.01±0.2°、24.04±0.2°、25.32±0.2°和25.66±0.2°。

本发明的一些方案中，上述F晶型的XRPD图谱如图16所示。

本发明的一些方案中，上述F晶型的的XRPD图谱解析数据如表6所示：

表6：F晶型的XRPD图谱解析数据

本发明的一些方案中，上述F晶型的差示扫描量热曲线(DSC)在48.69±3℃和225.26±3℃处分别有一个吸热峰的起始点。

本发明的一些方案中，上述F晶型的DSC图谱如图17所示。

本发明的一些方案中，上述F晶型的热重分析曲线(TGA)在100±3℃时失重达3.404％。

本发明的一些方案中，上述F晶型的TGA图谱如图18所示。

本发明还提供了式(I)化合物F晶型的制备方法，包括：

(a)将式(I)化合物加入醇类溶剂中搅拌加热至油浴55～65℃；

(b)47℃-53℃下搅拌72小时；

(c)关闭加热，保持搅拌自然降温1小时后至27℃；

(d)静置18小时，过滤，再用甲醇淋洗滤饼；

(e)60℃真空烘干48小时。

本发明的一些方案中，上述醇类溶剂为甲醇。

本发明还提供了上述的A晶型、上述的B晶型、上述的C晶型、上述的D晶型、上述的E晶型或上述的F晶型在制备治疗Wee1相关疾病的药物的应用。

技术效果

本发明化合物的A晶型、B晶型、C晶型、D晶型、E晶型及F晶型稳定、受光热湿度影响小、溶解性非常高好，成药前景广阔。

定义和说明

除非另有说明，本文所用的下列术语和短语旨在含有下列含义。一个特定的短语或术语在没有特别定义的情况下不应该被认为是不确定的或不清楚的，而应该按照普通的含义去理解。当本文出现商品名时，旨在指代其对应的商品或其活性成分。

本发明的中间体化合物可以通过本领域技术人员所熟知的多种合成方法来制备，包括下面列举的具体实施方式、其与其他化学合成方法的结合所形成的实施方式以及本领域技术上人员所熟知的等同替换方式，优选的实施方式包括但不限于本发明的实施例。

本发明具体实施方式的化学反应是在合适的溶剂中完成的，所述的溶剂须适合于本发明的化学变化及其所需的试剂和物料。为了获得本发明的化合物，有时需要本领域技术人员在已有实施方式的基础上对合成步骤或者反应流程进行修改或选择。

下面会通过实施例具体描述本发明，这些实施例并不意味着对本发明的任何限制。

本发明所使用的所有溶剂是市售的，无需进一步纯化即可使用。

本发明所使用的溶剂可经市售获得。本发明采用下述缩略词：DCM代表二氯甲烷；DMF代表N，N-二甲基甲酰胺；DMSO代表二甲亚砜；EtOH代表乙醇；MeOH代表甲醇；TFA代表三氟乙酸；TsOH代表对甲苯磺酸；mp代表熔点；EtSO₃H代表乙磺酸；MeSO₃H代表甲磺酸；ATP代表三磷酸腺苷；HEPES代表4-羟乙基哌嗪乙磺酸；EGTA代表乙二醇双(2-氨基乙基醚)四乙酸；MgCl₂代表二氯化镁；MnCl₂代表二氯化锰；DTT代表二硫苏糖醇；DCC代表二环己基碳二亚胺；DMAP代表4-二甲氨基吡啶；DIEA代表N,N-二异丙基乙胺；wt％：质量百分比；THF代表四氢呋喃。

仪器及分析方法

1.1X-射线粉末衍射(X-ray powder diffractometer,XRPD)

仪器型号：布鲁克D8 advance X-射线衍射仪

测试方法：大约10～20mg样品用于XRPD检测。

详细的XRPD参数如下：

光管：

光管电压：40kV，光管电流：40mA

发散狭缝：0.60mm

探测器狭缝：10.50mm

防散射狭缝：7.10mm

扫描范围：4-40deg

步径：0.02deg

步长：0.12秒

样品盘转速：15rpm

1.2差热分析(Differential Scanning Calorimeter,DSC)

仪器型号：TA Q2000差示扫描量热仪测试方法：取样品(～1mg)置于DSC铝锅内进行测试，在50mL/min N₂条件下，以10℃/min的升温速率，加热样品从30℃到300℃。

1.3热重分析(Thermal Gravimetric Analyzer,TGA)

