HK1221963B

HK1221963B - 多肽异源多聚体的制备方法

Info

Publication number: HK1221963B
Application number: HK16110177.6A
Authority: HK
Inventors: 井川智之; 坚田仁; 味元风太
Original assignee: Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha
Priority date: 2013-09-27
Filing date: 2014-09-26
Publication date: 2021-02-26

Description

多肽异源多聚体的制备方法

技术领域

本发明涉及多肽异源多聚体的制备方法和改变Fc区的氨基酸以使多肽的异源化得以促进的多肽异源多聚体等。

背景技术

抗体在血液中的稳定性高、副作用也少，因而作为药物受到关注(非专利文献1、非专利文献2)。其中，有能够同时识别2种的抗原或表位的双特异性抗体，它们被期待具有较高的靶特异性、同时抑制多个途径的功能(非专利文献3)。例如，已经上市的卡妥索单抗(catumaxomab)为与上皮细胞粘附因子EpCAM和T细胞上表达的CD3结合的双特异性抗体，被用作恶性腹水的治疗药。

对于IgG型双特异性抗体的制备，虽然获得目标双特异性抗体的效率低或从纯化的难易程度考虑难度高，但涉及有效生产的知识有一些报道(非专利文献3)。例如，将具有2种可变区的构成IgG的H链和L链的基因、总计4种基因导入细胞，通过共表达而分泌时，随机地引起2种H链的共价键或H链与L链的非共价键，因此目标双特异性抗体的比率变得极少、生产效率显著降低。作为解决该课题的方法，报道了：通过对IgG H链的CH3区实施氨基酸取代，可以优先地分泌具有异源组合的H链的IgG(专利文献1和非专利文献4和5)。该方法是：通过将存在于一方H链的CH3区的氨基酸侧链取代为更大的侧链(knob; 突起)、将存在于另一方H链的CH3区的氨基酸侧链取代为更小的侧链(hole; 空隙)，使突起配置在空隙内，引起异源H链形成的促进和同源H链形成的抑制的方法。而且，还报道了向各IgG H链的CH3区导入不同电荷的方法(专利文献2)。具体而言，为下述的方法：通过将存在于一方的H链的CH3区的氨基酸取代为带有正电荷的氨基酸，将存在于另一方的H链的CH3区的氨基酸取代为带有负电荷的氨基酸，而引起异源H链形成的促进和同源H链形成的抑制。另一方面，还报道了控制H链与L链的组合的技术(非专利文献6)。本方法是下述的方法：作为抗体的一方的Fab，通过使用将L链恒定区(CL)和H链CH1区进行了替换的Fab，可以有效引起目标的H链与L链的组合。此外，还存在两方的Fab使用共同L链的方法。这是由于通过使用共同L链，将导入细胞的L链基因作为1种，不需要考虑H链与L链的组合而获得双特异性抗体的缘故。现在，通过将异源H链形成技术、H链L链组合控制技术进行组合，可以以较高的效率形成双特异性抗体。但是，难以完全控制H链与L链的组合，成为复杂的分子设计。而且，就以共同L链对于2种抗原维持高的亲和性而言，还存在难度高的问题。

另一方面，代替上述的基因重组法，作为使用预先分别调制的单克隆抗体同伴制作双特异性抗体的方法，报道了被称为Fab臂交换的方法。该方法是基于在体内IgG4的半分子与内因性IgG4的半分子发生交换生成双特异性抗体(Bispecific Antidoby；BiAb)的知识(非专利文献7)而开发的技术，通过在体外将2种天然型人IgG4混合，产生双特异性抗体(专利文献3)，并且，报道了在还原条件下更有效地引起反应(非专利文献8)。而且，发现了：IgG4特征性的铰链区的228位和CH3区的409位的2位点被特定为是对该反应重要的氨基酸残基，即使为IgG1，通过将该2位点取代为IgG4型的氨基酸，也以与IgG4同等的效率引起反应(专利文献4)。Fab臂交换仅通过将利用一般方法制作的单克隆抗体同伴在体外混合即可获得目标双特异性抗体，因此泛用性高。但是，由于半分子交换反应随机地引起，因此将2种抗体混合而获得的双特异性抗体，理论上为存在于体系内的所有抗体量的50%。因此，报道了：研究改善双特异性抗体生成率的方法，通过对2种抗体导入非对称的氨基酸改变、即对一方H链导入K409R改变和对另一方H链导入F405L改变，可以大大提高反应效率，但反应效率仍保持在95%左右(专利文献5、非专利文献9)。在双特异性抗体的有效且稳定的制备中，必然要求纯化的便利性或尽可能降低批次之间的不均一性，因此希望开发实现更高反应效率的优异方法。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：WO1996/027011

专利文献2：WO2006/106905

专利文献3：WO2005/062916

专利文献4：WO2008/119353

专利文献5：WO2011/131746

非专利文献

非专利文献1：Nat Biotechnol., 23, 1073-1078, 2005

非专利文献2：Eur J Pharm Biopharm, 59(3), 389-396, 2005

非专利文献3：mAbs, 4, 653-663, 2012

非专利文献4：Protein Engineering, 9, 617-621, 1996

非专利文献5：Nature Biotechnol., 16, 677-681, 1998

非专利文献6：Proc. Natl. Acad. Sci., 108, 11187-11192, 2011

非专利文献7：Immunology, 97, 693-698, 1999

非专利文献8：Science, 317, 1554-1557, 2007

非专利文献9：Proc. Natl. Acad. Sci., 110, 5145-5150, 2013。

发明内容

发明所要解决的课题

本发明基于上述的状况而完成，其目的在于提供：为了有效且稳定地制备异源多聚体，在还原条件下促进多肽的异源化获得所希望的异源多聚体的反应效率更高的优异方法。

用于解决课题的手段

本发明人选择具有Fc区的多肽作为供于异源多聚体的多肽，对控制Fc区的解离和缔合的方法进行了深入研究。其结果，发现了：通过取代存在于重链CH3区的特定的氨基酸，可在还原条件下促进Fc区的解离和控制缔合，与现有技术比较，可高效形成所希望的异源分子。

本发明基于这样的知识而完成，具体而言，提供以下[1]～[25]。

[1] 用于制备异源多聚体的方法，该方法包括以下步骤：

a) 提供具有第1抗原结合活性、且包含Fc区的第1多肽的同聚体的步骤；

b) 提供具有与该第1抗原结合活性不同的第2抗原结合活性、且包含Fc区的第2多肽的同聚体的步骤；

c) 在可使铰链区内的半胱氨酸引起二硫键异构化的还原条件下，将该第1多肽的同聚体和该第2多肽的同聚体一起温育的步骤；以及

d) 获得包含第1和第2多肽的异源多聚体的步骤，

在上述第1和/或第2多肽的Fc区所含的CH3区中，选自下述(1)～(3)所示的氨基酸残基组的1组～3组的氨基酸残基带有同种电荷，

(1) 以EU编号表示的356位和439位的氨基酸残基；

(2) 以EU编号表示的357位和370位的氨基酸残基；

(3) 以EU编号表示的399位和409位的氨基酸残基，

在上述第1多肽的CH3区和上述第2多肽的CH3区的两方中，上述(1)～(3)所示的氨基酸残基组之中相同组的氨基酸残基分别带有同种电荷时，上述第2多肽的CH3区中的该组的氨基酸残基与上述第1多肽的CH3区中的该组的氨基酸残基带有相反电荷。

[2] [1]所述的制备方法，其中，在[1]的步骤a)中，包含提供与第1多肽形成多聚体的第3多肽的步骤，且在步骤b)中，包含提供与第2多肽形成多聚体的第4多肽的步骤。

[3] [1]或[2]所述的制备方法，其中，上述带有同种电荷的氨基酸残基为选自以下的(A)或(B)中任一组所含的1个以上的氨基酸残基：

(A) 谷氨酸(E)、天冬氨酸(D)；

(B) 赖氨酸(K)、精氨酸(R)、组氨酸(H)。

[4] [1]～[3]中任一项所述的制备方法，其中，第1和第2多肽中分别带有同种电荷的氨基酸残基组为以下的(1)～(4)的任意1组的氨基酸残基组：

(1) 以EU编号表示的356位和439位的氨基酸残基；

(2) 以EU编号表示的357位和370位的氨基酸残基；

(3) 以EU编号表示的399位和409位的氨基酸残基；

(4) (i) 以EU编号表示的399位和409位的氨基酸残基；以及

(ii) 以EU编号表示的356位和439位的氨基酸残基。

[5] [1]～[4]中任一项所述的制备方法，其中，第1和第2多肽中分别带有同种电荷的氨基酸残基组为以下的组的氨基酸残基组：

(i) 以EU编号表示的399位和409位的氨基酸残基；以及

(ii) 以EU编号表示的356位和439位的氨基酸残基。

[6] [1]～[5]中任一项所述的制备方法，其中，第1和/或第2多肽中，改变氨基酸以使第1和/或第2多肽的CH3区的稳定性变为不稳定。

[7] [1]～[6]中任一项所述的制备方法，其中，第1和/或第2多肽中，改变以EU编号表示的397位和/或392位的氨基酸。

[8] [1]～[7]中任一项所述的制备方法，其中，第1和/或第2多肽的Fc区为IgG1、IgG2、IgG3或IgG4型。

[9] [1]～[7]中任一项所述的制备方法，其中，第1和/或第2多肽的Fc区为来自小鼠的Fc区。

[10] [9]所述的用于制备异源多聚体的方法，在上述第1和/或第2多肽的Fc区所含的CH3区中，选自下述(1)～(3)所示的氨基酸残基组的1组～3组的氨基酸残基带有同种电荷，

(1) 以EU编号表示的356位和439位的氨基酸残基；

(2) 以EU编号表示的360位和371位的氨基酸残基；

(3) 以EU编号表示的399位和409位的氨基酸残基，

[11] 用于制备异源多聚体的方法，该方法包括下述的步骤：

d) 获得包含第1和第2多肽的异源多聚体的步骤，

改变上述第1和/或第2多肽的Fc区所含的CH3区中的以EU编号表示的397位和/或392位的氨基酸。

[12] [1]～[11]中任一项所述的制备方法，其中，第1和/或第2多肽中，使以EU编号表示的397位改变为Met(M)、Phe(F)或Tyr(Y)；且/或

使以EU编号表示的392位改变为Asp(D)、Glu(E)、Thr(T)、Val(V)或Ile(I)。

[13] [1]～[12]中任一项所述的制备方法，其中，第1和/或第2多肽中，使以EU编号表示的397位改变为Phe(F)或Tyr(Y)。

[14] [1]～[13]中任一项所述的制备方法，其中，第1多肽中，使以EU编号表示的356位改变为Lys(K)且使以EU编号表示的397位改变为Phe(F)或Tyr(Y)；第2多肽中，使以EU编号表示的397位改变为Phe(F)或Tyr(Y)且使以EU编号表示的439位改变为Glu(E)。

[15] [1]～[14]中任一项所述的制备方法，其中，上述步骤a)和b)通过将产生第1多肽的同聚体的细胞株和产生第2多肽的同聚体的细胞株混合来实施，上述步骤c)在该培养上清中实施。

[16] [1]～[15]中任一项所述的制备方法，其中，上述异源多聚体为多特异性抗体或异源Fc融合蛋白。

[17] [1]～[16]中任一项所述的制备方法，其中，上述异源多聚体为双特异性抗体。

[18] [1]～[17]中任一项所述的制备方法，其中，[1]或[11]所述的步骤c)包含与还原剂的接触。

[19] [18]所述的制备方法，其中，步骤c)包含添加选自谷胱甘肽、L-半胱氨酸、二硫苏糖醇、β-巯基乙醇、TCEP和2-MEA的作用物质。

[20] [19]所述的制备方法，其中，步骤c)包含添加选自谷胱甘肽、2-MEA的作用物质。

[21] 异源多聚体，该异源多聚体是通过[1]～[20]中任一项所述的方法制备的。

[22] [21]所述的异源多聚体，该异源多聚体为双特异性抗体。

[23] 组合物，该组合物包含[21]或[22]所述的异源多聚体和药学上可接受的载体。

[24] 异源多聚体，该异源多聚体包括：具有第1抗原结合活性且包含第1 Fc区的第1多肽，以及具有与该第1抗原结合活性不同的第2抗原结合活性且包含第2 Fc区的第2多肽，

通过在可使铰链区内的半胱氨酸引起二硫键异构化的还原条件下，将该第1多肽的同聚体和该第2多肽的同聚体一起温育，获得该异源多聚体，

(1) 以EU编号表示的356位和439位的氨基酸残基；

(2) 以EU编号表示的357位和370位的氨基酸残基；

(3) 以EU编号表示的399位和409位的氨基酸残基，

在上述第1多肽的CH3区和上述第2多肽的CH3区的两方中，上述(1)～(3)所示的氨基酸残基组之中相同组的氨基酸残基分别带有同种电荷时，上述第2多肽的CH3区中的该组的氨基酸残基与上述第1多肽的CH3区中的该组的氨基酸残基带有相反电荷，

上述第1和/或第2多肽中，改变氨基酸以使上述第1和/或第2多肽的CH3区的稳定性变为不稳定。

[25] 异源多聚体，该异源多聚体是通过包括下述步骤的方法制备的：

d) 获得包含第1和第2多肽的异源多聚体的步骤，

(1) 以EU编号表示的356位和439位的氨基酸残基；

(2) 以EU编号表示的357位和370位的氨基酸残基；

(3) 以EU编号表示的399位和409位的氨基酸残基，

发明效果

在本发明中提供了下述的制备方法：通过取代存在于重链CH3区的特定的氨基酸，可在还原条件下促进Fc区的解离和控制Fc区的缔合，与现有技术比较，可高效形成所希望的异源分子。

通过利用本发明的方法，与现有技术比较，能够提高双特异性抗体纯化时的便利性、尽可能降低批次之间的不均一性。

本发明的异源多聚体的制备方法以改变重链CH3区的氨基酸残基为特征。通过向这些区导入本发明的氨基酸残基的改变，多肽间的解离和缔合得以促进，与现有技术比较，可以高效获得所希望的异源多聚体。

附图简述

[图1] 是显示通过离子交换层析进行的Fab臂交换反应产物的分析结果的图。图中的“BiAb”显示所纯化的双特异性抗体(双重特异性抗体)、“H54 homo”显示具有H54/L28可变区的单克隆抗体、“MRA homo”显示具有MRAH/MRAL可变区的单克隆抗体。图中以百分率表示的数值显示双特异性抗体生成率，是用对应于双特异性抗体的峰面积除以存在于体系中的所有抗体的面积、再乘以100而算出的值。

[图2] 是显示通过离子交换层析进行的Fab臂交换反应产物的分析结果的图。是显示使用MRAH-G1drP1/MRAL-k0和H54-G1drN1/L28-k0作为同聚体、在3种还原条件下进行反应的结果的图。图中以百分率表示的数值显示双特异性抗体生成率，是用对应于双特异性抗体的峰面积除以存在于体系中的所有抗体的面积、再乘以100而算出的值。

[图3] 是显示使用5mM GSH作为还原剂时的Fab臂交换中的双特异性抗体生成率与所用同聚体的CH3的稳定性的相互关系的图。图中的“二种同聚体中CH3的Tm的较高者的值”是指，用于反应的二个同聚体中CH3的Tm高、即CH3更稳定的同聚体的CH3的Tm。

[图4] 是指显示人IgG1的V397周边的立体结构(PDB码 3DO3)的图。

[图5] 是指使用25mM 2MEA作为还原剂时的Fab臂交换中的双特异性抗体生成率与所用同聚体的CH3的稳定性的相互关系的图。图中的“二种同聚体中CH3的Tm较高者的值”是指，用于反应的二个同聚体中CH3的Tm高、即CH3更稳定的同聚体的CH3的Tm。

[图6] 是指通过离子交换层析进行的Fab臂交换反应产物的分析结果的图。是显示使用MRAH-G1dP17/MRAL-k0和H54-G1dN17/L28-k0作为同聚体、以不同的反应时间进行反应的结果的图。图中以百分率表示的数值显示双特异性抗体生成率，是用对应于双特异性抗体的峰面积除以存在于体系中的所有抗体的面积、再乘以100而算出的值。

[图7] 是指通过离子交换层析进行的Fab臂交换反应产物的分析结果的图。是显示使用MRAH-G1mrP1/MRAL-k0和H54-G1mrN1/L28-k0作为同聚体、在细胞培养上清中进行反应的结果的图。图中以百分率表示的数值显示双特异性抗体生成率，是用对应于双特异性抗体的峰面积除以存在于体系中的所有抗体的面积、再乘以100而算出的值。

[图8] 是显示小鼠IgG1的CH3结构域的相互作用界面周边的立体结构的图(PDB码1IGY)。

[图9] 是显示通过CE-IEF进行的小鼠IgG型Fab臂交换反应产物的分析结果的图。图中以百分率表示的数值显示双特异性抗体生成率，是用对应于双特异性抗体的峰面积除以存在于体系中的所有抗体的面积、再乘以100而算出的值。

[图10] 是将抗人磷脂酰肌醇蛋白聚糖3/抗人CD3双特异性抗体的细胞毒活性进行比较的图。图10-1和图10-2是分别将使用人IgG型Fab臂交换制作的双特异性抗体、使用小鼠IgG型Fab臂交换制作的双特异性抗体与利用CrossMab技术制作的双特异性抗体进行比较的图。

[图11] 是显示利用人IgG型Fab臂交换制作的抗人磷脂酰肌醇蛋白聚糖3/抗人CD3双特异性抗体和利用Knobs-into-Holes技术制作的双特异性抗体在正常小鼠中的血中浓度变化的图。

[图12] 是显示利用小鼠IgG型Fab臂交换制作的抗人IL-6受体抗体和具有天然型小鼠IgG1序列的抗人IL-6受体抗体的血中浓度变化的图。

具体实施方式

本发明涉及：通过改变重链CH3区的氨基酸残基，以在还原条件下促进具有第1抗原结合活性的多肽和具有与该第1抗原结合活性不同的第2抗原结合活性的多肽的各同聚体的解离、控制异聚体的缔合，来制备所希望的异源多聚体的方法。并且，本发明涉及选择所希望的异源多聚体的方法。

术语的定义

本发明中的“多肽”是指，在氨基酸序列中包含重链Fc区的多肽(含有Fc区的多肽)和蛋白(含有Fc区的蛋白)。而且，通常为来自生物的多肽，但没有特别限定，例如，可以是由人工设计的序列组成的多肽。而且，可以是天然多肽、或合成多肽、重组多肽等的任一种。并且，上述多肽的片段也包含在本发明的多肽中。

本说明书中，“抗体”是指天然的免疫球蛋白或者通过部分或完全合成制备得到的免疫球蛋白。抗体可从天然存在其的血浆或血清等天然资源或产生抗体的杂交瘤细胞的培养上清中分离得到，或者通过使用基因重组等方法而部分或完全合成。作为抗体的例子，可以优选举出：免疫球蛋白的同种型和这些同种型的亚类。作为人的免疫球蛋白，已知有IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2、IgD、IgE、IgM这9种类型(同种型)。作为小鼠的免疫球蛋白，已知有IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3这4种类型。本发明的抗体中，作为这些同种型中的人免疫球蛋白可以包含IgG1、IgG2、IgG3、IgG4，作为小鼠免疫球蛋白可以包含IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3。作为小鼠免疫球蛋白优选IgG1。作为人IgG1、人IgG2、人IgG3、人IgG4恒定区，基因多态性所致的多个的同种异型序列记载于Sequences of proteins ofimmunological interest, NIH Publication No.91-3242中，本发明可以是其中的任一个序列。特别是作为人IgG1的序列，以EU编号表示的356-358位的氨基酸序列可以是DEL也可以是EEM。而且，作为人Igκ(Kappa)恒定区和人Igλ(Lambda)恒定区，基因多态性所致的多个的同种异型序列记载于Sequences of proteins of immunological interest, NIHPublication No.91-3242中，本发明可以是其中的任一个序列。

“Fc区”的术语包含天然序列Fc区和变异型Fc区、用于定义免疫球蛋白重链的C末端区而使用。虽然免疫球蛋白重链的Fc区的边界是否发生变化仍属未知，但该Fc区是指由抗体分子中的铰链部或其一部分、CH2、CH3结构域构成的区。通常，人IgG重链Fc区被定义为自Cys226的位置的氨基酸残基延伸至Fc区的羧基末端，但不限于此。免疫球蛋白的Fc区包含2个恒定区、CH2和CH3。人IgG Fc区的“CH2”结构域通常自氨基酸231延伸至氨基酸340。“CH3”结构域自Fc区中的羧基末端延伸至CH2区。即，自IgG的氨基酸341延伸至大致氨基酸447。

Fc区可通过用胃蛋白酶等蛋白水解酶部分消化IgG单克隆抗体等之后，再洗脱吸附于蛋白A或蛋白G柱上的组分而适当地获取。作为所述蛋白水解酶，通过适当设定pH值等的酶的反应条件，能够限制性地消化全长抗体以产生Fab、F(ab')2的酶即可，没有特别限定，例如可以示例胃蛋白酶、木瓜蛋白酶等。

关于改变位点编号，采用了EU编号(Kabat EA等人, 1991. Sequences ofProteins of Immunological Interest. NIH)。

