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HK1228331B - 灭菌层析柱 - Google Patents

灭菌层析柱

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HK1228331B
HK1228331B HK17102126.4A HK17102126A HK1228331B HK 1228331 B HK1228331 B HK 1228331B HK 17102126 A HK17102126 A HK 17102126A HK 1228331 B HK1228331 B HK 1228331B
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HK
Hong Kong
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sterile
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HK17102126.4A
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J．R．沛泽
D．C．彭迪亚
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瑞普利根公司
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Publication date
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Description

灭菌层析柱
技术领域
本发明涉及层析柱的灭菌。
背景技术
柱层析是一种分离和/或纯化技术，其中填料的固定“床”包含在硬管或柱中。填料可以是固体颗粒的形式(“固定相”)或用液体固定相涂覆的固体支撑材料。不论哪种，填料通常填充柱管件内体积。
在分离层析中，随着液体样品(“移动相”)通过柱，样品中的不同化合物可与固定相不同结合使其相对于移动相较慢并以不同的速度通过柱移动。因此，那些与固定相结合较多的化合物通过柱的移动比那些结合较少的化合物更慢，而这种速度的差别导致了化合物随着通过和流出柱而互相分离。
在亲和色谱法中，填料包括粘合剂，如抗原、抗体或配体，其特别粘合至一种或多种液体样品中希望的化合物或分子。因此，随着液体样品流动通过填料，仅希望的化合物或分子保留在柱内。洗脱液之后，通过填料的流体从附着至填料的粘合剂分离希望的化合物或分子，或从填料分离粘合剂。不论哪种方法，将希望的化合物或分子清洗出柱并收集入洗脱流体。亲和色谱法可用于多种应用，包括核酸纯化、从无细胞提取物的蛋白质纯化和从血液的纯化。
生物工艺中新发展，如连续工艺和多产品工艺，对微生物控制要求更严格。需要从细胞培养到下游纯化的无菌流体通道以降低被污染的风险。因此，制造保持高水平性能的无菌、一次性柱将是非常有用的。
发明内容
本发明至少部分基于以下发现，如果用一定范围的γ辐照，例如8.0至35或40kGy辐照塑料层析柱，其将被灭菌至不同的无菌保证水平(SAL)，同时仍明显保持有用的功能。例如，即便在高至35或40kGy的高水平辐照下，塑料柱在辐照之后仍保持其γ辐照之前的初始压力等级和机械性能。此外，柱含有包含共价偶联亲和配体的填料，例如，固定化的蛋白A，在用本文描述的灭菌方法处理之后保持适宜的性能。本文描述的方法抑制或避免粘合剂的亲和捕获性能的任意降低，例如蛋白A，用于改变填料，其可能通常由辐照导致，通过包含填充入柱的保护液的特定添加剂以在辐照时保护填料。
一方面，本公开的特征在于制造和填充层析柱并之后将这些柱使用本文所述的特定的技术和参数灭菌的方法。这些方法包括选择柱管，例如塑料材料或另外适合的弹性材料，其具有适宜的内径和长度以容纳填料所需要的体积；(b)加入填料，例如，琼脂糖或二氧化硅小珠或任意其他适宜的层析填料，例如，共价偶联至功能化剂或粘合剂，如蛋白A，例如，全长野生型葡萄球菌蛋白A(SpA)或蛋白A的重组型；(c)通过用盖或密封封闭管在管内将填料封装成填充床，所述盖或密封可以例如用作管内“压配合”或“过盈配合”，以获得密封的介质填充床；(d)任选地，将填充柱在气密和水密的容器，例如塑料包、圆筒或盒子内封装或密封；和(e)用剂量为至少8kGy至约35或40kGy，例如，至少10、15、20、25、30、33、35或40kGy的γ辐射来辐照容器内的柱。
之后将任选仍在气密容器内的柱从辐射源移开，并可以在密封的容器内运输，从而保持柱内和柱外的无菌性。仅当柱的外表面需要保持无菌时需要气密或水密容器。即便没有这样的容器，如果柱的入口和出口保持密封，无菌柱的内部和填料将保持无菌。
这种水平的辐照产生可以根据无菌保证水平(SAL)描述的无菌填充柱。SAL是单一单元的可能性，例如，单一填充柱，在其经过灭菌之后不是无菌的，并且SAL取决于辐射剂量和辐照之前材料的固有生物负载。当使用25kGy的剂量时，具有低生物负载的物品，如本文描述的柱组分，将达到10-6生物体/单元的无菌保证水平，其为相对高水平的无菌性(仅一个单元，例如，一个柱，在1百万个已经无菌化的单元中，将不是无菌的)。如果在辐照之前在填充的柱上存在更高的初始生物负载，可以使用更高水平的γ辐照，例如30至40kGy，来实现这种同样的SAL。另一个，相对低的，但仍然有用的无菌化水平是使用8kGy剂量时可以实现的10-3生物体/单元(参见Guide to Irradiation and Sterilization Validation ofSingle-Use Systems(一次性体系的辐照和灭菌验证指南)，Bioprocess International,2008和其中的参考文献)。其他水平包括10-4生物体/单元和10-5生物体/单元。
在这些方法的各种实施中，塑料材料可以包括聚丙烯、聚乙烯、聚酰胺、缩醛类、玻璃填充塑料类、碳填充塑料类、玻璃纤维塑料类或碳纤维塑料类或碳纤维塑料类。填料可以包括琼脂糖、二氧化硅、陶瓷或丙烯酸酯的聚合物或纤维素基材料。
在一些实施方案中，填料可以用以下一种或多种功能化：离子交换基团；具有疏水和带电性能的多元基团；金属螯合基团；疏水基团；或能结合至免疫球蛋白IgG的葡萄球菌蛋白A(SpA)多肽。例如，离子交换基团可以包括一种或多种季胺、硫酸盐和羧酸盐而疏水基团可以包括一种或多种丙基、辛基和苯基基团。
此外，在各种实施方案中，SpA多肽可以包括全长野生型SpA，重组SpA，包括选自SpA域A、B、C、D、E或Z的SpA域的单体SpA多肽，或包括以选自SpA域A、B、C、D、E或Z的任意组合的任意两个、三个、四个、五个或更多SpA域的多聚体SpA多肽，或其功能等价物。例如，SpA多肽可以是多聚体SpA多肽，例如，多聚体SpA多肽可以包括四或五个选自SpA域B、C和Z的SpA域。例如，所有的SpA域可以是相同的，所有三个、四个或五个SpA域可以是C域。
在各种实施方案中，本文所述的无菌柱制备方法可以进一步包括选择适宜尺寸的第一和第二流体分布器，其中至少第二流体分布器(或第一和第二流体分布器均)具有大于管件的内径的直径，例如比管件的内径大约0.25至5.0％；将第一流体分布器永久固定至管件的第一端；在将填料加入柱管之后，通过应用轴向力将第二流体分布器插入管的第二端来使得第二流体分布器进入柱管以形成过盈配合，例如，从而引起环周张力，其能充分有效地形成密封，例如液压密封，第一和第二流体分布器之间管内的腔室；调整第二流体分布器在管内的纵向位置，通过(i)向第二流体分布器应用额外的轴向力直到其抵达柱管内希望的位置，或(ii)使液体进入腔室以应用液压使第二流体分布器返回向管件的第二端移动，或(i)和(ii)的任意组合；并且当将第二流体分布器适当放置时，将第二流体分布器永久固定在管内。
在某些实施中，填料可以是在适宜的缓冲液中包含约40％至约70％的固体的浆料。一旦将填料装填入柱，就可以加入保护液。保护液可包含缓冲液或其他可以影响填料功能性的添加剂。例如，如本文所述的，以低百分比(V/V)加入保护液的芳族醇类可以保持用粘合剂如蛋白A功能化的γ灭菌填料的亲和捕获性能。
在各种实施方案中，加入至柱内填料的保护液可以包括0.1至25.0％(体积/体积)的醇。例如，在一些实施方案中，保护液包括0.1至5.0％(体积/体积)的醇，其中所述醇包括芳族醇，如苯甲醇。在其他的实施方案中，保护液包括2.0至25.0％(体积/体积)的醇，其中所述醇包括脂肪族伯醇，如乙醇。
另一方面，本公开的特征在于无菌层析柱本身。这些无菌填充层析柱包括(a)具有两端的无菌中空管；和(b)管内的无菌填充的层析介质，其中所述管在两端都是封闭的以形成填充柱；其中所述填充柱具有的无菌保证水平(SAL)为10-3生物体/柱。在一些实施方案中，SAL为10-6生物体/柱。
