HK1212883B - 治疗眼部疾病的方法 - Google Patents

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治疗眼部疾病的方法

本申请是申请日为2009年10月22日、申请号为201210278029.7、发明名称为“治疗眼部疾病的方法”的发明专利申请的分案申请。

相关申请

本申请要求于2008年10月22日提交的美国临时专利申请第61/196995号和2008年11月11日提交的美国临时专利申请第61/198931号、以及于2009年2月15日提交的国际专利申请第PCT/IL2009/000179号的优先权，它们的全部内容通过引用并入本文。参考序列列表

说明书中所述的序列(SEQ ID NO:1-33,596)是通过USPTO电子文件系统(EFS)以文本文件形式提交，其标题为“188-PCT2.ST25.txt”，于2009年10月20日生成，文件大小为5952KB，它们的全部内容通过引用并入本文。

技术领域

本发明涉及一种治疗需要的受试者的眼部障碍的无创伤性方法，包括向所需受试者眼睛表面局部施用药物组合物的步骤，所述药物组合物包含与受试者视网膜中视网膜神经节细胞缺失相关的目标基因的治疗型寡核苷酸。此外，本发明涉及一种提高患有眼部疾病、障碍或损伤的受试者视网膜神经节细胞存活的无创伤性方法。

背景技术

向视网膜组织传输核酸化合物，特别是向视网膜神经节细胞是一个很大的给药挑战。迄今为止，滴眼剂被认为主要用于治疗眼前段疾病是有效的，就是因为其已经表明，核酸不通过角膜，且不充足的药物浓度达到眼后段组织(reviewed in del Amo and Urtti,2008.Drug Discov Today 13(3/4):135-143；Fattal and Bochot,2006.Adv Drug DelRev 56:1203-1223)。

视网膜神经节细胞(RGC)是一种靠近眼睛视网膜内表面位置的神经细胞。视网膜神经节细胞由感光细胞接收视觉信息，并统一传送视网膜视觉信息至大脑中的几个区域。

此外，同时仍然需要有抑制受试者视网膜神经节细胞缺失的无创伤性方法。各种眼部疾病和障碍是以视网膜神经节细胞(RGC)死亡为特征。因此，仍然需要有一种抑制患有眼部疾病、眼部障碍或眼部损伤或以存在感染眼部疾病、眼部障碍或眼部损伤的风险为特征和/或以视网膜神经节细胞(RGC)变性或死亡介导的受试者视网膜神经节细胞(RGC)缺失的无创伤性方法。

发明概述

本发明涉及一种与视网膜神经节细胞(RGC)变性或死亡相关的眼部疾病、眼部障碍或眼部损伤的无创伤性治疗方法及其使用的组合物。本发明的方法包括向受试者眼睛表面局部施用可用于提高受试者视网膜神经节细胞存活的治疗型寡核苷酸组合物。迄今为止，寡核苷酸已通过系统传输或玻璃体内注射，与有害副作用和患者依从性差相关的方法分别传输到眼部视网膜组织。本发明提供了包含寡核苷酸的局部眼科药物组合物，及其用于下调与受试者视网膜的视网膜神经节细胞缺失相关的目标基因表达的无创伤性方法，以挽救视网膜神经节细胞的凋亡并治疗眼部障碍。

因此，一方面，本发明提供一种向患有眼部疾病、眼部障碍或眼部损伤的受试者视网膜组织传输寡核苷酸的无创伤性方法，其中包括向受试者眼睛表面局部施用包含寡核苷酸的眼科组合物。

另一方面，本发明提供一种向患有眼部障碍的受试者视网膜神经节细胞传输寡核苷酸的无创伤性方法，其中包括向受试者眼睛表面局部施用包含寡核苷酸的眼科组合物。

另一方面，本发明提供了一种减弱与患有眼部疾病、眼部障碍或眼部损伤的受试者视网膜的视网膜神经节细胞缺失相关的目标基因表达的方法，其中包括向受试者眼睛表面局部(无创伤性)施用药物组合物，所述药物组合物包含目标基因的mRNA产物的至少一种寡核苷酸，以一定用量经过一段时间能有效减弱受试者视网膜基因的表达。

另一方面，本发明提供一种治疗受试者患有视网膜神经节细胞缺失或视网膜神经节细胞损伤的方法，并提供神经保护剂给患有或者存在感染眼部疾病、眼部障碍或眼部损伤风险的受试者。该方法包括向受试者眼睛表面局部施用眼科药物组合物，所述眼科药物组合物包括受试者视网膜目标基因靶向的至少一种寡核苷酸，以一定用量经过一段时间能有效抑制视网膜神经节细胞缺失或视网膜神经节细胞损伤。

在不同实施例中，眼科药物组合物被配制为霜、泡沫、膏、软膏、乳剂、包括滴眼剂、凝胶、喷雾、悬浮液、微乳液、微球、微囊剂、纳米球、纳米粒子、脂质囊泡、脂质体、聚合物囊泡、眼罩或隐形眼镜的液体溶液。在一些实施例中，药物组合物被配制为滴眼剂。在优选实施例中，向眼睛施用眼科组合物，例如，是通过滴眼剂滴注或通过施用薄雾。

在某些实施例中，至少一种目标眼部mRNA基因是选自任一SEQ ID NO:1-58所述mRNA多核苷酸。在某些实施例中，至少一种目标基因是选自被转录为任一SEQ ID NO:1-58所示mRNA多核苷酸的基因。

在一些实施例中，至少一种寡核苷酸是选自化学修饰的siRNA、未修饰的RNA、反义、核酶、miRNA和shRNA。在优选实施例中，至少一种寡核苷酸是化学修饰的siRNA。在一些实施例中，siRNA正义和反义寡核苷酸均是选自显示于表B1-B36中的正义和相应的反义寡核苷酸对，如SEQ ID NO:59-33,596所述。

在一些实施例中，眼部障碍、疾病或损伤是选自青光眼、干眼症、糖尿病视网膜病变(DR)、糖尿病性黄斑水肿(DME)或老年性黄斑变性(AMD)。在其他实施例中，眼部障碍、疾病或损伤是视神经炎、视网膜中央静脉阻塞、视网膜分枝静脉阻塞(BRVO)。在进一步实施例中，眼部障碍、疾病或损伤是色素性视网膜炎(RP)、缺血性视神经病变或视神经损伤。在进一步的实施例中，眼部障碍、疾病或损伤是早产儿视网膜神经节的视网膜病变(ROP)、黄斑变性、遗传性视神经病变、代谢性视神经病变，以及由于毒剂或药物不良反应或维生素缺乏症引起的视神经病变。在另一个实施例中，该障碍是与肿瘤疾病相关的视力丧失。

在不同实施例中，至少一种siRNA化合物被传输到受试者眼睛作为液体溶液，其中包括滴眼剂。在不同实施例中，本发明提供了一种减弱与患有眼部疾病、障碍或损伤的受试者的视网膜神经节细胞缺失相关的目标眼部基因表达的方法，其中包括向受试者眼睛表面局部施用以滴眼剂为配方的眼科药物组合物。

在不同实施例中，目标眼部mRNA的表达在患有眼部疾病、障碍或损伤的受试者视网膜眼部细胞中减弱。在不同实施例中，眼部细胞包括但不仅限于泪腺腺泡细胞、泪腺导管细胞、视网膜神经节细胞(RGC)、视网膜色素上皮(RPE)细胞、脉络膜细胞、角膜细胞、睫状突细胞或小梁网细胞或其组合。

本发明提供了一种抑制受试者视网膜神经节细胞缺失的方法，其中包括无创伤性地向受试者眼睛表面施用眼科组合物，所述眼科组合物包括至少一种siRNA的治疗有效量，所述siRNA下调与受试者视网膜的视网膜神经节细胞缺失相关的目标基因表达，从而抑制视网膜神经节细胞的丧失。在某些实施例中，两种或多种目标基因根据本发明方法被下调。至少一种与受试者视网膜的视网膜神经节细胞缺失相关的目标基因(眼部mRNA)的减弱表达赋予眼部神经保护特性。在不同实施例中，至少一种眼部目标基因是选自表A1至A4的列表，如SEQ ID NO:1-58所述。