本发明中的多肽的“缔合(association)”也可以指，例如，2个以上的多肽区呈相互作用的状态。

本发明中“控制缔合”是指，控制在形成所希望的缔合状态，更具体而言是指，控制在使多肽间的不希望的缔合(优选具有同一氨基酸序列的多肽同伴的缔合)难以形成的状态。

本发明中的“界面(interface)”通常是指，缔合(相互作用)时的缔合面，形成界面的氨基酸残基通常是指，供于其缔合的多肽区所含的1个或多个的氨基酸残基，更优选缔合时接近并参与相互作用的氨基酸残基。具体而言，该相互作用中包含：缔合时接近的氨基酸残基同伴形成氢键、静电相互作用、盐桥的情形等。

本发明中的多肽的“同聚体”是指，具有同一氨基酸序列的多肽同伴呈缔合的状态。

本发明中的多肽的“异聚体”是指，第1多肽和第2多肽呈缔合的状态，其中，第2多肽的氨基酸序列中与第1多肽至少1个氨基酸残基不同。

本发明中的多肽的“解离”是指，多肽的同聚体中，由2个以上多肽呈缔合的状态分离为各多肽单体的状态。

本发明中“异源多聚体(异源多聚体)”是指由多种的多肽构成、该多肽可以彼此缔合的蛋白的多聚体。更详细而言，“异源多聚体”至少具有第1多肽和第2多肽，在此，第2多肽是下述的分子：在其氨基酸序列中与第1多肽至少1个氨基酸残基不同。而且，虽然没有特别限定，但该异源多聚体优选对至少2种不同的配体、抗原、受体或底物等具有抗原结合活性。该异源多聚体除了由第1和第2多肽形成的“异源2聚体”之外，还可存在其它种的多肽。即，本发明的“异源多聚体”不限于异源2聚体，例如，还包含异源3聚体、异源4聚体等。

本发明的包含第1多肽、第2多肽和1个或2个第3多肽的多肽多聚体中，第1多肽和第2多肽可分别与第3多肽形成多聚体(2聚体)。而且，所形成的2聚体同伴可形成多聚体(4聚体)。2个第3多肽可以具有完全相同的氨基酸序列(可对相同抗原具有结合活性)。或者，2个第3多肽可以具有相同的氨基酸序列，但具有2种以上的活性(例如，可对2种以上不同的抗原具有结合活性)。而且，第3多肽为1个时，第3多肽可与第1多肽或第2多肽的任一方形成2聚体，进而形成多肽多聚体。

在本发明的多肽多聚体中，优选第1多肽和第2多肽对不同的抗原具有结合活性。另一方面，第3多肽可以是对与第1多肽或第2多肽的任一方或两方相同的抗原具有结合活性的多肽。或者，第3多肽可以是对与第1多肽、第2多肽不同的抗原具有结合活性的多肽。

或者，本发明的多肽多聚体还可以是包含第1多肽、第2多肽、第3多肽和第4多肽的多肽多聚体。这样的多肽多聚体中，第1多肽和第2多肽可以分别与第3多肽和第4多肽形成多聚体(2聚体)。例如，可以通过在第1多肽与第3多肽、第2多肽与第4多肽之间形成二硫键，来形成2聚体。

在本发明的多肽多聚体中，优选第1多肽和第2多肽对不同的抗原具有结合活性。另一方面，第3多肽可以是对与第1多肽或第2多肽的任一方或两方相同的抗原具有结合活性的多肽。或者，第3多肽可以是对与第1多肽、第2多肽不同的抗原具有结合活性多肽。而且，第4多肽可以是对与第1多肽或第2多肽的任一方相同的抗原具有结合活性的多肽。或者，第4多肽可以是对与第1多肽、第2多肽不同的抗原具有结合活性的多肽。

本发明中的“异源多聚体”为双特异性抗体时，例如，第1多肽和第2多肽分别为包含针对抗原A的抗体重链的氨基酸序列的多肽、包含针对抗原B的抗体重链的氨基酸序列的多肽时，可以将第3多肽制成包含针对抗原A的抗体轻链的氨基酸序列的多肽、将第4多肽制成包含针对抗原B的抗体轻链的氨基酸序列的多肽。

本发明中“具有抗原结合活性的多肽”是指，抗体重链或轻链的可变区、受体、受体与Fc区的融合肽、支架和它们的片段等的对于抗原、配体等蛋白或肽具有可结合的结构域(区)的具有5个氨基酸以上长度的肽和蛋白。即，具有抗原结合活性的多肽可以包含抗体可变区、受体、受体与Fc区的融合肽、支架、或它们的片段的氨基酸序列。

作为支架，只要是可与至少1个抗原结合、立体结构稳定的多肽即可，可以使用任意的多肽。作为这样的多肽，例如可以举出：抗体可变区片段、纤连蛋白、蛋白A结构域、LDL受体A结构域、脂笼蛋白等，以及Nygren等人(Current Opinion in Structural Biology,7: 463-469 (1997)、Journal of Immunol Methods, 290: 3-28 (2004))、Binz等人(Nature Biotech 23: 1257-1266 (2005))、Hosse等人(Protein Science 15: 14-27(2006))中记载的分子，但不限于这些。

抗体的可变区、受体、受体与Fc区的融合肽、支架和它们的片段的获取方法是本领域技术人员众所周知的。还可以使用包含所述区的氨基酸序列和抗体轻链恒定区的氨基酸序列的多肽。

本发明中的“还原条件”是指，形成重链铰链区内的重链间二硫键的半胱氨酸残基与被氧化相比成为被还原的状态的可能性高的条件或环境，优选是指，重链间的铰链区内的半胱氨酸可引起二硫键的异构化的条件或环境，特别优选是指，铰链区外的半胱氨酸不引起二硫键的显著异构化(即，重链与轻链之间保存二硫键的状态)，但重链铰链区内的半胱氨酸可引起二硫键的异构化的条件或环境。例如，本发明中，在还原条件下，将包含Fc区的第一多肽的同聚体和包含Fc区的第2多肽一起温育的时间，是本领域技术人员可以适当设定的。

本发明中的“还原剂”是指，在该环境中还原分子的化合物，即在该环境中使分子变为更还原的状态、以及变为处于更还原状态的化合物。还原剂通过供给电子而发挥作用，由此，在底物的还原后该还原剂本身成为被氧化的状态。因此，还原剂是指供给电子的作用物质。还原剂的例子中包含：二硫苏糖醇(DTT)、巯基乙醇、半胱氨酸、硫代乙醇酸、半胱胺(2-巯基乙胺：2-MEA)、谷胱甘肽(GSH)、TCEP(三(2-羧乙基)膦)和硼氢化钠。

本发明中的“重链间二硫键的异构化”是指，在不同的重链所含的半胱氨酸间进行二硫键的交换、即二硫键的重组。

“二硫键形成”是指，在1个或2个多肽中存在的2个半胱氨酸间形成共价键的过程，该键以“-S--S-”的形式图式化。

“二硫键的还原”是指，切断二硫键，产生2个巯基(-SH基)的过程。

本发明中的“FcγR”或“FcgR”是指为Fcγ受体，且可以与IgG1、IgG2、IgG3、IgG4单克隆抗体的Fc区结合的受体，实质上是指Fcγ受体基因所编码的蛋白家族的任一成员。对于人来说，该家族例如还包括：含有同种型FcγRIa、FcγRIb和FcγRIc的FcγRI(CD64)；含有同种型FcγRIIa(含有同种异型H131(H型)和R131(R型))、FcγRIIb(含有FcγRIIb-1和FcγRIIb-2)和FcγRIIc的FcγRII(CD32)；含有同种型FcγRIIIa(含有同种异型V158和F158)和FcγRIIIb(含有同种异型FcγRIIIb-NA1和FcγRIIIb-NA2)的FcγRIII(CD16)；以及任意的未发现的人FcγR类或FcγR同种型或同种异型。FcγR包括来自人、小鼠、大鼠、兔和猴的FcγR，但并不限定于这些，可来自任意的生物。小鼠FcγR类中例如还包括：FcγRI(CD64)、FcγRII(CD32)、FcγRIII(CD16)和FcγRIII-2(CD16-2)、FcγRIV以及任意的未发现的小鼠FcγR类或FcγR同种型或同种异型。

通过利用了氨基酸残基的电荷排斥的改变进行的异源多聚体的制备方法

在上述方法的优选方案中，本发明是制备所希望的多肽的异聚体的方法，该方法为：对于能够形成2种以上多聚体的异源多聚体，为了促进第1和第2多肽的同聚体的解离、控制形成1种以上多聚体的多肽间的缔合，而改变形成多肽间界面的氨基酸残基。

而且，本发明的具有第1抗原结合活性的多肽和具有第2抗原结合活性的多肽可以包含抗体重链恒定区的氨基酸序列或抗体Fc区的氨基酸序列。作为抗体Fc区或抗体重链恒定区的氨基酸序列，可以举出人IgG型的恒定区或Fc区的氨基酸序列，但不限于这些。作为IgG型的恒定区或Fc区，可以是天然型IgG1、IgG2、IgG3、IgG4的同种型的任一个。或者可以是它们的改变体。Fc区的EU编号447位的赖氨酸和EU编号446位的甘氨酸可以通过将编码它们的核酸进行重组基因操作而去除。

而且，本发明的具有第3抗原结合活性的多肽和具有第4抗原结合活性的多肽可以包含抗体轻链恒定区的氨基酸序列。作为抗体轻链恒定区的氨基酸序列，可以举出人kappa、人lambda型的恒定区的氨基酸序列，但不限于这些。或者，可以是它们的改变体。

而且，本发明的具有抗原结合活性的多肽可以包含抗体可变区的氨基酸序列(例如，CDR1、CDR2、CDR3、FR1、FR2、FR3、FR4的氨基酸序列)。

而且，在本发明的多肽间的解离和/或缔合控制方法的优选方案中，作为该方法，可以举出：在重链恒定区的界面导入电荷排斥而抑制重链同伴的缔合的方法。作为在重链恒定区的界面接触的氨基酸残基，例如可以举出：在CH3区中的356位和439位、357位和370位、399位和409位相对的区。关于重链恒定区，由EU编号表示。

如后述的实施例所示，通过改变这些氨基酸残基，实施本发明的方法，可以控制多肽间的重链的解离和/或缔合，优先地获取所希望的异源多聚体。即，在优选的方案中，本发明提供一种多肽，该多肽为：包含2种以上重链Fc区的抗体和Fc区含有蛋白(例如，IgG型抗体、微抗体(Alt M等人, FEBS Letters 199 9; 454: 90-94)、免疫粘附素(非专利文献2)等)，其中，第1重链Fc区中的选自以下(1)～(3)所示氨基酸残基组的1组～3组的氨基酸残基带有同种电荷：

(1) 以EU编号表示的356位和439位的氨基酸残基；

(2) 以EU编号表示的357位和370位的氨基酸残基；

(3) 以EU编号表示的399位和409位的氨基酸残基。

并且，本发明提供一种多肽，其中，作为选自与上述第1重链Fc区不同的第2重链Fc区中的上述(1)～(3)所示的氨基酸残基组的1组～3组的氨基酸残基，其中，与上述第1重链Fc区中的上述(1)～(3)所示的氨基酸残基组中带有同种电荷的组相同位置的氨基酸残基和上述第1重链Fc区中的氨基酸残基带有相反电荷。

上述多肽中，“带有电荷的氨基酸残基”优选例如选自以下的(a)或(b)中任一组所含的氨基酸残基：

(a) 谷氨酸(E)、天冬氨酸(D)；

(b) 赖氨酸(K)、精氨酸(R)、组氨酸(H)。

上述多肽中，“带有同种电荷”是指，例如，2个以上氨基酸残基的任一个具有上述(a)或(b)中任一组所含的氨基酸残基。“带有相反电荷”是指，例如，2个以上氨基酸残基中的至少1个氨基酸残基具有上述(a)或(b)中任一组所含的氨基酸残基时，剩余的氨基酸残基具有不同的组所含的氨基酸残基。

在优选的方案中，上述多肽的第1重链CH3区和第2重链CH3区可通过二硫键交联。

作为本发明中的“控制缔合界面的改变”，例如可以举出以下的改变：

(1) 第1重链Fc区中的以EU编号表示的356位的Asp(D)改变为Lys(K)、Arg(R)或His(H)，和第2重链Fc区中的以EU编号表示的439位的Lys(K)改变为Glu(E)或Asp(D)；

(2) 第1重链Fc区中的以EU编号表示的357位的Glu(E)改变为Lys(K)、Arg(R)或His(H)，和第2重链Fc区中的以EU编号表示的370位的Lys(K)改变为Glu(E)或Asp(D)；

(3) 第1重链Fc区中的以EU编号表示的399位Asp(D)改变为Lys(K)、Arg(R)或His(H)，和第2重链Fc区中的以EU编号表示的409位的Lys(K)改变为Glu(E)或Asp(D)。

作为本发明的非限定的一个方案，在涉及小鼠异源多聚体的制备方法的多肽间的解离和/或缔合控制方法的优选方案中，作为该方法，可以举出：向重链恒定区的界面导入电荷排斥而控制重链同伴的缔合的方法。该方法中，作为在重链恒定区的界面进行接触的氨基酸残基，例如可以举出：在CH3区中的356位与439位、360位与371位、399位与409位相对的区。关于重链恒定区，由EU编号表示。

如后述的实施例所示，通过改变这些来自小鼠的CH3区中的氨基酸残基，实施本发明的方法，可以控制多肽间的重链的解离和/或缔合，优先地获取所希望的异源多聚体。即，在优选的方案中，本发明提供一种多肽，该多肽为：包含2种以上重链Fc区的抗体和Fc区含有蛋白(例如，IgG型抗体、微抗体(Alt M等人, FEBS Letters 199 9; 454: 90-94)、免疫粘附素(非专利文献2)等)，其中，第1重链Fc区中的选自以下(1)～(3)所示氨基酸残基组的1组～3组的氨基酸残基带有同种电荷：

(1) 以EU编号表示的356位和439位的氨基酸残基；

(2) 以EU编号表示的360位和371位的氨基酸残基；

(3) 以EU编号表示的399位和409位的氨基酸残基。

并且，本发明提供一种多肽，其中，作为选自与上述第1重链Fc区不同的第2重链Fc区中的上述(1)～(3)所示的氨基酸残基组的1组～3组的氨基酸残基，与上述第1重链Fc区中的上述(1)～(3)所示的氨基酸残基组中带有同种电荷的组相同位置的氨基酸残基和上述第1重链Fc区中的氨基酸残基带有相反电荷。

上述多肽中，“带有电荷的氨基酸残基”优选选自例如以下的(a)或(b)中任一组所含的氨基酸残基：

(a) 谷氨酸(E)、天冬氨酸(D)；

(b) 赖氨酸(K)、精氨酸(R)、组氨酸(H)。

在上述多肽中，“带有同种电荷”是指，例如，2个以上氨基酸残基的任一个具有上述(a)或(b)中任一组所含的氨基酸残基。“带有相反电荷”是指，例如，2个以上氨基酸残基中的至少1个氨基酸残基具有上述(a)或(b)中任一组所含的氨基酸残基时，剩余的氨基酸残基具有不同的组所含的氨基酸残基。

(2) 第1重链Fc区中的以EU编号表示的360位的Glu(E)改变为Lys(K)、Arg(R)或His(H)，和第2重链Fc区中的以EU编号表示的371位的Lys(K)改变为Glu(E)或Asp(D)；

(3) 第1重链Fc区中的以EU编号表示的399位的Asp(D)改变为Lys(K)、Arg(R)或His(H)，和第2重链Fc区中的以EU编号表示的409位的Lys(K)改变为Glu(E)或Asp(D)。

本发明中，作为供于“改变”的氨基酸残基，不限于多肽的恒定区的氨基酸残基。对于多肽变异体或异源多聚体，本领域技术人员通过使用市售软件的同源建模等，可以发现形成界面的氨基酸残基，可以将该部位的氨基酸残基供于改变以控制缔合。

本发明的方法中的氨基酸残基的“改变”是指，具体而言，将原氨基酸残基取代为其它氨基酸残基、使原氨基酸残基缺失、添加新的氨基酸残基等，优选是指将原氨基酸残基取代为其它氨基酸残基。

通过改变397位和/或392位的氨基酸进行的异源多聚体的制备方法

在本发明的多肽间的解离和/或缔合控制方法的进一步优选方案中，该方法是：以使重链CH3区的稳定性变为不稳定而向重链Fc区导入氨基酸残基的变异为特征的方法。该方法可以进一步任意包含导入与利用了上述电荷排斥等的界面控制有关的氨基酸改变的步骤。

本发明中的“CH3区的稳定性变为不稳定”是指，在Fc区的氨基酸残基中加入至少1以上改变的多肽的同聚体，与未改变的多肽的同聚体相比，变成更容易分离为各多肽单体的状态。

本发明中的“CH3区的稳定性变为不稳定”是指，优选向CH3区的氨基酸残基中导入改变以使在pH7.4下的重链CH3区的热变性中间温度(Tm)为72.5℃以下、72.0℃以下、71.5℃以下、71.0℃以下、70.5℃以下的状态，进一步优选向CH3区的氨基酸残基中导入改变以使在pH7.4下的重链CH3区的热变性中间温度(Tm)为70.4℃以下、70.3℃以下、70.2℃以下、70.1℃以下、70.0℃以下、69.9℃以下、69.8℃以下、69.7℃以下、69.6℃以下、69.5℃以下、69.0℃以下、68.5℃以下、68.0℃以下、67.5℃以下的状态。

例如，重链CH3区的Tm可以通过本说明书的参考例3中记载的方法进行测定，测定中使用的缓冲液等可以适当选择。

在本发明的多肽间的解离和/或缔合控制方法的进一步优选方案中，该方法是：以向重链CH3区的EU编号397位和/或392位导入氨基酸残基的变异为特征的方法。该方法可以进一步任意包含导入与利用了上述电荷排斥等的界面控制有关的氨基酸改变的步骤。

作为本发明的非限定的一个方案，在来自小鼠的多肽间的解离和/或缔合控制方法中也可以向重链CH3区的EU编号397位和/或392位导入氨基酸残基的变异。该方法可以进一步任意包含导入与利用了上述电荷排斥等的界面控制有关的氨基酸改变的步骤。

作为向397位导入变异的氨基酸残基，优选改变为侧链体积大的氨基酸或侧链分支型的氨基酸。

作为向392位导入变异的氨基酸残基，优选改变为带有负电荷的氨基酸、侧链体积大的氨基酸或侧链分支型的氨基酸。

作为本发明中的“侧链体积大的氨基酸”，可以举出：Met(M)、Phe(F)、Tyr(Y)、Val(V)、Leu(L)、Ile(I)、Trp(W)、Arg(R)、His(H)、Glu(E)、Lys(K)、Gln(Q)、Asp(D)、Asn(N)、Cys(C)、Thr(T)等，优选可以举出： Met(M)、Phe(F)、Thr(T)和Tyr(Y)。

作为本发明中的“侧链分支型的氨基酸”，可以举出：Val(V)、Ile(I)、Leu(L)，优选可以举出： Val(V)和Ile(I)等。

作为本发明中的“带有负电荷的氨基酸”，可以举出Asp(D)和Glu(E)。

作为本发明中的“异源多聚体”，可以优选举出：多特异性抗体和异源融合蛋白等。

作为本发明的非限定的一个方案，提供增强与FcγR结合的异源多聚体的氨基酸改变。作为优选的氨基酸改变部位，可以举出：EU编号397位的氨基酸改变，但不限于此。作为向397位导入变异的氨基酸残基，优选改变为侧链体积大的氨基酸或侧链分支型的氨基酸。

本发明中，作为进一步优选的多特异性抗体，可以举出：IgG型、scFv-IgG、串联scFv-Fc、DVD-Ig、双抗体(Diabody)-Fc、单链双抗体-Fc、IgG-scFv、sVD-IgG、Tandemab、scFv 轻链C-末端融合(scFv light chain C-terminal fusion)、三特异性C-末端融合(Tri-specific C-terminal fusion)、三特异性N-末端融合(Tri-specific N-terminalfusion)、IgG-Fab等(Bispecific Antibodies, Roland E. Kontermann, 2011,WO2010034441, WO2010145792)。

本发明中，“抗体”的术语以最宽的含义使用，只要显示所希望的生物学活性即可，包含单克隆抗体、多克隆抗体、抗体变异体(嵌合抗体、人源化抗体、低分子化抗体(也包含抗体片段)、多特异性抗体等)。而且，本发明中“抗体”可以是多肽或异源多聚体的任一种。优选的抗体为单克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体和抗体片段等的低分子化抗体。本发明中，在获取(制作)这些抗体时可以适当使用本发明的解离和/或缔合控制方法。

作为供于本发明的方法的优选的多肽或异源多聚体，例如可以举出：具有抗体的重链可变区和轻链可变区的多肽或异源多聚体。而且，作为本发明的优选方案，更优选可以举出：本发明的多肽或异源多聚体包含2种以上重链可变区和2种以上轻链可变区时的该多肽或异源多聚体的解离和/或缔合控制方法。

本发明的具有抗原结合活性的多肽可以包含抗体重链的氨基酸序列或抗体轻链的氨基酸序列。更具体而言，具有第1抗原结合活性的多肽和具有第2抗原结合活性的多肽可以包含抗体重链的氨基酸序列，具有第3抗原结合活性的多肽和具有第4抗原结合活性的多肽可以包含抗体轻链的氨基酸序列。

而且，目标多肽多聚体为由第1多肽和第3多肽形成2聚体、由第2多肽和第4多肽形成2聚体、进一步使这些2聚体同伴形成多聚体的4聚体时，作为本发明的多肽多聚体，例如还可以使用：具有第1和第2抗原结合活性的多肽为包含抗体重链的氨基酸序列的多肽、具有第3和第4抗原结合活性的多肽为包含抗体轻链的氨基酸序列的多肽的多肽多聚体。