仪器型号：TA Q5000热重分析仪测试方法：取样品(2～5mg)置于TGA铂金锅内进行测试，在25mL/min N₂条件下，以10℃/min的升温速率，加热样品从30℃(室温)到300℃或失重20％。

附图说明

图1为(I)化合物的A晶型的Cu-Kα辐射的XRPD谱图；

图2为(I)化合物的A晶型的DSC谱图；

图3为(I)化合物的A晶型的TGA谱图；

图4为(I)化合物的B晶型的Cu-Kα辐射XRPD谱图；

图5为(I)化合物的B晶型的DSC谱图；

图6为(I)化合物的B晶型的TGA谱图；

图7为(I)化合物的C晶型的Cu-Kα辐射XRPD谱图；

图8为(I)化合物的C晶型的DSC谱图；

图9为(I)化合物的C晶型的TGA谱图；

图10为(I)化合物的D晶型的Cu-Kα辐射XRPD谱图；

图11为(I)化合物的D晶型的DSC谱图；

图12为(I)化合物的D晶型的TGA谱图；

图13为(I)化合物的E晶型的Cu-Kα辐射XRPD谱图；

图14为(I)化合物的E晶型的DSC谱图；

图15为(I)化合物的E晶型的TGA谱图；

图16为(I)化合物的F晶型的Cu-Kα辐射XRPD谱图；

图17为(I)化合物的F晶型的DSC谱图；

图18为(I)化合物的F晶型的TGA谱图。

具体实施方式

下面通过实施例对本发明进行详细描述，但并不意味着对本发明任何不利限制。本文已经详细地描述了本发明，其中也公开了其具体实施例方式，对本领域的技术人员而言，在不脱离本发明精神和范围的情况下针对本发明具体实施方式进行各种变化和改进将是显而易见的。

中间体1

参考专利WO2007126122中的合成方法制备。

实施例1：式(Ⅰ)化合物

合成路线：

步骤1：化合物1-A的合成。

在0～15℃下，氮气保护下往2-乙酰基-6-溴吡啶(7.35g,36.74mmol)的THF(150mL)溶液中滴加入3-丁烯基溴化镁(1M,55.12mL)，然后此反应液10～20℃搅拌3小时。加入饱和氯化铵溶液100mL淬灭反应，分液拿到有机层，再用饱和氯化钠50mL洗涤，无水硫酸钠干燥，浓缩旋干得到棕色油状物。此棕色油状物，再用硅胶柱层析纯化(PE/EA＝7/1)得到1-A。¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ7.73(t,J＝8.0Hz,1H),7.64(d,J＝7.2Hz,1H),7.46(d,J＝7.2Hz,1H),5.78～5.7(m,1H),4.94～4.85(m,2H),2.07～2.01(m,1H),1.90～1.71(m,3H),1.41(s,3H)。

步骤2：化合物1-B的合成。

往1-A(3.47g,13.55mmol)和1-C(3.01g,13.55mmol)的二氧六环(150mL)混合物中加入N,N'’-二甲基乙二胺(1.31g,14.90mmol,1.60mL)，碘化亚铜(2.58g,13.55mmol,)和碳酸钾(2.62g,18.97mmol)，氮气置换三次，然后此混合物在氮气保护下95℃搅拌1.5小时，加入氨水(28％)200mL，然后用乙酸乙酯萃取(300mL×2)，合并有机层，饱和食盐水洗涤200mL，无水硫酸钠干燥，减压浓缩至干。混合物用硅胶柱层析(PE/EA＝3/1)纯化得到1-B。¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ9.02(s,1H),8.04(t,J＝8.0Hz,1H),7.76(d,J＝7.2Hz,1H),7.64(d,J＝7.6Hz,1H),5.77～5.67(m,2H),5.01～4.79(m,6H),2.56(s,3H),2.15～2.11(m,1H),1.85～1.75(m,2H),1.70～1.60(m,1H),1.46(s,3H)。

步骤3：化合物1-D的合成。

往1-B(2.06g,5.18mmol)的甲苯(700mL)溶液中加入Grubbs第二代催化剂(1.32g,1.55mmol)，然后此混合物在80℃和氮气氛围下搅拌6小时。补加Grubbs第二代催化剂(0.65g，0.775mmol)，然后此混合物在80℃和氮气氛围下搅拌3小时。冷却到室温，过滤，滤液浓缩至干得到褐色残留物。经硅胶柱层析纯化(PE/EA＝1/1)得到1-D。¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ9.07(s,1H),8.06(t,J＝8.0Hz,1H),7.79(d,J＝8.2Hz,1H),7.70(d,J＝7.6Hz,1H),5.39～5.25(m,3H),4.66(d,J＝5.2Hz,2H),,2.62(s,3H),2.40～1.95(m,3H),1.85～1.65(m,1H)1.64(s,3H)。