在一个实施例中，所述眼部障碍是青光眼。因此，本发明提供了一种抑制患有青光眼受试者的视网膜神经节细胞缺失的方法，其中包括局部(无创伤性)向受试者眼睛表面施用眼科组合物，所述眼科组合物包括包括至少一种siRNA的治疗有效量，所述siRNA下调与受试者视网膜的视网膜神经节细胞缺失相关的目标基因表达，从而抑制受试者眼睛视网膜神经节细胞的缺失。在优选实施例中，siRNA是化学修饰的。在一些实施例中，化学修饰的siRNA减弱基因在受试者眼睛视网膜(目标眼部mRNA)的表达。在其他实施例中，化学修饰的siRNA减弱目标mRNA在受试者眼睛视神经中的表达。在某些实施例中，减弱与受试者视网膜神经节细胞缺失相关的至少一种目标基因的表达是青光眼的有效治疗方法。在某些实施例中，至少一种目标基因是选自表A1，如SEQ ID NO:1-35所述。在某些优选实施例中，该目标基因是选自CASP2(SEQ ID NO:1-2)、ASPP1(SEQ ID NO:4)、TP53BP2(SEQ ID NO:6-7)、BNIP3(SEQ ID NO:12),RTP801L(SEQ ID NO:14)、ACHE(SEQ ID NO:19-20)、ADRB1(SEQ IDNO:21)和CAPNS1(SEQ ID NO:28-29)。在不同实施例中，该基因如SEQ ID NO:1-2所述。在一些实施例中，siRNA正义和反义链均是选自SEQ ID NO:8515-9516所述的寡核苷酸序列对。

在另一个实施例中，所述眼部障碍是干眼症。因此，本发明提供了一种抑制患有干眼症受试者的视网膜神经节细胞缺失的方法，所述方法包括局部(无创伤性)向受试者眼睛表面施用眼科组合物，所述眼科组合物包括至少一种siRNA的治疗有效量，所述siRNA下调与受试者视网膜的视网膜神经节细胞缺失相关的目标基因(目标眼部mRNA)表达，从而抑制受试者眼睛视网膜神经节细胞的缺失。在优选实施例中，siRNA是化学修饰的。在某些实施例中，减弱与受试者视网膜神经节细胞缺失相关的至少一种目标基因的表达是干眼症的有效治疗方法。在某些实施例中，减弱与受试者视网膜神经节细胞缺失相关的至少一种目标基因的表达对减轻干眼症症状有效。在某些实施例中，至少一种目标基因(目标眼部mRNA)在受试者眼睛视网膜神经节细胞中表达。在某些实施例中，至少一种目标基因(目标眼部mRNA)在受试者眼睛泪腺中表达。在某些实施例中，至少一种目标基因是选自表A2，如任一SEQ ID NO:5(p53)、SEQ ID NO:8-10(LRDD)、SEQ ID NO:26-27(SHC1)和SEQ ID NO:30-44(FAS和FAS配位体)所述。在一些实施例中，该目标基因是选自FAS、FAS配位体(FASL)、p53、LRDD、PARP1、AIF(凋亡诱导因子)、NOS、NOS2A、XIAP和SHC1-SHC。在某些优选实施例中，目标基因如任一SEQ ID NO:36-SEQ ID NO:43或SEQ ID NO:44所述。在一些实施例中，siRNA的正义和反义链均是选自SEQ ID NO:13,225-15,224所述的寡核苷酸序列对。

在另一个实施例中，所述眼部障碍是AMD、DR或DME。因此，本发明提供了一种抑制患有AMD、DR或DME的受试者的视网膜神经节细胞缺失的方法。所述方法包括局部(无创伤性)向受试者眼睛表面施用眼科组合物，所述眼科组合物包括至少一种siRNA的治疗有效量，所述siRNA下调与受试者视网膜的视网膜神经节细胞缺失相关的目标基因(目标眼部mRNA)表达，从而抑制受试者眼睛视网膜神经节细胞的缺失。在优选实施例中，siRNA是化学修饰的。在某些实施例中，减弱与受试者视网膜神经节细胞缺失相关的至少一种目标基因的表达是AMD、DR或DME的有效治疗方法。在某些实施例中，减弱与受试者视网膜神经节细胞缺失相关的至少一种目标基因的表达对减轻AMD、DR或DME症状有效。在某些实施例中，至少一种siRNA的施用减弱至少一种目标基因(靶mRNA)在受试者眼睛视网膜神经节细胞中表达。在某些实施例中，至少一种siRNA的施用减弱至少一种目标基因(目标眼部mRNA)在受试者眼睛脉络膜中的表达。在某些实施例中，至少一种目标基因列于表A3，如任一SEQ ID NO:1-2、3、5、6-7、8-10、12、13、24-25、26-27、30-35、45-53所述。在某些实施例中，siRNA靶向CTSD、RTP801和BNIP3。在某些实施例中，该障碍是DR。siRNA靶向SEQ ID NO:48-53所述的mRNA。在一些实施例中，siRNA的正义和反义链均是选自SEQ ID NO:24575-29594所述的任一序列。在某些优选实施例中，该障碍是AMD，siRNA靶向SEQ ID NO:3所述的基因，siRNA的正义和反义链均是选自SEQ ID NO:11285-12224所述的任一序列。在一些实施例中，siRNA的正义和反义链均是选自SEQ ID NO:24575-29594所述的寡核苷酸序列对。

在一个进一步的实施例中，所述眼部障碍是视网膜色素变性(RP)。因此，本发明提供了一种抑制患有RP的受试者的视网膜神经节细胞缺失的方法。所述方法包括局部(无创伤性)向受试者眼睛表面施用眼科组合物，所述眼科组合物包括至少一种siRNA的治疗有效量，所述siRNA下调与受试者视网膜的视网膜神经节细胞缺失相关的目标基因(目标眼部mRNA)表达，从而抑制受试者眼睛视网膜神经节细胞的缺失。在优选实施例中，siRNA是化学修饰的。在某些实施例中，减弱与受试者视网膜神经节细胞缺失相关的至少一种目标基因的表达是RP的有效治疗方法。在某些实施例中，减弱与受试者视网膜神经节细胞缺失相关的至少一种目标基因的表达对减轻RP症状有效。在某些实施例中，至少一种目标眼部mRNA是选自表A4所列基因的产物，其被转录为任一SEQ ID NO:3、14、26-35、54-57所述的mRNA。在一些实施例中，目标眼部mRNA是选自由CASP1、CASP3、CASP12、RTP801、RTP801L、CAPNS1、PARP1、AIF、NOS1、NOS2、XIAP和SHC1-SHC组成的组的基因产物。在某些优选实施例中，siRNA靶向SEQ ID NO:56-57所述的基因。

另一方面，本发明是以一种拯救受试者视网膜神经节细胞的细胞凋亡的方法为特征，其中包括无创伤性地向受试者眼睛表面施用眼科组合物，所述眼科组合物包括受试者视网膜的目标基因的治疗有效量的至少一种siRNA，从而拯救受试者视网膜神经节细胞的细胞凋亡。在优选实施例中，至少一种siRNA是化学修饰的。在一些实施例中，该目标基因如任一SEQ ID NO:1-58所述。在不同实施例中，siRNA的正义和反义寡核苷酸均是选自显示于表B1-B36的正义及其相应的反义寡核苷酸，如SEQ ID NO:59-33,596所述。

另一方面，本发明提供一种提高呈现视神经病变体征或症状的受试者视网膜神经节细胞存活的方法，包括无创伤性地向受试者眼睛表面施用眼科组合物，所述眼科组合物包含至少一种siRNA的治疗有效量，所述siRNA下调与受试者视网膜的视网膜神经节细胞缺失相关的目标基因表达，从而提高受试者视网膜神经节细胞的存活。在优选实施例中，至少一种siRNA是化学修饰的。在某些实施例中，视神经病变的体征或症状是由细胞凋亡介导的。在一些实施例中，该目标基因如任一SEQ ID NO:1-58所述。在不同实施例中，siRNA的正义和反义寡核苷酸均是选自正义及其相应的反义寡核苷酸，如SEQ ID NO:59-33,596所述。