本发明中，可以进一步优选举出双特异性抗体作为多特异性抗体。

即，本发明的优选方案中，本发明涉及对于例如由2种重链(本发明中的多肽多聚体的第1多肽和第2多肽)和2种轻链(本发明中的多肽多聚体的第3多肽和第4多肽)构成的双特异性抗体控制解离和/或缔合的方法。

对于本发明的优选方案的“双特异性抗体”进一步详述，上述“第1多肽和第2多肽”是指，形成抗体的2个重链(H链)中的一方H链(第1 H链)和与该H链不同的另一方H链(第2 H链)。也就是说，可以将2个H链中的任意一方设为第1 H链，将另一方设为第2 H链。同样地，“第3多肽和第4多肽”是指，形成双特异性抗体的2个轻链(L链)中的一方L链(第1 L链)和与该L链不同的另一方L链(第2 L链)，可以将2个L链中的任意一方设为第1 L链，将另一方设为第2 L链。通常，第1 L链和第1 H链来自识别某抗原(或表位)的同一抗体，第2 L链和第2H链也来自识别某抗原(或表位)的同一抗体。在此，将由第1 H链・L链形成的L链-H链对称为第1对(或第1 HL分子)，将由第2 H链・L链形成的L链-H链对称为第2对(或第2 HL分子)。第1对和第2对所识别的抗原可以相同，优选识别不同的表位。此时，优选第1对和第2对的H链和L链彼此具有不同的氨基酸序列。第1对和第2对识别不同的表位时，该第1对和第2对可以识别完全不同的抗原、也可以识别同一抗原上的不同的部位(不同的表位) (例如，抗原为异源受体时，多特异性抗体识别构成异源受体的不同的结构域；或者，抗原为单体时，多特异性抗体识别单体抗原的多个位点)。通常，这样的分子与2个抗原结合，也可以对更多的(例如，3种)抗原具有特异性。而且，可以是一方识别蛋白、肽、基因、糖等抗原，另一方识别放射性物质、化疗剂、来自细胞的毒素(cell-derived toxin)等细胞毒性物质等。但是，考虑到要制作具有以特定的H链和L链的组合形成的对的抗体时，可以任意确定将其特定的H链和L链作为第1对和第2对。

本发明中的“融合蛋白”是指2个以上相同或实质上类似的蛋白分子经由Ig铰链区氨基酸序列接头进行连接而成的蛋白。是指含有超过1种蛋白的融合蛋白时，使用“异源”的前缀语。例如，“异源融合蛋白”含有将1个以上残部蛋白与不同的1个以上蛋白一起连接而得的2个以上蛋白。

本发明中的“抗体”中包含通过对上述抗体进一步进行氨基酸的取代、缺失、添加和/或插入、或者嵌合化或人源化等，而使其氨基酸序列得到改变的抗体。氨基酸的取代、缺失、添加和/或插入、以及人源化、嵌合化等的氨基酸序列的改变可以通过本领域技术人员公知的方法来进行。同样地，将本发明中的抗体作为重组抗体而制作时所利用的抗体的可变区和恒定区也可以通过氨基酸的取代、缺失、添加和/或插入、或者嵌合化或人源化等改变其氨基酸序列。

本发明中的抗体可以是来自小鼠抗体、人抗体、大鼠抗体、兔抗体、山羊抗体、骆驼抗体等任意动物的抗体。并且，可以是例如嵌合抗体、其中人源化抗体等的取代了氨基酸序列的改变抗体。而且，可以是使各种分子结合而得的抗体修饰物、抗体片段、低分子化抗体等任意的抗体。

“嵌合抗体”是指将来自不同的动物的序列组合而制作的抗体。例如可以示例：由小鼠抗体的重链、轻链的可变(V)区与人抗体的重链、轻链的恒定(C)区构成的抗体。嵌合抗体的制作是已知的，例如，将编码抗体V区的DNA与编码人抗体C区的DNA连接，将其插入表达载体并导入宿主而产生，由此可以获得嵌合抗体。

“人源化抗体”也被称为重构(reshaped)人抗体，将来自人以外的哺乳动物的抗体、例如小鼠抗体的互补决定区(CDR; complementarity determining region)移植到人抗体的CDR中而得的抗体。用于鉴定CDR的方法是已知的(Kabat等人, Sequence ofProteins of Immunological Interest (1987), National Institute of Health,Bethesda, Md.; Chothia等人, Nature (1989) 342: 877)。而且，其一般的基因重组方法也是已知的(参照欧州专利申请公开号EP125023号公报、WO96/02576号公报)。因此，可以利用已知的方法如下产生人源化抗体：例如，确定小鼠抗体的CDR，将该CDR与人抗体的框架区(framework region；FR)连接而得到抗体，获取编码该抗体的DNA，通过使用通常的表达载体的体系，产生人源化抗体。这样的DNA可以通过将制作成CDR和FR两方的末端区具有重叠的部分的多个寡核苷酸用作引物进行PCR法而合成(参照WO98/13388号公报中记载的方法)。对于通过CDR而连接的人抗体的FR，选择CDR形成良好的抗原结合部位的FR。根据需要，可以改变抗体可变区中的FR的氨基酸，以使重构人抗体的CDR形成适当的抗原结合部位(Sato等人, Cancer Res. (1993) 53: 851-6)。在可以改变的FR中的氨基酸残基中，包含与抗原直接、通过非共价键结合的部分(Amit等人, Science (1986) 233: 747-53)、影响或作用于CDR结构的部分(Chothia等人, J. Mol. Biol. (1987) 196: 901-17)和与VH-VL相互作用相关联的部分(EP239400号专利公报)。

本发明中的抗体为嵌合抗体或人源化抗体时，这些抗体的C区优选使用来自人抗体的C区。例如，H链可以使用Cγ1、Cγ2、Cγ3、Cγ4，L链可以使用Cκ、Cλ。而且，为了改善抗体或其产生的稳定性，根据需要，可以对人抗体C区进行修饰。本发明中的嵌合抗体优选由来自人以外的哺乳动物的抗体的可变区和来自人抗体的恒定区构成。另一方面，人源化抗体优选由来自人以外的哺乳动物的抗体的CDR和来自人抗体的FR和C区构成。来自人抗体的恒定区在IgG(IgG1、IgG2、IgG3、IgG4)、IgM、IgA、IgD和IgE等的各同种型具有固有的氨基酸序列。本发明中的人源化抗体所用的恒定区可以是属于任何同种型的抗体的恒定区。优选使用人IgG的恒定区，但不限于此。而且，对用于人源化抗体的来自人抗体的FR也没有特别限定，可以是属于任何同种型的抗体的FR。

本发明中的嵌合抗体和人源化抗体的可变区和恒定区，只要显示原抗体的结合特异性即可，可以通过缺失、取代、插入和/或添加等进行改变。

由于利用了来自人的序列的嵌合抗体和人源化抗体在人体内的抗原性降低，因此认为以治疗目的等给予人时有效。

与等电点改变技术等的组合

作为本发明的进一步优选的方案，通过将改变多肽的等电点(pI值)的氨基酸变异导入到本发明的多肽中，可以更高纯度且有效地纯化或制备具有目标第1～第4多肽的多肽多聚体(WO2007114325、US20130171095)。作为用于促进多肽缔合而导入的氨基酸变异，还可以使用Protein Eng. 1996 Jul; 9(7): 617-21.、Protein Eng Des Sel. 2010 Apr;23(4): 195-202.、J Biol Chem. 2010 Jun 18; 285(25): 19637-46.、WO2009080254、US20130195849等中记载的、通过改变重链恒定区的CH3结构域而对包含2种重链恒定区的多肽进行异源缔合化的方法；以及WO2009080251、WO2009080252、WO2009080253等中记载的、促进重链与轻链的特定组合的缔合化的方法等。

与涉及靶组织特异性抗原结合分子的技术的组合

作为本发明的非限定的实施方案，可以举出与下述的抗体技术组合：靶组织特异性地存在的分子以浓度依赖性方式自抗原解离或结合的抗体技术(WO2013/180200)。

与其它恒定区和/或可变区改变技术的组合

作为本发明的非限定的实施方案，可以举出与下述的改变技术组合：以与FcγR的结合增强为目的的恒定区改变技术(WO2013047752)。

作为本发明与其它恒定区改变技术的其它组合的方案，可以举出：与控制和补体结合的技术的组合。作为补体，只要是形成补体级联的多肽即可使用任一种的补体成分，但作为优选的补体，可以适当举出：参与调理素结合的C1q、C1r或C1s的补体成分。Fc区对补体的结合活性高于天然型Fc区对补体的结合活性的Fc区可以通过改变天然型Fc区的氨基酸来制作。在此所述的天然型Fc区是指，以人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4表示的Fc区。Fc区对补体的结合活性是否高于天然型Fc区对补体的结合活性，这可以使用FACS、ELISA等已知的免疫学方法来适当实施。Fc区的“氨基酸的改变”或“氨基酸改变”包含：改变为与起始Fc区的氨基酸序列不同的氨基酸序列。起始Fc区的修饰改变体只要在pH中性范围与补体结合，可以将任一个的Fc区用作起始结构域。而且，将已经加入了改变的Fc区作为起始Fc区且加入了进一步改变的Fc区也可以适当用作本发明的Fc区。起始Fc区是指，多肽本身、包含起始Fc区的组合物、或编码起始Fc区的氨基酸序列。在起始Fc区中，可以包含通过在抗体的项目中概述的重组而产生的已知的IgG抗体的Fc区。对起始Fc区的来源没有特别限定，可以从非人动物的任意生物或人中获取。作为任意的生物，可以优选适当举出：选自小鼠、大鼠、豚鼠、仓鼠、沙鼠、猫、兔、狗、山羊、绵羊、牛、马、骆驼和非人灵长类的生物。在另外的方案中，起始Fc区还可以从食蟹猴、狨猴、猕猴、黑猩猩或人中获取。优选起始Fc区可以从人IgG1中获取，但不限于IgG的特定类型。这意味着可以将人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的Fc区适当用作起始Fc区。同样意味着：在本说明书中，可以将来自上述的任意生物的IgG的任意类型或亚类的Fc区优选用作起始Fc区。天然存在的IgG的变体或工程模型的例子记载于已知的文献(Curr.Opin. Biotechnol. (2009) 20 (6), 685-91、Curr. Opin. Immunol. (2008) 20 (4),460-470、Protein Eng. Des. Sel. (2010) 23 (4), 195-202、WO2009086320、WO2008092117、WO2007041635、和WO2006105338)中，但不限于这些。

氨基酸的改变只要是具有对补体的结合活性、或提高对补体结合的结合活性，可以改变任意位置的氨基酸。抗原结合分子包含人IgG1的Fc区作为人Fc区时，优选包含产生对补体的结合强于人IgG1的起始Fc区的结合活性的效果的改变。作为用于改变对补体的结合活性的氨基酸，例如可以示例：在Duncan等人(Nature (1988) 332, 738-740)、Tao等人(J. Exp. Med. (1993) 178, 661-667)、Brekke等人(Eur. J. Immunol. (1994) 24,2542-2547)、Xu等人(Immunol. (1993) 150, 152A)、WO1994029351、WO2000042072和WO2011091078等中报道的对C1q的结合活性得到改变的Fc区的氨基酸。

作为这样的可改变而增强对C1q的结合活性的氨基酸，例如可以举出：选自以EU编号表示的231位～238位、318位～337位的至少一个以上的氨基酸。作为该氨基酸的非限定的一个例子，可以举出：选自235位、237位、267位、268位、276位、318位、320位、322位、324位、327位、331位和333位的至少一个以上的氨基酸。通过改变这些氨基酸，可以增强IgG型免疫球蛋白的Fc区对补体的结合。

作为特别优选的改变，例如可以举出： Fc区的以EU编号表示的下述改变：

267位的氨基酸为Glu；

268位的氨基酸为Phe或Tyr的任一个；

276位的氨基酸为Arg；

324位的氨基酸为Thr；

327位的氨基酸为Gly；

331位的氨基酸为Pro；或

333位的氨基酸为Ala、Asp、Gly、Ser或Val的任一个。而且，对待改变的氨基酸的数目没有特别限定，可以仅改变一个位点的氨基酸，也可以改变这些任意地组合的二个位点以上的氨基酸。

作为本发明与其它恒定区改变技术的其它组合方案，可以举出：与酸性pH下的FcRn结合增强改变Fc技术(WO2002060919、WO2004035752、WO2000042072)、中性pH下的FcRn结合增强改变Fc技术(WO2011122011、WO2012133782)、抑制型Fcγ受体选择性结合增强技术(WO2012115241、WO2013125667)、活性型Fcγ受体选择性结合增强技术(ADCC活性增强技术)(WO2013002362)、对类风湿因子的结合活性降低的技术(WO2013046704)等抗体改变技术的组合。

作为本发明与可变区改变技术的非限定的组合方案，可以举出：与pH依赖性抗体(WO2009125825)、钙依赖性抗体(WO2012073992)等改变技术的组合。

抗体文库、免疫和杂交瘤的制作

作为本发明方法中的变异导入前的编码抗体(本说明书中，有时仅记载为“本发明的抗体”)的H链或L链的基因，也可以使用已知的序列，还可以利用本领域技术人员已知的方法来获取。例如，可从抗体文库中获取，或者可从产生单克隆抗体的杂交瘤中克隆编码抗体的基因而获取。

关于抗体文库已经有许多的抗体文库是已知的，而且抗体文库的制作方法也是已知的，因此本领域技术人员可以获取适当的抗体文库。例如，关于抗体噬菌体文库可以参照Clackson等人, Nature 1991, 352: 624-8；Marks等人, J. Mol. Biol. 1991, 222:581-97；Waterhouses等人, Nucleic Acids Res. 1993, 21: 2265-6；Griffiths等人,EMBO J. 1994, 13: 3245-60；Vaughan等人, Nature Biotechnology 1996, 14: 309-14；以及日本特表平20-504970号公报等的文献。此外，可以使用将真核细胞作为文库的方法(WO95/15393号小册子)或核糖体展示法等已知的方法。并且，使用人抗体文库通过淘选法获取人抗体的技术也是已知的。例如，可以使人抗体的可变区以单链抗体(scFv)的形式通过噬菌体展示法表达在噬菌体的表面，选择与抗原结合的噬菌体。通过对所选择的噬菌体的基因进行分析，可以确定编码与抗原结合的人抗体可变区的DNA序列。如果明确了与抗原结合的scFv的DNA序列，则根据该序列制作适当的表达载体，可以获取人抗体。这些方法已经众所周知，可以参照WO92/01047、WO92/20791、WO93/06213、WO93/11236、WO93/19172、WO95/01438、WO95/15388。

由杂交瘤获取编码抗体的基因的方法基本上使用已知技术，使用所希望的抗原或表达所希望抗原的细胞作为敏化抗原，按照通常的免疫方法用该敏化抗原对动物进行免疫，通过常规的细胞融合法，将所得的免疫细胞与已知的亲本细胞融合，通过常规的筛选方法，筛选单克隆的抗体产生细胞(杂交瘤)，使用反转录酶由所得的杂交瘤的mRNA合成抗体可变区(V区)的cDNA，通过将该cDNA与编码所希望的抗体恒定区(C区)的DNA连接，可以获得编码抗体的基因。

更具体而言，不特别限于以下的示例，用于获得编码上述H链和L链的抗体基因的敏化抗原包含：具有免疫原性的完全抗原和含有不显示免疫原性的半抗原等的不完全抗原的两方。例如可以使用目标蛋白的全长蛋白或部分肽等。此外，已知由多糖类、核酸、脂质等构成的物质可用作抗原，对本发明抗体的抗原没有特别限定。抗原的调制可以通过本领域技术人员已知的方法来进行，例如，可以按照使用杆状病毒的方法(例如，WO98/46777等)等来进行。杂交瘤的制作，例如可以按照Milstein等人的方法(G. Kohler and C. Milstein,Methods Enzymol. 1981, 73: 3-46)等来进行。抗原的免疫原性低时，可以使该抗原与白蛋白等具有免疫原性的巨大分子结合，再进行免疫。而且，根据需要，还可以使抗原与其它分子结合作为可溶性抗原。将如受体这样的跨膜分子用作抗原时，还可以将受体的胞外区部分用作片段，或者将在细胞表面上表达跨膜分子的细胞用作免疫原。

抗体产生细胞可以通过使用上述的适当的敏化抗原对动物进行免疫而获得。或者，还可以在体外免疫能够产生抗体的淋巴细胞，以此作为抗体产生细胞。作为待免疫的动物，可以使用各种哺乳动物，但通常使用啮齿目、兔形目、灵长目的动物。可以示例：小鼠、大鼠、仓鼠等啮齿目；兔等兔形目；食蟹猴、猕猴、狒狒、黑猩猩等的猴等灵长目的动物。此外，具有人抗体基因的所有组成成分(repertoires)的转基因动物也是已知的，通过使用这样的动物也可以获得人抗体(参照WO96/34096; Mendez等人, Nat. Genet. 1997, 15: 146-56)。替代这样的转基因动物的使用，例如，在体外用所希望的抗原或表达所希望的抗原的细胞敏化人淋巴细胞，使敏化淋巴细胞与人骨髓瘤细胞、例如U266融合，由此也可以获得具有抗原结合活性的所希望的人抗体(参照日本特公平1-59878号公报)。而且，可以通过用所希望的抗原免疫具有人抗体基因的所有组成成分的转基因动物来获取所希望的人抗体(参照WO93/12227、WO92/03918、WO94/02602、WO96/34096、WO96/33735)。

动物的免疫可以如下进行：例如，将敏化抗原用磷酸缓冲盐水(PBS)或生理盐水等适当稀释、悬浮，根据需要，与佐剂混合并进行乳化后，注射到动物的腹腔内或皮下。然后，优选将与弗氏不完全佐剂混合的敏化抗原对动物每4～21天给予数次。抗体产生的确认可以如下进行：利用常用的方法测定动物血清中的目标抗体效价。

杂交瘤可以如下制作：使用常用的融合剂(例如，聚乙二醇)，将由用所希望的抗原进行了免疫的动物或淋巴细胞获得的抗体产生细胞与骨髓瘤细胞融合而制作(Goding,Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press, 1986, 59-103)。根据需要，培养并增殖杂交瘤细胞，利用免疫沉降、放射免疫分析(RIA)、酶联免疫吸附分析(ELISA)等已知的分析法测定由该杂交瘤产生的抗体的结合特异性。然后，根据需要，还可以利用有限稀释法等方法，对测定了目标特异性、亲和性或活性的产生抗体的杂交瘤进行亚克隆。

接着，使用可与抗体特异性结合的探针(例如，与编码抗体恒定区的序列互补的寡核苷酸等)，由杂交瘤或抗体产生细胞(敏化淋巴细胞等)可以克隆编码所选择的抗体的基因。而且，还可由mRNA通过RT-PCR进行克隆。免疫球蛋白分类为IgA、IgD、IgE、IgG和IgM这5个不同的类型。并且，这些类型分为几个亚类(同种型)(例如，IgG-1、IgG-2、IgG-3和IgG-4；IgA-1和IgA-2等)。本发明中抗体的制备所使用的H链和L链可以是来自属于这些任一类型和亚类的抗体，没有特别限定，特别优选IgG。

在此，还可以通过基因工程学的方法改变编码H链和L链的基因。例如，对于小鼠抗体、大鼠抗体、兔抗体、仓鼠抗体、绵羊抗体、骆驼抗体等抗体，可以以降低对人的异源抗原性等为目的适当制作人为地改变的基因重组型抗体、例如嵌合抗体、人源化抗体等。嵌合抗体是由人以外的哺乳动物、例如小鼠抗体的H链、L链的可变区和人抗体的H链、L链的恒定区构成的抗体，可以如下获得：将编码小鼠抗体的可变区的DNA与编码人抗体的恒定区的DNA连接，将其插入表达载体中并导入宿主而产生。人源化抗体也被称为重构(reshaped)人抗体，DNA序列设计成与人以外的哺乳动物、例如小鼠抗体的互补决定区(CDR;complementary determining region)连接，由制作成末端部具有重叠部分的多个寡核苷酸通过PCR法进行合成。将所得DNA与编码人抗体恒定区的DNA连接，接着插入到表达载体中，将其导入宿主而产生，由此获得(参照EP239400; WO96/02576)。对于通过CDR而连接的人抗体的FR，选择互补决定区形成良好的抗原结合部位的FR。根据需要，可以取代抗体的可变区的框架区的氨基酸以使重构人抗体的互补决定区形成适当的抗原结合部位(K. Sato等人, Cancer Res. 1993, 53: 851-856)。

除了上述的人源化以外，例如还可以进行改变以改善与抗原的结合性等的抗体的生物学特性。这样的改变可以通过位点特异性突变(例如，参照Kunkel (1985) Proc.Natl. Acad. Sci. USA 82: 488)、PCR诱变、盒式诱变等方法来进行。通常，生物学特性得到改善的抗体变异体与原抗体的可变区氨基酸序列具有70％以上、更优选80％以上、进一步优选90％以上(例如，95％以上、97％、98％、99％等)的氨基酸序列同源性和/或类似性。本说明书中，序列的同源性和/或类似性被定义为：为了获取序列同源性的最大值，根据需要对序列进行排比和缺口导入后，与原抗体残基同源(同一残基)或类似(根据通常的氨基酸侧链的特性分类为同一组的氨基酸残基)的氨基酸残基的比率。通常，天然的氨基酸残基根据其侧链的性质分类为以下的组：(1) 疏水性：丙氨酸、异亮氨酸、正亮氨酸、缬氨酸、蛋氨酸和亮氨酸；(2) 中性亲水性：天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、苏氨酸和丝氨酸；(3) 酸性：天冬氨酸和谷氨酸；(4) 碱性：精氨酸、组氨酸和赖氨酸；(5) 影响链取向的残基：甘氨酸和脯氨酸；以及(6) 芳族性：酪氨酸、色氨酸和苯丙氨酸。