步骤4：化合物1-E的合成。

在化合物1-D(360mg,974.45μmol)的甲苯(35mL)溶液中加入间氯过氧苯甲酸(265.09mg,1.31mmol,85％纯度)，反应在25℃下搅拌2小时。向反应液中加入4-(4-甲基哌嗪)苯胺(242.30mg,1.27mmol)和N,N-二异丙基乙胺(503.76mg,3.90mmol)。反应液在25℃搅拌12小时。向反应液中加入25mL水，并搅拌，用乙酸乙酯(30mL×3)萃取水相。合并有机相，用饱和碳酸氢钠溶液(30mL)和饱和食盐水(30mL)各洗涤一次，无水硫酸钠干燥。过滤，真空下浓缩得粗品，粗品经制备液相(中性)分离得到1-E。¹HNMR(400MHz,CDCl₃)δppm 1.70(s,3H)1.78(br d,J＝13.54Hz,2H)2.04(br d,J＝6.54Hz,1H)2.08-2.23(m,2H)2.39(s,3H)2.62-2.64(m,4H)3.21-3.24(m,4H)4.24(br s,1H)4.51(br d,J＝13.54Hz,1H)5.61-5.88(m,2H)6.95(d,J＝9.04Hz,2H)7.49(d,J＝9.04Hz,3H)7.81-7.90(m,2H)8.87(s,1H)；MS m/z:513.1[M+H]⁺。

步骤5：式(Ⅰ)化合物的合成。

化合物1-E(100mg,195.08μmol)经过SFC手性拆分(色谱柱:AD 250×50mm I.D.,10μm流动相:A:超临界CO₂,B:EtOH(0.1％NH₃H₂O),A:B＝55:45at 200mL/min)，保留时间：21min，得到式(Ⅰ)化合物。¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δppm 1.60(s,3H)1.68(br s,2H)1.94(brd,J＝7.04Hz,1H)2.00-2.20(m,2H)2.30(s,3H)2.52-2.55(m,4H)3.12-3.15(m,4H)4.24(brs,1H)4.42(br d,J＝9.54Hz,1H)5.65(br s,2H)6.85(d,J＝9.04Hz,2H)7.17(s,1H)7.40(d,J＝9.04Hz,2H)7.69-7.81(m,2H)8.77(s,1H)。MS m/z:513.1[M+H]⁺。

实施例2：式(I)化合物A晶型的制备

大约50mg式(I)化合物分别加入到不同的玻璃瓶中，分别加入丙酮0.5mL使其成悬浊液。将上述悬浊液样品置于恒温振荡仪(40℃)进行试验。悬浊液样品在40℃下振摇两天后离心，去上层液体，然后将残留样品置于真空干燥箱中(40℃)干燥过夜，得到式(I)化合物A晶型。

实施例3：式(I)化合物B晶型的制备

大约50mg式(I)化合物分别加入到不同的玻璃瓶中，分别加入乙醇0.3mL使其成悬浊液。将上述悬浊液样品置于恒温振荡仪(40℃)进行试验。悬浊液样品在40℃下振摇两天后离心，去上层液体，然后将残留样品置于真空干燥箱中(40℃)干燥过夜，得到式(I)化合物B晶型。

实施例4：式(I)化合物C晶型的制备

大约50mg式(I)化合物分别加入到不同的玻璃瓶中，分别加入甲醇0.2mL使其成悬浊液。将上述悬浊液样品置于恒温振荡仪(40℃)进行试验。悬浊液样品在40℃下振摇两天后离心，去上层液体，然后将残留样品置于真空干燥箱中(40℃)干燥过夜，得到式(I)化合物C晶型。

实施例5：式(I)化合物D晶型的制备

大约50mg式(I)化合物分别加入到不同的玻璃瓶中，分别加入甲醇/水(1/1)0.4mL使其成悬浊液。将上述悬浊液样品置于恒温振荡仪(40℃)进行试验。悬浊液样品在40℃下振摇两天后离心，去上层液体，然后将残留样品置于真空干燥箱中(40℃)干燥过夜，得到式(I)化合物D晶型。