另一方面，本发明涉及一种预防、治疗或减轻与受试者视网膜神经节细胞死亡相关的眼部疾病的方法，其中包括无创伤性地向受试者眼睛表面施用眼科组合物，所述眼科组合包括受试者视网膜目标基因的治疗有效量的至少一种siRNA，从而预防、治疗或减轻与受试者视网膜神经节细胞死亡相关的眼部疾病。在优选实施例中，至少一种siRNA是化学修饰的。在某些实施例中，该目标基因如任一SEQ ID NO:1-58所述。在不同实施例中，siRNA的正义和反义寡核苷酸均是选自显示于表B1-B36的正义及其相应的反义寡核苷酸，如SEQ IDNO:59-33,596所述。

另一方面，本发明提供了一种治疗或预防受试者视网膜神经节细胞死亡的方法，其中包括无创伤性地向受试者眼睛表面施用眼科组合物，所述眼科组合物包括：(a)受试者视网膜目标基因的治疗有效量的至少一种siRNA，和(b)药学上可接受的赋形剂或载体或其混合物，从而治疗或预防受试者视网膜神经节细胞死亡。在优选实施例中，至少一种siRNA是化学修饰的。在一些实施例中，该目标基因如任一SEQ ID NO:1-58所述。在不同实施例中，siRNA的正义和反义寡核苷酸均是选自正义及其相应的反义寡核苷酸，如SEQ ID NO:59-33,596所述。

另一方面，本发明涉及一种预防由受试者眼睛中高眼压介导的视网膜神经节细胞死亡的方法，其中包括无创伤性地向受试者眼睛表面施用眼科组合物，所述眼科组合包括受试者视网膜目标基因的治疗有效量的至少一种siRNA，从而预防受试者视网膜神经节细胞死亡。在优选实施例中，至少一种siRNA是化学修饰的。在一个特定实施例中，根据这一方法该受试者是患有青光眼。在一些实施例中，该目标基因如任一SEQ ID NO:1-58所述。在不同实施例中，siRNA的正义和反义寡核苷酸均是选自正义及其相应的反义寡核苷酸，如SEQID NO:59-33,596所述。

本发明还提供了一种延迟、预防或拯救患有高IOP受试者的视网膜细胞死亡的方法，其中包括无创伤性地向受试者眼睛表面施用眼科组合物，所述眼科组合物包括与受试者视网膜的RGC死亡相关的目标基因的治疗有效量的至少一种siRNA，从而延迟、预防或拯救视网膜细胞的损伤或死亡，其中眼内压(IOP)仍然大幅度提升。在优选实施例中，至少一种siRNA是化学修饰的。在一个特定实施例中，根据这一方法该受试者是患有青光眼。在一些实施例中，该目标基因如任一SEQ ID NO:1-58所述。在不同实施例中，siRNA的正义和反义寡核苷酸均是选自SEQ ID NO:59-33,596所述的正义及其相应的反义寡核苷酸。

本发明还提供一种治疗患有视网膜神经节细胞缺失或视网膜神经节细胞损伤受试者的方法，其中包括无创伤性地向受试者眼睛表面施用眼科组合物，所述眼科组合物包括至受试者视网膜的目标基因的治疗有效量的至少一种siRNA，从而治疗受试者或降低受试者视网膜细胞的死亡。在优选实施例中，至少一种siRNA是化学修饰的。在一些实施例中，该目标基因如任一SEQ ID NO:1-58所述。在不同实施例中，siRNA的正义和反义寡核苷酸均是选自SEQ ID NO:59-33,596所述的正义及其相应的反义寡核苷酸。

本发明还提供了一种降低视网膜神经节细胞缺失的方法，并提供神经保护剂给所需要的受试者，其中包括无创伤性地向受试者眼睛表面施用眼科组合物，所述眼科组合物包括至受试者视网膜的目标基因的治疗有效量的至少一种siRNA，从而降低网膜神经节细胞缺失，并提供神经保护剂给受试者。在优选实施例中，至少一种siRNA是化学修饰的。在某些实施例中，该目标基因如任一SEQ ID NO:1-58所述。在不同实施例中，siRNA的正义和反义寡核苷酸均是选自显示于表B1-B36的正义及其相应的反义寡核苷酸对，如SEQ ID NO:59-33,596所述。

本发明还提供一种预防与受试者视网膜神经节细胞缺失相关的视野丧失的方法，其中包括无创伤性地向受试者眼睛表面施用眼科组合物，所述眼科组合物包括至受试者视网膜的目标基因的治疗有效量的至少一种siRNA，从而预防受试者的视野丧失。在优选实施例中，至少一种siRNA是化学修饰的。在某些实施例中，该目标基因如任一SEQ ID NO:1-58所述。在不同实施例中，siRNA的正义和反义寡核苷酸均是选自显示于表B1-B36的正义及其相应的反义寡核苷酸对，如SEQ ID NO:59-33,596所述。

另一方面，本发明提供了一种无创伤治疗与受试者视网膜神经节细胞缺失相关的眼部疾病的眼科组合物，其中包括：(a)受试者视网膜目标基因的治疗有效量的至少一种siRNA，和(b)药学上可接受的赋形剂或载体或其混合物。在优选实施例中，至少一种siRNA是化学修饰的。在某些实施例中，该目标基因如任一SEQ ID NO:1-58所述。在不同实施例中，siRNA的正义和反义寡核苷酸均是选自显示于表B1-B36的正义及其相应的反义寡核苷酸对，如SEQ ID NO:59-33,596所述。

另一方面，本发明提供了一种无创伤治疗与视觉系统组织的病理性异常/变化有关的眼部疾病的局部眼科药物组合物，其中包括：(a)受试者视网膜目标基因的治疗有效量的至少一种siRNA，其中所述目标基因如任一SEQ ID NO:1-58所述，和(b)药学上可接受的赋形剂或载体或其混合物。在优选实施例中，至少一种siRNA是化学修饰的。在不同实施例中，siRNA的正义和反义寡核苷酸均是选自显示于表B1-B36的正义及其相应的反义寡核苷酸对，如SEQ ID NO:59-33,596所述。

根据另一方面，本发明涉及一种用于治疗与视网膜神经节细胞死亡相关的眼部疾病的眼科药物组合物，其中包括：(a)受试者视网膜目标基因的治疗有效量的至少一种siRNA，其中所述目标基因如任一SEQ ID NO:1-58所述，和(b)药学上可接受的赋形剂或载体或其混合物。在优选实施例中，至少一种siRNA是化学修饰的。在不同实施例中，siRNA的正义和反义寡核苷酸均是选自显示于表B1-B36的正义及其相应的反义寡核苷酸对，如SEQID NO:59-33,596所述。

在不同实施例中，所述眼部疾病是选自包括青光眼、干眼症、糖尿病视网膜病变(DR)、糖尿病性黄斑水肿(DME)、老年性黄斑变性(AMD)、视神经炎、视网膜中央静脉阻塞、视网膜分枝静脉阻塞、缺血性视神经病变、视神经损伤、早产儿视网膜病变(ROP)、色素性视网膜炎(RP)、视网膜神经节细胞变性，黄斑变性、遗传性视神经病变、代谢性视神经病变，以及由于毒剂或药物不良反应或维生素缺乏症引起的视神经病变；所述组合物被配制为霜、泡沫、膏、软膏、乳剂、液体溶液、滴眼剂、凝胶、喷雾、悬浮液、微乳液、微球、微囊剂、纳米球、纳米粒子、脂质囊泡、脂质体、聚合物囊泡、眼罩或生物插入物。在优选实施例中，所述组合物被配制为滴眼剂。

另一方面，本发明涉及一种包装的药物制剂，其中包括：(a)容器内根据本发明的药物组合物(b)所述组合物用于治疗眼部疾病的说明书。在不同实施例中，根据本发明的药物组合物包括患有眼部疾病的受试者视网膜目标基因的治疗有效量的至少一种siRNA。在优选实施中，至少一种siRNA是化学修饰的。在一些实施例中，目标基因如任一SEQ ID NO:1-58所述。在不同实施例中，siRNA的正义和反义寡核苷酸均是选自显示于表B1-B36的正义及其相应的反义寡核苷酸对，如SEQ ID NO:59-33,596所述。在一特定实施例中，根据本发明的一方面，所述药物组合物是用于无创伤性治疗与受试者视网膜神经节细胞缺失相关的眼部疾病。在另一特定实施例中，根据本发明的一方面，所述药物组合物是用于无创伤性治疗与视觉系统组织病理异常/变化相关的眼部疾病。在另一特定实施例中，根据本发明的一方面，所述药物组合物是用于无创伤性治疗患有与视网膜神经节细胞死亡相关的眼部疾病的受试者。