通常，在H链和L链的可变区中存在的总计6个互补决定区(超变区；CDR)发生相互作用，形成抗体的抗原结合部位。已知即使是其中1个可变区，虽然与包含所有结合部位的分子相比亲和性低，但也具有识别和结合抗原的能力。因此，对于编码本发明的H链和L链的抗体基因，只要由该基因所编码的多肽能够维持与所希望的抗原的结合性，可以编码包含H链和L链各自的抗原结合部位的片段部分。

多肽的活性和抗原的示例

通过利用本发明的解离和/或缔合控制方法，可以有效制作：例如具有活性的抗体或多肽。作为该活性，例如可以举出：结合活性、中和活性、细胞毒活性、激动活性、拮抗活性、酶活性等。激动活性是指，通过使抗体与受体等的抗原结合，信号被转导到细胞内等，诱导某些生理活性的变化的活性。作为生理活性，例如可以举出：增殖活性、生存活性、分化活性、转录活性、膜转运活性、结合活性、蛋白分解活性、磷酸化/脱磷酸化活性、氧化还原活性、转移活性、核酸分解活性、脱水活性、细胞死亡诱导活性、凋亡诱导活性等，但不限于这些。

而且，根据本发明的方法，可以有效制作识别所希望的抗原、或与所希望的受体结合的抗体或多肽。

本说明书中，对抗原没有特别限定，可以是任意的抗原。作为抗原的例子，例如可以适当举出：配体(细胞因子、趋化因子等)、受体、癌抗原、MHC抗原、分化抗原、免疫球蛋白、以及部分地包含免疫球蛋白的免疫复合物。

作为细胞因子的例子，可以举出：白细胞介素1～18、集落刺激因子(G-CSF、M-CSF、GM-CSF等)、干扰素(IFN-α、IFN-β、IFN-γ等)、生长因子(EGF、FGF、IGF、NGF、PDGF、TGF、HGF等)、肿瘤坏死因子(TNF-α、TNF-β)、淋巴毒素、促红细胞生成素、瘦蛋白、SCF、TPO、MCAF、BMP。

作为趋化因子的例子，可以举出：CCL1～CCL28等的CC趋化因子、CXCL1～CXCL17等的CXC趋化因子、XCL1～XCL2等的C趋化因子、CX3CL1等的CX3C趋化因子。

作为受体的例子，例如可以举出属于下述受体家族的受体等：造血因子受体家族、细胞因子受体家族、酪氨酸激酶型受体家族、丝氨酸/苏氨酸激酶型受体家族、TNF受体家族、G蛋白偶联型受体家族、GPI锚定型受体家族、酪氨酸磷酸酶型受体家族、粘附因子家族、激素受体家族等。关于属于这些受体家族的受体及其特征，记载于许多的文献，例如CookeBA., King RJB., van der Molen HJ. ed. New Comprehesive Biochemistry Vol. 18B“Hormones and their Actions Part II” 1-46页 (1988) Elsevier SciencePublishers BV.；Patthy(Cell (1990) 61 (1), 13-14)、Ullrich等人(Cell (1990) 61(2), 203-212)；Massague(e上带有重音符标记)(Cell (1992) 69 (6), 1067-1070)；Miyajima等人(Annu. Rev. Immunol. (1992) 10, 295-331)；Taga等人(FASEB J. (1992)6, 3387-3396)；Fantl等人(Annu. Rev. Biochem. (1993), 62, 453-481)；Smith等人(Cell (1994) 76 (6) 959-962)；Flower DR.(Biochim. Biophys. Acta (1999) 1422(3) 207-234)等。

作为属于上述受体家族的具体受体，例如可以适当示例：人或小鼠促红细胞生成素(EPO)受体(Blood (1990) 76 (1), 31-35、Cell (1989) 57 (2), 277-285)、人或小鼠粒细胞集落刺激因子(G-CSF)受体(Proc. Natl. Acad. Sci. USA. (1990) 87 (22),8702-8706、mG-CSFR、Cell (1990) 61 (2), 341-350)、人或小鼠血小板生成素(TPO)受体(Proc Natl Acad Sci U S A. (1992) 89 (12), 5640-5644、EMBO J. (1993) 12(7),2645-53)、人或小鼠胰岛素受体(Nature (1985) 313 (6005), 756-761)、人或小鼠Flt-3配体受体(Proc. Natl. Acad. Sci. USA. (1994) 91 (2), 459-463)、人或小鼠血小板源性生长因子(PDGF)受体(Proc. Natl. Acad. Sci. USA. (1988) 85 (10) 3435-3439)、人或小鼠干扰素(IFN)-α、β受体(Cell (1990) 60 (2), 225-234.和Cell (1994) 77 (3),391-400)、人或小鼠瘦蛋白受体、人或小鼠生长激素(GH)受体、人或小鼠白细胞介素(IL)-10受体、人或小鼠胰岛素样生长因子(IGF)-I受体、人或小鼠白血病抑制因子(LIF)受体、人或小鼠睫状神经营养因子(CNTF)受体等。

癌抗原是伴随细胞的恶性化而表达的抗原，也称为肿瘤特异性抗原。而且，细胞癌化时呈现于细胞表面或蛋白分子上的异常糖链也是癌抗原，也称为癌糖链抗原。作为癌抗原的例子，例如可以适当举出：作为上述受体属于GPI锚定型受体家族但在包含肝癌在内的几种癌中表达的GPC3(Int J Cancer. (2003) 103 (4), 455-65)、在包含肺癌在内的多种癌中表达的EpCAM(Proc Natl Acad Sci U S A. (1989) 86 (1), 27-31)、CA19-9、CA15-3、唾液酰SSEA-1(SLX)等。

MHC抗原主要分类为MHC-I类抗原和MHC-II类抗原，MHC-I类抗原中包含HLA-A、-B、-C、-E、-F、-G、-H，MHC-II类抗原中包含HLA-DR、-DQ、-DP。

分化抗原中可以包含：CD1、CD2、CD4、CD5、CD6、CD7、CD8、CD10、CD11a、CD11b、CD11c、CD13、CD14、CD15s、CD16、CD18、CD19、CD20、CD21、CD23、CD25、CD28、CD29、CD30、CD32、CD33、CD34、CD35、CD38、CD40、CD41a、CD41b、CD42a、CD42b、CD43、CD44、CD45、CD45RO、CD48、CD49a、CD49b、CD49c、CD49d、CD49e、CD49f、CD51、CD54、CD55、CD56、CD57、CD58、CD61、CD62E、CD62L、CD62P、CD64、CD69、CD71、CD73、CD95、CD102、CD106、CD122、CD126、CDw130。

免疫球蛋白中包含IgA、IgM、IgD、IgG、IgE。而且免疫复合物至少包含免疫球蛋白的任一成分。

作为其它抗原，可例示如下所述的分子：17-IA、4-1BB、4Dc、6-酮-PGF1a、8-异-PGF2a、8-氧代-dG、A1腺苷受体、A33、ACE、ACE-2、激活素、激活素A、激活素AB、激活素B、激活素C、激活素RIA、激活素RIA ALK-2、激活素RIB ALK-4、激活素RIIA、激活素RIIB、ADAM、ADAM10、ADAM12、ADAM15、ADAM17/TACE、ADAM8、ADAM9、ADAMTS、ADAMTS4、ADAMTS5、地址素(Addressin)、aFGF、ALCAM、ALK、ALK-1、ALK-7、α-1-抗胰蛋白酶、α-V/β-1拮抗剂、ANG、Ang、APAF-1、APE、APJ、APP、APRIL、AR、ARC、ART、Artemin、抗Id、ASPARTIC、心房钠利尿因子、av/b3整联蛋白、Axl、b2M、B7-1、B7-2、B7-H、B-淋巴细胞刺激因子(BlyS)、BACE、BACE-1、Bad、BAFF、BAFF-R、Bag-1、BAK、Bax、BCA-1、BCAM、Bcl、BCMA、BDNF、b-ECGF、bFGF、BID、Bik、BIM、BLC、BL-CAM、BLK、BMP、BMP-2 BMP-2a、BMP-3(成骨蛋白)、BMP-4 BMP-2b、BMP-5、BMP-6 Vgr-1、BMP-7(OP-1)、BMP-8(BMP-8a、OP-2)、BMPR、BMPR-IA(ALK-3)、BMPR-IB(ALK-6)、BRK-2、RPK-1、BMPR-II(BRK-3)、BMP、b-NGF、BOK、蛙皮素、骨衍生神经营养因子、BPDE、BPDE-DNA、BTC、补体因子3(C3)、C3a、C4、C5、C5a、C10、CA125、CAD-8、降钙素、cAMP、癌胚抗原(CEA)、癌相关抗原、组织蛋白酶A、组织蛋白酶B、组织蛋白酶C/DPPI、组织蛋白酶D、组织蛋白酶E、组织蛋白酶H、组织蛋白酶L、组织蛋白酶O、组织蛋白酶S、组织蛋白酶V、组织蛋白酶X/Z/P、CBL、CCI、CCK2、CCL、CCL1、CCL11、CCL12、CCL13、CCL14、CCL15、CCL16、CCL17、CCL18、CCL19、CCL2、CCL20、CCL21、CCL22、CCL23、CCL24、CCL25、CCL26、CCL27、CCL28、CCL3、CCL4、CCL5、CCL6、CCL7、CCL8、CCL9/10、CCR、CCR1、CCR10、CCR10、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CCR9、CD1、CD2、CD3、CD3E、CD4、CD5、CD6、CD7、CD8、CD10、CD11a、CD11b、CD11c、CD13、CD14、CD15、CD16、CD18、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD25、CD27L、CD28、CD29、CD30、CD30L、CD32、CD33(p67蛋白)、CD34、CD38、CD40、CD40L、CD44、CD45、CD46、CD49a、CD52、CD54、CD55、CD56、CD61、CD64、CD66e、CD74、CD80(B7-1)、CD89、CD95、CD123、CD137、CD138、CD140a、CD146、CD147、CD148、CD152、CD164、CEACAM5、CFTR、cGMP、CINC、肉毒杆菌毒素、产气荚膜梭菌(Clostridium Perfringens)毒素、CKb8-1、CLC、CMV、CMV UL、CNTF、CNTN-1、COX、C-Ret、CRG-2、CT-1、CTACK、CTGF、CTLA-4、CX3CL1、CX3CR1、CXCL、CXCL1、CXCL2、CXCL3、CXCL4、CXCL5、CXCL6、CXCL7、CXCL8、CXCL9、CXCL10、CXCL11、CXCL12、CXCL13、CXCL14、CXCL15、CXCL16、CXCR、CXCR1、CXCR2、CXCR3、CXCR4、CXCR5、CXCR6、细胞角蛋白肿瘤相关抗原、DAN、DCC、DcR3、DC-SIGN、补体抑制因子(衰变促进因子)、脱(1-3)-IGF-I(脑IGF-1)、Dhh、地高辛、DNAM-1、Dnase、Dpp、DPPIV/CD26、Dtk、ECAD、EDA、EDA-A1、EDA-A2、EDAR、EGF、EGFR(ErbB-1)、EMA、EMMPRIN、ENA、内皮素受体、脑啡肽酶、eNOS、Eot、嗜酸细胞活化趋化因子1、EpCAM、Ephrin B2/EphB4、EPO、ERCC、E-选择素、ET-1、因子IIa、因子VII、因子VIIIc、因子IX、成纤维细胞活化蛋白(FAP)、Fas、FcR1、FEN-1、铁蛋白、FGF、FGF-19、FGF-2、FGF3、FGF-8、FGFR、FGFR-3、纤维蛋白、FL、FLIP、Flt-3、Flt-4、促卵泡激素、断裂因子、FZD1、FZD2、FZD3、FZD4、FZD5、FZD6、FZD7、FZD8、FZD9、FZD10、G250、Gas6、GCP-2、GCSF、GD2、GD3、GDF、GDF-1、GDF-3(Vgr-2)、GDF-5(BMP-14、CDMP-1)、GDF-6(BMP-13、CDMP-2)、GDF-7(BMP-12、CDMP-3)、GDF-8(肌肉生长抑制素)、GDF-9、GDF-15(MIC-1)、GDNF、GDNF、GFAP、GFRa-1、GFR-α1、GFR-α2、GFR-α3、GITR、胰高血糖素、Glut4、糖蛋白IIb/IIIa(GPIIb/IIIa)、GM-CSF、gp130、gp72、GRO、生长激素释放因子、半抗原(NP-cap或NIP-cap)、HB-EGF、HCC、HCMV gB包膜糖蛋白、HCMV gH包膜糖蛋白、HCMV UL、造血生长因子(HGF)、Hep B gp120、乙酰肝素酶、Her2、Her2/neu(ErbB-2)、Her3(ErbB-3)、Her4(ErbB-4)、单纯疱疹病毒(HSV) gB糖蛋白、HSV gD糖蛋白、HGFA、高分子量黑色素瘤相关抗原(HMW-MAA)、HIV gp120、HIV IIIB gp 120 V3环、HLA、HLA-DR、HM1.24、HMFG PEM、HRG、Hrk、人心肌球蛋白、人巨细胞病毒(HCMV)、人生长激素(HGH)、HVEM、I-309、IAP、ICAM、ICAM-1、ICAM-3、ICE、ICOS、IFNg、Ig、IgA受体、IgE、IGF、IGF结合蛋白、IGF-1R、IGFBP、IGF-I、IGF-II、IL、IL-1、IL-1R、IL-2、IL-2R、IL-4、IL-4R、IL-5、IL-5R、IL-6、IL-6R、IL-8、IL-9、IL-10、IL-12、IL-13、IL-15、IL-18、IL-18R、IL-23、干扰素(INF)-α、INF-β、INF-γ、抑制素、iNOS、胰岛素A链、胰岛素B链、胰岛素样生长因子1、整联蛋白α2、整联蛋白α3、整联蛋白α4、整联蛋白α4/β1、整联蛋白α4/β7、整联蛋白α5(αV)、整联蛋白α5/β1、整联蛋白α5/β3、整联蛋白α6、整联蛋白β1、整联蛋白β2、干扰素γ、IP-10、I-TAC、JE、激肽释放酶2、激肽释放酶5、激肽释放酶6、激肽释放酶11、激肽释放酶12、激肽释放酶14、激肽释放酶15、激肽释放酶L1、激肽释放酶L2、激肽释放酶L3、激肽释放酶L4、KC、KDR、角质形成细胞生长因子(KGF)、层连蛋白5、LAMP、LAP、LAP(TGF-1)、潜伏型TGF-1、潜伏型TGF-1 bp1、LBP、LDGF、LECT2、Lefty、Lewis-Y抗原、Lewis-Y相关抗原、LFA-1、LFA-3、Lfo、LIF、LIGHT、脂蛋白、LIX、LKN、Lptn、L-选择素、LT-a、LT-b、LTB4、LTBP-1、肺表面、促黄体激素、淋巴毒素β受体、Mac-1、MAdCAM、MAG、MAP2、MARC、MCAM、MCAM、MCK-2、MCP、M-CSF、MDC、Mer、金属蛋白酶、MGDF受体、MGMT、MHC(HLA-DR)、MIF、MIG、MIP、MIP-1-α、MK、MMAC1、MMP、MMP-1、MMP-10、MMP-11、MMP-12、MMP-13、MMP-14、MMP-15、MMP-2、MMP-24、MMP-3、MMP-7、MMP-8、MMP-9、MPIF、Mpo、MSK、MSP、粘蛋白(Muc1)、MUC18、缪勒管抑制物质、Mug、MuSK、NAIP、NAP、NCAD、N-C粘附因子、NCA 90、NCAM、NCAM、脑啡肽酶、神经营养素-3、神经营养素-4或神经营养素-6、Neurturin、神经生长因子(NGF)、NGFR、NGF-β、nNOS、NO、NOS、Npn、NRG-3、NT、NTN、OB、OGG1、OPG、OPN、OSM、OX40L、OX40R、p150、p95、PADPr、甲状旁腺激素、PARC、PARP、PBR、PBSF、PCAD、P-钙黏蛋白、PCNA、PDGF、PDGF、PDK-1、PECAM、PEM、PF4、PGE、PGF、PGI2、PGJ2、PIN、PLA2、胎盘碱性磷酸酶(PLAP)、PlGF、PLP、PP14、胰岛素原、松弛素原、蛋白C、PS、PSA、PSCA、前列腺特异性膜抗原(PSMA)、PTEN、PTHrp、Ptk、PTN、R51、RANK、RANKL、RANTES、RANTES、松弛素A链、松弛素B链、肾素、呼吸道合胞体病毒(RSV)F、RSV Fgp、Ret、类风湿因子、RLIP76、RPA2、RSK、S100、SCF/KL、SDF-1、SERINE、血清白蛋白、sFRP-3、Shh、SIGIRR、SK-1、SLAM、SLPI、SMAC、SMDF、SMOH、SOD、SPARC、Stat、STEAP、STEAP-II、TACE、TACI、TAG-72(肿瘤相关糖蛋白-72)、TARC、TCA-3、T细胞受体(例如，T细胞受体α/β)、TdT、TECK、TEM1、TEM5、TEM7、TEM8、TERT、睾丸PLAP样碱性磷酸酶、TfR、TGF、TGF-α、TGF-β、TGF-β泛特异性(TGF-β Pan Specific)、TGF-βRI(ALK-5)、TGF-βRII、TGF-βRIIb、TGF-βRIII、TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3、TGF-β4、TGF-β5、凝血酶、胸腺Ck-1、促甲状腺激素、Tie、TIMP、TIQ、组织因子、TMEFF2、Tmpo、TMPRSS2、TNF、TNF-α、TNF-αβ、TNF-β2、TNFc、TNF-RI、TNF-RII、TNFRSF10A(TRAIL R1 Apo-2、DR4)、TNFRSF10B(TRAIL R2DR5、KILLER、TRICK-2A、TRICK-B)、TNFRSF10C(TRAIL R3 DcR1、LIT、TRID)、TNFRSF10D(TRAIL R4 DcR2、TRUNDD)、TNFRSF11A(RANK ODF R、TRANCE R)、TNFRSF11B(OPG OCIF、TR1)、TNFRSF12(TWEAK R FN14)、TNFRSF13B(TACI)、TNFRSF13C(BAFF R)、TNFRSF14(HVEMATAR、HveA、LIGHT R、TR2)、TNFRSF16(NGFR p75NTR)、TNFRSF17(BCMA)、TNFRSF18(GITRAITR)、TNFRSF19(TROY TAJ、TRADE)、TNFRSF19L(RELT)、TNFRSF1A(TNF RI CD120a、p55-60)、TNFRSF1B(TNF RII CD120b、p75-80)、TNFRSF26(TNFRH3)、TNFRSF3(LTbR TNF RIII、TNFC R)、TNFRSF4(OX40 ACT35、TXGP1 R)、TNFRSF5(CD40 p50)、TNFRSF6(Fas Apo-1、APT1、CD95)、TNFRSF6B(DcR3 M68、TR6)、TNFRSF7(CD27)、TNFRSF8(CD30)、TNFRSF9(4-1BB CD137、ILA)、TNFRSF21(DR6)、TNFRSF22(DcTRAIL R2 TNFRH2)、TNFRST23(DcTRAIL R1 TNFRH1)、TNFRSF25(DR3 Apo-3、LARD、TR-3、TRAMP、WSL-1)、TNFSF10(TRAIL Apo-2配体、TL2)、TNFSF11(TRANCE/RANK配体 ODF、OPG配体)、TNFSF12(TWEAK Apo-3配体、DR3配体)、TNFSF13(APRIL TALL2)、TNFSF13B(BAFF BLYS、TALL1、THANK、TNFSF20)、TNFSF14(LIGHT HVEM配体、LTg)、TNFSF15(TL1A/VEGI)、TNFSF18(GITR配体 AITR配体、TL6)、TNFSF1A(TNF-a连接蛋白、DIF、TNFSF2)、TNFSF1B(TNF-b LTa、TNFSF1)、TNFSF3(LTb TNFC、p33)、TNFSF4(OX40配体gp34、TXGP1)、TNFSF5(CD40配体CD154、gp39、HIGM1、IMD3、TRAP)、TNFSF6(Fas配体 Apo-1配体、APT1配体)、TNFSF7(CD27配体 CD70)、TNFSF8(CD30配体 CD153)、TNFSF9(4-1BB配体CD137配体)、TP-1、t-PA、Tpo、TRAIL、TRAIL R、TRAIL-R1、TRAIL-R2、TRANCE、运铁蛋白受体、TRF、Trk、TROP-2、TSG、TSLP、肿瘤相关抗原CA125、肿瘤相关抗原表达病毒Y相关碳水化合物、TWEAK、TXB2、Ung、uPAR、uPAR-1、尿激酶、VCAM、VCAM-1、VECAD、VE-钙黏蛋白、VE-钙黏蛋白-2、VEFGR-1(flt-1)、VEGF、VEGFR、VEGFR-3(flt-4)、VEGI、VIM、病毒抗原、VLA、VLA-1、VLA-4、VNR整联蛋白、冯维勒布兰德因子、WIF-1、WNT1、WNT2、WNT2B/13、WNT3、WNT3A、WNT4、WNT5A、WNT5B、WNT6、WNT7A、WNT7B、WNT8A、WNT8B、WNT9A、WNT9A、WNT9B、WNT10A、WNT10B、WNT11、WNT16、XCL1、XCL2、XCR1、XCR1、XEDAR、XIAP、XPD、HMGB1、IgA、Aβ、CD81、CD97、CD98、DDR1、DKK1、EREG、Hsp90、IL-17/IL-17R、IL-20/IL-20R、氧化LDL、PCSK9、激肽释放酶原、RON、TMEM16F、SOD1、嗜铬粒蛋白A、嗜铬粒蛋白 B、tau、VAP1、高分子激肽原、IL-31、IL-31R、Nav1.1、Nav1.2、Nav1.3、Nav1.4、Nav1.5、Nav1.6、Nav1.7、Nav1.8、Nav1.9、EPCR、C1、C1q、C1r、C1s、C2、C2a、C2b、C3、C3a、C3b、C4、C4a、C4b、C5、C5a、C5b、C6、C7、C8、C9、因子B、因子D、因子H、备解素、壳硬蛋白(sclerostin)、血纤蛋白原、血纤蛋白、凝血酶原、凝血酶、组织因子、因子V、因子Va、因子 VII、因子 VIIa、因子 VIII、因子 VIIIa、因子 IX、因子 IXa、因子X、因子 Xa、因子 XI、因子 XIa、因子 XII、因子 XIIa、因子 XIII、因子 XIIIa、TFPI、抗凝血酶III、EPCR、血栓调节蛋白、TAPI、tPA、纤溶酶原、纤溶酶、PAI-1、PAI-2、GPC3、多配体蛋白聚糖-1、多配体蛋白聚糖-2、多配体蛋白聚糖-3、多配体蛋白聚糖-4、LPA、S1P以及用于激素和生长因子的受体。