在这些无菌填充层析柱中，所述层析柱包括管件、第一流体分布器和第二流体分布器，并且这些组分可以各自由相同或不同的塑料材料制成。所述塑料材料可以包括一种或多种聚丙烯、聚乙烯、聚酰胺类、缩醛类、玻璃填充塑料类、碳填充塑料类、玻璃纤维塑料类或碳纤维塑料类或碳纤维塑料类。
在各种实施方案中，柱内的填料可以包括琼脂糖、二氧化硅、陶瓷或丙烯酸酯的聚合物或纤维素基材料。在某些实施方案中，填料用以下一种或多种功能化：离子交换基团；具有疏水和带电性能的多元基团；金属螯合基团；疏水基团；或能结合至免疫球蛋白IgG的葡萄球菌蛋白A(SpA)多肽。例如，离子交换基团可以包括一种或多种季胺类、硫酸盐类和羧酸盐类，而疏水基团可以包括一种或多种丙基、辛基和苯基。
在一些实施方案中，SpA多肽可以包括全长野生型SpA，重组SpA，包括选自SpA域A、B、C、D、E或Z的SpA域的单体SpA多肽，或包括以选自SpA域A、B、C、D、E或Z的任意组合的任意两个、三个、四个、五个或更多SpA域的多聚体SpA多肽，或其功能等价物。例如，SpA多肽可以是多聚体SpA多肽，例如，包括四或五个选自SpA域B、C和Z的SpA域。例如，所述SpA域可以都是相同的，例如，多聚体SpA多肽可以包括三个、四个或五个SpA域C。
在某些实施方案中，管件的两端通过流体分布器封闭，所述流体分布器具有的外径略大于管件的内径以提供过盈配合。此外，在任意的实施方案和本文所述的实施中，如本文所述的，可以将柱在辐照之前在气密和水密容器中密封。此外，在γ辐照之前，柱还可以进一步密封在第二气密和水密容器中以提供封装结构的双层。因此，最终产品是密封在气密和水密容器内的无菌预先填充的、塑料层析柱。这些高度功能性和经济的柱可被视为一次性的，但是具有多次再使用的功能整体性。
在一些实施方案中，本公开的特征在于包括具有第一端和第二端的无菌中空管的无菌填充层析柱；将无菌第一流体分布器固定至管件的第一端；具有大于管件内径的外径的无菌第二流体分布器；以及在所述第一和第二流体分布器之间的管内填充的无菌填料；其中将所述第二流体分布器固定至管件的第二端内以形成第一和第二流体分布器之间的中空管内的腔室，其用填料填充；并且其中填充的层析柱具有无菌保证水平10-3或10-6生物体/柱。
在这些无菌层析柱中的填料可以具有特性吸附水平为在未经过γ辐照的柱内的同一种类型的填料的特性吸附水平的至少60％。此外，在各种实施方案中，填料可以包含0.5至5.0％(体积/体积)的芳族醇或2.0至25％(体积/体积)的脂肪族伯醇。例如，所述填料可以包含0.5至3.0％(体积/体积)的苯甲醇或2.0至20％的乙醇。
在一些实施方案中，塑料管件还具有增加的末端直径DTe以在第一端形成凹槽，其中第一流体分布器具有大于DTi的外径Dfa，并且其中将第一流体分布器用过盈配合固定在管件的第一端内直接导致充分降低的环周张力。在某些实施方案中，所述第一流体分布器永久结合至管件或者第一和第二流体分布器都可以用永久结合如焊接节点固定至管件的内壁。
在某些实施方案中，在柱或者管件的腔室内包含有填料的新的层析柱可以液压密封。在某些实施方案中，所述腔室被构建为承受至少50磅/平方英寸的内压。在一些实施方案中，这三个特征都存在。在一些实施方案中，塑料管件和第二流体分布器由相同类型的塑料制成并且第一流体分布器是管件的组成特征。
如本文所使用的，术语“塑料”指层析柱或层析柱的组分由各种聚合材料制成，如热塑性塑料，例如，丙烯腈丁二烯苯乙烯(ABS)、丙烯酸，例如，聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、聚烯烃、聚丙烯(PP)、聚氯乙烯(PVC)、聚四氟乙烯(PTFE)、聚碳酸酯和各种由两种或多种不同类型的塑料和/或聚合材料制成的塑料复合物，以及热固性塑料，例如环氧树脂和纤维(例如，玻璃、金属(例如，不锈钢)，或碳纤维)增强塑料。
如本文所使用的，术语“床高”指包含在完整层析柱内的填料床的线性高度。
如本文所使用的，“填料”是固体材料的浆料或悬浮液，以不规则形状或球形颗粒形式，其之后在柱内形成“填料床”。填料可以有各种材料制成，如二氧化硅、陶瓷、琼脂糖、丙烯酸或纤维素类聚合物。固体材料可以功能化为具有分子特征，提供例如离子性、疏水性、或特异性亲和特征(例如，用粘合剂如抗体或蛋白A)。
如在本文使用的，“填料床”指层析柱内的层析填料的最终状态。这种最终状态以各种方式实现。例如，一种方法是结合流体流动接着通过一个或所有两个流体分布器的床的轴向压力。本领域已知的其他方法包括颗粒的重力沉降，震动沉降和/或单一机械轴向压缩。之后填充，填充床在通常包含抗菌剂添加剂的保护液中保持含水。如本文所描述的，此保护液也可以或可选地包含一种或多种缓冲液或其他添加剂，其可以帮助针对γ辐照的有害作用保护功能化的固体载体的完整性和性能。例如，所述保护液可以包含低百分比(V/V)的脂肪族或芳族醇，如乙醇或苯甲醇，或多元醇，如糖醇，以增强保护在辐照之后介质的层析性能。
如本文使用的，“床载体”是网、屏、网眼或玻璃原料，其允许各种液体通过而保留组成填充床的填料的小颗粒。可以将这些床载体直接连接至流体分布器。
如本文使用的，术语“永久结合”和“将其永久结合”用于指所述两组分之间的结合不能被分离除非破坏所述结合或结合组分(例如，管件和流体分布器)之一或二者都破坏。
本文描述的新方法和系统提供了很多优势和好处。例如，所述新方法能够制备具有完全可定制的和各种层高和直径，并具有希望的SAL，还具有完全功能化的填料的预先填充的、一次性柱。惊奇的是，在标准缓冲水溶液中使用之后，本文描述的γ辐照方法没有明显降低填料或粘合剂的性能，并且没有产生或提取任何污染物或导致所述污染物从用于组合层析柱的材料中泄漏。
除非另外限定，所有本文使用的技术和科学术语具有的含义同本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的含义相同。虽然在实践和测试本发明中可以使用与本文描述的类似或等价的方法和材料，适合的方法和材料在下文中描述。所有的公开文本、专利申请、专利和其他本文涉及的参考文献都通过引用的方式以其整体并入本文。如有矛盾，本说明书，包括定义将掌控。此外，材料、方法和实例仅是说明而不意为限制。
本发明的一种或多种实施方案的细节将在附随的附图和以下描述中说明。本发明的其他特征、目的和优势将从说明书和附图以及权利要求显现。
附图说明
图1是本文描述的一种层析柱的示意图。
图2a是图1的柱的横截面示意图。
图2b是图1的柱的分解示意的横截面。
图3a是柱管件的示意图。
图3b是横截面中所示柱管件的示意图。
图4a-4c分别为可用于本文描述的新型层析柱的流体分布器的一个实例的顶部、前部和底部视图的示意图。
图5是流体分布器刚插入以横截面所示的柱管件后的示意图。
图6是压力内的柱管件的示意图，所述压力用于向顶部流体分布器施加轴向力以使其进入柱管件从而提供以横截面所示的严密过盈配合。
图7是层析柱在顶部流体分布器在适当的位置焊接之后的示意图。
图8是制造本文所述的一种层析柱的基本步骤的流程图。
图9a是当将流体分布器压入具有凹槽端的管件以形成过盈配合产生的力的示意图。
图9b是当将具有O型环的流体分布器压入具有凹槽端的管件以形成过盈配合产生的力的示意图。
图10a是在形成了过盈配合之后将流体分布器压入管件产生的力的示意图。
图10b是在形成了过盈配合之后将具有O型环的流体分布器压入管件产生的力的示意图。
图11是表示当将流体分布器压入管件以形成过盈配合产生的力的实例的图。
图12是被装入管件的流体分布器的示意图。
图13是γ辐照的聚丙烯和非γ辐照的聚丙烯的外观的图示。
图14A-J是示意了在曝露在水和乙醇之后，对于非辐照和辐照组分的保留时间和峰面积的图。
图15是示意了纯聚丙烯和辐照聚丙烯的拉伸应力应变曲线的图。
图16是示意了纯聚丙烯和辐照聚丙烯的拉伸应力应变曲线(减少的应变范围)的图。
图17是示意了纯聚丙烯和辐照聚丙烯的弯曲应力应变曲线的图。
图18是示意了纯聚丙烯和辐照聚丙烯的拉伸应力应变曲线的图。
在各附图中类似的参照符号指类似的元件。
具体实施方式
本文描述的无菌层析柱可由相对便宜的塑料材料制成，因此可以被认为是一次性的，但是也可特别设计为用于使用，甚至多次使用是足够坚固的。本文描述的灭菌新方法提供了希望的灭菌保证水平(SAL)，从而使得层析柱比现有的层析柱远更有用，同时保持填充介质的适宜的功能性以及所需的压力等级和机械性能。因此，新型无菌、预先填充的一次性柱准备好用于防腐或无菌的制造过程，例如蛋白质纯化过程。由于通常已知电离辐射通过活性氧种类如羟基自由基或单线态氧可以降解包括多肽的材料，这些性能的结果是令人惊奇的。
本发明的实施方案包括组合物，所述组合物包括柱内的层析介质的填充床和用于无菌的且可用于纯化过程的蛋白质纯化体系的适宜连接。实例显示了用于层析柱的材料，所述材料即便在通过γ辐照灭菌之后仍保持层析性能。实例进一步显示了多固体载体类型的柱填料如二氧化硅和琼脂糖，例如，将其功能化以实现以亲和性为基础的分离，其在足以实现无菌的γ辐照之后，保持适宜的分离性能。进一步的实例显示构造的柱材料并没有被γ辐照不利影响而增加源自柱材料的可提取的或可泄漏的污染物。实例还提供了获得无菌组合物的方式，所述组合物以适合用于通常用于生物医学纯化过程的生物分离的形式。