根据另一方面，本发明涉及根据本发明在药剂加工中提高受试者视网膜神经节细胞存活的药物组合物的用途。在不同实施例中，根据本发明的药物组合物包括患有眼部疾病的受试者视网膜目标基因的治疗有效量的至少一种siRNA。在优选实施中，至少一种siRNA是化学修饰的。在一些实施例中，目标基因如任一SEQ ID NO:1-58所述。在不同实施例中，siRNA正义和反义寡核苷酸均是选自显示于表B1-B36的正义和相应的反义寡核苷酸对，如SEQ ID NO:59-33,596所述。在一特定实施例中，根据本发明的一方面，所述药物组合物是用于无创伤性治疗与受试者视网膜神经节细胞缺失相关的眼部疾病。在另一特定实施例中，根据本发明的一方面，所述药物组合物是用于无创伤性治疗与视觉系统组织病理异常/变化相关的眼部疾病。在另一特定实施例中，根据本发明的一方面，所述药物组合物是用于无创伤性治疗受试者患有与视网膜神经节细胞死亡相关的眼部疾病。

在一些实施例中，所述组合物包括增粘剂。增粘剂是选自(例如)亲水聚合物，其中包括纤维素和纤维素衍生物，如甲基纤维素和甲基纤维素衍生物。这些药剂包括甲基纤维素、羟乙基纤维素、羟丙基纤维素、羟丙甲基纤维素和羧甲基纤维素及其衍生物、组合和盐类。在一些实施例中，增粘剂是甲基纤维素。在某些实施例中，所提供的增粘剂浓度为约0.01％至约4％，在其他实施例中，所提供的增粘剂浓度为约0.1％至约3％，或约0.5％至约2％。

在一些实施例中，所述组合物包括提供渗透压平衡或者表面活性剂的药剂。这些药剂包括丙三醇、乙二醇、聚乙二醇(PEG)、丙二醇、山梨醇、甘露醇、单糖、双糖和低聚糖。

本发明还提供一种治疗所需受试者青光眼的方法，其中包括局部(无创伤性)地向受试者眼睛表面施用受试者眼睛目标基因的治疗有效量的至少一种siRNA，以一定量有效治疗青光眼。在某些优选实施例中，siRNA是化学修饰的。在某些实施例中，至少一种siRNA抑制至少一种基因在受试者眼睛视网膜中的表达。在某些实施例中，至少一种基因抑制赋予眼部神经保护特性。在某些实施例中，至少一种基因是选自表A1的列表，其被转录为SEQID NO:1-35所述的mRNA。在某些优选实施例中，该基因是选自CASP2(SEQ ID NO:1-2)、ASPP1(SEQ ID NO:4)、TP53BP2(SEQ ID NO:6-7)、BNIP3(SEQ ID NO:12)、RTP801L(SEQ IDNO:14)、ACHE(SEQ ID NO:19-20)、ADRB1(SEQ ID NO:21)和CAPNS1(SEQ ID NO:28-29)。在不同实施例中，该基因如SEQ ID NO:1-2所述。在一些实施例中，siRNA的正义和反义链是选自SEQ ID NO:8515-9516所述的任一序列。

本发明还提供了一种治疗所需受试者干眼症的方法，其中包括局部(无创伤性)地向受试者眼睛表面施用至少一种siRNA的治疗有效量，所述siRNA抑制至少一种基因在受试者眼睛中的表达，其以一定量有效降低干眼症症状。在某些优选实施例中，siRNA是化学修饰的。在某些实施例中，至少一种基因在受试者泪腺中表达。在某些实施例中，至少一种基因是选自表A2，如任一SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:8-10、SEQ ID NO:26-27和SEQ ID NO:30-44所述。在一些实施例中，所述基因是选自FAS、FAS配位体(FASL)、p53、LRDD、PARP1、AIF(凋亡诱导因子)、NOS1、NOS2A、XIAP和SHC1-SHC。在某些优选实施例中，所述基因被转录成任一SEQ ID NO:36-SEQ ID NO:44所述的mRNA。在一些实施例中，siRNA的正义和反义链均是选自表6-17中SEQ ID NO:13、225-15、224所述的任一序列。

本发明还提供了一种治疗所需受试者AMD、DR或DME的方法，其中包括局部(无创伤性)地向受试者眼睛表面施用至少一种siRNA的治疗有效量，所述siRNA抑制至少一种基因在受试者眼睛中的表达，其以一定量有效降低AMD、DR或DME症状。在某些优选实施例中，siRNA是化学修饰的。在某些实施例中，至少一种siRNA抑制至少一种基因在受试者眼睛脉络膜中的表达。在某些实施例中，至少一种目标眼部mRNA列于表A3，如任一SEQ ID NO:1-2、3、5、6-7、8-10、12、13、24-25、26-27、30-35、45-53所述。在某些优选实施例中，siRNA靶向CTSD、RTP801和BNIP3。在某些优选实施例中，所述眼部障碍是DR，siRNA靶向SEQ ID NO:48-53所述的mRNA。

在一个进一步的实施例中，所述眼部障碍是视网膜色素变性(RP)。因此，本发明提供了一种减弱目标眼部mRNA在患有RP的受试者眼睛中表达的方法。所述方法包括局部(无创伤性)地向受试者眼睛表面施用受试者眼睛目标基因的治疗有效量的至少一种siRNA。在某些优选实施例中，siRNA是化学修饰的。在某些实施例中，至少一种目标基因(目标眼部mRNA)的减弱表达是有效治疗RP的方法。在某些实施例中，至少一种目标眼部mRNA的减弱表达对减轻RP症状有效。在某些实施例中，至少一种目标眼部mRNA是选自表A4所列基因的基因产物，其被转录为任一SEQ ID NO:3、14、26-35、54-57所述的mRNA。在一些实施例中，目标眼部mRNA是选自由CASP1、CASP3、CASP12、RTP801、RTP801L、CAPNS1、PARP1、AIF、NOS1、NOS2、XIAP和SHC1-SHC组成的组的基因产物。在某些优选实施例中，siRNA靶向SEQ ID NO:56-57所述的mRNA。

在不同实施例中，至少一种siRNA是化学修饰的。在不同实施例中，至少一种siRNA包括足够数量的具有与目标mRNA中的核苷酸序列具有充分同源性的连续核苷酸序列，以与mRNA杂交，并减弱mRNA在受试者眼睛中的表达。

在不同实施例中，至少一种siRNA包括包括足够数量的具有与基因中的核苷酸序列具有充分同源性的连续核苷酸序列，以与该基因杂交，并降低或抑制基因在受试者眼睛中的表达。

附图简要说明

图1A-1B：表示施用滴眼剂后注入小鼠视网膜的Cy3标记DDIT4siRNA的典型图像。图1C：在E.D.给药后4小时的视网膜的共聚焦显微镜图像，给药(上X40，下X60)。在左(Cy3)和右(合并)小图中RGC的Cy3染色是显著的。

图2A-2C：表示施用滴眼剂后注入小鼠泪腺导管及腺泡细胞的Cy3标记DDIT4siRNA的典型图像。图2D：代表的Cy3标记的siRNA DDIT4纳入小鼠泪腺导管及腺泡细胞的图像。E.D.后4小时，泪腺的共聚焦显微镜图像(X60)。

图3A-3C：表示施用滴眼剂1-4小时后小鼠脉络膜的Cy3-siRNA累积随时间的变化。

图4：表示向眼睛施用滴眼剂1小时后传输到小梁网和睫状体的Cy3-siRNA。

图5A-5B：表示施用p53基因靶向QM5–siRNA的滴眼剂1小时后的视网膜共聚焦显微镜图像(倍数X60)。视网膜的siRNA(视网膜色素上皮细胞，视网膜神经节细胞)通过Cy3荧光显示。