实施例6：式(I)化合物E晶型的制备

大约50mg式(I)化合物分别加入到不同的玻璃瓶中，分别加入乙腈0.5mL使其成悬浊液。将上述悬浊液样品置于恒温振荡仪(40℃)进行试验。悬浊液样品在40℃下振摇两天后离心，去上层液体，然后将残留样品置于真空干燥箱中(40℃)干燥过夜，得到式(I)化合物E晶型。

实施例7：式(I)化合物F晶型的制备

25～26℃下，在装有560mL MeOH的1L三口瓶中加入式(I)化合物134.19g)，搅拌，加热至油浴55～65℃，20分钟后内温保持在47℃-53℃。保温搅拌72小时。关闭加热，保持搅拌自然降温1小时后至27℃。静置18小时，过滤，再用30mL MeOH淋洗滤饼。滤饼于60℃真空烘干48小时。得到式(I)化合物F晶型。

实验例1：式(I)化合物F晶型在高温，高湿光照条件下的固体稳定性试验

根据影响因素和加速试验条件，准确称重式(I)化合物F晶型约5mg置于干燥洁净的玻璃瓶中，一式两份，摊成薄薄一层，作为正式供试样品，放置于影响因素试验条件下(60℃，92.5％RH(相对湿度))和加速条件下(40℃/75％RH和60℃/75％RH)，其样品为完全暴露放样，用铝箔纸盖上，扎上小孔。另分别取少量样品放置在40mL玻璃样品瓶同样条件下待测定晶型状态。在5天、10天、1月进行取样分析，分析方法见表7，分析结果如表8所示。光照(可见光1200000Lux，紫外200W)条件下放置的样品为室温完全暴露放样。

表7有关物质的高效液相色谱分析方法

表8式(I)化合物F晶型固体稳定性样品含量和有关物质分析结果(5天、10天、1月)

条件和时间点	晶型	总杂质％	含量％
				0天	F晶型	0.63	99.38
60℃_5天	F晶型	0.74	99.39
				60℃_10天	F晶型	0.84	99.98
92.5％湿度_5天	F晶型	0.61	98.72
				92.5％湿度_10天	F晶型	0.64	98.38
避光	F晶型	0.61	97.77
				光照	F晶型	0.67	98.58
40℃-75％湿度-10天	F晶型	0.63	98.01
				40℃-75％湿度-1个月	F晶型	0.62	97.94
60℃-75％湿度-10天	F晶型	0.69	100.43
				60℃-75％湿度-1个月	F晶型	0.75	99.46

结论：式(I)化合物F晶型在为期1个月的固体影响因素和加速试验中，原料化合物晶型未发生改变，有良好的物理稳定性。在有关物质分析中杂质在高温(60℃)和加速条件(60℃/75％RH)下略有增加，其余条件下杂质总量几乎不变，对温度略有敏感。

实验结论：本发明晶型稳定性好，易于成药。

实验例2：式(I)化合物的体外酶学抑制活性

实验测试在Eurofins公司进行，实验结果由该公司提供。

在测试体系中，加入20mM Tris-HCl，pH 8.5，0.2mM EDTA，500μM多肽底物(LSNLYHQGKFLQTFCGSPLYRRR)，10mM醋酸镁和10μM[γ-³³P]-ATP(强度大约500cpm/pmol)。加入Mg²⁺和ATP混合液后，反应起始，室温孵育40min。加入3％磷酸缓冲液，终止反应。取10μL反应液在连续过滤机P30上过滤，用75mM磷酸缓冲液清洗三次，甲醇清洗一次，每次清洗5min。干燥后闪烁计数法读值。试验结果如表9所示。

表9：本发明化合物体外酶学活性测定结果(IC₅₀)

化合物编号	<![CDATA[Wee1(IC<sub>50</sub> nM)]]>
		AZD1775	47
式(I)化合物	29

实验例3：本发明化合物的体外渗透性测试

研究采用经荷兰癌症研究所Piet Borst实验室授权的MDR1-MDCK II细胞，它是一种转染了人的多耐药基因(MDR1)的Madin-Darby犬肾细胞，该细胞能稳定表达外排转运体P糖蛋白(P-gp)，因此适用于筛选P-gp底物或者抑制剂，并预测化合物在如十二指肠、血脑屏障、肝细胞核和肾单元等具有高外排作用屏障的渗透性。我们将第5-35代MDR1-MDCK II细胞用于渗透性研究。

