HK40007827B - 吡咯并苯并二氮杂䓬前药及其抗体缀合物 - Google Patents

Description

吡咯并苯并二氮杂前药及其抗体缀合物

相关申请的交叉引用

本申请要求2016年8月11日提交的美国临时申请序列号62/373,740的优先权权益，所述美国临时申请的全文并入本文。

发明领域

本公开的领域整体涉及具有二硫化物触发物、环状二酮触发物、或芳基硼酸或芳基硼酸酯触发物的吡咯并苯并二氮杂前药，以及其抗体缀合物。

背景技术

已知吡咯并苯并二氮杂(PBD)及其二聚体与DNA相互作用并且是有效的癌症化疗剂。问题是与一些PBD相关的副作用(诸如心脏毒性和急性组织坏死)限制了使用、剂量和有效性。

包含选择性载体-接头-PBD结构的缀合物(例如，抗体-PBD缀合物(ADC))是有吸引力的选择性化疗分子，因为它们结合了对靶细胞和细胞毒性药物的选择性的理想特性。通过将有效的细胞毒性药物导向靶细胞，可以改善在靶细胞中的期望治疗效果，同时使对非靶细胞的影响最小化。此类改善的实例包括实现治疗效果所需的剂量减少、靶向递送、以及改善的血流稳定性。尽管如此，PBD ADC仍然可能存在限制使用和/或剂量的不良副作用。

因此，需要提供降低的毒性和改善的生物功效的PBD化合物和制剂。

发明内容

在一些实施方案中，提供了一种式(I)的PBD前药二聚体-抗体缀合物组合物，其包含第一PBD前药单体M1和第二PBD-抗体单体M2：

M1为PBD单体。R²选自-H、＝CH₂、-CN、-R、＝CH-R、芳基、杂芳基、双环和杂双环。R³为H。R⁶、R⁷和R⁹独立地选自H、R、OH、OR、卤基、氨基、硝基、SH和SR。X选自S、O和NH。R¹⁰为前药部分，其包括(i)谷胱甘肽活化的二硫化物，(ii)DT-心肌黄酶活化的醌，或(iii)活性氧物质活化的芳基硼酸或芳基硼酸酯。R¹¹选自(i)H和R，当X为O或NH时，以及(ii)H、R和O_zU，当X为S时，其中z为2或3并且U为一价的药学上可接受的阳离子。R选自具有1至10个碳原子的低级烷基基团和最多12个碳原子的芳基烷基基团，(i)其中烷基基团任选地含有一个或多个碳-碳双键或三键，或最多12个碳原子的芳基烷基，并且(ii)其中R被一个或多个卤基、羟基、氨基、或硝基基团任选取代，并且任选地含有一个或多个杂原子。M1含有任选的双键，如虚线所指示，所述双键介于以下各项中的两者之间：(i)C₁与C₂；(ii)C₂与C₃；以及(iii)C₂与R²。

M2为PBD单体。R^2’、R^3’、R^6’、R^7’、R^9’、R^11’和X’分别对应于R²、R³、R⁶、R⁷、R⁹、R¹¹和X，并且以与它们相同的方式定义。L为自分解型(self-immolative)接头，其包括二硫化物部分、肽部分或肽模拟物部分。M2含有任选的双键，如虚线所指示，所述双键介于以下各项中的两者之间：(i)C_1’与C_2’；(ii)C_2’与C_3’；以及(iii)C_2’与R^2’。

M1和M2在C8位置上由部分-Q-T-Q'-键合，其中Q和Q'独立地选自O、NH和S，并且其中T为任选取代的C_1-12亚烷基基团，其进一步任选地被一个或多个杂原子和/或芳环中断。Ab为抗体，并且p为具有1、2、3、4、5、6、7或8的值的整数并代表可与抗体缀合或键合的PBD前药二聚体的数目。每个星号独立地代表外消旋或未定义的立体化学的手性中心。

在一些其它实施方案中，提供了一种式(II)的PBD单体前药组合物。

R²选自-H、＝CH₂、-CN、-R、＝CH-R、芳基、杂芳基、双环和杂双环。R³为H。R⁶、R⁷、R⁸和R⁹独立地选自H、R、OH、OR、卤基、氨基、硝基、SH和SR，或R⁷和R⁸与它们所键合的碳原子一起形成基团-O-(CH₂)_n-O-，其中n为1或2。X选自S、O和NH。R¹⁰为前药部分，其包括(i)谷胱甘肽活化的二硫化物，(ii)DT-心肌黄酶活化的醌，或(iii)活性氧物质活化的芳基硼酸或芳基硼酸酯。R¹¹选自(i)H和R，当X为O或NH时，以及(ii)H、R和O_zU，当X为S时，其中z为2或3并且U为一价的药学上可接受的阳离子。R选自具有1至10个碳原子的低级烷基基团和最多12个碳原子的芳基烷基基团，(i)其中烷基基团任选地含有一个或多个碳-碳双键或三键，或最多12个碳原子的芳基基团，并且(ii)其中R被一个或多个卤基、羟基、氨基、或硝基基团任选取代，并且任选地含有一个或多个杂原子。PBD单体前药含有任选的双键，如虚线所指示，所述双键介于以下各项中的两者之间：(i)C₁与C₂；(ii)C₂与C₃；以及(iii)C₂与R²。每个星号独立地代表外消旋或未定义的立体化学的手性中心。

在一些其它实施方案中，提供了一种式(VIII)的PBD前药二聚体化合物，其包含第一PBD前药单体M1和第二PBD单体M2：

M1为PBD单体。R²选自-H、＝CH₂、-CN、-R、＝CH-R、芳基、杂芳基、双环和杂双环。R³为H。R⁶、R⁷和R⁹独立地选自H、R、OH、OR、卤基、氨基、硝基、SH和SR。X选自S、O和NH。R¹⁰为前药部分，其包括(i)谷胱甘肽活化的二硫化物，(ii)DT-心肌黄酶活化的醌，或(iii)活性氧物质活化的芳基硼酸或芳基硼酸酯。R¹¹选自(i)H和R，当X为O或NH时，以及(ii)H、R和O_zU，当X为S时，其中z为2或3并且U为一价的药学上可接受的阳离子。R选自具有1至10个碳原子的低级烷基基团和最多12个碳原子的芳基烷基基团，(i)其中烷基基团任选地含有一个或多个碳-碳双键或三键，或最多12个碳原子的芳基基团，并且(ii)其中R被一个或多个卤基、羟基、氨基、或硝基基团任选取代，并且任选地含有一个或多个杂原子。M1含有任选的双键，如虚线所指示，所述双键介于以下各项中的两者之间：(i)C₁与C₂；(ii)C₂与C₃；以及(iii)C₂与R²。

M2为PBD单体。R^2’、R^3’、R^6’、R^7’、R^9’、R^11’和X'分别对应于R²、R³、R⁶、R⁷、R⁹、R¹¹和X。M2含有任选的双键，如虚线所指示，所述双键介于以下各项中的两者之间：(i)C_1’与C_2’；(ii)C_2’与C_3’；以及(iii)C_2’与R^2’。R¹²在N10’与C11’之间的键为双键时不存在，或选自-C(O)O-L和-C(O)O-R¹⁰。

L为自分解型接头，其包括二硫化物部分、肽部分和肽模拟物部分中的至少一个。M1和M2在C8位置上由部分-Q-T-Q'-键合，其中Q和Q'独立地选自O、NH和S，并且其中T为任选取代的C_1-12亚烷基基团，其进一步任选地被一个或多个杂原子和/或芳环中断。

每个星号独立地代表外消旋或未定义的立体化学的手性中心。

在一些其它实施方案中，提供了一种药物组合物，其包含先前所述的PBD前药二聚体-抗体缀合化合物以及药学上可接受的稀释剂、抗体或赋形剂。

在一些其它实施方案中，提供了一种治疗癌症的方法，其包括向患者施用如先前所述的药物组合物。

在其它实施方案中，提供了如先前所述的抗体-药物缀合化合物在制造用于治疗哺乳动物的癌症的药剂方面的用途。

在其它实施方案中，提供了用于在治疗癌症的方法中使用的如先前所述的抗体-药物缀合化合物。

在其它实施方案中，提供了一种制品，其包括如先前所述的药物组合物、容器以及指示药物组合物可用于治疗癌症的包装插页或标签。

附图说明

图1描绘了针对KPL-4细胞的PBD单体二硫化物前药活性[％]相对于以摩尔/升计的前药浓度的对数的图，并且还描绘了针对KPL-4细胞的PBD单体IC₅₀效力的表格。

图2描绘了针对WSU-DLCL2细胞的PBD单体二硫化物前药活性[％]相对于以摩尔/升计的前药浓度的对数的图，并且还描绘了针对WSU-DLCL2细胞的PBD单体IC₅₀效力的表格。

图3描绘了SK-BR-3细胞活力(对照的％)相对于PBD单体二硫化物前药浓度(μg/mL)的图。

图4描绘了以4小时和24小时的间隔评估的人和大鼠全血中的PBD单体二硫化物前药稳定性的图，其中结果呈现为相对于时间0剩余的母体化合物的百分比。

图5描绘了SK-BR-3细胞活力(对照的％)相对于PBD单体二硫化物前药浓度(微摩尔)和PBD二聚体二硫化物前药浓度(μg/mL)的图。

图6描绘了KPL-4细胞活力(对照的％)相对于PBD单体二硫化物前药浓度(微摩尔)和PBD二聚体二硫化物前药浓度(μg/mL)的图。

图7描绘了UACC-257和IGROV-1相对细胞活力(对照的％)相对于PBD二聚体非前药对照浓度(nM)的图，并且还描绘了针对UACC-257和IGROV-1细胞的PBD二聚体IC₅₀效力的表格。

图8描绘了UACC-257和IGROV-1相对细胞活力(对照的％)相对于在一个PBD单体N10位置上具有二硫化物前药且在另一个PBD单体上不具有前药的PBD二聚体的浓度(nM)的图，并且还描绘了针对UACC-257和IGROV-1细胞，对于所指示GSH浓度的PBD二聚体IC₅₀效力和IC₅₀比率的表格。IC₅₀比率相对于图7中描绘的PBD二聚体非前药对照的数据确定。

图9描绘了UACC-257和IGROV-1相对细胞活力(对照的％)相对于在两个PBD单体的N10位置上均具有二硫化物前药的PBD二聚体的浓度(nM)的图，并且还描绘了针对UACC-257和IGROV-1，对于所指示GSH浓度的PBD二聚体IC₅₀效力和IC₅₀比率的表格。IC₅₀比率相对于图7中描绘的PBD二聚体非前药对照的数据确定。

图10描绘了SK-BR3相对细胞活力(对照的％)相对于以下各项的浓度(nM)的图：(i)PBD二聚体非前药，(ii)在一个PBD单体N10位置上具有二硫化物前药且在另一个PBD单体上不具有前药的PBD二聚体，以及(iii)在两个PBD单体的N10位置上均具有二硫化物前药的PBD二聚体。

图11描绘了SK-BR-3细胞活力(对照的％)相对于以下各项的浓度的图：(i)7C2HCA140C肽连接的二硫化物环戊基前药ADC PBD二聚体，(ii)7C2LC K149C肽连接的二硫化物硫代-苯酚前药ADC PBD二聚体，(iii)不具有前药部分的7C2HC A140C ADC PBD二聚体，以及(iv)不具有前药部分的CD22HC A140C ADC PBD二聚体。

图12描绘了KPL-4细胞活力(对照的％)相对于以下各项的浓度的图：(i)7C2HCA140C肽连接的二硫化物环戊基前药ADC PBD二聚体，(ii)7C2LC K149C肽连接的二硫化物硫代-苯酚前药ADC PBD二聚体，(iii)不具有前药部分的7C2HC A140C ADC PBD二聚体，以及(iv)不具有前药部分的CD22HC A140C ADC PBD二聚体。

图13描绘了SK-BR-3细胞活力(对照的％)相对于以下各项的浓度的图：(i)7C2LCK149C肽连接的二硫化物环丁基前药ADC PBD二聚体，(ii)7C2LC K149C肽连接的二硫化物环戊基前药ADC PBD二聚体，(iii)7C2LC K149C肽连接的二硫化物硫代-苯酚前药ADC PBD二聚体，(iv)7C2LC K149C肽连接的二硫化物异丙基前药ADC PBD二聚体，(v)不具有前药部分的4D5HC A118C ADC PBD二聚体，以及(vi)不具有前药部分的4D5LC V205C ADC PBD二聚体。

图14描绘了KPL-4细胞活力(对照的％)相对于以下各项的浓度的图：(i)7C2LCK149C肽连接的二硫化物环丁基前药ADC PBD二聚体，(ii)7C2LC K149C肽连接的二硫化物环戊基前药ADC PBD二聚体，(iii)7C2LC K149C肽连接的二硫化物硫代-苯酚前药ADC PBD二聚体，(iv)7C2LC K149C肽连接的二硫化物异丙基前药ADC PBD二聚体，(v)不具有前药部分的4D5HC A118C ADC PBD二聚体，以及(vi)不具有前药部分的4D5LC V205C ADC PBD二聚体。

图15A描绘了相比于时间0时的细胞数目的3天后WSU-DLCL活细胞标准化百分比相对于以下各项的浓度的图：(i)在一个PBD单体的N10位置上具有甲酸苄酯(C₆H₅-CH₂-O-C(O)-)部分的CD22抗体ADC PBD二聚体(阴性对照)，(ii)CD22抗体ADC PBD二聚体芳基硼酸前药((OH)₂B-C₆H₄-CH₂-O-C(O)-)，以及(iii)不具有前药部分的CD22抗体ADC PBD二聚体(阳性对照)。

图15B描绘了暴露于以下各项后3天WSU-DLCL细胞杀伤相对于药物浓度(μg/mL)的图：(i)具有硼酸前药的CD22抗体ADC PBD二聚体(PBD二聚体ADC硼酸前药1A)；(ii)具有硼酸前药的Ly6E抗体ADC PBD二聚体(PBD二聚体ADC硼酸前药1B)；(iii)不具有前药部分的CD22抗体ADC PBD二聚体(PBD二聚体ADC硼酸对照2)(阳性对照)以及(iv)空白对照。

图15C描绘了暴露于以下各项后3天MDA-MB-453细胞杀伤相对于药物浓度(μM)的图：(i)PBD单体对照；(ii)在N10PBD位置处具有甲酸苄酯部分的PBD单体对照；以及(iii)PBD单体硼酸前药。

图15D描绘了暴露于以下各项后3天MDA-MB-453细胞杀伤相对于药物浓度(μM)的图：(i)silvestrol；(ii)PBD单体对照；(iii)在N10PBD位置处具有甲酸苄酯部分的PBD单体对照；(iv)PBD单体硼酸前药；(v)PBD单体对照和silvestrol；(vi)在N10PBD位置处具有甲酸苄酯部分的PBD单体对照和silvestrol；以及(vii)PBD单体硼酸前药和silvestrol.7

图16描绘了相比于时间0时的细胞数目的3天后BJAB活细胞标准化百分比相对于以下各项的浓度的图：(i)在一个PBD单体的N10位置上具有甲酸苄酯(C₆H₅-CH₂-O-C(O)-)部分的CD22抗体ADC PBD二聚体(阴性对照)，(ii)CD22抗体ADC PBD二聚体芳基硼酸前药((OH)₂B-C₆H₄-CH₂-O-C(O)-)，以及(iii)不具有前药部分的CD22抗体ADC PBD二聚体(阳性对照)。

图17描绘了针对KPL-4细胞的活性[％]相对于以下各项的浓度(M)的图：(i)在一个PBD单体的N10位置处具有醌前药并且在另一个PBD单体的N10位置处没有前药或接头的PBD二聚体，以及(ii)不具有前药或接头的PBD二聚体。图17还描绘了针对KPL-4细胞的PBD二聚体心肌黄酶前药和对照IC₅₀效力和IC₅₀比率的表格。IC₅₀比率基于相对于PBD二聚体对照的前药IC₅₀值。

图18描绘了针对WSU细胞的活性[％]相对于以下各项的浓度(M)的图：(i)在一个PBD单体的N10位置处具有醌前药并且在另一个PBD单体的N10位置处没有前药或接头的PBD二聚体，以及(ii)不具有前药或接头的PBD二聚体。图18还描绘了针对KPL-4细胞的PBD二聚体心肌黄酶前药和对照IC₅₀效力和IC₅₀比率的表格。IC₅₀比率基于相对于PBD二聚体对照的前药IC₅₀值。

图19描绘了针对KPL-4细胞的活性[％]相对于以下各项的浓度(M)的图：(i)在N10处具有醌前药的PBD单体，以及(ii)不具有前药或接头的PBD单体。图19还描绘了针对KPL-4细胞的PBD二聚体心肌黄酶前药和对照IC₅₀效力和IC₅₀比率的表格。IC₅₀比率基于相对于PBD二聚体对照的前药IC₅₀值。

图20描绘了针对WSU细胞的活性[％]相对于以下各项的浓度(M)的图：(i)在N10处具有醌前药的PBD单体，以及(ii)不具有前药或接头的PBD单体。图20还描绘了针对WSU细胞的PBD二聚体心肌黄酶前药和对照IC₅₀效力和IC₅₀比率的表格。IC₅₀比率基于相对于PBD二聚体对照的前药IC₅₀值。

图21描绘了SK-BR-3细胞活力(对照的％)相对于以下各项的浓度(μg/mL)的图：(i)7C2LC K149C VC-PBD DT心肌黄酶醌前药ADC PBD二聚体，(ii)Ly6E LC K149C VC-PBDDT心肌黄酶醌前药ADC PBD二聚体，以及(iii)不具有前药部分的4D5HC A118C ADC PBD二聚体。

图22描绘了KPL-4细胞活力(对照的％)相对于以下各项的浓度(μg/mL)的图：(i)7C2LC K149C VC-PBD DT心肌黄酶醌前药ADC PBD二聚体，(ii)Ly6E LC K149C VC-PBD DT心肌黄酶醌前药ADC PBD二聚体，以及(iii)不具有前药部分的4D5HC A118C ADC PBD二聚体。

图23描绘了肿瘤体积(mm³)相对于患有BJAB-luc人伯基特淋巴瘤的SCID小鼠用以下各项处理后的天数的图：(i)组氨酸缓冲液媒介物；(ii)非前药抗CD22HC-A118C PBD二聚体ADC；(iii)抗CD22 LC-K149C PDB二聚体硼酸前药ADC；(iv)抗Ly6E LC-K149C PDB二聚体硼酸前药ADC；(v)非前药抗CD22LC-K149C PDB二聚体ADC；以及(vi)非前药抗Her2HC-A118CPBD二聚体ADC。

图24描绘了体重变化％相对于患有BJAB-luc人伯基特淋巴瘤的SCID小鼠用以下各项处理后的天数的图：(i)组氨酸缓冲液媒介物；(ii)非前药抗CD22HC-A118C PBD二聚体ADC；(iii)抗CD22 LC-K149C PDB二聚体硼酸前药ADC；(iv)抗Ly6E LC-K149C PDB二聚体硼酸前药ADC；(v)非前药抗CD22LC-K149C PDB二聚体ADC；以及(vi)非前药抗Her2HC-A118CPBD二聚体ADC。

图25描绘了肿瘤体积(mm³)相对于患有KPL-4人乳腺肿瘤的SCID-beige小鼠用以下各项处理后的天数的图：(i)媒介物；(ii)非前药抗Her2HC-A140C PBD二聚体ADC；以及(iii)抗Her2HC-A140CPBD硫代-苯酚前药ADC。

图26描绘了体重变化％相对于患有KPL-4人乳腺肿瘤的SCID-beige小鼠用以下各项处理后的天数的图：(i)媒介物；(ii)非前药抗Her2HC-A140C PBD二聚体ADC；以及(iii)抗Her2HC-A140C PBD硫代-苯酚前药ADC。

具体实施方式

现在将详细参考本发明的某些实施方案，其实例在所附结构和式中说明。虽然将结合所列举的实施方案描述本发明，但是应该理解，它们并不旨在将本发明限于那些实施方案。相反，本发明旨在覆盖可包括在如由权利要求所限定的本发明的范围之内的所有替代物、修改和等同物。

本领域技术人员将认识到类似或等同于本文所述的那些的许多方法和材料，所述方法和材料可用于本发明的实践。本发明决不限于所描述的方法和材料。

在一些实施方案中，本公开整体涉及式(II)的PBD单体前药化合物：

其中R²、R³、R⁶、R⁷、R⁸、R⁹、X、R¹⁰、R¹¹和*在本文其它地方更详细地定义。

在一些实施方案中，本公开涉及PBD二聚体前药化合物，其包含在N10位置处具有R¹⁰的第一PBD单体。二聚体另外包含在N10位置处具有以下各项的第二PBD单体：(1)无取代；(2)R¹⁰；或(3)接头。PBD二聚体通常是以下两种结构中的一个：

其中R²、R^2’、R³、R^3’、R⁶、R^6’、R⁷、R^7’、R⁹、R^9’、X、R¹⁰、R¹¹、R^11’、Q、Q'、T、*和接头在本文其它地方更详细地定义。

在一些实施方案中，本公开涉及PBD二聚体前药化合物，其包含在N10位置处具有以下各项的第一PBD单体：(i)包含GSH活化的二硫化物触发物的保护基团，(ii)包含DTD活化的醌触发物的保护基团，或(iii)包含ROS活化的芳基硼酸或芳基硼酸酯触发物的保护基团。二聚体另外包含第二PBD单体，其在N10位置处具有与抗体巯基部分缀合的接头。PBD二聚体通常如下：

其中R²、R^2’、R³、R^3’、R⁶、R^6’、R⁷、R^7’、R⁹、R^9’、X、R¹⁰、R¹¹、R^11’、T、*、接头、抗体以及p在本文其它地方更详细地定义。

I.定义

除非另外定义，否则本文所用的科学术语的含义与本公开所属领域的普通技术人员通常理解的一样，并且与以下各文献一致：Singleton等人(1994)Dictionary ofMicrobiology and Molecular Biology,第2版,J.Wiley&Sons,New York,NY；以及Janeway,C.、Travers,P.、Walport,M.、Shlomchik(2001)Immunobiology,第5版,GarlandPublishing,New York。

如本文所定义的“前药”是在N10位置处被包含触发物的保护基团取代的PBD，其中保护基团掩盖药物毒性。通过对触发物施加刺激，诸如酶(例如，DTD)、ROS或GSH，将保护基团酶促或化学激活(切割)以生成活性药物。在一些实施方案中，触发物为二硫化物、环状二酮(例如，醌)、或芳基硼酸或芳基硼酸酯。

如本文所定义的“保护基团”是指通过阻断或保护特定功能性的官能团的化学修饰引入药物分子中的部分。

“DTD”是指DT-心肌黄酶；“ROS”是指活性氧物质；并且“GSH”是指谷胱甘肽。

“接头”(L)为双官能或多官能部分，其可用于将一个或多个药物部分(D)与抗体(Ab)连接以形成具有以下通式的抗体-接头-药物缀合物：

抗体-[L-D]_p

其中p可为1、2、3、4、5、6、7或8。接头通常包含与抗体(Ab)的连接部、任选的抗体间隔基单元、用于提供分解(immolation)的任选的触发物单元、任选的药物(D)间隔基单元、以及与药物的连接部，并且具有以下通式结构：

Ab-[Ab连接部]-[Ab间隔基]_任选-[触发物]_任选-[D间隔基]_任选-[D连接部]-D。

在一些实施方案中，可以使用具有反应性官能度以用于共价连接至药物和抗体的接头制备抗体-D缀合物。例如，在一些实施方案中，半胱氨酸工程改造的抗体(Ab)的半胱氨酸硫醇可以与接头或药物-接头中间体的反应性官能团形成键以制备ADC。在一个实施方案中，接头具有能够与抗体上存在的游离半胱氨酸反应以形成共价二硫键的官能度(参见，例如，Klussman等人(2004),Bioconjugate Chemistry 15(4):765-773的第766页的缀合方法，以及本文的实施例，其以引用方式全文并入本文)。在一些实施方案中，接头可包含可切割的自分解型部分，诸如肽、肽模拟物或二硫化物触发物。接头可任选地包含处于自分解型部分与药物部分之间(诸如对氨基-苄基(“PAB”))和/或处于自分解型部分与抗体之间(诸如衍生自己酸的部分)的一个或多个“间隔基”单元。间隔基的非限制性实例包括缬氨酸-瓜氨酸(“val-cit”或“vc”)、丙氨酸-苯丙氨酸(“ala-phe”)、以及对氨基苄氧基羰基(“PABC”)。在一些实施方案中，间隔基可以是自分解的。

“自分解”和“自分解型”是指可以在体内和/或体外诸如通过酶(例如蛋白酶或DTD)、GSH、ROS和/或pH变化切割的部分，诸如接头、间隔基和/或前药触发物。自分解型部分的实例包括二硫化物、肽和肽模拟物。

“肽”是指通过酰胺(肽)键连接的两个或更多个氨基酸单体的短链。氨基酸单体可以是天然存在的和/或非天然存在的氨基酸类似物。

“肽模拟物”是指具有与氨基酸或肽的一般化学结构不同的结构，但以与天然存在的氨基酸或肽类似的方式起作用的基团或部分。

“受阻接头”是指具有带有能够形成二硫键的硫的碳原子的接头，其中碳原子被除H以外的至少一个取代基取代，并且更具体地被烃基或取代的烃基部分取代，如下文进一步详述。

“亲和力”是指分子(例如，抗体)的单个结合位点与其结合配偶体(例如，抗原)之间的非共价相互作用的总和的强度。除非另外指明，否则如本文所用，“结合亲和力”是指内在结合亲和力，其反映了结合对的成员(例如，抗体与抗原)之间的1:1相互作用。分子X对其配偶体Y的亲和力通常可由解离常数(Kd)代表。亲和力可以通过本领域已知的常见方法测量，包括本文所述的那些方法。

“细胞靶向部分”是指对表达抗原的靶标具有结合亲和力的抗体。

“主要包含”是指在所列举的基础上，诸如例如且不限于在重量/重量％、体积/体积％、重量/体积％或当量％基础上参考组分的至少50％、至少75％、至少90％、至少95％或至少99％。“基本上由......组成”通常将特征结构、化合物、组合物或方法限于所列举的元素和/或步骤，但不排除不对所列举的特征结构、化合物、组合物或方法的功能、化合物、组合物和/或特征产生实质性影响的另外的元素和/或步骤的可能性。

术语“抗体”和“Ab”在本文中是在最广泛的意义上加以使用并且具体地涵盖单克隆抗体、多克隆抗体、二聚体、多聚体、多特异性抗体(例如，双特异性抗体)、以及抗体片段，只要它们显示所期望的生物活性即可(Miller等人(2003)Jour.of Immunology 170:4854-4861)。抗体可以是鼠、人、人源化的、嵌合的、或来源于其它物种。抗体是由免疫系统生成的蛋白质，其能够识别并结合特定抗原。(Janeway,C.、Travers,P.、Walport,M.、Shlomchik(2001)Immuno Biology,第5版,Garland Publishing,New York)。靶抗原通常具有由多个抗体上的CDR识别的许多结合位点，也称为表位。特异性结合不同表位的各个抗体具有不同的结构。因此，一种抗原可具有多于一种的对应抗体。抗体包括全长免疫球蛋白分子或全长免疫球蛋白分子的免疫活性部分，即含有免疫特异性地结合目标靶标的抗原或其部分的抗原结合位点的分子，此类靶标包括但不限于产生与自身免疫疾病相关的自身免疫抗体的一种或多种癌细胞。本文公开的免疫球蛋白可以属于免疫球蛋白分子的任何类型(例如，IgG、IgE、IgM、IgD和IgA)、类别(例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)或亚类。免疫球蛋白可以来源于任何物种。然而，在一个实施方案中，免疫球蛋白是人、鼠或兔来源的。

“抗体片段”包括全长抗体的一部分，通常为其抗原结合区或可变区。抗体片段的实例包括Fab、Fab'、F(ab')2和Fv片段；双抗体；线性抗体；微型抗体(Olafsen等人(2004)Protein Eng.Design&Sel.17(4):315-323)；由Fab表达文库产生的片段；抗独特型(抗Id)抗体；CDR(互补决定区)；以及免疫特异性地结合癌细胞抗原、病毒抗原或微生物抗原的本文所述的任何的表位结合片段，单链抗体分子；以及由抗体片段形成的多特异性抗体。

如本文所用的术语“单克隆抗体”是指从基本上同质的抗体群获得的抗体，即，除了可能存在少量可能天然存在的突变之外，构成群的单个抗体是相同的。单克隆抗体是高度特异性的，针对单个抗原位点。此外，与包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制剂相反，每种单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。除了它们的特异性之外，单克隆抗体的优点还在于它们可以在不被其它抗体污染的情况下合成。修饰语“单克隆”表明该抗体的特征，其是从基本上同质的抗体群获得的，并且不应解释为需通过任何特定方法产生该抗体。例如，根据本公开使用的单克隆抗体可以通过Kohler等人(1975)Nature 256:495最初描述的杂交瘤方法制备，或可以通过重组DNA方法制备(参见例如：US 4816567；US5807715)。单克隆抗体还可以分离自噬菌体抗体文库，利用例如在Clackson等人(1991)Nature,352:624-628；Marks等人(1991)J.Mol.Biol.,222:581-597中描述的技术。

本文中的单克隆抗体特别包括“嵌合”抗体，其中一部分的重和/或轻链与源自特定物种或属于特定抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或与其同源，同时链的剩余部分与在源自另一物种或属于另一抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同于或与其同源，以及上述抗体的片段，只要它们显示所期望的生物活性(US 4816567；和Morrison等人(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81:6851-6855)。本文的目标嵌合抗体包括包含衍生自非人灵长类动物(例如，旧世界猴、猿等)的可变结构域抗原结合序列和人恒定区序列的“灵长类化”抗体。

本文的“完整抗体”是包含VL和VH结构域、以及轻链恒定结构域(CL)和重链恒定结构域CH1、CH2和CH3的抗体。恒定结构域可为天然序列恒定结构域(例如，人天然序列恒定结构域)或其氨基酸序列变体。完整抗体可具有一种或多种“效应功能”，其指可归因于抗体Fc恒定区(天然序列Fc区或氨基酸序列变体Fc区)的那些生物活性。抗体效应功能的实例包括C1q结合；补体依赖性细胞毒性；Fc受体结合；抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)；吞噬作用；以及细胞表面受体(诸如B细胞受体和BCR)的下调。

根据它们重链的恒定结构域的氨基酸序列，可对完整抗体指定不同的“类别”。完整免疫球蛋白抗体有五大类别：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，并且这些的若干种可以进一步分为“亚类”(同种型)，例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA以及IgA2。与不同类别的抗体相对应的重链恒定结构域分别称为α、δ、ε、γ和μ。不同类别的免疫球蛋白的亚基结构和三维构型是众所周知的。Ig形式包括铰链-修饰或无铰链形式(Roux等人(1998)J.Immunol.161:4083-4090；Lund等人(2000)Eur.J.Biochem.267:7246-7256；US 2005/0048572；US 2004/0229310)。

“半胱氨酸工程改造的抗体”或“半胱氨酸工程改造的抗体变体”是其中抗体的一个或多个残基被半胱氨酸残基取代的抗体。根据本公开，半胱氨酸工程改造的抗体的一个或多个硫醇基团可以缀合至本公开的前药以形成THIOMAB^TM ADC(即，THIOMAB^TM药物缀合物(TDC))。在特定实施方案中，取代的残基出现在抗体的可接近位点。通过用半胱氨酸取代那些残基，反应性硫醇基团因此定位在抗体的可接近位点，并且可用于将抗体缀合至药物部分以产生如本文进一步描述的免疫缀合物。例如，THIOMAB^TM抗体可以是在轻链(例如，根据Kabat编号的G64C、K149C或R142C)中或在重链(例如，根据Kabat编号的D101C或V184C或T205C)中具有非半胱氨酸天然残基至半胱氨酸的单一突变的抗体。在具体实例中，THIOMAB^TM抗体在重链或轻链中具有单个半胱氨酸突变，以使每个全长抗体(即，具有两条重链和两条轻链的抗体)具有两个工程改造的半胱氨酸残基。US 2012/0121615 A1(以引用的方式全文并入本文)公开了半胱氨酸工程改造的抗体和制备方法。

术语“癌症”和“癌性”是指或描述哺乳动物中通常以失控的细胞生长/增殖为特征的生理状况。癌症的实例包括但不限于癌、淋巴瘤(例如，霍奇金氏和非霍奇金氏淋巴瘤)、胚细胞瘤、肉瘤以及白血病。此类癌症的更具体的实例包括急性骨髓性白血病(AML)、骨髓增生异常综合征(MDS)、慢性骨髓性白血病(CML)、慢性髓单核细胞白血病、急性早幼粒细胞白血病(APL)、慢性骨髓增生性病症、血小板性白血病(thrombocytic leukemia)、前体B细胞急性成淋巴细胞性白血病(pre-B-ALL)、前体T细胞急性成淋巴细胞性白血病(preT-ALL)、多发性骨髓瘤(MM)、肥大细胞病、肥大细胞白血病、肥大细胞肉瘤、骨髓性肉瘤、淋巴细胞性白血病、以及未分化性白血病。在一些实施方案中，癌症为骨髓性白血病。在一些实施方案中，癌症为急性骨髓性白血病(AML)。

术语“嵌合”抗体是指其中重链和/或轻链的一部分来源于特定来源或物种，而重链和/或轻链的其余部分来源于不同来源或物种的抗体。

抗体的“类别”是指其重链所具有的恒定结构域或恒定区的类型。抗体有五大类别：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，并且这些的若干种可以进一步分为“亚类”(同种型)，例如，IgG₁、IgG₂、IgG₃、IgG₄、IgA₁以及IgA₂。与不同类别的免疫球蛋白相对应的重链恒定结构域分别称为α、δ、ε、γ和μ。

“效应功能”是指可归因于抗体的Fc区的那些生物活性，其随抗体同种型而变化。抗体效应功能的实例包括：C1q结合和补体依赖性细胞毒性(CDC)；Fc受体结合；抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)；吞噬；细胞表面受体(例如B细胞受体)的下调；以及B细胞活化。

剂(例如，药物制剂)的“有效量”是指在必要的剂量和时间段内有效实现期望的治疗或预防结果的量。

术语“表位”是指抗体所结合的抗原分子上的特定位点。在一些实施方案中，抗体所结合的抗原分子上的特定位点通过羟基自由基足迹法(hydroxyl radicalfootprinting)确定。

本文的术语“Fc区”用于定义免疫球蛋白重链的C末端区域，其含有恒定区的至少一部分。该术语包括天然序列Fc区和变体Fc区。在一个实施方案中，人IgG重链Fc区从Cys226或从Pro230延伸至重链的羧基末端。然而，Fc区的C末端赖氨酸(Lys447)可以存在或可以不存在。除非本文另外指明，否则Fc区或恒定区中的氨基酸残基的编号是根据EU编号系统，也称为EU索引，如Kabat等人,Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest,第5版Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD,1991中所描述的。

“框架”或“FR”是指除高变区(HVR)残基之外的可变结构域残基。可变结构域的FR通常由四个FR结构域组成：FR1、FR2、FR3和FR4。因此，HVR和FR序列通常以下列顺序出现在VH(或VL)中：FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4。

术语“全长抗体”、“完整抗体”和“完全抗体”在本文可互换使用，是指具有与天然抗体结构基本相似的结构或具有含有如本文所定义的Fc区的重链的抗体。

术语“宿主细胞”、“宿主细胞系”和“宿主细胞培养物”可互换使用并且是指已引入外源核酸的细胞，包括此类细胞的后代。宿主细胞包括“转化体”和“转化细胞”，其包括原代转化细胞和由其衍生的后代，不考虑传代次数。后代可能与亲本细胞的核酸含量不完全相同，但可能含有突变。本文包括具有与在初始转化的细胞中筛选或选择的相同功能或生物活性的突变后代。

“人抗体”是具有与由人或人细胞产生的或来源于非人来源的利用人抗体库或其它人抗体编码序列的抗体的氨基酸序列相对应的氨基酸序列的抗体。人抗体的这一定义明确排除了包含非人抗原结合残基的人源化抗体。

“人共有框架”是代表在人免疫球蛋白VL或VH框架序列的选择中最常出现的氨基酸残基的框架。一般来说，人免疫球蛋白VL或VH序列的选择来自可变结构域序列的亚组。一般来说，序列的亚组是如Kabat等人,Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest,第5版,NIH Publication 91-3242,Bethesda MD(1991),第1-3卷中所述的亚组。在一个实施方案中，对于VL，亚组是亚组k I，如Kabat等人,同上中所述。在一个实施方案中，对于VH，亚组是亚组III，如Kabat等人,同上中所述。

“人源化”抗体是指包含来自非人HVR的氨基酸残基和来自人FR的氨基酸残基的嵌合抗体。在某些实施方案中，人源化抗体将包含基本上所有至少一个，且通常两个可变结构域，其中所有或基本上所有的HVR(例如，CDR)对应于非人抗体的那些，并且所有或基本上所有的FR对应于人抗体的那些。人源化抗体任选地可包括衍生自人抗体的抗体恒定区的至少一部分。抗体(例如非人抗体)的“人源化形式”是指已发生人源化的抗体。

术语“可变区”或“可变结构域”是指抗体重链或轻链的参与抗体与抗原的结合的结构域。天然抗体的重链和轻链的可变结构域(分别为VH和VL)通常具有类似结构，其中每个结构域包含四个保守框架区(FR)和三个高变区(HVR)。(参见，例如，Kindt等人KubyImmunology,第6版,W.H.Freeman and Co.,第91页(2007)。)单个VH或VL结构域可足以赋予抗原结合特异性。此外，可以使用来自结合特定抗原的抗体的VH或VL结构域分离结合该抗原的抗体，以分别筛选互补VL或VH结构域的文库。参见，例如，Portolano等人,J.Immunol.150:880-887(1993)；Clarkson等人,Nature 352:624-628(1991)。

如本文所用，术语“载体”是指能够增殖与其连接的另一核酸的核酸分子。该术语包括作为自我复制核酸结构的载体以及结合到其已被引入的宿主细胞的基因组中的载体。某些载体能够指导它们可操作地连接的核酸的表达。此类载体在本文被称为“表达载体”。

如本文所用，术语“高变区”或“HVR”是指抗体可变结构域的序列高变和/或形成结构上限定的环(“高变环”)的区域中的每一个。一般来说，天然四链抗体包括六个HVR；三个在VH中(H1、H2、H3)且三个在VL中(L1、L2、L3)。HVR通常包含来自高变环和/或来自“互补决定区”(CDR)的氨基酸残基，后者具有最高的序列可变性和/或参与抗原识别。示例性高变环出现在氨基酸残基26-32(L1)、50-52(L2)、91-96(L3)、26-32(H1)、53-55(H2)和96-101(H3)处。(Chothia和Lesk,J.Mol.Biol.196:901-917(1987)。)示例性CDR(CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3、CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3)出现在以下氨基酸残基处：L1的24-34、L2的50-56、L3的89-97、H1的31-35B、H2的50-65以及H3的95-102。(Kabat等人,Sequences of Proteins ofImmunological Interest,第5版Public Health Service,National Institutes ofHealth,Bethesda,MD(1991)。)除VH中的CDR1之外，CDR通常包含形成高变环的氨基酸残基。CDR还包含“特异性决定残基”或“SDR”，其为接触抗原的残基。SDR包含在被称为缩写-CDR或a-CDR的CDR的区域内。示例性的a-CDR(a-CDR-L1、a-CDR-L2、a-CDR-L3、a-CDR-H1、a-CDR-H2和a-CDR-H3)出现在以下氨基酸残基处：L1的31-34、L2的50-55、L3的89-96、H1的31-35B、H2的50-58、以及H3的95-102。(参见Almagro和Fransson,Front.Biosci.13:1619-1633(2008)。)除非另外指明，否则可变结构域中的HVR残基和其它残基(例如，FR残基)在本文根据Kabat等人,同上进行编号。

“个体”或“受试者”为哺乳动物。哺乳动物包括但不限于驯养动物(例如，牛、绵羊、猫、狗和马)、灵长类动物(例如，人和非人灵长类动物，诸如猴子)、兔以及啮齿动物(例如，小鼠和大鼠)。在某些实施方案中，个体或受试者为人。

“分离的抗体”是已与其天然环境的组分分离的抗体。在一些实施方案中，将抗体纯化至大于95％或99％的纯度，如通过例如电泳(例如，SDS-PAGE、等电点聚焦(IEF)、毛细管电泳)或色谱(例如，离子交换或反向HPLC)测定的。关于评估抗体纯度的方法的综述，参见，例如，Flatman等人,J.Chromatogr.B 848:79-87(2007)。

“天然抗体”是指具有各种结构的天然存在的免疫球蛋白分子。例如，天然IgG抗体为约150,000道尔顿的异四聚体糖蛋白，其由通过二硫键结合的两条相同的轻链和两条相同的重链组成。从N末端到C末端，每条重链具有一个可变区(VH)，也称为可变重链结构域或重链可变结构域，接着是三个恒定结构域(CH1、CH2和CH3)。类似地，从N末端到C末端，每条轻链具有一个可变区(VL)，也称为可变轻链结构域或轻链可变结构域，接着是恒定轻链(CL)结构域。抗体的轻链可基于其恒定结构域的氨基酸序列分为两种类型之一，称为kappa(κ)和lambda(λ)。

术语“包装插页”用于指通常治疗产品的商业包装中通常包括的说明书，其包含关于适应症、用法、剂量、施用、组合疗法、禁忌症和/或关于此类治疗产品的使用的警告的信息。

相对于参考多肽序列而言的“氨基酸序列同一性百分比(％)”定义成为了实现最大序列同一性百分比，将序列比对并且，如果需要，引入空位之后，而且不考虑任何保守型取代作为序列同一性一部分，在候选序列中与参考多肽序列中的氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分比。用于确定氨基酸序列同一性百分比的比对可以以在本领域技术范围内的各种方式实现，例如，使用可公开获得的计算机软件，诸如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件。本领域的技术人员可确定用于比对序列的适当参数，包括在正在比较的序列全长上实现最大比对所需的任何算法。然而，出于本文的目的，使用序列比较计算机程序ALIGN-2生成氨基酸序列同一性％值。ALIGN-2序列比较计算机程序由Genentech,Inc.创作，并且源代码已经与用户文档一起提交华盛顿特区的美国版权局(20559)，其美国版权注册号为TXU510087。ALIGN-2程序可从Genentech,Inc.,South San Francisco,California公开获得，或可由源代码编译。ALIGN-2程序应被编译为用于在UNIX操作系统上使用，包括数字UNIX V4.0D。所有序列比较参数均由ALIGN-2程序设定且不变。

在使用ALIGN-2进行氨基酸序列比较的情况下，给定氨基酸序列A与、和或对给定氨基酸序列B的氨基酸序列同一性％(或可以另选地表述为给定氨基酸序列A与、和或对给定氨基酸序列B具有或包括一定的氨基酸序列同一性％)计算如下：100乘以分数X/Y，其中X是在ALIGN-2程序的A和B比对时通过该序列比对程序评为相同配对的氨基酸残基的数目；并且其中Y是B中的氨基酸残基的总数。应当理解，在氨基酸序列A的长度不等于氨基酸序列B的长度的情况下，A与B的氨基酸序列同一性％将不等于B与A的氨基酸序列同一性％。除非另外特别说明，否则本文所用的所有氨基酸序列同一性％值均如前一段落中所述使用ALIGN-2计算机程序获得。

术语“药物制剂”是指这样的制剂，其形式使得其中所包含的活性成分的生物活性是有效的，并且不包含对将被施用制剂的受试者具有不可接受的毒性的附加组分。

“药学上可接受的载剂”是指药物制剂中除活性成分之外的成分，其对受试者无毒性。药学上可接受的载剂包括但不限于缓冲剂、赋形剂、稳定剂或防腐剂。

术语“治疗(treat)”和“治疗(treatment)”是指治疗性治疗和预防性或防止性措施，其中目的是为了防止或减缓(减少)不希望的生理学变化或病症，诸如癌症的发展或扩散。出于本公开的目的，有益的或期望的临床结果包括但不限于症状的减轻、疾病程度的减小、疾病状态的稳定(即不恶化)、疾病进程的延缓或减慢、疾病状态的改善或缓和，以及缓解(无论是部分缓解还是全部缓解)，无论是可检测还是不可检测。“治疗”还可以意指与不接受治疗的情况下预期的存活率相比延长存活。需要治疗的对象包括已经患有病状或病症的对象，以及易患病状或病症的对象或要预防其病状或病症的对象。

