HK1223299B - 用於预防或治疗与干扰素受体密度降低相关之疾病的方法 - Google Patents

Description

用于预防或治疗与干扰素受体密度降低相关之疾病的方法

技术领域

本发明涉及医药，特别地涉及戊二酸单酰组胺或其可药用盐用于预防或治疗与干扰素受体密度降低相关之疾病的用途。

背景技术

I型干扰素(包括干扰素α(IFNα)和干扰素β(IFNβ))是负责保护生物体免受病毒感染和肿瘤生长之先天免疫的最重要因子。这些细胞因子通过与细胞表面上的一种受体相互作用来执行其信号功能。所述受体是由两条链IFNAR1和IFNAR2组成的异二聚体。干扰素与该受体的相互作用导致生物化学链的激活，其以Janus激酶Tyk2和Jak1的激活开始，而Janus激酶Tyk2和Jak1的激活提供信号转导子和转录激活子Stat1和Stat2的磷酸化。后两种分子提供编码抗病毒效应蛋白的干扰素刺激的基因的转录。

干扰素信号是强大的刺激，其改变生物体中多种含干扰素受体之细胞的稳态、功能和分裂。干扰素分子与受体的相互作用失控可对免疫系统和整个生物体的细胞具有有毒的损害作用。例如，干扰素信号传导途径的缺陷导致发生例如系统性红斑狼疮的病理状况。就此而论，干扰素信号传导的强度受到严格控制，其涉及多种机制，并且首先是细胞表面上干扰素受体密度的调节/降低(Coccia E.M.，Uze G.，Pellegrini S.(2006)Negativeregulation of type I interferon signaling：facts and mechanisms.Cell Mol Biol(Noisy-le-grand)52：77-87)。这一生理机制包括细胞蛋白酶体中受体亚基IFNAR1的磷酸化、泛素化、胞吞和后续降解(Kumar K.G.，Krolewski J.J.，Fuchs S.Y.(2004)Phosphorylation and specific ubiquitin acceptor sites are required forubiquitination and degradation of the IFNAR1 subunit of type I interferonreceptor.J Biol Chem 279：46614-46620)。

病毒通过降低干扰素信号传导的强度(包括通过干扰素受体的降解)来将这一生理机制用于其自身益处。病原体的作用可包括用病毒蛋白定向抑制干扰素受体。例如，乙型肝炎病毒用蛋白X来降低干扰素受体的密度(Cho I.R.，Oh M.，Koh S.S.，Malilas W.，Srisuttee R.，Jhun B.H.，Pellegrini S.，Fuchs S.Y.，Chung Y.H.Hepatitis B virus Xprotein inhibits extracellular IFN-α-mediated signal transduction bydownregulation of type I IFN receptor.Int J Mol Med.2012年4月；29(4)：581-6.doi：10.3892/ijmm.2012.879.电子出版于2012年1月3日)。另一些病毒(包括疱疹病毒)通过由病毒引起的细胞应激来达到干扰素受体密度降低的作用(Liu J.，HuangFu W.C.，Kumar K.G.等Virus-induced unfolded protein response attenuates antiviraldefenses via phosphorylation-dependent degradation of the type I interferonreceptor.Cell Host Microbe 2009；5：72-83)。例如，单纯疱疹病毒能够通过降解干扰素受体的第一亚基IFNAR1来有效地降低其密度(Qian J.，Zheng H.，Huangfu W.C.，Liu J.，Carbone C.J.，Leu N.A.，Baker D.P.，Fuchs S.Y.Pathogen recognition receptorsignaling accelerates phosphorylation-dependent degradation of IFNAR1.PLoSPathog.2011年6月；7(6)：e1002065.doi：10.1371/journal.ppat.1002065.电子出版于2001年6月9日)。已知，疱疹病毒家族以导致不同严重程度的人疾病的8类疱疹病毒为代表。所述疾病的特征在于：病毒以其潜伏状态存在于人体中。