图6A-6B：表示注入小鼠视网膜的Cy3标记DDIT4 siRNA的典型图像。图6B表示施用滴眼剂1小时后DDIT4_1 Cy3-siRNA的累积。感光细胞的脉络膜、外核层、RPE和外节层显示了Cy3染色。

图7显示了施用滴眼剂1小时后RGC细胞通过使用Dy-649/C6染色的DDIT4_1 Dy-649/C6-siRNA累积。

图8A-8C表示对照siRNA FITC-CNL_1RD/CNL_1FD和不规则的3'cy3-CNL_1 RGC通过不同染色方法传输到视网膜组织。

图9A-9B表示Casp2的不同结构传输到小鼠视网膜组织。

图10A-10B表示TGASEII-FAM和HNOEL-FAM的传输。

图11表示PBS中作为阳性对照组的p53靶向siRNA的视网膜传输。

图12A-12B表示正常动物或施用不含有siRNA的ED后视网膜中无荧光信号。

图13A-13D提供了显示视网膜中p53抑制的实验结果。图13A-13B显示了测量p53蛋白水平的标准曲线。图13C-13D显示了通过滴眼剂实现的视网膜p53抑制。

发明详述

本发明提供了局部寡核苷酸组合物及其用于治疗各种眼部疾病及障碍的无创伤性方法。特别地，本发明提供了与患有该疾病或障碍的受试者眼睛基因表达相关的不同眼部疾病及障碍的治疗方法。

本发明部分是基于siRNA组合物靶向某些眼部组织和细胞类型的局部无创伤性给药的意外发现，并当局部传输至眼睛表面时在那些组织和细胞中很活跃。考虑到已知siRNA的传输障碍以及提供无创伤性方法作为玻璃体或全身传输的现实选择，这一发现是令人惊讶的。

对于有效沉默目标基因的mRNA的siRNA分子，所述siRNA需要三个层次的目标：目标组织、目标细胞的类型和目标亚细胞室。现在本发明公开了治疗眼部疾病和障碍的无创伤性方法。

本发明通常涉及下调基因在眼部细胞中表达的化合物，特别涉及新的小干扰RNA(siRNA)，以及这些新的siRNAs在治疗受试者患有与眼部组织和细胞中基因表达相关的疾病的用途。

对减弱眼部目标mRNA表达的方法及治疗眼部障碍的方法在此进行了详细谈论，任何所述分子和/或组合物可有益地用于治疗患有所述疾病的受试者。

本发明的siRNA具有可能增加活性、增加稳定性或减少毒性的结构和修饰；对本发明siRNAs的新修饰可以有益地应用到用于防止或减弱目标基因表达的双链RNA序列中，特别是此处讨论的目标基因。

每一个指示目标基因的非限制性实例，已详列于表A1-A4，见下文。

表A1：治疗青光眼的目标基因

表A2:治疗干眼症的目标基因

表A3：治疗DR、DME、AMD的目标基因

表A4：治疗视网膜色素变性的目标基因的实例(RP)

“变体”或“v”指的是转录变体。

表A1-A4提供了本发明涉及寡核苷酸抑制剂(“v”指的是转录变量)的人类mRNA多核苷酸的实例的gi(基因信息标识符)和序列号。

表A1、A2、A3和A4中的基因抑制剂分别用于治疗，尤其是青光眼、干眼症、糖尿病性视网膜病变(DR)、糖尿病性黄斑水肿(DME)、老年性黄斑变性(AMD)和视网膜色素变性(RP)。

定义

为了方便在本说明书中使用某些术语，此处实例和权利要求对其进行了描述。

应当指出的是，此处所使用的单数形式“a”、“an”和“the”包括复数形式，除非另有明确规定的内容。

本发明各方面或实施例根据马库什分组或其他替代分组，从而本领域的普通技术人员将会意识到本发明也能根据任何独立成员或该组成员的子群进行描述。

“抑制剂”是一种能在一定程度上降低基因表达或该基因产物的活跃性以达到所需生物或生理效应的化合物。此处所用的术语“抑制剂”指的是一种或多种寡核苷酸酶抑制剂，包括siRNA、反义、shRNA、miRNA和核酶。抑制可能也被称为mRNA的减弱表达、下调或RNA干扰(RNAi)、沉默。此处披露的抑制剂是化学修饰的siRNA化合物，其包括修饰，如糖基和/或碱基和/或寡核苷酸结构中核苷酸之间连接的变化。

此处所用的术语“抑制”或“减弱”，指的是在一定程度上降低基因、变体或其产物表达或这种基因产物的活性，以达到所需的生物或生理效应。抑制可能是完全或部分的。例如，CASP2基因的“抑制”指的是基因表达(转录或翻译)或任何表A1或A3所公开的一种或多种变体或SNP(单核苷酸多态性)或其它变体多肽活性的抑制。

“眼部组织”指的是与眼部结构有关的任何组织，旨在以非限制性方式包含巩膜、角膜、脉络膜、视网膜、泪腺和视神经。

“眼部细胞”指的是与眼部结构和泪器相关的任何细胞，旨在以非限制性方式包含视网膜神经节细胞、视网膜色素上皮细胞、角膜细胞、结膜、前房、虹膜、睫状突、视网膜、脉络膜和脉络膜细胞、小梁网等。例如，小梁网包括内葡萄膜网、角巩膜网、小梁和近小管组织。泪腺包括泪腺本身、低级和高级泪点、低级和高级泪小管、泪囊等。

此处所使用的术语“多核苷酸”和“核酸”可以互换使用，并指的是包括脱氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)的核苷酸序列。该术语也应理解为包括由核苷酸类似物制成的RNA或DNA的等同物或类似物。在本申请中，mRNA序列被描述表示相应的基因。术语“mRNA多核苷酸序列”和mRNA可以互换使用。

“寡核苷酸”、“寡核糖核苷酸”或“低聚物“指的是具有约2至50个核苷酸的脱氧核苷酸或核糖核苷酸序列。该序列的每个DNA或RNA可以是独立天然或合成的和/或修饰或未修饰的。修饰包括糖基、碱基和/或寡核苷酸结构中核苷酸之间连接的变化。本发明的化合物包括由脱氧核苷酸、核糖核苷酸、修饰的脱氧核苷酸、修饰的核糖核苷酸及其组合组成的分子。

本发明提供了一种抑制体内目标基因表达的方法和组合物。一般情况下，该方法包括局部施用寡核糖核苷酸，特别是小干扰RNA(即siRNA)或能在细胞中产生siRNA以靶向表A1-A4所述基因的mRNA的核酸物质；其以一定量通过RNA干扰机制充分下调目标基因的表达。特别地，该方法可用于抑制治疗患有与眼部组织或细胞基因的表达相关的眼部障碍或疾病的受试者的基因表达。根据本发明，目标基因的siRNA分子或抑制剂被用作治疗各种眼部疾病的药物。

“核苷酸”指的是包括脱氧核苷酸和核糖核苷酸，其可能是天然的或合成的，和/或修饰的或未修饰的。修饰包括糖基的变化和取代，碱基和/或核苷酸间连接。.