术语“治疗有效量”是指对于治疗哺乳动物疾病或病症有效的药物的量。在癌症的情况下，治疗有效量的药物可以减少癌细胞的数量；减小肿瘤尺寸；抑制(即，在一定程度上减缓且优选停止)癌细胞浸润到外周器官中；抑制(即，在一定程度上减缓且优选停止)肿瘤转移；在一定程度上抑制肿瘤生长；并且/或者在一定程度上缓解与癌症相关的一种或多种症状。在药物可防止生长和/或杀死现有癌细胞的程度上，它可以是细胞抑制性和/或细胞毒性的。对于癌症的治疗，功效可例如通过评定疾病进展时间(TTP)和/或测定响应率(RR)来测定。

如本文所用的术语“离去基团”是指在涉及本文所述基团的化学反应的过程中离开的部分。

如本文所用的术语“烃基”描述了仅由元素碳和氢组成的有机化合物或自由基。这些部分包括但不限于烷基、烯基、炔基和芳基部分。这些部分还包括被其它脂族或环状烃基取代的烷基、烯基、炔基和芳基部分，诸如烷芳基、烯芳基和炔芳基。除非另外指明，否则这些部分优选包括1至20个碳原子、1至10个碳原子或1至6个碳原子。

如本文所用的术语“烷基”自身或作为另一个取代基的一部分意指具有指定碳原子数的直链或支链烃基(即，C_1-8意指1至8个碳原子)。烷基的实例包括甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、叔丁基、异丁基、仲丁基、正戊基、正己基、正庚基、正辛基等。除非另外指明，否则本文所述的烷基基团优选地是在主链中含有1至10个或1至8个碳原子的低级烷基。它们可以是直链或支链或环状的，包括但不限于甲基、乙基、丙基、异丙基、烯丙基、苄基、己基等。烷基部分可任选地包含选自O、S和N的一个或多个杂原子并被称为“杂烷基”。

术语“碳环(carbocycle)”、“碳环基(carbocyclyl)”、“碳环(carbocyclic ring)”和“环烷基”是指具有3至12个碳原子的作为单环(C_3-12)或具有7至12个碳原子的作为双环的一价非芳族、饱和或部分不饱和的环。具有7至12个原子的双环碳环可以被布置为例如双环[4,5]、[5,5]、[5,6]或[6,6]系统，并且具有9或10个环原子的双环碳环可被布置为双环[5,6]或[6,6]系统，或桥接系统诸如双环[2.2.1]庚烷、双环[2.2.2]辛烷和双环[3.2.2]壬烷。单环碳环的实例包括但不限于环丙基、环丁基、环戊基、1-环戊-1-烯基、1-环戊-2-烯基、1-环戊-3-烯基、环己基、1-环己-1-烯基、1-环己-2-烯基、1-环己-3-烯基、环己二烯基、环庚基、环辛基、环壬基、环癸基、环十一烷基、环十二烷基等。碳环和环烷基部分可任选地包含选自O、S和N的一个或多个杂原子。

术语“烷氧基”是指通过氧原子连接至分子的其余部分的那些烷基基团。烷氧基部分可任选地包含选自O、S和N的一个或多个杂原子并被称为“杂烷氧基”。

术语“亚烷基”自身或作为另一个取代基的一部分意指衍生自烷烃的二价基团，诸如-CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂-。

除非另外指明，否则本文所述的炔基基团优选地是在主链中含有2至8个碳原子且含有最多20个碳原子的低级炔基。它们可以是直链或支链，包括但不限于乙炔基、丙炔基、丁炔基、异丁炔基、己炔基等。

如本文单独使用或作为另一基团的一部分使用的术语“芳基”表示任选取代的同素环芳族基团，优选在环部分中含有5至20个碳、5至10个碳、或5至6个碳的单环或双环基团，包括但不限于苯基、联苯基、萘基、取代的苯基、取代的联苯基或取代的萘基。芳基部分可任选地包含选自O、S和N的一个或多个杂原子并被称为“杂芳基”或“杂双环”。此类杂芳族化合物可在环中包含1或2个氮原子、1或2个硫原子、1或2个氧原子、以及它们的组合，其中每个杂原子通过碳键合至分子的其余部分。非限制性示例性基团包括吡啶、吡嗪、嘧啶、吡唑、吡咯、咪唑、噻吩、硫代吡喃鎓(thiopyrrilium)、对噻嗪、吲哚、嘌呤、苯并咪唑、喹诺酮、吩噻嗪。非限制性示例性取代基包括以下基团中的一个或多个：烃基、取代的烃基、烷基、烷氧基、酰基、酰氧基、烯基、烯氧基、芳基、芳氧基、氨基、酰氨基、缩醛、氨基甲酰基、碳环并、氰基、酯、醚、卤素、杂环并、羟基、酮、缩酮、磷酸基、硝基以及硫代基。

如本文所用的术语“芳基烷基”是指被至少一个烷基取代的芳基部分，并且任选地进一步被取代。芳基烷基的一个实例是苯基甲基，也称为苄基(C₆H₅CH₃)或亚苄基(-C₆H₄CH₂-)。

本文所述的“被取代的”部分是被至少一个不是碳的原子取代的诸如烃基、烷基、杂芳基、双环和杂双环的部分，包括其中碳链原子被杂原子诸如氮、氧、硅、磷、硼、硫或卤素原子取代的部分。这些取代基包括但不限于卤素、杂环基、烷氧基、烯氧基、炔氧基、芳基氧基、羟基、酮基、酰基、酰氧基、硝基、叔氨基、酰氨基、硝基、氰基、硫代基、亚磺酸酯基、氨磺酰基、缩酮、缩醛、酯以及醚。

如本文单独使用或作为另一基团的一部分使用的术语“卤素”和“卤基”是指氯、溴、氟和碘。

术语“环状二酮”是指具有偶数个-C(O)-基团的环状和杂环化合物。在一些实施方案中，环状化合物为芳基(醌)。在一些实施方案中，杂环化合物为杂芳基。环状二酮的非排他性列表包括萘醌和吲哚二酮。

术语“药学上可接受的阳离子”，表示为U，是指一价阳离子。药学上可接受的一价阳离子的实例论述于Berge等人,J Pharm.Sci.,66,1-19(1977)中，其以引用方式并入本文。在一些方面，药学上可接受的阳离子是无机的，包括但不限于碱金属离子(例如，钠离子或钾离子)和氨。例如，在一些方面，部分SO_zU可以是SO₃Na、SO₃K或SO₃NH₄。

本公开的某些化合物可具有不对称碳原子(光学中心)或双键。此类化合物具有相同的分子式，但其原子键合性质或顺序或其原子空间排列不同，并且被称为“异构体”。其原子空间排列不同的异构体被称为“立体异构体”。非对映体是在一个或多个手性中心处具有相反构型的立体异构体，其不是对映体。为彼此的不可重叠的镜像的带有一个或多个不对称中心的立体异构体被称为“对映体”。当化合物具有不对称中心时，例如，如果碳原子键合至四个不同的基团，那么一对对映体是可能的。对映体可通过一个或多个其不对称中心的绝对构型表征，并且通过Cahn、Ingold和Prelog的R-和S-顺序规则描述，或以分子旋转偏振光的平面并被指定为右旋或左旋(即，分别为(+)或(-)-异构体)的方式进行描述。手性化合物可以作为单独的对映体或作为其混合物存在。含有等比例的对映体的混合物被称为“外消旋混合物”。在某些实施方案中，化合物富含至少约90重量％的单一非对映体或对映体。在其它实施方案中，化合物富含至少约95重量％、98重量％或99重量％的单一非对映体或对映体。本公开的化合物涵盖外消旋体、非对映体、几何异构体、位置异构体以及其各个异构体(例如，单独对映体)，并且所有这些均旨在涵盖在本公开的范围内。

II.前药单体、二聚体和缀合物

在一些实施方案中，药物为PBD单体或PBD二聚体。在一些实施方案中，PDB二聚体识别并结合特定DNA序列。天然产物安曲霉素(一种PBD)最初报道于1965年(Leimgruber等人,(1965)J.Am.Chem.Soc.,87:5793-5795；Leimgruber等人,(1965)J.Am.Chem.Soc.,87:5791-5793)。从那以后，已经报道了天然存在的和为类似物的多种PBD(Thurston等人,(1994)Chem.Rev.1994,433-465，包括三环PBD支架的二聚体(US 6884799；US 7049311；US7067511；US 7265105；US 7511032；US 7528126；US 7557099)。尽管无意于受任何特定理论的束缚，据信二聚体结构赋予适当的三维形状，以用于与B型DNA的小沟的同螺旋性(isohelicity)，从而导致在结合位点处的滑动配合(snug fit)(Kohn,在Antibiotics III中.Springer-Verlag,New York,第3-11页(1975)；Hurley和Needham-VanDevanter,(1986)Acc.Chem.Res.,19:230-237)。带有C2芳基取代基的二聚体PBD化合物已显示可用作细胞毒性剂(Hartley等人(2010)Cancer Res.70(17):6849-6858；Antonow(2010)J.Med.Chem.53(7):2927-2941；Howard等人(2009)Bioorganic and Med.Chem.Letters 19(22):6463-6466)。本段中引用的每篇参考文献均以引用的方式全文并入本文。

在本公开范围内的PBD单体和PBD二聚体是已知的。参见，例如，US 2010/0203007、WO 2009/016516、US 2009/304710、US 2010/047257、US 2009/036431、US 2011/0256157、WO 2011/130598)、WO 00/12507、WO 2005/085250和WO 2005/023814，其中的每一个以引用的方式全文并入本文。本公开范围内的PBD二聚体由在每个PBD单体的C8碳原子上连接的两个PBD单体形成。

A.缀合物

在一些实施方案中，PBD前药二聚体-抗体缀合物具有式(I)，其包含第一PBD前药单体M1和第二PBD-抗体单体M2：

M1为PBD单体，其中虚线代表以下各项中的两者之间的任选的双键：(i)C₁与C₂；(ii)C₂与C₃；以及(iii)C₂与R²。在一些实施方案中，C₁与C₂之间的键为单键，C₂与C₃之间的键为单键，并且C2与R²之间的键为双键。

R²选自-H、＝CH₂、-CN、-R、＝CHR、芳基、杂芳基、双环和杂双环。在一些实施方案中，R²为＝＝CH₂、

R³为氢；X选自S、O和NH；并且R¹¹选自(i)H和R，当X为O或NH时，以及(ii)H、R和O_zU，当X为S时，其中z为2或3并且U为一价的药学上可接受的阳离子。

R⁶、R⁷和R⁹独立地选自H、R、OH、OR、卤基、氨基、硝基、SH和SR。在一些实施方案中，R⁶和R⁹为H。在一些实施方案中，R⁷为OCH₃。

R¹⁰为前药部分，在本文其它地方更详细地描述，其包括(i)谷胱甘肽活化的二硫化物，(ii)DT-心肌黄酶活化的醌，或(iii)活性氧物质活化的芳基硼酸或芳基硼酸酯。

R选自具有1至10个碳原子的低级烷基基团和最多12个碳原子的芳基烷基基团，(i)其中烷基基团任选地含有一个或多个碳-碳双键或三键，或最多12个碳原子的芳基基团，并且(ii)其中R被一个或多个卤基、羟基、氨基、或硝基基团任选取代，并且任选地含有一个或多个杂原子。

M2为PBD单体，其中虚线代表以下各项中的两者之间的任选的双键：(i)C_1’与C_2’；(ii)C_2’与C_3’；以及(iii)C_2’与R^2’。在一些实施方案中，C_1’与C_2’之间的键为单键，C_2’与C_3’之间的键为单键，并且C_2’与R^2’之间的键为双键。

R^2’、R^3’、R^6’、R^7’、R^9’、R^11’和X’分别对应于R²、R³、R⁶、R⁷、R⁹、R¹¹和X，并且以与它们相同的方式定义。

L为自分解型接头，其包括二硫化物部分、肽部分和肽模拟物部分中的至少一个。在一些实施方案中，接头包括二硫化物部分或肽部分。

每个星号独立地代表外消旋或未定义的立体化学的手性中心。

M1和M2在C8位置上由部分-Q-T-Q'-键合，其中Q和Q'独立地选自O、NH和S，并且其中T为任选取代的C_1-12亚烷基基团，其进一步任选地被一个或多个杂原子和/或芳环中断。在一些实施方案中，Q和Q'为O，并且T为C₃亚烷基或C₅亚烷基。

Ab是如本文其它地方所定义的抗体。在一些实施方案中，抗体包含至少一个半胱氨酸巯基部分，其中抗体结合至选自以下各项的一种或多种肿瘤相关抗原或细胞表面受体：(1)BMPR1B(骨形态发生蛋白受体-IB型)；(2)E16(LAT1、SLC7A5)；(3)STEAP1(前列腺的六次跨膜上皮抗原)；(4)MUC16(0772P、CA125)；(5)MPF(MPF、MSLN、SMR、巨核细胞增强因子、间皮素)；(6)Napi2b(NAPI-3B、NPTIIb、SLC34A2、溶质载体家族34(磷酸钠)成员2、II型钠依赖性磷酸盐转运蛋白3b)；(7)Sema 5b(FLJ10372、KIAA1445、Mm.42015、SEMA5B、SEMAG、信号素(Semaphorin)5b Hlog、sema结构域、7个血小板反应蛋白重复的序列(1型和1型样)、跨膜结构域(TM)和短细胞质结构域(信号素)5B)；(8)PSCA hlg(2700050C12Rik、C530008O16Rik、RIKEN cDNA 2700050C12、RIKEN cDNA 2700050C12基因)；(9)ETBR(内皮素B型受体)；(10)MSG783(RNF124、假设蛋白FLJ20315)；(11)STEAP2(HGNC_8639、IPCA-1、PCANAP1、STAMP1、STEAP2、STMP、前列腺癌相关基因1、前列腺癌相关蛋白1、前列腺的六跨膜上皮抗原2、六跨膜前列腺蛋白)；(12)TrpM4(BR22450、FLJ20041、TRPM4、TRPM4B、瞬时受体电位阳离子通道、亚家族M成员4)；(13)CRIPTO(CR、CR1、CRGF、CRIPTO、TDGF1、畸胎瘤衍生生长因子)；(14)CD21(CR2(补体受体2)或C3DR(C3d/EB病毒(Epstein Barr virus)受体)或Hs73792)；(15)CD79b(CD79B、CD79β、IGb(免疫球蛋白相关β)、B29)；(16)FcRH2(IFGP4、IRTA4、SPAP1A(含有SH2结构域的磷酸酶锚定蛋白1a)、SPAP1B、SPAP1C)；(17)HER2；(18)NCA；(19)MDP；(20)IL20Rα；(21)短蛋白聚糖(Brevican)；(22)EphB2R；(23)ASLG659；(24)PSCA；(25)GEDA；(26)BAFF-R(B细胞活化因子受体、BLyS受体3、BR3)；(27)CD22(B细胞受体CD22-B同种型)；(28)CD79a(CD79A、CD79α、免疫球蛋白相关α)；(29)CXCR5(伯基特淋巴瘤受体1)；(30)HLA-DOB(MHC II类分子的β亚基(Ia抗原))；(31)P2X5(嘌呤能受体P2X配体门控离子通道5)；(32)CD72(B细胞分化抗原CD72、Lyb-2)；(33)LY64(淋巴细胞抗原64(RP105)、富含亮氨酸重复序列(LRR)家族的I型膜蛋白)；(34)FcRH1(Fc受体样蛋白1)；(35)FcRH5(IRTA2、免疫球蛋白超家族受体易位相关2)；(36)TENB2(推定的跨膜蛋白聚糖)；(37)PMEL17(银同系物；SILV；D12S53E；PMEL17；SI；SIL)；(38)TMEFF1(具有EGF样和两个卵泡抑素样结构域1的跨膜蛋白；Tomoregulin-1)；(39)GDNF-Ra1(GDNF家族受体α1；GFRA1；GDNFR；GDNFRA；RETL1；TRNR1；RET1L；GDNFR-α1；GFR-α-1)；(40)Ly6E(淋巴细胞抗原6复合物，基因座E；Ly67、RIG-E、SCA-2、TSA-1)；(41)TMEM46(shisa同系物2(非洲蟾蜍(Xenopus laevis))；SHISA2)；(42)Ly6G6D(淋巴细胞抗原6复合物，基因座G6D；Ly6-D、MEGT1)；(43)LGR5(含富亮氨酸重复序列的G蛋白偶联受体5；GPR49、GPR67)；(44)RET(ret原癌基因；MEN2A；HSCR1；MEN2B；MTC1；PTC；CDHF12；Hs.168114；RET51；RET-ELE1)；(45)LY6K(淋巴细胞抗原6复合物，基因座K；LY6K；HSJ001348；FLJ35226)；(46)GPR19(G蛋白偶联受体19；Mm.4787)；(47)GPR54(KISS1受体；KISS1R；GPR54；HOT7T175；AXOR12)；(48)ASPHD1(含有天冬氨酸β-羟化酶结构域的1；LOC253982)；(49)酪氨酸酶(TYR；OCAIA；OCA1A；酪氨酸酶；SHEP3)；(50)TMEM118(无名指蛋白，跨膜2；RNFT2；FLJ14627)；(51)GPR172A(G蛋白偶联受体172A；GPCR41；FLJ11856；D15Ertd747e)；(52)CD33；以及(53)CLL-1。在一些实施方案中，将抗体工程改造以用于缀合。在一些实施方案中，抗体是半胱氨酸工程改造的抗体，其包含LC K149C、HC A118C、HCA140C或LC V205C作为接头缀合的位点。在一些实施方案中，抗体或半胱氨酸工程改造的抗体选自抗HER2、抗CD22、抗CD33、抗Napi2b、抗Ly6E以及抗CLL-1。

整数p为1、2、3、4、5、6、7或8。在一些实施方案中，p为1、2、3或4。在一些实施方案中，提供了一种包含PBD前药二聚体-抗体缀合物的混合物的组合物，其中缀合化合物的混合物中每个抗体的平均药物负载为约2至约5。

在一些实施方案中，R⁷和R^7’为-OCH₃；R³、R^3’、R⁶、R^6’、R⁹和R^9’均为H；并且R²和R^2’为＝CH₂、

在一些实施方案中，M1的C₁与C₂之间的键为单键；M1的C₂与C₃之间的键为单键；M2的C_1’与C_2’之间的键为单键；M2的C_2’与C_3’之间的键为单键；M1的C₃被两个R³基团取代，所述R³基团中的每一个为H；M2的C_3’被两个R^3’基团取代，所述R^3’基团中的每一个为H；M1的C₂与R²之间的键为双键；并且M2的C_2’与R^2’之间的键为双键。

在一些实施方案中，PBD前药二聚体-抗体缀合化合物具有式(Ia)：

其中R¹⁰、L、p和Ab如本文其它地方所定义。

B.单体

在一些实施方案中，PBD单体化合物具有式(II)：

其中R²、R³、R⁶、R⁷、R⁸、R⁹、R¹⁰、R¹¹、X、*以及吡咯烷环A中的键合方案如本文其它地方结合PBD二聚体所描述。

在一些实施方案中，PBD单体化合物具有式(IIa)：

其中R¹⁰如本文其它地方所定义。

C.二聚体

在一些实施方案中，PBD前药二聚体化合物具有式(VIII)，其包含第一PBD前药单体M1和第二PBD单体M2：

其中R²、R^2’、R³、R^3’、R⁶、R^6’、R⁷、R^7’、R⁹、R^9’、R¹⁰、R¹¹、R^11’、X、X'、Q、Q'、T、*以及吡咯烷环A和B中的键合方案如本文其它地方结合PBD二聚体所描述。

在一些实施方案中，R¹²不存在并且N10'与C_11’之间的键为双键。在一些实施方案中，R¹²选自-C(O)O-L和-C(O)O-R¹⁰，其中R¹⁰为如本文其它地方所述的前药部分。L如本文其它地方所定义。

在一些实施方案中，PBD前药二聚体化合物具有式(VIIIa)：

其中R¹⁰如本文其它地方所定义。

在一些实施方案中，PBD前药二聚体化合物具有式(VIIb)：

其中R¹⁰和L如本文其它地方所定义。

III.前药保护基团-触发物

在本公开范围内的包含触发物的前药保护基团包括二硫化物、环状二酮、芳基硼酸以及芳基硼酸酯。包含触发物的前药保护基团通过氨基甲酸酯部分在N10位置处缀合至PBD。通过施加刺激，诸如酶(例如，DTD)、ROS或GSH，将保护基团酶促或化学切割以生成活性药物。

A.二硫化物保护基团-触发物

本公开的二硫化物保护基团-触发物R¹⁰部分具有通式(V)：

其中波浪线指示与PBD N10位置的连接点(即，)。

R⁵⁰选自任选取代的C_1-8烷基或C_2-6烷基、任选取代的C_1-8或C_2-6杂烷基、包含2至6个碳原子的任选取代的环烷基、以及包含2至6个碳原子的任选取代的杂环烷基。在一些特定实施方案中，R⁵⁰选自-CH₂-CH₃、-CH(CH₃)₂、-C(CH₃)₃、-CH₂-CH₂OH、-CH₂-CH₂-C(O)OH、-CH₂-CH₂-O-CH₃、以及3至6元环烷基或杂环烷基。在一些实施方案中，环烷基和杂环烷基R⁵⁰部分选自：

在一些实施方案中，R⁵⁰选自CH₃CH₂-、(CH₃)₂CH-和(CH₃)₃C-。

R⁵¹为任选取代的C₂亚烷基或任选取代的亚苄基。在一些这样的实施方案中，R⁵¹具有式：

在一些实施方案中，R⁶¹和R⁶²独立地选自H和任选取代的C_1-6烷基、以及任选取代的C_1-6杂烷基。在一些特定实施方案中，R⁶¹和R⁶²独立地选自H和任选取代的C_1-4烷基、以及任选取代的C_1-4醚或叔胺。在一些其它特定实施方案中，R⁶¹和R⁶²中的一个为H。在其它特定实施方案中，R⁶¹和R⁶²中的一个为H并且R⁶¹和R⁶²中的另一个为-CH₃、C_1-4醚或C叔胺。在一些其它特定实施方案中，R⁶¹和R⁶²各自为H，或R⁶¹和R⁶²各自为CH₃。

在一些实施方案中，R⁶¹和R⁶²与它们键合的碳原子一起形成任选取代的环烷基、任选取代的杂环烷基、任选取代的芳基或任选取代的杂芳基部分，每个环取代包含2至6个碳原子。

在一些实施方案中，R⁶³和R⁶⁴独立地选自H和CH₃。在一些其它特定实施方案中，R⁶³和R⁶⁴为H。

示例性R⁵¹部分的非限制性列表如下：

在一些另选的实施方案中，R⁵¹为芳基烷基。在一个这样的实施方案中，R⁵¹为：

示例性二硫化物保护基团-触发物部分的非限制性列表如下：

根据本公开并且基于迄今为止的体外实验证据，已经发现本公开的二硫化物保护基团-触发物在增殖细胞(诸如癌细胞)中被胞内切割，从而表达升高的GSH，并且在表达正常GSH水平的非增殖细胞以及全血/血浆中通常是稳定的。更具体地，已知GSH的血液浓度非常低，诸如在微摩尔范围内，而胞内GSH浓度通常大最多三个数量级，诸如在毫摩尔范围内。还据信，由于还原酶的活性增加，癌细胞中的GSH浓度甚至更高。

还已发现，增殖细胞与非增殖细胞之间的胞内还原电位(以mV表示)之间的差异可用于在增殖细胞中实现二硫化物触发物激活和药物释放，同时在非增殖细胞、全血和血浆中提供前药稳定性。更具体地，据信GSH/GSSG氧化还原对中还原GSH与氧化GSH(也称为GSH二硫化物或“GSSG”)的比率与还原电位(通常以mV表示)相关。还据信某些GSH/GSSG比率是增殖细胞的特征。还原电位的负性随着GSH/GSSG的比率的增大(即，随着GSH的相对浓度增大)而增大。典型的GSH/GSSG还原电位呈现于下表：

	细胞质还原电位(mV)
		血液/血浆	-140
增殖细胞	-260至-230
		生长停滞细胞	-220至-190
凋亡细胞	-170至-150

半胱氨酸(Cys)和二硫半胱氨酸(CySS)氧化还原对的还原电位还可实现药物从二硫化物前药中的胞内释放，其中血液/血浆Cys/CySS还原电位通常为-80mV至0mV并且细胞质中的Cys/CySS还原电位通常为约-160mV。

B.环状二酮保护基团-触发物

在一些实施方案中，R¹⁰环状二酮保护基团-触发物是具有以下通式的1,4-或1,2-醌：

A、D、E、G和J独立地选自C和N，其中N为仲胺、叔胺或亚胺(＝N-)。每个m独立地选自0和1。虚线代表E-D或D-A之间的任选的双键。当存在时，R^A、R^D、R^E、R^G和R^J独立地选自H、OH、任选取代的C_1-4烷基或杂烷基、C_1-4烷氧基或杂烷氧基、以及卤素，条件是R^A、R^D、R^E、R^G和R^J中的至少一个是与PBD N10位置处的氨基甲酸酯部分的氧原子共价键合的C_1-4任选取代的烷基或杂烷基接头。在一些实施方案中，R^A、R^D和R^E中的一个为C_1-4任选取代的烷基或杂烷基接头。在一些其它实施方案中，A-(R^A)_m、D-(R^D)_m和E-(R^E)_m中的一个为在一些其它实施方案中，A-(R^A)_m为D为C并且R^D为C₁接头，E-(R^E)_m为其中D与E之间的键为双键。在其它实施方案中，G和J为C(碳)。在其它实施方案中，G和J为C，并且R^G和R^J中的一个为-O-CH₃。在一些实施方案中，环状二酮为1,4-环状二酮。

在一些实施方案中，环状二酮前药部分是选自以下各项的醌：

其中羟基部分提供与PBD的连接点。

在一些特定实施方案中，环状二酮是具有下式中的一个的吲哚二酮：

其中波浪线指示与PBD N10位置处的氧原子的连接点(即，)。

在一些实施方案中，R¹⁰环状二酮保护基团-触发物是具有下式的1,4-或1,2-环状二酮：

A、D、E、F、G和J独立地选自C和N，其中A、D、E和F中的至少一个为C并且G和J中的至少一个为C，并且其中N为仲胺、叔胺或亚胺(＝N-)。每个n独立地选自0和1。虚线代表任选的双键。当存在时，R^A、R^D、R^E、R^F、R^G和R^J独立地选自H、OH以及任选取代的C_1-4烷基或杂烷基、C_1-4烷氧基或杂烷氧基、以及卤素，条件是R^A、R^D、R^E、R^F、R^G和R^J中的至少一个存在并且是与PBDN10位置处的氨基甲酸酯部分的氧原子共价键合的C_1-4任选取代的烷基或杂烷基接头。在一些实施方案中，R^A、R^D、R^E和R^F中的一个为C_1-4任选取代的烷基或杂烷基接头。在一些实施方案中，D-R^D或E-R^E为具有键合至C_1-4任选取代的烷基或杂烷基接头的碳原子的部分，并且A、F以及D和E中的另一个中的至少一个为N。在一些实施方案中，R^A、R^E和R^F中的一个独立地选自H、任选取代的C_1-4烷基或杂烷基以及任选取代的C_1-4烷氧基或杂烷氧基，并且其中D为C并且R^D为C₁接头。在一些其它实施方案中，G-(R^G)_n和J-(R^J)_n中的至少一个为在一些其它实施方案中，G-R^G和J-R^J中的一个为C-O-CH₃，G-R^G和J-R^J中的另一个为CH，其中G与J之间的键为双键。在一些其它实施方案中，由A、D、E和F形成的环是不饱和的或部分饱和的。在其它实施方案中，由A、B、D和E形成的环是不饱和的或部分饱和的。

具有环状二酮保护基团-触发物的前药可以用DTD双电子还原酶活化，该酶被认为在许多人肿瘤和血管的内皮细胞中过表达。DTD为NAD(P)H:醌氧化还原酶I型(NQO1)酶(EC1.6.99.2)，其使用NADH或NADPH作为辅因子催化醌的直接双电子转移(参见，例如，Mendoza等人,“Human NAD(P)H:quinone oxidoreductase type I(HNQO1)activation of quinonepropionic acid trigger groups”,Biochemistry,2012年10月9日；51(40):8014-8026，以引用方式并入本文)。据信DTD在有氧和缺氧条件下都是前药活化剂。

已知人乳腺癌和肺癌表达高DTD水平。例如，以nRPKM计的NQO1表达(其中nRPKM是指每百万绘制读段的每Kb转录物长度的标准化读段)为大约30至2000，相比于通常具有在约0.5至约20范围内的nRPKM值的血液和淋巴癌。如下表所公开，相对于正常组织，DTD在许多癌症中过表达(参见S.Danson等人,“DT-diaphorase:atarget for new anticancerdrugs”,Cancer Treatment Reviews(2004)30,437-449)，其中“NS”是指不显著的：

细胞	与正常组织的DTD比率
		人结肠癌原发性	2.5至3.9
人结肠癌转移性	47
		人乳腺癌	NS至9.5
人NSCLC	8.2至19.2
		人肝癌	3.8至50

不受任何特定理论的束缚，据信胞内前药释放机制通常根据以下机制进行，如通过一种醌物质所代表的，其中前药醌触发物活化和药物释放由DTD双电子还原介导：

C.芳基硼酸和芳基硼酸酯保护基团-触发物

本公开的芳基硼酸和芳基硼酸酯保护基团-触发物R¹⁰部分具有通式(IVa)：

其中波浪线指示与PBD N10位置处的氧原子的连接点(即，-O-C(O)-N₁₀<PBD)。R²⁰和R²¹独立地选自H、任选取代的烷基或杂烷基、任选取代的环烷基或杂环烷基、以及任选取代的芳基或杂芳基。另选地，R²⁰和R²¹一起是任选取代的部分-(CH₂)_n-，其中n为2或3，所述部分与它们所连接的O原子连同B原子一起形成杂环烷基环。杂环烷基环可任选地包括稠合杂烷基环、稠合芳基环或稠合杂芳基环。波浪线指示与PBD N10位置的连接点。

在一些实施方案中，芳基硼酸和芳基硼酸酯触发物具有下式：

R³⁰、R³¹、R³²、R³³、R⁴⁰、R⁴¹、R⁴²、R⁴³、R⁴⁴和R⁴⁵独立地选自H、卤素、-CN、-OH、-NH₂、-COOH、-CONH₂、-NO₂、-SH、-SO₂Cl、-SO₃H、-SO₄H、-SO₂NH₂、-NHNH₂、-ONH₂、-NHC＝(O)NHNH₂、任选取代的C_1-8烷基或杂烷基、包含2至7个碳原子的任选取代的环烷基或杂环烷基、任选取代的芳基或杂芳基。在一些实施方案中，(i)R³⁰或R³¹中的一个和R³²或R³³中的一个，(ii)R⁴⁰或R⁴¹中的一个和R⁴²或R⁴³中的一个，和/或(iii)R⁴²或R⁴³中的一个和R⁴⁴或R⁴⁵中的一个形成具有2至7个碳原子的任选取代的稠合环烷基环、稠合杂环烷基环、稠合芳基环或稠合杂芳基环。波浪线指示与PBD N10位置的连接点。

示例性芳基硼酸和芳基硼酸酯保护基团-触发物的非限制性列表如下：

在一个实施方案中，保护基团-触发物为芳基硼酸，即，其中R²⁰和R²¹为H。

具有芳基硼酸或芳基硼酸酯保护基团-触发物的前药可以用ROS(诸如H₂O₂)活化。(参见，例如，Kuang,Y.等人,“Hydrogen Peroxide Inducible DNA Cross-LinkingAgents:Targeted Anticancer Prodrugs”,J.Am.Chem.Soc.(2011),133(48),19278-19281；Peng,X.等人,“ROS-activated anticancer prodrugs:a new strategy fortumor-specific damage”,Ther Deliv.(2012),3(7),823-833；以及Chen,W.等人,“Reactive Oxygen Species(ROS)Inducible DNA Cross-Linking Agents and TheirEffect on Cancer Cells and Normal Lymphocytes”,J.Med.Chem.(2014),57,4498-4510，其中的每一个以引用方式全文并入本文。)

癌细胞被认为相比于正常的非癌性细胞表现出增大的氧化应激反应，并且被认为具有增大的ROS(诸如H₂O₂)细胞浓度，其中H₂O₂浓度可在癌细胞中升高10倍，诸如最高至0.5nmol/10⁴个细胞/h。(参见，例如，Peng；Chen；Zieba,M.等人,“Comparison of hydrogenperoxide generation and the content of lipid peroxidation products in lungcancer tissue and pulmonary parenchyma”,Respiratory Medicine(2000),94,800-805；Szatrowski,T.等人,“Production of Large Amounts of Hydrogen Peroxide inHuman Tumor Cells”,Cancer Research(1991),51,794-798，其中的每一个以引用方式并入本文。)据信，癌细胞中的高ROS浓度和伴随的ROS信号传导通过DNA突变、转移、血管生成和对治疗剂的敏感性降低而成为肿瘤形成、发展、增殖和存活的主要因素(参见，例如，Peng)。

不受任何特定理论的束缚，据信ROS活化的胞内前药释放机制根据以下机制进行：

IV.接头

本公开的接头是能够将抗体和药物(“D”)共价连接在一起成为三重分子(tripartite molecule)的双官能化学部分。在本公开范围内的接头没有严格限制并且具有通式结构：

Ab-[Ab连接部]-[Ab间隔基]_任选-[触发物]_任选-[D间隔基]_任选-[D连接部]-D并且包括Ab连接部、任选的Ab间隔基单元、任选的自分解型(触发物)单元、和任选的药物间隔基、以及药物连接部。

在一些实施方案中，接头包括自分解型部分(触发物)。在本公开范围内的自分解型部分的非限制性实例包括肽、肽模拟物以及二硫化物。

在一些实施方案中，接头包括自分解型肽单元，其允许接头的酶促切割，诸如通过蛋白酶，从而在暴露于胞内蛋白酶(诸如溶酶体酶)时促进药物从免疫缀合物中释放(Doronina等人(2003)Nat.Biotechnol.21:778-784)。示例性肽单元包括但不限于二肽、三肽、四肽和五肽。示例性二肽包括但不限于缬氨酸-瓜氨酸(vc或val-cit)、缬氨酸-丙氨酸(va或val-ala)、丙氨酸-苯丙氨酸(af或ala-phe)；苯丙氨酸-赖氨酸(fk或phe-lys)；苯丙氨酸-高赖氨酸(phe-homolys)；以及N-甲基-缬氨酸-瓜氨酸(Me-val-cit)。示例性三肽包括但不限于甘氨酸-缬氨酸-瓜氨酸(gly-val-cit)和甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸(gly-gly-gly)。肽单元可包含天然存在的氨基酸残基和/或次要氨基酸和/或非天然存在的氨基酸类似物，诸如瓜氨酸。可以设计和优化肽单元以用于通过特定酶进行酶促切割，所述酶例如肿瘤相关蛋白酶、组织蛋白酶B、C和D、或纤溶酶蛋白酶。

在一些实施方案中，接头包括允许接头的被切割的自分解型肽模拟物单元。示例性肽模拟物单元包括但不限于三唑、环丁烷-1-1-二甲醛、环丁烷-1-1-二甲醛-瓜氨酸、烯烃、卤代烯烃以及异噁唑。一些肽模拟物单元实例包括以下，其中肽模拟物单元左侧的波浪线是与间隔基或抗体连接部分的连接点，并且肽模拟物单元右侧的波浪线是与间隔基或药物连接部分的连接点：

在本公开范围内的一些Ab-[肽模拟物接头单元]-药物基团的实例如下，其中“AA”是指氨基酸，其中AA1和AA2可以是相同的、或不同的、天然存在的或非天然存在的氨基酸：

在一些实施方案中，接头包括允许接头被切割的自分解型二硫化物单元。二硫化物接头通常具有下式：

其中：S_C为抗体半胱氨酸硫原子；R⁷⁰和R⁷¹独立地选自H和C_1-3烷基，其中R⁷⁰和R⁷¹中只有一个可以是H，或R⁷⁰和R⁷¹与它们所键合的碳原子一起形成任选包含氧杂原子的四至六元环；并且，波浪线指示与PBD N10位置处的氨基甲酸酯部分的氧原子的连接点。在一些其它实施方案中，R⁷⁰和R⁷¹独立地选自H、-CH₃和-CH₂CH₃，其中R⁷⁰和R⁷¹中只有一个可以是H，或R⁷⁰和R⁷¹与它们所键合的碳原子一起形成选自环丁基、环戊基、环己基、四氢呋喃和四氢吡喃的环。

在一些实施方案中，接头可包括间隔基单元。在一些实施方案中，间隔基单元为对氨基苄氧羰基(PAB)。在一些这样的实施方案中，对氨基苄醇间隔基单元通过酰胺键连接至氨基酸单元，并且在苄醇与药物之间形成氨基甲酸酯、甲基氨基甲酸酯或碳酸酯连接部(Hamann等人(2005)Expert Opin.Ther.Patents(2005)15:1087-1103)。在其它实施方案中，接头-抗体部分如下连接至PBD N10位置处的氨基甲酸酯部分的氧原子：

在一些其它实施方案中，间隔基包括但不限于与PAB基团电子相似的芳族化合物，诸如2-氨基咪唑-5-甲醇衍生物(美国专利号7,375,078；Hay等人(1999)Bioorg.Med.Chem.Lett.9:2237)以及邻或对氨基苄基缩醛。

在一些实施方案中，可以使用在酰胺键水解时发生环化的间隔基，诸如取代和未取代的4-氨基丁酸酰胺(Rodrigues等人(1995)Chemistry Biology 2:223)、适当取代的双环[2.2.1]和双环[2.2.2]环系(Storm等人(1972)J.Amer.Chem.Soc.94:5815)以及2-氨基苯基丙酸酰胺(Amsberry等人(1990)J.Org.Chem.55:5867)。药物与甘氨酸残基的α-碳的连接键是可能有用的间隔基的另一个实例(Kingsbury等人(1984)J.Med.Chem.27:1447)。在一些方面，间隔基单元是自分解型的。

接头包括适合与抗体共价缀合的反应基团。在一些实施方案中，抗体包括至少一个反应性巯基部分，并且接头包括反应性硫原子、马来酰亚胺、溴乙酰胺和碘乙酰胺、或烯烃，其中抗体通过共价键与接头缀合，所述共价键是根据本领域技术人员已知的方法通过抗体反应性巯基与接头反应性硫原子、马来酰亚胺、溴乙酰胺、碘乙酰胺或烯烃的反应形成的。

用于将具有反应性巯基部分的抗体与药物-接头部分缀合的方案的非限制性实例如下所示：

一些特定的药物-[L]缀合物的实例如下，其中x为1至8并且其中[缀合]是指如本文其它地方所述的反应性基团：

在包括自分解型二硫化物的实施方案中，可以根据申请号PCT/CN2015/092084中所述的方法完成与Ab的缀合，所述申请以引用的方式全文并入本文。一般来说，使具有下式的活化的离去基团-二硫化物-药物化合物：

与具有至少一个巯基部分的抗体接触，离去基团(X_L)被替代，并且硫原子与巯基硫原子共价键合形成二硫化物。在上式中：X_L为硫醇离去基团；离去基团和接头通过二硫键键合；R⁷⁰和R⁷¹如本文其它地方所定义；并且，Sp为如本文其它地方所述的任选的间隔基，其中n为0或1。接头可以被认为是受阻接头，因为R⁷⁰和R⁷¹中只有一个可以是H。

在一些实施方案中，离去基团可以合适地选自以下：

在这样的实施方案中，波浪线指示离去基团与受阻接头S原子的连接点，从而形成二硫键。X¹、X²、X³、X⁴和X⁵独立地为C、N、S或O，条件是X¹至X⁵中的至少一个为N，虚线代表任选的双键，并且A表示六元环。Y¹、Y²、Y³和Y⁴独立地为C、N、S或O，条件是Y¹至Y⁴中的至少一个为N，虚线代表任选的双键，并且B表示五元环。Z¹、Z²、Z³、Z⁴、Z⁵和Z⁶独立地为C、N、S或O，条件是Z¹和Z²中的至少一个为N，虚线代表任选的双键，C表示六元环，并且D表示稠合五元环。每个R³独立地选自-NO₂、-NH₂、-C(O)OH、R⁵S(O)(O)-、-C(O)N(R⁵)(R⁵)、-Cl、-F、-CN和-Br。每个R⁵独立地选自H、任选取代的C_1-6烃基、任选取代的C_5-6碳环、以及任选取代的C_5-6杂环，并且q为1、2或3。离去基团1、离去基团2、离去基团3和/或离去基团4的环结构中的每个碳原子被R⁵任选取代。离去基团1、离去基团2、离去基团3和/或离去基团4的环结构中的每个氮原子被R⁵任选取代，以形成叔胺或季胺。

在一些特定的此类实施方案中，X¹、X²、X³、X⁴和X⁵独立地为C或N，X¹至X⁵中不超过两个为N，并且环A是不饱和的。在其它特定实施方案中，Y¹、Y²Y³和Y⁴独立地为C或N，并且B环是不饱和的。在其它特定实施方案中，Z¹为N，Z²选自N、S和O，Z³至Z⁶选自C和N，Z³至Z⁶中不超过两个为N，并且环C是不饱和的。在其它特定实施方案中，每个R³独立地选自-NO₂、-NH₂、-C(O)OH、H₃CS(O)(O)-和-C(O)N(CH₃)₂。

在一些实施方案中，离去基团为其中波浪线指示离去基团与受阻接头S原子的连接点，从而形成二硫键。在一些特定实施方案中，C_1-4烷基为甲基。

本公开的离去基团的一些实例在下文例示：

受阻二硫化物接头的实例如下，其中硫原子处的波浪线是指与本文其它地方所定义的离去基团的连接点，并且其中羰基部分处的波浪线是指与PBD N10原子的连接点：

V.抗体

本公开的抗体是结合一种或多种肿瘤相关抗原或细胞表面受体的任何细胞靶向的生物化合物，抗体包含适于与接头缀合的至少一个反应性半胱氨酸巯基部分。

某些类型的细胞，诸如癌细胞，表达与周围组织相比独特的表面分子(抗原)。与这些表面分子结合的细胞靶向部分能够将本文其它地方描述的药物特异性地靶向递送至靶细胞。例如且非限制性地，细胞靶向部分可与肺、乳腺、脑、前列腺、脾、胰腺、宫颈、卵巢、头颈、食道、肝、皮肤、肾、白血病、骨、睾丸、结肠或膀胱细胞结合并被内化。

A.肿瘤相关抗原

在本公开的一些特定实施方案中，靶细胞是表达肿瘤相关抗原(TAA)或包含细胞表面受体的癌细胞。肿瘤相关抗原是本领域已知的，并且可以使用本领域熟知的方法和信息制备以用于生成抗体。为了发现用于癌症诊断和治疗的有效细胞靶标，研究人员已寻求鉴定与一种或多种更正常的非癌性细胞上相比在一种或多种特定类型的癌细胞的表面上特异性地表达的跨膜或其它肿瘤相关多肽。通常，与非癌性细胞的表面相比，此类肿瘤相关多肽在癌细胞的表面上更丰富地表达。此类肿瘤相关细胞表面抗原多肽的鉴定已经产生了通过基于抗体的疗法特异性地靶向癌细胞以进行破坏的能力。

肿瘤相关抗原TAA的实例包括但不限于本文列出的TAA(1)-(53)。为方便起见，本文列出了与这些抗原(所有这些都是本领域已知的)相关的信息，并且包括名称、别名、Genbank登录号以及一个或多个主要参考文献，这些遵循美国国家生物技术信息中心(NCBI)的核酸和蛋白质序列鉴定惯例。与TAA(1)-(53)相对应的核酸和蛋白质序列可在公共数据库诸如GenBank中获得。由抗体靶向的肿瘤相关抗原包括相对于所引用的参考文献中鉴定的序列具有至少约70％、80％、85％、90％或95％序列同一性，或表现出与具有所引用的参考文献中发现的序列的TAA基本上相同的生物学特性或特征的所有氨基酸序列变体和同种型。例如，具有变体序列的TAA通常能够特异性地结合与具有所列出的对应序列的TAA特异性地结合的抗体。本文具体引用的参考文献中的序列和公开内容明确地以引用方式并入。

(1)BMPR1B(骨形态发生蛋白受体-IB型，Genbank登录号NM_001203)ten Dijke,P.等人Science 264(5155):101-104(1994),Oncogene 14(11):1377-1382(1997))；WO2004063362(权利要求2)；WO2003042661(权利要求12)；US2003134790-A1(第38-39页)；WO2002102235(权利要求13；第296页)；WO2003055443(第91-92页)；WO200299122(实施例2；第528-530页)；WO2003029421(权利要求6)；WO2003024392(权利要求2；图112)；WO200298358(权利要求1；第183页)；WO200254940(第100-101页)；WO200259377(第349-350页)；WO200230268(权利要求27；第376页)；WO200148204(实施例；图4)NP_001194骨形态发生蛋白受体，IB型/pid＝NP_001194.1-交叉参考：MIM：603248；NP_001194.1；AY065994。