无菌层析柱
如本文所定义的，新型无菌层析柱由塑料制成，并因此整体可由广泛可得的塑料/热塑性塑料和/或复合材料(如聚丙烯(PP)、聚乙烯(PE)、聚酰胺类(如各种尼龙)、缩醛类或玻璃填充、金属填充或碳填充塑料，例如玻璃纤维、钢纤维和碳纤维塑料)或弹性组分制成，并用γ辐射无菌化至希望的SAL。当然，这些材料可能通过过高剂量的γ辐射破坏。此外，填料和功能化材料，例如粘合剂，也可以通过不适宜水平的辐射破坏。因此，惊奇的是可以制造足够无菌化以满足SAL准则的预先填充的一次性层析柱，同时仍保持足够的柱填料的功能性能、柱机械性能和压力等级。此外，惊奇的是辐照没有导致明显通过通常使用的有机溶剂提取或在标准缓冲水溶液中使用之后从材料中泄漏的污染物。
通常，采用任意各种用二氧化硅、琼脂糖、陶瓷或其他聚合物支柱的填充柱，可以将其功能化，例如用一种或多种类型的亲和配体或粘合剂(例如蛋白A配体，如重组天然结构或设计的功能域)、离子相互作用配体、混合模式配体和疏水配体。通常，所述蛋白A配体可以包括全长野生型葡萄球菌蛋白A(SpA)，蛋白A的重组型(例如，如在Peyser等，美国专利号7691608中描述的)，或包括任意一个、两个、三个、四个、五个或多个SpA域的单体或多聚体配体，例如，选自域A、B、C、D、E或蛋白质Z的任意一个或组合(例如，如在Spector，美国专利号8592555和Hall等，美国专利号8329860中描述的)。例如，多聚体多肽可由三个、四个、五个或多个域制成，其可以相同或不同。例如，多聚体蛋白可以包括五个SpA C域以形成Penta C多肽。
下文提供了关于柱和填料的进一步细节，以及如何组合层析柱的某些实施方案。
一旦将柱填充，将填料保持含水以用保护液保护，如本文描述的，将其设计为包含某些组分，所述组分包括例如化学基团，如硫醇基(例如半胱氨酸)和脂肪碳上的羟基(例如乙醇)。此外，保护液可以包含其他醇类，所述醇包含如聚乙烯吡咯烷酮(PVP)的化合物。
当发现芳族化合物有时是辐射增敏剂并增加辐射破坏时，发现使用芳族醇、苯甲醇的本方法对于固定在层析介质上的蛋白A多肽却很有保护性。因此，填料的功能性能以及任意功能化试剂，例如本文所述的粘合剂或配体，如蛋白A，当在包含低百分比(V/V)，例如1至25％，例如1、2、3、5、7、8、10、12、15、18、20、23或25％的醇，如脂肪醇(例如乙醇和异丙醇)、芳族醇(例如苯甲醇、色醇、酪醇和苯乙醇(苯基乙醇))或多元醇，如糖醇(例如山梨醇和甘露醇)的保护液中辐照时，可以被保护。
一旦将柱用填料和保护液填充，并将流体分布器固定在柱管件内，将整个预先填充的柱任选地封装在气密和水密容器内，例如包、圆筒或塑料盒、橡胶或其他可以弯曲或坚硬的材料，并且其可易于与内部的无菌柱传输。将此容器设计为足够坚固从而允许无破裂传输，以保持无菌预先填充柱在无菌条件下在容器内。在某些情况下，柱保持无菌化而不加入容器。
一旦在容器中封装，用一剂量的γ辐射辐照整个容器和内部的预先填充的柱以提供所希望的SAL。SAL的通常概念描述在，例如“Guide to Irradiation and SterilizationValidation of Single-Use Bioprocess Systems(一次性生物工艺体系的辐照和灭菌验证指南)”，Bioprocess Int’1，10-22(2008年5月)，其通过引用的方式以其整体并入本文。γ辐射剂量用千戈瑞(kGy)单位测量，其量化辐射的吸收能。一戈瑞是一千克物质吸收的一焦耳辐射能量(1kGy＝1焦耳/克)。至少8kGy的剂量通常足以消除低生物负载水平并提供10-3生物体/单元的无菌水平。使用至少25kGy剂量可以通常获得10-6生物体/单元的水平。但是，过高的γ辐射剂量可以毁坏柱填料的功能性甚至毁坏柱本身。因此，预先填充的柱的γ辐射水平必须至少为8.0kGy并且可以高至约35kGy或更高，例如，辐照水平选自约8和40kGy之间的剂量，例如8、12、15、17.5、20、22.5、25、27.5、30、32.5、33、35、38和40kGy。
所述辐射剂量可以用高能光子实现，例如，从同位素源(例如，钴60)放射出的，其穿过辐照产品产生离子化(电子干扰)。例如，可将其中密封填充柱的容器置于腔室中，在该腔室中，将其曝露至辐射源足够长的时间以实现希望的SAL。之后，将柱(仍在气密容器内)从辐射源移除，并可以在密封的容器内传输，从而保持柱的无菌性。通过使用密封管和流动途径可以将柱流动途径的无菌性在盒子外或容器包之外保持，所述密封管和流动途径提供连接至制造过程中使用的其他设备的无菌连接端口。柱内的无菌性保持了很长使用时间，例如一个月，两个月或更长，部分取决于用于储存无菌柱的容器的性质。以下实例表明在各种水平的γ辐照下，存在柱物理性质的最小变化，并且机械性能和结构性能类似于非辐照的柱。其他实例表明在γ辐照下，层析介质的功能性能仅有非常微小的变化，并且层析介质仍表现为适合用于生物制造的方式。
层析柱和填料
本文描述的层析柱主要由柱管件和一对流体分布器(或一个流体分布器和一个端盖)组成。流体分布器包括圆柱形盘和一个或多个入口/出口管，其使液体流入和通过该盘。此外，流体分布器可以包括连接至流体分布器盘的填料一侧的床支架、屏和/或过滤器。
可将流体分布器的流动途径根据标准规程和已知设计来设计，并且流体分布器本身可以由例如与管件同样或类似的塑料材料制成，但是也可以由对于待通过柱流动的液体和试剂为惰性的金属、陶瓷或其他材料制成。
管件是中空的，通常是圆形的、圆筒形的，允许流体(例如，液体)从第一端(例如，较高端)流至第二端(例如，较低端)。管件的内径的尺寸和结构能接受用于传送流体至管件和将流体从管件移出的流体分布器。基于各种层析柱的性能说明，管件可以以各种不同的尺寸和结构制成。在一些实施方案中，管件的尺寸和结构，当能承受高至约185psi(例如，约20、30、40、50或60psi)的内部压力下，能在系统引发的内部操作压力下保持结构完整性。在一些实施方案中，管件通常为圆柱形并具有内径约5cm至约100cm和长约5至约90cm。
通常，管件的全部引发环周张力，基于各种因素，可以基于最终用户的说明变化，如期望的层析柱将经受的内压力。组合和填充柱的方法的细节描述于US2013/0193052(其对应于WO2013/116367)，其通过引用的方式以其整体并入本文。
图4a-4c说明了在一些实施中，流体分布器24是盘状元件，具有沿着第一侧28的中心区域形成的安装孔26和沿着第二侧32形成的多个槽和通道30的系统。安装孔26是盲孔，其尺寸和构造能接受配件。安装孔26包括接受配件的一种或多种特征。在一个特定实施中，安装孔26具有螺纹以接受具有螺纹的配件(例如M30×3.5螺纹配件)。在一些实施方案中，将配件以各种其他方式连接至流体分布器24，所述方式如粘合、焊接、卡销或鲁尔接口连接，或其他充分连接的技术。在一些实施方案中，将配件制造为流体分布器24的整体组分。流体分布器24还包括流体通道34以将安装孔26液压连接至流体分布器24的第二侧32，使得流体可以穿过流体分布器24的第二侧32和插入安装孔26的配件之间。
流体分布器24可以通过任意的各种制造技术形成，如模塑、铸造、机械加工或其他方法，并可以商业获得。在一些实施方案中，将流体分布器24的通常形状铸造或模塑并从通常形状中机械加工出槽和通道30。为了紧密配合管件的内径，在一些实施方案中，使用车床形成流体分布器的外径以保证外缘是圆的并至容限。
配件是机械连接件，可以将其固定或稳固至流体分布器以向流体分布器和其中设置流体分布器的管件传输流体或从流体分布器和其中设置流体分布器的管件移除流体。为了传输流体，配件具有穿过配件沿其中心轴形成的流体传输孔。配件还包括接收在流体分布器的安装孔中的一个或多个特征以保持配件。如图1、2a和2b所示，在此实例中，配件38具有螺纹端40(例如，M30×3.5螺纹端)以啮合安装孔26。配件38也具有螺母部分42，其可以通过工具(例如，转矩扳手)紧密咬合以将配件38旋转和固定在安装孔26中。在一些实施方案中，配件28包括其他类型的连接机械装置，如粘合剂、焊接、卡销或鲁尔接口连接或其他充分连接技术。
配件38基于其安装位置可以具有不同的额外特征。例如，安装在顶部流体分布器24a的入口配件38a可以在与螺纹端相对的配件末端具有连接特征。连接特征(如软管连接)允许软管或管件以简单的方式连接至配件。在此实例中，入口配件24a限定了凹进44，其尺寸和构造能被软管配件中接收，如卫生配件(例如，快装式连接或凸轮锁)类型的软管配件。