此处所使用的术语“非配对核苷酸类似物”指的是包括非碱基配对部分的核苷酸类似物，其包括但不仅限于：六德氨基腺苷(水粉荤素)、4-Me-吲哚、3-硝基吡咯、5-硝基吲哚、Ds、Pa、N3-Me ribo U、N3-Me riboT、N3-Me dC、N3-Me-dT、N1-Me-dG、N1-Me-dA、N3-ethyl-dC、N3-Me dC。在一些实施例中，非碱基配对核苷酸类似物是核糖核苷酸。在其他实施例中，它是脱氧核糖核酸。

所有核苷酸/寡核苷酸的类似物或修饰，可以用于本发明，只要所述类似物或修饰不显著影响核苷酸/寡核苷酸的稳定和功能。可接受的修饰包括糖基的修饰、碱基的修饰、核苷酸间连键及其组合的修饰。

在本发明中有时被称为“脱碱基核苷酸”或“脱碱基核苷酸类似物”的物质被更为恰当地称为伪核苷酸或非常规部分。核苷酸是核酸的单体单元，其组成为核糖或脱氧糖、磷酸盐和碱基(DNA中的腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶或胞嘧啶；RNA中的腺嘌呤、鸟嘌呤、尿嘧啶或胞嘧啶)。一种修饰的核苷酸包括一种或多种糖、磷酸盐或碱基的修饰。脱碱基伪核苷酸缺乏碱基，因此不是严格的核苷酸。

此处使用的术语“盖基”包括脱碱基核糖基、脱碱基脱氧核糖基、包括2’O烷基的修饰脱碱基核糖和脱氧核糖基；反向脱碱基核糖基和脱碱基脱氧核糖基及其修饰；C6-亚氨基-Pi；包括L-DNA和L-RNA的镜像核苷酸；5’OMe核苷酸；包括4',5'-亚甲基核苷酸的核苷酸类似物；1-(β-D-赤型呋喃酮酰基)核苷酸；4'-硫代核苷酸、碳环核苷酸；5'-氨基烷基磷酸酯；1,3-二氨基-2-丙基磷酸酯、3-氨丙基磷酸酯；6-氨己基磷酸酯；12-氨十二烷基磷酸酯；羟丙基磷酸酯；1,5-失水己糖醇核苷酸；α-核苷酸；苏型-戊呋喃酮酰基核苷酸；无环3',4'-开环核苷酸；3,4-二羟丁基核苷酸；3,5-二羟戊基核苷酸；5'-5'-反向脱碱基；1,4-丁二醇磷酸酯；5'-氨基；以及桥接或非桥接甲基膦酸酯和5'-巯基。一种2’-O-甲基糖基修饰的核苷酸也被称为2'-OMe糖基修饰或2'-OMe修饰核苷酸。

某些优选的盖基是脱碱基核糖或脱碱基脱氧核糖基；反向脱碱基核糖基或脱碱基脱氧核糖基；C6-氨基-Pi；镜像核苷酸包括L-DNA和L-RNA。

此处所用的术语“非常规基团”指的是脱碱基核糖基、脱碱基脱氧核糖基、脱氧核糖核酸、修饰的脱氧核糖核酸、镜像核苷酸、非碱基配对核苷酸类似物和通过2’-5’核苷酸间磷酸键与相邻核苷酸连接的核苷酸；包括LNA和乙烯桥接核苷酸的桥接核苷酸。

脱碱基脱氧核糖基包括(例如)脱碱基脱氧核糖-3'-磷酸酯；1,2-脱氧-D-呋喃核糖三磷酸酯；1,4-脱水-2-脱氧-D-核糖醇-3-磷酸酯。反向脱碱基脱氧核糖基包括3',5'反向脱氧脱碱基5'-磷酸酯。

在本发明中，“镜像”核苷酸(也称为spiegleMer)，是一个天然产生的手性反转核苷酸类似物或常用核苷酸，即天然产生或常用核苷酸的镜像。镜像核苷酸是核糖核苷酸(L-RNA)或脱氧核糖核苷酸(L-DNA)，且可进一步包括至少一种糖基或碱基修饰和/或骨架修饰，如硫代磷酸或膦酸酯基团。美国专利No.6,602,858披露了包括至少一种L-核苷酸替代物的核酸催化剂。镜像核苷酸包括(例如)L-DNA(L-脱氧核糖腺苷-3'-磷酸酯(镜像dA)；L-脱氧核糖胞啶-3'-磷酸酯(镜像dC)；L-脱氧核糖鸟苷-3'-磷酸酯(镜像dG)；L-脱氧核糖胸苷-3'-磷酸酯(镜像dT)和L-RNA(L-核糖腺苷-3'-磷酸酯(镜像rA)；L-核糖胞啶-3'-磷酸酯(镜像rC)；L-核糖鸟苷-3'-磷酸酯(镜像rG)；L-核糖尿嘧啶-3'-磷酸酯(镜像dU)。

修饰脱氧核糖核酸例如包括5'OMe DNA(5-甲基-脱氧核糖鸟苷-3'-磷酸酯)，其可用作5'末端位置的核苷酸(位点数：1)；PACE(脱氧核糖腺嘌呤3'膦酰基乙酸酯、脱氧核糖胞啶3'膦酰基乙酸酯、脱氧核糖鸟苷3'膦酰基乙酸酯、脱氧核糖胸苷3'膦酰基乙酸酯)。

桥接核酸包括LNA(2'-O，4'-C-亚甲基桥接核酸腺苷3'单磷酸酯，2'-O，4'-C-亚甲基桥接核5-甲基-胞苷3'单磷酸酯，2'-O，4'-C-亚甲基桥接核酸鸟苷3'单磷酸酯，5-甲基-尿苷(或胸苷)3'单磷酸酯)；和ENA(2'-O，4'-C-乙烯基桥接核酸腺苷3'单磷酸酯，2'-O，4'-C-乙烯基桥接核酸5-甲基-胞苷3'单磷酸酯，2'-O，4'-C-乙烯基桥接核酸鸟苷3'单磷酸酯，5-甲基-尿苷(或胸苷)3'单磷酸酯)。

在本发明的一些实施例中，优选的非常规基团是脱碱基核糖基、脱碱基脱氧核糖基、脱氧核糖核苷酸、镜像核苷酸、通过2’-5’核苷酸间磷酸键与相邻核苷酸连接的核苷酸。

根据一方面，本发明提供了抑制的寡核苷酸化合物，其中包括未修饰和修饰的核苷酸。该化合物包括选自由糖基修饰、碱基修饰和核苷酸间键修饰组成的组的至少一种修饰核苷酸，并可能包含DNA和修饰核苷酸，如LNA(锁核酸)，其中包括ENA(乙烯桥接核酸；PNA(肽核酸)；阿拉伯糖苷；PACE(膦酰基乙酸及其衍生物)，镜像核苷酸或含有6个碳糖的核苷酸。

在一个实施例中，该化合物包括至少一种核苷酸的糖基上的2’修饰(“2’糖基修饰”)。在某些实施例中，该化合物包括2’O-烷基或2’-氟代或2’O-烯丙基或任何其他的2’糖基修饰，任选地在交替的位置上。

其他的稳定修饰也是可能的(如添加到低聚物3'或5'末端的修饰核苷酸)。在一些实施例中，寡核苷酸是被修饰的，并包括磷酸-D-核糖的实体，但也可能包含硫代磷酸酯-D-核糖实体、三酯、硫代酯、2'-5'桥接骨架(也可简称为5'-2')，PACE修饰核苷酸间键或任何其他类型的修饰。

其他修饰包含寡核苷酸5’和/或3’末端的附加物。这种末端修饰可以是脂类、肽类、糖或其他分子。

糖残基的可能修饰是多方面的，且包括2'-O烷基、锁核酸(LNA)、乙二醇核酸(GNA)、苏阿糖核酸(TNA)、阿拉伯糖苷；阿卓糖醇(ANA)和其他六元糖包括第三代反义寡核苷酸和环己菌素基。

国际专利申请No.WO 00/47599、WO 99/14226和WO 98/39352披露了LNA化合物。包括LNA核苷酸的siRNA化合物实例在ElMen et al.,(NAR 2005.33(1):439-447)和国际专利申请No.WO 2004/083430中披露。六元环核苷酸类似物在Allart,et al(Nucleosides&Nucleotides,1998,17:1523-1526；和Perez-Perez,et al.,1996,Bioorg.and MedicinalChem Letters 6:1457-1460)中披露。包括六元环核苷酸类似物的寡核苷酸在国际专利申请No.WO 2006/047842中披露，其中所述六元环核苷酸类似物包括己糖醇和阿卓糖醇核苷酸单体。

骨架修饰，如乙基(结果是磷酸乙基三酯)；丙基(结果是磷酸丙三酯)；和丁基(结果是磷酸-丁三酯)也是可能的。其他骨架修饰包括聚合物骨架、骨架循环、非循环骨架、硫代-D-核糖骨架、酰胺化物和膦酰基乙酸衍生物。某些结构包括具有一个或多个2'-5'核苷酸间键(桥或骨架)的siRNA化合物。