MDR1-MDCK II细胞用α-MEM培养基(α-Minimum Essential Media)培养，培养条件为37±1℃，5％CO₂和饱和相对湿度。之后将细胞接种于BD Transwell-96孔板里，接种密度为2.3×10⁵个细胞/cm²，然后将细胞置于二氧化碳培养箱中培养4-7天后用于转运实验。其α-MEM培养基的制备方法如下：液体养基采用粉末(α-MEM powder来至Gibco,Cat#:11900)溶于纯水配制，添加了L-(左旋谷酰胺)和NaHCO₃。之后使用时添加10％FBS(胎牛血清)，1％PS(双抗)and 1％NEAA使之成为完全培养基。α-MEM培养基配料如表10所示。

表10.αMEM(1L×)配料表

AZD1775(或本发明化合物)和地高辛(Digoxin)给药浓度为2μM，双向(A-B和B-A方向)给药，均做二个复孔。非诺特罗(Fenoterol)和普萘洛尔(Propranolol)测试浓度均为2μM，单向(A-B方向)给药，均做二个复孔。

将待使用的溶液置37±1℃水浴锅预孵育30分钟。将给药液和接收液分别加入到对应的细胞板孔位(每个顶端和基底端孔分别加样75和250μL)，启动双向转运实验。加样后，将细胞板置于37±1℃，5％CO₂和饱和相对湿度的培养箱中孵育150分钟。样品收集信息见表11。

表11.样品收集信息

注：T₀表示起始给药液样品。

所有的样品漩涡震荡后于3220g离心10分钟，转移适量体积的上清液到样品分析板，封板后样品若不立即分析则储存于2-8℃，采用LC-MS/MS的方法进行分析。

转运实验结束后，采用荧光黄检测实验(Lucifer Yellow Rejection Assay)测试MDR1-MDCK II细胞的完整性。荧光黄溶液孵育30分钟后，收取荧光黄样品，2e读板仪在425/528nm(激发/发射)波谱处检测样品中荧光黄的相对荧光强度(the relativefluorescence unit,RFU)。

采用半定量分析供试品AZD1775(或本发明化合物)、对照品非诺特罗(Fenoterol)、普萘洛尔(Propranolol)以及地高辛(Digoxin)，用被分析物与内标的峰面积比值作为对照品的浓度。

实验结果如表12所示。

表12.渗透速率(10^-6cm/s)

	AZD1775	式(I)化合物
			A to B	2.83	4.55
B to A	29.3	17.38
			外排比率	10.37	3.82

实验结论：

式(I)化合物的渗透性性质相对于AZD1775有了很大的提高，有利于生物体对于药物的利用。

实验例4：化合物药代动力学评价

本实验旨在研究AZD1775(或本发明化合物)单次静脉，单次口服给药后，在雌性Balb/c Nude小鼠血浆中的药代动力学情况。

12只小鼠(灵畅提供)随机分为两组，每组6只雌性，采用交叉采血方式进行样品采集。静脉组所有动物静脉注射给予1mg/kg的AZD1775(或本发明化合物)，溶媒配制制剂为含0.2mg/mL AZD1775(或本发明化合物)的5％HP-betaCD(昆山瑞斯克化工原料有限公司)的澄清溶液。口服组动物灌胃给予10mg/kg的AZD1775(或本发明化合物)，溶媒配制制剂为含1mg/mL AZD1775(或本发明化合物)的0.5％甲基纤维素的均一混悬液。

静脉组动物在给药后5分钟、15分钟、30分钟、1小时、2小时、4小时、6小时、8小时及24小时的9个时间点采集血浆样品；口服组在给药后15分钟、30分钟、1小时、2小时、4小时、6小时、8小时及24小时的8个时间点采集血浆样品；样品经过LC-MS/MS分析获得AZD1775(或本发明化合物)血浆浓度数据，并计算药代参数，如达峰浓度，达峰时间，清除率，半衰期，药时曲线下面积，生物利用度等。实验结果如表13所示。