或者，连接至底部流体分布器24b的出口配件38b可以具有不同于入口配件的类型的连接。在此实例中，将出口配件38b固定至软管46以将出口配件38b液压连接至远程快速断开出口配件48。可将远程快速断开出口配件48安装或设置在比出口配件38b用户可以更方便接触的区域。
层析柱组分(例如，管件20，流体分布器24a、24b，配件38a、38b和其他组分)可由任意各种结构和化学适合的塑料材料制成。例如，所述组分可由一种或多种热塑性塑料(例如，丙烯腈丁二烯苯乙烯(ABS)、丙烯酸(例如，PMMA)、聚丙烯(PP)、聚氯乙烯(PVC)、聚四氟乙烯(PTFE)、其他热塑性塑料或复合材料)和热固性塑料(例如环氧树脂和纤维(例如，玻璃或碳)增强塑料)制成。材料选择考量包括材料的特定机械性能并且如果材料将承受系统引发的内操作压力。
在制造和填充柱时，将顶部和底部流体分布器24a、24b安装(例如，压合)入管件20的顶部和底部。在一些实施方案中，在插入顶部流体分布器24a和用填料填充管件20之前，将管件20和流体分布器24a、24b中的一个或两个都永久结合。之后为柱的满意性测试，第二(例如顶部)流体分布器24a永久结合到位。
除非通过损坏连接或连接的物件(例如管件20和流体分布器24a、24b)，该永久结合不能被轻易分开。在较高端，额外的盖(例如顶盖)54可以任选地坐落在管件20上并固定至管件20，并且对齐以使安装在柱顶部的流体分布器24a的入口配件38a穿过额外的顶部端盖54的入口配件孔56。这种任选的顶盖54(其主要为美学特征)可以使用各种固定机械原理(如紧固件、粘合剂、管件和顶盖之间的摩擦力或其他机械原理)被固定至管件20。
本文描述的层析柱的管件可用任意通过最终用户指定的用于柱层析的固相柱填料填充。这种潜在填料的多样性延伸至基础颗粒的组合以及其功能化学性(例如亲和性、离子交换和疏水相互作用)。柱填料可以包括加入至洗脱溶剂的固定相颗粒的浆料。固定相颗粒可以包括琼脂糖、硅胶(SiO2)、氧化铝(AL2O3)、纤维素和其他各种筛孔尺寸的适合材料。洗脱可以包括一种或多种各种溶剂，如去离子水、乙醇或丙酮。
填料的实例包括，但不限于琼脂糖(例如，来自通用电子医疗(GE Health Care)的 Fast Flow和CaptoTM)可控孔度玻璃(来自Millipore的)、陶瓷羟磷灰石、聚甲基丙烯酸酯(例如，来自Tosoh Bioscience的介质)，和其他合成的聚合物树脂(例如，Life Technologies的PorosTM介质和来自EMD的FractogelTM介质)。
制造填充的层析柱的方法
某些塑料/热塑性塑料的一个已知的特性是其固有的顺应性或弯曲能力，不随着施力破裂。使用利用塑料的“流动能力”(例如弹性)的组合过程制备新型层析柱，所述“流动能力”通过引发环周张力界定，用于制备柱管件20。柱管件20由挤出的、铸造、模塑(注塑、变形(roto)或其他)或机械加工的塑料/热塑性塑料或特定内尺寸和外尺寸带状铺设的复合材料制造而成。本发明描述的用于流体分布器24的设计和方法包括大于柱管件20的名义内径的外径，自此以后描述为过盈配合。
当与圆筒柱管件20使用时，流体分布器24也必须是圆的，在外表面尽可能少(例如，无)的非均匀性，来保证均匀引发环周张力和当压配合入管件20时流体分布器24对管件20的内壁表面的充分的不透液配合和密封。充分水平的均匀圆度或环形可以通过在机床上旋转流体分布器24轻易实现，但是本领域技术人员已知其他实现这种水平的均匀圆度的方法。
过盈配合的可接受水平由机械性质，即包围管件20和流体分布器24的特定塑料/热塑性塑料或复合物组分的弹性或流动性决定，因此，在聚丙烯的情况下，管件20壁的厚度，但是在所有的情况下，流体分布器24的外径超过管件20的名义内径以产生要求的过盈配合以在将流体分布器24装入管件20时保证令人满意的引发环周张力。
此种组合方式向新型层析柱提供了独特的优势。将由多个尺寸稳定的材料(钢、玻璃等)构造的常规柱设计为使得流体分布器24稍微小于柱管件，其对于允许此组分容易插入和在柱管件内组装时移动至希望的位置是必须的。在流体分布器24周围使用O型环或类似的密封结构以实现流体分布器24和管件20壁之间的不透液体的密封。在这些常规设计中，具有比管件的内径更小的外径的流体分布器的组合和包括O型环的必要性必要导致了称为“死空间”的区域，该区域在流体分布器24和管件20的壁高至O型环坐落的点之间。这些“死空间”很难曝露至柱流，因此造成柱清洁性和最终清洁度的风险。过盈配合的设计消除或极大减少了常规柱的“死空间”从而最小化柱使用之间的污染物的携带。在一些实施方案中，过盈配合也可以实现一起取消O型环，从而将柱的复杂程度、成本和由于密封失败的整体性风险最小化。此特征的另一个优势在于减少将通过柱层析纯化的有价值的产品曝露至可从所述(通常是弹性体的)O型环释放的污染物，其需要昂贵并费时间的以可提取物和可泄漏物的研究的形式的风险评估。
如图8所示，制造新型层析柱50的方法包括几个步骤。
首先，指定塑料柱管件20，其具有适宜的直径和长度以容纳最终柱需要的介质材料的体积(802)，以及适宜的弹性，如本文其他部分所述的。管的长度应为最终柱中介质材料的长度或“床高”的约两倍。管件20的最终长度可以是约与内径相同，例如，200和/或199.90mm内径管件20可具有最终长度约150至250mm，例如约200mm。还选择沿管件每端的内表面形成的凹槽。要求这种凹槽匹配并有助于插入流体分布器24使其装入柱管件20内部。
第二，应指定适宜尺寸的流体分布器24以具有稍大的外径，例如，比管件(804)的内径(“ID”)大约0.25％，0.5至约1.0、1.5、2.0、2.5、3.0或3.5％。例如，对于具有内径199.90mm的聚丙烯管件，流体分布器24应具有大于201.90mm的外径(“OD”)，例如202和204、202.5、203、203.5、204、204.5、205、205.5mm之间)。将流体分布器24设计为特定的名义OD使其将在管件20壁引发足够的环周张力。当选择适宜的名义OD，考虑的关键因素包括构建材料的物理性质(例如，摩擦系数、杨氏模量、弹性模量和屈服伸长)结合几何尺寸包括柱管件的ID和其壁厚以及流体分布器24OD的公差。将组件压配合到一起所需的力可由理论确定(例如，通过先进的分析工具，如有限元分析)和作为替代方式，此种评估可以通过采用特定构建材料的实证研究进行。
在一些实施方案中，流体分布器可由与管件同样的材料制成，以保证使用兼容性和简化流体分布器至管件内壁的固定，例如，焊接时固定。
第三，如图5所示，将第一(例如底部)流体分布器24b固定至管件20的第一端(例如，底端)(806)。这可以通过任意已知的方式实现，或者可以使用本文描述的过盈配合方法来帮助避免或减少任意与第一流体分布器关联的死区域。例如，可以使用金属夹、管件20内的螺纹切割(或在内壁或在外壁上)和流体分布器周壁、粘合剂和各种类型的焊接将第一流体分布器24b固定。要点是一旦将此第一流体分布器24b固定至管件20的第一端，该第一流体分布器24b不需要移动。在一些实施方案中，第一流体分布器24b形成管件20的整体部分。例如，可以使用已知技术将第一流体分布器模塑为管件20的特征。
如果对于第一(例如底部)流体分布器使用过盈配合方法，可以通过引发环周张力将其一开始定位在所希望的位置以提供在需要的压力下的有效液压密封，之后使用任意已知方式(包括焊接、螺钉固定或粘合)将其永久固定在该位置。特别地，为了确定适宜的过盈配合，将流体分布器24与管件的凹槽底端对齐，之后在流体分布器24上施加约1000lbf至10,000lbf(例如1000、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000或10,000lbf)的轴向力以使其装入柱管件20，从而扩张管件的内径。例如，当将流体分布器24插入管件20时，管件20和流体分布器24都产生可塑性变性以一起配合，管件20的变形幅度大于流体分布器24的变形幅度。
使流体分布器装入管件所需的力取决于，例如形成于管件内的凹槽的角度，以及特定于结合其几何尺寸的(如上所述)构造的材料的其他物理性质的因素。例如，使第二流体分布器装入管件以建立管件内的过盈配合的轴向力是过盈配合、管壁厚度和管件特定机械性能和流体分布器材料的函数。使流体分布器装入管件的任一端所需的力可以通过测压元件或类似的拉力试验仪测量，并应在每次组合时检验以确保流体分布器和管件壁之间充分的过盈配合。使流体分布器装入管件的轴向力必须大于并与管壁和流体分布器外周缘之间的粘附和变形摩擦力产生的反向力相反。
以下等式1进一步描述了插入力。
F施加>F摩擦，插入+F摩擦，变形＝F磨擦，净 (1)
其中F施加是克服与将流体分布器插入管件相反的摩擦力所需的轴向力，F摩擦，插入是由于流体分布器和管壁材料之间的粘附的摩擦力，F摩擦，变形是由于流体分布器和/或管壁的变形的摩擦力，F磨擦，净是净摩擦力。如果需要，可以通过应用润滑剂移除粘附摩擦力并从无润滑剂时插入流体分布器所需的总轴向力减去插入流体分布器所需的最终轴向力来区分两个相反的摩擦力。