(2)E16(LAT1、SLC7A5，Genbank登录号NM_003486)Biochem.Biophys.Res.Commun.255(2),283-288(1999),Nature 395(6699):288-291(1998),Gaugitsch,H.W.等人(1992)J.Biol.Chem.267(16):11267-11273)；WO2004048938(实施例2)；WO2004032842(实施例IV)；WO2003042661(权利要求12)；WO2003016475(权利要求1)；WO200278524(实施例2)；WO200299074(权利要求19；第127-129页)；WO200286443(权利要求27；第222、393页)；WO2003003906(权利要求10；第293页)；WO200264798(权利要求33；第93-95页)；WO200014228(权利要求5；第133-136页)；US2003224454(图3)；WO2003025138(权利要求12；第150页)；NP_003477溶质载体家族7(阳离子氨基酸转运蛋白，y+系统)，成员5/pid＝NP_003477.3-智人(Homo sapiens)交叉参考：MIM：600182；NP_003477.3；NM_015923；NM_003486_1。

(3)STEAP1(前列腺的六次跨膜上皮抗原，Genbank登录号NM_012449)CancerRes.61(15),5857-5860(2001),Hubert,R.S.等人(1999)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.96(25):14523-14528)；WO2004065577(权利要求6)；WO2004027049(图1L)；EP1394274(实施例11)；WO2004016225(权利要求2)；WO2003042661(权利要求12)；US2003157089(实施例5)；US2003185830(实施例5)；US2003064397(图2)；WO200289747(实施例5；第618-619页)；WO2003022995(实施例9；图13A，实施例53；第173页，实施例2；图2A)；NP_036581前列腺的六次跨膜上皮抗原交叉参考：MIM：604415；NP_036581.1；NM_012449_1。

(4)0772P(CA125、MUC16，Genbank登录号AF361486)J.Biol.Chem.276(29):27371-27375(2001))；WO2004045553(权利要求14)；WO200292836(权利要求6；图12)；WO200283866(权利要求15；第116-121页)；US2003124140(实施例16)；US 798959。交叉参考：GI：34501467；AAK74120.3；AF361486_1。

(5)MPF(MPF、MSLN、SMR、巨核细胞增强因子、间皮素，Genbank登录号NM_005823)Yamaguchi,N.等人Biol.Chem.269(2),805-808(1994),Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.96(20):11531-11536(1999),Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.93(1):136-140(1996),J.Biol.Chem.270(37):21984-21990(1995))；WO2003101283(权利要求14)；(WO2002102235(权利要求13；第287-288页)；WO2002101075(权利要求4；第308-309页)；WO200271928(第320-321页)；WO9410312(第52-57页)；交叉参考：MIM：601051；NP_005814.2；NM_005823_1。

(6)Napi3b(NAPI-3B、NPTIIb、SLC34A2、溶质载体家族34(磷酸钠)成员2、II型钠依赖性磷酸盐转运蛋白3b，Genbank登录号NM_006424)J.Biol.Chem.277(22):19665-19672(2002),Genomics 62(2):281-284(1999),Feild,J.A.等人(1999)Biochem.Biophys.Res.Commun.258(3):578-582)；WO2004022778(权利要求2)；EP1394274(实施例11)；WO2002102235(权利要求13；第326页)；EP875569(权利要求1；第17-19页)；WO200157188(权利要求20；第329页)；WO2004032842(实施例IV)；WO200175177(权利要求24；第139-140页)；交叉参考：MIM：604217；NP_006415.1；NM_006424_1。

(7)Sema 5b(FLJ10372、KIAA1445、Mm.42015、SEMA5B、SEMAG、信号素5b Hlog、sema结构域、7个血小板反应蛋白重复序列(1型和1型样)、跨膜结构域(TM)和短细胞质结构域(信号素)5B，Genbank登录号AB040878)Nagase T.等人(2000)DNA Res.7(2):143-150)；WO2004000997(权利要求1)；WO2003003984(权利要求1)；WO200206339(权利要求1；第50页)；WO200188133(权利要求1；第41-43、48-58页)；WO2003054152(权利要求20)；WO2003101400(权利要求11)；登录号：Q9P283；EMBL；AB040878；BAA95969.1。Genew；HGNC：10737。

(8)PSCA hlg(2700050C12Rik、C530008O16Rik、RIKEN cDNA2700050C12、RIKENcDNA 2700050C12基因，Genbank登录号AY358628)；Ross等人(2002)Cancer Res.62:2546-2553；US2003129192(权利要求2)；US2004044180(权利要求12)；US2004044179(权利要求11)；US2003096961(权利要求11)；US2003232056(实施例5)；WO2003105758(权利要求12)；US2003206918(实施例5)；EP1347046(权利要求1)；WO2003025148(权利要求20)；交叉参考：GI：37182378；AAQ88991.1；AY358628_1。

(9)ETBR(内皮素B型受体，Genbank登录号AY275463)；Nakamuta M.等人Biochem.Biophys.Res.Commun.177,34-39,1991；Ogawa Y.等人Biochem.Biophys.Res.Commun.178,248-255,1991；Arai H.等人Jpn.Circ.J.56,1303-1307,1992；Arai H.等人J.Biol.Chem.268,3463-3470,1993；Sakamoto A.、Yanagisawa M.等人Biochem.Biophys.Res.Commun.178,656-663,1991；Elshourbagy N.A.等人J.Biol.Chem.268,3873-3879,1993；Haendler B.等人J.Cardiovasc.Pharmacol.20,s1-S4,1992；Tsutsumi M.等人Gene 228,43-49,1999；Strausberg R.L.等人Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.99,16899-16903,2002；Bourgeois C.等人J.Clin.Endocrinol.Metab.82,3116-3123,1997；Okamoto Y.等人Biol.Chem.272,21589-21596,1997；Verheij J.B.等人Am.J.Med.Genet.108,223-225,2002；Hofstra R.M.W.等人Eur.J.Hum.Genet.5,180-185,1997；Puffenberger E.G.等人Cell 79,1257-1266,1994；Attie T.等人,Hum.Mol.Genet.4,2407-2409,1995；Auricchio A.等人Hum.Mol.Genet.5:351-354,1996；Amiel J.等人Hum.Mol.Genet.5,355-357,1996；Hofstra R.M.W.等人Nat.Genet.12,445-447,1996；Svensson P.J.等人Hum.Genet.103,145-148,1998；FuchsS.等人Mol.Med.7,115-124,2001；Pingault V.等人(2002)Hum.Genet.111,198-206；WO2004045516(权利要求1)；WO2004048938(实施例2)；WO2004040000(权利要求151)；WO2003087768(权利要求1)；WO2003016475(权利要求1)；WO2003016475(权利要求1)；WO200261087(图1)；WO2003016494(图6)；WO2003025138(权利要求12；第144页)；WO200198351(权利要求1；第124-125页)；EP522868(权利要求8；图2)；WO200177172(权利要求1；第297-299页)；US2003109676；US6518404(图3)；US5773223(权利要求1a；第31-34栏)；WO2004001004。

(10)MSG783(RNF124、推定蛋白FLJ20315，Genbank登录号NM_017763)；WO2003104275(权利要求1)；WO2004046342(实施例2)；WO2003042661(权利要求12)；WO2003083074(权利要求14；第61页)；WO2003018621(权利要求1)；WO2003024392(权利要求2；图93)；WO200166689(实施例6)；交叉参考：基因座ID：54894；NP_060233.2；NM_017763_1。

(11)STEAP2(HGNC_8639、IPCA-1、PCANAP1、STAMP1、STEAP2、STMP、前列腺癌相关基因1、前列腺癌相关蛋白1、前列腺的六次跨膜上皮抗原2、六次跨膜前列腺蛋白，Genbank登录号AF455138)Lab.Invest.82(11):1573-1582(2002))；WO2003087306；US2003064397(权利要求1；图1)；WO200272596(权利要求13；第54-55页)；WO200172962(权利要求1；图4B)；WO2003104270(权利要求11)；WO2003104270(权利要求16)；US2004005598(权利要求22)；WO2003042661(权利要求12)；US2003060612(权利要求12；图10)；WO200226822(权利要求23；图2)；WO200216429(权利要求12；图10)；交叉参考：GI：22655488；AAN04080.1；AF455138_1。

(12)TrpM4(BR22450、FLJ20041、TRPM4、TRPM4B、瞬时受体电位阳离子通道、亚家族M成员4，Genbank登录号NM_017636)Xu,X.Z.等人Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.98(19):10692-10697(2001),Cell 109(3):397-407(2002),J.Biol.Chem.278(33):30813-30820(2003))；US2003143557(权利要求4)；WO200040614(权利要求14；第100-103页)；WO200210382(权利要求1；图9A)；WO2003042661(权利要求12)；WO200230268(权利要求27；第391页)；US2003219806(权利要求4)；WO200162794(权利要求14；图1A-D)；交叉参考：MIM：606936；NP_060106.2；NM_017636_1。

(13)CRIPTO(CR、CR1、CRGF、CRIPTO、TDGF1、畸胎瘤衍生的生长因子，Genbank登录号NP_003203或NM_003212)Ciccodicola,A.等人EMBO J.8(7):1987-1991(1989),Am.J.Hum.Genet.49(3):555-565(1991))；US2003224411(权利要求1)；WO2003083041(实施例1)；WO2003034984(权利要求12)；WO200288170(权利要求2；第52-53页)；WO2003024392(权利要求2；图58)；WO200216413(权利要求1；第94-95、105页)；WO200222808(权利要求2；图1)；US5854399(实施例2；第17-18栏)；US5792616(图2)；交叉参考：MIM：187395；NP_003203.1；NM_003212_1。

(14)CD21(CR2(补体受体2)或C3DR(C3d/EB病毒受体)或Hs.73792，Genbank登录号M26004)Fujisaku等人(1989)J.Biol.Chem.264(4):2118-2125)；Weis J.J.等人J.Exp.Med.167,1047-1066,1988；Moore M.等人Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.84,9194-9198,1987；BarelM.等人Mol.Immunol.35,1025-1031,1998；Weis J.J.等人Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.83,5639-5643,1986；Sinha S.K.等人(1993)J.Immunol.150,5311-5320；WO2004045520(实施例4)；US2004005538(实施例1)；WO2003062401(权利要求9)；WO2004045520(实施例4)；WO9102536(图9.1-9.9)；WO2004020595(权利要求1)；登录号：P20023；Q13866；Q14212；EMBL；M26004；AAA35786.1。

(15)CD79b(CD79B、CD79β、IGb(免疫球蛋白相关β)、B29，Genbank登录号NM_000626或11038674)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.(2003)100(7):4126-4131,Blood(2002)100(9):3068-3076，Muller等人(1992)Eur.J.Immunol.22(6):1621-1625)；WO2004016225(权利要求2，图140)；WO2003087768、US2004101874(权利要求1，第102页)；WO2003062401(权利要求9)；WO200278524(实施例2)；US2002150573(权利要求5，第15页)；US5644033；WO2003048202(权利要求1，第306和309页)；WO 99/558658、US6534482(权利要求13，图17A/B)；WO200055351(权利要求11，第1145-1146页)；交叉参考：MIM：147245；NP_000617.1；NM_000626_1。

(16)FcRH2(IFGP4、IRTA4、SPAP1A(含有SH2结构域的磷酸酶锚定蛋白1a)、SPAP1B、SPAP1C，Genbank登录号NM_030764、AY358130)Genome Res.13(10):2265-2270(2003),Immunogenetics 54(2):87-95(2002),Blood 99(8):2662-2669(2002),Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.98(17):9772-9777(2001)，Xu,M.J.等人(2001)Biochem.Biophys.Res.Commun.280(3):768-775；WO2004016225(权利要求2)；WO2003077836；WO200138490(权利要求5；图18D-1-18D-2)；WO2003097803(权利要求12)；WO2003089624(权利要求25)；交叉参考：MIM：606509；NP_110391.2；NM_030764_1。

(17)HER2(ErbB2，Genbank登录号M11730)Coussens L.等人Science(1985)230(4730):1132-1139)；Yamamoto T.等人Nature 319,230-234,1986；Semba K.等人Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.82,6497-6501,1985；Swiercz J.M.等人J.Cell Biol.165,869-880,2004；Kuhns J.J.等人J.Biol.Chem.274,36422-36427,1999；Cho H.-S.等人Nature 421,756-760,2003；Ehsani A.等人(1993)Genomics 15,426-429；WO2004048938(实施例2)；WO2004027049(图1I)；WO2004009622；WO2003081210；WO2003089904(权利要求9)；WO2003016475(权利要求1)；US2003118592；WO2003008537(权利要求1)；WO2003055439(权利要求29；图1A-B)；WO2003025228(权利要求37；图5C)；WO200222636(实施例13；第95-107页)；WO200212341(权利要求68；图7)；WO200213847(第71-74页)；WO200214503(第114-117页)；WO200153463(权利要求2；第41-46页)；WO200141787(第15页)；WO200044899(权利要求52；图7)；WO200020579(权利要求3；图2)；US5869445(权利要求3；第31-38栏)；WO9630514(权利要求2；第56-61页)；EP1439393(权利要求7)；WO2004043361(权利要求7)；WO2004022709；WO200100244(实施例3；图4)；登录号：P04626；EMBL；M11767；AAA35808.1.EMBL；M11761；AAA35808.1。

(18)NCA(CEACAM6，Genbank登录号M18728)；Barnett T.等人Genomics 3,59-66,1988；Tawaragi Y.等人Biochem.Biophys.Res.Commun.150,89-96,1988；Strausberg R.L.等人Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.99:16899-16903,2002；WO2004063709；EP1439393(权利要求7)；WO2004044178(实施例4)；WO2004031238；WO2003042661(权利要求12)；WO200278524(实施例2)；WO200286443(权利要求27；第427页)；WO200260317(权利要求2)；登录号：P40199；Q14920；EMBL；M29541；AAA59915.1.EMBL；M18728。

(19)MDP(DPEP1，Genbank登录号BC017023)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.99(26):16899-16903(2002))；WO2003016475(权利要求1)；WO200264798(权利要求33；第85-87页)；JP05003790(图6-8)；WO9946284(图9)；交叉参考：MIM：179780；AAH17023.1；BC017023_1。

(20)IL20Rα(IL20Ra、ZCYTOR7、Genbank登录号AF184971)；Clark H.F.等人GenomeRes.13,2265-2270,2003；Mungall A.J.等人Nature 425,805-811,2003；Blumberg H.等人Cell 104,9-19,2001；Dumoutier L.等人J.Immunol.167,3545-3549,2001；Parrish-NovakJ.等人J.Biol.Chem.277,47517-47523,2002；Pletnev S.等人(2003)Biochemistry 42:12617-12624；Sheikh F.等人(2004)J.Immunol.172,2006-2010；EP1394274(实施例11)；US2004005320(实施例5)；WO2003029262(第74-75页)；WO2003002717(权利要求2；第63页)；WO200222153(第45-47页)；US2002042366(第20-21页)；WO200146261(第57-59页)；WO200146232(第63-65页)；WO9837193(权利要求1；第55-59页)；登录号：Q9UHF4；Q6UWA9；Q96SH8；EMBL；AF184971；AAF01320.1。

(21)短蛋白聚糖(BCAN、BEHAB，Genbank登录号AF229053)Gary S.C.等人Gene256,139-147,2000；Clark H.F.等人Genome Res.13,2265-2270,2003；Strausberg R.L.等人Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.99,16899-16903,2002；US2003186372(权利要求11)；US2003186373(权利要求11)；US2003119131(权利要求1；图52)；US2003119122(权利要求1；图52)；US2003119126(权利要求1)；US2003119121(权利要求1；图52)；US2003119129(权利要求1)；US2003119130(权利要求1)；US2003119128(权利要求1；图52)；US2003119125(权利要求1)；WO2003016475(权利要求1)；WO200202634(权利要求1)。

(22)EphB2R(DRT、ERK、Hek5、EPHT3、Tyro5，Genbank登录号NM_004442)Chan,J.和Watt,V.M.,Oncogene 6(6),1057-1061(1991)Oncogene 10(5):897-905(1995),Annu.Rev.Neurosci.21:309-345(1998),Int.Rev.Cytol.196:177-244(2000))；WO2003042661(权利要求12)；WO200053216(权利要求1；第41页)；WO2004065576(权利要求1)；WO2004020583(权利要求9)；WO2003004529(第128-132页)；WO200053216(权利要求1；第42页)；交叉参考：MIM：600997；NP_004433.2；NM_004442_1。

(23)ASLG659(B7h，Genbank登录号AX092328)US20040101899(权利要求2)；WO2003104399(权利要求11)；WO2004000221(图3)；US2003165504(权利要求1)；US2003124140(实施例2)；US2003065143(图60)；WO2002102235(权利要求13；第299页)；US2003091580(实施例2)；WO200210187(权利要求6；图10)；WO200194641(权利要求12；图7b)；WO200202624(权利要求13；图1A-1B)；US2002034749(权利要求54；第45-46页)；WO200206317(实施例2；第320-321页，权利要求34；第321-322页)；WO200271928(第468-469页)；WO200202587(实施例1；图1)；WO200140269(实施例3；第190-192页)；WO200036107(实施例2；第205-207页)；WO2004053079(权利要求12)；WO2003004989(权利要求1)；WO200271928(第233-234、452-453页)；WO 0116318。

(24)PSCA(前列腺干细胞抗原前体，Genbank登录号AJ297436)Reiter R.E.等人Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.95,1735-1740,1998；Gu Z.等人Oncogene 19,1288-1296,2000；Biochem.Biophys.Res.Commun.(2000)275(3):783-788；WO2004022709；EP1394274(实施例11)；US2004018553(权利要求17)；WO2003008537(权利要求1)；WO200281646(权利要求1；第164页)；WO2003003906(权利要求10；第288页)；WO200140309(实施例1；图17)；US2001055751(实施例1；图1b)；WO200032752(权利要求18；图1)；WO9851805(权利要求17；第97页)；WO9851824(权利要求10；第94页)；WO9840403(权利要求2；图1B)；登录号：O43653；EMBL；AF043498；AAC39607.1。

(25)GEDA(Genbank登录号AY260763)；AAP14954脂肪瘤HMGIC融合配偶体-类蛋白/pid＝AAP14954.1-智人物种：智人(人)WO2003054152(权利要求20)；WO2003000842(权利要求1)；WO2003023013(实施例3，权利要求20)；US2003194704(权利要求45)；交叉参考：GI：30102449；AAP14954.1；AY260763_1。

(26)BAFF-R(B细胞活化因子受体、BLyS受体3、BR3，Genbank登录号AF116456)；BAFF受体/pid＝NP_443177.1-智人Thompson,J.S.等人Science 293(5537),2108-2111(2001)；WO2004058309；WO2004011611；WO2003045422(实施例；第32-33页)；WO2003014294(权利要求35；图6B)；WO2003035846(权利要求70；第615-616页)；WO200294852(第136-137栏)；WO200238766(权利要求3；第133页)；WO200224909(实施例3；图3)；交叉参考：MIM：606269；NP_443177.1；NM_052945_1；AF132600。

(27)CD22(B细胞受体CD22-B同种型、BL-CAM、Lyb-8、Lyb8、SIGLEC-2、FLJ22814，Genbank登录号AK026467)；Wilson等人(1991)J.Exp.Med.173:137-146；WO2003072036(权利要求1；图1)；交叉参考：MIM：107266；NP_001762.1；NM_001771_1。

(28)CD79a(CD79A、CD79α、免疫球蛋白相关α，一种B细胞特异性蛋白，其与Igβ(CD79B)共价相互作用并且在表面上与Ig M分子形成复合物，转导涉及B细胞分化的信号)，pI：4.84，MW：25028，TM：2[P]基因染色体：19q13.2，Genbank登录号NP_001774.10)WO2003088808、US20030228319；WO2003062401(权利要求9)；US2002150573(权利要求4，第13-14页)；WO9958658(权利要求13，图16)；WO9207574(图1)；US5644033；Ha等人(1992)J.Immunol.148(5):1526-1531；Mueller等人(1992)Eur.J.Biochem.22:1621-1625；Hashimoto等人(1994)Immunogenetics 40(4):287-295；Preud’homme等人(1992)Clin.Exp.Immunol.90(1):141-146；Yu等人(1992)J.Immunol.148(2)633-637；Sakaguchi等人(1988)EMBO J.7(11):3457-3464。

(29)CXCR5(伯基特淋巴瘤受体1，一种G蛋白偶联受体，由CXCL13趋化因子活化，在淋巴细胞迁移和体液防御中起作用，在HIV-2感染中起作用且可能在AIDS、淋巴瘤、骨髓瘤和白血病的发展中起作用)；372aa，pI：8.54，MW：41959，TM：7[P]基因染色体：11q23.3，Genbank登录号NP_001707.1)WO2004040000；WO2004015426；US2003105292(实施例2)；US6555339(实施例2)；WO200261087(图1)；WO200157188(权利要求20，第269页)；WO200172830(第12-13页)；WO200022129(实施例1，第152-153页，实施例2，第254-256页)；WO9928468(权利要求1，第38页)；US5440021(实施例2，第49-52栏)；WO9428931(第56-58页)；WO9217497(权利要求7，图5)；Dobner等人(1992)Eur.J.Immunol.22:2795-2799；Barella等人(1995)Biochem.J.309:773-779。

(30)HLA-DOB(MHC II类分子的β亚基(Ia抗原)，其结合肽并将它们呈递给CD4+T淋巴细胞)；273aa，pI：6.56，MW：30820，TM：1[P]基因染色体：6p21.3，Genbank登录号NP_002111.1)Tonnelle等人(1985)EMBO J.4(11):2839-2847；Jonsson等人(1989)Immunogenetics 29(6):411-413；Beck等人(1992)J.Mol.Biol.228:433-441；Strausberg等人(2002)Proc.Natl.Acad.Sci USA 99:16899-16903；Servenius等人(1987)J.Biol.Chem.262:8759-8766；Beck等人(1996)J.Mol.Biol.255:1-13；Naruse等人(2002)Tissue Antigens 59:512-519；WO9958658(权利要求13，图15)；US6153408(第35-38栏)；US5976551(第168-170栏)；US6011146(第145-146栏)；Kasahara等人(1989)Immunogenetics 30(1):66-68；Larhammar等人(1985)J.Biol.Chem.260(26):14111-14119。

(31)P2X5(嘌呤能受体P2X配体门控离子通道5，由胞外ATP门控的离子通道，可能涉及突触传递和神经发生，缺陷可能促使特发性逼尿肌不稳定的病理生理学情况)；422aa)，pI：7.63，MW：47206，TM：1[P]基因染色体：17p13.3，Genbank登录号NP_002552.2)Le等人(1997)FEBS Lett.418(1-2):195-199；WO2004047749；WO2003072035(权利要求10)；Touchman等人(2000)Genome Res.10:165-173；WO200222660(权利要求20)；WO2003093444(权利要求1)；WO2003087768(权利要求1)；WO2003029277(第82页)。

(32)CD72(B细胞分化抗原CD72、Lyb-2)朊蛋白序列全长maeaity...tafrfpd(1..359；359aa)，pI：8.66，MW：40225，TM：1[P]基因染色体：9p13.3，Genbank登录号NP_001773.1)WO2004042346(权利要求65)；WO2003026493(第51-52、57-58页)；WO200075655(第105-106页)；Von Hoegen等人(1990)J.Immunol.144(12):4870-4877；Strausberg等人(2002)Proc.Natl.Acad.Sci USA99:16899-16903。

(33)LY64(淋巴细胞抗原64(RP105)，富含亮氨酸重复序列(LRR)家族的I型膜蛋白，调节B细胞活化和凋亡，功能丧失与患有系统性红斑狼疮患者的疾病活动增加有关)；661aa，pI：6.20，MW：74147，TM：1[P]基因染色体：5q12，Genbank登录号NP_005573.1)US2002193567；WO9707198(权利要求11，第39-42页)；Miura等人(1996)Genomics 38(3):299-304；Miura等人(1998)Blood 92:2815-2822；WO2003083047；WO9744452(权利要求8，第57-61页)；WO200012130(第24-26页)。

(34)FcRH1(Fc受体样蛋白1，含有C2型Ig样和ITAM结构域的免疫球蛋白Fc结构域的推定受体，可能在B淋巴细胞分化中起作用)；429aa，pI：5.28，MW：46925，TM：1[P]基因染色体：1q21-1q22，Genbank登录号NP_443170.1)WO2003077836；WO200138490(权利要求6，图18E-1-18-E-2)；Davis等人(2001)Proc.Natl.Acad.Sci USA 98(17):9772-9777；WO2003089624(权利要求8)；EP1347046(权利要求1)；WO2003089624(权利要求7)。

(35)IRTA2(免疫球蛋白超家族受体易位相关2，在B细胞发育和淋巴瘤形成中具有可能的作用的推定的免疫受体；由于易位所导致的基因失调在一些B细胞恶性肿瘤中发生)；977aa，pI：6.88，MW：106468，TM：1[P]基因染色体：1q21，Genbank登录号人：AF343662、AF343663、AF343664、AF343665、AF369794、AF397453、AK090423、AK090475、AL834187、AY358085；小鼠：AK089756、AY158090、AY506558；NP_112571.1。WO2003024392(权利要求2，图97)；Nakayama等人(2000)Biochem.Biophys.Res.Commun.277(1):124-127；WO2003077836；WO200138490(权利要求3，图18B-1-18B-2)。

(36)TENB2(TMEFF2、tomoregulin、TPEF、HPP1、TR，与EGF/调蛋白家族的生长因子和卵泡抑素相关的推定的跨膜蛋白聚糖)；374aa，NCBI登录号：AAD55776、AAF91397、AAG49451、NCBI RefSeq:NP_057276；NCBI基因：23671；OMIM：605734；SwissProt Q9UIK5；Genbank登录号AF179274；AY358907、CAF85723、CQ782436 WO2004074320(SEQ ID NO 810)；JP2004113151(SEQ ID NO 2、4、8)；WO2003042661(SEQ ID NO 580)；WO2003009814(SEQ IDNO 411)；EP1295944(第69-70页)；WO200230268(第329页)；WO200190304(SEQ ID NO2706)；US2004249130；US2004022727；WO2004063355；US2004197325；US2003232350；US2004005563；US2003124579；Horie等人(2000)Genomics 67:146-152；Uchida等人(1999)Biochem.Biophys.Res.Commun.266:593-602；Liang等人(2000)Cancer Res.60:4907-12；Glynne-Jones等人(2001)Int J Cancer.10月15日；94(2):178-84。

(37)PMEL17(银同系物；SILV；D12S53E；PMEL17；SI；SIL)；ME20；gp100)BC001414；BT007202；M32295；M77348；NM_006928；McGlinchey,R.P.等人(2009)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.106(33),13731-13736；Kummer,M.P.等人(2009)J.Biol.Chem.284(4),2296-2306。

(38)TMEFF1(具有EGF样和两个卵泡抑素样结构域1的跨膜蛋白；Tomoregulin-1)；H7365；C9orf2；C9ORF2；U19878；X83961；NM_080655；NM_003692；Harms,P.W.(2003)GenesDev.17(21),2624-2629；Gery,S.等人(2003)Oncogene 22(18):2723-2727。

(39)GDNF-Ra1(GDNF家族受体α1；GFRA1；GDNFR；GDNFRA；RETL1；TRNR1；RET1L；GDNFR-α1；GFR-α-1)；U95847；BC014962；NM_145793NM_005264；Kim,M.H.等人(2009)Mol.Cell.Biol.29(8),2264-2277；Treanor,J.J.等人(1996)Nature 382(6586):80-83。

(40)Ly6E(淋巴细胞抗原6复合物，基因座E；Ly67、RIG-E、SCA-2、TSA-1)；NP_002337.1；NM_002346.2；de Nooij-van Dalen,A.G.等人(2003)Int.J.Cancer 103(6),768-774；Zammit,D.J.等人(2002)Mol.Cell.Biol.22(3):946-952。

(41)TMEM46(shisa同系物2(非洲蟾蜍)；SHISA2)；NP_001007539.1；NM_001007538.1；Furushima,K.等人(2007)Dev.Biol.306(2),480-492；Clark,H.F.等人(2003)Genome Res.13(10):2265-2270。

(42)Ly6G6D(淋巴细胞抗原6复合物，基因座G6D；Ly6-D、MEGT1)；NP_067079.2；NM_021246.2；Mallya,M.等人(2002)Genomics 80(1):113-123；Ribas,G.等人(1999)J.Immunol.163(1):278-287。

(43)LGR5(含富亮氨酸重复序列的G蛋白偶联受体5；GPR49、GPR67)；NP_003658.1；NM_003667.2；Salanti,G.等人(2009)Am.J.Epidemiol.170(5):537-545；Yamamoto,Y.等人(2003)Hepatology 37(3):528-533。

(44)RET(ret原癌基因；MEN2A；HSCR1；MEN2B；MTC1；PTC；CDHF12；Hs.168114；RET51；RET-ELE1)；NP_066124.1；NM_020975.4；Tsukamoto,H.等人(2009)Cancer Sci.100(10):1895-1901；Narita,N.等人(2009)Oncogene 28(34):3058-3068。

(45)LY6K(淋巴细胞抗原6复合物，基因座K；LY6K；HSJ001348；FLJ35226)；NP_059997.3；NM_017527.3；Ishikawa,N.等人(2007)Cancer Res.67(24):11601-11611；deNooij-van Dalen,A.G.等人(2003)Int.J.Cancer 103(6):768-774。

(46)GPR19(G蛋白偶联受体19；Mm.4787)；NP_006134.1；NM_006143.2；Montpetit,A.和Sinnett,D.(1999)Hum.Genet.105(1-2):162-164；O'Dowd,B.F.等人(1996)FEBSLett.394(3):325-329。

(47)GPR54(KISS1受体；KISS1R；GPR54；HOT7T175；AXOR12)；NP_115940.2；NM_032551.4；Navenot，J.M.等人(2009)Mol.Pharmacol.75(6):1300-1306；Hata,K.等人(2009)Anticancer Res.29(2):617-623。

(48)ASPHD1(含有天冬氨酸β-羟化酶结构域的1；LOC253982)；NP_859069.2；NM_181718.3；Gerhard,D.S.等人(2004)Genome Res.14(10B):2121-2127。

(49)酪氨酸酶(TYR；OCAIA；OCA1A；酪氨酸酶；SHEP3)；NP_000363.1；NM_000372.4；Bishop,D.T.等人(2009)Nat.Genet.41(8):920-925；Nan,H.等人(2009)Int.J.Cancer 125(4):909-917。

(50)TMEM118(无名指蛋白，跨膜2；RNFT2；FLJ14627)；NP_001103373.1；NM_001109903.1；Clark,H.F.等人(2003)Genome Res.13(10):2265-2270；Scherer,S.E.等人(2006)Nature 440(7082):346-351。

(51)GPR172A(G蛋白偶联受体172A；GPCR41；FLJ11856；D15Ertd747e)；NP_078807.1；NM_024531.3；Ericsson,T.A.等人(2003)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.100(11):6759-6764；Takeda,S.等人(2002)FEBS Lett.520(1-3):97-101。

(52)CD33，唾液酸结合性免疫球蛋白样凝集素家族的成员，是67-kDa的糖基化跨膜蛋白。除了定型骨髓单核细胞和红细胞祖细胞之外，CD33还在大多数骨髓性和单核细胞白血病细胞上表达。在最早的多能干细胞、成熟粒细胞、淋巴样细胞或非造血细胞上没有看到它(Sabbath等人,(1985)J.Clin.Invest.75:756-56；Andrews等人,(1986)Blood 68:1030-5)。CD33在其细胞质尾上含有两个酪氨酸残基，每个残基后面跟着是疏水性残基，类似于在许多抑制性受体中看到的免疫受体酪氨酸抑制性基序(ITIM)。

(53)CLL-1(CLEC12A、MICL和DCAL2)编码C型凝集素/C型凝集素样结构域(CTL/CTLD)超家族的一个成员。该家族的成员共享共同的蛋白质折叠并具有各式各样的功能，诸如细胞粘附、细胞-细胞信号传导、糖蛋白周转以及在炎症和免疫应答中的作用。由此基因编码的蛋白质是粒细胞和单核细胞功能的负调节物。已经描述了此基因的若干可变剪接转录物变体，但尚未确定这些变体中的一些的全长性质。此基因与染色体12p13上的天然杀伤基因复合物区域中的其它CTL/CTLD超家族成员紧密连锁(Drickamer K(1999)Curr.Opin.Struct.Biol.9(5):585-90；van Rhenen A等人,(2007)Blood 110(7):2659-66；Chen CH等人(2006)Blood 107(4):1459-67；Marshall AS等人(2006)Eur.J.Immunol.36(8):2159-69；Bakker AB等人(2005)Cancer Res.64(22):8443-50；Marshall AS等人(2004)J.Biol.Chem.279(15):14792-802)。已经显示CLL-1是II型跨膜受体，其包含单个C型凝集素样结构域(其预测不结合钙或糖)、茎区、跨膜结构域以及含有ITIM基序的短的细胞质尾。

在本公开的任何抗体实施方案中，抗体是人源化的。在一个实施方案中，抗体包含如本公开的任何实施方案中的HVR，并且还包含人受体框架，例如人免疫球蛋白框架或人共有框架。在某些实施方案中，人受体框架是人VLκI共有(VLKI)框架和/或VH框架VH1。在某些实施方案中，人受体框架是人VLκI共有(VLKI)框架和/或VH框架VH1，其包含以下突变中的任一种。

在另一个实施方案中，抗体包含如本文提供的任何实施方案中的VH，以及如本文提供的任何实施方案中的VL。

在本公开的另一个实施方案中，根据本文的任何实施方案的抗体是单克隆抗体，包括人抗体。在一个实施方案中，抗体是抗体片段，例如Fv、Fab、Fab'、scFv、双抗体或F(ab')2片段。在另一个实施方案中，抗体是基本上全长抗体，例如，IgG1抗体、IgG2a抗体或如本文定义的其它抗体类别或同种型。在一些特定实施方案中，抗体选自抗HER2、抗CD22、抗CD33、抗Napi2b以及抗CLL-1。

在另一实施方案中，根据本文的任何实施方案的抗体可以如本文所述单独或组合结合任何特征。

B.抗体亲和力

在某些实施方案中，本文提供的抗体具有≤1μM、≤100nM、≤50nM、≤10nM、≤5nM、≤1nM、≤0.1nM、≤0.01nM或≤0.001nM，且任选地≥10^-13M的解离常数(Kd)。(例如，10^-8M或更小，例如10^-8M至10^-13M，例如10^-9M至10^-13M)。

在一个实施方案中，Kd通过放射性标记的抗原结合测定(RIA)测量，所述测定使用目标抗体的Fab型式及其抗原进行，如通过以下测定所描述。Fab对抗原的溶液结合亲和力通过以下方式测量：在未标记抗原的滴定系列的存在下用最小浓度的(¹²⁵I)标记的抗原平衡Fab，然后用抗Fab抗体包被的板捕获结合的抗原(参见，例如，Chen等人,J.Mol.Biol.293:865-881(1999))。为了建立测定条件，将多孔板(Thermo Scientific)用在50mM碳酸钠(pH 9.6)中的5μg/ml的捕获抗Fab抗体(CappelLabs)包被过夜，并且随后用在PBS中的2％(重量/体积)胎牛血清白蛋白在室温(大约23℃)下封闭2至5小时。在非吸附性板(Nunc#269620)中，将100pM或26pM的[¹²⁵I]-抗原与目的Fab的连续稀释液混合(例如，与Presta等人,Cancer Res.57:4593-4599(1997)中的抗VEGF抗体，Fab-12的评估一致)。然后将目的Fab孵育过夜；然而，孵育可以持续更长的时间段(例如，约65小时)，以确保实现平衡。此后，将混合物转移至捕获板以用于室温孵育(例如，持续一小时)。然后除去溶液并将板用在PBS中的0.1％聚山梨醇酯20洗涤八次。当板已经干燥时，添加150μl/孔的闪烁体(MICROSCINT-20^TM；Packard)，并将板在TOPCOUNT^TMγ计数仪(Packard)上计数十分钟。选择产生小于或等于20％的最大结合的各Fab的浓度用于竞争性结合测定。

根据另一个实施方案，Kd使用表面等离子共振测定测量，所述测定在25℃利用固定化抗原CM5芯片以约10响应单位(RU)使用或(BIAcore,Inc.,Piscataway,NJ)进行。简而言之，根据供应商的说明，将羧甲基化的葡聚糖生物传感器芯片(CM5，BIACORE,Inc.)用N-乙基-N’-(3-二甲基氨基丙基)-碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)活化。将抗原用10mM乙酸钠(pH 4.8)和/或HBS-P(0.01M Hepes pH7.4、0.15M NaCl、0.005％表面活性剂P20)稀释至5μg/ml(约0.2μM)，之后以5μl/分钟和/或30μl/分钟的流速注射以实现偶联蛋白的大约10个响应单位(RU)。在注射抗原后，注射1M乙醇胺以封闭未反应的基团。对于动力学测量，在25℃下以大约25μl/分钟的流速将Fab的两倍连续稀释液(0.78nM至500nM)注射到具有0.05％聚山梨醇酯20(TWEEN-20^TM)表面活性剂的PBS(PBST)中。使用简单一对一朗缪尔(Langmuir)结合模型(Evaluation Software版本3.2)通过同时拟合缔合和解离感应图来计算缔合速率(k_on)和解离速率(k_off)。平衡解离常数(Kd)计算为比率k_off/k_on。参见，例如，Chen等人,J.Mol.Biol.293:865-881(1999)。如果通过本文所述的表面等离子共振测定测量的缔合速率超过10⁶M^-1s^-1，那么可以通过以下方式确定缔合速率：如在分光计诸如配备有截流装置(stop-flow)的分光光度计(Aviv Instruments)或具有搅拌池的8000-系列SLM-AMINCO^TM分光光度计(ThermoSpectronic)中测量的，使用测量在增加浓度的抗原的存在下，在25℃，在PBS(pH 7.2)中的20nM抗抗原抗体(Fab形式)的荧光发射强度的增加或减小的荧光淬灭技术(激发＝295nm；发射＝340nm，16nm带通)。

C.抗体片段

在某些实施方案中，本文提供的抗体是抗体片段。抗体片段包括但不限于Fab、Fab'、Fab'-SH、F(ab')2、Fv和scFv片段，以及本文所述的其它片段。关于特定抗体片段的综述，参见Hudson等人Nat.Med.9:129-134(2003)。关于scFv片段的综述，参见，例如，Pluckthün,于The Pharmacology of Monoclonal Antibodies,第113卷,Rosenburg和Moore编辑,(Springer-Verlag,New York),第269-315页(1994)中；还参见WO 93/16185；以及美国专利号5,571,894和5,587,458。对于包含补救受体结合表位残基且具有增加的体内半衰期的Fab和F(ab')2片段的讨论，参见美国专利号5,869,046。

双抗体是具有两个抗原结合位点的抗体片段，其可以是二价的或双特异性的。参见，例如，EP 404,097；WO 1993/01161；Hudson等人,Nat.Med.9:129-134(2003)；以及Hollinger等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:6444-6448(1993)。Hudson等人,Nat.Med.9:129-134(2003)中也描述了三抗体和四抗体。

单结构域抗体是这样的抗体片段，其包含抗体的全部或部分的重链可变结构域或全部或部分的轻链可变结构域。在某些实施方案中，单结构域抗体是人单结构域抗体(Domantis,Inc.,Waltham,MA；参见，例如，美国专利号6,248,516B1)。

抗体片段可以通过各种技术制备，所述技术包括但不限于完整抗体的蛋白水解消化以及通过重组宿主细胞(例如，大肠杆菌(E.coli)或噬菌体)产生，如本文所述。

D.嵌合和人源化抗体

在某些实施方案中，本文提供的抗体是嵌合抗体。某些嵌合抗体描述于例如美国专利号4,816,567；以及Morrison等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81:6851-6855(1984))中。在一个实例中，嵌合抗体包含非人可变区(例如，来源于小鼠、大鼠、仓鼠、兔或非人灵长类动物诸如猴的可变区)和人恒定区。在另一个实例中，嵌合抗体是“类别转换”抗体，其中类别或亚类已经由亲本抗体的类别或亚类改变。嵌合抗体包括其抗原结合片段。

在某些实施方案中，嵌合抗体是人源化抗体。典型地，将非人抗体人源化以降低对人的免疫原性，同时保留亲本非人抗体的特异性和亲和力。一般来说，人源化抗体包含一个或多个可变结构域，其中HVR，例如，CDR(或其部分)来源于非人抗体，并且FR(或其部分)来源于人抗体序列。人源化抗体任选地还将包含至少一部分的人恒定区。在一些实施方案中，人源化抗体中的一些FR残基被取代成来自非人抗体(例如，HVR残基所来源于的抗体)的对应残基，例如，以恢复或提高抗体特异性或亲和力。

人源化抗体及其制备方法被综述于例如Almagro和Fransson,Front.Biosci.13:1619-1633(2008)中，并且被进一步描述于例如Riechmann等人,Nature 332:323-329(1988)；Queen等人,Proc.Nat’lAcad.Sci.USA 86:10029-10033(1989)；美国专利号5,821,337、7,527,791、6,982,321和7,087,409；Kashmiri等人,Methods 36:25-34(2005)(描述了SDR(a-CDR)移植)；Padlan,Mol.Immunol.28:489-498(1991)(描述了“表面再建(resurfacing)”)；Dall’Acqua等人,Methods 36:43-60(2005)(描述了“FR改组(shuffling)”)；以及Osbourn等人,Methods 36:61-68(2005)和Klimka等人,Br.J.Cancer,83:252-260(2000)(描述了用于FR改组的“导向选择”方法)。

可用于人源化的人框架区域包括但不限于：使用“最佳匹配”方法选择的框架区(参见，例如，Sims等人J.Immunol.151:2296(1993))；来源于具有特定亚组的轻链或重链可变区的人抗体的共有序列的框架区(参见，例如，Carter等人Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89:4285(1992)；以及Presta等人J.Immunol.,151:2623(1993))；人成熟(体突变)框架区或人生殖系框架区(参见，例如，Almagro和Fransson,Front.Biosci.13:1619-1633(2008))；以及来源于FR文库筛选的框架区(参见，例如，Baca等人,J.Biol.Chem.272:10678-10684(1997)和Rosok等人,J.Biol.Chem.271:22611-22618(1996))。

E.人抗体

在某些实施方案中，本文提供的抗体是人抗体。可以使用本领域已知的各种技术产生人抗体。人抗体一般性地描述于van Dijk和vande Winkel,Curr.Opin.Pharmacol.5:368-74(2001)以及Lonberg,Curr.Opin.Immunol.20:450-459(2008)中。

人抗体可以通过向已被改良成产生完整人抗体或具有人可变区的完整抗体以响应抗原激发的转基因动物施用免疫原来制备。此类动物通常含有全部或部分的人免疫球蛋白基因座，其替代内源性免疫球蛋白基因座，或其存在于染色体外或被随机整合到动物的染色体中。在此种转基因小鼠中，内源性免疫球蛋白基因座通常已失活。关于由转基因动物获得人抗体的方法的综述，参见Lonberg,Nat.Biotech.23:1117-1125(2005)。还参见，例如，描述了XENOMOUSE^TM技术的美国专利号6,075,181和6,150,584；描述了技术的美国专利号5,770,429；描述了K-M技术的美国专利号7,041,870以及描述了技术的美国专利申请公布号US2007/0061900。来自由此类动物生成的完整抗体的人可变区可以被进一步修饰，例如，通过与不同的人恒定区组合。

人抗体还可以通过基于杂交瘤的方法制备。用于产生人单克隆抗体的人骨髓瘤和小鼠-人杂交骨髓瘤细胞系已有描述。(参见，例如，Kozbor J.Immunol.,133:3001(1984)；Brodeur等人,Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications,第51-63页(Marcel Dekker,Inc.,New York,1987)；以及Boerner等人,J.Immunol.,147:86(1991)。)通过人B细胞杂交瘤技术产生的人抗体也描述于Li等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,103:3557-3562(2006)中。另外的方法包括在例如美国专利号7,189,826(描述了由杂交瘤细胞系产生单克隆人IgM抗体)和Ni,Xiandai Mianyixue,26(4):265-268(2006)(描述了人-人杂交瘤)中描述的那些。人杂交瘤技术(Trioma技术)还描述于Vollmers 和Brandlein,Histology and Histopathology,20(3):927-937(2005)以及Vollmers和Brandlein,Methods and Findings in Experimental and ClinicalPharmacology,27(3):185-91(2005)中。

人抗体也可以通过分离选自人源噬菌体展示文库的Fv克隆可变结构域序列来生成。此类可变结构域序列然后可与期望的人恒定结构域组合。本文描述了用于从抗体文库选择人抗体的技术。

