HK1219741B - Method for the production of domain antibodies - Google Patents

Claims (13)

1. Procédé pour produire un domaine variable unique d'immunoglobuline dans une levure, comprenant

   A) l'application de conditions qui favorisent la formation de ponts disulfures dans des domaines variables uniques d'immunoglobuline ou

   B) l'élimination des domaines variables uniques d'immunoglobuline manquant d'au moins un pont disulfure en appliquant des conditions sélectionnées parmi

   i) la liaison de domaines variables uniques d'immunoglobuline comprenant des groupes thiols libres à des groupes thiols immobilisés, facultativement dans des conditions de dénaturation ; et

   ii) une chromatographie haute performance en phase inverse, ou

   C) une combinaison de (A) et (B),

   dans lequel les conditions qui favorisent la formation de ponts disulfures, sont sélectionnées parmi une ou plusieurs des conditions suivantes :

   a) l'ajout d'ions métalliques oxydants à au moins une étape de production sélectionnée parmi : le bouillon de culture après fermentation, le surnageant comprenant le domaine variable unique d'immunoglobuline après élimination de l'hôte, n'importe quelle étape après purification du domaine variable unique d'immunoglobuline ou du domaine variable unique d'immunoglobuline purifié ou

   b) l'ajout de Cu2+ à une concentration finale de 1 à 10 mM.
2. Procédé selon la revendication 1 A) (a), dans lequel lesdits ions métalliques sont sélectionnés parmi le Cu2+, le Fe2+, le Fe3+ et le Zn2+.
3. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1A) (a) ou 2, dans lequel lesdits ions métalliques sont ajoutés à une concentration finale de l'ion métallique de 0,15 à 10 mM.
4. Procédé selon la revendication 1 A) (b), dans lequel du Cu2+ est ajouté à une concentration finale de 1 à 10 mM à au moins une étape de production du domaine variable unique d'immunoglobuline sélectionné parmi : la culture de l'hôte pour produire le domaine variable unique d'immunoglobuline, le bouillon de culture après fermentation, le surnageant de culture comprenant le domaine variable unique d'immunoglobuline après élimination de l'hôte, n'importe quelle étape après purification du domaine variable unique d'immunoglobuline ou du domaine variable unique d'immunoglobuline purifié.
5. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, dans lequel ledit ajout d'ions métalliques oxydants est réalisé seul ou en combinaison avec une ou plusieurs des conditions selon la revendication 1 B).
6. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, dans lequel le domaine variable unique d'immunoglobuline est fixé à une phase stationnaire d'une colonne de chromatographie.
7. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, dans lequel ledit hôte est sélectionné parmi Pichia, Hansenula, Saccharomyces, Kluyveromyces, Candida, Torulopsis, Torulaspora, Schizosaccharomyces, Citeromyces, Pachysolen, Debaromyces, Metschunikowia, Rhodosporidium, Leucosporidium, Botryoascus, Sporidiobolus, Endomycopsis, de préférence Pichia pastoris.
8. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, dans lequel le domaine variable unique d'immunoglobuline est une séquence de domaines variables de chaîne légère ou une séquence de domaines variables de chaîne lourde.
9. Procédé selon la revendication 8, dans lequel le domaine variable unique d'immunoglobuline est une séquence de domaines variables de chaîne lourde qui est dérivée d'un anticorps classique à quatre chaînes, ou une séquence de domaines variables de chaîne lourde qui est dérivée d'un anticorps à chaîne lourde.
10. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, comprenant au moins les étapes de culture de l'hôte pour produire le domaine variable unique d'immunoglobuline comprenant :

    a) la culture dudit hôte ou d'une cellule hôte dans des conditions qui sont telles que ledit hôte ou ladite cellule hôte va se multiplier ;

    b) le maintien d'un hôte ou d'une cellule hôte dans des conditions qui sont telles que ledit hôte ou ladite cellule hôte exprime et/ou produit le domaine variable unique d'immunoglobuline ; facultativement suivi par

    c) l'isolement et/ou la purification du domaine variable unique d'immunoglobuline sécrété à partir du milieu.
11. Procédé selon la revendication 10, dans lequel des conditions qui favorisent la formation de ponts disulfures, sont appliquées après l'étape b), ou lors de l'étape c) ou après celle-ci.
12. Procédé selon la revendication 10, dans lequel des conditions qui favorisent la formation de ponts disulfures, sont appliquées sur le domaine variable unique d'immunoglobuline pur, ou des échantillons semi-purifiés, ou sur un matériau qui est présent dans le bouillon de culture non clarifié et/ou dans un milieu de culture clarifié.
13. Procédé selon la revendication 10, dans lequel des conditions qui éliminent des domaines variables uniques d'immunoglobuline manquant d'au moins un pont disulfure, sont appliquées après l'étape b).