或者，可以确定使流体分布器装入管件的最小轴向力以产生足够的最终引发环周张力。这种引发环周张力以径向力起作用，其将流体分布器保持在管件内的特定位置。考虑到熟知的过盈配合等式，导出表达式来代表对于所有管件和流体分布器尺寸的引发环周张力。
通过乘以流体分布器与管壁接触的圆周面积，可以将引发环周张力与通过管壁施加在流体分布器壁上的总径向力关联。以下等式2进一步将其解释。
其中F径向是围绕管件壁均匀分布沿径向向内作用于流体分布器壁的径向力，A接触，fd是流体分布器与管壁接触的面积。可以进一步看出此径向力与流体分布器和管件内壁之间的垂直摩擦力F磨擦，净直接关联。因此，可以将克服摩擦力将流体分布器装入管件所需的力F施加与将流体分布器保持在管件内部希望位置的引发环周张力σ环周张力关联。以下等式4、5和6进一步描述了这种关系。
F摩擦，净＝F径向(μ摩擦) (3)
F施加≥F摩擦，净＝σ环周张力(A接触，fd)(μ摩擦) (4)
和
其中μ摩擦是流体分布器材料和管壁材料之间的摩擦系数。
作为此关联的结果，只要实证检验可以保证给定的引发环周张力将提供防漏密封到推荐的最大操作压力，例如2×、3×或4×以上的足够的安全因素，可以确保，并在与测压元件或类似设备组合时检测，柱的充分的操作压力。重要的是注意灰尘、湿度、氧化膜、表面抛光、滑动速度、温度、振动、柱和流体分布器壁污染范围可以使摩擦系数μ摩擦的值变化，从而影响记录的插入力。在试图减少此错误时，推荐在稳定的、可重复的制造/实验室环境，即干净的室内进行所有的确定精确摩擦系数(μ摩擦)和之后以实现所需引发环周张力的应用负载(F施加)的初始测试。最后，优选的是设备具有非常少的灰尘、低的湿度、最小的UV光线(其可影响材料的机械性能)、最小的振动、恒定温度(接近室温条件)、低程度污染和恒定的插入速度。
此外，使用以下等式确定在形成的过盈配合上的表面抛光的量级并且显示在整个过盈配合上表面抛光(对于我们的情况中的材料)是可以忽略的。
δeff＝δint-Δδ (6)
其中δeff是有效过盈，Δδ是考虑到内管壁的表面抛光和流体分布器的圆周表面的测量过盈的修正。
Δδ＝0.1(2)(Rz,管件+Rz,fd) (7)
其中，Rz,管件是管件内壁的表面抛光，Rz,fd是流体分布器的外壁的表面抛光。
为了保证充分的引发环周应力来包含此压力，可以首先进行试验来形成流体分布器和管壁之间的过盈量之间的关系以避免高至一定压力的泄漏。等式(1)显示引发环周张力直接与产生流体分布器和管壁之间的防漏密封有关。假设恒定的管件和流体分布器材料，三个主要的变量将对引发环周张力的量级有贡献：过盈配合δint、管件的外径D管件，O和流体分布器的外径Dfd。一旦选择了这些值中的两个，改变第三个变量将允许测试针对泄漏的内压的插入流体分布器的施加力F施加的几种情况。一旦在没有任何泄漏穿过流体分布器时获得充分的内压，可以使用施加力的值倒退计算包含所需压力所必需的引发环周张力。一旦发现对于一定层析柱尺寸(管的内部参数)所必须的引发环周张力，只要这些变量最终获得同样的最终引发环周张力值，可以再次改变对引发环周张力有贡献的三个主要变量以优化设计。
图9a和9b示意表示了当将流体分布器24初始装入管件20在其抵达凹槽22之前产生的力的自由体图。因为流体分布器24首先进入管件20，管件20还没有膨胀。流体分布器24和管20壁之间的过盈将使管20扩大而使流体分布器24压缩。由于管件20的壁厚小于流体分布器24的直径和厚度，总的净压力将导致管壁的扩张(注意流体分布器24可相应经历微量压缩)。为了这种现象发生，轴向的力必须足够大以克服由于引发环周张力产生的力。轴向力来自直线驱动器，水平或径向力来自引发环周应力。轴向力简单克服了摩擦力。摩擦力直接与来自引发环周的力的值相关。
图10a和10b示意显示了当流体分布器24穿过凹槽22之后使其沿着管件20的轴向长度前进产生的力的自由体图。虽然轴向力的一些组分有助于扩张管件20，压力分布在3-5个远离流体分布器24和管件20之间的初始接触点的特有维度上并且管件20已经在流体分布器24之前扩张。因此，随着流体分布器24沿着管件20的长度进一步轴向插入，推动流体分布器24的轴向力大于克服不仅发生在与流体分布器24接触的点，还发生在流体分布器24之前的3-5个特有维度的更高的环周张力。在一些实施方案中，凹槽开始于管壁的最后并且例如可以沿着管件的整个长度延伸。
图11显示表明了在一个实施方案中，随着流体分布器24进入管件20，将流体分布器24压入管件20所需的轴向力的图。如所示，当流体分布器24的第一部分进入并穿过管件凹槽22的初始处时，力开始增加到峰值。开始时，流体分布器24和管壁经历静摩擦并且克服该静摩擦的力是最大的。一旦流体分布器24和管20壁的变形使流体分布器24滑入管件20，由于其经历动力学摩擦，将流体分布器24继续压入管件所需的力下降。动力学摩擦远比静摩擦易克服。在此图中还出现了两个额外的峰。第一个峰在约21mm，对应当凹槽22的底部在流体分布器24的O型环凹槽26内(如图12所示)。第二个峰对应的点是当整个流体分布器24啮合在凹槽外的管件20的区域中。如所示，在此实施例中，最大轴向力是约1200-1300lbf。
对于某些实施方案，可以通过使用设置在流体分布器24的外壁中的O型环凹槽26中的O型环改进密封。在某些实施方案中，压配合或过盈配合足以将流体分布器保持到位，但是在其他实施方案中，需要更持久的结合。
一旦流体分布器24已经装入管件的第一(例如，底)端约1至10cm，例如6.0、6.5、7.0、7.5、8.0或8.5cm，可以将流体分布器24永久固定到位，例如通过焊接，例如如果流体分布器24和管件由相同或充分类似的材料制成。可以使用各种焊接技术来形成流体分布器和柱管件之间的焊接，包括但不限于热工具焊接、热气焊接(例如在420℃)、超声波、挤压、激光、传导、高频等。如果两个部件由不同的材料制成，可以使用机械夹将其连接，如金属软管夹，外部施加以压缩管件并施加将流体分布器在该位置锚定入管件的力，或通过粘合剂或通过穿过管壁进入流体分布器的机械固定件。
第四，入口和出口配件38a、38b连接至第一(例如底部)和第二(例如顶部)流体分布器24a、24b(808)。入口和出口配件38a、38b具有拧入顶部和底部流体分布器24a、24b的螺纹配件孔26的螺纹区域40。可以在每个配件的底端(即，与流体分布器配合的一端)或在流体分布器的螺纹配件孔26的末端形成凹进(例如，O型环密封压盖)。在此实例中，O型环设置于配件38和流体分布器24之间以形成当其通过螺纹结合时配件38和流体分布器之间的密封(例如，不透液体的密封)。可以使用转矩扳手来保证O型环的充分压缩以产生在此界面的充分密封。
接着，以液体浆料形式的填料在底部流体分布器24b以上的空间(腔室)装载入柱管件20(810)。
接着，如图6和7所示，一旦第二(例如顶部)流体分布器24a垂直加入管件(并任选地已经连接至液体源)，当使用过盈配合方法时，将其以如插入第一流体分布器24b的基本相同的方法插入管件20(812)。重要的是对于第二流体分布器使用过盈配合方法，因为此第二(例如，顶部)流体分布器24a装入管件20的初始位置不应被立即固定，因为有可能在测试之后需要重新调整第二流体分布器的初始位置。因此，使用过盈配合方法，从而使第二(例如，顶部)流体分布器24a可以在管件20内移动以做最终的调整。同样重要的是设计并实施过盈配合使其在测试柱期间使用的压力下保证不透液体的密封。
在此，使用适于特定介质的方法，例如具有适宜配制的溶液(“流动相”或“包装缓冲液”)的流体或从柱出口配件38b施加的抽吸、或任意其他已知的适宜技术或方法，可以将填料灵活地装入填充床。可以通过向流体分布器施加额外的轴向力直到其接触填料并可以压缩填料至达到希望的位置，将第二(例如，顶部)流体分布器进一步装入管件。取决于填料的性质，所述压力的范围可以从无到填充床高的30％或以上。以通过HETP(理论塔板当量高度)测试和不对称分析测量的柱性能将部分是床压力的函数。如果适宜，也有可能将插入的流体分布器24a朝管件的末端移出以降低床压。这使用通过施加至第一和第二流体分布器之间产生的腔室内的液体的力的流体静压实现。由于将第一流体分布器24B永久固定，一旦通过柱管件内的液体施加针对它的足以克服压配合的力，使用压配合固定的第二流体分布器24A将移动。
接着，可以通过未保留的和已经可检测的测试件(例如，通过UV监控的丙酮或通过电导监测的氯化钠)的注射脉冲检测柱填料的适宜性(818)。基于填充测试的结果，顶部流体分布器24a可以进一步向下进入(例如，可以被推入)填充床并且可以重复填充测试。如果顶部流体分布器移入管件过深，可导致过度压缩填充床，液体将通过入口配件被迫进入腔室，出口配件密封关闭，从而使用液压将顶部流体分布器24a沿着管件的顶端移动回去并减少填充床的压缩。一旦确定柱填料的适宜性，之后可以将柱消毒和/或用按照最终用户指定的抑制细菌的保护液冲洗。