F.来源于文库的抗体

本公开的抗体可通过筛选具有期望的一种或多种活性的抗体的组合文库来分离。例如，本领域已知多种方法用于生成噬菌体展示文库并且针对具有期望的结合特征的抗体筛选此类文库。此类方法综述于例如Hoogenboom等人,在Methods in Molecular Biology178:1-37(O’Brien等人编辑,Human Press,Totowa,NJ,2001)中并进一步描述于例如McCafferty等人,Nature 348:552-554；Clackson等人,Nature 352:624-628(1991)；Marks等人,J.Mol.Biol.222:581-597(1992)；Marks和Bradbury,在Methods in MolecularBiology 248:161-175(Lo编辑,Human Press,Totowa,NJ,2003)中；Sidhu等人,J.Mol.Biol.338(2):299-310(2004)；Lee等人,J.Mol.Biol.340(5):1073-1093(2004)；Fellouse,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 101(34):12467-12472(2004)；以及Lee等人,J.Immunol.Methods 284(1-2):119-132(2004)中。

在某些噬菌体展示方法中，VH和VL基因的库通过聚合酶链式反应(PCR)分别克隆并且在噬菌体文库中随机重组，然后可以针对结合抗原的噬菌体筛选所述文库，如Winter等人,Ann.Rev.Immunol.,12:433-455(1994)中所述。噬菌体通常将抗体片段展示为单链Fv(scFv)片段或Fab片段。来自被免疫的来源的文库向免疫原提供高亲和力抗体而不需要构建杂交瘤。另选地，可以克隆天然库(例如，由人)，以向多种非自身抗原以及自身抗原提供单一来源的抗体而不需要进行任何免疫，如Griffiths等人,EMBO J,12:725-734(1993)所述。最后，也可以通过以下方式合成地制备天然文库：由干细胞克隆未重排的V-基因区段，并且使用含随机序列的PCR引物来编码高变CDR3区并且在体外实现重排，如Hoogenboom和Winter,J.Mol.Biol.,227:381-388(1992)所述。描述人抗体噬菌体文库的专利公布包括，例如：美国专利号5,750,373、以及美国专利公布号2005/0079574、2005/0119455、2005/0266000、2007/0117126、2007/0160598、2007/0237764、2007/0292936和2009/0002360。

在本文中，分离自人抗体文库的抗体或抗体片段被认为是人抗体或人抗体片段。

G.多特异性抗体

在某些实施方案中，本文提供的抗体是多特异性抗体，例如双特异性抗体。术语“多特异性抗体”以最广义使用并且具体涵盖包含具有多表位特异性(即，能够特异性地结合一个生物分子上的两个或更多个不同表位或能够特异性地结合两个或更多个不同生物分子上的表位)的抗原结合结构域的抗体。在一些实施方案中，多特异性抗体是对至少两个不同位点具有结合特异性的单克隆抗体。在一些实施方案中，多特异性抗体(诸如双特异性抗体)的抗原结合结构域包含两个VH/VL单元，其中第一VH/VL单元特异性地结合第一表位并且第二VH/VL单元特异性地结合第二表位，其中每个VH/VL单元包含重链可变结构域(VH)和轻链可变结构域(VL)。此类多特异性抗体包括但不限于全长抗体；具有两个或更多个VL和VH结构域的抗体；抗体片段诸如Fab、Fv、dsFv、scFv；双抗体；双特异性双抗体和三抗体；已共价或非共价连接的抗体片段。还包含至少一部分重链可变区和/或至少一部分轻链可变区的VH/VL单元也可称为“臂”或“半聚体(hemimer)”或“半抗体”。在一些实施方案中，半聚体包含足以允许与第二半聚体形成分子内二硫键的重链可变区部分。在一些实施方案中，半聚体包含钮突变(knob mutation)或孔突变(hole mutation)，例如以允许与包含互补孔突变或钮突变的第二半聚体或半抗体进行异二聚。钮突变和孔突变在本文中进一步论述。

在某些实施方案中，本文提供的多特异性抗体可以是双特异性抗体。术语“双特异性抗体”以最广义使用并且涵盖包含能够特异性地结合一个生物分子上的两个不同表位或能够特异性地结合两个不同生物分子上的表位的抗原结合结构域的多特异性抗体。双特异性抗体也可在本文中称为具有“双重特异性”或为“双重特异性的”。双特异性抗体可被制备成全长抗体或抗体片段。如本文所用的术语“双互补位抗体(biparatopic antibody)”是指双特异性抗体，其中第一抗原结合结构域和第二抗原结合结构域结合相同抗原分子上的两个不同表位，或它可结合两个不同抗原分子上的表位。

在一些实施方案中，双互补位抗体的第一抗原结合结构域和第二抗原结合结构域可结合同一抗原分子内的两个表位(分子内结合)。例如，双互补位抗体的第一抗原结合结构域和第二抗原结合结构域可结合相同抗体分子上的两个不同表位。在某些实施方案中，双互补位抗体所结合的两个不同表位是正常情况下不被一个单特异性抗体(诸如常规抗体或一个免疫球蛋白单可变结构域)同时结合的表位。

在一些实施方案中，双互补位抗体的第一抗原结合结构域和第二抗原结合结构域可结合位于两个不同抗原分子内的表位。

用于制备多特异性抗体的技术包括但不限于具有不同特异性的两个免疫球蛋白重链-轻链对的重组共表达(参见Milstein和Cuello,Nature 305:537(1983))、WO 93/08829、以及Traunecker等人,EMBO J.10:3655(1991))和“钮入孔(knob-in-hole)”工程改造(参见，例如，美国专利号5,731,168)、WO2009/089004、US2009/0182127、US 2011/0287009、Marvin和Zhu,Acta Pharmacol.Sin.(2005)26(6):649-658、以及Kontermann(2005)Acta Pharmacol.Sin.,26:1-9)。如本文所用的术语“钮入孔”或“KnH”技术是指在体外或体内通过在相互作用的界面处将突起(钮)引入一种多肽并将空腔(cavity)(孔)引入另一多肽中来指导两个多肽配对在一起的技术。例如，KnH已被引入抗体的Fc:Fc结合界面、CL:CH1界面或VH/VL界面(参见，例如，US 2011/0287009、US2007/0178552、WO 96/027011、WO 98/050431、以及Zhu等人,1997,Protein Science 6:781-788)。在一些实施方案中，在制造多特异性抗体期间KnH驱动两条不同的重链配对在一起。例如，在其Fc区中具有KnH的多特异性抗体还可包含连接于每个Fc区的单一可变结构域，或还包含与类似或不同的轻链可变结构域配对的不同的重链可变结构域。KnH技术还可用于将两个不同受体胞外结构域配对在一起或将包含不同靶标识别序列的任何其它多肽序列(例如，包括亲和体、肽体和其它Fc融合物)配对。

如本文所用的术语“钮突变”是指在多肽与另一多肽相互作用的界面处将突起(钮)引入多肽的突变。在一些实施方案中，另一多肽具有孔突变。

“突起”是指从第一多肽的界面伸出且因此可位于相邻界面(即第二多肽的界面)的互补空腔以便使异源多聚体稳定且由此有利于例如异源多聚体形成而非同源多聚体形成的至少一个氨基酸侧链。突起可存在于原始界面或可以合成方式(例如通过改变编码界面的核酸)引入。在一些实施方案中，编码第一多肽的界面的核酸被改变以编码突起。为实现此目的，将编码第一多肽的界面中的至少一个“原始”氨基酸残基的核酸替代为编码侧链体积大于原始氨基酸残基的至少一个“输入”氨基酸残基的核酸。应当理解，可存在多于一个原始和对应的输入残基。各种氨基残基的侧链体积示出于例如US2011/0287009的表1中。引入“突起”的突变可称为“钮突变”。

在一些实施方案中，用于形成突起的输入残基为选自精氨酸(R)、苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)和色氨酸(W)的天然存在的氨基酸残基。在一些实施方案中，输入残基为色氨酸或酪氨酸。在一些实施方案中，用于形成突起的原始残基具有小侧链体积，诸如丙氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸或缬氨酸。

“空腔”是指从第二多肽的界面凹陷且因此容纳第一多肽的相邻界面上的对应突起的至少一个氨基酸侧链。空腔可存在于原始界面或可以合成方式(例如通过改变编码界面的核酸)引入。在一些实施方案中，编码第二多肽的界面的核酸被改变以编码空腔。为实现此目的，将编码第二多肽的界面中的至少一个“原始”氨基酸残基的核酸替代为编码侧链体积小于原始氨基酸残基的至少一个“输入”氨基酸残基的DNA。应当理解，可存在多于一个原始和对应的输入残基。在一些实施方案中，用于形成空腔的输入残基为选自丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)和缬氨酸(V)的天然存在的氨基酸残基。在一些实施方案中，输入残基为丝氨酸、丙氨酸或苏氨酸。在一些实施方案中，用于形成空腔的原始残基具有大侧链体积，诸如酪氨酸、精氨酸、苯丙氨酸或色氨酸。引入“空腔”的突变可称为“孔突变”。

突起“可位于”空腔中，其分别意指第一多肽和第二多肽的界面上的突起和空腔的空间位置，并且突起和空腔的尺寸使得突起可位于空腔中且不显著干扰第一和第二多肽在该界面的正常缔合。由于诸如Tyr、Phe和Trp的突起通常不从界面的轴线垂直延伸且具有优选构象，所以突起与对应空腔的对准在一些情况下可依赖于基于三维结构(诸如通过X射线结晶学或核磁共振(NMR)获得的三维结构)将突起/空腔对模型化。这可使用本领域公认的技术实现。

在一些实施方案中，IgG1恒定区中的钮突变为T366W。在一些实施方案中，IgG1恒定区中的孔突变包括选自T366S、L368A和Y407V的一个或多个突变。在一些实施方案中，IgG1恒定区中的孔突变包括T366S、L368A和Y407V。

在一些实施方案中，IgG4恒定区中的钮突变为T366W。在一些实施方案中，IgG4恒定区中的孔突变包括选自T366S、L368A和Y407V的一个或多个突变。在一些实施方案中，IgG4恒定区中的孔突变包括T366S、L368A和Y407V。

还可通过以下方式来制备多特异性抗体：工程改造静电转向作用以制备抗体Fc-异二聚体分子(WO 2009/089004A1)；使两个或更多个抗体或片段交联(参见，例如，US4676980，以及Brennan等人,Science,229:81(1985))；使用亮氨酸拉链产生双特异性抗体(参见，例如，Kostelny等人,J.Immunol.,148(5):1547-1553(1992))；使用用于制备双特异性抗体片段的“双抗体”技术(Hollinger等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90:6444-6448(1993))；以及使用单链Fv(sFv)二聚体(Gruber等人,J.Immunol.,152:5368(1994))；以及制备三特异性抗体，如例如Tutt等人J.Immunol.147:60(1991)中所述。

本文还包括具有三个或更多个功能抗原结合位点的工程改造的抗体，包括“章鱼抗体”或“双重可变结构域免疫球蛋白”(DVD)(US 2006/0025576A1，以及Wu等人(2007)Nature Biotechnology)。

在某些实施方案中，可将一个或多个氨基酸修饰引入本文提供的抗体的Fc区中，从而生成Fc区变体。Fc区变体可包含人Fc区序列(例如，人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4Fc区)，其在一个或多个氨基酸位置处包含氨基酸修饰(例如取代)。

在某些实施方案中，本公开涵盖具有一些但非所有效应功能的抗体变体，这使得所述抗体成为对于其中抗体的体内半衰期至关重要，而某些效应功能(诸如补体和ADCC)不必要或有害的应用而言合乎需要的候选物。可进行体外和/或体内细胞毒性测定以确认CDC和/或ADCC活性的降低/损耗。例如，可进行Fc受体(FcR)结合测定以确保抗体缺乏FcγR结合能力(从而可能缺乏ADCC活性)，但保留FcRn结合能力。用于介导ADCC的原代细胞NK细胞仅表达Fc(RIII，而单核细胞表达Fc(RI、Fc(RII和Fc(RIII。FcR在造血细胞上的表达概述于Ravetch和Kinet,Annu.Rev.Immunol.9:457-492(1991)的第464页上的表3中。评估目标分子的ADCC活性的体外测定的非限制性实例描述于US 5500362(参见，例如，Hellstrom,I.等人Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 83:7059-7063(1986))和Hellstrom,I等人,Proc.Nat’lAcad.Sci.USA 82:1499-1502(1985)；5,821,337(参见Bruggemann,M.等人,J.Exp.Med.166:1351-1361(1987))中。另选地，可采用非放射性测定方法(参见，例如，流式细胞术的ACTI^TM非放射性细胞毒性测定(CellTechnology,Inc.Mountain View,CA)；以及CytoTox非放射性细胞毒性测定(Promega,Madison,WI))。可用于此类测定的效应细胞包括外周血单核细胞(PBMC)和自然杀伤(NK)细胞。另选地或除此之外，可在体内评估目标分子的ADCC活性，例如在动物模型中，诸如Clynes等人Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 95:652-656(1998)中所公开的动物模型。还可进行C1q结合测定以证实抗体不能结合C1q且因此缺乏CDC活性。参见，例如，WO 2006/029879和WO 2005/100402的C1q和C3c结合ELISA。为评估补体活化，可进行CDC测定(参见，例如，Gazzano-Santoro等人,J.Immunol.Methods 202:163(1996)；Cragg,M.S.等人,Blood 101:1045-1052(2003)；以及Cragg,M.S.和M.J.Glennie,Blood 103:2738-2743(2004))。还可使用本领域已知的方法进行FcRn结合和体内清除率/半衰期测定(Petkova,S.B.等人,Int’l.Immunol.18(12):1759-1769(2006))。

具有降低的效应功能的抗体包括Fc区残基238、265、269、270、297、327和329中的一个或多个被取代的那些抗体(US 6,737,056，其以引用的方式全文并入)。此类Fc突变体包括在氨基酸位置265、269、270、297和327中的两个或更多个上被取代的Fc突变体，包括残基265和297被取代为丙氨酸的所谓的“DANA”Fc突变体(US 7332581，其以引用的方式全文并入)。

在某些实施方案中，用甘氨酸或精氨酸或大至足以破坏在Fc的脯氨酸329与FcgRIII的色氨酸残基Trp 87和Trp 110之间形成的Fc/Fcγ受体界面内的脯氨酸夹心的氨基酸残基取代野生型人Fc区的Pro329(Sondermann等人:Nature 406,267-273(2000年7月20日))。在另一个实施方案中，Fc变体中的至少一个另外的氨基酸取代为S228P、E233P、L234A、L235A、L235E、N297A、N297D或P331S，并且在另一个实施方案中，所述至少一个另外的氨基酸取代为人IgG1Fc区的L234A和L235A或人IgG4Fc区的S228P和L235E(US 8969526，其以引用的方式全文并入)。

在某些实施方案中，多肽包含野生型人IgG Fc区的Fc变体，其中所述多肽的人IgGFc区的Pro329被甘氨酸取代并且其中Fc变体包含人IgG1Fc区的L234A和L235A或人IgG4Fc区的S228P和L235E处的至少两个另外的氨基酸取代，并且其中残基根据Kabat的EU索引进行编号(美国专利号8,969,526，其以引用的方式全文并入)。在某些实施方案中，包含P329G、L234A和L235A取代的多肽表现出对人FcγRIIIA和FcγRIIA的亲和力减少，以用于将ADCC下调至通过包含野生型人IgG Fc区的多肽诱导的ADCC的至少20％，和/或用于ADCP的下调(美国专利号8,969,526，其以引用的方式全文并入)。

在一个具体实施方案中，包含野生型人Fc多肽的Fc变体的多肽包含三重突变：位置Pro329处的氨基酸取代、L234A和L235A突变(P329/LALA)(美国专利号8,969,526，其以引用的方式全文并入)。在具体实施方案中，多肽包含以下氨基酸取代：P329G、L234A和L235A。

描述了与FcR的结合改善或削弱的某些抗体变体。(参见，例如，美国专利号6,737,056；WO 2004/056312，以及Shields等人,J.Biol.Chem.9(2):6591-6604(2001))。

在某些实施方案中，抗体变体包含具有一个或多个改善ADCC的氨基酸取代(例如，Fc区的位置298、333和/或334(残基的EU编号)的取代)的Fc区。

在一些实施方案中，在Fc区中进行引起C1q结合和/或补体依赖性细胞毒性(CDC)改变(即，改善或削弱)的改变，例如，如美国专利号6,194,551、WO 99/51642以及Idusogie等人,J.Immunol.164:4178-4184(2000)中所述。

半衰期增加且与负责将母体IgG转移至胎儿的新生儿Fc受体(FcRn)(Guyer等人,J.Immunol.117:587(1976)和Kim等人,J.Immunol.24:249(1994))的结合改善的抗体描述于US2005/0014934A1(Hinton等人)中。那些抗体包含其中具有改善Fc区与FcRn的结合的一个或多个取代的Fc区。此类Fc变体包括在以下一个或多个Fc区残基处具有取代的那些：238、256、265、272、286、303、305、307、311、312、317、340、356、360、362、376、378、380、382、413、424或434，例如，Fc区残基434的取代(美国专利号7,371,826)。

关于Fc区变体的其它实例，还参见Duncan&Winter,Nature 322:738-40(1988)；美国专利号5,648,260；美国专利号5,624,821；以及WO 94/29351。

H.半胱氨酸工程改造的抗体变体

在某些实施方案中，可希望产生半胱氨酸工程改造的抗体，例如，“THIOMAB^TM抗体”，其中抗体的一个或多个残基被半胱氨酸残基取代。在特定实施方案中，取代的残基出现在抗体的可接近位点。通过用半胱氨酸取代那些残基，反应性硫醇基团因此定位在抗体的可接近位点，并且可用于将抗体缀合至药物部分以产生免疫缀合物，如本文进一步描述。在某些实施方案中，以下残基中的任何一个或多个可被半胱氨酸取代：轻链的V205(Kabat编号)；轻链的K149(Kabat编号)；重链的A118(EU编号)；以及重链Fc区的S400(EU编号)。半胱氨酸工程改造的抗体可以如例如美国专利号7,521,541中所述的那样生成。

在一些实施方案中，THIOMAB^TM抗体包含下表A中列出的重链或轻链半胱氨酸取代中的一个。

表A

在其它实施方案中，THIOMAB^TM抗体包含表B中列出的重链半胱氨酸取代中的一个。

表B

在一些其它实施方案中，THIOMAB^TM抗体包含表C中列出的轻链半胱氨酸取代中的一个。

表C

在一些其它实施方案中，THIOMAB^TM抗体包含表D中列出的重链或轻链半胱氨酸取代中的一个。

表D

可在本公开的抗体-药物缀合物(ADC)中用于癌症治疗的半胱氨酸工程改造的抗体包括但不限于针对细胞表面受体和肿瘤相关抗原(TAA)的抗体。肿瘤相关抗原是本领域已知的，并且可以使用本领域熟知的方法和信息制备以用于生成抗体。为了发现用于癌症诊断和治疗的有效细胞靶标，研究人员已寻求鉴定与一种或多种更正常的非癌性细胞上相比在一种或多种特定类型的癌细胞的表面上特异性地表达的跨膜或其它肿瘤相关多肽。通常，与非癌性细胞的表面相比，此类肿瘤相关多肽在癌细胞的表面上更丰富地表达。此类肿瘤相关细胞表面抗原多肽的鉴定已经产生了通过基于抗体的疗法特异性地靶向癌细胞以进行破坏的能力。

肿瘤相关抗原TAA的实例包括但不限于本文列出的TAA(1)-(53)。为方便起见，本文列出了与这些抗原(所有这些都是本领域已知的)相关的信息，并且包括名称、别名、Genbank登录号以及一个或多个主要参考文献，这些都遵循美国国家生物技术信息中心(NCBI)的核酸和蛋白质序列鉴定惯例。与TAA(1)-(53)相对应的核酸和蛋白质序列可在公共数据库诸如GenBank中获得。抗体靶向的肿瘤相关抗原包括相对于所引用的参考文献中鉴定的序列具有至少约70％、80％、85％、90％或95％序列同一性，或表现出与具有所引用的参考文献中发现的序列的TAA基本上相同的生物学特性或特征的所有氨基酸序列变体和同种型。例如，具有变体序列的TAA通常能够特异性地结合与具有所列出的对应序列的TAA特异性地结合的抗体。本文具体引用的参考文献中的序列和公开内容明确地以引用方式并入。

VI.前药制备

用于制备本公开范围内的PBD单体前药和PBD二聚体前药的方法在本文其它地方描述。

VII.接头-药物缀合

接头与PBD胺的缀合可根据WO 2013/055987、WO 2015/023355和WO 2015/095227的方法合适地进行，所述专利各自以引用的方式全文并入本文。

在一些此类实施方案中，将如本文其它地方所述的活化接头与PBD单体或二聚体的溶液组合以形成接头-PBD缀合物。一般来说，能够提供包含约0.05至约1摩尔/升PBD的溶液的任何溶剂都是合适的。在一些实施方案中，溶剂为DCM。在一些其它接头-PBD缀合实施方案中，在溶剂(例如，无水DCM)中形成PBD、化学计量过量的三光气(或双光气或光气)和碱(例如，4-二甲氨基吡啶)的溶液。将具有醇部分的接头中间体(如本文其它地方所述)与PBD溶液配混以形成反应混合物，搅拌所述反应混合物，直到反应完全，以形成包括接头-PBD缀合物的产物混合物。反应混合物可适宜地包含约0.005摩尔/升至约0.5摩尔/升的PBD、每当量PBD约2至约10当量的接头中间体、以及约0.02至约0.5当量的碱。在反应完全后，可分离接头-PBD缀合物，诸如通过溶剂蒸发，并通过本领域已知的方法纯化，所述方法诸如萃取、反相高压液相色谱、离子交换色谱或快速色谱中的一种或多种。

VIII.二硫化物缀合化合物的制备

在一些实施方案中，具有下式的本公开的二硫化物缀合化合物：

可通过形成反应混合物来制备，所述反应混合物包含(1)包含水的溶剂体系，(2)包含具有巯基部分的至少一个半胱氨酸的抗体的来源，以及(3)化学计量过量的具有下式的接头-PBD缀合物的来源：

抗体、X_L、R¹、R²、Sp、n和D如本文其它地方所述。使反应混合物反应，以形成包含式(II)的二硫化物缀合化合物的混合物，其中p为1、2、3、4、5、6、7或8。虽然混合物中的单独二硫化物缀合化合物可具有1至8的p值，并且这种混合物中的一些抗体分子可以是未缀合的(p＝0)，产物混合物中多个所形成的二硫化物缀合化合物的PBD与抗体的比率，表示为PBD当量与抗体当量的比率，为约1至约5、约1.5至约3、约1.5至约2.5、约1.7至约2.3、约1.8至约2.2、或约2。

在此类实施方案的各种实施方案中的任一个中，抗体的来源可提供于含水缓冲液中的溶液中。在一些此类实施方案中，缓冲液可以适宜地为N-(2-乙酰氨基)-氨基乙磺酸(“ACES”)；醋酸盐；N-(2-乙酰氨基)-亚氨基二乙酸(“ADA”)；2-氨基乙磺酸，牛磺酸(“AES”)；2-氨基-2-甲基-1-丙醇(“AMP”)；2-氨基-2-甲基-1,3-丙二醇，氨基丁二醇(Ammediol)(“AMPD”)；N-(1,1-二甲基-2-羟乙基)-3-氨基-2-羟基丙磺酸(“AMPSO”)；N,N-双-(2-羟乙基)-2-氨基乙磺酸(“BES”)；N,N’-双(2-羟乙基)-甘氨酸(“Bicine”)；[双-(2-羟乙基)-亚氨基]-三-(羟甲基甲烷)(“BIS-Tris”)；1,3-双[三(羟甲基)-甲基氨基]丙烷(“BIS-Tris-丙烷”)；二甲基胂酸(“Cacodylate”)；3-(环己基氨基)-2-羟基-1-丙磺酸(“CAPSO”)；环己基氨基乙磺酸(“CHES”)；柠檬酸盐；3-[N-双(羟乙基)氨基]-2-羟基丙磺酸(“DIPSO”)；N-(2-羟乙基)-哌嗪-N’-乙磺酸(“HEPES”)；N-(2-羟乙基)-哌嗪-N’-3-丙磺酸(“HEPPS、EPPS”)；N-(2-羟乙基)-哌嗪-N’-2-羟基丙磺酸(“HEPPSO”)；2-(N-吗啉代)-乙磺酸(“MES”)；3-(N-吗啉代)-丙磺酸(“MOPS”)；3-(N-吗啉代)-2-羟基丙磺酸(“MOPSO”)；哌嗪-N,N’-双(2-乙磺酸)(“PIPES”)；哌嗪-N,N’-双(2-羟基丙磺酸)(“POPSO”)；琥珀酸的盐；3-{[三(羟甲基)-甲基]-氨基}-丙磺酸(“TAPS”)；3-[N-三(羟甲基)-甲基氨基]-2-羟基丙磺酸(“TAPSO”)；2-氨基乙磺酸，AES(“牛磺酸”)；三乙醇胺(“TEA”)；2-[三(羟甲基)-甲基氨基]-乙磺酸(“TES”)；N-[三(羟甲基)-甲基]-甘氨酸(“Tricine”)；三(羟甲基)-氨基甲烷(“TRIS”)。在一些此类实施方案中，缓冲液可以是琥珀酸盐或tris。缓冲液浓度适宜地为约5mM、约10mM、约15mM、约20mM、约50mM、约100mM，或约150nM，诸如约5mM至约150mM、约5mM至约30mM、约5mM至约20mM、约5mM至约10mM、或约50mM至约100nM。缓冲液中的抗体浓度可为约1mg/mL、约5mg/mL、约10mg/mL或更高。抗体溶液的pH适宜地为约4至约8、约4至约6、或约5。

在此类实施方案的各种实施方案中的任一个中，接头-PBD缀合化合物(“活化的接头-PBD缀合物”)的来源通常可以通过将活化的受阻接头-PBD缀合物溶解于包含至少一种极性非质子溶剂的溶剂中来形成，所述极性非质子溶剂选自乙腈、四氢呋喃、乙酸乙酯、丙酮、N,N-二甲基甲酰胺、二甲基乙酰胺、二甲亚砜、丙二醇、乙二醇以及二氯甲烷。在一些实施方案中，溶剂包括、主要包括或基本上由以下组成：N,N-二甲基甲酰胺和/或二甲基乙酰胺。

抗体的来源和活化的接头-PBD缀合物的来源可以适宜地混合以形成反应混合物。反应混合物中的抗体浓度适宜地为约1mg/mL、约5mg/mL、约10mg/mL、约15mg/mL、约20mg/mL、或约25mg/mL、以及其范围，诸如约1mg/mL至约25mg/mL、约1mg/mL至约20mg/mL、约1mg/mL至约15mg/mL、约1mg/mL至约10mg/mL、约5mg/mL至约25mg/mL、约5mg/mL至约20mg/mL或约5mg/mL至约15mg/mL。活化的接头-PBD缀合物与抗体的当量比率适宜地为约2:1、约3:1、约5:1、约10:1、约15:1或约20:1、以及其范围，诸如约2:1至约20:1、约3:1至约15:1、约3:1至约10:1、或约5:1至约10:1。在本公开的一些实施方案中，反应混合物溶剂体系主要包括水。在一些其它实施方案中，反应混合物溶剂体系通常可包含至少75体积/体积％的如本文其它地方所述的缓冲液，以及约5体积/体积％、约10体积/体积％、约15体积/体积％、约20体积/体积％、约25体积/体积％或约30体积/体积％、以及其范围，诸如约5体积/体积％至约30体积/体积％、约5体积/体积％至约20体积/体积％、约5体积/体积％至约15体积/体积％、或约10体积/体积％的如本文其它地方所述的极性非质子溶剂。在一些其它实施方案中，反应混合物溶剂体系通常可包含至少50体积/体积％的如本文其它地方所述的缓冲液、以及介于约10体积/体积％与约50体积/体积％之间，诸如约10体积/体积％、约20体积/体积％、约30体积/体积％、约40体积/体积％或高于50体积/体积％的丙二醇或乙二醇。或者说，反应混合物溶剂体系可包含约50体积/体积％、约60体积/体积％、约70体积/体积％、75体积/体积％、约80体积/体积％、约85体积/体积％、约90体积/体积％或约95体积/体积％的水至约95体积/体积％，以及其范围，诸如约50体积/体积％至约95体积/体积％的水、约75体积/体积％至约95体积/体积％的水、约80体积/体积％至约95体积/体积％的水或约85体积/体积％至约95体积/体积％的水。反应混合物的pH适宜地为约5.0、约5.5、约6.0、约6.5、约7.0、约7.5、约8.0、约8.5或约9.0，以及其范围，诸如约5.0至约9.0、约5.0至约9.0、约6.0至约9.0、约6.5至约9.0、或约7.0至约9.0、或约7.5至约8.5。

将反应混合物在约10℃、约15℃、约20℃、约25℃、约30℃、约35℃、约40℃、约45℃或约50℃、以及其范围诸如约10℃至约50℃、约15℃至约45℃、约15℃至约40℃、约20℃至约40℃、约20℃至约35℃、或约20℃至约30℃下孵育约0.5小时、约1小时、约4小时、约8小时、约12小时、约18小时、约24小时、约36小时或约48小时、以及其范围诸如约0.5小时至约48小时、或约1小时至约24小时，以形成包含式(II)的二硫化物缀合化合物的产物混合物。

通过MS/LC测定，产物混合物可包含至少60A％、至少65面积％、至少70面积％、至少75面积％、至少80面积％、至少85面积％、或至少90面积％的抗体-接头-PBD缀合物。产物混合物还可包含至少一种离去基团副产物物质。在一些实施方案中，如通过MS/LC所测量的，与所形成的二硫化物缀合化合物的面积百分比相比，总离去基团副产物物质的面积百分比小于10面积％、小于5面积％、小于4面积％、小于3面积％、小于2面积％、小于1面积％、小于0.5面积％。在抗体的情况下，并且基于迄今为止的实验证据，离去基团副产物物质可包括：

其中X_L如本文其它地方所定义，并且其中Q是指不具有硫连接原子的X_L部分。示例性X和对应的Q例示如下：

反应混合物还可包含未缀合的抗体化合物，其包括(i)包含通过两个半胱氨酸巯基部分的反应形成的至少一个二硫键的未缀合的抗体单体物质，(ii)包含通过两个半胱氨酸巯基部分的反应形成的至少一个二硫键的未缀合的抗体二聚体物质，以及(iii)未缀合的抗体单体物质和未缀合的抗体二聚体物质的组合。在一些实施方案中，如通过MS/LC所测量的，与所形成的二硫化物缀合化合物的面积百分比相比，未缀合的抗体化合物的总浓度小于10面积％、小于5面积％、小于4面积％、小于3面积％、小于2面积％、小于1面积％、小于0.5面积％、小于0.3面积％、小于0.1面积％、或者是不可检测的。

IX.PBD前药治疗方法

预期本公开的PBD前药缀合化合物可用于治疗例如通过肿瘤抗原的过表达表征的各种疾病或病症。示例性病状或过度增殖性病症包括良性或恶性实体肿瘤和血液病症诸如白血病和淋巴恶性肿瘤。其它包括神经元、神经胶质、星形胶质细胞、下丘脑、腺体、巨噬细胞、上皮细胞、间质、囊胚腔、炎症性、血管发生和免疫性(包括自身免疫性)病症。

在一个实施方案中，本文提供的PBD前药缀合化合物在抑制癌细胞增殖的方法中使用，所述方法包括在允许抗体或抗体-前药缀合物与细胞表面上的肿瘤相关抗原结合的条件下将细胞暴露于抗体-前药缀合物，从而抑制细胞的增殖。在某些实施方案中，所述方法是体外或体内方法。在另外的实施方案中，细胞为淋巴细胞、淋巴母细胞、单核细胞或骨髓单核细胞。

体外细胞增殖抑制可使用可购自Promega(Madison,WI)的CellTiter-Glo^TMLuminescent Cell Viability Assay测定。所述测定基于存在的ATP(其为代谢活跃细胞的指示)的量化确定培养物中的活细胞数目。参见Crouch等人(1993)J.Immunol.Meth.160:81-88、美国专利号6602677。该测定可以以96孔或384孔形式进行，从而使其适应自动化高通量筛选(HTS)。参见Cree等人(1995)AntiCancer Drugs6:398-404。测定程序涉及直接向培养细胞中添加单一试剂(试剂)。这导致细胞裂解和通过荧光素酶反应产生的发光信号的生成。发光信号与存在的ATP的量成比例，后者与培养物中存在的活细胞的数目成正比。可以通过光度计或CCD照相机成像装置记录数据。发光输出表示为相对光单位(RLU)。

在另一个实施方案中，提供了一种用作药剂的PBD前药缀合化合物。在另外的实施方案中，提供了一种在治疗方法中使用的PBD前药缀合化合物。在某些实施方案中，提供了一种用于治疗癌症的PBD前药缀合化合物。在某些实施方案中，本公开提供了一种在治疗个体的方法中使用的PBD前药缀合化合物，所述方法包括向个体施用有效量的PBD前药缀合化合物。

本公开的PBD前药缀合化合物可单独使用或与疗法中的其它剂组合使用。例如，本公开的抗体或免疫缀合物可与至少一种另外的治疗剂共同施用。在一些实施方案中，另外的治疗剂是蒽环霉素。在一些实施方案中，蒽环霉素是柔红霉素或伊达比星。在一些实施方案中，另外的治疗剂是阿糖胞苷。在一些实施方案中，另外的治疗剂是克拉屈滨。在一些实施方案中，另外的治疗剂是氟达拉滨或拓扑替康。在一些实施方案中，另外的治疗剂是5-氮杂胞苷或地西他滨。

本文指出的此类组合疗法涵盖组合施用(其中两种或更多种治疗剂包括于同一或分开的制剂中)和分开施用，在此情况下，本公开的化合物的施用可在另外的治疗剂和/或佐剂的施用之前、与其同时和/或在其之后发生。本公开的化合物还可与放射疗法组合使用。

本公开的化合物(和任何另外的治疗剂)可通过任何合适的方式施用，包括肠胃外、肺内和鼻内、以及在必要时针对局部治疗的病灶内施用。肠胃外输注包括肌内、静脉内、动脉内、腹膜内、或皮下施用。给药可通过任何合适途径，例如通过注射，诸如静脉内或皮下注射，部分取决于施用是短期的还是长期的。本文设想了各种给药时程，包括但不限于单次施用或经各个时间点多次施用、弹丸式施用以及脉冲式输注。

本公开的化合物将以符合良好医学实践的方式配制、确定剂量和施用。在此背景下考虑的因素包括所治疗的具体病症、所治疗的具体哺乳动物、个别患者的临床病状、病症起因、药剂递送部位、施用方法、施用时程安排、以及医学从业者已知的其它因素。本公开的化合物无需但任选地与一或多种当前用于预防或治疗所述病症的药剂一起配制。所述其它药剂的有效量取决于配方中本公开的化合物的量、所治疗病症的类型、以及本文论述的其它因素。这些药剂通常以与如本文所述相同的剂量且用如本文所述的施用途径使用，或以本文所述的剂量的约1％至99％使用，或以凭经验/临床上确定为适当的任何剂量和任何途径使用。

为预防或治疗疾病，本公开的化合物(当单独或与一种或多种其它另外的治疗剂组合使用时)的适当剂量将取决于待治疗的疾病类型、化合物的类型、疾病的严重程度和病程、化合物是出于预防还是治疗目的而施用、先前疗法、患者的临床病史和对化合物的响应、以及主治医师的判断。化合物适合一次或经由一系列治疗对患者施用。取决于疾病的类型和严重程度，约1μg/kg至15mg/kg(例如0.1mg/kg-10mg/kg)的本公开化合物可作为首次候选剂量向患者施用，无论是例如通过一次或多次单独的施用或通过连续输注。根据本文提及的因素，一种典型的日剂量可在约1μg/kg至100mg/kg或更多的范围内。对于几天或更长时间的重复施用，取决于病情，治疗应通常持续直至出现疾病症状得到期望的遏制为止。化合物的一种示例性剂量将在约0.05mg/kg至约10mg/kg的范围内。因此，可以向患者施用约0.5mg/kg、2.0mg/kg、4.0mg/kg或10mg/kg(或其任何组合)的一个或多个剂量。此类剂量可间歇施用，例如每周或每三周(例如以使患者接受约两剂至约二十剂，或例如约六剂抗体)。初始可施用较高负载剂量，随后可施用一个或多个较低剂量。然而，其它给药方案可以是可用的。通过常规技术和测定易于监测此疗法的进展。

在靶细胞中药物从PBD前药缀合化合物中的胞内释放据信是由接头自分解和(i)二硫化物触发物的GSH活化、(ii)醌触发物的DTD活化或(iii)芳基硼酸或芳基硼酸酯触发物的ROS活化的组合引起的。

关于包含二硫化物部分的接头，与现有技术中已知的某些接头(诸如酸不稳定的肼接头)相比，GSH介导的释放提供了优势。更具体地，已知GSH的血液浓度非常低，诸如在微摩尔范围内，而胞内GSH浓度通常大最多三个数量级，诸如在毫摩尔范围内。还据信，由于还原酶的活性增加，癌细胞中的GSH浓度甚至更高。还据信，带有硫原子的接头碳原子处的空间位阻提供了改善的血流稳定性和改善的胞内释放。因此，据信本公开的二硫化物缀合化合物提供了改善的在血流中的稳定性和改善的胞内释放速率。

关于PBD前药，PBD N10保护基团的GSH、DTD或ROS活化掩盖了在血流和血浆中的毒性，并且与不包含保护性前药部分的PBD药物相比提供了选择性毒性优势。更具体地，已知与癌细胞相比，GSH、DTD和ROS的血液浓度低。因此，据信本公开的PBD前药缀合化合物提供了降低的血流毒性和对PBD的靶向胞内活化。

X.制品

在本公开的另一个实施方案中，提供了一种制品，所述制品含有可用于本文所述病症的治疗、预防和/或诊断的材料。制品包括容器和在容器上或与容器相关的标签或包装插页。合适的容器包括例如瓶子、小瓶、注射器、IV溶液袋等。容器可由多种材料(诸如玻璃或塑料)形成。容器装有单独或与有效治疗、预防和/或诊断病症的另一组合物组合的组合物，并且可具有无菌存取口(例如容器可以是具有可由皮下注射针刺穿的塞子的静脉内溶液袋或小瓶)。组合物中的至少一种活性剂是本公开的PBD前药缀合化合物。标签或包装插页指示组合物用于治疗所选病状。此外，制品可包括(a)其中含有组合物的第一容器，其中组合物包含本公开的PBD前药缀合化合物；和(b)其中含有组合物的第二容器，其中组合物包含另一种细胞毒性剂或其它治疗剂。本发明的此实施方案中的制品还可包括指示组合物可用于治疗特定病状的包装插页。另选地或除此之外，制品还可包括第二(或第三)容器，其包括药学上可接受的缓冲液，诸如抑菌性注射用水(BWFI)、磷酸盐缓冲盐水、林格氏溶液和右旋糖溶液。它还可以包括从商业和用户角度所需的其它材料，包括其它缓冲剂、稀释剂、过滤器、针头和注射器。

实施例

以下为本公开的方法和化合物的实施例。应当理解，考虑到本文提供的一般性描述，可实践各种其它实施方案。

下文描绘实施例中公开的PBD单体和二聚体化合物的结构以及对应的参考标签，其中星号是指外消旋或未定义的立体化学的手性中心。

实施例1：ADC制备的一般方法

在本公开的一些方面，通过用还原剂诸如DTT(Cleland试剂，二硫苏糖醇)或TCEP(三(2-羧乙基)膦盐酸盐处理使半胱氨酸工程改造的抗体(诸如表A至D中列出的那些)具有反应性以便缀合接头-药物中间体；参见Getz等人(1999)Anal.Biochem.第273:73-80卷(以引用方式并入本文)；Soltec Ventures,Beverly,MA)，之后利用温和氧化剂诸如脱氢抗坏血酸重新形成链间二硫键(再氧化)。在室温下，在具有2mM EDTA的50mM Tris(pH 8.0)中例如用约50倍过量的DTT将在CHO细胞(参见Gomez等人(2010)Biotechnology andBioeng.105(4):748-760(以引用方式并入本文)；以及Gomez等人(2010)Biotechnol.Prog.26:1438-1445(以引用方式并入本文))中表达的全长半胱氨酸工程改造的单克隆抗体(THIOMABT^M)还原过夜，这去除半胱氨酸和GSH加合物并且减少抗体中的链间二硫键。使用PLRP-S柱通过反相液相色谱/质谱分析(“LC/MS”)监测加合物的去除。通过添加至少4倍体积的10mM琥珀酸钠(pH 5缓冲液)稀释和酸化还原的THIOMAB^TM。另选地，通过添加至少4倍体积的10mM琥珀酸盐(pH5)并用10％乙酸滴定直到pH大约为5来稀释和酸化抗体。随后将pH降低且稀释的THIOMAB^TM上样到HiTrap S阳离子交换柱上，用几个柱体积的10mM乙酸钠(pH 5)洗涤，并用50mM Tris(pH 8.0)、150mM氯化钠洗脱。

通过进行再氧化，在亲代Mab中存在的半胱氨酸残基之间重建二硫键。将上述洗脱的还原的THIOMAB^TM用15X脱氢抗坏血酸(DHAA)处理约3小时，或另选地，用200nM至2mM硫酸铜(CuSO4)水溶液在室温下处理过夜。可使用本领域已知的其它氧化剂(即氧化试剂)和氧化条件。环境空气氧化也可以是有效的。这种温和的部分再氧化步骤有效地以高保真度形成链内二硫化物。使用PLRP-S柱通过反相LC/MS监测再氧化。将再氧化的THIOMAB^TM用如上所述的琥珀酸盐缓冲液稀释以达到大约5的pH，并且如上所述在S柱上进行纯化，不同的是使用10mM琥珀酸盐(pH 5)的梯度(在10mM琥珀酸盐(pH 5，缓冲液A)中的300mM氯化钠(缓冲液B))进行洗脱。将EDTA添加到洗脱的THIOMAB^TM中至2mM的终浓度，并且在需要时浓缩以达到大于5mg/mL的终浓度。

将适用于缀合的所得THIOMAB^TM以等分试样储存于-20℃。LC/MS分析在6200系列TOF或QTOF Agilent LC/MS上进行。将样品在加热至80℃的1000A，微孔柱(50mmx2.1mm，Polymer Laboratories,Shropshire,UK)上进行色谱分离。使用30-40％B的线性梯度(溶剂A：在水中的0.05％TFA，溶剂B：在乙腈中的0.04％TFA)，并使用电喷雾源将洗脱液直接离子化。收集数据并通过MassHunter软件解卷积。在LC/MS分析之前，在37℃下使用肽N-葡糖苷酶F(“PNGase F”)(2单位/ml；PROzyme,San Leandro,CA)处理抗体或药物缀合物(50微克)2小时，以除去N-连接的碳水化合物。另选地，将抗体或药物缀合物用LysC(0.25μg/50μg抗体或缀合物)在37C下部分消化15分钟，以得到Fab和Fc片段，用于通过LC/MS进行分析。对解卷积的LC/MS谱中的峰进行分配和定量。通过计算与药物缀合的抗体相对应的一个或多个峰的强度相对于观察到的所有峰的强度的比率来计算药物与抗体比率(DAR)。

用1M Tris将在10mM琥珀酸盐(pH 5)、150mM NaCl、2mM EDTA中的用于缀合的THIOMAB^TM调整至pH 7.5-8.5。将过量的约3至20摩尔当量的具有硫醇反应性吡啶基二硫化物基团的本公开的接头-药物中间体溶解在DMF或DMA中，并添加至经过还原的、再氧化的且pH调整的抗体中。将反应在室温或37℃下孵育并监测直到完全(1至约24小时)，如通过反应混合物的LC/MS分析所确定的。当反应完全时，可通过若干方法中的一种或任何组合纯化缀合物，以除去剩余的未反应的接头-药物中间体和聚集的蛋白质(如果以显著水平存在的话)。例如，缀合物可用pH 5.5的10mM组氨酸-乙酸酯稀释直到最终pH为大约5.5，并使用连接至Akta纯化系统(GE Healthcare)的HiTrap S柱或使用S maxi自旋柱(Pierce)通过S阳离子交换色谱纯化。另选地，可使用连接至Akta纯化系统的S200柱或使用Zeba自旋柱通过凝胶过滤色谱纯化缀合物。另选地，可使用渗析。利用240mM蔗糖使用凝胶过滤或渗析将THIOMAB^TM药物缀合物配制成20mM His/乙酸盐(pH 5)。将纯化的缀合物通过离心超滤浓缩，并在无菌条件下通过0.2-μm过滤器过滤并冷冻以便储存。抗体-药物缀合物通过以下各项进行表征：BCA测定，以确定蛋白质浓度；分析性SEC(尺寸排阻色谱)，用于聚集分析；以及在用赖氨酸C肽链内切酶(LysC)处理后的LC/MS，以计算DAR。