并且，在本发明的非限定的一个实施方案中，双特异性抗体的1个特异性能够以癌抗原为靶标，另一个特异性能够以在CTL(细胞毒性T淋巴细胞，Cytotoxic T lymphocyte)上表达的抗原、例如CD3或TNFRSF(肿瘤坏死因子受体超家族，Tumor Necrosis FactorReceptor Super Family)为靶标，但不限于该组合。作为TNFRSF的例子，可以举出：TNFRSF9(CD137)、TNFRSF5 (CD40)和TNFRSF4 (OX40)等。

核酸的改变

而且，在本发明的制备方法的另一方案中，本发明提供异源多聚体的制备方法，该方法是使形成多肽间界面的氨基酸残基(例如，以EU编号表示的356位和439位、357位和370位、以及399位和409位的氨基酸残基)、以及/或EU编号397位和/或392位的氨基酸残基具有变异以控制多肽间的解离和/或缔合的异源多聚体的制备方法，该制备方法包括下述的步骤：(a) 将编码形成该多肽间界面等的氨基酸残基的核酸根据原核酸进行改变以控制多肽间的解离和缔合的步骤；(b) 培养具有该核酸的宿主细胞以表达该多肽的步骤；(c) 由该宿主细胞的培养物回收该多肽的步骤；以及(d) 在还原条件下，温育各多肽，回收所希望多肽的异聚体的步骤。

而且，包含利用本发明的上述的解离和/或缔合控制方法，将编码形成该多肽间界面的氨基酸残基的核酸根据原核酸进行改变以抑制多肽间缔合的步骤的方法也是本发明的上述制备方法的优选方案之一。

在本发明的上述方法中，“改变核酸”是指改变核酸以与通过本发明中的“改变”而导入的氨基酸残基对应。更具体而言，是指将编码原(改变前)氨基酸残基的核酸改变为编码通过改变而导入的氨基酸残基的核酸。通常，是指对于原核酸进行至少1个碱基的插入、缺失或取代的基因操作或诱变处理，以形成编码目标氨基酸残基的密码子。即，编码原氨基酸残基的密码子被编码通过改变而导入的氨基酸残基的密码子取代。这样的核酸的改变，可以使用本领域技术人员已知的技术，例如位点特异性诱变法、PCR诱变法等适当实施。

而且，本发明中的核酸通常被携带(插入)到适当的载体中并导入到宿主细胞中。作为该载体，只要稳定地保持所插入的核酸即可，没有特别限定，例如当将大肠杆菌用作宿主时，作为克隆用载体优选pBluescript载体(Stratagene公司制造)等，但可以利用市售的各种载体。在生产本发明多肽的目的中使用载体时，表达载体特别有用。作为表达载体，只要是在试管内、大肠杆菌内、培养细胞内、生物个体内表达多肽的载体即可，没有特别限定，例如，在试管内表达优选pBEST载体(Promega公司制造)、在大肠杆菌内表达优选pET载体(Invitrogen公司制造)、在培养细胞内表达优选pME18S-FL3载体(GenBank登录号AB009864)、在生物个体内表达优选pME18S载体(Mol Cell Biol. 8:466-472(1988))等。将本发明的DNA插入到载体，可以利用常规方法，例如通过使用限制酶切位点的连接酶反应来进行(Current protocols in Molecular Biology edit. Ausubel等人(1987) Publish.John Wiley & Sons．Section 11.4-11.11)。

作为上述宿主细胞，没有特别限制，根据目的可以使用各种的宿主细胞。作为用于表达多肽的细胞，例如可以示例：细菌细胞(例：链球菌、葡萄球菌、大肠杆菌、链霉菌、枯草杆菌)、真菌细胞(例：酵母、曲霉菌)、昆虫细胞(例：果蝇S2、夜蛾SF9)、动物细胞(例：CHO、COS、HeLa、C127、3T3、BHK、HEK293、黑色素瘤细胞)和植物细胞。向宿主细胞中导入载体，例如可以通过磷酸钙沉淀法、电脉冲穿孔法(Current protocols in Molecular Biologyedit. Ausubel等人(1987) Publish. John Wiley & Sons．Section 9.1-9.9)、脂质转染法(GIBCO-BRL公司制造)、显微注射法等的已知方法来进行。

为了使宿主细胞中所表达的多肽分泌到内质网的内腔、细胞周质间隙、或细胞外环境中，可以将适当的分泌信号与目标多肽组合。这些信号对于目标多肽可以是内源性信号、也可以是异源信号。

关于上述制备方法中的多肽的回收，当本发明的多肽分泌到培养基时，回收培养基。当本发明的多肽在细胞内生产时，首先将该细胞溶解，然后回收多肽。

由重组细胞培养物回收本发明的多肽进行纯化时，可以使用包含硫酸铵或乙醇沉淀、酸萃取、阴离子或阳离子交换层析、磷酸纤维素层析、疏水作用层析、亲和层析、羟磷灰石层析和凝聚素层析的已知方法。

作为本发明的非限定的实施方案，可以举出下述的方法：分别培养产生第一和第二多肽的同聚体的各细胞株，将该培养上清纯化后，使用纯化抗体引起FAE(Fab臂交换)反应的方法；分别培养产生第一和第二多肽的同聚体的各细胞株，无需纯化该培养上清而进行混合，在混合培养上清中引起FAE反应，然后进行纯化的方法；将产生第1多肽的同聚体的细胞株与产生第2多肽的同聚体的细胞株混合并进行培养，将该培养上清纯化后，使用纯化抗体引起FAE反应的方法；将产生第1多肽的同聚体的细胞株与产生第2多肽的同聚体的细胞株混合并进行培养，在该培养上清中引起FAE反应，然后进行纯化的方法。

作为非限定的实施方案，本发明提供异源多聚体的制备方法，该方法包括以下a)～c)的步骤：

a) 将产生第1多肽的同聚体的细胞株与产生第2多肽的同聚体的细胞株混合的步骤；

b) 在该培养上清中将该第1多肽的同聚体和该第2多肽的同聚体一起温育以使铰链区内的半胱氨酸引起二硫键的异构化的步骤；以及

c) 获得包含第1和第2多肽的异源多聚体的步骤。

a) 分别培养产生第1和第2多肽的同聚体的细胞株的步骤；

b) 将各细胞株的培养上清混合，将该第1多肽的同聚体和该第2多肽的同聚体一起温育以使铰链区内的半胱氨酸引起二硫键的异构化的步骤；以及

c) 获得包含第1和第2多肽的异源多聚体的步骤。

选择所希望的异源多聚体的方法

并且，本发明提供选择所希望的异源多聚体的方法。作为优选方案，该方法为选择具有所希望特性的异源多聚体的方法，包含以下的步骤：

a) 提供第1多肽的组和第2多肽的组的步骤，其中，构成第1组的各多肽与构成第2组的各多肽具有不同的靶特异性，且构成第1和第2组的各多肽包含使涉及利用了上述电荷排斥的界面控制的氨基酸改变和/或CH3区的稳定性变为不稳定的氨基酸改变；

b) 在还原条件下，将该构成第1组的各多肽与该构成第2组的各多肽一起温育，由此制作多种的异源多聚体的混合物的步骤；

c) 将作为结果获得的多种的异源多聚体的混合物对于预定的所希望的特性进行分析的步骤；以及

d) 选择具有所希望特性的异源多聚体的步骤。

药物组合物

本发明还涉及本发明的异源多聚体、以及包含药学上可接受的载体的组合物(药剂)。

本发明中，药物组合物通常是指用于疾病的治疗或预防、或者检测、诊断的药剂。

本发明的药物组合物可以通过本领域技术人员已知的方法来进行配制。例如，可以以与水或其它药学上可接受的液体的无菌性溶液或悬浮液剂的注射剂形式非口服地使用。例如，可以适宜组合药理学上可接受的载体或介质，具体而言，适宜组合无菌水或生理盐水、植物油、乳化剂、助悬剂、表面活性剂、稳定剂、香味剂、赋形剂、溶剂、防腐剂、粘合剂等，以通常所认可的制药实践所要求的单位用量形式进行混合，由此进行配制。设定这些制剂中的有效成分量，以便可得到指示范围的适当容量。

用于注射的无菌组合物可以使用注射用蒸馏水之类的溶剂按照通常的制剂实践来进行配制。

作为注射用水溶液，可以举出例如生理盐水、含有葡萄糖或其它辅助药(例如，D-山梨糖醇、D-甘露糖、D-甘露醇、氯化钠)的等渗液。可以与适当的溶解助剂、例如醇(乙醇等)、多元醇(丙二醇、聚乙二醇等)、非离子性表面活性剂(聚山梨醇酯80(TM)、HCO-50等)并用。

作为油性液可以举出芝麻油、大豆油，还可以并用苯甲酸苄酯和/或苯甲醇作为溶解助剂。此外，还可以与缓冲剂(例如，磷酸缓冲盐水和乙酸钠缓冲液)、止痛剂(例如，盐酸普鲁卡因)、稳定剂(例如，苯甲醇和苯酚)、抗氧化剂配合。所调制的注射液通常填充于适当的安瓿中。

本发明的药物组合物优选通过非口服给药来给予。可以制成例如注射剂型、经鼻给予剂型、经肺给予剂型、经皮给予型的组合物。可以通过例如静脉内注射、肌肉内注射、腹腔内注射、皮下注射等全身或局部给予。

给予方法可以根据患者的年龄、症状而适当选择。含有抗体或编码抗体的多核苷酸的药物组合物的给予量可设定为：例如，0.0001mg～1000mg/kg体重/次的范围。或者可设定为：例如，每个患者为0.001～100000mg的给予量，但本发明并受上述数值的限制。给予量和给予方法根据患者的体重、年龄、症状等而改变，本领域技术人员可以考虑这些条件设定适当的给予量和给予方法。

在本发明中，上述本发明的异源多聚体作为对癌症的治疗药或预防药的有效成分是有用的。癌症包含下述的癌症，但不限于这些：肺癌(包含小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺腺癌和肺扁平上皮癌)、大肠癌、直肠癌、结肠癌、乳腺癌、肝癌、胃癌、胰腺癌、肾癌、前列腺癌、卵巢癌、甲状腺癌、胆管癌、腹膜癌、间皮瘤、扁平上皮癌、子宫颈癌、子宫体癌、膀胱癌、食道癌、头颈部癌、鼻咽癌、唾液腺肿瘤、胸腺瘤、皮肤癌、基底细胞瘤、恶性黑色素瘤、肛门癌、阴茎癌、精巢癌、肾母细胞瘤、急性骨髓性白血病(包含急性髓细胞性白血病、急性成髓细胞性白血病、急性前髓细胞性白血病、急性粒-单核细胞性白血病和急性单核细胞性白血病)、慢性髓性白血病、急性淋巴细胞性白血病、慢性淋巴样白血病、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤(伯基特氏淋巴瘤、慢性淋巴细胞性白血病、蕈样肉芽肿、套细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、弥漫性大细胞型淋巴瘤、边缘带淋巴瘤、毛细胞白血病浆细胞瘤、外周T细胞淋巴瘤和成人T细胞白血病/淋巴瘤)、郎格罕细胞组织细胞增生症、多发性骨髓瘤、骨髓增生异常综合症、脑肿瘤(包含神经胶质瘤、星形胶质细胞瘤、胶质母细胞瘤、脑膜瘤和室管膜瘤)、神经母细胞瘤、视网膜母细胞瘤、骨肉瘤、卡波西氏肉瘤、尤文氏肉瘤、血管肉瘤、血管外皮细胞瘤。

而且，根据需要，还可以将本发明的多肽或异源多聚体与其它药物成分组合配制。

而且，本发明提供用于本发明的治疗方法或预防方法的试剂盒，该试剂盒至少包含：通过本发明的制备方法制备的异源多聚体、或本发明的药物组合物。该试剂盒中，还另外包装有药学上可接受的载体、媒介物、记载了使用方法的说明书等。而且，本发明涉及本发明的多肽或通过本发明的制备方法制备的多肽在制备免疫炎症性疾病的治疗药或预防药中的用途。而且，本发明涉及用于本发明的治疗方法或预防方法的本发明的多肽或通过本发明的制备方法制备的多肽。

需要说明的是，在本说明书中使用的氨基酸的三字母标记和单字母标记的对应如下所示。

丙氨酸：Ala：A

精氨酸：Arg：R

天冬酰胺：Asn：N

天冬氨酸：Asp：D

半胱氨酸：Cys：C

谷氨酰胺：Gln：Q

谷氨酸：Glu：E

甘氨酸：Gly：G

组氨酸：His：H

异亮氨酸：Ile：I

亮氨酸：Leu：L

赖氨酸：Lys：K

蛋氨酸：Met：M

苯丙氨酸：Phe：F

脯氨酸：Pro：P

丝氨酸：Ser：S

苏氨酸：Thr：T

色氨酸：Trp：W

酪氨酸：Tyr：Y

缬氨酸：Val：V

需要说明的是，本说明书中引用的全部现有技术文献均作为参照结合到本说明书中。

实施例

[实施例1] 通过对抗体导入控制缔合界面的改变来研究Fab臂交换效率的提高

在Fab臂交换中，将2种同源抗体在还原剂存在下混合，所生成的4个抗体分子单臂(称为半分子或HL分子、由一个重链和一个轻链构成的分子)重新结合，由此产生双特异性抗体。由于HL分子的重新结合随机发生，因此在理论上目标双特异性抗体仅获得体系中所存在的所有抗体量的50%。但是，通过对2种同源抗体预先导入不同的电荷，所生成的HL分子同伴重新结合时，异源2聚化较同源2聚化优先地发生，由此可以高效率地制作双特异性抗体。于是，使用WO2006/106905中报道的控制抗体CH3区中的缔合界面的改变(利用CH3区的电荷的相互作用和排斥使2种H链异源缔合化的改变)，验证了Fab臂交换的反应效率(双特异性抗体生成率)是否提高。

抗体H链可变区使用了WO2009/125825中公开的作为抗人白细胞介素6受体的抗体的H链可变区的WT(H)(SEQ ID NO: 1：以后记载为MRAH)和H54(SEQ ID NO: 2)。对于这些H链可变区，制作了作为抗体H链恒定区具有去除了人IgG1的H链恒定区的C末端的Gly和Lys的G1d的MRAH-G1d(SEQ ID NO: 3)和H54-G1d(SEQ ID NO: 4)、以及具有去除了人IgG4的H链恒定区的C末端的Gly和Lys的wtG4d的MRAH-wtG4d(SEQ ID NO: 5)和H54-wtG4d(SEQ IDNO: 6)。接着，制作了将P228S和K409R的改变导入到MRAH-G1d和H54-G1d以成为IgG4型的铰链序列、CH3结构域序列的MRAH-G1dsr(SEQ ID NO: 7)、H54-G1dsr(SEQ ID NO: 8)。并且，作为控制缔合界面的改变，制作了将D356K导入到MRAH-G1dsr的MRAH-G1dsrP1(SEQ ID NO:9)、将K439E导入到H54-G1dsr的H54-G1dsrN1(SEQ ID NO: 10)、将E356K导入到MRAH-wtG4d的MRAH-wtG4dP1(SEQ ID NO: 11)、将K439E导到H54-wtG4d的H54-wtG4dN1(SEQ ID NO:12)。H链可变区为MRAH时使用MRAL-k0(SEQ ID NO: 13)作为抗体L链、H链可变区为H54时使用L28-k0(SEQ ID NO: 14)作为抗体L链。按照参考例1的方法，将MRAH-G1dsr/MRAL-k0、H54-G1dsr/L28-k0、MRAH-G1dsrP1/MRAL-k0、H54-G1dsrN1/L28-k0、MRAH-wtG4d/MRAL-k0、H54-wtG4d/L28-k0、MRAH-wtG4dP1/MRAL-k0、H54-wtG4dN1/L28-k0表达并进行了纯化。

接着，将所得的2种同聚体按照下示的组合进行混合，按照参考例2的方法评价了反应产物。

(1) MRAH-wtG4d/MRAL-k0与H54-wtG4d/L28-k0

(2) MRAH-wtG4dP1/MRAL-k0与H54-wtG4dN1/L28-k0

(3) MRAH-G1dsr/MRAL-k0与H54-G1dsr/L28-k0

(4) MRAH-G1dsrP1/MRAL-k0与H54-G1dsrN1/L28-k0

反应条件： PBS(Sigma, pH7.4)中，[各mAb] = 0.2 mg/ml，[GSH(Sigma)] = 0.5mM，0.05% Tween 20 (Junsei)，37℃、24小时。

由于在本研究中使用的二种抗体可变区MRAH/MRAL和H54/L28的pI明显不同，因此容易通过离子交换层析分离各同聚体和所生成的双特异性抗体所对应的峰，可以评价反应效率。图1是通过离子交换层析评价反应产物的结果。未导入控制缔合界面的改变的MRAH-wtG4d/MRAL-k0与H54-wtG4d/L28-k0反应而得的wtG4d、或者MRAH-G1dsr/MRAL-k0与H54-G1dsr/L28-k0反应而得的G1dsr的双特异性抗体生成率分别为50.5%、52.7%。而导入了控制缔合界面的改变的MRAH-wtG4dP1/MRAL-k0与H54-wtG4dN1/L28-k0反应而得的wtG4dP1/N1的双特异性抗体生成率为99.0%，且MRAH-G1dsrP1/MRAL-k0与H54-G1dsrN1/L28-k0反应而得的G1dsrP1/N1的双特异性抗体生成率为98.5%，明确了以极高的效率生成了双特异性抗体。根据以上的结果，通过将WO2006/106905中报道的导入有控制缔合界面的改变的2种同聚体在还原剂存在下进行混合，显示出能够以极高的效率制作双特异性抗体。

[实施例2] 具有人天然型IgG1的铰链序列的同聚体中的Fab臂交换

在实施例1中，为了将铰链区的序列制成天然型人IgG4型，将P228S改变导入到IgG1，进行了Fab臂交换。但是，报道了给予到生物体内的天然型IgG4与内源性IgG4引起半分子交换。而且，报道了其原因在于：Ser位于铰链区中EU编号228位，通过将该氨基酸取代为IgG1型的Pro稳定性提高，在生物体内不引起交换(Labrijn AF等人, Nat. Biotechnol.2009, 27, 767-771)。因此在考虑给予到生物体内时，所制作的双特异性抗体的铰链序列希望为226C-227P-228P-229C。于是，在本研究中，通过导入控制缔合界面的改变，验证了天然型人IgG1的铰链序列是否有效引起Fab臂交换。

首先，制作了将K409R和D356K导入到MRAH-G1d的MRAH-G1drP1(SEQ ID NO: 15)、将K409R和K439E导入到H54-G1d的H54-G1drN1(SEQ ID NO: 16)。H链可变区为MRAH时使用MRAL-k0作为抗体L链、H链可变区为H54时使用L28-k0作为抗体L链，按照参考例1的方法将MRAH-G1drP1/MRAL-k0、H54-G1drN1/L28-k0表达并进行了纯化。接着，将所得的2种同聚体在以下的反应条件下进行混合，按照参考例2的方法评价了反应产物。

反应条件： TBS(Takara, pH7.6)中，[各mAb] = 0.2 mg/ml，0.05% Tween 20(Junsei)，37℃、24小时。还原剂在[GSH(Sigma)] = 0.5 mM或5 mM或[2-MEA(Sigma)] = 25mM的3种条件下进行了研究。

将按照参考例2的方法分析反应产物的结果示于图2中。在与实施例1相同的GSH(0.5 mM)的条件下，双特异性抗体生成率为21.8%，与EU编号228位的氨基酸残基为Ser时比较，效率大幅降低。但是，在2-MEA(25 mM)和GSH(5 mM)的还原条件下，双特异性抗体的生成率为99%以上。根据以上的结果，明确了：即使铰链的序列为人天然型IgG1的序列，通过导入控制缔合界面的改变，采用适当的还原条件，也可以高效率地制作双特异性抗体。