当第二(例如，顶部)流体分布器24a适当定位时，可以将其例如通过焊接或其他如上所述的用于固定第一流体分布器的方式，永久固定(818)。在一些实施方案中，过盈配合可以满足将顶部(或第二)流体分布器24a固定至管件20的内壁。
在一些实施方案中，可以之后用顶盖、底座和/或侧护板装配填充的最终层析柱。可将层析柱经过最终的杀菌并用于运送或包装后运送。
使用方法
本文描述的系统和方法提供给最终用户一次性、预先填充的、预先通过审核并且无菌的层析柱，其在性能上与其他通常存在于需要大量基本费用的持久硬件装置的层析柱具有可比性。新型无菌柱的使用方法与其他已知的层析柱相同，但是考虑到一次性和无菌性，新型柱对于分离和纯化有毒或另外有危险的试剂(例如病毒、病原体和毒素)是特别有用的。此外，可以使用这些无菌柱而不用害怕经常发生在再次使用柱或没有有效清洗柱时的污染。例如，这些无菌柱可用于其中要求高水平的微生物控制时的无菌连续过程和多产品设备。
新型无菌柱可用于一次性体系中和多柱层析体系中。也可以通过无菌连接将新型无菌柱连接至无菌体系。
在一些用途中，可以将柱用各种具有两种或多种不同SpA分子的亲和捕获介质预先填充。
实施例
在以下实施例中进一步描述本发明，以下实施例不限制权利要求所描述的发明的范围。
实施例1-γ辐射对压力容限的影响
本实施例的目的在于确定本文描述的新型灭菌方法在塑料层析柱和其部件上的影响。本测试涉及不包含任何填料的组合层析柱的辐照，以及层析柱部件的辐照，以检测γ辐射在每个元件的压力容限上的影响。
柱材料-OPUSTM层析柱(Repligen公司)
●14cm流体分布器
●14cm床载体-聚丙烯网
●14cm流体分布器O型环
●端口O型环(小O型环)
●入口端口
●端口夹
●端口塞
●14cm挤出聚丙烯管件
方法
通过灭菌承包公司，Steris公司，其在他们的Isomedix Services商业(Northborough，MA)上提供承包灭菌服务，用25kGy的希望的目标，在15-40kGy之间的剂量的γ辐照层析柱元件。实际传输的剂量在21.3-25.3kGy之间。Steris Corp.使用从同位素源(钴60)发射的高能光子以产生穿过预先填充的柱的离子化(电子干扰)。在活细胞中，这些干扰导致DNA和其他细胞结构的破坏。这些分子水平的光子引发的变化导致生物体的死亡或使生物体不能繁殖，因此提供所希望的杀菌。
对于辐照之后的测试，将柱连接至用水填充的压力箱。可以使用外部惰性气体箱将压力箱加压至高达100psi(7巴)。首先用水将柱填充，之后使柱经过升压。将压力计连接至柱的入口以监控测试中的压力升高。
结果
将非辐照的新型层析柱确定为最大压力是4巴。辐照的柱没有将顶部接合器焊接，因此，预期其承受的最大压力小于4巴。
顶部流体接合器直到压力达到5.5巴才移动。在5.5巴下，顶部流体接合器开始缓慢上移，直到其可以完全从柱移除。本测试表明辐照柱具有与非辐照柱相当的压力容限。
实施例2-γ辐射对可泄漏物和可提取物的影响
本实施例的目的在于确定用通过γ辐照杀菌的层析柱的材料的兼容性。在本实施例中，确定γ辐射对来自柱部件的可泄漏物和可提取物的影响。
柱材料-OPUSTM层析柱(Repligen公司)
●14cm流体分布器-加工模塑的聚丙烯
●14cm床载体-聚丙烯网
●14cm流体分布器O型环-铂硫化硅橡胶(platinum cured silicone)
●端口O型环(小O型环)-铂硫化硅橡胶
●入口端口-加工的聚丙烯
●14cm挤出聚丙烯管件
方法
如以上实施例1描述的，通过STERIS Isomedix(Northborough，MA)，用希望的目标25kGy，在15-40kGy之间γ辐照OPUSTM层析柱元件。实际传输的剂量在21.3-25.3kGy之间。
柱材料，辐照的和非辐照的，均分别在37℃浸泡在20％乙醇和水中72小时。在培养期的末期，通过反相HPLC分析上清液。
用于检测可泄漏物和可提取物的HPLC方法：
-HPLC柱YMC C18-3um，12nm
-缓冲液A：水中0.1％TFA
-缓冲液B：乙腈中0.1％TFA
-流速1mL/min
表1：用于检测可泄漏物和可提取物的HPLC方法
时间 ％A
0.00 5.0
45.00 50.0
60.00 80.0
65.00 80.0
68.00 5.0
75.00 5.0
结果
参照图14A-J，对于非辐照和辐照的柱部件，在20％乙醇中存在比在水中稍高水平的可泄漏物和可提取物。所述图显示出在塑料制品经过辐照之后，没有明显的可泄漏物和可提取物存在。样品之间可见的变化性在统计上不明显。
在20％乙醇中，所有检测的柱部件显示辐照后比非辐照的部件更低水平的可提取物。在水中，柱体具有的辐照后可提取物的水平稍高，但是差别在统计上不明显。在水中辐照后，床载体显示更高水平的可提取物。但是，整体变化甚微。在辐照样品中，一些化合物峰下降，或完全消失，可能由于来自于γ辐照的交联。
实施例3-γ辐射对物理外观的影响
本实施例的目的在于检测γ辐射对组合层析柱的物理外观的影响。
柱材料-OPUSTM层析柱(Repligen公司)
●14cm流体分布器-加工模塑的聚丙烯
●14cm床载体-聚丙烯网
●14cm流体分布器O型环-铂硫化硅橡胶
●端口O型环(小O型环)-铂硫化硅橡胶
●入口端口-加工的聚丙烯
●端口夹
●端口塞
●14cm挤出聚丙烯管件
方法
如实施例1描述的，通过STERIS Isomedix(Northborough，MA)，用25kGy的希望的目标，在15-40kGy之间γ辐照组合的空OPUSTM层析柱。实际传输的剂量在21.3-25.3kGy之间。
结果
如图13所示，与非辐照的柱相比，辐照的聚丙烯柱具有近白色/黄色的色彩，但是还是完整的。
实施例4-γ辐射对机械性能的影响
本实施例的目的在于检测γ辐射对色谱柱管件机械性能的影响。具体地，目的在于导出应力对应变曲线。拉伸屈服强度、屈服伸长、断裂拉伸应力、断裂伸长和弹性模量都能从此曲线上找到。
柱材料-OPUSTM层析柱(Repligen公司)
●14cm挤出聚丙烯管件
方法
通过STERIS Isomedix(Northborough，MA)，用希望的目标是25kGy的γ辐照，在15-40kGy之间γ辐照OPUSTM层析柱管件。实际传输的剂量在21.3-25.3kGy之间。
辐照之后，Intertek PTL(Pittsfield，MA)根据ASTM D638-10进行拉伸试验。准备(从柱管件切出)并检测五个非辐照纯挤出的PP管件样品和五个辐照的、挤出的PP管件样品。以下列出具体参数。
样品制备
通过Intertek PTL加工
样品类型
ASTM 1型拉力试棒
样品尺寸
0.500”×0.125”(平均)
十字头速度
50mm/min
伸缩仪
基于50mm标准长度的160％。符合实践的最低要求
E83：模量(类别B-2)/伸长(类别C)
条件
在23℃±2℃/50％±10％RH下40+小时
实验条件
23℃±2℃/50％±10％RH
结果
表2总结了从这一系列试验中获得的数据。图15和16显示了纯的和辐照挤出的PP管件之间可以忽略的差别。所有的样品经历看上去非常类似的弹性变性区域，其通过图16所示的第一最小值至最大值表示。在屈服之后，在应力的每个递增变化，辐照样品倾向于拉伸得稍多，其会为较坚韧材料的特征(高至断裂的曲线以下的区域)，但是仅有的相关材料包含在曲线的弹性区域，因为塑料在组装中不会经历永久变形。将所有的过盈设计为使得材料不会经历任何弹性变性。值得注意的是，由于处于拉力或压力，材料随时间将经历轻微蠕变，这是塑料的正常物理性质。
表2对比了纯的和辐照的挤出PP管件的作为图16的分析结果的最终工程性能。两个样品都经过同样的屈服伸长，而辐照样品实现稍大的拉伸屈服强度，140PSI。这小于总拉伸屈服强度的3％，因此可以将其视为最小因子，特别是当考虑到纯的和辐照的样品的标准偏差分别是35PSI和49PSI。弹性模量，其通过在弹性变形区域内的应力对应变曲线的斜率表示，对纯的样品，辐照样品是高于20,000PSI。高弹性模量表示更有弹性的材料，因此，材料可以吸收更高量级的能量并仍然回到其初始形状。该材料的回弹通过以下等式表示。
其中，Ur是回弹模量，σ是应力，ε是应变，εy是屈服应变的值。
总而言之，两种材料都显示非常类似的弹性变形，但是辐照样品被认为比非辐照纯样品更有回弹力。这表示辐照样品会需要比非辐照纯样品略大的压力来到达实现屈服点的应变的量级。
表2.纯的和辐照的挤出PP管件的拉伸性能分析
实施例5-γ辐射对机械性能的影响
本实施例的目的在于检测γ辐射对层析柱管件机械性能的影响。具体地，目的在于导出应力对应变曲线。弯曲应力和5％应变和弯曲模量都能从此曲线上找到。
柱材料-OPUSTM层析柱(Repligen公司)
●14cm挤出聚丙烯管件。
方法
如在实施例1所述，通过STERIS Isomedix(Northborough，MA)，用25kGy的γ辐照的希望的目标，在15-40kGy之间γ辐照OPUSTM层析柱管件。实际传输的剂量在21.3-25.3kGy之间。