不同疱疹病毒的基因组结构的相似性提供了阻断干扰素信号传导的共同机制。

在病毒感染中对干扰素受体进行病毒调节的另一实例是在女性的乳头瘤病毒肿瘤发生中打乱干扰素受体亚基之间的平衡(Tirone N.R.，Peghini B.C.，Barcelos A.C.，Murta E.F.，Michelin M.A.Local expression of interferon-alpha and interferonreceptors in cervical intraepithelial neoplasia.Cancer ImmunolImmunother.2009年12月；58(12)：2003-10.doi：10.1007/s00262-009-0707-6.电子出版于2009年4月18日.PubMed PMID：19381629)。

因此，急性和慢性病毒感染伴随着干扰素系统抑制，其特别地由干扰素受体的加速降解引起(Qian J.，Zheng H.，Huangfu W.C.，Liu J.，Carbone C.J.，Leu N.A.，BakerD.P.，Fuchs S.Y.Pathogen recognition receptor signaling acceleratesphosphorylation-dependent degradation of IFNAR1.PLoS Pathog.2011年6月；7(6)：e1002065.doi：10.1371/journal.ppat.1002065.电子出版于2011年6月9日；2008年6月15日；197(1)：54-62)。

生物体的慢性中毒(例如，吸烟)导致呼吸道细胞中干扰素受体的密度降低，由此导致吸烟者中病毒性疾病的发生率提高，并且可能导致肺癌的风险(Huang Fu W.C.，LiuJ.，Harty R.N.，Fuchs S.Y.Cigarette smoking products suppress anti-viraleffects of Type I interferon via phosphorylation-dependent downregulation ofits receptor.FEBS Lett.2008年9月22日；582(21-22)：3206-10；Picaud S，Bardot B，DeMaeyer E，Seif I.Enhanced tumor development in mice lacking a functional typeI interferon receptor.J Interferon Cytokine Res.2002年4月；22(4)：457-62)。

目前，用重组(外源性)干扰素药物来治疗伴随有干扰素系统抑制的疾病。在此情况下，用高剂量的药物来补偿受损细胞对外源性干扰素的降低的敏感性。这导致由干扰素治疗引起的毒性作用，特别是伴随着抑郁综合征的发生(Patten S.B.Psychiatric sideeffects of interferon treatment.Curr Drug Saf.2006年5月；1(2)：143-50.Review.PubMed PMID：18690925)。对该治疗的抗性主要由干扰素受体的表达降低决定。例如，在多发性硬化中观察到的干扰素受体IFNAR1亚基mRNA的合成水平降低导致用干扰素β进行治疗的效力降低(Serana F.，Sottini A.，Ghidini C.，Zanotti C.，Capra R.，Cordioli C.，Caimi L.，Imberti L.Modulation of IFNAR1 mRNA expression inmultiple sclerosis patients.J Neuroimmunol.2008年6月15日；197(1)：54-62)。

在慢性病毒性疾病的干扰素治疗中观察到相同的情况。损失一定量干扰素受体的被病毒感染细胞变得对干扰素治疗不敏感。例如，用干扰素α在乙型肝炎中进行治疗的效果通常较为短暂，并且该疾病转到恶化阶段，伴随着人血液中病毒基因组拷贝的升高。这意味着生物体中的一部分被病毒感染细胞未对干扰素治疗作出应答。为此，干扰素药物无法治愈由多种疱疹病毒引起的慢性感染(Kroeker A.L.，Coombs K.M.Systems biologyunravels interferon responses to respiratory virus infections.World J BiolChem.2014年2月26日；5(1)：12-25.doi：10.4331/wjbc.v5.i1.12.Review.PubMed PMID：24600511；PubMed Central PMCID：PMC3942539)；(Eron L.J.，Toy C.，Salsitz B.，ScheerR.R.，Wood D.L.，Nadler P.I.Therapy of genital herpes with topically appliedinterferon.Antimicrob Agents Chemother.1987年7月；31(7)：1137-9.PubMed PMID：3310870；PubMed Central PMCID：PMC174885)。

本发明人已意外地发现：用于治疗伴随有细胞对干扰素敏感性降低之疾病的有效方法是涉及提高细胞表面上干扰素受体密度的治疗。在此情况下，细胞对内源性干扰素信号的增敏可产生治疗效果而无需使用重组干扰素的制剂，或者可提供其治疗剂量的降低。