[实施例3] 使用人天然型IgG1的CH3进行的Fab臂交换

在目前为止的研究中，通过对人IgG1导入使CH3为IgG4型的K409R改变和控制缔合界面的改变(D356K和K439E)来进行Fab臂交换，显示出以极高的高效率获得目标双特异性抗体。

另一方面，已知若409位的氨基酸残基为Arg，则抗体在酸性条件下的稳定性降低(WO/2009/041613)。在抗体药物的制备中，将抗体暴露于酸性条件下的病毒灭活步骤是必需的，此时为了确保抗体的品质，希望抗体在酸性条件下的稳定性高。因此，不希望409位的氨基酸残基为Arg。另一方面认为：被报道可以有效引起Fab臂交换反应的改变使用K409R的改变，由于409位的氨基酸残基为Arg，因此有可能存在酸性条件下的稳定性问题。于是，接下来，对于不含K409R改变的完全人天然型IgG1的抗体，仅导入WO2006/106905中报道的控制缔合界面的改变，验证了是否引起Fab臂交换。

将所研究的控制缔合界面的改变的组合示于表1中。

[表1]

H链可变区为MRAH时使用MRAL-k0作为抗体L链；H链可变区为H54时使用L28-k0作为抗体L链。按照参考例1的方法，将MRAH-G1dP1/MRAL-k0、H54-G1dN1/L28-k0、MRAH-G1dP3/MRAL-k0、H54-G1dN3/L28-k0、MRAH-G1dP4/MRAL-k0、H54-G1dN4/L28-k0、MRAH-G1dP5/MRAL-k0、H54-G1dN5/L28-k0、MRAH-G1dP6/MRAL-k0、H54-G1dN6/L28-k0表达并进行了纯化。

(1) MRAH-G1dP1/MRAL-k0与H54-G1dN1/L28-k0

(2) MRAH-G1dP3/MRAL-k0与H54-G1dN3/L28-k0

(3) MRAH-G1dP4/MRAL-k0与H54-G1dN4/L28-k0

(4) MRAH-G1dP5/MRAL-k0与H54-G1dN5/L28-k0

(5) MRAH-G1dP6/MRAL-k0与H54-G1dN6/L28-k0

反应条件： TBS(Takara, pH7.6)中，[各mAb] = 0.2 mg/ml，0.05% Tween 20(Junsei)，[GSH(Sigma)] = 5 mM，37℃、24小时。

将所得的结果示于表2中。

[表2]

表中的“简称”是显示反应中所用的同聚体的组合的简称。例如，简称为G1dP1/N1时，显示使MRAH-G1dP1/MRAL-k0与H54-G1dN1/L28-k0反应。而且，“所用MoAb1的H链恒定区名称”是显示具有MRAH可变区的抗体的恒定区名称，“所用MoAb2的H链恒定区名称”是显示具有H54可变区的抗体的恒定区名称。“导入的改变”显示对MRAH-G1d或H54-G1d导入的改变。

在一方的同聚体中导入有D356K、另一方的同聚体中导入有K439E的G1dP1/N1中，双特异性抗体生成率为1.7%。图2中，在相同反应条件下(5mM GSH)，具有K409R改变和控制缔合界面的改变(D356K和K439E)的G1drP1/N1的双特异性抗体生成率为99.3%，相对于此，EU编号409位的氨基酸残基为Lys的G1dP1/N1显示出反应效率大幅降低。但是，一方的同聚体中导入有控制缔合界面的改变D399K、另一方的同聚体中导入有K409D的G1dP3/N3，一方的同聚体中导入有D356K/D399K、另一方的同聚体中导入有K409D/K439E的G1dP5/N5，分别显示出93.4%、98.1%的非常高的双特异性抗体生成率。因此显示，通过不使用使CH3结构域为IgG4型的K409R改变、仅使用控制缔合界面的改变，可以高效率地引起Fab臂交换。

接着，对于反应效率高的G1dP3/N3和G1dP5/N5，在3种还原条件下比较了反应效率。此时，作为比较对象，还对实施例2中使用的G1drP1/N1和作为通过Fab臂交换而制作有效的双特异性抗体的改变的由Labrijn等人报道的一方的抗体中导入有K409R、另一方的同聚体中导入有F405L的改变体的组合进行了验证(Labrijn AF等人, Proc. Natl., Acad.Sci., 2013. 110. 5145-5150)。

制作了对MRAH-G1d导入有K409R的MRAH-G1dr(SEQ ID NO: 27)、对H54-G1d导入有F405L的H54-G1dl(SEQ ID NO: 28)。H链可变区为MRAH时使用MRAL-k0作为抗体L链、H链可变区为H54时使用L28-k0作为抗体L链。按照参考例1的方法将MRAH-G1drP1/MRAL-k0、H54-G1drN1/L28-k0、MRAH-G1dP3/MRAL-k0、H54-G1dN3/L28-k0、MRAH-G1dP5/MRAL-k0、H54-G1dN5/L28-k0、MRAH-G1dr/MRAL-k0、H54-G1dl/L28-k0表达并进行了纯化。

(1) MRAH-G1drP1/MRAL-k0与H54-G1drN1/L28-k0

(2) MRAH-G1dP3/MRAL-k0与H54-G1dN3/L28-k0

(3) MRAH-G1dP5/MRAL-k0与H54-G1dN5/L28-k0

(4) MRAH-G1dr/MRAL-k0与H54-G1dl/L28-k0

将所得的结果示于表3中。

[表3]

表中的“简称”是显示反应中所用的同聚体的组合的简称。例如，简称为G1dP1/N1时，显示将MRAH-G1dP1/MRAL-k0与H54-G1dN1/L28-k0反应。而且，“所用MoAb1的H链恒定区名称”是显示具有MRAH可变区的抗体的恒定区名称，“所用MoAb2的H链恒定区名称”是显示具有H54可变区的抗体的恒定区名称。“导入的改变”显示对MRAH-G1d或H54-G1d导入的改变。

在5mM GSH的还原条件下，使用由Labrijn等人报道的现有的提高Fab臂交换效率的改变的G1dr/l的双特异性抗体生成率为87.3%。此时，一方的同聚体中导入有D399K、另一方的同聚体中导入有K409D的G1dP3/N3为85.2%，一方的同聚体中导入有D356K/D399K、另一方的同聚体中导入有K409D/K439E的G1dP5/N5为99.1%。而且，除了IgG4型的K409R改变之外，一方的同聚体中具有D356K、另一方的同聚体中具有K439E的G1drP1/N1的双特异性抗体生成率为99.3%。

在25mM 2MEA的还原条件下，使用由Labrijn等人报道的现有的提高Fab臂交换效率的改变的G1dr/l的双特异性抗体生成率为95.6%。此时，一方的同聚体中导入有D399K、另一方的同聚体中导入有K409D的G1dP3/N3为92.8%，一方的同聚体中导入有D356K/D399K、另一方的同聚体中导入有K409D/K439E的G1dP5/N5为100%，而且，除了IgG4型的K409R改变之外，一方的同聚体中具有D356K、另一方的同聚体中具有K439E的G1drP1/N1的双特异性抗体生成率为99.7%。

在0.5mM GSH的还原条件下，使用现有的提高Fab臂交换效率的改变的G1dr/l的双特异性抗体生成率为9.5%。此时，一方的同聚体中导入有D399K、另一方的同聚体中导入有K409D的G1dP3/N3为4.8%，一方的同聚体中导入有D356K/D399K、另一方的同聚体中导入有K409D/K439E的G1dP5/N5为75.4%，而且，除了IgG4型的K409R改变之外，一方的同聚体中具有D356K、另一方的同聚体中具有K439E的G1drP1/N1的双特异性抗体生成率为21.8%，与其它还原条件比较，均大幅降低。

根据以上的结果明确了：在任一种的反应条件下，一方的同聚体中导入有D356K/D399K、另一方的同聚体中导入有K409D/K439E的G1dP5/N5相比由Labrijn等人报道的现有的提高Fab臂交换效率的改变，均显示出高的双特异性抗体生成率。高的双特异性抗体生成率在实际作为药物的双特异性抗体的制备中非常重要，因此认为本改变与现有的改变比较，有用性高。

[实施例4] 利用CH3结构域不稳定化改变开发高效率的Fab臂交换

在目前为止的实施例中，显示出：利用控制缔合界面的改变，对各同聚体导入不同的电荷，由此使因还原剂而产生的半分子优先地与来自不同的同聚体的半分子结合，以高效率生成双特异性抗体。另一方面，报道了：在通过Fab臂交换生成双特异性抗体的过程中，用还原剂开裂2种同聚体之后，CH3结构域解离而产生半分子(HL分子)的过程成为速控步骤(Rispens T等人, J. Am. Chem. Soc., 2011. 133. 10302-10311)。即，只要通过使各同聚体的CH3结构域适当地不稳定化而能够促进CH3结构域的解离，就可以期待能够更有效地引起Fab臂交换。于是，首先评价了表2、表3所示的在5 mM GSH存在下的双特异性抗体生成率与各同聚体的CH3结构域的稳定性的关系。CH3结构域的稳定性，以按照参考例3的方法测定的Tm(热变性中间温度)为指标。

将双特异性抗体生成率与所用的二种同聚体中CH3的Tm高者的值的关系示于图3中。在双特异性抗体生成率低的G1dP1/N1或G1dP4/N4中，CH3的Tm为76℃以上、较高，而反应效率高的G1dP5/N5、G1dP3/N3、G1drP1/N1中，同聚体的CH3的Tm分别为65.1℃、69.6℃、69.5℃。以上的结果显示出：Fab臂交换中的双特异性抗体生成率与同聚体的CH3的稳定性呈现显著相关。而且，显示出：为了实现高的反应效率，优选使CH3区的稳定性变为不稳定，而使得所用的二种同聚体中较稳定一方的同聚体的CH3的Tm低于70℃等。在此，在相同条件下测定的具有天然型人IgG1的序列的MRAH-G1d/MRAL-k0的CH3区的Tm为83.6℃，因此明确了：为了在Fab臂交换中实现高的反应效率，有必要使CH3区的稳定性变为不稳定，而使得来自天然型人IgG1的CH3区的Tm降低例如13℃以上。

于是，接着，对通过使所用的同聚体的CH3结构域的Tm降低是否提高双特异性抗体生成率进行了研究。作为使CH3的稳定性降低的改变，使用了作为IgG2型的改变的V397M。有报道称：在IgG2中EU编号397位的氨基酸残基为Met，通过导入将该氨基酸取代为IgG1型的Val的改变，来提高CH3区的稳定性(Tm) (WO2009/041613)。因此期待着：对于IgG1型的CH3结构域，导入V397M改变，由此使CH3结构域不稳定化，进而变得容易解离。

于是，对于表2中双特异性抗体生成率低的G1dP1/N1、G1dP4/N4、G1dP6/N6，研究了在两方的同聚体中导入有V397M改变的G1dP8/N8、G1dP9/N9、G1dP10/N10。具体而言，制作了对MRAH-G1dP1、MRAH-G1dP4、MRAH-G1dP6、H54-G1dN1、H54-G1dN4、H54-G1dN6导入有V397M的MRAH-G1dP8(SEQ ID NO: 29)、MRAH-G1dP9(SEQ ID NO: 30)、MRAH-G1dP10(SEQ ID NO:31)、H54-G1dN8(SEQ ID NO: 32)、H54-G1dN9(SEQ ID NO: 33)、H54-G1dN10(SEQ ID NO:34)。H链可变区为MRAH时使用MRAL-k0作为抗体L链，H链可变区为H54时使用L28-k0作为抗体L链，按照参考例1的方法，将MRAH-G1dP8/MRAL-k0、H54-G1dN8/L28-k0、MRAH-G1dP9/MRAL-k0、H54-G1dN9/L28-k0、MRAH-G1dP10/MRAL-k0、H54-G1dN10/L28-k0表达并进行了纯化。而且，按照参考例3的方法测定了所得抗体的Tm。

(1) MRAH-G1dP8/MRAL-k0与H54-G1dN8/L28-k0

(2) MRAH-G1dP9/MRAL-k0与H54-G1dN9/L28-k0

(3) MRAH-G1dP10/MRAL-k0与H54-G1dN10/L28-k0

(4) MRAH-G1dr/MRAL-k0与H54-G1dl/L28-k0

将所得的结果示于表4中。

[表4]

表中“MoAb1的CH3的Tm”显示具有MRAH的可变区的同聚体的CH3的Tm，“MoAb2的CH3的Tm”显示具有H54的可变区的同聚体的CH3的Tm。

在G1dP1/N1的两方的同聚体中导入有V397M改变的G1dP8/N8中，MoAb1的CH3的Tm降低6.6℃，为70.1℃，MoAb2的CH3的Tm降低4.2℃，为70.5℃，双特异性抗体由1.7%提高至73.2%。在G1dP4/N4的两方的同聚体中导入有V397M改变的G1dP9/N9中，MoAb1的CH3的Tm降低1.5℃，为67℃，MoAb2的CH3的Tm降低5.5℃，为71℃，双特异性抗体由4.4%提高至67.3%。在G1dP6/N6的两方的同聚体中导入有V397M改变的G1dP10/N10中，MoAb2的CH3的Tm未发生变化，而MoAb1的CH3的Tm降低2.2℃，为63.8℃，双特异性抗体由29.3%提高至96.9%。以上的结果显示出：加入V397M改变使同聚体的CH3的Tm降低，由此提高Fab臂交换中的双特异性抗体生成效率。而且，此时使用现有的提高Fab臂交换效率的改变的G1dr/l的双特异性抗体生成率为88.1%，因此G1dP10/N10显示出优于该G1dr/l的双特异性抗体生成率。

于是，接着，对于有效果的EU编号397位周边，导入期待更大的CH3不稳定化效果的改变，并且研究了双特异性抗体生成率是否提高。图4是使用报道的IgG1的X射线晶体结构分析数据(PDB:3DO3)，显示CH3结构域的EU编号397位周边的图。

首先，由于认为A链的D399与B链的K392之间发生静电相互作用，因此除了V397M改变之外，通过将K392取代为Asp或Glu，引起两个链的静电排斥，由此可以使两个链的相互作用更不稳定化。而且，通过将K392取代为侧链分支型的氨基酸，由于与M397的空间位阻，由此还可以期待使两个链的缔合更不稳定化。并且，通过将EU编号397位的氨基酸残基取代为体积更大的氨基酸，还可以期待相比V397M改变能够进一步抑制CH3的缔合。根据以上所述的观点，以MRAH-G1dP1和H54-G1dN1为基础，重新制作了表5所示的7种抗体H链基因。

[表5]

H链可变区为MRAH时使用MRAL-k0作为抗体L链，H链可变区为H54时使用L28-k0作为抗体L链。按照参考例1的方法，将MRAH-G1dP14/MRAL-k0、H54-G1dN14/L28-k0、MRAH-G1dP15/MRAL-k0、H54-G1dN15/L28-k0、MRAH-G1dP16/MRAL-k0、H54-G1dN16/L28-k0、MRAH-G1dP17/MRAL-k0、H54-G1dN17/L28-k0、MRAH-G1dP18/MRAL-k0、H54-G1dN18/L28-k0、MRAH-G1dP19/MRAL-k0、H54-G1dN19/L28-k0、MRAH-G1dP20/MRAL-k0、H54-G1dN20/L28-k0表达并进行了纯化。而且，按照参考例3的方法测定了所得抗体的Tm。

(1) MRAH-G1dP14/MRAL-k0与H54-G1dN14/L28-k0

(2) MRAH-G1dP15/MRAL-k0与H54-G1dN15/L28-k0

(3) MRAH-G1dP16/MRAL-k0与H54-G1dN16/L28-k0

(4) MRAH-G1dP17/MRAL-k0与H54-G1dN17/L28-k0 (5) MRAH-G1dP18/MRAL-k0与H54-G1dN18/L28-k0

(6) MRAH-G1dP19/MRAL-k0与H54-G1dN19/L28-k0

(7) MRAH-G1dP20/MRAL-k0与H54-G1dN20/L28-k0

(8) MRAH-G1dr/MRAL-k0与H54-G1dl/L28-k0

(9) MRAH-G1dP1/MRAL-k0与H54-G1dN1/L28-k0

(10) MRAH-G1dP8/MRAL-k0与H54-G1dN8/L28-k0

反应条件： TBS(Takara, pH7.6)中，[各mAb] = 0.2 mg/ml，0.05% Tween 20(Junsei)，[2-MEA(Sigma)] = 25 mM，37℃、24小时。

将所得的结果示于表6中。

[表6]

在将V397M改变导入到G1dP1/N1的两方的同聚体的G1dP8/N8中，双特异性抗体为73.2%，相对于此，在该两个链中导入有K392D的G1dP14/N14中为96.5%、导入有K392E的G1dP15/N15中为96.9%、导入有K392T的G1dP18/N18中为98.9%，大大提高了双特异性抗体生成率。而且，对于G1dP1/N1，代替V397M而导入有V397F的G1dP16/N16中为96.5%、导入有V397Y的G1dP17/N17中为98%，与V397M相比，提高了双特异性抗体生成率。认为这是由于：包含V397M的G1dP8/N8的MoAb1和MoAb2的CH3的Tm分别为70.1℃和70.5℃，相对于此，在G1dP16/N16中为69.1℃和69.7℃，在G1dP17/N17中为69.2℃和69.8℃，因此如所期待的那样，与V397M改变相比，减弱了同聚体的CH3结构域的相互作用，而使解离变得容易。此时，使用现有的提高Fab臂交换效率的改变的G1dr/l的双特异性抗体生成率为91.7%，G1dP14/N14、G1dP15/N15、G1dP16/N16、G1dP17/N17、G1dP18/N18，与该G1dr/l相比，显示出优异的双特异性抗体生成率。

考虑在药物制备中的应用性时，与现有的提高Fab臂交换效率的改变相比，双特异性抗体生成率高、异源成分少的G1dP16/N16(D356K/V397F和V397F/K439E)以及G1dP17/N17(D356K/V397Y和V397Y/K439E)极其有用。

而且，将在表3和表6中研究的改变体的CH3的稳定性、与使用25mM的2MEA作为还原剂时的双特异性抗体生成率的关系示于图5中。如图5所示，所用的同聚体的CH3的稳定性与Fab臂交换中的效率呈现显著相关，通过使CH3区的稳定性变为不稳定而使得所用的二种同聚体中CH3的稳定性较高一方的同聚体的Tm为低于70℃等，可以实现高的双特异性抗体生成率。

[实施例5] 反应时间的研究

使用实施例4中发现的G1dP17/N17研究了反应时间与反应效率的关系。

反应条件：TBS(Takara, pH7.6)中，[各mAb] = 1.0 mg/ml，[2-MEA(Sigma)] = 25mM，37℃、总量50μl。

在90分钟、3小时、24小时，向反应液中添加450μl冷却至4℃的25 mM MES缓冲液(pH5.0)，并保存于4℃，由此使反应停止。其后，按照参考例2的方法评价了反应效率(图6)。

如图6所示，G1dP17/N17的双特异性抗体生成率，在25mM 2-MEA存在下，在90分钟为94.6%、在3小时为95.2%、在24小时为97.4%，在90分钟的反应时间为约95%。根据该结果明确了：与一方链中导入有K409R改变、另一方链中导入有F405L改变的G1dr/l的双特异性抗体生成率相比(表6)，显示出充分高的反应效率。

[实施例6] 评价显示高效率的Fab臂交换的改变体与人FcgR和人FcRn的结合

对于实施例4中显示了高效率的FAE效率的改变体G1dP17/N17，实施了与人FcgR和人FcRn的结合评价。首先，按照参考例5的方法，实施了具有天然型IgG1序列的MRAH-G1d/MRAL-k0和Fab臂交换后的改变体MRAH-G1dP17/MRAL-k0//H54-G1dN17/L28-k0与人FcRn的结合。将与人FcRn的结合分析结果示于表7中。

[表7]

简称	对人FcRn的KD(M)
		G1d	2.1E-06
G1dP17/N17	1.9E-06

由表7所示的结果明确了：通过Fab臂交换而制作的改变体MRAH-G1dP17/MRAL-k0//H54-G1dN17/L28-k0，对于人FcRn，具有与天然型IgG1同等的结合活性。

接着，按照参考例4的方法评价了对人FcgR的结合活性。在此，除了具有天然型IgG1的序列的MRAH-G1d/MRAL-k0、Fab臂交换后的改变体MRAH-G1dP17/MRAL-k0//H54-G1dN17/L28-k0之外，还一并对Fab臂交换反应前的2种同聚体(MRAH-G1dP17/MRAL-k0和H54-G1dN17/L28-k0)和缺乏使CH3结构域不稳定化的改变的V397Y的2种同聚体(MRAH-G1dP1/MRAL-k0和H54-G1dN1/L28-k0)进行了评价。表8中，KD倍数hFcgRIa、KD倍数hFcgRIIaR、KD倍数hFcgRIIaH、KD倍数hFcgRIIb、KD倍数hFcgRIIIaV是显示将G1d对各FcgR的KD设为1时的各改变体的相对结合活性的值。

与天然型比较，Fab臂交换后的改变体G1dP17/N17与hFcgRIa的结合为1.1倍、与hFcgRIIaR的结合为2.7倍、与hFcgRIIaH的结合为2.3倍、与hFcgRIIb的结合为2.5倍、与hFcgRIIIaV的结合为2.5倍，均得到增强。在此，在导入使CH3结构域不稳定化的V397Y之前的同聚体G1dP1和G1dN1中，对于各FcgR的结合均与天然型同等，而且在其中导入有V397Y的同聚体(G1dP17和G1dN17)中，对各FcgR的结合得到增强，因此明确：通过V397Y改变增强了与hFcgR的结合。