辐照之后，Intertek PTL(Pittsfield，MA)根据ASTM D790-10进行弯曲试验。准备(从柱管件切出)并检测五个纯挤出的聚丙烯管件样品和五个辐照的、挤出的聚丙烯管件样品。以下列出具体参数。
样品制备
通过Intertek PTL加工
样品类型
ASTM弯曲试棒
样品尺寸
0.500”×0.125”×5”(平均)
十字头速度
0.054in/min
跨度距离
2.016in
伸缩仪
基于50mm标准长度的160％。符合实践的最低要求
E83：模量(类别B-2)伸长(类别C)
跨厚比
16±1∶1
载体半径
0.197in
负载鼻半径(Radius of Loading Nose)
0.197in
条件
在23℃±2℃/50％±10％RH下40+小时
实验条件
23℃±2℃/50％±10％RH
结果
图17显示了纯的和辐照挤出的PP管件之间可以忽略的差别。在所有样品上进行三个点的弯曲试验高至6％的应变，辐照样品在与纯的样品拉伸同样距离时需要稍高的压力。
表3对比了纯的和辐照的挤出PP管件的作为图17的分析结果的最终工程性能。又如预期的，辐照样品经历比纯的样品稍高的弯曲模量，其表示挤出的PP管件在引入辐射之后变得稍微更有回弹性。
总而言之，如图17所表示的，在纯的和辐照的样品之间存在非常微小的差别。在经过辐照之后，辐照的样品变得稍微更有回弹性。表3支持了之前所述的假设。
表3.纯的和辐照的挤出PP管件的弯曲应力性质
实施例6-γ辐射对机械性能的影响-流体分布器O型环
本实施例的目的在于检测γ辐射对层析柱硅胶O型环的机械性能的影响。具体地，目的在于导出对于每种材料应力对应变曲线。断裂拉伸强度和断裂伸长都能从此曲线上找到。
柱材料
●14cm流体分布器O型环
●14cm挤出聚丙烯管件
方法
通过STERIS Isomedix(Northborough，MA)，用25kGy的γ辐照的希望的目标，在15-40kGy之间γ辐照具有流体分布器和O型环的组合的OPUSTM层析柱管件。实际传输的剂量在21.3-25.3kGy之间。
辐照之后，Intertek PTL(Pittsfield，MA)根据ASTM D412-06a进行拉伸试验。准备并检测两个纯硅胶O型环样品和两个辐照硅胶O型环样品。将测试的O型环从经历辐照过程的组合柱移除。如此，O型环在延长的时间段内处于拉力和压力下并在辐照过程中处于拉力和压力下。从库存中取出纯的O型环以也用于检测。以下列出具体参数。
样品制备
通过Intertek PTL切割
样品类型
O型环部件
十字头速度
20in/min
伸缩仪
基于1.0”标准长度的1000％
条件
在23℃±2℃/50％±10％RH下40+小时
实验条件
23℃±2℃/50％±10％RH
结果
图18表示对于非辐照纯的和辐照硅胶O型环的应力对应变的曲线。实验之前，从库存中取出非辐照的纯的O型环，与从经过辐照的组合柱移出的辐照的样品相比。换言之，辐照的样品经历了管壁和流体分布器之间的压力(约20％压力)和拉力(拉伸以配合流体分布器内的O型环密封压盖)，其可能有助于材料的一些内部蠕变。内部蠕变将产生稍长的样品，其不会伸长到屈服，其在图17中显明。辐照样品还具有更陡峭的弹性区域(弹性模量)，更高的屈服和断裂应力，和更低的断点应变(strain to break point)，其都明显表示稍硬且更具回弹性的材料。辐射和初始压力/拉力的组合使得辐照样品稍微比纯的硅胶O型环更具回弹性并更硬。表4支持了之前所述的假设。
表4.辐照和非辐照硅胶O型环的拉伸强度分析
实施例7-γ辐射对机械性能的影响-流体分布器O型环
本实施例的目的在于检测γ辐射对层析柱硅胶O型环的机械性能的影响。具体地，目的在于导出对于O型环样品的硬度值。
柱材料-OPUSTM层析柱(Repligen公司)
●14cm流体分布器O型环
方法
如实施例1所示，通过STERIS Isomedix(Northborough，MA)，用25kGy的γ辐照的希望的目标，在15-40kGy之间γ辐照OPUSTM层析柱流体分布器O型环。实际传输的剂量在21.3-25.3kGy之间。
辐照之后，Intertek PTL(Pittsfield，MA)根据ASTM D2240-05(2010)进行硬度试验。准备并检测五个非辐照的纯硅胶O型环样品和五个辐照硅胶O型环样品。以下列出具体参数。
样品制备
通过Intertek PTL从O型环剖面切割
缩进(indention)时间间隔
1秒
使用的硬度计压头
A
条件
在23℃±2℃/50％±10％RH下40+小时
实验条件
23℃±2℃/50％±10％RH
结果
表5对比了纯的和辐照的硅胶O型环的硬度等级。通过硬度计单位描述材料的硬度，假设恒定力，其代表特定仪器压入材料的距离。例如，按照ASTM D2240类型A规模进行这些试验，其指定硬化钢杆，直径1.1-1.5mm，具有截断的35°锥。锥的尖端用8.064N的力压入来自O型环的切割样品。锥的尖端可以延伸至0-2.54mm的任意处，取决于材料的硬度。如果尖端行进2.54mm，材料将具有O邵氏A硬度，相反地，如果尖端行进0mm，材料将具有100邵氏A硬度。
辐照样品具有73邵氏A硬度而非辐照纯硅胶O型环具有77邵氏A硬度。供应商表示硅胶O型环具有75邵氏A硬度，因此辐照和非辐照的纯样品都是从平均值偏离2标准偏差，可以将其忽略，因为存在与此试验相关的±5的误差。
表5.辐照和非辐照硅胶O型环的硬度分析
实施例8-γ辐射对填充有琼脂糖介质的OPUSTM柱的影响
本实施例的目的在于确定填充床的流动性能是否会在γ辐照后变化。
材料和方法
用Sepharose 6Fast Flow介质(通用电子医疗)填充OPUSTM柱(Repligen公司)至尺寸为20cm内径(id)×20cm床高(BH)。进行初始测试，之后将柱在STERIS(Northborough，MA)用36.3kGy和39.9kGy之间的剂量γ辐照之后再次测试。
对于该测试，理论塔板、不对称性和压力在100cm/hr下确定。在将1％柱体积脉冲的10％的丙酮溶液注入柱之前，在3个柱体积的100mM NaCl中平衡该柱。
表6.γ辐照之前和之后柱填充床的性能属性
结果
对于γ辐照柱的填充床的理论塔板数的数量、不对称性和压降下降的变化每个都小于20％。结果表明用琼脂糖介质如Sepharose 6FF填充的20cm ID×20cm BH OPUS柱的整体性在灭菌剂量的γ辐射之后仍然完整。
实施例9-γ辐射对结合力的影响
本测试的目的在于确定γ辐照之后各种填料的功能性水平。检测用蛋白A功能化的二氧化硅和琼脂糖介质。使用在静态结合力(SBC)和动态结合力(DBC)模式中的人多克隆IgG(hIgG)的能力评定γ辐照在这些亲和填料上的功能性影响。
方法
二氧化硅介质，(W.R.Grace)和SepharoseTM4Fast Flow特征用重组蛋白A，rSPA(Repligen公司)使用还原胺化化学法固定。用不同的蛋白A配体，MB4(Repligen)也将同样的介质固定。MB4是包括四个B域的多聚体重组蛋白A配体，每个都具有G29A突变。用rSPA固定的Sepharose 4FF通过Repligen公司在CaptivATMPriMabTM商品名下出售。将所有的介质样品都储存在20％乙醇溶液中。一半的固定样品作为对照保存，另一半邮寄到STERIS(Northborough，MA)进行γ辐照(28.6-33.5kGy)。
将100μl体积的每种介质测量入1.5ml离心管并用1ml磷酸盐缓冲盐水(PBS)清洗3次以平衡介质。向介质中加入1.0ml的10g/L的IgG(SeraCare)并允许上下颠倒混合30分钟。孵育后，介质用1.0ml PBS清洗5次。之后通过加入10ml的100mM磷酸盐，pH2.8，洗脱hIgG。通过在280nm的UV测量确定洗脱液中的hIgG的量。通过将UV280结果乘以100然后除以消光系数1.3，计算结合力(g IgG/L介质)。
IgG动态结合力
将每种介质约3.42ml量填充入柱，形成10cm的床高(Omnifit,0.66cm ID)。每个柱用PBS在2.0ml/min的流速下使用AKTAExplorer FPLC(通用电子医疗)填充。在PBS中将IgG(SeraCare)稀释至2.2mg/ml之后以提供的3分钟停留时间的流速上柱。在5％hIgG穿透下确定结合力。
结果
结果在表7中显示。
表7.γ辐照之前和之后的蛋白A层析介质的结合力
这些结果显示了γ辐照之后填料功能的百分比在非辐照对比样品的66.0和90.0％之间。如果施加高水平的γ辐照(28.6-33.5kGy)，这个结果意外地高。这些数据还显示了在所有的检测介质中，保留了大于65％的初始力并且在某些情况下，保留了大于80％的力。这种性能将从每升辐照的蛋白A介质纯化20g至42g抗体产品并因此支持蛋白质纯化过程。
实施例10-介质保护液组合物在γ辐射中有关于结合力的影响