表13.药代动力学测试结果

实验结论：式(I)化合物对比AZD1775可以显著提高小鼠药代动力学多项指标，其中体内清除率，半衰期，体内浓度积分以及生物利用度都有明显优势。

实验例5：体内研究

(1)化合物对人结肠癌LoVo细胞皮下异种移植肿瘤BALB/c裸小鼠模型的体内药效学研究

实验方法：选用的实验动物(上海西普尔-必凯实验动物有限公司提供)是BALB/c裸小鼠，6-8周龄，体重18-22克。

人结肠癌LoVo细胞，体外单层培养，培养条件为Ham’s F-12培养基中加10％胎牛血清，100U/mL青霉素，100μg/mL链霉素和2mM谷氨酰胺，37℃，5％CO₂培养。一周两次用胰酶-EDTA进行常规消化处理传代。当细胞饱和度为80％-90％时，收取细胞，计数，接种。将0.1mL(10×10⁶个)LoVo细胞皮下接种于每只裸小鼠的右后背，肿瘤平均体积达到213mm³时开始分组给药。灌胃给药剂量：40毫克/公斤，每日两次。实验指标是考察肿瘤生长是否被抑制、延缓或治愈。每周两次用游标卡尺测量肿瘤直径。肿瘤体积的计算公式为：V＝0.5a×b²，a和b分别表示肿瘤的长径和短径。

化合物的抑瘤疗效用TGI(％)或相对肿瘤增殖率T/C(％)评价。TGI(％)，反映肿瘤生长抑制率。TGI(％)的计算：TGI(％)＝【(1-(某处理组给药结束时平均瘤体积－该处理组开始给药时平均瘤体积))/(溶剂对照组治疗结束时平均瘤体积－溶剂对照组开始治疗时平均瘤体积)】×100％。

最终给药16天实验结果如表14所示。

表14.人结肠癌LoVo细胞异种移植瘤小鼠模型药效试验结果

化合物	TGI(％)
		AZD1775	26.73
式(I)化合物	84.74

结论：本发明化合物对比AZD1775可以显著提高对小鼠身体肿瘤的抑制作用，而且化合物的手性对于体内药效有着意想不到的影响。

(2)化合物对人胰腺癌BxPC-3BALB/c裸小鼠皮下移植瘤模型的体内药效学研究

实验方法：选用的实验动物是BALB/c nude裸小鼠，6－8周龄，体重18-22克。

BxPC-3细胞第10代，体外单层培养，培养条件为RPMI 1640培养基(生产厂家：gibco，货号：22400-089)中加10％胎牛血清，100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素，37℃5％CO₂培养，传代4次。传代方法为一周两次用胰酶-EDTA进行常规消化处理传代。当细胞饱和度达到80％-90％时，细胞用胰酶-EDTA消化，计数，重悬于PBS，密度为5x 10⁷个细胞/mL。每只动物于右后背位置接种0.1mL(5×10⁶个)BxPC-3细胞，当肿瘤平均体积达到153mm³时，根据瘤体积随机分组，并开始给药。灌胃给药剂量：25毫克/公斤，每日一次。

实验指标是考察肿瘤生长是否被抑制、延缓或治愈。每周两次用游标卡尺测量肿瘤直径。化合物的抑瘤疗效用TGI(％)或相对肿瘤增殖率T/C(％)评价。TGI(％)，反映肿瘤生长抑制率。TGI(％)的计算：TGI(％)＝【(1-(某处理组给药结束时平均瘤体积－该处理组开始给药时平均瘤体积))/(溶剂对照组治疗结束时平均瘤体积－溶剂对照组开始治疗时平均瘤体积)】×100％。

最终给药27天实验结果如表15所示。

表15.人胰腺癌BxPC-3细胞异种移植瘤小鼠模型药效试验结果

化合物	TGI(％)
		AZD1775	24.3
式(I)化合物	73.3

结论：通过表15可以看出，式(I)化合物对比AZD1775可以显著提高对小鼠身体肿瘤的抑制作用。(3)化合物对CT26小鼠结肠癌细胞动物移植瘤模型的体内抗肿瘤药效研究

实验方法：选用的实验动物是BALB/c裸小鼠，7周龄，体重16-20克，雌性。

细胞：小鼠结肠癌CT26细胞(中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库)体外单层培养，培养条件为采用含10％胎牛血清RPMI-1640培养基，37℃5％CO₂培养箱中培养。用胰酶-EDTA进行常规消化处理传代。当细胞处于指数生长期，饱和度为80％-90％时，收取细胞，计数，接种。将0.1mL DPBS(含3×10⁵个CT26细胞)皮下接种于每只小鼠的右后背，待肿瘤平均体积达到50～70mm³时，根据肿瘤体积进行随机分组给药。灌胃给药剂量：30毫克/公斤，每日两次。