目前，就其降解而言，没有药剂能够在多种病理状况下恢复或提高干扰素受体的密度。本发明人已意外地发现，戊二酸单酰组胺导致干扰素受体之信使RNA合成提高和细胞表面上受体自身的密度提高。因此，戊二酸单酰组胺能够恢复和/或提高细胞表面上干扰素受体的密度，这使得该药剂有希望用于预防或治疗多种疾病。由于细胞表面上干扰素受体的密度升高，因此这一药剂可用作病毒性疾病的单药治疗以实现细胞对低水平内源性干扰素之敏感性提高的效果。另外，戊二酸单酰组胺可与干扰素药物一起用于综合治疗以提高被免疫抑制细胞对外源性干扰素的应答。

发明内容

本发明人已在实验中表明，戊二酸单酰组胺可用于预防和治疗与干扰素受体的密度降低相关之疾病。所述疾病特别地是乙型肝炎、疱疹、乳头瘤病毒感染和多发性硬化。在戊二酸单酰组胺的施用中，由于细胞表面上干扰素受体的密度升高，细胞对内源性干扰素作用的敏感性得以增强，从而克服病毒引起的免疫抑制并且提供对病毒感染的治疗效果，所述病毒感染例如1至8型疱疹、乙型肝炎、乳头瘤病毒感染和多发性硬化。另外，在上述疾病中，对干扰素治疗的抗性也得以克服。

已经确定，戊二酸单酰组胺的治疗效果不会伴随有毒性反应和其他副作用。另外，为低分子量物质的戊二酸单酰组胺不会导致中和性抗体的形成。

鉴于上述内容，本发明涉及用于预防和/或治疗与干扰素受体密度提高相关的疾病的药剂，其中所述药剂是下式的戊二酸单酰组胺：

本发明还涉及用于预防或治疗与干扰素受体密度降低相关之疾病的方法，所述方法包括施用有效量的戊二酸单酰组胺或其可药用盐。

上述疾病的预防包括预防所述疾病的复发或恶化。

此外，本发明涉及用于预防或治疗与干扰素受体密度降低相关之疾病的药物组合物，其中所述组合物包含有效量的戊二酸单酰组胺或其可药用盐。

另外，本发明涉及用于预防或治疗与干扰素受体密度降低相关之疾病的药盒，其中所述药盒包含上述组合物及其使用说明。

此外，本发明涉及戊二酸单酰组胺或其可药用盐用于预防或治疗与干扰素受体密度降低相关之疾病的用途。

另外，本发明涉及戊二酸单酰组胺或其可药用盐在制备用于预防或治疗与干扰素受体密度降低相关之疾病的药物组合物中的用途。

所述疾病优选地可选自包含以下的组：乙型肝炎、疱疹(特别是由1、2、3、4、5、6、7或8型疱疹病毒引起的疱疹)、乳头瘤病毒感染和多发性硬化。

上述预防或治疗基于在用干扰素进行长期治疗期间补偿降低的干扰素受体表达水平。所述预防或治疗可通过在疾病中克服对干扰素治疗的抗性进行，所述疾病选自包含以下的组：乙型肝炎、疱疹、乳头瘤病毒感染和多发性硬化。

在一个具体实施方案中，所述预防和治疗通过在通过用干扰素β进行治疗的多发性硬化中提高干扰素受体的密度来进行。另外，本发明涉及在吸烟者中预防吸烟引起的与干扰素受体降解相关的免疫抑制，其中所述治疗可涉及在吸烟者中克服对干扰素治疗的抗性。根据本发明的干扰素受体是干扰素α(IFNα)和干扰素β(IFNβ)受体。

优选地以固体剂型施用戊二酸单酰组胺。

当每天施用一次或更多次时，可将戊二酸单酰组胺或其盐以每天0.1至100mg/kg人体重的剂量、优选以0.1至30mg/kg的剂量、更优选以0.3至10mg/kg的剂量施用于患者。戊二酸单酰组胺的单剂量可以是约100mg。施用戊二酸单酰组胺的持续时间可以是5天至12个月。

根据本发明的戊二酸单酰组胺的可药用盐可以是其与碱金属或碱土金属的盐，优选钠盐、钾盐和锂盐。

以有效量施用戊二酸单酰组胺或其盐以提供期望的治疗结果。

应指出，对于特定患者的具体剂量取决于很多因素，例如患者的年龄、体重、性别、总体健康状况和饮食；药剂的施用方案和途径，其从身体排泄的速率；以及接受治疗之个体中疾病的严重程度。