本测试的目的在于确定填料保护液的组合物在γ辐照中是否对于曝露之后的功能能力具有影响。将用蛋白A功能化的琼脂糖介质在多种不同溶液中γ辐照。以动态(DBC)模式的人多克隆IgG(hIgG)的能力用于评定在动态结合试验中γ辐射对这些亲和填料的性能的影响
方法
将CaptivATMPriMabTM(用rSPA固定的Sepharose 4FF，Repligen公司)蛋白A介质的13个20ml样品洗入13种不同溶液。在50％浆料浓度下制备每一20ml样品。将13个样品中的每一个寄送至STERIS(Northborough，MA)用于40kGy剂量的目标γ辐射。实际传输的剂量在36.3kGy和39.9kGy之间。γ辐照之后确定每个的DBC。
IgG动态结合力
将每种介质约1ml量填充入柱(XK5，0.5cm ID)。每个柱用PBS在1ml/min的流速下使用AKTA Explorer FPLC(通用电子医疗)填充。在PBS中将hIgG(SeraCare)稀释至2.2mg/ml之后以提供6分钟停留时间的流速上柱。在10％hIgG穿透下确定结合力。
结果
结果在表8中显示。
表8.在不同溶液中γ辐照的蛋白A层析介质的结合力
结果表明其中蛋白A介质经过γ辐照的溶液对功能能力具有主要影响。在纯去离子水中，功能能力降低为原始的<10％。之前的实施例显示在20％乙醇中在28.6-33.5kGy之间的剂量下辐照之后，结合力>对照的65％。这表明脂肪族伯醇可有利于保持包含蛋白A分子的亲和介质的性能。在此实验中，用存在于20％的乙醇溶液中的200mM抗坏血酸获得了类似的结果。
出人意料的，在含有2％苯甲醇的溶液中辐照的介质，其不含有醋酸盐或乙醇，保留了所有的功能结合。这证明了在γ辐射曝露期间，芳族醇的存在可提供保护优势。存在醋酸盐的样品在pH6不如在pH5稳定，但是与纯水相比，其每一个都保留了更多的能力。在醋酸盐样品中抗坏血酸的存在随着浓度的升高提供了适度的保护作用。
其他实施方案
应理解当本发明已经结合其详细说明来描述，之前的描述意为解释而不是限制本发明的范围，本发明通过所附权利要求的范围限定。其他方面、优势、实施方案和改变都在以下权利要求的范围之内。

Claims (31)

1.一种制备无菌填充层析柱的方法，所述方法包括：
(a)选择管件；
(b)将填料加入所述管件，向所述填料加入保护液，并封闭所述管件的两端以形成填充柱，
其中所述保护液包括2.0％的苯甲醇水溶液或2.0％的苯甲醇磷酸盐缓冲盐水；和
(c)用一剂量从至少8kGy至40kGy的γ辐射辐照所述柱以形成无菌填充层析柱；
其中，所述填料用能结合至免疫球蛋白IgG的葡萄球菌蛋白A(SpA)多肽和任选的以下一种或多种功能化：离子交换基团；具有疏水和带电性能的多元基团；金属螯合基团；疏水基团；
所述SpA多肽包括全长野生型SpA，重组SpA，包括选自SpA域A、B、C、D、E或Z的SpA域的单体SpA多肽，或包括以选自SpA域A、B、C、D、E或Z的任意组合的任意两个、三个、四个、五个或更多SpA域的多聚体SpA多肽，或其功能等价物。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述层析柱包括所述管件、第一流体分布器和第二流体分布器，并且其中所述管件、第一流体分布器和第二流体分布器各自由相同或不同的塑料材料制成。
3.根据权利要求2所述的方法，其中所述塑料材料包括聚丙烯、聚乙烯、聚酰胺、缩醛类、玻璃填充塑料类、碳填充塑料类、玻璃纤维塑料类或碳纤维塑料类。
4.根据权利要求1至3任一项所述的方法，其中所述填料包括琼脂糖、二氧化硅、陶瓷或丙烯酸酯的聚合物或纤维素基材料。
5.根据权利要求1至3任一项所述的方法，其中所述离子交换基团包括一种或多种季胺、硫酸盐和羧酸盐。
6.根据权利要求1至3任一项所述的方法，其中所述疏水基团包括一种或多种丙基、辛基和苯基基团。
7.根据权利要求1-3任一项所述的方法，其中所述SpA多肽包括多聚体SpA多肽。
8.根据权利要求7所述的方法，其中所述多聚体SpA多肽包括四或五个选自SpA域B、C和Z的SpA域。
9.根据权利要求8所述的方法，其中所有的SpA域是相同的。
10.根据权利要求9所述的方法，其中所述多聚体SpA多肽包括五个SpA域C。
11.根据权利要求1所述的方法，其中封闭所述管件的两端包括
向所述管件的一端插入略大于所述管件的流体分布器以形成一端的过盈配合；
向所述管件加入填料；和
插入另一个流体分布器以形成所述管件内的介质的填充床。
12.根据权利要求1所述的方法，其中所述γ辐射辐照的剂量包括8、10、15、20、25、30、33、35或40kGy。
13.根据权利要求1所述的方法，进一步包括在γ辐射辐照之前在气密和水密容器内密封所述层析柱。
14.根据权利要求13所述的方法，进一步包括在γ辐射辐照之前在第二气密和水密容器内密封所述层析柱以提供双层封装。
15.一种无菌填充层析柱，其包括：
(a)具有两端的无菌中空管件；
(b)在所述管件内的无菌层析填料，其中所述管件在两端封闭以形成所述填充层析柱；和
(c)保护液，其中所述保护液包括2.0％的苯甲醇水溶液或2.0％的苯甲醇磷酸盐缓冲盐水；
其中，所述填料用能结合至免疫球蛋白IgG的葡萄球菌蛋白A(SpA)多肽和任选的以下一种或多种功能化：离子交换基团；具有疏水和带电性能的多元基团；金属螯合基团；疏水基团；
所述SpA多肽包括全长野生型SpA，重组SpA，包括选自SpA域A、B、C、D、E或Z的SpA域的单体SpA多肽，或包括以选自SpA域A、B、C、D、E或Z的任意组合的任意两个、三个、四个、五个或更多SpA域的多聚体SpA多肽，或其功能等价物；并且
其中所述填充层析柱具有的无菌保证水平(SAL)为10-3生物体/柱。
16.根据权利要求15所述的无菌填充层析柱，其中所述填充层析柱具有的SAL为10-6生物体/柱。
17.根据权利要求15或16所述的无菌填充层析柱，其中所述层析柱包括所述管件、第一流体分布器和第二流体分布器，并且其中所述管件、第一流体分布器和第二流体分布器各自由相同或不同的塑料材料制成。
18.根据权利要求17所述的无菌填充层析柱，其中所述塑料材料包括聚丙烯、聚乙烯、聚酰胺类、缩醛类、玻璃填充塑料类、碳填充塑料类、玻璃纤维塑料类或碳纤维塑料类。
19.根据权利要求15所述的无菌填充层析柱，其中所述填料包括琼脂糖、二氧化硅、陶瓷或丙烯酸酯的聚合物或纤维素基材料。
20.根据权利要求15或16所述的无菌填充层析柱，其中所述离子交换基团包括一种或多种季胺、硫酸盐和羧酸盐。
21.根据权利要求15或16所述的无菌填充层析柱，其中所述疏水基团包括一种或多种丙基、辛基和苯基基团。
22.根据权利要求15或16所述的无菌填充层析柱，其中所述SpA多肽包括多聚体SpA多肽。
23.根据权利要求22所述的无菌填充层析柱，其中所述多聚体SpA多肽包括四或五个选自SpA域B、C和Z的SpA域。
24.根据权利要求23所述的无菌填充层析柱，其中所有的SpA域是相同的。
25.根据权利要求24所述的无菌填充层析柱，其中所述多聚体SpA多肽包括五个SpA域C。
26.根据权利要求15所述的无菌填充层析柱，其中所述管件的两端通过具有略大于所述管件内径的外径的流体分布器封闭以提供过盈配合。
27.根据权利要求15所述的无菌填充层析柱，其中所述层析柱在气密和水密容器内密封。
28.根据权利要求27所述的无菌填充层析柱，其中在γ辐照之前在第二气密和水密容器内进一步密封所述层析柱以提供双层封装。
29.一种无菌填充层析柱，其包括
具有第一端和第二端的无菌中空管件；
固定至所述管件的第一端的无菌第一流体分布器；
具有大于所述管件的内径的外径的无菌第二流体分布器；
填充在所述第一和第二流体分布器之间的所述管件内的无菌填料；和
添加到所述无菌填料的保护液，其中所述保护液包括2.0％的苯甲醇水溶液或2.0％的苯甲醇磷酸盐缓冲盐水；
其中所述第二流体分布器固定在所述管件的第二端内以形成所述第一和第二流体分布器之间的用填料填充的中空管件内的腔室；
其中所述填料用能结合至免疫球蛋白IgG的葡萄球菌蛋白A(SpA)多肽和任选的以下一种或多种功能化：离子交换基团；具有疏水和带电性能的多元基团；金属螯合基团；疏水基团；
所述SpA多肽包括全长野生型SpA，重组SpA，包括选自SpA域A、B、C、D、E或Z的SpA域的单体SpA多肽，或包括以选自SpA域A、B、C、D、E或Z的任意组合的任意两个、三个、四个、五个或更多SpA域的多聚体SpA多肽，或其功能等价物；
并且其中所述填充层析柱具有的无菌保证水平为10-3生物体/柱。
30.根据权利要求29所述的无菌填充层析柱，其中所述层析柱具有的SAL为10-6生物体/柱。
31.根据权利要求29所述的无菌填充层析柱，其中在所述层析柱内的所述填料具有特性吸附水平为在未用γ射线辐照的层析柱内的同一种类型的填料的特性吸附水平的至少60％。
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