以上的结果显示出：实现高的Fab臂交换效率的G1dP17/N17，与天然型比较，不损及对人FcRn、人FcgR的结合。

[实施例7] 在培养上清中研究Fab臂交换

在通过Fab臂交换制备双特异性抗体中，假设将二种同聚体分别培养、纯化后进行Fab臂交换，但如果能够在培养上清中引起反应则可以省略同聚体的纯化步骤，因此非常有利。于是，将二种同聚体在培养上清中与还原剂一起混合，验证了是否以高效率引起Fab臂交换。

首先，分别制作了将MRAH-G1d和H54-G1d的356位的氨基酸残基取代为E、358位的氨基酸残基取代为M的MRAH-G1m(SEQ ID NO: 49)、H54-G1m(SEQ ID NO: 50)。接着，制作了对于MRAH-G1m导入有E356K和K409R的MRAH-G1mrP1(SEQ ID NO: 51)、对于H54-G1m导入有K439E和K409R的H54-G1mrN1(SEQ ID NO: 52)。H链可变区为MRAH时使用MRAL-k0作为抗体L链，H链可变区为H54时使用L28-k0作为抗体L链。按照参考例1的方法，将MRAH-G1mrP1/MRAL-k0、H54-G1mrN1/L28-k0表达并进行了纯化。

而且，将FreeStyle293细胞(Invitrogen)在FreeStyle 293 Expression medium(FreeStyle 293表达培养基)中培养后，进行离心，回收上清，用0.22μm的过滤膜进行过滤，将所得物作为MocK CM用于Fab臂交换。

反应条件： Mock CM(pH7.6)中，[各mAb] = 1.0 mg/ml，[2-MEA(Sigma)] = 25mM，37℃、90分钟。

向反应后的反应溶液中添加rProtein A Sepharose Fast Flow(GE Healthcare)进行纯化后，按照参考例2的方法评价了反应效率(图7)。

如图7所示，明确了：即使是在培养上清中，通过在25mM 2-MEA存在下于37℃反应90分钟，也以98%以上的反应效率生成了双特异性抗体。

[实施例8] 在小鼠IgG1中开发Fab臂交换

在目前为止的实施例中，显示出在人IgG1或人IgG4中可以有效引起Fab臂交换。接着，验证了在小鼠IgG1中是否也同样地通过Fab臂交换生成双特异性抗体。

根据报道的晶体结构(Harris LJ等人, J. Mol. Biol., 1998. 275. 861-872)，推测出EU编号399位的D和409位的K有助于CH3结构域的链间相互作用(图8)。于是，向该位点导入与人IgG1同样地用于促进异源二聚化的电荷，验证了是否引起Fab臂交换。

抗体H链可变区使用了WO2009/125825中公开的作为抗人白细胞介素6受体的抗体的H链可变区的WT(H)(SEQ ID NO: 1：以后记载为MRAH)和H54(SEQ ID NO: 2)。对于这些H链可变区，制作了作为抗体H链恒定区具有小鼠IgG1的H链恒定区的MRAH-mIgG1(SEQ IDNO: 53)和H54-mIgG1(SEQ ID NO: 54)。并且，作为控制缔合界面的改变，制作了在MRAH-mIgG1中导入有D399K的MRAH-mIgG1mP3(SEQ ID NO: 55)、导入有D399R的MRAH-mIgG1mP4(SEQ ID NO: 56)，在H54-mIgG1中导入有K409D的H54-mIgG1mN3(SEQ ID NO: 57)、导入有K409E的H54-mIgG1mN4(SEQ ID NO: 58)。作为L链，制作了具有小鼠κ链恒定区的序列的MRAL-mk1(SEQ ID NO: 59)和L28-mk1(SEQ ID NO: 60)，H链可变区为MRAH时使用MRAL-mk1作为抗体L链，H链可变区为H54时使用L28-mk1作为抗体L链。按照参考例1的方法，将MRAH-mIgG1mP3/MRAL-mk1、MRAH-mIgG1mP4/MRAL-mk1、H54-mIgG1mN3/L28-mk1、H54-mIgG1mN4/L28-mk1表达并进行了纯化。

接着，按照以下的组合实施了Fab臂交换。

(1) MRAH-mIgG1mP3/MRAL-mk1与H54-mIgG1mN3/L28-mk1

(2) MRAH-mIgG1mP4/MRAL-mk1与H54-mIgG1mN4/L28-mk1

反应条件： TBS(Takara, pH7.6)中，[各mAb] = 2 mg/ml，[2-MEA(Sigma)] = 25mM，37℃、19小时。

反应后，按照参考例5的方法，利用CE-IEF确定了反应效率(图9)。

其结果，确认了： MRAH-mIgG1mP3/MRAL-mk1与H54-mIgG1mN3/L28-mk1反应时为89.2%，MRAH-mIgG1mP4/MRAL-mk1与H54-mIgG1mN4/L28-mk1反应时为89.9%，均以较高的效率生成了双特异性抗体。与使用人IgG1或人IgG4的Fab臂交换比较，反应效率略有降低，这可以预想是由于：在小鼠IgG1中铰链区存在3个二硫键，相比人IgG1或人IgG4的铰链，使二个重链更牢固地结合(Harris LJ等人, J. Mol. Biol., 1998. 275. 861-872)。

[实施例9] 评价通过小鼠IgG1的Fab臂交换制作的双特异性抗体对小鼠FcgR和小鼠FcRn的结合活性

按照参考例4-3，评价了通过小鼠IgG型Fab臂交换制作的2种双特异性抗体(MRAH-mIgG1mP3/MRAL-mk1//H54-mIgG1mN3/L28-mk1和

MRAH-mIgG1mP4/MRAL-mk1//H54-mIgG1mN4/L28-mk1)与小鼠FcgR和小鼠FcRn的结合。而且，按照参考例1制作了MRAH-mIgG1/MRAL-mk1，作为比较对象进行了测定。将测定结果示于表9中。

[表9]

所制作的二种双特异性抗体均显示出与天然型mIgG1同样的结合谱。具体而言，未与mFcgRI和mFcgRIV结合，对于mFcgRII和mFcgRIII，与天然型mIgG1比较，显示出1.2倍的结合活性。

其次，按照参考例4-4，将评价与mFcRn结合的结果示于表10中。

[表10]

所制作的二种双特异性抗体均显示出对于mFcRn维持与天然型mIgG1同等的结合。

[实施例10] 细胞毒活性的测定

通过测定抗人磷脂酰肌醇蛋白聚糖3和抗人CD3的双特异性抗体的细胞毒活性，对通过Fab臂交换制作的人IgG型双特异性抗体、小鼠IgG型双特异性抗体是否维持与通过现有方法制作的双特异性抗体同等的功能进行了评价。首先，作为对照，通过由Schaefer等人报道的CrossMab技术(Proc Natl Acad Sci, 2011, 108, 11187-11192)制作了具有人IgG4的恒定区的抗人GPC3/抗人CD3双特异性抗体。通过CrossMab技术制作的该分子是WO2012/073985中记载的对人GPC3的Fab的VH结构域和VL结构域被取代了的分子。而且，在抗体H链恒定区中，为了促进异源缔合，使用了Knobs-into-Holes技术。Knobs-into-Holes技术是通过将存在于一方H链的CH3区的氨基酸侧链取代为更大的侧链(Knob; 突起)、将存在于另一方H链的CH3区的氨基酸侧链取代为更小的侧链(Hole; 空隙)，使突起配置在空隙内，促进H链的异源二聚化，由此可以有效获取目标异源二聚化抗体的技术(Nature, 1994,372, 379-383)。而且，作为使对FcgR的结合减弱的改变，使用了WO2011/108714中记载的改变。具体而言，导入了将EU编号234位、235位、297位的氨基酸残基取代为Ala的改变。从抗体H链的C末端去除EU编号446位的Gly和447位的Lys，对于该序列，为了进一步使抗体表达后的纯化变得容易，在抗人GPC3侧的H链的C末端添加了组氨酸标签、在抗人CD3侧的H链的C末端添加了FLAG标签。作为导入了以上改变的抗人GPC3侧H链，制作了GC33(2)H-G4dKnHS(SEQID NO: 61)。而且，作为抗人CD3侧的H链，制作了rCE115H-G4dHlFS(SEQ ID NO: 62)。作为抗体L链，使用GC33(2)L-k0(SEQ ID NO: 63) 作为抗人GPC3侧、使用rCE115L-k0(SEQ IDNO: 64)作为抗人CD3侧。对于这些抗体的表达，按照参考例1，使其在FreeStyle293细胞中瞬时表达。将所得的培养上清添加到MabSelect SuRe柱(GE Healthcare公司)中，洗涤该柱后，实施了利用50 mM乙酸进行的洗脱。将包含抗体的组分添加到HisTrap HP柱(GEHealthcare公司)或Ni Sepharose FF柱(GE Healthcare公司)中，洗涤该柱后，实施了利用咪唑进行的洗脱。包含抗体的组分利用超滤膜进行浓缩后，将浓缩液添加到Superdex 200柱(GE Healthcare公司)中，通过仅回收该洗脱液的单体的抗体，获得了纯化抗体GPC3ERY22-rCE115。

接着，通过Fab臂交换制作了具有人IgG1型、人IgG4型、小鼠IgG1型的恒定区、可变区为抗人GPC3/抗人CD3的双特异性抗体。在人IgG1型和人IgG4型的H链恒定区中，对于包含用于Fab臂交换的改变的G1dP17、G1dN17、G1drP1、G1drN1、G4dP1、G4dN1，分别制作了作为FcgR结合降低的改变导入有将EU编号235位的氨基酸残基取代为Arg、239位的氨基酸残基取代为Lys的改变的F760P17、F760N17、F760G1drP1、F760G1drN1、F760G4dP1、F760G4dN1。在小鼠IgG1型的H链恒定区中，对于实施例8中使用的mIgG1mP4、mIgG1mN4，制作了作为FcgR结合降低的改变导入有将EU编号235位、239位的氨基酸残基取代为Lys的改变的mF18mP4、mF18mN4。使用WO2012/073985中记载的抗人GPC3的序列作为可变区，制作了H0000-F760N17(SEQ ID NO: 65)、H0000-F760G1drN1(SEQ ID NO: 66)、H0000-F760G4dN1(SEQ ID NO:67)、H0000-mF18mN4(SEQ ID NO: 68)。另一方面，作为人CD3侧H链，制作了rCE115H-F760P17(SEQ ID NO: 69)、rCE115H-F760G1drP1(SEQ ID NO: 70)、rCE115H-F760G4dP1(SEQ ID NO: 71)、rCE115H-mF18mP4(SEQ ID NO: 72)。作为人IgG1型和人IgG4型的抗体L链，共同使用GL4-k0(SEQ ID NO: 79)作为抗人GPC3侧、rCE115L-k0(SEQ ID NO: 64)作为抗人CD3侧。而且，作为小鼠IgG1型的抗体L链，使用GL4-mk1(SEQ ID NO: 80)作为抗人GPC3侧、使用rCE115L-mk1(SEQ ID NO: 81)作为抗人CD3侧。将这些同聚体按照参考例1的方法进行表达并纯化，获得了rCE115H-F760P17/rCE115L-k0、H0000-F760N17/GL4-k0、rCE115H-F760G1drP1/rCE115L-k0、H0000-F760G1drN1/GL4-k0、rCE115H-F760G4dP1/rCE115L-k0、H0000-F760G4dN1/GL4-k0、rCE115H-mF18mP4/rCE115L-mk1、H0000-mF18mP4/GL4-mk1。

接着，将所得的2种同聚体按照下示的组合进行混合，引起了FAE反应。

(1) rCE115H-F760P17/rCE115L-k0与H0000-F760N17/GL4-k0

(2) rCE115H-F760G1drP1/rCE115L-k0与H0000-F760G1drN1/GL4-k0

(3) rCE115H-F760G4dP1/rCE115L-k0与H0000-F760G4dN1/GL4-k0

(4) rCE115H-mF18mP4/rCE115L-mk1与H0000-mF18mP4/GL4-mk1

反应条件：TBS(Takara, pH7.6)中，[各mAb] = 0.36 mg/ml，[2-MEA(Sigma)] =25 mM，37℃、18小时。

将反应后的产物在PBS中透析，并用于细胞毒活性的评价。

细胞毒活性的评价通过参考例6中记载的方法进行了实施。将结果示于图10-1、图10-2中。

如图10-1所示，通过人IgG1型和人IgG4型的Fab臂交换制作的双特异性抗体均显示出与通过现有的双特异性抗体制作技术制作的对照抗体(GPC3 ERY22-rCE115)同等的细胞毒活性。而且，如图10-2所示，通过小鼠IgG型Fab臂交换制作的双特异性抗体也显示出与通过现有的双特异性抗体制作技术制作的对照抗体(GPC3 ERY22-rCE115)同等的细胞毒活性。

[实施例11] 正常小鼠PK试验

(11-1) 使用正常小鼠进行的体内试验

对于通过人IgG型和小鼠IgG型Fab臂交换制作的抗体与通过现有方法制作的抗体是否显示同等的血中浓度变化，通过使用正常小鼠进行的体内试验进行了评价。

作为人IgG型抗体，通过人IgG型Fab臂交换制作了3种抗人磷脂酰肌醇蛋白聚糖3/抗人CD3双特异性抗体：TR-G1drP1/N1、TR-G1dP17/N17、TR-G4dP1/N1。而且，作为对照抗体，使用了如下制作的双特异性抗体TR-G1dKiH、TR-G4dKiH，其中，可变区与上述同样，具有抗人磷脂酰肌醇蛋白聚糖3/抗人CD3，作为恒定区，对于自MRAH-G1d(SEQ ID NO: 3)的EU编号118位的Ala开始的恒定区G1d和恒定区G4d(自MRAH-wtG4d(SEQ ID NO: 5)的EU编号118位的Ala开始的恒定区wtG4d，且进一步将228位的氨基酸残基由Ser取代为Pro而作为IgG1型的铰链而得)，导入Knobs-into-Holes改变(Nature, 1994, 372, 379-383)。在此，恒定区名称G1dKiH和G4dKiH是指，使用对于恒定区G1d或G4d导入有Knob改变(将349位的氨基酸残基取代为Cys、366位的氨基酸残基取代为Trp的改变)的Knob链和对于G1d或G4d导入有Hole改变(将356位的氨基酸残基取代为Cys、366位的氨基酸残基取代为Ser、368位的氨基酸残基取代为Ala、407位的氨基酸残基取代为Val的改变)的Hole链，显示以各Knob链和Hole链的组合表达的恒定区。

另一方面，作为小鼠IgG型抗体，制作了对于WO2009/125825中记载的具有作为抗人IL-6受体抗体的H链可变区的H237的序列、恒定区为天然型mIgG1的序列的H237-mIgG1(SEQ ID NO: 73)，导入有用于Fab臂交换的改变的H237-mIgG1mP3(SEQ ID NO: 74)、H237-mIgG1mN3(SEQ ID NO: 75)、H237-mIgG1mP4(SEQ ID NO: 76)、H237-mIgG1mN4(SEQ ID NO:77)。作为抗体L链，使用了由作为抗人IL-6受体L链可变区的L104的序列和作为小鼠κ链的恒定区的mk1构成的L104-mk1(SEQ ID NO: 78)。按照参考例1的方法进行表达，获得了H237-mIgG1mP3/L104-mk1、H237-mIgG1mN3/L104-mk1、H237-mIgG1mP4/L104-mk1、H237-mIgG1mN4/L104-mk1。使用所得的同聚体进行Fab臂交换，获得了SA-mIgG1mP3/mN3(H237-mIgG1mP3/L104-mk1与H237-mIgG1mN3/L104-mk1的组合)、SA-mIgG1mP4/mN4(H237-mIgG1mP4/L104-mk1与H237-mIgG1mN4/L104-mk1的组合)。而且，作为对照抗体，使用了用H237-mIgG1和L104-mk1表达的SA-mIgG1。

Fab臂交换均在以下的反应条件下进行，反应后用PBS透析，用于体内试验。

反应条件： TBS(Takara, pH7.6)中，[各mAb] = 0.225 mg/ml，[2-MEA(Sigma)] =25 mM，37℃、17小时。

对正常小鼠(C57BL/6J小鼠，Charles River Japan)给予人IgG型抗人磷脂酰肌醇蛋白聚糖3/抗人CD3双特异性抗体(TR-G1dKiH、TR-G1drP1/N1、TR-G1dP17/N17、TR-G4dKiH、TR-G4dP1/N1)、抗人IL-6受体小鼠抗体(SA-mIgG1、SA-mIgG1mP3/mN3和SA-mIgG1mP4/mN4)后，评价了各抗体的体内动力学。抗体被调制为0.1mg/mL，将调制物以10 mL/kg给予尾静脉。抗体给予后经过5分钟、2小时、1天、2天、3天、7天、14天、21天、28天后，自该小鼠采血。将采集的血液立即在4℃、15,000rpm下进行15分钟离心，由此得到血浆。分离的血浆直到实施测定为止保存在设定为-20℃以下的冰箱中。

(11-2) 利用ECLIA法测定血浆中的双特异性抗体浓度

小鼠血浆中的双特异性抗体浓度利用ECLIA法进行了测定。首先，将可溶型人磷脂酰肌醇蛋白聚糖3分注到MULTI - ARRAY 96孔板(Meso Scale Discovery)中，在4℃下静止一夜，由此制作了可溶型人磷脂酰肌醇蛋白聚糖3固定板。调制了包含血浆中浓度为200、100、50、25、12.5、6.25、3.125 ng/mL的双特异性抗体的校准曲线试样和经100倍以上稀释的小鼠血浆测定试样。将这些校准曲线试样和血浆测定试样100μL分注到各孔中而得的可溶型人磷脂酰肌醇蛋白聚糖3固定板在室温下搅拌了2小时。接下来，将针对抗人CD3抗体的兔型独特型抗体在室温下搅拌了1小时。然后，使抗兔IgG-磺基标签抗体(Meso ScaleDiscovery)在室温下反应1小时，添加读数缓冲液T (Read Buffer T，Meso ScaleDiscovery)后的发光通过SECTOR成像仪2400 (SECTOR Imager 2400，Meso ScaleDiscovery)进行了测定。小鼠血浆中的抗体浓度根据校准曲线的发光信号使用分析软件SOFTmax PRO(Molecular Devices)进行了计算。将其结果示于图11中。而且，将PK参数示于表11中。根据图11和表11所示的结果明确了：通过人IgG型Fab臂交换制作的双特异性抗体均显示出与使用现有的双特异性抗体制作技术Knobs-into-Holes技术制作的对照抗体同等的血中浓度变化。

[表11]

简称	t1/2 (天)	CL (mL/天/kg)	Vss (mL/kg)
				TR-G1dKiH	17	3.49	84.5
TR-G1drP1/N1	15.3	3.98	83.5
				TR-G1dP17/N17	16.9	3.05	71.5
TR-G4dKiH	19.5	3.05	84.9
				TR-G4dP1/N1	23.7	2.22	73.5

(11-3) 利用ELISA法测定血浆中的抗人IL-6受体小鼠抗体浓度

小鼠血浆中的抗人IL-6受体小鼠抗体浓度利用ELISA法进行了测定。首先，将可溶型人IL-6受体分注到Nunc-Immuno Plate, MaxiSoup(Nalge nunc International)中，在4℃下静止一夜，由此制作了可溶型人IL-6受体固定板。调制了包含血浆中浓度为2.50、1.25、0.625、0.313、0.156、0.078、0.039μg/mL的抗人IL-6受体小鼠抗体的校准曲线试样和经100倍以上稀释的小鼠血浆测定试样。将这些校准曲线试样和血浆测定试样100μL分注到各孔中而得的可溶型人IL-6受体固定板在室温下搅拌了2小时。然后，将抗小鼠IgG-过氧化物酶抗体(SIGMA)在室温下反应了2小时，使用TMB单一组分HRP微孔底物(BioFXLaboratories)作为底物进行了所得反应液的显色反应。通过添加1N-硫酸(ShowaChemical)使反应停止，利用酶标仪测定了各孔的反应液在450 nm下的吸光度。小鼠血浆中的抗体浓度根据校准曲线的吸光度使用分析软件SOFTmax PRO(Molecular Devices)进行了计算。将其结果示于图12中，将该抗体参数示于表12中。根据图12和表12所示的结果，明确了：通过小鼠IgG型Fab臂交换制作的抗体显示出与具有天然型mIgG1的序列的对照抗体同等的血中浓度变化。

[表12]

简称	t1/2 (天)	CL (mL/天/kg)	Vss (mL/kg)
				SA-mIgG1	12.8	5.13	98.7
SA- mIgG1mP3/mN3	16.6	3.7	86.7
				SA- mIgG1mP4/mN4	21.9	3.47	104

[参考例1] 制作抗体的表达载体和抗体的表达与纯化

编码抗体的H链和L链的核苷酸序列的全长基因的合成，使用装配PCR (AssemblePCR)等、利用本领域技术人员已知的方法进行了制作。氨基酸取代的导入使用PCR等通过本领域技术人员已知的方法进行。将所得的质粒片段插入到动物细胞表达载体，制作了H链表达载体和L链表达载体。所得表达载体的核苷酸序列利用本领域技术人员已知的方法进行了确定。将所制作的质粒瞬时地导入到来自人胚肾癌细胞的HEK293H株(Invitrogen公司)或FreeStyle293细胞(Invitrogen公司)中，进行了抗体的表达。回收所得的培养上清后，通过0.22μm过滤器MILLEX(R)-GV(Millipore)、或0.45μm过滤器MILLEX(R)-GV(Millipore)而获得培养上清。使用rProtein A Sepharose Fast Flow(GE Healthcare)或Protein GSepharose 4 Fast Flow(GE Healthcare)，利用本领域技术人员已知的方法从所得的培养上清中纯化抗体。对于纯化抗体的浓度，使用分光光度计测定在280 nm下的吸光度，由所得的值通过PACE等方法算出吸光系数，利用该吸光系数算出抗体浓度(Protein Science1995 ; 4 : 2411-2423)。