使用Shodex KW802.5柱，在具有0.25mM氯化钾和15％IPA的0.2M磷酸钾(pH 6.2)中以0.75ml/min的流速对缀合物进行尺寸排阻色谱。通过在280nm下的洗脱峰面积吸光度的积分来确定缀合物的聚集状态。

可以使用Agilent QTOF 6520ESI仪器对缀合物进行LC/MS分析。例如，在37℃下，在Tris(pH 7.5)中使用1:500重量/重量的内切蛋白酶Lys C(Promega)处理抗体-药物缀合物30min。将所得的切割片段上样到加热至80℃的(Angstrom)，8μm(微米)PLRP-S(高度交联的聚苯乙烯)柱上，并且使用30％B至40％B的梯度在5分钟内进行洗脱。流动相A是具有0.05％TFA的H₂O，并且流动相B是具有0.04％TFA的乙腈。流速为0.5ml/min。在电喷雾离子化和MS分析之前，通过在280nm下的紫外吸光度检测来监测蛋白质洗脱。通常实现了未缀合的Fc片段、残余未缀合的Fab和药物化的Fab的色谱分辨(Chromatographicresolution)。使用Mass Hunter^TM软件(Agilent Technologies)将获得的m/z光谱解卷积，以计算抗体片段的质量。

实施例2：赫赛汀A118C抗体-探针缀合物

将包含接头和硫醇离去基团的各种探针化合物与赫赛汀A118C缀合。在每次缀合中，使溶剂体系中的5mg/mL抗体与探针-接头-离去基团化合物接触，探针化合物与抗体的当量比率为10:1，其中探针-接头通过二硫键与抗体缀合。溶剂体系包含75mM Tris(pH8.5)和10体积/体积％DMF。缀合反应在室温下进行24小时。通过LC/MS分析反应产物混合物以确定药物与抗体的比率(DAR)、与抗体-探针缀合物相比离去基团副产物的面积百分比、与抗体-探针缀合物相比未缀合二聚体的面积百分比、以及与抗体-探针缀合物相比未缀合单体的面积百分比。

探针具有下式，其中波浪线指示接头的连接点：

所评估的探针-接头-离去基团化合物包括：

结果报告于下表1中，其中“DAR”是指药物-抗体比率，“％LG”是指离去基团副产物的百分比，“％未缀合二聚体”是指未缀合的抗体二聚体的百分比并且“％未缀合单体”是指未缀合的抗体二聚体的百分比。

表1

接头-离去基团	DAR	％LG	％未缀合二聚体	％未缀合单体
					二甲基/PDS	0.6	64	3	6
二甲基/5-硝基PDS	0.7	35	22	1
					二甲基/3-硝基PDS	0.2	69	18	2
二甲基/Ellman	0.2	89	2	1
					环丙基/5-硝基PDS	2	1	0	0
乙基/5-硝基PDS	2	1	0	0
					甲基/PDS	1.1	39	0	3
甲基/5-硝基PDS	1.4	27	1	1
					甲基/3-硝基PDS	2	2	0	0
甲基/Ellman	1.7	17	1	0

实施例3：赫赛汀K149C抗体-探针缀合物

评估了实施例2的探针化合物在实施例2的反应条件下通过二硫键与赫赛汀K149C的缀合。通过LC/MS分析反应产物混合物以确定药物与抗体比率(DAR)以及与抗体-探针缀合物相比离去基团副产物的面积百分比。结果报告于下表2中。

表2

接头-离去基团	DAR	％LG
			二甲基/PDS	0.3	84
二甲基/5-硝基PDS	0.6	68
			二甲基/3-硝基PDS	0.2	92
二甲基/Ellman	0.2	91
			环丙基/5-硝基PDS	2	0.4
乙基/5-硝基PDS	2	0.3
			甲基/PDS	0.7	62
甲基/5-硝基PDS	1.6	20
			甲基/3-硝基PDS	1.8	9
甲基/Ellman	1.8	9

实施例4：赫赛汀A118C ADC

包含接头和5-硝基PDS硫醇离去基团的各种药物化合物通过二硫键与赫赛汀24D5 HC A118C抗体缀合。在每次缀合中，溶剂体系中的5mg/mL抗体与药物-接头-离去基团化合物接触，其中药物-接头-离去基团化合物与抗体的当量比率为3:1。溶剂体系包括75mMTris(pH 8.5)。缀合反应在室温下进行3小时。通过LC/MS分析反应产物混合物以确定药物与抗体比率(DAR)以及与抗体-探针缀合物相比离去基团副产物的面积百分比。

药物具有下式，其中波浪线指示接头的连接点：

所评估的药物-接头-离去基团化合物包括以下，其中“D”表示药物：

结果报告于下表3中。

表3

实施例5：xCD22K149C ADC

在第一评估中，包含甲磺酸根离去基团(MTS)(接头1)的接头-药物化合物通过二硫键与xCD22K149C抗体缀合。在第二评估中，在第二评估中将包含MTS离去基团(接头2)的接头-药物化合物与抗体缀合。在每次缀合中，使溶剂体系中的5mg/mL抗体与药物-接头-离去基团化合物接触，其中探针化合物与抗体的当量比率为3:1。溶剂体系包括75mM Tris(pH8.5)。缀合反应在室温下进行3小时。接头1和2例示如下：

通过LC/MS分析反应产物混合物以确定药物与抗体比率(DAR)以及与抗体-探针缀合物相比离去基团副产物的面积百分比。对于接头1，药物与抗体的比率为2.0，抗体-药物缀合物的面积百分比为约91％，未缀合抗体的面积百分比小于0.1％，并且MTS副产物的面积百分比为约0.5％。对于接头2，药物与抗体的比率为1.5，抗体-药物缀合物的面积百分比为约91％，未缀合抗体的面积百分比小于0.1％，并且MTS副产物的面积百分比为约0.5％。

实施例6：PBD单体二硫化物前药对KPL-4和WSU-DLCL2细胞系的毒性

评估了PBD单体二硫化物前药和心肌黄酶前药对KPL-4、WSU-DLCL2、HCT-116、HCC1395和Jurkat细胞培养物的毒性。KPL-4(乳腺癌细胞系)表达Her2并且表现出约12至约24mM的高GSH水平。KPL-4细胞还具有大约839nRPKM的高DTD表达(其中nRPKM是指每百万绘制读段的每Kb转录物长度的标准化读段)。WSU-DLCL2(非霍奇金氏淋巴瘤细胞系)表现出约1.4mM的低GSH水平和约1.4nRPKM的低DTD表达。

二硫化物和DT-心肌黄酶前药的效力通过使用以下方案的细胞增殖测定(CELLTITER GLO^TM Luminescent Cell Viability Assay,Promega Corp.)测量。首先，将40ul的在RPMI-1640培养基(补充有10％胎牛血清、2mM谷氨酰胺、50uM胱氨酸和0.015g/LL-甲硫氨酸)中的含有约8000个细胞的WSU-DLCL2细胞(低NQO1基因和GSH水平)、4000个KPL-4细胞(高NQO1基因和GSH水平)、HCT-116细胞、HCC1395细胞或Jurkat细胞的细胞培养物的等分试样沉积在384孔平底透明白色聚苯乙烯组织培养处理的微孔板(Corning,NY)的每个孔中。其次，制备含有具有和不具有细胞的培养基的对照孔。第三，利用1:3x系列稀释液一式三份使用ECHO声波移液技术(LabcyteInc,Sunnyvale,CA)将具有和不具有二硫化物或DT-心肌黄酶前药的化合物(n＝3)添加至实验孔中，以产生10点剂量-反应曲线。第四，将细胞在设定为37℃的潮湿培养箱中培养并保持5％CO₂的气氛。第五，将板平衡至室温，持续大约30分钟。第六，添加一定体积的CELLTITER GLO^TM试剂，其等于每个孔中存在的细胞培养基的体积。第七，将内容物在轨道振荡器上在黑暗中混合10分钟以诱导细胞裂解。第八，将板在室温下孵育30分钟以稳定发光信号。第九，记录发光并在图中报告为％活性，其中RLU(相对发光单位)针对对照(无化合物对照减去无细胞对照)标准化。第十，将每种抗体的每个重复(n＝3)的数据绘制为单独点，作为每组重复的发光平均值，具有标准偏差误差条。

IC₅₀效力结果呈现于下表4中，以nM表示，其中括号中的数据代表重复评估的IC₅₀结果：

表4

PBD单体对照1和PBD单体二硫化物前药1至4针对KPL-4的结果描绘于图1中并且PBD单体对照1和PBD单体二硫化物前药1至4针对WSU-DLCL2的结果描绘于图2中，其中每个图是活性[％]相对于以摩尔每升计的前药浓度的对数的图。活性[％]以负值表示，是指细胞活力的降低。例如，-50的活性[％]是指细胞活力降低50％。除了前药4，对于KPL-4，对于前药1至3，母体化合物与具有最大IC₅₀的前药(前药2)的比率为约1.5。除了前药4，对于WSU-DLDL2，对于前药1至3，母体化合物与具有最大IC₅₀的前药(前药2)的比率为约9.6。在高GSH细胞系(KPL-4)和低GSH细胞系(WSU-DLCL2)中均观察到差异性的二硫化物前药活化。与WSU-DLCL2细胞系相比，对于KPL-4细胞系，观察到较少差异。

除了效力评估之外，还评估了PBD二聚体心肌黄酶前药1的释放。根据以下方法，在90分钟孵育后，释放被测量为12％。首先，在96孔聚丙烯板中制备含有0.5uM的PBD前药、50uM PBD、200mM NADPH的主混合反应液，淬灭并用40uL的0.1％甲酸稀释。其次，将反应混合物在室温下孵育5、30、90min。第三，在96孔聚丙烯板中利用1:2.5x系列稀释液一式三份使用ECHO声波移液技术(Labcyte Inc,Sunnyvale,CA)在0.1％甲酸中制备在DMSO中的标准品，以产生10点剂量-反应曲线。第四，将10uL的样品和标准品注入与Waters液相色谱相结合的AB SCIEX6500质谱仪中。所用的LC梯度为Phenomenex Kinetex C18，1.7μm，100×2.1mm柱，流动相A(在水中的0.1％甲酸)和B(在乙腈中的0.1％甲酸)为0-0.5min 5％B、1-1.10min 70-95％B、2.49-2.5min 95％B、2.5-3.0min95-5％B，流速为0.8mL/min(柱温为30℃)。保留时间为1.06min。MS中的多反应监测(MRM)转换为(585/257.0)和(585/504.2)。MRM(585/257.0)的化合物依赖性MS参数分别为51、20、206和10的CE、CXP、DP和EP，MRM(585/504.2)的所述参数分别为27、12、206和10的CE、CXP、DP和EP。最后，使用MultiQuant分析软件分析数据，并使用GraphPad Prism 6线性回归拟合计算标准。

实施例7：PBD单体二硫化物前药对SK-BR-3细胞系的毒性

评估了PBD单体二硫化物前药1至4、PBD二聚体二硫化物前药1和4、PBD单体对照1和PBD二聚体对照1对SK-BR-3细胞培养物的毒性。SK-BR-3细胞系是乳腺癌细胞，其过表达HER2并且表现出约3至约10mM的GSH水平。在通过序列分析验证后，在Genentech内部获得HER2阳性乳腺癌细胞系SK-BR-3。使细胞在37摄氏度下在补充有2mM L-谷氨酰胺的DMEM+10％FBS中生长，持续该测定的持续时间。在实验的第一天，命名为“第-1天(Day-1)”，从组织培养瓶中收获SK-BR-3细胞，计数，然后以每孔7,500个细胞的浓度接种到96孔板中。第二天，命名为“第0天”，将细胞培养基从细胞中除去，并用100uL的含有下表5中的化合物的系列稀释液(1:3)的新鲜培养基替换。然后将板放回37摄氏度培养箱中并使其孵育3天。在测定的“第3天”，将板从培养箱中取出并使其平衡至室温，然后添加100uL的室温CellTiter-Glo试剂(Promega)。然后将板以300rpm搅拌10分钟。将由该反应生成的发光信号记录在Envision酶标仪(Perkin-Elmer)上。将数据排列在Excel(Microsoft)中并在Kaleidagraph(Synergy Software)中作图。

IC₅₀效力结果呈现于下表5中：

表5

PBD剂	<![CDATA[SK-BR-3IC<sub>50</sub>(nM)]]>
		PBD单体对照1	124
PBD单体二硫化物前药1	331
		PBD单体二硫化物前药3	616
PBD单体二硫化物前药2	1757
		PBD单体二硫化物前药4	>10,000
PBD二聚体对照1	0.144
		PBD二聚体二硫化物前药1	2.39
PBD二聚体二硫化物前药4	3.09

SK-BR-3的结果描绘于图3和10中，其中图是细胞活力(对照的％)相对于PBD化合物浓度(nM)的图。基于所述结果，据信体积更大的二硫化物前药部分具有降低的效力。此外，基于迄今为止的实验结果，据信效力与二硫化物稳定性相关。

实施例8：PBD单体和二聚体前药的全血稳定性

评估了本发明的各种PBD单体和PBD二聚体前药的全血稳定性。

如下制备全血稳定性样品。在小鼠(CB17SCID)、大鼠(Sprague-Dawley)、食蟹猴(Cynomologus Monkey)和人全血血浆以及缓冲液(0和24小时)中生成稳定性样品。通过Bioreclamation收集血液，然后冷运输过夜，并在全血到达时立即产生样品。为了产生稳定性样品，在缓冲液(1X PBS、0.5％BSA、15PPM Proclin)中制备源材料的初始稀释液，使得所有分子的浓度均为1mg/mL。然后进行1:10x稀释(36uL的1mg/mL初始稀释+324uL血液或缓冲液)以产生终浓度为100ug/mL的稳定性样品。一旦混合，即将150μL的全血/缓冲液稳定性样品等分到两个单独组的管中，以用于两个不同的时间点。然后将0小时时间点置于-80℃冷冻机中，而将24小时时间点置于37℃培养箱中的振荡器上。当24小时样品达到给定时间点时，也将它们置于-80℃冷冻机中。

通过亲和捕获LC-MS测定评估全血稳定性样品。首先，将链霉抗生物素蛋白包被的磁珠粒(Life Technologies Corporation,Grand Island,NY)用HBS-EP缓冲液(GEHealthcare,Sunnyvale,CA)洗涤2x，然后使用KingFisher Flex(Thermo FisherScientific,Waltham,MA)与生物素化的CD22抗独特型抗体混合并在室温、温和搅拌下孵育2小时。2小时后，将SA-珠粒/生物素-xId Ab复合物用HBS-EP缓冲液洗涤2x，与稀释的全血稳定性样品混合，然后在室温、温和搅拌下孵育2小时。2小时后，将SA-珠粒/生物素-xIdAb/样品复合物用HBS-EP缓冲液洗涤2x，与去糖基化酶PNGase F(New England BioLabs,Ipswich,MA)混合，然后在37℃、温和搅拌下孵育过夜。过夜孵育后，将去糖基化的SA-珠粒/生物素-xId Ab/样品复合物用HBS-EP缓冲液洗涤2x，然后用水(Optima H₂O,FisherScientific,Pittsburgh,PA)洗涤2x，最后用10％乙腈洗涤1x。然后将珠粒置于30％乙腈/0.1％甲酸中进行洗脱，其中将它们在室温、温和搅拌下孵育30min，然后收集珠粒。将洗脱的样品注入并上样到保持在65℃的Thermo Scientific PepSwift RP整体柱(500μm×5cm)上。使用Waters Acquity UPLC系统以20μL/min的流速在柱上分离样品，使用以下梯度：20％B(95％乙腈+0.1％甲酸)，0-2min；35％B，2.5min；65％B，5min；95％B，5.5min；5％B，6min。该柱与Waters Synapt G2-S Q-ToF质谱结合以用于在线检测，所述质谱以正ESI操作，采集质量数范围为500至5000Th(m/z)。

在人和大鼠中以4小时和24小时的间隔评估了PBD单体二硫化物前药2至6、8、10和13以及PBD单体对照1的体外全血稳定性。结果在图4中作为相对于时间0剩余母体化合物的百分比而呈现。

在小鼠、大鼠、食蟹猴和人中评估了PBD二聚体ADC硼酸前药1，PBD二聚体ADC心肌黄酶前药1B，以及PBD二聚体ADC二硫化物前药1、2A、2B和3至5的体外全血稳定性并且结果呈现于下表6中，其中“DAR”是指药物与抗体的比率，“Δ％DAR2”是指相对于0小时时的缓冲液在24小时时的ΔDAR2，并且“前药损失”是指相对于0小时时的缓冲液在24小时时的前药损失。

表6：

实施例9：PBD单体二硫化物前药和PBD二聚体二硫化物前药对各种细胞系的毒性

对UACC-257、Igrov-1和A2058细胞系评估了各种PBD单体二硫化物前药和PBD二聚体二硫化物前药的毒性。将细胞接种在384孔板中并且24小时后用药物处理。在药物孵育4天后，使用Promega CellTiter-Glo发光试剂确定细胞活力，其测量ATP水平(细胞数目的间接度量)。在PerkinElmer Envision读取器上测量发光强度。通过标准化为非药物处理对照来计算相对细胞活力，并使用KleidaGraph软件包绘图。IC₅₀值被确定为获得最大细胞杀伤的50％的浓度。

IC₅₀结果呈现于下表7A：

表7A

PBD剂	UACC-257	Igrov-1	A2058
				PBD单体对照1	181.4	68.5	56.9
PBD单体对照2	>20,000	>20,000	>20,000
				PBD单体二硫化物前药1	275.7	122.8	82.9
PBD单体二硫化物前药2	1858.8	1871.8	635.2
				PBD单体二硫化物前药3	356.0	253.9	75.2
PBD单体二硫化物前药4	19164.1	12640.1	8109.9
				PBD单体二硫化物前药5	892.1	765.1	395.3
PBD单体二硫化物前药6	497.4	3262.3	566.6
				PBD单体二硫化物前药7	>30,000	>30,000	10956
PBD单体二硫化物前药8	194.1	171.8	47.2
				PBD单体二硫化物前药9	2109.1	1046.9	291.8
PBD单体二硫化物前药10	4732.3	4807.6	1827.9
				PBD单体二硫化物前药11	331.1	206.7	108.3
PBD单体二硫化物前药12	155.8	83.6	31.1
				PBD单体二硫化物前药13	>10,000	>10,000	>10,000
PBD单体二硫化物前药15	1500.2	928.2	304.2
				PBD单体二硫化物前药16	19460.1	18509.1	5593.4
PBD单体二硫化物前药19	147.3	77.4	37.7
				PBD单体二硫化物前药22	80.6	39.8	23.7
PBD单体二硫化物前药23	866.2	687.2	206.3
				PBD单体二硫化物前药24	2694.2	1479.9	596.1
PBD单体二硫化物前药25	241.6	129.4	47.7
				PBD单体二硫化物前药26	328.3	245.8	84.5
PBD单体二硫化物前药27	939.1	957.9	261.2
				PBD单体二硫化物前药28	2102.2	2304.1	920.1
PBD单体二硫化物前药29	142.1	57.8	29.1
				PBD单体二硫化物前药30	307.6	234.8	107.6
PBD二聚体对照1(在GSH细胞组中)	0.95	0.061	----
				PBD二聚体二硫化物前药1	2.2	0.21	----
PBD二聚体二硫化物前药4	7.8	2.5	----

应注意，可以计算每种前药与相应对照相比的IC₅₀比率。例如，对于细胞系UACC-257和IGROV-1，PBD二聚体二硫化物前药1的IC₅₀比率分别为2.3和3.4，计算如下：(PBD二聚体二硫化物前药1UACC-257IC₅₀ 2.2)/(PBD二聚体对照1UACC-257IC₅₀ 0.95)＝比率2.3)；并且(PBD二聚体二硫化物前药1IGROV-1IC₅₀ 0.21)/(PBD二聚体对照1IGROV-1IC₅₀ 0.061)＝比率3.4)。

在标准细胞组中针对多种细胞系对PBD二聚体对照1和PBD二聚体对照2进行进一步评估。IC50结果报告于下表7B中。

表7B：

细胞系	PBD二聚体对照1	PBD二聚体对照2
			MES-SA	0.028	10.0
MES-SA/Dx5	0.56	>100
			BJAB	0.015	4.9
BJAB/Pgp	----	53.7
			KPL-4	0.053	67.4
HCC1569X2	0.097	----
			T-47D	0.032	----
HCC1937	0.15	----
			NCI-H1781	0.011	----
SW 900	0.078	----
			MDA-MB-231	----	73.2
HCT 116	----	15.0
			A2058	----	5.3
DLD-1	----	>100
			HL-60	----	2.4

针对SK-BR-3的PBD单体二硫化物前药2、3、5、6，PBD二聚体二硫化物前药1至3，PBD单体对照1和PBD二聚体对照1的结果描绘于图5中并且针对KPL-4的结果描绘于图6中，其中每个图是细胞活力(对照的％)相对于PBD化合物浓度(μg/mL)的图。在高GSH细胞系(KPL-4)和低GSH细胞系(WSU-DLCL2)中均观察到差异性的二硫化物前药活化。与WSU-DLCL2细胞系相比，对于KPL-4细胞系，观察到较少差异。

PBD二聚体对照1针对UACC-257和IGROV-1细胞系的结果描绘于图7中。PBD二聚体二硫化物前药化合物1针对UACC-257和IGROV-1细胞系的结果描述于图8中。PBD二聚体二硫化物前药化合物4针对UACC-257和IGROV-1细胞系的结果描述于图9中。

实施例10：PBD二聚体二硫化物前药-抗体缀合物对SK-BR-3和KPL-4细胞系的毒性

评估了各种PBD二聚体ADC二硫化物前药、PBD二聚体ADC心肌黄酶前药和非前药PBD二聚体ADC对照对KPL-4和SK-BR-3细胞培养物的毒性。将细胞涂板于黑壁96孔板中(对于SK-BR-3，每孔4000个；对于KPL-4，每孔1200个细胞)并使其在37℃下在5％CO₂的潮湿气氛中贴附过夜。然后除去培养基并用含有不同浓度ADC的新鲜培养基替换。5天后，将CellTiter-Glo试剂添加到孔中，在室温下持续10min，并使用PerkinElmer EnVision测量发光信号。

IC₅₀结果呈现于下表8中：

表8

针对SK-BR-3的PBD二聚体ADC二硫化物前药2A、PBD二聚体ADC二硫化物前药1B、非前药PBD二聚体ADC对照1和非前药PBD二聚体ADC对照2的结果描绘于图11中并且针对KPL-4的结果描绘于图12中，其中每个图是5天后的细胞活力(对照的％)相对于PBD化合物浓度(μg/mL)的图。在HER2细胞系中观察到HER2缀合物对二硫化物前药的差异性活化。

实施例11：PBD二聚体二硫化物前药-抗体缀合物对SK-BR-3和KPL-4细胞系的毒性

针对5天后的细胞活力，评估了PBD二聚体ADC二硫化物前药1、2B、3和4以及非前药PBD二聚体ADC对照1和2对SK-BR-3和KPL-4细胞系的毒性。将细胞涂板于黑壁96孔板中(对于SK-BR-3，每孔4000个；对于KPL-4，每孔1200个细胞)并使其在37℃下在5％CO₂的潮湿气氛中贴附过夜。然后除去培养基并用含有不同浓度ADC的新鲜培养基替换。5天后，将CellTiter-Glo试剂添加到孔中，在室温下持续10min，并使用PerkinElmer EnVision测量发光信号。

结果报告于图13和14中。

实施例12：PBD二聚体-抗体缀合物二硫化物前药的全血稳定性

PBD二聚体ADC二硫化物前药1和2B的稳定性在缓冲液(“缓冲液”)、食蟹猴全血(“食蟹猴WB”)、人全血(“人WB”)、小鼠全血(“小鼠WB”)以及大鼠全血(“大鼠WB”)中进行评估。实验方案描述于实施例8中。结果报告于下表9中，其中百分比损失是指与时间0时的前药浓度相比前药的总损失。前药的损失包括亚胺形式(即，与N10前药取代点相邻的C11处的羟基部分)的损失。

表9

实施例13：ROS活化的PBD二聚体-抗体缀合物芳基硼酸前药的毒性

针对细胞毒性评估了各种PBD单体和二聚体硼酸前药化合物的毒性。在体外肿瘤细胞杀伤测定中，将细胞以每孔8,000个细胞添加到96孔微量滴定板的每个孔中，并在37℃下在5％CO₂的潮湿气氛中孵育过夜。将细胞暴露于各种浓度的指定前药、阳性对照和阴性对照化合物。在评估silvestrol的情况下，使用1:3系列稀释液。孵育3天后，将Cell titer-Glo试剂(Promega,Madison WI)以每孔100μL添加到孔中，然后在室温下孵育10分钟，并且使用Packard/Perkin-Elmer TopCount测量发光信号。

针对细胞活力，评估了PBD二聚体ADC硼酸前药1A和1B对WSU-DLCL和BJAB肿瘤细胞系的毒性。PBD二聚体ADC硼酸对照1A用作阴性对照并且PBD二聚体ADC硼酸对照2用作阳性对照。结果作为相对于剂量(μg/mL)的相比于时间0时的细胞数目的3天后的活细胞标准化百分比报告于图15A、15B和16中。PBD二聚体ADC硼酸前药1A提供1.701nM的EC₅₀并且非前药PBD二聚体ADC对照2提供0.0236nM的EC₅₀。PBD二聚体ADC硼酸前药1A提供0.0509nM的EC₅₀，PBD二聚体ADC硼酸前药1B提供15.86nM的EC₅₀，并且PBD二聚体ADC硼酸对照2提供0.0274的EC₅₀。

针对细胞活力，评估了PBD单体硼酸前药1对MDA-MB-453肿瘤细胞系的毒性。PBD单体对照1用作阳性对照并且PBD单体对照2用作阴性对照。重复毒性研究，其中PBD前药和对照与silvestrol组合施用。图15C描绘了暴露于以下各项后3天MDA-MB-453细胞杀伤相对于药物浓度(μM)的图：(i)PBD单体对照；(ii)在N10PBD位置处具有甲酸苄酯部分的PBD单体对照；以及(iii)PBD单体硼酸前药。图15D描绘了暴露于以下各项后3天MDA-MB-453细胞杀伤相对于药物浓度(μM)的图：(i)silvestrol；(ii)PBD单体对照；(iii)在N10PBD位置处具有甲酸苄酯部分的PBD单体对照；(iv)PBD单体硼酸前药；(v)PBD单体对照和silvestrol；(vi)在N10PBD位置处具有甲酸苄酯部分的PBD单体对照和silvestrol；以及(vii)PBD单体硼酸前药和silvestrol。PBD单体对照1提供0.1635nM的EC₅₀，PBD单体硼酸前药1提供1.846nM的EC₅₀，并且PBD单体前药2提供267,356nM的EC₅₀。

结果表明相对于阴性对照，ROS芳基硼酸前药提供增加的细胞杀伤。

实施例14：抗CD22和抗Her2抗体药物缀合物的功效

在BJAB-luc人伯基特淋巴瘤的小鼠异种移植模型中研究抗CD22抗体-药物缀合物(ADC)的功效。BJAB-luc细胞系获自Genentech细胞系库。此细胞系使用Promega PowerPlex16系统通过短串联重复序列(STR)图谱化(short tandem repeat(STR)profiling)进行鉴别并与细胞系的外部STR图谱相比较以确定细胞系祖先。BJAB-luc细胞系表达CD22，如通过FACS和IHC所确定的。为了建立异种移植模型，将雌性C.B-17SCID小鼠(Charles RiverLaboratories)各自在侧腹区域中皮下接种BJAB-luc细胞(悬浮在0.2mL Hank’s平衡盐溶液(Invitrogen)中的2000万个细胞)。

在KPL4人乳腺癌的小鼠异种移植模型中研究抗Her2抗体-药物缀合物(ADC)的功效。KPL4细胞系获自Dr.J.Kurebayashi实验室(日本)，并且此细胞系表达HER2，如通过FACS和IHC所确定的。为了建立异种移植模型，将雌性C.B-17SCID-beige小鼠(Charles RiverLaboratories)各自在胸乳房脂垫区域中接种KPL4细胞(悬浮在0.2mL的Hank’s平衡盐溶液(Invitrogen)和基质凝胶(Matrigel)(BD Biosciences)的1:1混合物中的300万个细胞)。KPL4异种移植物是诱导恶病质的模型，其中动物响应于肿瘤本身而损失其初始体重的约5％。抗Her2ADC的施用减弱了这种肿瘤相关的体重减轻，并且在动物中具有良好的耐受性。

当肿瘤达到100-300mm³的平均肿瘤体积时，将动物随机分成各自5-10只小鼠的组，并接受ADC的单次静脉内注射(称为第0天)。在如图23和24所描绘的第一评估中，用媒介物(组氨酸缓冲液#8，100μL IV一次)、非前药PBD二聚体ADC对照2(0.1mg/kg和0.2mg/kg IV一次)、PBD二聚体ADC硼酸前药1A(0.2、0.5、1、2和5mg/kg IV一次)、PBD二聚体ADC硼酸对照1A(1mg/kg IV一次)、PBD二聚体ADC硼酸前药1B(1mg/kg IV一次)以及非前药PBD二聚体ADC对照3(0.2和1mg/kg IV一次)处理小鼠。在图25和26所描绘的第二评估中，用媒介物(组氨酸缓冲液#8，100μL IV一次)、非前药PBD二聚体ADC对照1(0.3、1和3mg/kg IV一次)以及PBD二聚体ADC二硫化物前药1B(1、3、6和10mg/kg IV一次)处理小鼠。在整个研究中，一周1-2次测量小鼠的肿瘤和体重。当体重减轻＞其起始体重的20％时，立即对小鼠实施安乐死。在肿瘤达到3000mm³或显示出即将发生溃疡的迹象之前对所有动物实施安乐死。使用卡尺在两个维度(长度和宽度)上测量肿瘤体积，并使用下式计算肿瘤体积：肿瘤大小(mm3)＝0.5x(长度x宽度x宽度)。

结果呈现于图23至26中。

图23示出抗CD22ADC在具有BJAB-luc人伯基特淋巴瘤的C.B-17SCID小鼠中的功效。所评估的最高剂量(0.2mg/kg)的非前药PBD二聚体ADC对照2仅导致中等的肿瘤生长延迟。相比之下，PBD二聚体ADC硼酸前药1A非常有效并且在低至0.2mg/kg的剂量下推动肿瘤消退。PBD二聚体ADC硼酸对照1未显示出对肿瘤生长的任何影响。PBD二聚体ADC硼酸前药1A和非前药PBD二聚体ADC对照3缀合物具有一些抗肿瘤活性；然而，在匹配的剂量水平下抗CD22缀合物的活性更优异。

图24示出抗CD22ADC(1)非前药PBD二聚体ADC对照2、(2)PBD二聚体ADC硼酸前药1A和(3)PBD二聚体ADC硼酸对照1对具有BJAB-luc人伯基特淋巴瘤的C.B-17SCID小鼠的体重的影响。抗CD22ADC的施用在没有观察到体重减轻的动物中具有良好的耐受性。

图25示出抗Her2ADC在具有KPL-4人乳腺肿瘤的C.B-17SCID-beige小鼠中的功效。非前药PBD二聚体ADC对照1展示出肿瘤生长的剂量依赖性抑制以及在1mg/kg或更高下的肿瘤消退。类似地，PBD二聚体ADC二硫化物前药1也显示出剂量依赖性功效以及在6mg/kg或更高下的肿瘤消退。

图26示出非前药PBD二聚体ADC对照1和PBD二聚体ADC二硫化物前药1(抗Her2ADC)对具有KPL4人乳腺肿瘤的C.B-17SCID-beige的体重的影响。KPL4异种移植物是诱导恶病质的模型，其中动物响应于肿瘤本身而损失其初始体重的约5％。抗Her2ADC的施用减弱了这种肿瘤相关的体重减轻，并且在动物中具有良好的耐受性。

实施例15：DTD活化的PBD单体和二聚体醌前药的毒性

针对细胞活力，评估了PBD二聚体心肌黄酶前药1、PBD单体心肌黄酶前药2、PBD二聚体对照1和PBD单体对照1对KPL-4和WSU细胞系的毒性。KPL-4细胞系是由839的NQO1nRPKM表征的高DTD细胞系，并且WSU细胞系是由1.36的NQO1nRPKM表征的低DTD细胞系。IC₅₀比率基于相对于PBD二聚体对照的前药IC₅₀值。

结果在下文报告于表10和图17至20中。

表10

实施例16：DTD活化的PBD单体和二聚体醌前药的毒性

针对细胞活力，评估了PBD二聚体ADC心肌黄酶前药1A和1B以及非前药PBD二聚体ADC对照5对KPL-4和SK-BR-3细胞系的毒性。KPL-4细胞系是由839的NQO1nRPKM表征的高DTD细胞系，并且SK-BR03细胞系是由171的NQO1nRPKM表征的低DTD细胞系。结果在下文报告于图21和22中。

实施例17：二硫化物切割和PBD类似物的DNA寡核苷酸结合

评估了本公开的各种前药二硫化物化合物在暴露于半胱氨酸和谷胱甘肽(GSH)24小时后的切割，并评估了PBD类似物的DNA结合。

对于二硫化物切割确定，将化合物在15μM下与0.2mM半胱氨酸或4mM GSH一起在含有5％甲醇的100mM Tris缓冲液(pH 7.0)中在37℃下孵育。在指定时间点取等分试样，并在Hypersil Gold C18柱(100x2.1，1.9μM，Thermo Scientific)上在Sciex TripleTOF 5600上通过LC/MS分析样品。在0.4mL/min下通过缓冲液A(在10mM乙酸铵中的0.1％甲酸)至缓冲液B(在90％乙腈中的10mM乙酸铵中的0.1％甲酸)的梯度将柱洗脱，5％B 0-0.5min，5-25％B 0.5-8min，25-75％B 8-13min，以及75-95％B 13-13.5min，95％B 13.5-14.5min，95-5％B 14.5-15min。将所有产物分离并通过正ESI离子模式的LC/MS/MS表征。所有分析物均具有作为主要物质的质子化分子MH+，以及很少的源片段。全扫描精确质量峰面积用于估计每种组分的相对丰度。

对于DNA结合确定，将化合物在100μM下与100μM双链DNA寡核苷酸1和2一起在10mMBis-Tris(pH 7.1)中在37℃下孵育1小时。在Genentech合成单链DNA寡核苷酸(5’-TATAGAATCTATA-3’和3’-ATATCTTAGATAT-5’)。在Hypersil Gold C18柱(100x2.1，1.9μM，Thermo Scientific)上在Sciex TripleTOF 5600上通过LC/MS/UV(210-450nm)分析样品。在0.4mL/min下通过缓冲液A(50mM六氟异丙醇和15mM二异丙基乙胺)至缓冲液B(50％A和50％的1:1甲醇:乙腈)的梯度将柱洗脱，5％0-0.5min，5-25％B 0.5-25min，25-95％B25-40min，以及95％B 40-42min。剩余％是在孵育中剩余的起始DNA寡核苷酸的平均值(n＝2)。通过负ESI离子模式的LC/MS表征产物。

结果报告于下表11中。

表11：

实施例18：GSH加合物的形成和醌的稳定性

评估了在暴露于GSH时本公开范围内的醌以及PBD单体和二聚体心肌黄酶前药的稳定性以及相关GSH加合物的形成。

对于降解分析，将化合物在25μM下与15mM GSH一起在含有5％甲醇的200mM Tris缓冲液(pH 7.0)中在37℃下孵育3小时。对照孵育在没有GSH的情况下进行。在HypersilGold C18柱(100x2.1，1.9μM，Thermo Scientific)上在Sciex TripleTOF 5600上通过LC/MS分析样品。在0.4mL/min下通过缓冲液A(在10mM乙酸铵中的0.1％甲酸)至缓冲液B(在90％乙腈中的10mM乙酸铵中的0.1％甲酸)的梯度将柱洗脱，5％B 0-0.5min，5-25％B 0.5-8min，25-75％B 8-13min，以及75-95％B 13-13.5min，95％B 13.5-14.5min，95-5％B14.5-15min。将所有产物分离并通过正ESI离子模式的LC/MS/MS表征。全扫描精确质量峰面积用于估计每种组分的相对丰度。

体外DT心肌黄酶激活的药物释放测定用于测量NADPH损耗。通过NADPH的体外损耗测量DT心肌黄酶激活的诺氟沙星和有效负载(PBD)释放。由于化合物的干扰，测定方法由在A340处的NADPH的吸光度测量(Osman等人,Chemico-Biological Interactions 147(2004)99-108)改进。通过监测在340nM下激发后在480nm处NADPH的荧光强度的降低来测量NADPH的损耗。材料和试剂如下：(1)牛血清白蛋白(BSA)：Sigma目录号A7030-50G(≥98％(琼脂糖凝胶电泳)，冻干粉末，基本上不含脂肪酸，基本上不含球蛋白；(2)测定缓冲液：50mM Tris-HCl/0.007％BSA缓冲液(pH 7.4)；(3)DT心肌黄酶制剂：将冻干的人DT心肌黄酶(Sigma目录号D1315，批号SLBJ9723V，MW＝32,253U/mg，1.6mg蛋白质/小瓶，在37℃下在甲萘醌底物的存在下一个单位将每分钟还原1微摩尔的细胞色素C)溶解于8.1ml H2O中，作为50U/0.2mg/ml(6.25uM蛋白质)，将等分试样储存于-20℃。在测定之前，将原液2.5倍稀释于测定缓冲液中，作为5X工作溶液(20U/mL，2.5uM，0.08ug/mL)；(4)β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH，还原的二钠盐水合物，Sigma，目录号N6505-5G，>＝94％(HPLC)：在测定缓冲液中制备48mM NADPH原液并储存于-20C。在测定之前，将原液稀释至1mM，作为5X工作溶液；(5)DT心肌黄酶特异性抑制剂：在0.13N NaOH中制备双香豆素(Sigma，目录号M1390-5G，MW＝336.29)的40mM原液，储存于4℃。将原液稀释至250uM，作为5X工作溶液；(6)化合物：将诺氟沙星和PBD缀合化合物在测定缓冲液中稀释至250uM，作为5X工作溶液；以及(7)具有透明底的384孔黑色板。对于测定程序：(1)将含有0.5uM DT-D、50uM化合物、200mM NADPH的反应混合物以50ul/孔置于384孔板中。对于具有DT心肌黄酶抑制剂的对照，在反应混合物中添加双香豆素，每种化合物最终50uM。还添加仅含有NADPH和化合物的反应混合物作为基线对照。DT心肌黄酶在最后一步添加；并且(2)将反应混合物在室温下孵育5、30、90min。在M1000酶标仪(Tecan)上记录DNAPH的荧光强度(RFU)，其中在340nM下激发且在480nM下发射。对于数据分析，分析数据并使用PrismGraphPad 6作图。通过下式计算在90min的反应时间点时的NADPH损耗，其中：％NADPH损耗＝[RFU_无抑制剂-(RFU_有抑制剂/RFU_无抑制剂)]*100。

结果报告于下表12中，其中：“剩余％”是指3小时后的剩余百分比；“降解(Degr)”是指降解；“有效负载释放(Pay.Rel)”是指基于2μM起始材料的有效负载释放(MRM Qunat)(相对于0小时在90-min时的回收率％)；并且“NADPH损耗(NADPH Dep.)”是指90分钟时的NADPH损耗。

表12：

实施例19：PBD单体二硫化物前药的制备

实施例19一般方案1

一般方案1的总体反应方案如下：

实施例19一般方案1步骤1：

在0℃下分两部分向化合物1(1.13kg，4.59mol，1.00当量)在THF(10L)中的溶液中添加LiBH₄(99.90g，4.59mol，1.00当量)(在LiBH₄的添加期间几乎没有温度变化)。将悬浮液在0℃下搅拌1h，然后在10-20℃下搅拌18h。将混合物冷却至0℃并添加NH₄Cl水溶液(5L)。将层分离并且用EA(5Lx3)萃取水层。将合并的有机物用盐水洗涤。将有机层经Na₂SO₄干燥，过滤并浓缩，以得到为透明油状物的化合物2(1600g，7.36mol，80.22％收率)。

实施例19一般方案1步骤2：

向50-L烧瓶中装入化合物2(1.60kg，7.36mol，1.00当量)、DCM(20L)，接着在0℃、搅拌下依次逐滴添加TEA(1.12kg，11.05mol，1.50当量)和乙酰氯(635.54g，8.10mol，1.10当量)。添加后，将所得溶液在15-25℃下搅拌18h，通过添加5L水淬灭并用3x2L的DCM萃取。将合并的有机层经无水硫酸钠干燥并真空浓缩，以得到为无色油状物的化合物3(2.46kg，9.49mol，128.90％收率)。

实施例19一般方案1步骤3：

向20L 3颈圆底烧瓶中装入在DCM(12L)中的化合物3(1.23kg，4.75mol，1.00当量)，然后在15℃下分几批添加PCC(1.54kg，7.13mol)。将所得溶液在15-25℃下搅拌18h。滤出固体并将滤液真空浓缩。将残余物在硅胶柱上用乙酸乙酯:石油醚(1:5)洗脱来纯化，以得到为浅黄色液体的化合物4(1.13kg，4.38mol，46.15％收率)。

实施例19一般方案1步骤4：

向10-L 3颈圆底烧瓶中装入甲基(三苯基)溴化膦(958.03g，2.68mol)、THF(2.5L)，然后在0℃下经2h分批添加t-BuOH(300.94g，2.68mol)。在0℃、搅拌下向其中逐滴添加化合物4(460.00g，1.79mol)在THF(2.5L)中的溶液。将所得溶液在-5～0℃下搅拌20min，通过添加500mL水淬灭并用3x500mL乙酸乙酯萃取。将合并的有机层经无水硫酸钠干燥并真空浓缩。将残余物在硅胶柱上用乙酸乙酯:石油醚(1:20)洗脱来纯化，以得到为浅黄色液体的化合物5(275.00g，1.08mol，30.09％)。

实施例19一般方案1步骤5：

将化合物5(330.00g，1.29mol)在HCl(气体)/EtOAc(3L，4M/L)中的混合物在0℃下搅拌20min。然后将混合物在10-30℃下搅拌1h。将混合物真空浓缩，以得到为黄色固体的化合物6(250.00g，1.30mol，101.12％)，其不经纯化用于下一步骤。

实施例19一般方案1步骤6：

向用氮气惰性气氛吹扫并维持的3000-mL 3颈圆底烧瓶中装入化合物7(354.42g，1.56mol，1.30当量)在THF(1.5L)中的溶液，然后在搅拌下逐滴添加SOCl₂(1.71kg，14.33mol，11.94当量)。将所得溶液在20-30℃下搅拌4h，然后真空浓缩。向用氮气惰性气氛吹扫并维持的另一个3000-mL 3颈圆底烧瓶中装入化合物6(230.00g，1.20mol，1.00当量)在DCM(2.5L)中的溶液。在-40℃、搅拌下向其中逐滴添加Et₃N(485.75g，4.80mol，4.00当量)，然后在-40℃下添加第一个烧瓶中的溶液。使温度自然升温至0℃，通过添加3000mL的水/冰淬灭，并用3x1000mL二氯甲烷萃取。将合并的有机层经无水硫酸钠干燥并真空浓缩。将残余物在硅胶柱上用EtOAc:PE(1:3)洗脱来纯化，以得到为浅棕色油状物的化合物8(210.00g)，其不经纯化用于下一步骤。

实施例19一般方案1步骤7：

在0℃下一次性向化合物8(90.00g，247.02mmol，1.00当量)在THF(400mL)、MeOH(100mL)、H2O(400mL)中的混合物中添加NaOH(29.64g，741.05mmol，3.00当量)。将混合物在20-30℃下搅拌18h。用EtOAc(300mLx3)萃取水相。将合并的有机相用饱和盐水(100mL)洗涤，用无水Na₂SO₄干燥，过滤并真空浓缩，以得到为黄色固体的化合物9(90.26g，粗制品)，其不经进一步纯化用于下一步骤。

实施例19一般方案1步骤8：

在配备有温度探针、磁力搅拌器和氮气入口的2000mL三颈圆底烧瓶中，添加TBDMSCl(126.62g，840.12mmol)、在DMF(1L)中的咪唑(57.20g，840.12mmol，3.00当量)。然后在0℃下向混合物中添加化合物9(90.26g，280.04mmol，1.00当量)在DMF(1L)中的溶液。将所得反应混合物在25-30℃下搅拌2h。将反应混合物倒入冰水(1L)中，然后用DCM(200mLx3)萃取。将合并的有机相用盐水(100mL)洗涤，经Na₂SO₄干燥并真空浓缩以得到残余物，以得到为黄色油状物的化合物10(126.00g)，其不经进一步纯化用于下一步骤。