本发明的药物组合物包含期望结果所需的有效量的戊二酸单酰组胺或其可药用盐，并且可作为单位剂型(例如，以固体、半固体或液体形式)制备，所述单位剂型包含在与适于肌内、静脉内、经口、舌下、吸入、鼻内、直肠内和经皮施用的载体或赋形剂的混合物中的作为活性剂的戊二酸单酰组胺或其盐。所述活性剂可与适于制备以下剂型的常规无毒可药用载体一起包含在组合物中：溶液剂、片剂、丸剂、胶囊剂、糖衣丸剂、栓剂、乳剂、混悬剂、软膏剂、凝胶剂、贴剂以及任何其他剂型。

赋形剂可以是多种物质，例如糖类，例如葡萄糖、乳糖或蔗糖；甘露醇或山梨糖醇；纤维素衍生物；和/或磷酸钙类，例如磷酸三钙或磷酸氢钙。用作黏合剂的化合物包括淀粉糊(例如，玉米、小麦、水稻或马铃薯淀粉)、明胶、西黄蓍胶、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羧甲基纤维素钠和/或聚乙烯吡咯烷酮。如有必要的话，可使用崩解剂，并且其可包括前述淀粉和羧甲基淀粉、交联聚乙烯吡咯烷酮、琼脂或者藻酸或其盐(例如藻酸钠)。

可任选地使用的添加剂为流动性控制剂和润滑剂，例如二氧化硅、滑石、硬脂酸及其盐(例如硬脂酸镁或硬脂酸钙)和/或丙二醇。

还可使用稳定剂、增稠剂、着色剂和芳香剂作为添加剂。

作为软膏剂基质，存在合适的烃软膏剂基质，例如白凡士林和黄凡士林(分别为Vaselinum album和Vaselinum flavum)、凡士林油(Oleum Vaselini)以及白软膏和液体软膏(分别为Unguentum album和Unguentum flavum)，其中可使用固体石蜡或蜡作为提供较坚硬质地的添加剂；吸收性软膏剂基质，例如亲水性凡士林(Vaselinum hydrophylicum)、羊毛脂(Lanolinum)和冷霜剂(Unguentum lenien)；水可去除性软膏剂基质，例如亲水性软膏(Unguentum hydrophylum)；水溶性软膏剂基质，例如聚乙二醇软膏(UnguentumGlycolis Polyaethyleni)；膨润土基质；等。

用于凝胶剂的基质可选自甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、氧基丙基纤维素、聚乙二醇或聚环氧乙烷和卡波普。

用于栓剂的基质可以是水不溶性基质，例如可可豆脂；水溶性或水混溶性基质，例如明胶-甘油或聚环氧乙烷；或组合基质，例如皂-甘油基质。

与载体组合使用的活性剂的量在制备单位剂型的过程中可不同，这取决于进行治疗的接受者和治疗剂的具体施用途径。

例如，当以注射用溶液剂的形式使用戊二酸单酰组胺或其盐时，其中的活性剂的量为0.1％至5％。稀释剂可选自0.9％氯化钠溶液、蒸馏水、注射用奴佛卡因溶液、林格液、葡萄糖溶液和特定的增溶助剂。当以片剂或栓剂形式施用戊二酸单酰组胺或其盐时，其量为每单位剂型10至300mg。