[参考例2] 通过离子交换层析评价双特异性抗体生成率

在使用Priminence UFLC(岛津制作所)的离子交换层析纯化法中，评价了各检样的分离。流动相使用25 mM MES缓冲液(pH5.0)以及包含500 mM氯化钠的25 mM MES缓冲液(pH5.0)，柱使用ProPac WCX-10 (Thermo Scientific)，通过双液混合梯度法分离了双特异性抗体。数据的获取在215 nm的波长下实施，使用Empower2(Waters)评价了洗脱结果。

双特异性抗体生成率(%)使用了：将双特异性抗体的面积值除以体系中存在的所有抗体的面积值再乘以100而得的值。当一方的同聚体的回收率差时，将另一方的同聚体的面积的2倍值与双特异性抗体的面积值合计，将所得的值作为所有抗体的面积值进行计算。

[参考例3] Tm的测定

CH3结构域的Tm的测定使用Rotor-gene Q(QIAGEN)按照本领域技术人员已知的方法来进行。将抗体浓度为0.1mg/mL、SYPRO橙(SYPRO orange)浓度以10X浓度混合而得的样本由30℃升温至99℃，每0.4℃测定荧光强度(激发波长470nm、荧光波长555nm)。测定在PBS(Sigma, pH7.4)中进行。分析使用Rotor-gene Q系列软件来进行，将通过荧光强度的一阶求导而求得的拐点作为Tm。对于MRAH的Tm，CH2为70℃付近、Fab为95℃付近，而对于H54的Tm，CH2为70℃付近、Fab为90℃付近，利用这点计算出CH3结构域的Tm。

[参考例4] 通过SPR分析相互作用

(4-1) FcγR的调制方法和改变抗体与FcγR的相互作用分析方法

通过以下的方法调制了FcγR的细胞外结构域。首先，通过本领域技术人员已知的方法实施了FcγR的细胞外结构域的基因合成。此时，各FcγR的序列，基于登录于NCBI的信息进行了制作。具体而言，FcγRI基于NCBI的检索号NM_000566.3的序列、FcγRIIa基于NCBI的检索号NM_001136219.1的序列、FcγRIIb基于NCBI的检索号NM_004001.3的序列、FcγRIIIa基于NCBI的检索号NM_001127593.1的序列、FcγRIIIb基于NCBI的检索号NM_000570.3的序列进行制作，在这些序列的C末端上添加了His标签。此外，已知FcγRIIa、FcγRIIIa、FcγRIIIb存在着多态性，FcγRIIa的多态性位点参考J. Exp. Med., 1990,172: 19-25、FcγRIIIa的多态性位点参考J. Clin. Invest., 1997, 100 (5): 1059-1070, FcγRIIIb的多态性位点参考J. Clin. Invest., 1989, 84, 1688-1691，进行了制作。

将所得基因片段插入到动物细胞表达载体中，制作了表达载体。将所制作的表达载体瞬时地导入到来自人胚肾癌细胞的FreeStyle293细胞(Invitrogen公司)中，使目标蛋白表达。进行培养、将所得培养上清回收后，通过0.22μm过滤器而获得培养上清。所得的培养上清原则上通过以下4个步骤进行纯化。第1步骤实施了阳离子交换柱层析(SPSepharose FF)、第2步骤实施了针对His标签的亲和柱层析(HisTrap HP)、第3步骤实施了凝胶过滤柱层析(Superdex200)、第4步骤实施了无菌过滤。其中，在FcγRI之际，第1步骤中实施了使用Q sepharose FF的阴离子交换柱层析。所纯化的蛋白使用分光光度计测定在280 nm下的吸光度，根据所得的值通过PACE等方法算出吸光系数，使用吸光系数计算出纯化蛋白的浓度(Protein Science 1995 ; 4 : 2411-2423)。

使用Biacore T100(GE Healthcare)、Biacore T200(GE Healthcare)、BiacoreA100、Biacore 4000，分析了各改变抗体与上述调制的Fcγ受体的相互作用。运行缓冲液使用HBS-EP+(GE Healthcare)，测定温度设为25℃。使用在S系列传感器芯片CM5(GEHealthcare)或S系列传感器芯片CM4(GE Healthcare)上通过胺偶联法使抗原肽、蛋白A(Thermo Scientific)、蛋白A/G(Thermo Scientific)、蛋白L(ACTIGEN或BioVision)固定而得的芯片，或者使预先生物素化的抗原肽与S系列传感器芯片SA(检定的)(GEHealthcare)相互作用而固定得到的芯片。

在这些传感器芯片上捕获目标抗体，并与用运行缓冲液稀释的Fcγ受体相互作用，测定抗体结合量，在抗体间进行了比较。其中，Fcγ受体的结合量依赖于捕获的抗体的量，因此比较了用各抗体的捕获量除以Fcγ受体的结合量而得的修正值。而且，通过与10mM甘氨酸-HCl(pH1.5)反应，对传感器芯片上捕获的抗体进行洗涤，使传感器芯片再生而重复使用。

而且，为了计算各改变抗体对FcγR的KD值，按照以下的方法实施了动力学分析。首先，在上述的传感器芯片上捕获目标抗体，使其与用运行缓冲液稀释的Fcγ受体相互作用，对于所得的传感图，利用Biacore 评价软件，将测定结果用1:1朗缪耳结合模型(Langmuir binding model)进行全局拟合，由此算出结合速率常数ka (L/mol/s)、解离速率常数kd(1/s)，根据其值计算出解离常数KD(mol/L)。

(4-2) FcRn的调制方法和改变抗体与FcRn的相互作用分析方法

FcRn是FcRn与β2-微球蛋白的复合物。基于所公布的人FcRn基因序列调制了寡DNA引物(J Exp Med. 1994 Dec 1; 180(6): 2377-81)。对于编码基因整体的DNA片段，使用所调制的引物和作为模板的人cDNA(Human Placenta Marathon-Ready cDNA, Clontech)，通过PCR进行了调制。将所得的DNA片段用作模板，通过PCR扩增编码含有信号区(Met1～Leu290)的细胞外结构域的DNA片段，并将其插入到哺乳动物细胞表达载体中。同样地，基于所公布的人β2-微球蛋白基因序列(Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99 (26): 16899-16903 (2002))调制了寡DNA引物。对于编码基因整体的DNA片段，使用所调制的引物和作为模板的人cDNA(Human Placenta Marathon-Ready cDNA, Clontech)，通过PCR进行了调制。将所得的DNA片段用作模板，通过PCR扩增编码含有信号区(Met1～Met119)的蛋白整体的DNA片段，并将其插入到哺乳动物细胞表达载体中。

按以下的程序表达可溶型人FcRn。用于表达人FcRn(SEQ ID NO: 30)和β2-微球蛋白(SEQ ID NO: 31)而构建质粒，通过使用PEI(Polyscience)的脂质转染法将其导入到来自人胚肾癌的细胞株HEK293H(Invitrogen)的细胞中。回收所得的培养上清，使用IgGSepharose 6 Fast Flow(Amersham Biosciences)进行纯化后，通过HiTrap Q HP(GEHealthcare)(J Immunol. 2002 Nov 1; 169(9): 5171-80)，进一步纯化了FcRn。

作为使用Biacore评价抗体与FcRn的相互作用的测定体系，报道了：将抗体固定于J Immunol. 2009;182(12):7663-71.中记载的传感器芯片上且将人FcRn作为分析物的体系。为了该目的，如参考例4所记载地调制了人FcRn。使用该体系，对Fv4-IgG1、Fv4-IgG1-v1和Fv4-IgG1-v2在pH6.0和pH7.4下与人FcRn的结合活性(解离常数KD)进行了评价。作为被测物质的抗体直接固定于S系列传感器芯片CM5上并供于试验。对于抗体在传感器芯片上的固定，使用50mmol/L磷酸钠/150mmol/L NaCl、0.05%(v/v%)表面活性剂P20(pH6.0)作为运行缓冲液，使用胺偶联试剂盒，按照制造商的手册，以固定量达到500RU为目标进行了实施。

使用50mmol/L磷酸钠/150mmol/L NaCl、0.05%表面活性剂P20(pH6.0)、或50mmol/L磷酸钠/150mmol/L NaCl、0.05%表面活性剂P20(pH7.4)作为运行缓冲液，使用所制作的传感器芯片实施了测定。测定均在25℃下进行。以5μL/分钟的流速注入人FcRn稀释液和运行缓冲液(作为对照溶液)10分钟，使人FcRn与传感器芯片上的抗体相互作用。然后，以5μL/分钟的流速流过运行缓冲液1分钟，观察到FcRn解离后，以30μL/分钟的流速注入20mmol/LTris-HCl/150mmol/L NaCl(pH8.1) 15秒钟，重复2次，由此使传感器芯片再生。

而且，为了计算各改变抗体对FcRn的KD值，按照以下的方法实施了动力学分析。首先，在上述的传感器芯片上捕获目标抗体，使其与用运行缓冲液稀释的FcRn相互作用，对于所得的传感图，利用Biacore评价软件，将测定结果用1:1 朗缪耳结合模型(Langmuirbinding model)进行全局拟合，由此算出结合速率常数ka(L/mol/s)、解离速率常数kd(1/s)，根据其值计算出解离常数KD(mol/L)。

[4-3] mFcγR的调制方法和改变抗体与mFcγR的相互作用分析方法

通过以下的方法调制了小鼠FcγR的细胞外结构域。首先，通过本领域技术人员已知的方法实施了FcγR的细胞外结构域的基因合成。此时，对于各FcγR的序列，基于登录于NCBI的信息进行了制作。具体而言，mFcγRI基于NCBI参考序列: NP_034316.1、mFcγRII基于NCBI参考序列: NP_034317.1、mFcγRIII基于NCBI参考序列: NP_034318.2、mFcγRIV基于NCBI参考序列: NP_653142.2的序列，进行制作，在这些序列的C末端上添加了His标签。

将所得基因片段插入到动物细胞表达载体中，制作了表达载体。将所制作的表达载体瞬时地导入到来自人胚肾癌细胞的FreeStyle293细胞(Invitrogen公司)中，使目标蛋白表达。将所得的培养上清回收后，通过0.22μm过滤器而获得培养上清。所得的培养上清原则上通过以下4个步骤进行纯化。第1步骤实施了离子交换柱层析、第2步骤实施了针对His标签的亲和柱层析(HisTrap HP)、第3步骤实施了凝胶过滤柱层析(Superdex200)、第4步骤实施了无菌过滤。关于第1步骤的离子交换柱层析，mFcγRI之际使用了Q Sepharose HP、mFcγRII和mFcγRIV之际使用了SP Sepharose FF、mFcγRIII之际使用了SP SepharoseHP。而且，第3步骤以后使用的溶剂为D-PBS(-)，但mFcγRIII之际使用含有0.1M精氨酸的D-PBS(-)。对于所纯化的蛋白，使用分光光度计测定280 nm下的吸光度，由所得的值通过PACE等方法算出吸光系数，使用吸光系数计算出纯化蛋白的浓度(Protein Science (1995) 4 :2411-2423)。

在这些传感器芯片上捕获目标抗体，并与用运行缓冲液稀释的mFcγR相互作用，测定抗体结合量，在抗体间进行了比较。其中，mFcγR的结合量依赖于捕获的抗体的量，因此比较了用各抗体的捕获量除以mFcγR的结合量而得的修正值。而且，通过与10mM甘氨酸-HCl(pH1.5)反应，对在传感器芯片上捕获的抗体进行洗涤，使传感器芯片再生而重复使用。

而且，为了计算各改变抗体对FcγR的KD值，按照以下的方法实施了动力学分析。首先，在上述的传感器芯片上捕获目标抗体，使其与用运行缓冲液稀释的mFcγR相互作用，对于所得的传感图，利用Biacore评价软件，将测定结果用1:1 朗缪耳结合模型(Langmuirbinding model)进行全局拟合，由此算出结合速率常数ka (L/mol/s)、解离速率常数kd(1/s)，根据其值计算出解离常数KD (mol/L)。

[4-4] mFcRn的调制方法和改变抗体与mFcRn的相互作用分析方法

使用Biacore T100、Biacore T200、Biacore A100、Biacore 4000(GEHealthcare)，进行了小鼠FcRn和抗体的动力学分析。在传感器芯片CM4(GE Healthcare)上通过胺偶联法将适当量的蛋白L(ACTIGEN)固定，并在其上捕获了目标抗体。接着，注入FcRn稀释液和运行缓冲液(作为对照溶液)，使小鼠FcRn与传感器芯片上捕获的抗体相互作用。运行缓冲液使用50mmol/L磷酸钠、150mmol/L NaCl、0.05%(w/v) Tween20(pH6.0)，FcRn的稀释也使用了各自的缓冲液。芯片的再生使用了10mmol/L甘氨酸-HCl(pH1.5)。测定均在25℃下实施。由测定得到的传感图算出作为动力学参数的结合速率常数ka(1/Ms)和解离速率常数k_d(1/s)，基于其值算出了各抗体对小鼠FcRn的KD(M)。各参数的计算中使用了Biacore评价软件(GE Healthcare)。

[参考例5] CE-IEF

对于CE-IEF的测定，使用PA800 Plus(Beckman Coulter)，利用本领域技术人员已知的方法进行。将宽范围为5-8和8-10.5的Pharmalyte进行等量混合，在pI范围5-10.5下进行了分析。使用4mg/mL抗体溶液进行分析，结果使用32 karat软件(Beckman Coulter)进行了分析。对于双特异性抗体生成率(%)，用双特异性抗体的面积值除以存在于体系中的所有抗体的面积值，再乘以100，利用所得到的值。

[参考例6] 细胞毒活性的测定

(6-1) 人外周血单核细胞(PBMC)溶液的调制

使用预先注入了100μL的1,000单元/mL的肝素溶液(用于注射的Novo-Heparin，5千单元，Novo Nordisk公司)的注射器，自健康志愿者(成人)采集了50mL外周血。将用PBS(-)稀释2倍之后并进行了4等分的外周血加入到预先注入15mL的Ficoll-Paque PLUS并进行了离心操作的Leucosep淋巴细胞分离管(Cat. No. 227290、Greiner bio-one公司)中。对该分离管进行离心分离(2,150rpm、10分钟、室温)之后，分取了单核细胞组分层。用包含10%FBS的Dulbecco改良Eagle培养基(SIGMA公司，以下称为10%FBS/D-MEM)将单核细胞组分的细胞进行1次洗涤后，该细胞使用10%FBS/D-MEM将其细胞密度调制为4×10⁶细胞/mL。将如此调制的细胞溶液作为人PBMC溶液用于以后的试验。

(6-2) 细胞毒活性的测定

对于细胞毒活性，使用xCELLigence实时细胞分析仪(Roche Diagnostics公司)通过细胞生长抑制率进行了评价。靶细胞使用了使人GPC3在SK-HEP-1细胞株中强制表达而确立的SK-pca13a细胞株。将SK-pca13a自培养皿剥离，以100μL/孔接种于E-Plate 96(RocheDiagnostics公司)板使达到1×10⁴细胞/孔，使用xCELLigence实时细胞分析仪开始活细胞的测定。次日，从xCELLigence实时细胞分析仪中取出板，向该板中添加了调制为各浓度(0.004、0.04、0.4、4μg/ml)的50μL各抗体。在室温下反应15分钟后，加入(6-1)中调制的50μL(2×10⁴细胞/孔)人PBMC溶液，通过将该板再设置于xCELLigence实时细胞分析仪上，开始活细胞的测定。反应在5%CO₂、37℃条件下进行，根据人PBMC添加72小时后的细胞指数值，利用下式求出了细胞生长抑制率(%)。需要说明的是，用于计算的细胞指数值使用了以临添加抗体前的细胞指数值为1而进行标准化后的数值。

细胞生长抑制率(%)＝(A-B)×100/(A-1)

A显示未添加抗体的孔中的细胞指数值的平均值(仅靶细胞和人PBMC)，B显示各孔中的细胞指数值的平均值。

产业实用性

通过使用本发明的方法，可以在还原条件下以比现有技术高的效率制作双特异性抗体。

Claims

1.用于制备异源多聚体的方法，该方法包括下述步骤：

a)提供具有第1抗原结合活性、且包含Fc区的第1多肽的同聚体的步骤；

b)提供具有与该第1抗原结合活性不同的第2抗原结合活性、且包含Fc区的第2多肽的同聚体的步骤；

c)在可使铰链区内的半胱氨酸引起二硫键异构化的还原条件下，将该第1多肽的同聚体和该第2多肽的同聚体一起温育的步骤；以及

d)获得包含第1和第2多肽的异源多聚体的步骤，

(1)以EU编号表示的356位和439位的氨基酸残基；

(2)以EU编号表示的357位和370位的氨基酸残基；

(3)以EU编号表示的399位和409位的氨基酸残基，

其中，第1和/或第2多肽中，改变以EU编号表示的397位的氨基酸，

其中以EU编号表示的397位的氨基酸为侧链体积大的氨基酸或侧链分支型的氨基酸，其中侧链体积大的氨基酸为Met(M)、Phe(F)、Tyr(Y)、Val(V)、Leu(L)、Ile(I)、Trp(W)、Arg(R)、His(H)、Glu(E)、Lys(K)、Gln(Q)、Asp(D)、Asn(N)、Cys(C)或Thr(T)，侧链分支型的氨基酸为Val(V)、Ile(I)或Leu(L)。

2.权利要求1所述的方法，其中，在权利要求1的步骤a)中，包含提供与第1多肽形成多聚体的第3多肽的步骤，且在步骤b)中，包含提供与第2多肽形成多聚体的第4多肽的步骤。

3.权利要求1或2所述的方法，其中，上述带有同种电荷的氨基酸残基选自以下的(A)或(B)中任一组所含的1个以上的氨基酸残基：

(A)谷氨酸(E)、天冬氨酸(D)；

(B)赖氨酸(K)、精氨酸(R)、组氨酸(H)。

4.权利要求1或2所述的方法，其中，第1和第2多肽中分别带有同种电荷的氨基酸残基组为以下的(1)～(4)中任意1组的氨基酸残基组：

(1)以EU编号表示的356位和439位的氨基酸残基；

(2)以EU编号表示的357位和370位的氨基酸残基；

(3)以EU编号表示的399位和409位的氨基酸残基；

(4)(i)以EU编号表示的399位和409位的氨基酸残基；以及

(ii)以EU编号表示的356位和439位的氨基酸残基。

5.权利要求1或2所述的方法，其中，第1和第2多肽中分别带有同种电荷的氨基酸残基组为以下的组的氨基酸残基组：

(i)以EU编号表示的399位和409位的氨基酸残基；以及

(ii)以EU编号表示的356位和439位的氨基酸残基。

6.权利要求1或2所述的方法，其中，第1和/或第2多肽中，改变氨基酸以使第1和/或第2多肽的CH3区的稳定性变为不稳定。

7.权利要求1或2所述的方法，其中，第1和/或第2多肽的Fc区为IgG1、IgG2、IgG3或IgG4型。

8.权利要求1或2所述的方法，其中，第1和/或第2多肽的Fc区为来自小鼠的Fc区。

9.权利要求1或2所述的方法，其中，第1和/或第2多肽中，

使以EU编号表示的397位改变为Met(M)、Phe(F)或Tyr(Y)。

10.权利要求1或2所述的方法，其中，第1和/或第2多肽中，还改变以EU编号表示的392位的氨基酸。

11.权利要求10所述的方法，其中，第1和/或第2多肽中，使以EU编号表示的392位改变为Asp(D)、Glu(E)、Thr(T)、Val(V)或Ile(I)。

12.权利要求11所述的方法，其中，第1和/或第2多肽中，使以EU编号表示的397位改变为Met(M)、Phe(F)或Tyr(Y)。

13.权利要求1或2所述的方法，其中，第1和/或第2多肽中，使以EU编号表示的397位改变为Phe(F)或Tyr(Y)。

14.权利要求1或2所述的方法，其中，第1多肽中，使以EU编号表示的356位改变为Lys(K)且使以EU编号表示的397位改变为Phe(F)或Tyr(Y)；第2多肽中，使以EU编号表示的397位改变为Phe(F)或Tyr(Y)且使以EU编号表示的439位改变为Glu(E)。

15.权利要求1或2所述的方法，其中，步骤a)和b)通过将产生第1多肽的同聚体的细胞株和产生第2多肽的同聚体的细胞株混合并进行培养来实施，步骤c)在该培养产生的上清中实施。

16.权利要求1或2所述的方法，其中，上述异源多聚体为多特异性抗体或异源Fc融合蛋白。

17.权利要求1或2所述的方法，其中，上述异源多聚体为双特异性抗体。

18.权利要求1或2所述的方法，其中，权利要求1所述的步骤c)包含与还原剂的接触。

19.权利要求18所述的方法，其中，步骤c)包含添加选自谷胱甘肽、L-半胱氨酸、二硫苏糖醇、β-巯基乙醇、TCEP和2-MEA的作用物质。

20.权利要求19所述的方法，其中，步骤c)包含添加选自谷胱甘肽、2-MEA的作用物质。