实施例19一般方案1步骤9：

通过维持低于30℃的温度，向化合物10(126.00g，288.61mmol，1.00当量)在AcOH(1L)中的混合物中分批添加Zn(188.72g，2.89mol)。将混合物在20-30℃下搅拌30min。将残余物倒入EtOAc(500mL)中并过滤。将滤液真空浓缩。通过硅胶色谱(PE/EtOAc＝10/1、1/1)纯化残余物，以得到为黄色油状物的11(58.00g，142.64mmol，49％收率)。1H NMR(400MHz,氯仿-d)d ppm 6.71(s,1H)6.22(s,1H)4.85-4.97(m,2H)4.52(br.s.,1H)4.14-4.23(m,1H)3.99-4.13(m,1H)3.82(s,3H)3.77(s,3H)3.59(d,J＝5.73Hz,1H)2.63-2.72(m,2H)2.01-2.04(m,1H)1.23(t,J＝7.06Hz,1H)0.85(s,9H)-0.06-0.06(m,5H)。

如下的实施例19一般方案2是用于制备本公开的PBD二硫化物前药的一般方案：

结构C中和实施例19中描绘的其它地方的星号代表手性中心。在一些方面，以上方案中引用的R¹对应于如本文所述的R⁶¹，以上方案中引用的R²对应于如本文所述的R⁶²，并且以上方案中引用的R³对应于如本文所述的R⁵⁰。

实施例19A：PBD单体二硫化物前药10的制备

实施例19A一般程序IA-碳酸酯形成方法A：

将(2-氨基-4,5-二甲氧基-苯基)-[(2S)-2-[[叔丁基(二甲基)甲硅烷基]氧基甲基]-4-亚甲基-吡咯烷-1-基]甲酮(222mg，0.5460mmol)溶解于3mL的DCM中，然后通过移液管添加Et₃N，接着添加三光气。总共20min后，添加在2mL的DCM(包括0.5mL漂洗液)中的2-(叔丁基二硫烷基)-2-甲基-丙-1-醇(B，1.05当量，0.5733mmol，100质量％)，然后添加10uL的二乙酸二丁基锡(20μL，0.07487mmol)。约1.5h后，添加另外35uL(28mg)的二硫醇和8uL的二乙酸二丁基锡(2:57pm)并将反应液搅拌过夜。将反应液用EtOAc稀释，然后用1NHCl溶液洗涤。用饱和碳酸氢钠洗涤有机物。将有机层经硫酸钠干燥，然后浓缩。通过快速色谱法(25g硅胶，20％-30％-50％EtOPc/Hept)纯化残余物，以得到为无色油状物的期望的碳酸酯(227mg，67％收率)。

实施例19A一般程序II-通过HOAc除去TBS基团：

将[2-(叔丁基二硫烷基)-2-甲基-丙基]N-[2-[(2S)-2-[[叔丁基(二甲基)甲硅烷基]氧基甲基]-4-亚甲基-吡咯烷-1-羰基]-4,5-二甲氧基-苯基]氨基甲酸酯(200mg，0.319mmol)溶解于3mL的THF中，然后在室温下添加水(0.8mL)和乙酸(3.4mL)。反应完成后，添加碳酸钠以中和乙酸。将混合物用EtOAc萃取三次。将合并的EtOAc萃取物经硫酸钠干燥、浓缩，以得到粗醇(233mg)，其不经纯化用于下一步骤。

实施例19A一般程序III-DMP氧化和环化：

在室温下向在DCM(3.5mL)中的2-(异丙基二硫烷基)-2-甲基-丙基]N-[2-[(2S)-2-(羟甲基)-4-亚甲基-吡咯烷-1-羰基]-4,5-二甲氧基-苯基]氨基甲酸酯(99.2mg，0.199mmol，100质量％)中添加Dess-Martin高碘烷(86.1mg，0.203mmol，1.02当量)。将反应混合物用DCM稀释，然后用混合的饱和NaHCO₃(约3mL)和1M亚硫酸钠(约3mL)洗涤，经硫酸钠干燥，浓缩以得到约120mg粗制品(油状物)，通过反相HPLC将其纯化，以得到期望的碳酸酯(28.9mg)以及回收的醇起始材料(10.3mg)。LCMS:(5-95,AB,5min),RT＝2.69min,m/z＝497[M+1]+；1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ7.08(s,1H),6.82(s,1H),6.64(d,J＝6.0Hz,1H),5.49-5.33(m,1H),5.13(d,J＝7.3Hz,2H),4.21-4.05(m,2H),4.04-3.91(m,1H),3.81(s,4H),3.79-z3.72(m,1H),3.46(t,J＝9.3Hz,1H),3.31(s,3H),2.99-2.76(m,2H),2.63-2.51(m,1H),1.38-0.94(m,12H)。

实施例19B：PBD单体二硫化物前药4的制备

以与实施例19A相同的方式合成标题化合物，不同的是以下一般程序IB用于二硫化物形成。

实施例19B一般程序Ib-碳酸酯形成方法B：

将(2-氨基-4,5-二甲氧基-苯基)-[(2S)-2-[[叔丁基(二甲基)甲硅烷基]氧基甲基]-4-亚甲基-吡咯烷-1-基]甲酮(121mg，0.2976mmol)和N,N-二异丙胺(3当量，0.8928mmol)在3mL的THF中混合，然后在室温下添加(4-硝基苯基)氯甲酸酯(75mg，0.3720mmol)。将混合物加热至75℃。约1h 50min后，添加在1.5mL的THF中的2-(异丙基二硫烷基)-2-甲基-丙-1-醇(71mg，0.3938mmol)。将混合物在75℃下搅拌过夜，冷却至室温，在EtOAc中稀释，用1N HCl洗涤且接着用饱和碳酸氢钠洗涤。将溶液浓缩并且通过硅胶色谱(20％接着30％接着50％EtOAc/Hept)纯化所得的残余物，以得到二硫化物(34mg，19％收率)。

LCMS:(5-95,AB,5min),RT＝2.78min,m/z＝511[M+1]+；1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ7.08(s,1H),6.81(s,1H),6.63(d,J＝5.9Hz,1H),5.49-5.34(m,1H),5.13(d,J＝6.1Hz,2H),4.19-3.91(m,3H),3.81(s,3H),3.78-3.67(m,1H),3.46(t,J＝9.2Hz,1H),3.32(s,35H),2.96-2.82(m,1H),2.61-2.53(m,1H),1.18(s,9H),1.04(d,J＝3.7Hz,6H)。

实施例19C：PBD单体二硫化物前药15的制备

根据以下反应方案3制备PBD单体二硫化物前药15：

将三光气(116mg，0.39mmol)溶解于2mL的DCM中，然后添加(2R)-2-[(5-硝基-2-吡啶基)二硫烷基]丙-1-醇(277mg，1.125mmol)和吡啶(0.14mL，1.761mmol)在2mL的DCM中的溶液。30min后，将此溶液添加到(2-氨基-4,5-二甲氧基-苯基)-[(2S)-2-[[叔丁基(二甲基)甲硅烷基]氧基甲基]-4-亚甲基-吡咯烷-1-基]甲酮(410mg，0.978mmol，97质量％)在3mL的DCM(外加0.5mL漂洗液)中的溶液中。反应完成后，将混合物用EtOAc稀释，用1N HCl水溶液洗涤，接着用饱和碳酸氢钠洗涤。将有机物经硫酸钠干燥，浓缩。通过硅胶柱色谱(25g硅胶，30％接着40％接着50％EtOAc/Hept)纯化残余物，以得到[(2R)-2-[(5-硝基-2-吡啶基)二硫烷基]丙基]N-[2-[(2S)-2-[[叔丁基(二甲基)甲硅烷基]氧基甲基]-4-亚甲基-吡咯烷-1-羰基]-4,5-二甲氧基-苯基]氨基甲酸酯(480mg，72％收率)。

不使用任何溶剂通过注射器向在DMF(0.5mL)中的[(2R)-2-[(5-硝基-2-吡啶基)二硫烷基]丙基]N-[2-[(2S)-2-[[叔丁基(二甲基)甲硅烷基]氧基甲基]-4-亚甲基-吡咯烷-1-羰基]-4,5-二甲氧基-苯基]氨基甲酸酯(45mg，0.066mmol，100质量％)中添加丙烷-2-硫醇(40mg，0.53mmol)。将混合物在密封小瓶中加热至59℃。反应完成后，将混合物减压浓缩，与甲苯共沸(azotroped)一次。通过硅胶色谱(40g硅胶，20％-35％-50％EtOAc/Hept)纯化所得的残余物，以得到为黄色油状物的[(2R)-2-(异丙基二硫烷基)丙基]N-[2-[(2S)-2-[[叔丁基(二甲基)甲硅烷基]氧基甲基]-4-亚甲基-吡咯烷-1-羰基]-4,5-二甲氧基-苯基]氨基甲酸酯(134mg，89％收率)。

然后根据实施例19A的一般程序II和III制备PBD单体二硫化物前药15。

LCMS:(5-95,AB,5min),RT＝2.58min,m/z＝483[M+1]+；1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ7.07(s,1H),6.82(s,1H),6.63(d,J＝6.1Hz,1H),5.38(dd,J＝9.7,6.1Hz,1H),5.20-5.07(m,2H),4.20(dd,J＝11.1,6.1Hz,1H),4.15-4.05(m,1H),3.97(d,J＝15.4Hz,2H),3.80(s,6H),3.45(t,J＝9.3Hz,1H),3.10-2.82(m,3H),2.58-2.53(m,1H),1.18(t,J＝6.2Hz,7H),1.04(d,J＝6.9Hz,3H)。

实施例19D：PBD单体二硫化物前药13的制备

根据实施例19C的方法制备PBD单体二硫化物前药13。LCMS:(5-95,AB,5min),RT＝2.70min,m/z＝497[M+1]+；1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ7.07(s,1H),6.81(s,1H),6.65(d,J＝5.9Hz,1H),5.38(dd,J＝9.7,5.9Hz,1H),5.19-5.04(m,2H),4.20(dd,J＝11.2,5.9Hz,1H),4.10(d,J＝15.8Hz,1H),4.04-3.91(m,2H),3.80(s,6H),3.45(t,J＝9.3Hz,1H),3.04-2.82(m,2H),2.58-2.53(m,1H),1.23(s,9H),1.03(d,J＝6.9Hz,3H)。

实施例19E：PBD单体二硫化物前药2的制备

根据以下反应方案制备PBD单体二硫化物前药2：

在一些方面，R³对应于如本文其它地方所述的R⁵⁰。

将三光气(268mg，0.9046mmol，100质量％)溶解于烧瓶中的3mL DCM中，然后添加2-[(5-硝基-2-吡啶基)二硫烷基]乙醇(604mg，2.601mmol)在6mL的DCM中的溶液，然后添加纯吡啶(1.8当量，4.071mmol，100质量％)。30min后，将此溶液添加到(2-氨基-4,5-二甲氧基-苯基)-[(2S)-2-[[叔丁基(二甲基)甲硅烷基]氧基甲基]-4-亚甲基-吡咯烷-1-基]甲酮(948mg，2.262mmol)在5mL的DCM(外加0.8mL漂洗液)中的溶液中。约20min后，将混合物用EtOAc稀释，用1N HCl洗涤，接着用饱和碳酸氢钠洗涤。将有机物经硫酸钠干燥，浓缩并柱层析(40g硅胶，25％接着45％EtOAc/Hept)，以得到为黄色蓬松固体的氨基甲酸酯(1.07g，71％收率)。

将2-[(5-硝基-2-吡啶基)二硫烷基]乙基N-[2-[(2S)-2-[[叔丁基(二甲基)甲硅烷基]氧基甲基]-4-亚甲基-吡咯烷-1-羰基]-4,5-二甲氧基-苯基]氨基甲酸酯(1.067g，1.61mmol)溶解于THF中，然后添加水(1.5mL)，接着在室温下添加乙酸(8mL)。将混合物加热至55℃并搅拌过夜。将混合物冷却至室温后，添加碳酸钠以中和乙酸。将混合物用EtOAc萃取三次。将合并的EtOAc萃取物经硫酸钠干燥、浓缩，以得到粗醇(1.26g)，其不经纯化用于下一步骤。

在室温下向以上在DCM(16mL)中的醇(884mg，1.61mmol)中添加Dess-Martin高碘烷(715mg，1.685mmol)。约70min后，再添加105mg的D-M高碘烷。2.5h后，再添加76mg的D-M高碘烷。一旦所有起始材料消耗完，将混合物用DCM稀释，然后用混合的饱和NaHCO₃(约6mL)和1M亚硫酸钠(约6mL)洗涤，经硫酸钠干燥，减压浓缩。通过硅胶柱色谱(40g硅胶，50％接着80％接着100％EtOAc/Hept)纯化所得的残余物，以得到为黄色固体的2-[(5-硝基-2-吡啶基)二硫烷基]乙基(6S,6aR)-6,6a-二羟基-2,3-二甲氧基-8-亚甲基-11-氧代基-7,9-二氢-6H-吡咯并[2,1-c][1,4]苯并二氮杂-5-羧酸酯(765mg，84％收率)。

通过注射器向在0.2mL的DMSO中的2-[(5-硝基-2-吡啶基)二硫烷基]乙基(6aS)-6-羟基-2,3-二甲氧基-8-亚甲基-11-氧代基-6,6a,7,9-四氢吡咯并[2,1-c][1,4]苯并二氮杂-5-羧酸酯(63mg，0.115mmol)中添加丙烷-2-硫醇(0.5mL)，然后加热至59℃。反应完成后，将混合物冷却至室温，与EtOAc一起在旋转蒸发仪中共蒸发两次，以除去尽可能多的硫醇。通过反相HPLC纯化所得的残余物，以得到2-硫烷基乙基(6aS)-6-羟基-2,3-二甲氧基-8-亚甲基-11-氧代基-6,6a,7,9-四氢吡咯并[2,1-c][1,4]苯并二氮杂-5-羧酸酯(38.6mg)。

LCMS:(5-95,AB,5min),RT＝2.42min,m/z＝469[M+1]+；1HNMR(400MHz,DMSO-d6)δ7.06(s,1H),6.80(s,1H),6.62(s,1H),5.37(dd,J＝9.6,5.4Hz,1H),5.13(d,J＝7.0Hz,2H),4.37(dt,J＝12.2,6.3Hz,1H),4.14-3.93(m,4H),3.80(s,6H),3.45(t,J＝9.3Hz,1H),3.01-2.83(m,3H),1.23-1.16(m,6H)。

实施例19F：PBD单体二硫化物前药16的制备

根据实施例19E的方法制备PBD单体二硫化物前药16。LCMS:(5-95,AB,5min),RT＝2.56min,m/z＝483[M+1]+；1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ7.06(s,1H),6.79(s,1H),6.62(s,1H),5.37(dd,J＝9.7,5.9Hz,1H),5.16-5.09(m,2H),4.35(dt,J＝12.2,6.3Hz,1H),4.10(d,J＝16.0Hz,1H),3.98(d,J＝16.0Hz,2H),3.80(s,6H),3.44(t,J＝9.3Hz,1H),2.88(t,J＝12.6Hz,3H),2.54(s,1H),1.25(s,9H),0.08(s,1H)。

实施例19G：PBD单体二硫化物前药29的制备

根据实施例19E的方法制备PBD单体二硫化物前药29。LCMS:(5-95,AB,5min),RT＝1.72min,m/z＝471[M+1]+；1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ7.06(s,1H),6.79(d,J＝4.9Hz,1H),6.62(s,1H),5.37(dd,J＝9.7,5.8Hz,1H),5.13(d,J＝7.0Hz,2H),4.88-4.80(m,1H),4.45-4.34(m,1H),4.14-4.05(m,1H),4.02-3.93(m,1H),3.80(s,6H),3.79-3.78(m,1H),3.60(dq,J＝14.2,6.5Hz,2H),3.49-3.40(m,1H),2.94-2.69(m,4H),2.54(s,1H)。

实施例19H：PBD单体二硫化物前药28的制备

根据实施例19D的方法制备PBD单体二硫化物前药28。LCMS:(5-95,AB,5min),RT＝2.68min,m/z＝495[M+1]+；1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ7.06(s,1H),6.80(s,1H),6.62(s,1H),5.37(dd,J＝9.7,5.8Hz,1H),5.13(d,J＝6.8Hz,2H),4.44-4.33(m,1H),4.15-4.05(m,1H),4.02-3.93(m,1H),3.81(s,6H),3.44(t,J＝9.1Hz,1H),2.88(d,J＝7.8Hz,3H),2.55(dt,J＝5.7,2.5Hz,2H),2.48-2.42(m,1H),1.89(d,J＝8.4Hz,2H),1.64(s,2H),1.53(s,4H)。

实施例19I：PBD单体二硫化物前药27的制备

根据实施例19E的方法制备PBD单体二硫化物前药27。LCMS:(5-95,AB,5min),RT＝1.83min,m/z＝499[M+1]+；1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ7.06(s,1H),6.80(s,1H),5.37(d,J＝9.7Hz,1H),5.16-5.09(m,2H),4.45-4.34(m,1H),4.16-3.93(m,2H),3.80(s,6H),3.44(t,J＝9.2Hz,1H),3.05-2.79(m,5H),2.65-2.50(m,1H),2.46(s,1H),2.07(s,3H)。

实施例19J：PBD单体二硫化物前药7的制备

根据实施例19E的方法制备PBD单体二硫化物前药7。LCMS:(5-95,AB,5min),RT＝2.62min,m/z＝495[M+1]+；1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ7.07(s,1H),6.82(s,1H),6.66-6.60(m,1H),5.41-5.36(m,1H),5.16-5.09(m,2H),4.30(d,J＝11.7Hz,1H),4.15-4.06(m,1H),4.02-3.88(m,2H),3.81(s,6H),3.45(t,J＝9.3Hz,1H),2.91(td,J＝16.0,8.6Hz,2H),2.57-2.53(m,1H),1.14(dd,J＝11.4,6.6Hz,6H),0.96-0.81(m,4H)。

实施例19K：PBD单体二硫化物前药1的制备

根据实施例19E的方法制备PBD单体二硫化物前药1。LCMS:(5-95,AB,5min),RT＝2.20min,m/z＝455[M+1]+；1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ7.06(s,1H),6.80(s,1H),6.62(s,1H),5.37(dd,J＝9.7,5.1Hz,1H),5.16-5.09(m,2H),4.39(dt,J＝12.2,6.3Hz,1H),4.15-3.93(m,3H),3.80(s,6H),3.45(t,J＝9.3Hz,1H),2.88(dd,J＝16.1,9.0Hz,3H),2.65(q,J＝12.6,6.8Hz,2H),2.54(d,J＝2.3Hz,1H),1.23-1.14(m,3H)。

实施例19L：PBD单体二硫化物前药26的制备

根据实施例19E的方法制备PBD单体二硫化物前药26。LCMS:(5-95,AB,5min),RT＝2.08min,m/z＝497[M+1]+；1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ7.08(s,1H),6.82(s,1H),6.65(s,1H),5.38(d,J＝9.7Hz,1H),5.13(d,J＝6.6Hz,2H),4.77(s,3H),4.45-4.34(m,1H),4.26-4.06(m,3H),4.02-3.93(m,1H),3.81(s,6H),3.45(t,J＝9.3Hz,1H),3.09(s,1H),2.94-2.83(m,1H),2.62-2.53(m,1H),1.04(d,J＝6.9Hz,2H),-0.03--0.13(m,1H)。

实施例19M：PBD单体二硫化物前药25的制备

根据实施例19E的方法制备PBD单体二硫化物前药25。LCMS:(5-95,AB,5min),RT＝2.16min,m/z＝499[M+1]+；1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ7.07(s,1H),6.82(s,1H),6.63(brs,1H),5.38(d,J＝9.7Hz,1H),5.14(s,2H),4.2-4.1(m,2H),3.99(s,1H),3.81(s,6H),3.46(s,4H),3.22(s,3H),2.79(s,2H),2.69-2.54(m,3H),1.05(s,2H)。

实施例19N：PBD单体二硫化物前药24的制备

根据实施例19E的方法制备PBD单体二硫化物前药24。

根据以下方案合成硫醇：

向四氢-2H-吡喃-4-甲醛14a(5g，43.8mmol)在MTBE(50mL)中的溶液中添加S₂Cl₂(2.96g，21.9mmol)。将反应混合物在氮气下在55℃下搅拌16小时，然后将反应混合物冷却至环境温度，在真空下除去溶剂并通过硅胶柱色谱(二氧化硅：200-300目，PE/EtOAc＝5/1)纯化，以得到为黄色油状物的二硫化物14b(5g，58％)。1H NMR(300MHz,CDCl3)δ9.05(s,1H),3.92-3.42(m,8H),2.22-1.58(m,8H)。

向4,4'-二硫烷二基双(四氢-2H-吡喃-4-甲醛)7(5g，12.82mmol)在THF(50mL)中的溶液中分批添加LiAlH₄(0.97g，25.64mmol)。添加后，将反应混合物在环境温度下搅拌2小时，然后将反应混合物用HCl(3N)酸化至PH＝6，用乙酸乙酯(30mLx3)萃取，经Na₂SO₄干燥，除去溶剂并用硅胶柱色谱(二氧化硅：200-300目，PE/EA＝10/1)纯化，以得到为黄色油状物的硫醇14c(2.02g，34％)。1H NMR(300MHz,CDCl3)δ3.86-.383(m,4H),3.53(s,2H),2.25(s,1H),1.86-1.43(m,5H)。GCMS(m/z)ES＝148。

LCMS:(5-95,AB,5min),RT＝2.24min,m/z＝525[M+1]+；1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ7.07(s,1H),6.82(s,1H),6.61(s,1H),5.37(d,J＝9.6Hz,1H),5.13(d,J＝7.0Hz,2H),4.23(dd,J＝11.1,6.0Hz,1H),4.10(d,J＝15.7Hz,1H),4.02-3.83(m,4H),3.81(s,6H),3.45(t,J＝9.3Hz,1H),3.02(dt,J＝11.1,4.1Hz,1H),2.94-2.83(m,2H),2.59-2.52(m,2H),1.95-1.76(m,2H),1.55-1.37(m,2H),1.27-1.21(m,1H),1.05(d,J＝6.9Hz,3H)。

实施例19O：PBD单体二硫化物前药的制备

根据实施例19E的方法制备以上PBD单体二硫化物前药。LCMS:(5-95,AB,5min),RT＝1.86min,m/z＝485[M+1]+；1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ7.06(s,1H),6.79(s,1H),6.62(s,1H),5.37(dd,J＝9.7,6.0Hz,1H),5.13(d,J＝7.0Hz,2H),4.88(t,J＝5.7Hz,1H),4.38(d,J＝7.5Hz,1H),4.16-3.95(m,2H),3.80(s,6H),3.46(d,J＝11.3Hz,2H),3.38-3.34(m,1H),2.86(s,4H),2.58-2.53(m,1H),1.19(dd,J＝12.6,6.6Hz,3H)。

实施例19P：PBD单体二硫化物前药12的制备

根据实施例19E的方法制备PBD单体二硫化物前药12。LCMS:(5-95,AB,5min),RT＝2.40min,m/z＝469[M+1]+；1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ7.07(s,1H),6.82(s,1H),6.63(s,1H),5.38(dd,J＝9.7,5.9Hz,1H),5.13(d,J＝6.7Hz,2H),4.21(dd,J＝11.1,6.2Hz,1H),4.10(d,J＝16.0Hz,1H),3.97(d,J＝16.1Hz,2H),3.81(d,J＝2.3Hz,6H),3.45(t,J＝9.3Hz,1H),3.05(s,1H),2.94-2.83(m,1H),2.70-2.53(m,3H),2.45(p,J＝1.9Hz,1H),1.16(t,J＝7.2Hz,3H),1.08-1.02(m,2H)。

实施例19Q：PBD单体二硫化物前药3的制备

根据实施例19E的方法制备PBD单体二硫化物前药3。

根据以下方案合成对硝基吡啶二硫化物：

向环丁烷甲醛17a(9.8g，120mmol)在MTBE(80mL)中的溶液中添加S₂Cl₂(8.1g，60mmol)。将反应混合物在氮气下在55℃下搅拌16小时。将反应混合物冷却至环境温度，在真空下除去溶剂并用硅胶柱色谱(二氧化硅：200-300目，PE/EtOAc＝20/1)纯化，以得到为棕色油状物的1,1'-二硫烷二基二环丁烷甲醛(11.2g，83％)。1H NMR(300MHz,CDCl3)δ9.28(s,2H),3.06-1.20(m,12H)。

向1,1'-二硫烷二基二环丁烷甲醛5(11.2g，49mmol)在THF(200mL)中的溶液中分批添加LiAlH₄(3.7g，97mmol)。添加后，将反应混合物在环境温度下搅拌2小时。将反应混合物用HCl(3N)酸化至pH＝6，用乙酸乙酯(200mLx3)萃取，经Na₂SO₄干燥，除去溶剂并用硅胶柱色谱(二氧化硅：200-300目，PE/EtOAc＝10/1)纯化，以得到为黄色油状物的硫醇17c(3.8g，33％)。1H NMR(300MHz,CDCl3)δ3.64(s,2H),2.35-2.09(m,5H),2.05-1.87(m,2H),1.81(s,1H).GCMS(ES)m/z＝+118。

将17c(4.88g，41.35mmol)和1,2-双(5-硝基吡啶-2-基)二硫烷(12.82g，41.35mmol)在MeOH(100mL)中的混合物在环境温度下在氮气下搅拌16小时。将溶液真空浓缩并通过硅胶柱色谱(二氧化硅：200-300目，PE/EA＝10/1)纯化残余物，以得到为黄色固体的目标化合物17d(2.01g，18％)。1H NMR(400MHz,DMSO)δ9.30(s,1H),8.34(dd,J＝8.8,2.6Hz,1H),7.60(d,J＝8.8Hz,1H),3.57(s,2H),3.41(s,1H),2.27-2.14(m,5H),2.08-1.93(m,1H).；LCMS(ES)m/z＝+273(M+1)。

LCMS:(5-95,AB,5min),RT＝2.61min,m/z＝495[M+1]+；1HNMR(400MHz,DMSO-d6)δ7.08(s,1H),6.82(s,1H),6.64(d,J＝6.0Hz,1H),5.45-5.36(m,1H),5.13(d,J＝7.2Hz,2H),4.30(d,J＝11.5Hz,1H),4.10(d,J＝15.8Hz,1H),3.97(d,J＝13.7Hz,2H),3.80(s,6H),3.46(td,J＝9.5,1.8Hz,1H),2.89(dd,J＝15.8,9.2Hz,1H),2.62-2.52(m,2H),1.91(s,6H),1.63(s,1H),1.13(t,J＝7.5Hz,3H)。

实施例19R：PBD单体二硫化物前药5的制备

根据实施例19E的方法制备PBD单体二硫化物前药5。

根据以下方案合成对硝基吡啶二硫化物：

向环戊烷甲醛18a(9.0g，92mmol)在MTBE(30mL)中的溶液中添加S₂Cl₂(7.4g，55mmol)。将反应混合物在氮气下在55℃下搅拌16小时。将反应混合物冷却至环境温度，在真空下除去溶剂并用硅胶柱色谱(二氧化硅：200-300目，PE/EtOAc＝80/1)纯化，以得到为棕色油状物的1,1'-二硫烷二基二环戊烷甲醛18b(5.5g，46％)。1HNMR(300MHz,CDCl3)δ9.23(s,2H),2.41-1.51(m,16H)。

向1,1'-二硫烷二基二环戊烷甲醛18b(8.5g，32.9mmol)在THF(60mL)中的溶液中分批添加LiAlH₄(2.5g，65.8mmol)。添加后，将反应混合物在环境温度下搅拌2小时，然后将溶液用HCl(3N)酸化至pH＝6，用乙酸乙酯(150mLx2)萃取，经Na₂SO₄干燥，除去溶剂并通过硅胶柱色谱(二氧化硅：200-300目，PE/EtOAc＝20/1)纯化，以得到为黄色油状物的18c(5.5g，63％)。1H NMR(300MHz,CDCl3)δ3.51(s,2H),2.04(s,1H),1.85-1.67(m,7H),1.64(s,1H)。GCMS(ES)m/z＝+132。

将18c(3.5g，26.5mmol)和1,2-双(5-硝基吡啶-2-基)二硫烷3(12.3g，39.8mmol)在MeOH(50mL)中的混合物在环境温度下在氮气下搅拌16小时。反应完全后，将溶液真空浓缩。将残余物用硅胶柱色谱(二氧化硅：200-300目，PE/EtOAc＝10/1)纯化，以得到为黄色固体的目标化合物18d(1.9g，25％)。1H NMR(400MHz,DMSO):δ9.24-9.20(m,1H),8.58(dd,J＝8.9,2.7Hz,1H),8.17(dd,J＝8.9,0.5Hz,1H),5.18(t,J＝5.5Hz,1H),3.40(d,J＝5.5Hz,2H),1.63-1.82(m,8H)；LCMS(ES)m/z＝+287(M+1)。

LCMS:(5-95,AB,5min),RT＝2.48min,m/z＝509[M+1]+；1HNMR(400MHz,DMSO-d6)δ7.08(s,1H),6.82(s,1H),6.73-6.60(m,1H),5.40(d,J＝7.7Hz,1H),5.13(d,J＝7.2Hz,2H),4.22(d,J＝11.0Hz,1H),4.10(d,J＝15.9Hz,1H),4.01-3.84(m,2H),3.81(s,6H),3.46(t,J＝9.2Hz,1H),2.88(dd,J＝15.9,9.3Hz,1H),2.55(dd,J＝4.1,2.3Hz,2H),1.81-1.39(m,10H),1.12(t,J＝7.3Hz,3H)。

实施例19S：PBD单体二硫化物前药11和30的制备

PBD单体二硫化物前药11和30对应于以上结构并且是在用星号标出的一个或多个手性中心处具有不同构型的非对映体。根据实施例19E的方法制备化合物。

使用实施例19N中所述的程序，根据以下方案合成对硝基吡啶二硫化物。

PBD单体二硫化物前药11LCMS:(5-95,AB,5min),RT＝1.95min,m/z＝511[M+1]+；1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ7.08(s,1H),6.83(s,1H),6.64(s,1H),5.39(d,J＝9.7Hz,1H),5.13(d,J＝7.1Hz,2H),4.34(d,J＝11.5Hz,1H),4.10(d,J＝16.0Hz,1H),3.98(t,J＝15.3Hz,2H),3.81(d,J＝2.4Hz,6H),3.78-3.72(m,1H),3.63(s,1H),3.54(s,2H),3.46(t,J＝9.2Hz,1H),2.89(dd,J＝15.7,9.4Hz,1H),2.62-2.50(m,3H),1.83(d,J＝37.2Hz,2H),1.12(t,J＝7.3Hz,3H)。

PBD单体二硫化物前药30LCMS:(5-95,AB,5min),RT＝1.99min,m/z＝511[M+1]+；1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ7.08(s,1H),6.82(s,1H),6.66(s,1H),5.48-5.34(m,1H),5.21-5.07(m,2H),4.33(d,J＝11.5Hz,1H),4.18-3.91(m,3H),3.81(s,6H),3.79-3.70(m,0H),3.48(d,J＝17.5Hz,2H),2.97-2.82(m,1H),2.55(dd,J＝4.2,2.2Hz,2H),2.47-2.29(m,1H),1.85(d,J＝13.2Hz,2H),1.13(t,J＝7.4Hz,3H)。

实施例20：PBD二聚体二硫化物前药的制备

实施例20A：PBD二聚体二硫化物前药4的制备

根据以下反应方案制备PBD二聚体二硫化物前药4：

以上结构中和实施例20中描绘的其它地方的每个星号代表手性中心。

在0℃下，向三光气(83.2mg，0.280mmol)在DCM(2.0mL)中的溶液中添加化合物A2和吡啶在DCM(3.0mL)中的溶液。将混合物在20℃下搅拌30min并真空浓缩。将其溶解于DCM(5.0mL)中并在20℃下逐滴添加到吡啶(18.5mg，0.234mmol)和化合物A1(124mg，0.516mmol)的溶液中。将反应混合物在20℃下搅拌2h后，将其真空浓缩并通过柱色谱(在石油醚中的0-50％EtOAc)纯化，以得到为黄色固体的化合物A3(150mg，54％)。LCMS(5-95,AB,1.5min):RT＝1.419min,m/z＝1261.4[M+1]+。

将化合物A3(150mg，0.119mmol)在THF(4.0mL)、H₂O(4.0mL)和HOAc(6.0mL)中的溶液在10℃下搅拌8h。将混合物用EtOAc(15mL)稀释并用H₂O(10mL)、NaHCO₃水溶液(10mL)和盐水(10mL)洗涤。将有机层经Na₂SO₄干燥，过滤，浓缩并通过制备型TLC(在DCM中的5％CH₃OH)纯化，以得到为无色油状物的化合物A4(75mg，60.4％)。LCMS(5-95,AB,1.5min):RT＝0.941min,m/z＝1033.3[M+1]+。

将化合物A4(44mg，0.04mmol)和DMP(54mg，0.13mmol)在DCM(15mL)中的混合物在13℃下搅拌16h。将反应混合物真空浓缩并通过制备型TLC(在DCM中的5.6％MeOH，Rf＝0.5)纯化，然后通过制备型HPLC(10mM，NH₄HCO₃-ACN)纯化，以得到为白色固体的PBD二聚体二硫化物前药4(15mg，34％)。LCMS(5-95,AB,1.5min):RT＝0.941min,m/z＝1051.2[M+23]+；1HNMR(400MHz,CDCl3)δ7.19(s,2H),6.73(s,2H),5.59-5.57(m,2H),5.12(s,4H),4.43(d,J＝10.8Hz,2H),4.26-4.15(m,1H),4.11(s,1H),4.02-3.98(m,3H),3.96(s,4H),3.88(s,6H),3.80-3.65(m,2H),3.62(m,2H),2.90-2.80(m,2H),2.72-2.60(m,6H),2.18(br,2H),2.02-1.92(br,13H),1.70-1.63(m,3H),1.22-1.19(m,6H)。

实施例20B：PBD二聚体二硫化物前药1的制备

根据以下反应方案制备PBD二聚体二硫化物前药1：

向三光气(42.02mg，0.140mmol)在DCM(4.0mL)中的溶液中逐滴添加化合物A1(300.0mg，0.310mmol)和三乙胺(63.68mg，0.630mmol)在DCM(4mL)中的溶液。将混合物在0℃下搅拌30min后，添加化合物A2(112.16mg，0.630mmol)和三乙胺(127mg，1.26mmol)在DCM(2.0mL)中的溶液，并将混合物在18℃下搅拌18h。使混合物在水(20.0mL)与DCM(40.0mL)之间分配，并将有机层用水(20.0mL)、盐水(20.0mL)洗涤，并浓缩。将其在柱色谱(EtOAc:石油醚1:2)上纯化，以得到为黄色油状物的化合物A3(240mg，65％)。LCMS(5-95,AB,1.5min):RT＝1.296min,m/z＝1157.4[M+1]+。

向化合物A3(240.0mg，0.210mmol)在THF(1.5mL)中的溶液中逐滴添加HOAc/H2O(4.0mL，3/1)的混合物。将混合物在8℃下搅拌18h。用NaHCO₃溶液将pH调整至8，并用EtOAc(3x50mL)萃取。合并的有机层经Na₂SO₄干燥，过滤并浓缩。将其通过柱色谱(DCM:MeOH＝20:1)纯化，以得到为黄色油状物的化合物A4(130mg，68％)。LCMS(5-95,AB,1.5min):RT＝0.868min,m/z＝929.3[M+1]+。

向化合物A4(60.0mg，0.0600mmol)在DCM(6.0mL)中的溶液中添加DMP(95.83mg，0.230mmol)，并将混合物在18℃下搅拌1.0h。将混合物过滤，用Na₂SO₃水溶液(20.0mL)、盐水(20.0mL)和水(20.0mL)洗涤。有机层经Na₂SO₄干燥，浓缩，并通过制备型TLC(在DCM中的7％MeOH)纯化，以得到为白色固体的化合物A5(30mg，49％)。LCMS(5-95,AB,1.5min):RT＝0.804min,m/z＝925.3[M+1]+。

在0℃下将TFA(1.0mL)逐滴添加到化合物A5(30.0mg，0.030mmol)中。搅拌20min后，在0℃下将混合物逐滴添加到饱和NaHCO₃溶液(40.0mL)中，并用DCM(3x15mL)萃取。合并的有机层经Na₂SO₄干燥，浓缩，并通过制备型TLC(在DCM中的18％MeOH，Rf＝0.6)纯化，以得到为白色固体的PBD二聚体二硫化物前药1(5.8mg，22％)。LCMS(5-95,AB,1.5min):RT＝0.890min,m/z＝807.2[M+1]+。

实施例20C：PBD二聚体二硫化物前药2的制备

根据以下反应方案制备PBD二聚体二硫化物前药2：

向三光气(89.43mg，0.300mmol)和分子筛(50mg)在DCM(5.0mL)中的溶液中添加化合物A2(165.0mg，0.710mmol)和吡啶(168.58mg，2.13mmol)在DCM(5.0mL)中的溶液。将混合物在0℃下搅拌30min。将所得混合物逐滴添加到化合物A1(745mg，0.780mmol)、吡啶(169mg，2.13mmol)和MS在DCM(5.0mL)中的溶液中。在0℃下搅拌30min，并用水(5.0mL)洗涤。将有机相干燥，浓缩并通过快速柱色谱(在DCM中的5％MeOH)纯化，以得到为黄色油状物的产物A3(698mg，81％)。LCMS(5-95,AB,1.5min):RT＝1.187min,m/z＝606.5[M/2+1]+。

向化合物A3(698.0mg，0.580mmol)在DCM(10.0mL)中的溶液中添加2-丙硫醇(439mg，5.76mmol)。将混合物在20℃下搅拌1h后，添加MnO₂(100mg)并搅拌5min，并过滤。将滤液浓缩并通过制备型TLC(在石油醚中的50％EtOAc)纯化，以得到为黄色固体的化合物A5(620mg，95％)。LCMS(5-95,AB,1.5min):RT＝1.221min,m/z＝1131.4[M+1]+。

向化合物A5(620.0mg，0.550mmol)在THF(6.0mL)和水(6.0mL)中的溶液中添加HOAc(3.29g，54.8mmol)。将混合物在40℃下搅拌16h并浓缩。通过柱色谱(在DCM中的10％MeOH)纯化，以得到为黄色油状物的化合物A6(208mg，42％)。LCMS(5-95,AB,1.5min):RT＝0.854min,m/z＝903.3[M+1]+。

向化合物A6(208.0mg，0.230mmol)在DCM(8.0mL)中的溶液中添加分子筛、DMP(224.7mg，0.530mmol)。将混合物在20℃下搅拌2h并用饱和NaHCO₃和Na₂S2O₃溶液(2.0mL/2.0mL)淬灭。搅拌5min后，添加DCM(5.0mL)并分离。用水(2x5mL)洗涤DCM相。将其干燥，浓缩并通过制备型TLC(在DCM中的5％MeOH，Rf＝0.2)纯化，以得到为浅黄色泡沫的化合物A7(121mg，58％)。LCMS(5-95,AB,1.5min):RT＝0.783min,m/z＝781.3[M-100+1]+。

在0℃下将TFA(1.0mL，13.5mmol)添加到化合物A7(121.0mg，0.130mmol)中。将混合物搅拌10min后，将其添加到冷的饱和NaHCO₃溶液(20mL)中并用DCM(3x10mL)萃取。将合并的有机层浓缩并通过制备型TLC(在DCM中的10％MeOH，Rf＝0.2)纯化，然后通过制备型HPLC(ACN，乙腈：42～62％，0.225％FA)纯化，以得到PBD二聚体二硫化物前药2(7.2mg，7.0％)。LCMS(5-95,AB,1.5min):RT＝0.868min,m/z＝781.3[M+1]+。

实施例20D：PBD二聚体二硫化物前药3的制备

根据以下反应方案制备PBD二聚体二硫化物前药3：

在0℃、N₂下向三光气(65.37mg，0.220mmol)在DCM(2.0mL)中的溶液中添加化合物A1(420.0mg，0.440mmol)和三乙胺(89.16mg，0.880mmol)在DCM(3.0mL)中的混合物。将混合物在21℃下搅拌30min后，将其浓缩，并添加DCM(18mL)。在0℃、N₂下，添加A2(75.0mg，0.390mmol)和三乙胺(78.91mg，0.780mmol)在DCM(2.0mL)中的溶液。将反应混合物在20℃下搅拌1h后，将其真空浓缩并通过柱色谱(在石油醚中的0-50％EtOAC)纯化，以得到为黄色固体的化合物A3(350mg，74％)。LCMS(5-95,AB,1.5min):RT＝1.379min,m/z＝1171.5[M+1]+。

向化合物A3(415.2mg，0.350mmol)在THF(30mL)和水(15mL)中的溶液中添加HOAc(2.02mL，35.2mmol)。将反应溶液在20℃下搅拌12h。将其真空浓缩并用EtOAc(200mL)稀释，用H₂O(2x100mL)洗涤，接着用NaHCO₃水溶液(2x60mL)洗涤。将EtOAc层经Na₂SO₄干燥，过滤并浓缩。将其通过柱色谱(在DCM中的0-10％MeOH)纯化，以得到为黄色固体的化合物A4(320mg，87.1％)。LCMS(5-95,AB,1.5min):RT＝1.080min,m/z＝943.5[M+1]+。

向化合物A4(170.0mg，0.180mmol)在DCM(20mL)中的溶液中添加DMP(229.3mg，0.540mmol)。将反应混合物在18℃下搅拌1h后，将其用H₂O(20mL)稀释，并且添加Na₂SO₃水溶液(20mL)和NaHCO₃水溶液(20mL)。用EtOAc(3x60mL)萃取混合物。将合并的有机层经Na₂SO₄干燥，过滤，浓缩，并通过柱色谱(在DCM中的0-5％MeOH)纯化，以得到为白色固体的化合物A5(150mg，75％)。LCMS(5-95,AB,1.5min):RT＝0.814min,m/z＝961.5[M+23]+。

将化合物A5(75.0mg，0.080mmol)在TFA(9.5mL)和水(0.50mL)中的溶液在14℃下搅拌1h。将反应混合物倒入冷的饱和NaHCO₃(100mL)中并用DCM(2x100mL)萃取。将合并的有机层干燥，浓缩，并通过制备型TLC(在DCM中的4％MeOH，Rf＝0.5)纯化，然后通过制备型HPLC(Waters Xbridge Prep OBD C18 150*30 5u，条件：0.225％FA-CAN)纯化，以得到为白色固体的PBD二聚体二硫化物前药3(9.5mg，14％)。LCMS(5-95,AB,1.5min):RT＝0.956min,m/z＝821.3[M+23]+。

实施例20E：PBD二聚体对照1的制备

根据以下反应方案制备PBD二聚体对照1：

将化合物A1(1.80g，1.71mmol)在HOAc/THF/H₂O(9.0mL/4.5mL/3.0mL)中的溶液在室温下搅拌48h。将溶液用EtOAc(150mL)稀释，用H₂O(4x40mL)、NaHCO₃水溶液(4x40mL)和H₂O(40mL)洗涤。将EtOAc层经Na₂SO₄干燥，过滤并浓缩，以得到为油状物的化合物A2(1.38g，91％)。

在0℃下向化合物A2(800mg，0.99mmol)在DCM(20mL)中的经搅拌溶液中添加DMP(1.26g，2.97mmol)。将反应混合物在室温下搅拌3h。将其用EtOAc(100mL)稀释，并在0℃下用Na₂SO₃水溶液(30mL)淬灭。将有机层用H₂O(3x30mL)、NaHCO₃水溶液(30mL)和H₂O(30mL)洗涤。将其经Na₂SO₄干燥，过滤，浓缩，并通过制备型TLC(DCM/MeOH＝15:1)纯化，以得到为无色固体的化合物A3(400mg，50.0％)。LCMS(ESI,5-95AB/1.5min):RT＝0.767min,[M+Na]+＝843.4。

将化合物A3(300mg，0.36mmol)在95％TFA/H₂O(4.0mL)中的溶液在0℃下搅拌2h。然后在0℃下将该溶液逐滴添加到饱和NaHCO₃溶液(120mL)中。用DCM(3x20mL)萃取混合物。将合并的有机层经Na₂SO₄干燥，过滤，干燥，浓缩并通过制备型HPLC纯化，以得到为白色固体的PBD二聚体对照1(70mg，33％)。LCMS(ESI,5-95AB/1.5min):RT＝0.767min,[M+Na]+＝843.4 1H NMR(400MHz,CDCl3)δppm 7.69(d,J＝4.80Hz,2H),7.50(s,2H),6.81(s,2H),5.19(d,J＝10.80Hz,4H),4.29(s,5H),4.02-4.19(m,4H),3.94(s,6H),3.83-3.92(m,3H),3.09-3.16(m,2H),2.90-2.99(m,2H),1.98-1.94(m,4H),1.66-1.70(m,2H)。