本发明的剂型通过常规操作制备，例如共混、制粒、形成丸剂、溶解和冻干。

应指出，以治疗剂量或比治疗剂量大一个数量级的剂量长期施用戊二酸单酰组胺或其盐未显示出不良的副作用。

附图说明

图1是示出了在戊二酸单酰组胺的作用下上皮细胞A549中干扰素受体亚基之mRNA的合成提高的图。

图2是示出了在戊二酸单酰组胺的作用下人巨噬细胞原代培养物的表面上干扰素受体亚基的蛋白量提高的图。

图3是展示经戊二酸单酰组胺处理的细胞对低浓度干扰素的增敏作用的免疫印迹照片。

具体实施方式

下面通过实施例对本发明进行更详细的描述，所述实施例支持戊二酸单酰组胺用于预防和治疗根据本发明的疾病的效力，其中所公开的实施例并非旨在限制本发明的范围。

实施例1

在戊二酸单酰组胺的作用下干扰素受体的mRNA合成水平

用100ng/mL浓度的戊二酸单酰组胺处理连续细胞系A-549。在处理后16小时，通过实时PCR分析确定干扰素受体的信使RNA拷贝的量。通过使用Rneasy试剂盒(Quiagen)分离RNA。用DNA酶(不含RNA酶的DNA酶I(Ambion))处理RNA制备物。通过使用Thermoscript RT-PCR系统(Invitrogen)进行逆转录。用以下引物进行定量PCR：

Ifnar1(正向)5′CACTGACTGTATATTGTGTGAAAGCCAGAG 3′，

(反向)5′CATCTATACTGGAAGAAGGTTTAAGTGATG 3′；

Ifnar2(正向)5′ATTTCCGGTCCATCTTATCAT 3′，

(反向)5′ACTGAACAACGTTGTGTTCC 3′。

结果。从图中可见(参见图1)，用戊二酸单酰组胺处理细胞至少导致I型干扰素受体之亚基IFNAR1的mRNA合成提高两倍并且亚基IFNAR2的mRNA量提高3倍。

实施例2

戊二酸单酰组胺对原代人巨噬细胞表面上干扰素受体密度的作用

将人巨噬细胞在96孔板中的10天原代培养物在以下浓度的戊二酸单酰组胺存在下或者在无戊二酸单酰组胺下孵育24小时：0.1、1.0、10或100ng/mL。然后，用多聚甲醛溶液固定细胞(无透化)，将固定的细胞用含洗涤剂的缓冲溶液(PBS-Tween)洗掉，用牛血清白蛋白的溶液封闭并与针对干扰素受体亚基IFNAR1或IFNAR2的抗体一起孵育。如下使制备物可视化：用经辣根过氧化物酶标记的二抗染色，并添加底物。使用ELISA分光光度计测量光密度。

由该实施例可知(参见图2)，用戊二酸单酰组胺处理巨噬细胞提高细胞表面上干扰素受体的两条链的密度，这反映在用IFNAR2和IFNAR1特异性抗体染色的信号水平显著提高。

实施例3

戊二酸单酰组胺对针对干扰素之细胞敏感性的作用

在其信号传导受到病毒感染抑制的情况下，细胞表面上干扰素受体的密度提高必定导致细胞对弱内源性干扰素信号的敏感性提高。为了证明细胞对干扰素信号的增敏作用，将A-549细胞用100ng/mL浓度的戊二酸单酰组胺处理并孵育8或24小时，之后在存在或不存在1 IU干扰素-α(IFNα：Roche Molecular Biochemicals，Mannheim)的情况下对细胞进行裂解。通过利用使用底物(化学发光试剂Super Signal West Femto化学发光底物(Thermo Fisher Scientific))的化学发光方法通过使用针对MxA蛋白(sc-50509，Santa Cruz Biotechnology)的单克隆抗体染色膜来对细胞裂解物进行免疫印迹分析(western印迹)的操作。选择MxA蛋白作为指示产物，其指示用干扰素处理细胞后干扰素刺激的基因(ISG)的表达。

通过该实施例可见(参见图3)，在未经干扰素处理的细胞中，戊二酸单酰组胺并未引起抗病毒MxA蛋白的累积(第1、2和3行)。在1 IU的低浓度下，干扰素也未引起MxA蛋白的合成(第4行)。同时，经戊二酸单酰组胺和干扰素两者处理的细胞在孵育后8小时(第5行)和开始处理细胞后24小时(第6行)就已表现出MxA蛋白合成的提高。因此，用戊二酸单酰组胺处理细胞导致干扰素信号传导提高，并且因此导致抗病毒效应分子生物合成的提高。