本发明还涉及到下调各种基因表达的化合物，特别涉及新的小分子干扰RNA(siRNA)化合物，以及这些新的siRNA在治疗各种眼部疾病和眼睛病症中的用途。

每个基因都有19个低聚物序列的单独列表，其优先以它们专有算法的记分作为最佳的人类基因表达靶向序列的基础。21或23个碱基长度的siRNA序列可以通过此处的19个碱基序列的5'和/或3'端延伸而产生。优选地，这种延伸与到相应的mRNA序列互补。某23个低聚物通过这种方法设计，其中的优化顺序对应19个碱基的顺序。表B1-B36提供了用于制备siRNA.的人类正义和相应的反义寡核苷酸。跨物种的缩写是：Ms：鼠，Rb：兔，Chmp：黑猩猩，Mnk：猴，Chn：灰鼠，GP：荷兰猪。

眼部疾病

治疗型寡核苷酸化合物的局部传输用于治疗广谱的眼部疾病和障碍。本发明的某些化合物用于治疗患有疾病和障碍的病人，其中视神经的神经保护是有益的，例如：

1.原发性/继发性开角型青光眼

2.多发性硬化(视神经炎)

3.视网膜中央/分枝静脉阻塞

4.缺血性视神经病变(癫痫持续状态，HIV-1感染)

5.视神经损伤

6.肿瘤延伸到鞍区域(蝶鞍上方)

7.近交叉肿瘤(与垂体瘤压迫视交叉相关的视力丧失可能是暂时或永久性的，可能与视网膜神经节细胞不可逆的逆行变性的程度有关。

8.视网膜神经胶质瘤

原发性开角型青光眼

大部分青光眼的病例被认为是原发性开角型青光眼POAG的形式，也称慢性开角型青光眼。POAG是由于眼前房内的房水液体增加而造成眼内压(IOP)。高IOP，可以通过“眼压测量”试验测得，由液体进入眼睛造成，且不足以溢出眼睛。通常情况下，液体是通过渗出睫状体的血管而进入眼睛。这种液体最终朝晶状体方向流动，通过瞳孔(虹膜中央)，并进入虹膜-角膜角。形成虹膜和角膜结合的解剖角。然后该液体通过该角的小梁网，并通过巩膜静脉窦离开眼睛。

如果过多的液体进入眼睛，或者如果小梁网“排泄”被堵塞(例如，有杂物或细胞)，这样使得没有足够的液体离开眼睛，压力积聚在所谓的“开角型青光眼“内。当虹膜后部粘附到晶状体前表面形成“瞳孔阻滞”时，也可引起“开角型青光眼“，并防止眼内液体通过瞳孔进入前房。

如果虹膜和角膜之间的的角度过于狭窄或甚至封闭，然后液体倒流，引起所谓的“闭角型青光眼”内的压力增强。

未经治疗的青光眼最终导致视神经萎缩和失明。

正常眼压性青光眼

在美国约25-30％的青光眼的眼内压力是正常的(介于12-22mmHg)，被称为正常眼压性青光眼病症(在日本，比例可能高达70％)。导致视神经损伤的其他因素也存在，但不影响IOP。

闭角型青光眼

闭角型青光眼(也称为角性青光眼)是所有青光眼病例中15％引起的原因。在美国不如POAG常见，但由于在亚洲人中患病率高，其构成世界约一半的青光眼病例。该虹膜推挤晶状体，有时粘附于它，使其与引流角隔离。这种情况可能发生得很突然，导致压力的立即上升。当瞳孔突然收缩时，其通常发生在易得病人群中。闭角型青光眼也可以是慢性和平缓的，这是一种不太常见的情况。

先天性青光眼

先天性青光眼，是从出生时开始，其眼睛的排出通道不能正常排泄。这是非常罕见的，新生儿中发病的概率为约1万分之一。这可能是一种遗传性疾病，往往可以用显微手术矫正。

一方面，本发明提供了一种减弱患有青光眼受试者眼睛中目标眼部mRNA表达的方法，其中包括局部(无创伤性)向受试者眼睛表面施用至少一种化学修饰siRNA和药学上可接受载体的有效量。在某些实施例中，至少一种眼部目标mRNA是选自表A1列表中如SEQ IDNO:1-35所述的基因产物。在某些优选实施例中，目标眼部mRNA是选自CASP2、ASPP1、TP53BP2、BNIP3、RTP801L、ADRB1和CAPNS1的基因产物。在目前的优选实施例中，siRNA以滴眼剂传输为配方。在不同实施例中，目标眼部mRNA如SEQ ID NO:1-2所述。

另一方面，本发明提供了一种治疗所需受试者青光眼的方法，其中包括局部(无创伤性)向受试者眼睛表面施用至少一种化学修饰siRNA的有效量，所述化学修饰siRNA抑制目标基因在受试者眼睛中的表达。在一些实施例中，该基因是选自表A1列表中的人类基因，其被转录为任一SEQ ID NO:1-35所述的mRNA。在某些优选实施例中，该基因是选自CASP2、ASPP1、TP53BP2、BNIP3、RTP801L、ADRB1和CAPNS1。在目前的优选实施例中，siRNA以滴眼剂传输为配方。在不同实施例中，目标眼部mRNA如SEQ ID NO:1-2所述。

视神经炎

视神经炎是视神经的炎症，可能影响神经和眼球内盘(乳头炎)或眼球(球后视神经炎)后面部分。视神经炎可能是由以下任何一项引起：脱髓鞘性病，如多发性硬化症或感染后脑脊髓炎；全身性病毒或细菌感染，其中包括炎症性疾病并发症(如鼻窦炎、脑膜炎、结核病、梅毒、脉络膜视网膜炎、眼眶炎症)；营养和代谢性疾病(如糖尿病、恶性贫血、甲状腺机能亢进)；遗传视神经病，一种罕见形式的遗传视神经病，主要影响年轻人；毒素(烟草、甲醇、奎宁、砷、水杨酸、铅)和创伤。

视神经萎缩

视神经萎缩症是一种遗传性或由视神经和视束神经纤维变性造成的视力丧失。这可能是通过视网膜中央静脉或动脉闭塞，动脉硬化改变引起，可继发于视网膜退化疾病，可能对视神经形成压力的结果，或者可能与代谢疾病(如糖尿病)、创伤、青光眼或毒性(酒精、烟草或其他有毒物质)有关。视神经纤维的变性和萎缩是不可逆的，虽然在一些病例中静脉注射类固醇被发现能减慢其过程。

视神经乳头水肿

视神经盘(乳头)肿胀，最常见的原因是颅内压增加(肿瘤诱导)、恶性高血压或视网膜中央静脉形成血栓。该疾病通常是双边的，神经头是非常升高和肿胀的，瞳孔反应通常是正常的。视力最初不会受到影响，眼球运动也没有疼痛。如果视神经乳头水肿不及时治疗，继发视神经萎缩和永久的视力丧失可能会发生。

缺血性视神经病变(ION)

由于滋养动脉的闭塞性障碍，供应视神经(通常在一只眼中)的动脉血液不足而造成严重的致盲疾病。视神经病变可以是前面的，从而导致视神经盘的苍白水肿，或面的，其中视神经盘不肿，但眼球和视交叉之间发生异常。前部缺血性视神经病变通常会导致视力丧失，可能会突然或在几天后发生。后部缺血性视神经病变并不常见，并且诊断在很大程度上取决于其他原因的排除，主要是中风和脑肿瘤。

其他疾病和障碍包括干眼症、糖尿病性视网膜病变、糖尿病性黄斑水肿和色素性视网膜炎。

干眼症

干眼症，又称为干燥性角膜结膜炎或干燥性角结膜炎，通常是由润滑眼睛的泪膜产物减少引起的常见问题。干眼症的大多数患者觉得不适，并没有丧失视力；虽然在严重情况下，角膜可能会损伤或感染。