实验指标是考察肿瘤生长是否被抑制、延缓或治愈。每周两次用游标卡尺测量肿瘤直径。化合物的抑瘤疗效用TGI(％)或相对肿瘤增殖率T/C(％)评价。TGI(％)，反映肿瘤生长抑制率。TGI(％)的计算：

TGI(％)＝【(1-(某处理组给药结束时平均瘤体积－该处理组开始给药时平均瘤体积))/(溶剂对照组治疗结束时平均瘤体积－溶剂对照组开始治疗时平均瘤体积)】×100％。

最终给药18天实验结果如表16所示。

表16.小鼠结肠癌CT26细胞同种移植瘤模型体内药效试验结果

化合物	TGI(％)
		AZD1775	66.43
式(I)化合物	93.38

结论：通过表16可以看出，式(I)化合物对比AZD1775可以显著提高对小鼠身体肿瘤的抑制作用。

Claims (45)

1.式(Ⅰ)化合物的A晶型，其X射线粉末衍射(XRPD)图谱在下列2θ角处具有特征衍射峰：5.71±0.2°、12.68±0.2°和15.32±0.2°，

2.根据权利要求1所述的A晶型，其X射线粉末衍射图谱在下列2θ角处具有特征衍射峰：5.71±0.2°、12.68±0.2°、15.32±0.2°、18.04±0.2°、19.72±0.2°、21.44±0.2°、23.61±0.2°和25.68±0.2°。

3.根据权利要求2所述的A晶型，其XRPD图谱如图1所示。

4.根据权利要求1～3任意一项所述的A晶型，其差示扫描量热曲线(DSC)在34.95±3℃、174.75±3℃和219.12±3℃处分别有一个吸热峰的起始点。

5.根据权利要求4所述的A晶型，其DSC图谱如图2所示。

6.根据权利要求1～3任意一项所述的A晶型，其热重分析曲线(TGA)在70.33±3℃时失重达0.7367％；在209.42±3℃时又失重达3.123％。

7.根据权利要求6所述的A晶型，其TGA图谱如图3所示。

8.式(Ⅰ)化合物的B晶型，其X射线粉末衍射(XRPD)图谱在下列2θ角处具有特征衍射峰：5.58±0.2°、12.44±0.2°和22.16±0.2°，

9.根据权利要求8所述的B晶型，其X射线粉末衍射图谱在下列2θ角处具有特征衍射峰：5.58±0.2°、11.71±0.2°、12.44±0.2°、14.48±0.2°、15.13±0.2°、18.64±0.2°、22.16±0.2°和26.33±0.2°。

10.根据权利要求9所述的B晶型，其XRPD图谱如图4所示。

11.根据权利要求8～10任意一项所述的B晶型，其差示扫描量热曲线(DSC)在42.88±3℃、198.79±3℃和222.36±3℃处分别有一个吸热峰的起始点。

12.根据权利要求11所述的B晶型，其DSC图谱如图5所示。

13.根据权利要求8～10任意一项所述的B晶型，其热重分析曲线(TGA)在64.21±3℃时失重达3.265％；在243.05±3℃时又失重达1.516％。

14.根据权利要求13所述的B晶型，其TGA图谱如图6所示。

15.式(Ⅰ)化合物的C晶型，其X射线粉末衍射(XRPD)图谱在下列2θ角处具有特征衍射峰：5.05±0.2°、5.58±0.2°和12.44±0.2°，

16.根据权利要求15所述的C晶型，其X射线粉末衍射图谱在下列2θ角处具有特征衍射峰：5.05±0.2°、5.58±0.2°、12.44±0.2°、15.91±0.2°、16.68±0.2°、17.61±0.2°、22.19±0.2°和26.37±0.2°。

17.根据权利要求16所述的C晶型，其XRPD图谱如图7所示。

18.根据权利要求15～17任意一项所述的C晶型，其差示扫描量热曲线(DSC)在37.06±3℃、189.16±3℃和218.61±3℃处分别有一个吸热峰的起始点。