实施例4

戊二酸单酰组胺在疱疹脑膜脑炎的鼠模型中的治疗效力

用单纯疱疹病毒HSV-1/CL和HSV-2/VN以30μl的剂量大脑内感染小鼠，所述剂量包括10 LD₅₀。

如下研究戊二酸单酰组胺的治疗作用：在用病毒进行感染后24、48、72、96和120小时，以30mg/kg的剂量向受感染的小鼠每日一次地经口施用200μl的所述药物。在相同条件下，向对照组的小鼠施用安慰剂(200ml生理溶液)。在感染后，监测动物14天，并登记处理组和对照组中小鼠之中由于疱疹脑膜脑炎的致死病例。通过相对于对照组动物对经戊二酸单酰组胺处理动物的死亡率进行来评价该药物的活性。将经处理动物相对于对照的死亡率降低以百分比表示。

经处理、对照(未经戊二酸单酰组胺处理的受感染小鼠)和完好(阴性对照)小鼠的死亡保护和预期寿命的指数提供于表1中。

用戊二酸单酰组胺处理HSV-1/CL病毒感染显示死亡率发生统计学上显著的降低(p＝0.02)(从95％下降至65％)并且平均预期寿命提高(从4.8天上升至8.1天)。类似地，用戊二酸单酰组胺处理经HSV-2/VN感染的小鼠导致死亡率发生统计学上显著的降低(p＝0.008)(从85％下降至45％)并且平均预期寿命提高(从6.1天上升至10.2天)。统计学显著性通过对数秩Mantel-Cox检验进行评估。因此，已表明戊二酸单酰组胺在小鼠中疱疹感染的处理方面具有治疗有效性。

＊P＝0.02

＊＊P＝0.008

实施例5

戊二酸单酰组胺剂型的制备

通过标准方法制备根据本发明使用的戊二酸单酰组胺的剂型，所述方法例如混合、制粒、形成丸剂、溶解和冻干的过程。

片剂形式

通过使用以下成分制备片剂形式：

戊二酸单酰组胺或其可药用盐	1至100mg
		马铃薯淀粉	20至50mg
硬脂酸镁	3mg
		微粉硅胶	1mg
乳糖	高至300mg

将所述成分混合并压制以形成重量为300mg的片剂。

明胶胶囊剂

将上述成分混合并制粒，将所得颗粒以220mg的量置于固体明胶胶囊中。

栓剂

栓剂配方的实例

戊二酸单酰组胺或其可药用盐	1至100mg
		可可豆脂	栓剂所需的量

直肠、阴道和尿道栓剂可任选地用相应的赋形剂制备。

注射用溶液剂

注射用溶液剂配方的实例

戊二酸单酰组胺或其可药用盐	1至100mg
		注射用水	2ml

注射用溶液剂可通过使用0.9％氯化钠溶液、蒸馏水或奴佛卡因溶液作为稀释剂来制备。产品形式是安瓿、瓶、注射器-管和“插入物”。

Claims (7)

1.有效量的戊二酸单酰组胺或其可药用盐在制备用于在治疗与干扰素受体密度降低相关之疾病时提高干扰素受体的密度的药物的用途，其中所述干扰素受体是干扰素α(IFNα)和/或干扰素β(IFNβ)受体，其中所述疾病选自：乙型肝炎、疱疹、乳头瘤病毒感染、多发性硬化和在吸烟者中吸烟引起的与干扰素受体降解相关的免疫抑制。

2.权利要求1所述的用途，其中所述干扰素受体的密度的提高在用干扰素进行的长期治疗中克服对使用干扰素之治疗的抗性和/或补偿降低的干扰素受体表达水平。

3.权利要求1所述的用途，其中待以固体剂型施用戊二酸单酰组胺，并且所述施用的持续时间为5天至12个月。

4.权利要求1至3中任一项所述的用途，其中当每天施用一次或更多次时，所述药物中的戊二酸单酰组胺或其可药用盐的剂量为每天0.1至100mg/kg人体重。

5.权利要求4所述的用途，其中当每天施用一次或更多次时，所述药物中的戊二酸单酰组胺或其可药用盐的剂量为每天0.1至30mg/kg人体重。

6.权利要求5所述的用途，其中当每天施用一次或更多次时，所述药物中的戊二酸单酰组胺或其可药用盐的剂量为0.3至10mg/kg人体重。

7.权利要求1至3中任一项所述的用途，其中所述药物中的戊二酸单酰组胺的单剂量为100mg。