实施例20F：PBD二聚体对照2的制备

根据以下反应方案制备PBD二聚体对照2：

将化合物A1(1.80g，1.71mmol)在HOAc/THF/H₂O(9.0mL/4.5mL/3.0mL)中的溶液在室温下搅拌48h。将其用EtOAc(150mL)稀释，用H₂O(4x40mL)、NaHCO₃水溶液(2x40mL)和H₂O(40mL)洗涤。将EtOAc层经Na₂SO₄干燥，过滤并浓缩，以得到为油状物的化合物2(1.38g，91％)。

在0℃下向化合物A2(800mg，0.99mmol)在DCM(20mL)中的经搅拌溶液中添加DMP(1.26g，2.97mmol)，并将反应混合物在室温下搅拌3h。然后将混合物用EtOAc(100mL)稀释，并在0℃下用Na₂SO₃水溶液(30mL)淬灭。将有机层用H₂O(3x30mL)、饱和NaHCO₃溶液(30mL)和H₂O(30mL)洗涤，经Na₂SO₄干燥，过滤并浓缩。通过制备型TLC(DCM/MeOH＝15:1)纯化残余物，以得到为无色固体的化合物A3(400mg，50.0％)。LCMS(ESI,5-95AB/1.5min):RT＝0.867min,[M+Na]+＝843.4。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.20(s,2H),6.61(s,2H),5.49(d,J＝9.2Hz,2H),5.14(d,J＝4.8Hz,4H),4.32-4.14(m,5H),4.07-3.99(m,5H),3.90(s,6H),3.62(t,J＝9.2Hz,2H),2.96-2.89(m,2H),2.73-2.69(m,2H),1.98-1.94(m,4H),1.69-1.67(m,2H),1.37(s,18H)。

将化合物A3(120mg，0.147mmol)在95％TFA/H2O(2.0mL)中的溶液在0℃下搅拌2h。然后在0℃下将溶液逐滴添加到饱和NaHCO₃溶液(120mL)中。用DCM(3x20mL)萃取混合物。将合并的有机层经Na₂SO₄干燥并浓缩，以得到为粗产物的化合物4(86mg，100％)。LCMS(ESI,5-95AB/1.5min):RT＝0.764min,[M+H]+＝585.3。

向化合物A4(86mg，0.147mmol)在无水DCM/MeOH(5.0mL/2.5mL)中的溶液中添加NaBH₃CN(92mg，1.47mmol)。将反应混合物在室温下搅拌过夜。将其浓缩并将残余物用饱和NaHCO₃(20mL)稀释，并用DCM(3x20mL)萃取。将合并的DCM层经Na₂SO₄干燥，过滤并浓缩。通过制备型HPLC(FA)纯化残余物，以得到为白色固体的PBD二聚体对照2(15.6mg，18.1％)。LCMS(ESI,5-95AB/1.5min):RT＝0.808min,[M+H]+＝589.3。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.58(s,2H),6.05(s,2H),5.06(d,J＝11.6Hz,4H),4.42-4.27(m,6H),3.98(t,J＝6.8Hz,6H),3.84(s,6H),3.55(d,J＝12.0Hz,2H),3.35-3.30(dd,J＝12.4,9.6Hz,2H),2.93-2.87(m,2H),2.46-2.42(m,2H),1.94-1.89(m,4H),1.62-1.60(m,2H)。

实施例21：包含用于与抗体缀合的接头的PBD二聚体二硫化物前药的制备

实施例21A：包含接头的PBD二聚体二硫化物前药4的制备

根据以下反应方案制备包含接头的PBD二聚体二硫化物前药4：

以上结构中和实施例21中描绘的其它地方的每个星号代表手性中心。

向A6(400.0mg，1.47mmol)在DCM(10mL)中的混合物中添加乙硫醇A7(2.74g，44.1mmol)。将反应混合物在40℃下搅拌30h。将混合物用MnO₂(0.20g)处理5min，并过滤。浓缩滤液，并通过制备型TLC(100％DCM，Rf＝0.5)纯化残余物，以得到为无色油状物的化合物A2(110mg，42％)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ3.74(s,2H),2.75-2.70(m,2H),2.13-1.87(m,6H),1.84(s,1H),1.30(t,J＝7.6Hz,3H)。

向三光气(82.4mg，0.28mmol)在DCM(4.0mL)中的溶液中逐滴添加A2(110.0mg，0.620mmol)和吡啶(146.4mg，1.85mmol)在DCM(4.0mL)中的溶液。将混合物在15℃下搅拌30min并浓缩。将其溶解于DCM(5.0mL)中并在0℃下逐滴添加到A1(1.05g，1.23mmol)和吡啶(145.87mg，1.84mmol)在DCM(15.0mL)中的溶液中。将混合物在15℃搅拌2h后，将其浓缩，并通过柱色谱(在石油醚中的0-50％EtOAc)纯化残余物，以得到为黄色油状物的A3(310mg，45.8％)。LCMS(5-95,AB,1.5min):RT＝1.151min,m/z＝1057.4[M+1]+。

在0℃下向三光气(26.5mg，0.090mmol)在DCM(5.0mL)中的溶液中添加A3(210mg，0.200mmol)和三乙胺(60.28mg，0.60mmol)在DCM(5.0mL)中的溶液。将反应混合物在15℃下搅拌30min。向以上混合物中逐滴添加MC-VC-PAB(166.0mg，0.290mmol)和三乙胺(59.0mg，0.58mmol)在DMSO(3.0mL)中的溶液。将反应混合物在40℃下搅拌2h。将混合物用DCM(30mL)稀释，并用水(3x10mL)洗涤。将合并的有机层干燥，浓缩，并通过柱色谱(在DCM中的0-10％MeOH)纯化，以得到为黄色油状物的A4(160mg，48.4％)。LCMS(5-95,AB,1.5min):RT＝1.271min,m/z＝828.6[M/2+1]+。

向A4(160.0mg，0.100mmol)在THF(3.0mL)和水(3.0mL)中的混合物中添加乙酸(4.5mL)。将反应混合物在15℃下搅拌15h。将混合物用EtOAc(30mL)稀释，用水(2x10mL)、饱和NaHCO₃(2x10mL)和盐水(10mL)洗涤。将有机相经Na₂SO₄干燥并浓缩，以得到为黄色油状物的粗制品A5(120mg，82.7％)，其不经进一步纯化用于下一步骤。LCMS(5-95,AB,1.5min):RT＝0.801min,m/z＝714.6[M/2+1]+。

向A5(60.0mg，0.040mmol)在DMSO(3.0mL)中的混合物中添加IBX(58.8mg，0.21mmol)。将反应混合物在40℃下搅拌16h。通过制备型HPLC(ACN 40-70％/0.225％FA水溶液)纯化混合物，以得到为白色固体的(15mg，25.1％)。LCMS(5-95,AB,1.5min):RT＝0.758min,m/z＝712.5[M/2+1]+。

在本公开的一些方面，包含接头的PBD二聚体二硫化物前药4可以与抗体缀合以形成PBD二聚体ADC二硫化物前药4。

实施例21B：包含接头的PBD二聚体二硫化物前药3的制备

根据以下反应方案制备包含接头的PBD二聚体二硫化物前药3：

向三光气(486.9mg，1.64mmol)在DCM(10mL)中的溶液中添加化合物A1(1.40g，1.64mmol)和三乙胺(664mg，6.56mmol)在DCM(10mL)中的溶液。将混合物在8℃下搅拌10min。将混合物浓缩，以得到为黄色固体的粗产物(1.48g，99.6％)。向以上粗产物(1.41g，1.56mmol)在DCM(15mL)中的溶液中添加化合物A2(150.0mg，0.780mmol)和三乙胺(158mg，1.56mmol)在DCM(6.0mL)中的溶液。将混合物在8℃下搅拌1h后，将其浓缩并通过快速柱色谱(在石油醚中的50％EtOAc)纯化，以得到为黄色固体的产物化合物A3(300mg，30％)。LCMS(5-95,AB,1.5min):RT＝1.193min,m/z＝1071.5[M+1]+。

向三光气(41.6mg，0.140mmol)在DCM(6.0mL)中的溶液中添加化合物A3(300mg，0.280mmol)和三乙胺(56.7mg，0.560mmol)在DCM(5.0mL)中的溶液。将混合物在8℃下搅拌15min。将混合物浓缩，以得到为黄色固体的粗产物(307mg，99.9％)，其直接用于下一步骤。向粗产物(300.0mg，0.270mmol)在DCM(10mL)中的溶液中添加MC_VC_PAB(156mg，0.270mmol)和三乙胺(27.7mg，0.270mmol)在DMF(6.0mL)中的溶液。将混合物在8℃下搅拌12h后，将其浓缩并通过快速柱色谱(在DCM中的6％MeOH)纯化，以得到为黄色固体的产物化合物A4(140mg，31％)。LCMS(5-95,AB,1.5min):RT＝1.354min,m/z＝836.4[M/2+1]+。

将化合物A4(140.0mg，0.080mmol)在THF(2.0mL)、水(2.0mL)和乙酸(3.0mL)中的混合物在8℃下搅拌12h。将混合物用EtOAc(60mL)稀释，并用水(3x50mL)、饱和NaHCO₃(50mL)、盐水(50mL)洗涤。将有机层干燥并浓缩，以得到为黄色固体的粗产物化合物A5(120mg，99％)。LCMS(5-95,AB,1.5min):RT＝0.983min,m/z＝722.0[M/2+1]+。

在18℃下向化合物A5(140.0mg，0.100mmol)在DMSO(4.0mL)中的溶液中添加IBX(108mg，0.390mmol)。将反应混合物在40℃下搅拌8h。通过制备型HPLC(ACN 40-70％/0.225％FA水溶液)纯化混合物，以得到为白色固体的产物，包含接头的PBD二聚体二硫化物前药2(20mg，14％)。LCMS(5-95,AB,1.5min):RT＝0.760min,m/z＝719.7[M/2+1]+。

在本公开的一些方面，包含接头的PBD二聚体二硫化物前药3可以与抗体缀合以形成PBD二聚体ADC二硫化物前药2A或PBD二聚体ADC二硫化物前药2B。

实施例21C：包含接头的PBD二聚体二硫化物前药2的制备

根据以下反应方案制备包含接头的PBD二聚体二硫化物前药2：

向化合物A8(3.18g，10.24mmol)在DCM(25.0mL)中的溶液中添加化合物A9(400mg，5.12mmol)。将混合物在8℃下搅拌12h。向混合物中添加MnO₂(100mg)并搅拌10min并过滤。将滤液浓缩并通过快速柱色谱(100％DCM)纯化，以得到为黄色固体的化合物2(620mg，2.67mmol，52.1％)。

向三光气(191.6mg，0.65mmol)在DCM(5.0mL)中的溶液中添加化合物A2(300mg，1.29mmol)和吡啶(306mg，3.87mmol)在DCM(5.0mL)中的溶液。将混合物在8℃下搅拌10min。将所得混合物逐滴添加到化合物A1(1.43g，1.68mmol)和吡啶(306mg，3.87mmol)在DCM(15.0mL)中的溶液中。将混合物在8℃下搅拌30min后，将其浓缩并通过快速柱色谱(在石油醚中的50％EtOAc)纯化，以得到为黄色油状物的产物化合物A3(0.50g，0.427mmol，33.1％)。LCMS(5-95,AB,1.5min):RT＝1.077min,m/z＝1111.7[M+1]+。

向化合物A3(300mg，0.270mmol)在DCM(10mL)中的溶液中添加化合物A4(205mg，2.7mmol)。将混合物在8℃下搅拌10min。向混合物中添加MnO₂(100mg)，搅拌10min并过滤。将滤液浓缩并通过快速柱色谱(在石油醚中的50％EtOAc)纯化，以得到为黄色固体的产物化合物A5(210mg，0.204mmol，75.4％)。

向三光气(30.2mg，0.100mmol)在DCM(5.0mL)中的溶液中添加化合物A5(210mg，0.200mmol)和三乙胺(61.7mg，0.610mmol)在DCM(5.0mL)中的溶液。将混合物在8℃下搅拌30min。然后将混合物逐滴添加到MC_VC_PAB(139.8mg，0.240mmol)和三乙胺(61.7mg，0.610mmol)在DMF(5.0mL)中的溶液中。将混合物在8℃下搅拌12h。将混合物浓缩并通过快速柱色谱(在DCM中的8％MeOH)纯化，以得到为黄色油状物的产物化合物A6(140mg，0.085mmol，41.8％)。LCMS(5-95,AB,1.5min):RT＝1.248min,m/z＝816.1[M/2+1]+。

将化合物A6(140.0mg，0.090mmol)在乙酸(3.0mL)、THF(2.0mL)和水(2.0mL)中的混合物在8℃下搅拌8h。将混合物用EtOAc(60mL)稀释，用水(3x50mL)、饱和NaHCO₃(50mL)、盐水(50mL)洗涤并浓缩，以得到为白色固体的产物化合物A7(120mg，0.0856mmol，99.7％)。LCMS(5-95,AB,1.5min):RT＝0.787min,m/z＝701.6[M/2+1]+。

在9℃下向化合物A7(130.0mg，0.090mmol)在DMSO(3.0mL)中的溶液中添加IBX(129.9mg，0.460mmol)。将反应混合物在50℃下搅拌48h。通过制备型HPLC(ACN 35-65％/0.225％FA水溶液)纯化混合物，以得到为白色固体的产物，包含接头的PBD二聚体二硫化物前药4(10mg，0.0071mmol，7.6％)。LCMS(5-95,AB,1.5min):RT＝0.728min,m/z＝1397.9[M+1]+。

在本公开的一些方面，包含接头的PBD二聚体二硫化物前药2可以与抗体缀合以形成PBD二聚体ADC二硫化物前药4。

实施例21D：PBD二聚体二硫化物前药的制备，所述前药包含用于缀合以形成PBD二聚体心肌黄酶前药1A和1B的接头，并具有以下结构：

和名称：4-(叔丁基二硫烷基)苄基(11aS)-8-((5-(((11aS)-10-(((4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-二氧代基-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰氨基)-3-甲基丁酰氨基)-5-脲基戊酰氨基)苄基)氧基)羰基)-11-羟基-7-甲氧基-2-亚甲基-5-氧代基-2,3,5,10,11,11a-六氢-1H-苯并[e]吡咯并[1,2-a][1,4]二氮杂-8-基)氧基)戊基)氧基)-11-羟基-7-甲氧基-2-亚甲基-5-氧代基-2,3,11,11a-四氢-1H-苯并[e]吡咯并[1,2-a][1,4]二氮杂-10(5H)-羧酸酯。

根据以下反应方案制备包含接头的PBD二聚体二硫化物前药：

向A7(250mg，1.78mmol)在95％EtOH(10mL)中的溶液中添加A8(2.01mL，17.85mmol)。将混合物冷却至0℃，逐滴添加碘(200mg，0.79mmol)在95％EtOH(10mL)中的溶液，直到混合物的颜色从无色变为棕色。搅拌2h后，在0℃下添加饱和NaHCO₃(2.0mL)，直到pH大于7。将溶液真空浓缩。添加EtOAc(20mL)，并将有机层用10％NaHCO3(3x15mL)和盐水洗涤。将有机层经Na₂SO₄干燥，过滤并浓缩，并通过快速柱色谱(在石油醚中的0-32％EtOAc)纯化，以得到为黄色油状物的化合物A2(280mg，68.8％)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.51(d,J＝8.4Hz,2H),7.23(d,J＝8.4Hz,2H),4.57(s,2H),2.40(br,1H),1.29(s,9H)。

在0℃、N₂下向三光气(26mg，0.090mmol)在DCM(1.0mL)中的溶液中添加化合物A2(50.0mg，0.220mmol)和吡啶(18.0mg，0.230mmol)在DCM(4.0mL)中的溶液。将反应混合物在0℃、N₂下搅拌5min后，在0℃、N₂下将其逐滴添加到吡啶(34.0mg，0.430mmol)和A1(277mg，0.320mmol)的溶液中。将反应混合物在20℃、N₂下搅拌2h。除去溶剂并通过制备型TLC(在石油醚中的50％EtOAc，Rf＝0.4)纯化残余物，以得到为黄色泡沫的化合物A3(70mg，28.3％)。LCMS(5-95,AB,1.5min):RT＝1.328min,m/z＝1108.7[M+1]+。

在0℃、N₂下向三光气(46.0mg，0.160mmol)在DCM(7.0mL)中的溶液中添加化合物A3(400.0mg，0.360mmol)和三乙胺(37.0mg，0.370mmol)在DCM(3.0mL)中的混合物。将反应混合物在0℃下搅拌30min后，在20℃、N₂下添加MC-VC-PAB(247.0mg，0.430mmol)和三乙胺(73.0mg，0.720mmol)在DMF(3.0mL)中的溶液。将反应混合物在40℃、N₂下搅拌8h。将混合物浓缩并通过柱色谱(在DCM中的0-6％MeOH)纯化，以得到为黄色固体的化合物A4(190mg，30.7％)。LCMS(5-95,AB,1.5min):RT＝1.308min,m/z＝854.2[M/2+1]+。

在15℃下向化合物A4(415mg，0.240mmol)在水(2.0mL)和THF(2mL)中的溶液中添加HOAc(6.47mL，113mmol)。将反应混合物在15℃下搅拌7h后，将其用EtOAc(30mL)稀释，并用水(2x15mL)、饱和NaHCO₃水溶液(15mL)和盐水(15mL)洗涤。将其干燥并浓缩，以得到为黄色固体的粗化合物A5(150mg，41.7％)，其不经进一步纯化直接用于下一步骤。LCMS(5-95,AB,1.5min):RT＝0.997min,m/z＝739.4[M/2+1]+。

在18℃下向化合物A5(50.0mg，0.030mmol)在DMSO(3.0mL)中的溶液中添加IBX(38.0mg，0.140mmol)。将反应混合物在37℃下搅拌8h。通过制备型HPLC(ACN 40-70％/0.225％FA水溶液)纯化混合物，以得到为白色固体的包含接头的PBD二聚体二硫化物前药1(17.2mg，33.1％)。LCMS(5-95,AB,1.5min):RT＝0.806min,m/z＝737.1[M/2+1]+。

在本公开的一些方面，包含接头的PBD二聚体二硫化物前药可以与抗体缀合以形成PBD二聚体ADC二硫化物前药1A或PBD二聚体ADC二硫化物前药1B。

实施例21E：包含接头的PBD二聚体二硫化物前药5的制备

根据以下反应方案制备包含接头的PBD二聚体二硫化物前药5：

向TBDPSCl(8.62g，31.36mmol)在DMF(40mL)中的溶液中添加化合物A8(2.27g，29.05mmol)在DMF(30mL)中的溶液。将溶液搅拌10min后，添加在DMF(8.0mL)中的咪唑(4.27g，62.7mmol)并且将反应混合物在20℃下搅拌24h。将混合物浓缩并溶于DCM(30mL)中，过滤，并用H2O(3x30mL)洗涤。将有机层用MgSO₄干燥，过滤，并除去溶剂。通过快速柱色谱(在石油醚中的3％EtOAc)纯化残余物，以得到为无色油状物的化合物A9(7.0g，76％)。

经15min向化合物A9(1.00g，3.16mmol)在DCM(10mL)中的溶液中逐滴添加化合物A10(1.96mg，6.32mmol)在DCM(10mL)中的溶液。将混合物在26℃下再搅拌1h后，添加二氧化锰(1.00g，11.5mmol)并搅拌10min，直到黄色溶液变为无色。滤出二氧化锰并浓缩滤液。添加MeOH(5.0mL)并过滤固体以除去化合物A10。通过柱色谱(在石油醚中的0-2.5％EtOAc)纯化残余物，以得到为黄色固体的化合物A11(0.90g，61％)。

经15min向化合物A11(250mg，1.89mmol)在DCM(6.0mL)中的溶液中逐滴添加化合物A12(0.50g，1.58mmol)在DCM(4.0mL)中的溶液。添加后，将混合物在26℃下再搅拌1h。添加二氧化锰(1.0g，11.5mmol)。将混合物再搅拌10min，直到黄色反应溶液变为无色。滤出二氧化锰，浓缩滤液并添加MeOH(5.0mL)。滤出固体，并通过柱色谱(在石油醚中的0-14％EtOAc)纯化残余物，以得到为黄色油状物的化合物A2(0.500g，71％)。

在0℃下向三光气(695mg，2.34mmol)在DCM(5.0mL)中的溶液中添加化合物A1(2.0g，2.34mmol)和三乙胺(711.0mg，7.03mmol)在DCM(10mL)中的溶液。将混合物在0℃下搅拌30min。浓缩反应混合物，并添加化合物A2(680mg，1.52mmol)和三乙胺(308mg，3.04mmol)在DCM(4.0mL)中的溶液。将混合物在25℃下搅拌2h，浓缩，并通过柱色谱(在石油醚中的0-50％EtOAc)纯化，以得到为黄色固体的A3(700mg，33％)。LCMS(5-95,AB,1.5min):RT＝1.401min,m/z＝1326.0[M+1]+。

在0℃、N₂下向三光气(54.0mg，0.180mmol)在DCM(10mL)中的溶液中添加化合物A3(500mg，0.450mmol)和三乙胺(50.0mg，0.490mmol)在DCM(5.0mL)中的混合物。将反应混合物在0℃下搅拌30min。向反应混合物中添加Fmoc-VC_PAB(260.0mg，0.450mmol)和三乙胺(78.0mg，0.770mmol)在DMF(3.0mL)中的溶液。将混合物在40℃下搅拌8h，浓缩，并通过柱色谱(在DCM中的0-8％MeOH)纯化，以得到为黄色固体的化合物A4(130mg，14％)。LCMS(5-95,AB,1.5min):RT＝1.474min,m/z＝978.1[M/2+1]+。

在26℃下向化合物A4(130.0mg，0.070mmol)在水(2.0mL)和THF(2.0mL)中的溶液中添加HOAc(3.0mL，52.5mmol)并在26℃下搅拌7h。将反应混合物用EtOAc(20mL)稀释，用水(2x15mL)、饱和NaHCO₃(10mL)和盐水(10mL)洗涤。将其干燥并浓缩，以得到为黄色固体的粗化合物A5(130mg，83％)，其不经进一步纯化直接用于下一步骤。LCMS(5-95,AB,1.5min):RT＝1.065min,m/z＝863.2[M/2+1]+。

在25℃下向化合物A5(130.0mg，0.080mmol)在DMSO(3.0mL)中的溶液中添加2-碘酰基苯甲酸(84.4mg，0.300mmol)。将混合物在40℃下搅拌10h后，将其通过制备型HPLC(ACN85-100％，0.225％FA水溶液)纯化，以得到为白色固体的产物A6(60mg，45％)。LCMS(5-95,AB,1.5min):RT＝1.178min,m/z＝861.4[M/2+1]+。

在26℃下向化合物A6(60.0mg，0.035mmol)在THF(3.0mL)中的溶液中添加TBAF(39.4mg，0.150mmol)。将反应混合物在26℃下搅拌2h。将反应混合物用DCM(20mL)稀释，用水(3x15mL)洗涤，经Na₂SO₄干燥，并浓缩以得到为黄色油状物的粗化合物A7(70mg，粗制品)。

在26℃下向化合物A7(70.0mg，0.060mmol)在DMF(2.0mL)中的经搅拌溶液中添加MC_OSu(51.4mg，0.170mmol)。将混合物在26℃下搅拌2h。通过制备型HPLC(ACN 35-55％/0.225％FA水溶液)纯化反应混合物，以得到为白色固体的(5.5mg，6.7％)。LCMS(5-95,AB,1.5min):RT＝0.852min,m/z＝1453.5[M+1]+。

在本公开的一些方面，包含接头的PBD二聚体二硫化物前药5可以与抗体缀合以形成PBD二聚体ADC二硫化物前药5。

实施例22：包含用于与抗体缀合的接头的PBD二聚体硼酸前药的制备

实施例22A：包含接头的PBD二聚体硼酸前药1的制备

根据以下反应方案制备包含接头的PBD二聚体硼酸前药1：

以上结构中和实施例22中描绘的其它地方的每个星号代表手性中心。

在0℃、N₂下向三光气(228mg，0.77mmol)在THF(15mL)中的溶液中添加A2(450mg，1.92mmol)和吡啶(304mg，3.84mmol)在THF(5.0mL)中的溶液。将混合物在N₂下在0℃下搅拌20min，并在0℃、N₂下添加到A1(2.04g，2.39mmol)和三乙胺(389mg，3.84mmol)在DCM(20mL)中的溶液中。将反应混合物在10℃下搅拌2h。将混合物浓缩并通过制备型TLC(在石油醚中的30-60％EtOAc)纯化，以得到为黄色固体的化合物A3(500mg，26％)。LCMS(5-95,AB,1.5min):RT＝1.268min,m/z＝1113.4[M+1]+。

在0℃、N₂下向三光气(53mg，0.18mmol)在DCM(15mL)中的溶液中添加化合物A3(500mg，0.39mmol)和三乙胺(45mg，0.44mmol)在DCM(5.0mL)中的混合物。将反应混合物在0℃下搅拌30min。在10℃、N₂下向该反应混合物中添加MC_VC_PAB(308mg，0.54mmol)和三乙胺(90mg，0.89mmol)在DMSO(4.0mL)中的溶液。将反应混合物在40℃、N₂下搅拌6h。将混合物用DCM(30mL)稀释，用水(2x15mL)洗涤并用EtOAc(2x20mL)萃取水层。将合并的有机层经Na₂SO₄干燥，浓缩并通过快速柱(在DCM中的0-10％MeOH)纯化，以得到为黄色固体的化合物8(300mg，34％收率)。LCMS(5-95,AB,1.5min):RT＝1.253min,m/z＝857.1[M/2+1]+。

在10℃下向化合物A4(100.0mg，0.050mmol)在水(2.0mL)和THF(2.0mL)中的溶液中添加HOAc(3.0mL)。将反应混合物在10℃下搅拌6h。将反应混合物用EtOAc(20mL)稀释，用水(2x15mL)、饱和NaHCO₃水溶液(15mL)和盐水(15mL)洗涤。将其经Na₂SO₄干燥并浓缩，以得到为黄色固体的粗化合物A5(71mg，99.8％收率)。LCMS(5-95,AB,1.5min):RT＝0.829min,m/z＝857.1[M/2-17]+。

在9℃下向化合物A5(36mg，0.030mmol)在DMSO(3.0mL)中的溶液中添加2-碘酰基苯甲酸(22mg，0.080mmol)。将反应混合物在40℃下搅拌6h。通过制备型HPLC(ACN 27-47％/0.225％FA水溶液)纯化混合物，以得到为白色固体的包含接头的PBD二聚体硼酸前药1(2.0mg，5.5％)。LCMS(5-95,AB,1.5min):RT＝0.813min,HRMS:m/z＝1397.5906[M+1]+。

在本公开的一些方面，包含接头的PBD二聚体硼酸前药1可以与抗体缀合以形成PBD二聚体ADC硼酸前药1A或PBD二聚体ADC硼酸前药1B。

实施例22B：包含接头的PBD二聚体硼酸对照1的制备

根据以下反应方案制备包含接头的PBD二聚体硼酸对照1：

向在DMF(2.0mL)中的化合物A1(500.0mg，0.590mmol)中添加Cbz-OSu(161mg，0.640mmol)。将混合物在50℃下搅拌4h后，添加另一批Cbz-OSu(161mg，0.640mmol)。将混合物在50℃再搅拌16h，并通过制备型TLC(在DCM中的5％MeOH，Rf＝0.8)纯化，然后通过制备型HPLC纯化，以得到为橙色油状物的化合物A2(220mg，35.2％)。LCMS(5-95,AB,1.5min):RT＝1.097min,m/z＝987.5[M+1]+。

在0℃下向三光气(26.45mg，0.090mmol)和MS(30mg)在DCM(3.0mL)中的混合物中添加化合物A2(220.0mg，0.220mmol)和三乙胺(22.6mg，0.220mmol)在DCM(2.0mL)中的溶液。将混合物在0℃下搅拌1h，并浓缩。在0℃下向异氰酸酯(225.0mg，0.220mmol)在DCM(6.0mL)中的溶液中添加MC_VC_PAB(34.59mg，0.060mmol)、Et3N(23mg，0.22mmol)和MS(30mg)在DMF(2.0mL)中的溶液。将混合物在20℃下搅拌16h后，用水将其淬灭。添加DCM(10mL)，分离，并且将DCM相浓缩并通过制备型TLC(在DCM中的15％MeOH，Rf＝0.4)纯化，以得到为浅黄色油状物的化合物A3(70mg，19.8％)。LCMS(5-95,AB,1.5min):RT＝1.107min,m/z＝793.9[M/2+1]+。

向在THF(3.0mL)和水(2.0mL)的混合物中的化合物A3(70.0mg，0.040mmol)中添加HOAc(1.0mL，17.49mmol)，并将混合物在40℃下搅拌8h。将混合物浓缩并通过制备型TLC(在DCM中的13％MeOH，Rf＝0.5)纯化，以得到为黄色油状物的化合物A4(40mg，67.8％)。LCMS(5-95,AB,1.5min):RT＝0.751min,m/z＝679.6[M/2+1]+。

在18℃下向化合物A4(30.0mg，0.020mmol)在DMSO(3.0mL)中的溶液中添加2-碘酰基苯甲酸(30.9mg，0.110mmol)。将反应混合物在40℃下搅拌16h后，将其通过制备型TLC(在DCM中的10％MeOH，Rf＝0.4)纯化，以得到为白色固体的包含接头的PBD二聚体硼酸对照1(13mg，43.5％)。LCMS(5-95,AB,1.5min):RT＝0.726min,m/z＝677.5[M/2+1]+。

在本公开的一些方面，包含接头的PBD二聚体硼酸对照1可以与抗体缀合以形成PBD二聚体ADC硼酸对照1A或PBD二聚体ADC硼酸对照1B。

实施例23：PBD单体和二聚体心肌黄酶前药的制备

实施例23A：PBD单体心肌黄酶前药2的制备

根据以下反应方案制备PBD单体心肌黄酶前药2：

以上结构中和实施例23中描绘的其它地方的每个星号代表手性中心。

在N₂下向0℃的三光气(58.39mg，0.200mmol)在DCM(2.0mL)中的溶液中缓慢添加化合物A1在DCM(5.0mL)中的溶液，并且将混合物在0℃下搅拌1h。在0℃下经10min将在DCM(2.0mL)中的化合物A2(100.0mg，0.450mmol)和三乙胺(91.5mg，0.900mmol)逐滴添加到以上溶液中。将混合物在0℃下搅拌1h。将混合物用水(5.0mL)淬灭，分离并浓缩。将其通过制备型TLC(在DCM中的5％MeOH，Rf＝0.7)纯化，以得到为橙色固体的化合物A3(63mg，19％)。LCMS(5-95,AB,1.5min):RT＝1.007min,m/z＝654.3[M+1]+。

向化合物A3(63.0mg，0.100mmol)在THF(2.0mL)和水(1.0mL)中的溶液中添加乙酸(2.0mL，2.1mmol)。将混合物在15℃下搅拌16h。将混合物浓缩并通过制备型TLC(在DCM中的5％MeOH，Rf＝0.3)纯化，以得到为橙色固体的A4(40mg，77％)。LCMS(5-95,AB,1.5min):RT＝0.761min,m/z＝540.1[M+1]+。

向在DCM(3.0mL)中的化合物A4(26.0mg，0.050mmol)中添加DMP(40.0mg，0.090mmol)，使混合物在10℃下搅拌16h。将混合物用饱和Na₂SO₃和NaHCO₃溶液的混合物(3.0mL/3.0mL)淬灭。将有机相分离、浓缩并通过制备型HPLC(Diamonsil 150*20mm*5um，0.225％FA-ACN，ACN 23-53％)纯化，以得到为橙色固体的PBD单体心肌黄酶前药2(20mg，74％)。LCMS(5-95,AB,1.5min):RT＝0.747min,m/z＝538.1[M+1]+。

1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.22(s,1H),6.64(s,1H),6.52(s,1H),5.69(s,1H),5.59-5.57(d,J＝9.6Hz,1H),5.30-5.27(d,J＝13.6Hz,1H),5.16-5.15(m,2H),4.94-4.90(d,J＝13.6Hz,1H),4.32-4.27(d,J＝16.4Hz,1H),4.17-4.13(d,J＝16.4,1H),3.93(s,3H),3.83(s,3H),3.78-3.76(m,6H),3.64-3.59(m,1H),2.47(m,1H),2.96-2.89(m,1H),2.73-2.69(m,1H)。

实施例23B：PBD二聚体心肌黄酶前药1的制备

根据以下反应方案制备PBD二聚体心肌黄酶前药1：

在0℃下向三光气(56.03mg，0.190mmol)在DCM(2.0mL)中的溶液中逐滴添加化合物A1(400mg，0.420mmol)和三乙胺在DCM(5.0mL)中的溶液。将混合物在19℃下搅拌1h后，添加化合物A2(92.8mg，0.420mmol)和三乙胺(42.5mg，0.420mmol)在DMSO(0.50mL)/DCM(2.50mL)中的溶液。将混合物在19℃下搅拌2.0h。将混合物用DCM(20.0mL)稀释，用水(2x10.0mL)洗涤，并分离。用EtOAc(2x20mL)萃取水层，并且将合并的有机层经Na₂SO₄干燥，浓缩并通过制备型TLC(在DCM中的20％MeOH，Rf＝0.7)纯化，以得到化合物A3(150mg，30％)。LCMS(5-95,AB,1.5min):RT＝1.118min,m/z＝1201.7[M+1]+。

向化合物A3(130.0mg，0.110mmol)在THF(2.0mL)中的溶液中添加乙酸(3.0mL)和水(1.0mL)。将混合物在18℃下搅拌18h。添加饱和NaHCO₃以调整pH＝8，并用DCM(2x50mL)萃取混合物。将有机层合并，用盐水(30mL)和水(30mL)洗涤，并经Na₂SO₄干燥。将其浓缩并通过制备型TLC(在DCM中的6.7％MeOH)纯化，以得到为黄色固体的化合物A4(72mg，68％)。LCMS(5-95,AB,1.5min):RT＝0.766min,m/z＝972.3[M+1]+。

向化合物4(50.0mg，0.050mmol)在DCM(10mL)中的溶液中添加DMP(76.36mg，0.180mmol)，并将混合物在18℃下搅拌18h。过滤混合物，并用饱和Na₂CO₃(20.0mL)洗涤滤液。用DCM(2x20.0mL)萃取水层，并且将有机层合并，经Na₂SO₄干燥并浓缩。将其通过制备型TLC(在DCM中的6.7％MeOH，Rf＝0.5)纯化，以得到为黄色固体的化合物A5(40mg，74％)。LCMS(5-95,AB,1.5min):RT＝0.731min,m/z＝990.2[M+23]+。

在0℃下将TFA(1.0mL)逐滴添加到化合物A5(40.0mg，0.040mmol)中。将混合物在0℃下搅拌30min。在0℃下将饱和NaHCO₃逐滴添加到混合物中，以调整pH＝7。将其用DCM(3x20.0mL)萃取，并将合并的有机层用盐水(20.0mL)洗涤，经Na₂SO₄干燥并浓缩。通过制备型TLC(在DCM中的6.7％MeOH，Rf＝0.6)纯化残余物，以得到为黄色固体的PBD二聚体心肌黄酶前药1(4.9mg，14％)。LCMS(5-95,AB,1.5min):RT＝0.807min,m/z＝850.2[M+23]+。

实施例23C：PBD单体心肌黄酶前药3的制备

根据以下反应方案制备PBD单体心肌黄酶前药3：

在16℃下向化合物A1(280mg，1.27mmol)在DMF(10mL)中的溶液中添加DIEA(490mg，3.79mmol)和双(4-硝基苯基)碳酸酯(770mg，2.53mmol)。将反应混合物在16℃、N₂下搅拌2h。将反应溶液浓缩并用MTBE洗涤，以得到为橙色固体的化合物A2(500mg，78％)。LCMS(5-95,AB,1.5min):RT＝0.726min,m/z＝491.0[M+23]+。

在16℃下向化合物A2(500mg，0.99mmol)、化合物A3(240mg，1.95mmol)和HOBt(13mg，0.10mmol)在DMF(8.0mL)中的溶液中添加DIEA(340mg，2.63mmol)。将反应混合物在50℃、N₂下搅拌2h。浓缩反应液并通过MeCN(3x8mL)洗涤残余物，以得到为橙色固体的化合物A4(350mg，95％)。LCMS(5-95,AB,1.5min):RT＝0.745min,m/z＝393.1[M+23]+。

在0℃、N₂下向三光气(58mg，0.20mmol)在DCM(8.0mL)中的溶液中添加化合物A5(200mg，0.49mmol)和三乙胺(60.0mg，0.59mmol)在DCM(1.5mL)中的溶液。将反应混合物在12℃、N₂下搅拌30min并且在N₂下添加0℃的化合物A4(91mg，0.25mmol)、TEA(75mg，0.74mmol)和DMAP(6mg，0.05mmol)在DCM(1.5mL)和DMSO(1.0mL)中的溶液。将反应混合物在12℃、N₂下搅拌6h后，将其用DCM(30mL)稀释，用水(2x15mL)洗涤。用EtOAc(2x20mL)萃取水层，并且将合并的有机层经Na₂SO₄干燥，浓缩，并通过制备型HPLC(ACN 66-86％/0.225％FA水溶液)纯化，以得到为橙色固体的化合物A6(60mg，12％)。LCMS(5-95,AB,1.5min):RT＝1.051min,m/z＝803.2[M+1]+。

在10℃下向化合物A6(40mg，0.05mmol)在水(1.0mL)和THF(1.0mL)中的溶液中添加HOAc(1.5mL，26mmol)。将反应混合物在10℃下搅拌6h。将反应混合物用EtOAc(20mL)稀释并且用水(2x15mL)、饱和NaHCO₃(15mL)和盐水(15mL)洗涤。将其经Na₂SO₄干燥，浓缩，并通过制备型TLC(在DCM中的6.25％MeOH)纯化，以得到为橙色固体的化合物A7(35mg，97％)。LCMS(5-95,AB,1.5min):RT＝0.819min,m/z＝689.1[M+1]+。

在0℃下向化合物A7(35mg，0.050mmol)在DCM(4.0mL)中的溶液中添加DMP(61mg，0.14mmol)。将反应混合物在10℃下搅拌10h。将反应用饱和NaHCO₃/Na₂SO₃(4.0mL/4.0mL)淬灭并用DCM(3x10mL)萃取。将合并的有机层用NaHCO₃/Na₂SO₃(4.0mL/4.0mL)、盐水(7.0mL)洗涤。将其经Na₂SO₄干燥，浓缩，并通过制备型HPLC(ACN 30-60％/0.225％FA水溶液)纯化，以得到为橙色固体的PBD单体心肌黄酶前药3(15mg，45％)。LCMS(5-95,AB,1.5min):RT＝0.806min,m/z＝687.2[M+1]+；1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.30-7.25(m,2H),7.18-7.15(M,4H),6.77(s,1H),6.69(S,1H),6.50(s,1H),5.67(s,1H),5.56(d,J＝9.2Hz,1H),5.27(d,J＝12.4Hz,1H),5.17-5.12(m,4H),4.81(d,J＝12.4Hz,1H),4.27(d,J＝16.0Hz,1H),4.12(d,J＝16.0Hz,1H),3.33(s,3H),3.89(s,3H),3.81(s,3H),3.68-3.59(m,4H),2.93-2.87(m,1H),2.69(d,J＝15.6Hz,1H)。

实施例23D：PBD二聚体心肌黄酶前药2的制备

根据以下反应方案制备PBD二聚体心肌黄酶前药2：

在0℃、N₂下向三光气(62.0mg，0.210mmol)在DCM(12mL)中的溶液中添加化合物A1(500.0mg，0.520mmol)和三乙胺(63.0mg，0.620mmol)在DCM(2.0mL)中的溶液。将反应混合物在12℃、N₂下搅拌30min，并且在0℃、N₂下添加化合物A2(97.0mg，0.260mmol)、DMAP(6.0mg，0.050mmol)和三乙胺(79.0mg，0.780mmol)在DCM(1.5mL)和DMSO(0.60mL)中的溶液。将反应混合物在12℃、N₂下搅拌6h。将其用DCM(30mL)稀释，用水(2x15mL)洗涤。用EtOAc(2x20mL)萃取水层，并将有机层经Na₂SO₄干燥。将其通过硅胶色谱(在DCM中的3％MeOH)纯化，以得到为橙色固体的化合物A3(200mg，49％)。LCMS(5-95,AB,1.5min):RT＝1.294min,m/z＝1349.6[M+1]+。

在9℃下向化合物A3(206.9mg，0.130mmol)在水(2.0mL)和THF(2.0mL)中的溶液中添加HOAc(3.0mL，52.46mmol)。将反应混合物在9℃下搅拌10h。将其用DCM(20mL)稀释，并将混合物用NaHCO₃(2x15mL)、水(15mL)洗涤。将其经Na₂SO₄干燥，浓缩，并通过制备型TLC(在DCM中的6.25％MeOH)纯化，以得到为黄色固体的化合物A4(100mg，66％)。LCMS(5-95,AB,1.5min):RT＝0.932min,m/z＝1121.6[M+1]+。

在0℃下向化合物A4(100.0mg，0.090mmol)在DCM(10mL)中的溶液中添加DMP(113.0mg，0.270mmol)。将反应混合物在9℃下搅拌10h。将反应用NaHCO₃/Na₂SO₃的饱和溶液(5.0mL/5.0mL)淬灭并用DCM(3x10mL)萃取。将合并的有机层用NaHCO₃/Na₂SO₃(5mL/5mL)、盐水(10mL)洗涤，干燥并浓缩。通过制备型TLC(在DCM中的6.25％MeOH)纯化残余物，以得到为橙色固体的化合物A5(45mg，46％)。LCMS(5-95,AB,1.5min):RT＝0.884min,m/z＝1140.0[M+23]+。

在0℃下将冷TFA(95％水溶液，2.0mL)添加到化合物A5(35.0mg，0.030mmol)中。将反应混合物在0℃下搅拌15min。在0℃下将反应混合物逐滴添加到饱和NaHCO₃水溶液(4.0mL)中，并用DCM(4x8.0mL)萃取。将合并的有机层用盐水(15mL)洗涤，经Na₂SO₄干燥并浓缩。将其通过制备型HPLC(ACN 36-66/0.225％FA水溶液)纯化，以得到为橙色固体的PBD二聚体心肌黄酶前药2(6.1mg，19％)。LCMS(5-95,AB,1.5min):RT＝0.831min,m/z＝999.3[M+1]+。

实施例23E：PBD二聚体心肌黄酶前药3的制备

根据以下反应方案制备PBD二聚体心肌黄酶前药3：

在0℃下向三光气(28.0mg，0.090mmol)在DCM(5.0mL)中的溶液中添加化合物A1(200mg，0.210mmol)和三乙胺(42.0mg，0.420mmol)在DCM(3.0mL)中的溶液。将其在N₂下在26℃下搅拌20min。将混合物浓缩并重新溶解于DCM(3.0mL)中，并在0℃下添加到三乙胺(38.0mg，0.380mmol)和化合物A2(51.0mg，0.230mmol)在DCM(3.0mL)中的经搅拌溶液中。将其在N₂下在26℃下搅拌2h，并通过柱色谱(在石油醚中的0-40％EtOAc)纯化，以得到为黄色固体的化合物A3(240mg，90％)。LCMS(5-95,AB,1.5min):RT＝1.159min,m/z＝1200.5[M+1]+。

在25℃下向化合物A3(240.0mg，0.200mmol)在THF(4.0mL)和水(4.0mL)中的溶液中添加HOAc(6.0mL，153mmol)。将混合物在25℃下搅拌10h，并添加EtOAc(100mL)。将其用水(50mL)、饱和NaHCO₃(50mL)，接着盐水(50mL)洗涤。将有机层干燥并浓缩，以得到为黄色固体的粗产物化合物A4(194mg，99.8％)。LCMS(5-95,AB,1.5min):RT＝0.767min,m/z＝972.4[M+1]+。

向化合物A4(194.0mg，0.200mmol)在DCM(15mL)中的溶液中添加DMP(211.6mg，0.500mmol)。将混合物在26℃下搅拌1h，并用饱和的Na₂SO₃/NaHCO₃(10mL/10mL)淬灭。将其用DCM(2x30mL)稀释，并分离。将DCM相用水(20mL)洗涤，经Na₂SO₄干燥，浓缩并通过制备型HPLC(ACN 43-63/0.225％FA水溶液)纯化，以得到为黄色固体的化合物A5(70mg，36％收率)。LCMS(5-95,AB,1.5min):RT＝0.733min,m/z＝968.6[M+1]+。