19.根据权利要求18所述的C晶型，其DSC图谱如图8所示。

20.根据权利要求15～17任意一项所述的C晶型，其热重分析曲线(TGA)在64.98±3℃时失重达2.211％；在224.71±3℃时又失重达1.127％。

21.根据权利要求20所述的C晶型，其TGA图谱如图9所示。

22.式(Ⅰ)化合物的D晶型，其X射线粉末衍射(XRPD)图谱在下列2θ角处具有特征衍射峰：5.22±0.2°、15.99±0.2°和16.57±0.2°，

23.根据权利要求22所述的D晶型，其X射线粉末衍射图谱在下列2θ角处具有特征衍射峰：5.22±0.2°、15.18±0.2°、15.99±0.2°、16.57±0.2°、17.08±0.2°、18.60±0.2°、21.22±0.2°和21.89±0.2°。

24.根据权利要求23所述的D晶型，其D晶型的XRPD图谱如图10所示。

25.根据权利要求22～24任意一项所述的D晶型，其差示扫描量热曲线(DSC)在56.07±3℃、193.93±3℃和216.54±3℃处分别有一个吸热峰的起始点。

26.根据权利要求25所述的D晶型，其DSC图谱如图11所示。

27.根据权利要求22～24任意一项所述的D晶型，其热重分析曲线(TGA)在79.35±3℃时失重达1.977％；在223.66±3℃时又失重达1.589％。

28.根据权利要求27所述的D晶型，其TGA图谱如图12所示。

29.式(Ⅰ)化合物的E晶型，其X射线粉末衍射(XRPD)图谱在下列2θ角处具有特征衍射峰：8.65±0.2°、14.22±0.2°和24.58±0.2°，

30.根据权利要求29所述的E晶型，其X射线粉末衍射图谱在下列2θ角处具有特征衍射峰：8.65±0.2°、11.41±0.2°、13.13±0.2°、14.22±0.2°、17.35±0.2°、18.34±0.2°、20.39±0.2°、20.94±0.2°和24.58±0.2°。

31.根据权利要求30所述的E晶型，其XRPD图谱如图13所示。

32.根据权利要求29～31任意一项所述的E晶型，其差示扫描量热曲线(DSC)在121.57±3℃、197.26±3℃和217.23±3℃处分别有一个吸热峰的起始点；在168.31±3℃和212.95±3℃分别有一个放热峰的峰值。

33.根据权利要求32所述的E晶型，其DSC图谱如图14所示。

34.根据权利要求29～31任意一项所述的E晶型，其热重分析曲线(TGA)在143.31±3℃时失重达6.775％；在213.62±3℃时又失重达0.3184％。

35.根据权利要求34所述的E晶型，其TGA图谱如图15所示。

36.式(Ⅰ)化合物的F晶型，其X射线粉末衍射(XRPD)图谱在下列2θ角处具有特征衍射峰：5.06±0.2°、15.91±0.2°和16.68±0.2°，

37.根据权利要求36所述的F晶型，其X射线粉末衍射图谱在下列2θ角处具有特征衍射峰：5.06±0.2°、8.34±0.2°、10.98±0.2°、15.13±0.2°、15.91±0.2°、16.68±0.2°、17.63±0.2°和18.87±0.2°。

38.根据权利要求37所述的F晶型，其XRPD图谱如图16所示。

39.根据权利要求36～38任意一项所述的F晶型，其差示扫描量热曲线(DSC)在48.69±3℃和225.26±3℃处分别有一个吸热峰的起始点。

40.根据权利要求39所述的F晶型，其DSC图谱如图17所示。

41.根据权利要求36～38任意一项所述的F晶型，其热重分析曲线(TGA)在100±3℃时失重达3.404％。

42.根据权利要求41所述的F晶型，其TGA图谱如图18所示。

43.根据权利要求1～7任意一项所述的A晶型、根据权利要求8～14任意一项所述的B晶型、根据权利要求15～21任意一项所述的C晶型、根据权利要求22～28任意一项所述的D晶型、根据权利要求29～35任意一项所述的E晶型或根据权利要求36～42任意一项所述的F晶型在制备治疗Wee1相关疾病的药物的应用。

44.根据权利要求36～42任意一项所述的F晶型的制备方法，包括：

(a)将式(I)化合物加入醇类溶剂中搅拌加热至油浴55～65℃；

(b)47℃-53℃下搅拌72小时；

(c)关闭加热，保持搅拌自然降温1小时后至27℃；

(d)静置18小时，过滤，再用甲醇淋洗滤饼；

(e)60℃真空烘干48小时。

45.根据权利要求44所述的制备方法，其中，醇类溶剂为甲醇。