HK1219741B - Method for the production of domain antibodies - Google Patents

Claims (13)

1. Verfahren zur Herstellung einer einzelnen variablen Immunglobulindomäne in einer Hefe, umfassend

   A) Anwenden von Bedingungen, die die Bildung von Disulfidbrücken in einzelnen variablen Immunglobulindomänen fördern, oder

   B) Entfernen von einzelnen variablen Immunglobulindomänen, denen mindestens eine Disulfidbrücke fehlt, durch Anwenden von Bedingungen, die ausgewählt sind aus

   i) Binden von einzelnen variablen Immunglobulindomänen, die freie Thiolgruppen umfassen, an immobilisierte Thiolgruppen, optional unter denaturierenden Bedingungen; und

   ii) Umkehrphasen-Hochleistungschromatographie, oder

   C) eine Kombination von (A) und (B),

   wobei die Bedingungen, die die Bildung von Disulfidbrücken fördern, ausgewählt sind aus einer oder mehreren der folgenden:

   a) Zugabe von oxidierenden Metallionen zu mindestens einem Produktionsschritt, ausgewählt aus: der Kulturbrühe nach der Fermentation, dem Überstand, der die einzelne variable Immunglobulindomäne enthält, nach Entfernung des Wirts, einem beliebigen Schritt nach der Reinigung der einzelnen variablen Immunglobulindomäne oder der gereinigten einzelnen variablen Immunglobulindomäne oder

   b) Zugabe von Cu2+ zu einer Endkonzentration von 1 bis 10 mM.
2. Verfahren gemäß Anspruch 1 A) (a), wobei die Metallionen ausgewählt sind aus Cu2+, Fe2+, Fe3+ und Zn2+.
3. Verfahren gemäß irgendeinem der Ansprüche 1 A) (a) oder 2, wobei die Metallionen zu einer Endkonzentration des Metallions von 0,15 bis 10 mM zugegeben werden.
4. Verfahren nach Anspruch 1 A) (b), wobei Cu2+ in einer Endkonzentration von 1 bis 10 mM zu mindestens einem Produktionsschritt der einzelnen variablen Immunglobulindomäne zugegeben wird, ausgewählt aus: Kultivierung des Wirts zur Herstellung der einzelnen variablen Immunglobulindomäne, der Kulturbrühe nach der Fermentation, dem Kulturüberstand, der die einzelne variable Immunglobulindomäne enthält, nach Entfernung des Wirts, einem beliebigen Schritt nach der Reinigung der einzelnen variablen Immunglobulindomäne oder der gereinigten einzelnen variablen Immunglobulindomäne.
5. Verfahren gemäß irgendeinem der Ansprüche 1 bis 4, wobei die Zugabe von oxidierenden Metallionen allein oder in Kombination mit einer oder mehreren der Bedingungen nach Anspruch 1 B) durchgeführt wird.
6. Verfahren gemäß irgendeinem der Ansprüche 1 bis 5, wobei die einzelne variable Domäne des Immunglobulins an eine stationäre Phase einer chromatographischen Säule gebunden ist.
7. Verfahren gemäß irgendeinem der Ansprüche 1 bis 6, wobei der Wirt ausgewählt ist aus Pichia, Hansenula, Saccharomyces, Kluyveromyces, Candida, Torulopsis, Torulaspora, Schizosaccharomyces, Citeromyces, Pachysolen, Debaromyces, Metschunikowia, Rhodosporidium, Leucosporidium, Botryoascus, Sporidiobolus, Endomycopsis, vorzugsweise Pichia pastoris.
8. Verfahren gemäß irgendeinem der Ansprüche 1 bis 7, wobei die einzelne variable Domäne des Immunglobulins eine variable Domänensequenz der leichten Kette oder eine variable Domänensequenz der schweren Kette ist.
9. Verfahren gemäß Anspruch 8, wobei die einzelne variable Immunglobulindomäne eine variable Domänensequenz der schweren Kette ist, die von einem herkömmlichen vierkettigen Antikörper abgeleitet ist, oder eine variable Domänensequenz der schweren Kette, die von einem Antikörper der schweren Kette abgeleitet ist.
10. Verfahren gemäß irgendeinem der Ansprüche 1 bis 9, das mindestens die Schritte des Kultivierens des Wirts zur Herstellung der einzelnen variablen Immunglobulindomäne umfasst, umfassend:

    a) Kultivieren des Wirts oder der Wirtszelle unter Bedingungen, die so beschaffen sind, dass der Wirt oder die Wirtszelle sich vermehren wird;

    b) Aufrechterhalten (maintaining) des Wirts oder der Wirtszelle unter Bedingungen, die so beschaffen sind, dass der Wirt oder die Wirtszelle die einzelne variable Immunglobulindomäne exprimiert und/oder produziert; optional gefolgt von:

    c) Isolieren und/oder Reinigen der sezernierten einzelnen variablen Immunglobulindomäne aus dem Medium.
11. Verfahren gemäß Anspruch 10, wobei Bedingungen, die die Bildung von Disulfidbrücken fördern, nach Schritt b), oder bei oder nach Schritt c) angewendet werden.
12. Verfahren gemäß Anspruch 10, wobei Bedingungen, die die Bildung von Disulfidbrücken fördern, auf die reine einzelne variable Immunglobulin-Domäne oder auf halbgereinigte Proben oder auf Material, das in der ungeklärten Kulturbrühe und/oder im geklärten Kulturmedium vorhanden ist, angewendet werden.
13. Verfahren gemäß Anspruch 10, wobei Bedingungen, die einzelne variable Immunglobulin-Domänen entfernen, denen mindestens eine Disulfidbrücke fehlt, nach Schritt b) angewendet werden.