在0℃下将TFA(0.20mL，2.68mmol)添加到化合物A5(40.0mg，0.040mmol)中。将反应混合物在0℃下搅拌30min，并用冷的饱和NaHCO₃(2.0mL)淬灭。添加DMSO(2.0mL)，并通过制备型HPLC(ACN 36-66％/10mM NH4HCO3水溶液)纯化混合物，以得到为黄色固体的PBD二聚体心肌黄酶前药3(9.9mg，28％)。LCMS(5-95,AB,1.5min):RT＝0.695min,m/z＝850.3[M+1]+。

实施例24：醌的合成

实施例24A：醌1的合成

根据以下反应方案制备醌1：

将NaH(8.9g，0.223mol)在DMF(300mL)中的悬浮液在冰浴中冷却。向其中逐滴添加起始胺(30g，0.171mol)在DMF(150mL)中的溶液。将反应混合物在室温下搅拌60分钟。然后添加碘甲烷(31.5g，0.223mol)。将反应混合物在室温下搅拌1小时。然后将混合物倒入10％的NaHCO₃水溶液中，用EA萃取。将合并的有机相用10％NaHCO₃水溶液、盐水洗涤并干燥。将溶液浓缩，以得到粗产物，将其从EA/Hex研磨，以得到为浅黄色固体的产物(29.5g，91.2％)。

将起始醛(29.5g，156mmol，1当量)5-甲氧基-1-甲基-1H-吲哚-3-甲醛在乙酸(300mL)中的溶液冷却至10℃。向其中添加硝酸(4.6mL)在乙酸(20mL)中的混合物。然后将反应混合物在室温下搅拌16h。获得黄色悬浮液，将其倒入冰水混合物中，滤出所得晶体并干燥。将粗产物从EA/Hex研磨，以得到为黄色固体的产物(30.0g，82.1％)。

向起始材料(10g，43mmol)在乙醇(600mL)中的悬浮液中添加锡粉(44.23g，0.37mol)。然后添加3N HCl(200mL)。将反应液在室温下搅拌2小时。将溶液用饱和NaHCO₃水溶液稀释。将混合物过滤并用EA洗涤。分离有机相，并用EA萃取水相。将合并的有机相用盐水洗涤、干燥并浓缩，以得到粗产物，将其从EA/Hex＝1/20研磨，以得到为灰色固体的产物(6.0g，68.3％)。

将起始醛(5.0g，24.5mmol，1当量)溶解于100mL THF中。将LiAlH₄(1.86g，49mmol，2当量)在200mL THF中的悬浮液冷却至0℃。将醛溶液逐滴添加至LiAlH₄溶液中。使反应液达到室温并在室温下搅拌30min。将其用水淬灭，然后通过硅藻土过滤，用MgSO₄干燥并蒸发。残余物直接用于下一反应。将残余物溶解于300mL丙酮中。向300mL的0.3M NaH₂PO₄溶液中添加19.7g(73.5mmol，3当量)的弗里米盐。将该混合物添加到丙酮中的残余物中并在室温下搅拌0.5h。真空除去过量的丙酮。将所得残余物用二氯甲烷萃取并用水洗涤。将有机层干燥(MgSO₄)并蒸发。将粗产物从EA/Hex研磨，以得到为橙色固体的产物(2.51g，46.1％，两步)。

1H NMR(400MHz,CDCl3)δ6.70(s,1H),5.69(s,1H),4.64(d,J＝6.9Hz,2H),3.93(s,3H),3.84(s,3H),3.78(t,J＝7.0Hz,1H)。

实施例24B：醌2的合成

根据以下反应方案制备醌2：

将4.6g硅胶添加到3-氧代丁酸乙酯(50g，0.38mmol)中。向其中添加甲胺溶液(水溶液；40％，35.7g，0.46mol)并将混合物搅拌过夜。将反应混合物用DCM萃取，用MgSO₄干燥，过滤并蒸发，以得到为无色油状物的产物(50g，92％)。

将50g(0.35mol，1当量)的亚胺和37.7g(0.35mol，1当量)的1,4-苯醌溶解于400mL硝基甲烷中。将混合物放置24h(不搅拌)。产物晶体沉淀。将它们过滤，用硝基甲烷洗涤并从EtOAc中重结晶。黄色固体，收率：25g，30.6％。

将醇(25g，0.11mol)和KOH(25.5g，0.46mol)在DMSO(200mL)中的溶液在室温下搅拌30分钟。然后添加碘甲烷(62g，0.44mol)。将混合物用EA(700mL)稀释，用1N HCl、盐水洗涤并干燥。将溶液浓缩以得到粗产物，将其通过硅胶柱纯化，以得到为灰色固体的产物(20g，75.5％)。

向冷却至0℃的20g(81mmol，1当量)5-甲氧基-1,2-二甲基-1H-吲哚-3-羧酸乙酯在乙酸(200mL)中的溶液中添加硝酸(4.6mL)和乙酸(20mL)的混合物。然后将混合物在室温下搅拌2h。获得黄色悬浮液，将其倒入冰水混合物中，滤出所得晶体并干燥。通过快速色谱纯化粗产物，以得到为黄色固体的产物(14.0g，59.3％)。

向起始酯(8.0g，27mmol)在乙醇(600mL)中的悬浮液中添加锡粉(14.6g，0.123mol)。然后添加3N HCl(200mL)。将反应液在室温下搅拌2小时。除去溶剂，并且将残余物用水稀释，用饱和NaHCO₃中和。将混合物过滤并用EA洗涤。分离有机相，并用EA萃取水相。将合并的有机相用盐水洗涤、干燥并浓缩，以得到粗产物，将其从EA/Hex＝1/20研磨，以得到为灰色固体的产物(5.0g，70.6％)。

将5.0g(19.06mmol，1当量)的起始材料溶解于50mL THF中。将2.9g(76.25mmol，4当量)LiAlH₄溶解于250mL THF中并冷却至0℃。将起始材料的溶液逐滴添加到LiAlH4溶液中。使反应液达到室温并在室温下搅拌30min。将其用水、NaOH和硅胶淬灭。将其通过硅藻土过滤，用MgSO₄干燥并蒸发。残余物直接用于下一反应。将残余物溶解于330mL丙酮中。向330mL的0.3M NaH₂PO₄溶液中添加15.32g(57.18mmol，3当量)的弗里米盐。将该混合物添加到在丙酮中的羟甲基吲哚中并在室温下搅拌1h。真空除去过量的丙酮。将所得残余物用二氯甲烷萃取并用水洗涤。将有机层干燥(MgSO₄)并蒸发。通过快速色谱纯化粗产物，以得到为红色固体的产物(2.51g，56％)。

1H NMR(400MHz,CDCl3)δ5.63(s,1H),4.61(s,2H),3.88(s,3H),3.82(s,3H),2.23(s,3H)。

实施例24C：醌3的合成

根据以下反应方案制备醌3：

将4-甲氧基苯胺(32g，259.2mmol)溶解于HCl(37％，64mL)和水(112mL)中。在-5℃下逐滴添加NaNO₂(19.5g，283.2mmol)在水(32mL)中的溶液。添加后，将混合物在0℃下搅拌15min，并通过添加CH₃COONa(16.8g，204.8mmol)使pH达到3-4。在0℃下将乙基-2-乙酰乙酸乙酯(44.8g，283.2mmol)溶解于乙醇(200mL)中。向该溶液中添加KOH(15.6g，283.2mmol)在水(24mL)中的溶液。用320g冰处理所得溶液。立即添加4-甲氧基苯胺的重氮盐。然后将混合物调整至pH 5-6并在0℃下搅拌4h。将溶液在4℃下储存过夜并用EA(4×200mL)萃取。将合并的萃取物用盐水洗涤并通过NaSO₄干燥。蒸发大部分溶剂，并将残余物直接用于下一反应(180mL)。

在80℃下将(Z)-2-(2-(4-甲氧基苯基)亚肼基)丁酸乙酯(180mL)逐滴添加到3MHCl/EtOH(180mL)的溶液中。添加后，将混合物在80℃下保持3h。将溶剂蒸发，并将残余物用水(60mL)和DCM(300mL)处理。然后用DCM(3×100mL)萃取水层。将合并的有机层用盐水(150mL)洗涤，经Na₂SO₄干燥并蒸发至干燥，以得到粗化合物，将其从Hex研磨，以得到为黄色固体的产物(32.0g，53.2％)。

将5-甲氧基-3-甲基-1H-吲哚-2-羧酸乙酯(20.0g，85.7mmol)溶解于DCM(200mL)中并且将混合物冷却至-20℃，添加HNO₃(70％，9mL)并将混合物搅拌20min。将其用NaHO₃中和并用DCM(3x100mL)萃取，用NaSO₄干燥并浓缩至干燥。通过快速色谱纯化粗产物，以得到为黄色固体的产物(15.5g，59.3％)。

将MeI(30mL)添加到在含有KOH(10g，178mmol)的丙酮(500mL)中的5-甲氧基-3-甲基-4-硝基-1H-吲哚-2-羧酸乙酯(14.5g，52.1mmol)中。添加后，将混合物在室温下搅拌1h。从过量的KOH中滗析出溶剂，并用HCl中和混合物。然后用DCM(3×100mL)萃取混合物。将合并的有机层用盐水(150mL)洗涤，经Na₂SO₄干燥并蒸发至干燥，以得到粗化合物，将其从Hex和DCM研磨，以得到为黄色固体的产物(14.0g，53.2％)。

将锡粉(9.14g，77mol)添加到5-甲氧基-1,3-二甲基-4-硝基-1H-吲哚-2-羧酸乙酯(5.0g，17.1mmol)在乙醇(500mL)中的悬浮液中。然后添加3N HCl(130mL)。将反应液在室温下搅拌2小时。除去溶剂，并且将残余物用水稀释并用饱和NaHCO₃中和。将混合物过滤并用DCM洗涤。分离有机相，并用DCM萃取水相。将合并的有机相用盐水洗涤、干燥并浓缩，以得到粗产物，将其从EA/Hex＝1/20研磨，以得到为灰色固体的产物(4.0g，80％)。

将4-氨基-5-甲氧基-1,3-二甲基-1H-吲哚-2-羧酸乙酯(1.5g，5.72mmol)溶解于90mL THF中。将0.88g(22.68mmol，4当量)的LiAlH4溶解于180mL THF中并冷却至0℃。将4-氨基-5-甲氧基-1,3-二甲基-1H-吲哚-2-羧酸乙酯的溶液逐滴添加到LiAlH₄溶液中。使反应液达到室温并在室温下搅拌30min。然后将其用水、NaOH和硅胶淬灭。然后将其通过硅藻土过滤，用MgSO₄干燥并蒸发。将残余物溶解于170mL丙酮中并直接用于下一反应。向180mL的0.3M NaH₂PO₄溶液中添加弗里米盐(4.6g，17.16mmol，3当量)。将该混合物添加到在丙酮中的羟甲基吲哚中并在室温下搅拌1h。真空除去过量的丙酮。将所得残余物用二氯甲烷萃取并用水洗涤。将有机层干燥(MgSO₄)并蒸发。通过快速色谱纯化粗产物，以得到为橙色固体的产物(1.0g，56％)。

1H NMR(400MHz,CDCl3)δ5.63(s,1H),4.65(s,2H),4.02(s,3H),3.81(s,3H),2.34(s,3H)。

实施例24D：醌4的合成

根据以下反应方案制备醌4：

向250-mL圆底烧瓶中放置5-甲氧基-1H-吲哚-2-羧酸(10g，52.31mmol，1.00当量)在甲醇(100mL)中的溶液，然后在搅拌下逐滴添加亚硫酰氯(12.5g，105.07mmol，2.00当量)。将所得溶液加热至回流，持续4h，冷却至室温并真空浓缩，以得到为灰色固体的11g(粗制品)的5-甲氧基-1H-吲哚-2-羧酸甲酯。

向用氮气惰性气氛吹扫并维持的5-L 4颈圆底烧瓶中放置N,N-二甲基甲酰胺(2L)，然后在搅拌下分几批添加氢化钠(37.6g，1.10mol，1.50当量，70％)。在低于10℃下，在搅拌下向其中逐滴添加5-甲氧基-1H-吲哚-2-羧酸甲酯(150g，730.96mmol，1.00当量)。将混合物搅拌0.5h。在搅拌下向混合物中逐滴添加MeI(125g，0.88mol，1.20当量)。将所得溶液在室温下搅拌过夜并用5L水稀释。通过过滤收集固体，用3x1L的水洗涤并干燥，以得到为黄色固体的163g(粗制品)的5-甲氧基-1-甲基-1H-吲哚-2-羧酸甲酯。

向用氮气惰性气氛吹扫并维持的5000-mL 4颈圆底烧瓶中放置LiAlH₄(111g，2.92mol，4.00当量)在四氢呋喃(1500mL)中的溶液，然后在0℃下在搅拌下经30min逐滴添加5-甲氧基-1-甲基-1H-吲哚-2-羧酸甲酯(160g，729.81mmol，1.00当量)在四氢呋喃(1000mL)中的溶液。将混合物在0℃下搅拌1h并在室温下搅拌3h。然后通过在0℃下添加111g水、333mL的NaOH水溶液(15％)和111g水来淬灭混合物。将固体滤出。将滤液经无水硫酸钠干燥并真空浓缩，以得到为黄色固体的100g(72％)的(5-甲氧基-1-甲基-1H-吲哚-2-基)甲醇。

向用氮气惰性气氛吹扫并维持的3000-mL 4颈圆底烧瓶中放置(5-甲氧基-1-甲基-1H-吲哚-2-基)甲醇(100g，522.94mmol，1.00当量)在二氯甲烷(2000mL)中的溶液，然后在室温下在搅拌下逐滴添加三乙胺(61.6g，608.76mmol，1.50当量)。将混合物搅拌30min。在室温下在搅拌下向其中逐滴添加乙酰氯(79g，1.01mol，1.50当量)。将所得溶液在室温下搅拌3h并真空浓缩。将残余物在硅胶柱上用乙酸乙酯:石油醚(1:10-1:5)洗脱而纯化，以得到为黄色固体的75g(61％)的乙酸(5-甲氧基-1-甲基-1H-吲哚-2-基)甲酯。

向用氮气惰性气氛吹扫并维持的250-mL 3颈圆底烧瓶中放置N,N-二甲基甲酰胺(20g，273.64mmol，6.00当量)，然后在0℃下在搅拌下逐滴添加POCl₃(9.85g，0.0642mol，1.50当量)。将混合物在室温下搅拌30min。在低于0℃的温度下，在搅拌下向其中分批添加乙酸(5-甲氧基-1-甲基-1H-吲哚-2-基)甲酯(10g，42.87mmol，1.00当量)。将所得溶液在室温下搅拌2h并通过添加100mL水/冰淬灭。用氢氧化钠水溶液(2N)将溶液的pH值调整至7-8。用3x200mL乙酸乙酯萃取所得溶液。将有机层合并，经无水硫酸钠干燥并真空浓缩。将残余物在硅胶柱上用乙酸乙酯:石油醚(1:3)洗脱而纯化，以得到为黄色固体的9g(80％)乙酸(3-甲酰基-5-甲氧基-1-甲基-1H-吲哚-2-基)甲酯。

向用氮气惰性气氛吹扫并维持的250-mL 3颈圆底烧瓶中放置乙酸(3-甲酰基-5-甲氧基-1-甲基-1H-吲哚-2-基)甲酯(9g，3.60mmol，1.00当量)、AcOH(100mL)，然后在低于5℃的温度下在搅拌下逐滴添加HNO3(20mL)在AcOH(50mL)中的溶液。将所得溶液在室温下搅拌30min，用1000mL水稀释并搅拌30min。通过过滤收集固体，用3x100mL水洗涤并干燥，以得到为浅红色固体的8.6g(粗制品)的乙酸(3-甲酰基-5-甲氧基-1-甲基-4-硝基-1H-吲哚-2-基)甲酯。

向用氮气惰性气氛吹扫并维持的1000-mL 3颈圆底烧瓶中放置乙酸(3-甲酰基-5-甲氧基-1-甲基-4-硝基-1H-吲哚-2-基)甲酯(8g，26.12mmol，1.00当量)、乙醇(400mL)，然后在0℃下在搅拌下分批添加Sn(34.1g，11.00当量)。在搅拌下向其中逐滴添加氯化氢(4N)(400mL)。将所得溶液在0℃下搅拌2h，真空浓缩并用500mL水稀释。用饱和碳酸氢钠水溶液将溶液的pH值调整至7-8。将固体滤出并用3x50mL的EA洗涤。将滤液用4x200mL乙酸乙酯萃取。将有机层合并，经无水硫酸钠干燥并真空浓缩。将残余物在硅胶柱上用乙酸乙酯:石油醚(1:2)洗脱而纯化，以得到为黄色固体的6.5g(90％)的乙酸(4-氨基-3-甲酰基-5-甲氧基-1-甲基-1H-吲哚-2-基)甲酯。

向用氮气惰性气氛吹扫并维持的2000-mL 3颈圆底烧瓶中放置乙酸(4-氨基-3-甲酰基-5-甲氧基-1-甲基-1H-吲哚-2-基)甲酯(6g，21.72mmol，1.00当量)、丙酮(600mL)，然后在小于10℃的温度下在搅拌下逐滴添加(KO₃S)₂NO(17.48g，65.2mol，3.00当量)在NaH₂PO₄(0.4M)(1200mL)中的溶液。将所得溶液在室温下搅拌2h并真空浓缩。将残余物用3x300mL二氯甲烷萃取。将有机层合并，用3x300mL水洗涤，经无水硫酸钠干燥并真空浓缩。将残余物在硅胶柱上用乙酸乙酯:石油醚(1:2)洗脱而纯化，以得到为黄色固体的3.5g(55％)的乙酸(3-甲酰基-5-甲氧基-1-甲基-4,7-二氧代基-4,7-二氢-1H-吲哚-2-基)甲酯。

向500-mL 3颈圆底烧瓶中放置乙酸(3-甲酰基-5-甲氧基-1-甲基-4,7-二氧代基-4,7-二氢-1H-吲哚-2-基)甲酯(3.5g，12.02mmol，1.00当量)、CH₃CN(200mL)、NaH₂PO₄(0.6g，4mmol，0.30当量)、H₂O₂(2g，59mmol，5.00当量)、NaClO₂(2.5g，28mmol，2.41当量)和H₂O(50mL)。将所得溶液在室温下搅拌2h并通过添加500mL水淬灭。用HCl(2mol/L)将溶液的pH值调整至2。用4x300mL乙酸乙酯萃取所得溶液。将有机层合并，用2x200mL盐水洗涤，经无水硫酸钠干燥并真空浓缩，以得到为红色固体的3.5g(95％)的2-[(乙酰氧基)甲基]-5-甲氧基-1-甲基-4,7-二氧代基-4,7-二氢-1H-吲哚-3-羧酸。

向用氮气惰性气氛吹扫并维持的250-mL 3颈圆底烧瓶中放置2-[(乙酰氧基)甲基]-5-甲氧基-1-甲基-4,7-二氧代基-4,7-二氢-1H-吲哚-3-羧酸(3.8g，12.37mmol，1.00当量)、甲醇(100mL)和氯化氢(20mL)。将所得溶液在60℃下搅拌4h，真空浓缩，通过添加500mL水淬灭并用4x200mL乙酸乙酯萃取。将有机层合并，经无水硫酸钠干燥并真空浓缩。将残余物在硅胶柱上用乙酸乙酯:石油醚(1:3)洗脱而纯化。通过制备型HPLC纯化粗产物，以得到为黄色固体的0.3g(9％)的2-(羟甲基)-5-甲氧基-1-甲基-4,7-二氧代基-4,7-二氢-1H-吲哚-3-羧酸甲酯。

LC-MS(ES,m/z):280[M+H]+。1H-NMR-300MHz,CDCl3,ppm):δ5.73(s,1H),4.77(s,2H),4.09(s,3H),3.95(s,3H),3.85(s,3H)。

实施例24E：醌5的合成

根据以下反应方案制备醌5：

向250-mL圆底烧瓶中放置5-甲氧基-1H-吲哚-2-羧酸(10g，52.31mmol，1.00当量)在甲醇(100mL)中的溶液，然后在搅拌下逐滴添加亚硫酰氯(12.5g，105.07mmol，2.00当量)。将所得溶液加热至回流，持续4h，冷却至室温并真空浓缩，以得到为灰色固体的11g(粗制品)的5-甲氧基-1H-吲哚-2-羧酸甲酯。

向用氮气惰性气氛吹扫并维持的5-L 4颈圆底烧瓶中放置N,N-二甲基甲酰胺(2L)，然后在搅拌下分几批添加氢化钠(37.6g，1.10mol，1.50当量，70％)。在低于10℃的温度下在搅拌下向其中逐滴添加5-甲氧基-1H-吲哚-2-羧酸甲酯(150g，730.96mmol，1.00当量)。将混合物搅拌0.5h。在搅拌下向混合物中逐滴添加MeI(125g，0.88mol，1.20当量)。将所得溶液在室温下搅拌过夜并用5L水稀释。通过过滤收集固体，用3x1L的水洗涤并干燥，以得到为黄色固体的163g(粗制品)的5-甲氧基-1-甲基-1H-吲哚-2-羧酸甲酯。

向用氮气惰性气氛吹扫并维持的5000-mL 4颈圆底烧瓶中放置LiAlH₄(111g，2.92mol，4.00当量)在四氢呋喃(1500mL)中的溶液，然后在0℃下在搅拌下经30min逐滴添加5-甲氧基-1-甲基-1H-吲哚-2-羧酸甲酯(160g，729.81mmol，1.00当量)在四氢呋喃(1000mL)中的溶液。将混合物在0℃下搅拌1h并在室温下搅拌3h。然后通过在0℃下添加111g水、333mL的NaOH水溶液(15％)和111g水来淬灭混合物。将固体滤出。将滤液经无水硫酸钠干燥并真空浓缩，以得到为黄色固体的100g(72％)的(5-甲氧基-1-甲基-1H-吲哚-2-基)甲醇。

向用氮气惰性气氛吹扫并维持的3000-mL 4颈圆底烧瓶中放置(5-甲氧基-1-甲基-1H-吲哚-2-基)甲醇(100g，522.94mmol，1.00当量)在二氯甲烷(2000mL)中的溶液，然后在室温下在搅拌下逐滴添加三乙胺(61.6g，608.76mmol，1.50当量)。将混合物搅拌30min。在室温下在搅拌下向其中逐滴添加乙酰氯(79g，1.01mol，1.50当量)。将所得溶液在室温下搅拌3h并真空浓缩。将残余物在硅胶柱上用乙酸乙酯:石油醚(1:10-1:5)洗脱而纯化，以得到为黄色固体的75g(61％)的(5-甲氧基-1-甲基-1H-吲哚-2-基)乙酸甲酯。

向用氮气惰性气氛吹扫并维持的250-mL 3颈圆底烧瓶中放置N,N-二甲基甲酰胺(20g，273.64mmol，6.00当量)，然后在0℃下在搅拌下逐滴添加POCl₃(9.85g，0.0642mol，1.50当量)。将混合物在室温下搅拌30min。在低于0℃的温度下，在搅拌下向其中分批添加乙酸(5-甲氧基-1-甲基-1H-吲哚-2-基)甲酯(10g，42.87mmol，1.00当量)。将所得溶液在室温下搅拌2h并通过添加100mL水/冰淬灭。用氢氧化钠水溶液(2N)将溶液的pH值调整至7-8。用3x200mL乙酸乙酯萃取所得溶液。将有机层合并，经无水硫酸钠干燥并真空浓缩。将残余物在硅胶柱上用乙酸乙酯:石油醚(1:3)洗脱而纯化，以得到为黄色固体的9g(80％)(3-甲酰基-5-甲氧基-1-甲基-1H-吲哚-2-基)乙酸甲酯。

向用氮气惰性气氛吹扫并维持的250-mL 3颈圆底烧瓶中放置乙酸(3-甲酰基-5-甲氧基-1-甲基-1H-吲哚-2-基)甲酯(9g，3.60mmol，1.00当量)、AcOH(100mL)，然后在低于5℃的温度下在搅拌下逐滴添加HNO3(20mL)在AcOH(50mL)中的溶液。将所得溶液在室温下搅拌30min，用1000mL水稀释并搅拌30min。通过过滤收集固体，用3x100mL水洗涤并干燥，以得到为浅红色固体的8.6g(粗制品)的乙酸(3-甲酰基-5-甲氧基-1-甲基-4-硝基-1H-吲哚-2-基)甲酯。

向用氮气惰性气氛吹扫并维持的1000-mL 3颈圆底烧瓶中放置乙酸(3-甲酰基-5-甲氧基-1-甲基-4-硝基-1H-吲哚-2-基)甲酯(8g，26.12mmol，1.00当量)、乙醇(400mL)，然后在0℃下在搅拌下分批添加Sn(34.1g，11.00当量)。在搅拌下向其中逐滴添加氯化氢(4N)(400mL)。将所得溶液在0℃下搅拌2h，真空浓缩并用500mL水稀释。用饱和碳酸氢钠水溶液将溶液的pH值调整至7-8。将固体滤出并用3x50mL的EA洗涤。将滤液用4x200mL乙酸乙酯萃取。将有机层合并，经无水硫酸钠干燥并真空浓缩。将残余物在硅胶柱上用乙酸乙酯:石油醚(1:2)洗脱而纯化，以得到为黄色固体的6.5g(90％)的乙酸(4-氨基-3-甲酰基-5-甲氧基-1-甲基-1H-吲哚-2-基)甲酯。

向用氮气惰性气氛吹扫并维持的2000-mL 3颈圆底烧瓶中放置乙酸(4-氨基-3-甲酰基-5-甲氧基-1-甲基-1H-吲哚-2-基)甲酯(6g，21.72mmol，1.00当量)、丙酮(600mL)，然后在小于10℃的温度下在搅拌下逐滴添加(KO₃S)₂NO(17.48g，65.2mol，3.00当量)在NaH₂PO₄(0.4M)(1200mL)中的溶液。将所得溶液在室温下搅拌2h并真空浓缩。将残余物用3x300mL二氯甲烷萃取。将有机层合并，用3x300mL水洗涤，经无水硫酸钠干燥并真空浓缩。将残余物在硅胶柱上用乙酸乙酯:石油醚(1:2)洗脱而纯化，以得到为黄色固体的3.5g(55％)的(3-甲酰基-5-甲氧基-1-甲基-4,7-二氧代基-4,7-二氢-1H-吲哚-2-基)乙酸甲酯。

向250-mL 3颈圆底烧瓶中放置乙酸(3-甲酰基-5-甲氧基-1-甲基-4,7-二氧代基-4,7-二氢-1H-吲哚-2-基)甲酯(3.5g，12.02mmol，1.00当量)、二氯甲烷(47mL)，然后在搅拌下逐滴添加LiOH(380mg，15.87mmol，1.30当量)在甲醇(40mL)中的溶液。将所得溶液在室温下搅拌30min，用80mL的DCM稀释并用3x100mL水洗涤。将有机相经无水硫酸钠干燥并真空浓缩。将残余物在硅胶柱上用乙酸乙酯:石油醚(1:2)洗脱而纯化，以得到为黄色固体的1.1g(37％)的2-(羟甲基)-5-甲氧基-1-甲基-4,7-二氧代基-4,7-二氢-1H-吲哚-3-甲醛。

LC-MS(ES,m/z):250[M+H]+。1H-NMR(CDCl3,300MHz,ppm):10.55(s,1H),5.79(s,1H),4.83(s,2H),4.09(s,3H),3.89(s,3H)。

实施例24F：醌的合成6

根据以下反应方案制备醌6：

在0℃下向化合物1(30mg，0.135mmol)在无水DMF(2.0mL)中的经搅拌溶液中添加双(4-硝基苯基)碳酸酯(82.5mg，0.271mmol)和DIEA(87.5mg，0.678mmol)，然后在N₂下将混合物在25℃下搅拌2h。混合物不经进一步纯化用于下一步骤。

在0℃下向以上的混合物中添加化合物3(100.2mg，0.814mmol)、DIEA(87.6mg，0.678mmol)、DMF(2.0mL)以及催化量的HOBt(5.0mg)。然后在N₂下将混合物在25℃下搅拌15h。将其用水(15mL)稀释，并用EtOAc(30mL×4)萃取。将合并的有机相用盐水(30mL)洗涤，经Na₂SO₄干燥，并浓缩，以得到为红色固体的期望产物(26mg，52％)。LCMS:(5-95AB,1.5min),0.714min,MS＝392.8[M+23]。

在0℃下向化合物4(26mg，0.070mmol)在无水DMF(1.0mL)中的溶液中添加双(4-硝基苯基)碳酸酯(42.7mg，0.140mmol)和DIEA(45.4mg，0.351mmol)。然后在N₂下将混合物在25℃下搅拌15h。混合物不经进一步纯化用于下一步骤。

在0℃下向化合物5(37.59mg，0.070mmol)在无水DMF(1.0mL)中的溶液中添加诺氟沙星(44.83mg，0.140mmol)和DIEA(45.36mg，0.351mmol)。在N₂下将混合物在25℃下搅拌2h。将其过滤并通过制备型HPLC(FA)纯化滤液，以得到为黄色固体的产物(30mg，59.7％)。LCMS:(5-95,AB,1.5min),RT＝0.862min,MS＝715.9[M+1]+；1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.86(s,1H),8.95(s,1H),8.28(s,1H),7.95-7.93(d,J＝8.0Hz,1H),7.46-7.44(d,J＝8.0Hz,2H),7.33-7.31(d,J＝8.0,2H),7.19(s,1H),6.68(s,1H),5.85(s,1H),5.22(s,2H),5.04(s,2H),4.57(s,2H),3.96(s,3H),3.77(s,3H),3.60(s,8H),1.40(s,3H)。

实施例24G：醌7的合成

根据以下反应方案制备醌7：

在30℃下向化合物1(100mg，0.45mmol)在无水DMF(10mL)中的溶液中添加双(4-硝基苯基)碳酸酯(280mg，0.9mmol)和DIEA(175mg，1.36mmol)。在N₂下将混合物在30℃下搅拌16h。其不经进一步纯化用于下一步骤。

在30℃下向化合物2、诺氟沙星(288mg，0.9mmol)在无水DMF(10.0mL)中的溶液中添加DIEA(116mg，0.90mmol)。将混合物在30℃下搅拌2h后，将其过滤并且将滤饼用DCM/MeOH(10/1)洗涤且接着浓缩，以得到为黄色固体的期望产物(150mg，59％)。

LCMS:(5-95,AB,1.5min),RT＝0.824min,MS＝566.9[M+1]；1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.89(s,1H),7.94(d,J＝13.2Hz,1H),7.20(d,J＝7.2Hz,1H),6.63(s,1H),5.83(s,1H),5.22(s,2H),4.57(d,J＝6.8Hz,2H),3.97(s,2H),3.80(s,2H),3.63(s,3H),3.37(s,3H),3.21(s,4H),1.46(d,J＝7.2Hz,3H)。

实施例24H：醌8的合成

根据以下反应方案制备醌8：

将醇(100mg，0.4mmol)溶解于DMF(2mL)中。添加对硝基苯基碳酸酯(610mg，2.0mmol，5当量)，然后添加DIPEA(0.35mL，2.0mmol，5当量)，并将反应液在室温下搅拌3h。将反应液浓缩并在粗制品上进行。

将诺氟沙星(130mg，0.4mmol，1当量)添加到小瓶中，然后添加起始碳酸酯(200mg，0.4mmol)，然后添加DMF(3mL)。添加HOBt(10mg，0.08mmol，0.2当量)，然后添加吡啶(0.3mL，4mmol，10当量)，并将反应液在室温下搅拌19h。通过HPLC纯化反应液，以得到136mg的产物(57％，两步)。

1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ10.40(s,1H),8.96(s,1H),7.94(d,J＝13.2Hz,1H),7.20(d,J＝7.2Hz,1H),5.99(s,1H),5.49(s,2H),4.58(q,J＝7.1Hz,2H),4.02(s,3H),3.83(s,3H),3.63-3.48(m,5H),2.07(s,3H),1.41(t,J＝7.1Hz,3H)。

实施例24I：醌9的合成

根据以下反应方案制备醌9：

将醇(200mg，0.9mmol)溶解于DMF(4mL)中。添加对硝基苯基碳酸酯(284mg，1mmol，1.1当量)，然后添加DIPEA(0.3mL，1.7mmol，2当量)，并将反应液在室温下搅拌19h。将反应液浓缩并在粗制品上进行。

将诺氟沙星(290mg，0.9mmol，1当量)添加到小瓶中，然后添加起始碳酸酯(350mg，0.9mmol)，然后添加DMF(4mL)。添加HOBt(25mg，0.18mmol，0.2当量)，然后添加吡啶(0.74mL，9mmol，10当量)，并将反应液在室温下搅拌24h。通过HPLC纯化反应液，以得到103mg的产物(20％，两步)。

1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.99(s,1H),7.98(d,J＝12.8Hz,1H),7.31(s,1H),7.24(d,J＝7.0Hz,1H),5.86(s,1H),5.19(s,2H),4.61(d,J＝9.9Hz,4H),3.92(s,3H),3.80(s,3H),3.63(s,6H),1.58-1.33(m,3H)。

实施例24J：醌10的合成

根据以下反应方案制备醌10：

将醇(100mg，0.43mmol)溶解于DMF(2mL)中。添加对硝基苯基碳酸酯(142mg，0.47mmol，1.1当量)，然后添加DIPEA(0.15mL，0.85mmol，2当量)，并将反应液在室温下搅拌19h。将反应液浓缩并在粗制品上进行。

将诺氟沙星(136mg，0.43mmol，1当量)添加到小瓶中，然后添加起始碳酸酯(170mg，0.43mmol)，然后添加DMF(7mL)。添加HOBt(12mg，0.09mmol，0.2当量)，然后添加吡啶(0.35mL，4.3mmol，10当量)，并将反应液在室温下搅拌24h。通过HPLC纯化反应液，以得到18mg的产物(7％，两步)。

1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.95(s,1H),8.48(s,1H),7.94(d,J＝13.0Hz,1H),7.20(d,J＝7.1Hz,1H),6.80(s,1H),5.78(s,1H),5.17(s,2H),4.58(d,J＝7.7Hz,2H),3.86(s,3H),3.76(s,4H),3.53(s,5H),2.28(s,3H),1.40(t,J＝7.0Hz,3H)。

实施例24K：醌11的合成

根据以下反应方案制备醌11：

将醇(100mg，0.43mmol)溶解于DMF(2mL)中。添加对硝基苯基碳酸酯(142mg，0.47mmol，1.1当量)，然后添加DIPEA(0.15mL，0.85mmol，2当量)，并将反应液在室温下搅拌19h。将反应液浓缩并在粗制品上进行。

将诺氟沙星(136mg，0.43mmol，1当量)添加到小瓶中，然后添加起始碳酸酯(170mg，0.43mmol)，然后添加DMF(7mL)。添加HOBt(12mg，0.09mmol，0.2当量)，然后添加吡啶(0.35mL，4.3mmol，10当量)，并将反应液在室温下搅拌24h。通过HPLC纯化反应液，以得到31mg的产物(12％，两步)。

1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.95(s,1H),8.49(s,2H),7.94(d,J＝13.1Hz,1H),6.76(s,2H),5.19(s,2H),4.58(d,J＝7.5Hz,2H),3.96(s,3H),3.83-3.69(m,5H),3.58(t,J＝5.1Hz,4H),2.30(s,3H),1.40(t,J＝7.1Hz,3H)。

实施例24L：醌12的合成

根据以下反应方案制备醌12：

将醇(100mg，0.36mmol)溶解于DMF(2mL)中。添加对硝基苯基碳酸酯(545mg，1.8mmol，5当量)，然后添加DIPEA(0.31mL，1.8mmol，5当量)，并将反应液在室温下搅拌3h。将反应液浓缩并在粗制品上进行。

将诺氟沙星(110mg，0.36mmol，1当量)添加到小瓶中，然后添加起始碳酸酯(160mg，0.36mmol)，然后添加DMF(3mL)。添加HOBt(10mg，0.07mmol，0.2当量)，然后添加吡啶(0.29mL，3.6mmol，10当量)，并将反应液在室温下搅拌19h。添加更多的诺氟沙星(110mg，0.36mmol，1当量)并将反应液搅拌2.5天。通过HPLC纯化反应液，以得到89mg的产物(40％，两步)。

1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.96(s,1H),7.94(d,J＝13.1Hz,1H),7.20(d,J＝7.2Hz,1H),5.93(s,1H),5.32(s,2H),4.58(q,J＝7.1Hz,2H),4.00(s,3H),3.80(d,J＝3.3Hz,6H),3.64-3.49(m,8H),1.41(t,J＝7.1Hz,3H)。

实施例25：包含用于与抗体缀合的接头的PBD二聚体心肌黄酶前药1的合成

根据以下反应方案制备包含接头的PBD二聚体心肌黄酶前药1：

以上结构中和实施例25中描绘的其它地方的每个星号代表手性中心。

在30℃下向化合物A1(1.00g，1.17mmol)在DCM(30mL)中的溶液中添加三光气(347mg，1.17mmol)和Et₃N(356mg，3.52mmol)在DCM(10mL)中的溶液。将混合物在30℃下搅拌30min后，将其浓缩，添加二乙酸二丁基锡(0.32mL，1.22mmol)，然后添加化合物A2(215mg，0.97mmol)和Et₃N(369mg，3.65mmol)在DMF(15mL)中的溶液。将混合物在25℃下搅拌1h。将混合物用水(10mL)稀释并搅拌20min。然后浓缩混合物并通过快速柱色谱(在DCM中的0-5％MeOH)纯化，以得到为黄色固体的化合物A3(800mg，26.9％)。LCMS(5-95,AB,1.5min):RT＝1.032min,m/z＝1100.5[M+1]+。

向三光气(97.1mg，0.33mmol)在DCM(15mL)中的溶液中添加化合物A3(800.0mg，0.33mmol)和Et3N(99.31mg，0.98mmol)在DCM(5.0mL)中的溶液。将混合物在30℃下搅拌30min后，将其浓缩。向以上残余物中添加MC_VC_PAB(368.0mg，0.33mmol)和Et₃N(0.14mL，0.98mmol)在DMF(15mL)中的溶液。将混合物在25℃下搅拌12h。将混合物浓缩并通过快速柱色谱(在DCM中的5-10％MeOH)纯化，以得到为黄色固体的A4(300mg，37％)。LCMS(5-95,AB,1.5min):RT＝1.023min,m/z＝850.5[M/2+1]+。

向化合物A4(300.0mg，0.18mmol)在THF(1.0mL)中的溶液中添加水(1.0mL)和HOAc(1.5mL)，并在25℃下搅拌12h。将混合物用EtOAc(80mL)稀释，用饱和NaHCO₃(3x40mL)洗涤，并浓缩，以得到为红色固体的化合物A5(160mg，61.7％)。

向化合物A5(140.0mg，0.10mmol)在DMSO(5.0mL)中的溶液中添加IBX(266mg，0.95mmol)。将混合物在38℃下搅拌12h后，将其通过制备型HPLC(ACN 37-67％/0.225％FA水溶液)纯化，然后通过制备型TLC(在DCM中的10％MeOH，Rf＝0.5)纯化，以得到为黄色固体的包含接头的PBD二聚体心肌黄酶前药1(15mg，10.5％)。LCMS(5-95,AB,1.5min):RT＝0.712min,m/z＝734.2[M/2+1]+。

实施例26：PBD二聚体前药抗体-药物缀合物(ADC)的合成

ADC 1A和1B通过抗体和实施例21D的PBD二聚体ADC二硫化物前药接头-药物中间体的缀合制备，并具有以下结构：

ADC 2A和2B通过抗体和实施例21B的PBD二聚体ADC二硫化物前药接头-药物中间体的缀合制备，并具有以下结构：

ADC 3通过抗体和实施例21A的PBD二聚体ADC二硫化物前药接头-药物中间体的缀合制备，并具有以下结构：

ADC 4通过抗体和实施例21C的PBD二聚体ADC二硫化物前药接头-药物中间体的缀合制备，并具有以下结构：

ADC 5通过抗体和实施例21E的PBD二聚体ADC二硫化物前药接头-药物中间体的缀合制备，并具有以下结构：

PBD二聚体ADC硼酸前药1A和1B通过抗体和实施例22A的PBD二聚体ADC硼酸前药接头-药物中间体的缀合制备，并具有以下结构：

PBD二聚体ADC心肌黄酶前药1A和1B通过抗体和实施例25的PBD二聚体ADC心肌黄酶前药接头-药物中间体的缀合制备，并具有以下结构：

#imgpt200#

当介绍本公开的要素或其优选实施方案时，冠词“一种”、“一个”、“该”和“所述”旨在意指存在一个或多个要素。术语“包含”、“包括”和“具有”旨在包括端值并且意味着可能存在不同于已列出的元素的附加元素。

本书面描述使用实例来公开本发明，包括最佳模式，并且还使本领域任何技术人员能够实践本发明，包括制备和使用任何装置或系统并执行任何所并入的方法。本发明的可授予专利的范围由权利要求限定，并且可包括本领域技术人员想到的其它实例。如果此类其它实例具有不异于权利要求的字面语言的结构元素，或者如果此类其它实例包括与权利要求的字面语言无实质性差异的等效结构元素，则此类其它实例旨在处于权利要求的范围之内。

Claims (11)

1.一种吡咯并苯并二氮杂前药二聚体-抗体缀合化合物，其选自：

其中p为1、2、3、4、5、6、7或8，Ab为抗体，且每个星号独立地代表手性中心。

2.如权利要求1所述的化合物，其中p为1、2、3或4。

3.如权利要求1所述的化合物，其包含缀合化合物的混合物，其中缀合化合物的所述混合物中每个抗体的平均药物负载为2至5。

4.如权利要求3所述的化合物，其中所述抗体包含被工程改造以用于缀合的至少一个半胱氨酸巯基部分，其中所述抗体结合选自以下各项的一种或多种肿瘤相关抗原或细胞表面受体：

(1)BMPR1B；(2)E16；(3)STEAP1；(4)MUC16；(5)MPF；(6)Napi2b；(7)Sema 5b；(8)PSCAhlg；(9)ETBR；(10)MSG783；(11)STEAP2；(12)TrpM4；(13)CRIPTO；(14)CD21；(15)CD79b；(16)FcRH2；(17)HER2；(18)NCA；(19)MDP；(20)IL20Rα；(21)短蛋白聚糖；(22)EphB2R；(23)ASLG659；(24)PSCA；(25)GEDA；(26)BAFF-R；(27)CD22；(28)CD79a；(29)CXCR5；(30)HLA-DOB；(31)P2X5；(32)CD72；(33)LY64；(34)FcRH1；(35)FcRH5；(36)TENB2；(37)PMEL17；(38)TMEFF1；(39)GDNF-Ra1；(40)Ly6E；(41)TMEM46；(42)Ly6G6D；(43)LGR5；(44)RET；(45)LY6K；(46)GPR19；(47)GPR54；(48)ASPHD1；(49)酪氨酸酶；(50)TMEM118；(51)GPR172A；(52)CD33；以及(53)CLL-1。

5.如权利要求1所述的化合物，其中所述抗体是半胱氨酸工程改造的抗体。

6.如权利要求5所述的化合物，其中所述半胱氨酸工程改造的抗体包含LC K149C、HCA118C、HC A140C或LC V205C作为接头缀合的位点。

7.如权利要求6所述的化合物，其中所述抗体选自抗HER2、抗CD22、抗CD33、抗Napi2b、抗Ly6E以及抗CLL-1。

8.如权利要求1所述的化合物，其中Ab是与一种或多种肿瘤相关抗原或细胞表面受体结合的抗体，所述肿瘤相关抗原或细胞表面受体选自：

(1)BMPR1B；(2)E16；(3)STEAP1；(4)MUC16；(5)MPF；(6)Napi2b；(7)Sema 5b；(8)PSCAhlg；(9)ETBR；(10)MSG783；(11)STEAP2；(12)TrpM4；(13)CRIPTO；(14)CD21；(15)CD79b；(16)FcRH2；(17)HER2；(18)NCA；(19)MDP；(20)IL20Rα；(21)短蛋白聚糖；(22)EphB2R；(23)ASLG659；(24)PSCA；(25)GEDA；(26)BAFF-R；(27)CD22；(28)CD79a；(29)CXCR5；(30)HLA-DOB；(31)P2X5；(32)CD72；(33)LY64；(34)FcRH1；(35)FcRH5；(36)TENB2；(37)PMEL17；(38)TMEFF1；(39)GDNF-Ra1；(40)Ly6E；(41)TMEM46；(42)Ly6G6D；(43)LGR5；(44)RET；(45)LY6K；(46)GPR19；(47)GPR54；(48)ASPHD1；(49)酪氨酸酶；(50)TMEM118；(51)GPR172A；(52)CD33；以及(53)CLL-1。

9.一种药物组合物，其包含根据权利要求1-8中任一项所述的化合物以及药学上可接受的稀释剂、抗体或赋形剂。

10.如权利要求1-8中任一项所限定的化合物在制备用于治疗癌症的药物中的用途。

11.一种吡咯并苯并二氮杂前药二聚体化合物，其选自：