干眼症是一种眼泪的多因性疾病，在眼睛表面发生，引起不舒服、视觉障碍以及在潜在损伤眼睛表面的泪膜不稳定性。它伴随着泪膜渗透压和眼睛表面炎症增加。

泪腺是由腺泡、导管和肌上皮细胞组成的多叶组织。腺泡细胞在泪腺细胞中占80％，是合成、贮存和蛋白质分泌的场所。这些蛋白质具有的抗菌(溶菌酶、乳铁蛋白)或生长因子(表皮生长因子、转化生长因子α、角膜细胞生长因子)性能对眼表面健康是至关重要的。该导管细胞的主要功能是修饰腺泡细胞分泌的原生流体，分泌水和电解质。该肌上皮细胞中含有多个过程，而腺泡和导管细胞底面积周围被认为是将液体压入和压出管道至眼表面。

泪腺功能失调机制

细胞凋亡、激素失衡、自身抗体产物、信号分子改变、神经功能障碍和炎性细胞因子水平的增加曾被认为是泪腺功能不全的可能介质。小儿干燥综合征的主要症状之一是干眼症。泪腺的腺泡和导管上皮细胞凋亡曾被认为是一种引起分泌功能损伤(Manganelliand Fietta,Semin Arthritis Rheum.2003.33(1):49-65)的可能机制。不希望受理论束缚，凋亡的上皮细胞死亡可能是由于涉及Fas(Apo-1/CD95)、Fas(FasL/CD95L)、凋亡因子、凋亡蛋白酶、穿孔蛋白和颗粒酶的几个凋亡路径的激活。细胞毒性T细胞通过蛋白酶的释放，如穿孔蛋白和颗粒酶或以T细胞表达的FasL与上皮细胞Fas的相互作用，可导致腺泡细胞凋亡。

干眼症的目前治疗主要是局部和对症的，如：泪润滑剂补充；泪润湿治疗，如封泪管、水分室型眼镜或隐形眼镜；泪刺激，例如通过促分泌素；生物泪替代品；抗炎治疗(环孢菌素、类固醇、四环素)；和膳食的必需脂肪酸。

一方面，本发明提供了一种减弱患有干眼症受试者眼睛中目标眼部mRNA表达的方法，其中包括局部(无创伤性)向受试者眼睛表面施用至少一种化学修饰siRNA的有效量和药学上可接受的载体。在一些实施例中，该眼部目标mRNA是选自如表A2中如SEQ ID NO:5,8-10,26-27,30-44所述人类基因的产物。在一些实施例中，该目标眼部mRNA是选自FAS、FAS配位体(FASL)、p53、LRDD、PARP1、AIF(凋亡诱导因子)、NOS1、NOS2A、XIAP和SHC1-SHC。在某些优选实施例中，该目标眼部mRNA如任一SEQ ID NO:36-44所述。在目前的优选实施例中，该siRNA是以滴眼剂传输为配方。在不同实施例中，该受试者是患有小儿干燥综合症。在一些实施例中，siRNA的正义和反义链是选自表16-17中如SEQ ID NO:13225-15224所述的序列。

另一方面，本发明提供一种治疗所需受试者干眼症的方法，其中包括局部(无创伤性)向受试者眼睛表面施用至少一种化学修饰siRNA的治疗有效量，所述化学修饰siRNA抑制目标基因在受试者眼睛中的表达。在一些实施例中，该目标基因是选自表A2中的人类基因，其mRNA如任一SEQ ID NO:5、8-10、26-27或30-44所述。在一些实施例中，该目标基因是是选自FAS、FAS配位体(FASL)、p53、LRDD、PARP1、AIF(凋亡诱导因子)、NOS1、NOS2A、XIAP和SHC1-SHC。在某些优选实施例中，该目标基因mRNA如任一SEQ ID NO:36-44所述。在目前的优选实施例中，siRNA是以滴眼剂传输为配方。在不同实施例中，该受试者是患有小儿干燥综合症。在一些实施例中，siRNA的正义和反义链是选自表16-17中如SEQ ID NO:13225-15224所述的序列。

色素性视网膜炎

色素性视网膜炎(RP)代表了一组以渐进性周边视觉丧失和夜盲症为特征的遗传性疾病，可能导致中心视觉丧失。虽然病情发展可通过饮食中补充维生素A减弱，但目前还没有视网膜色素变性的治疗方法。

视锥杆感光细胞的细胞凋亡是RP中视网膜变性的关键过程，并代表了成人失明的主要原因。

一方面，本发明提供一种减弱患有色素性视网膜炎(RP)受试者眼睛的目标眼部mRNA表达的方法，其中包括局部(无创伤性)向受试者眼睛表面施用至少一种化学修饰siRNA的有效量和药学上可接受的载体。在一些实施例中，该眼部目标mRNA是选自表A4所列基因的基因产物，该基因被转录为任一SEQ ID NO:3、14、26-35、54-57所述的mRNA。在一些实施例中，该目标眼部mRNA是选自由CASP1、CASP3、CASP12、RTP801、RTP801L、钙蛋白酶S1、PARP1、AIF、NOS1、NOS2、XIAP和SHC1-SHC组成的组的基因产物。在目前的优选实施例中，该siRNA是以滴眼剂传输为配方。在某些优选实施例中，该siRNA目标mRNA如SEQ ID NO:56-57所述。在一些实施例中，siRNA的正义和反义链是选自表16-17中如SEQ ID NO:13225-15224所述的序列。

另一方面，本发明提供一种治疗所需受试者色素性视网膜炎(RP)的方法，其中包括局部(无创伤性)向受试者眼睛表面施用至少一种化学修饰siRNA的治疗有效量，所述化学修饰siRNA抑制目标基因在受试者眼睛中的表达。在一些实施例中，该目标基因是选自表A4所列的人类基因，被转录为如任一SEQ ID NO:3、14、26-35、54-57所述的mRNA。在一些实施例中，该基因是选自由CASP1、CASP3、CASP12、RTP801、RTP801L、钙蛋白酶S1、PARP1、AIF、NOS1、NOS2、XIAP和SHC1-SHC组成的组的人类基因。在目前的优选实施例中，siRNA是以滴眼剂传输为配方。在某些优选实施例中，该siRNA靶向和抑制如SEQ ID NO:56-57所述的mRNA。在一些实施例中，siRNA的正义和反义链是选自表11中如SEQ ID NO:9517-10516所述的序列。

糖尿病性视网膜病变

糖尿病性视网膜病变是糖尿病的并发症，并是导致失明的主要原因。它在当糖尿病损伤视网膜内的微小血管后发生。糖尿病性视网膜病变具有四个阶段：

-轻微的非增殖性视网膜病：视网膜内血管的小动脉瘤

-适度的非增殖性视网膜病：当该病发展时，滋养视网膜的血管被堵塞。

-严重的非增殖性视网膜病：更多的血管被堵塞，使视网膜的几个区域丧失了血液供给，胜过了新血管的增长。

-增殖性视网膜病：新血管随着视网膜和玻璃体凝胶表面而增长。当血管渗漏血液后，可能导致严重的视力丧失，甚至失明。

在怀孕期间，糖尿病视网膜病变可能是糖尿病女性的问题。

一方面，本发明提供一种减弱患有糖尿病视网膜病变受试者眼睛的目标眼部mRNA表达的方法，其中包括局部(无创伤性)向受试者眼睛表面施用至少一种化学修饰siRNA的有效量和药学上可接受的载体。在一些实施例中，该目标眼部mRNA是选自如表A3所列的基因产物，其含有任一SEQ ID NO:1-2、3、5、6-7、8-10、12、13、24-25、26-27、30-35、45-53所述的mRNA。在目前的优选实施例中，siRNA是以滴眼剂传输为配方。在某些优选实施例中，该目标眼部mRNA如任一SEQ ID NO:48-53所述。在一些实施例中，siRNA的正义和反义链是选自表4、28-32中的序列，如SEQ ID NO:2669-3648和25575-29594所述。

另一方面，本发明提供一种治疗所需受试者糖尿病视网膜病变的方法，其中包括局部(无创伤性)向受试者眼睛表面施用至少一种化学修饰siRNA的治疗有效量，所述化学修饰siRNA抑制目标基因在受试者眼睛中的表达。在一些实施例中，该目标基因是选自表A3所列的人类基因，其含有任一SEQ ID NO:1-2、3、5、6-7、8-10、12、13、24-25、26-27、30-35、45-53所述的mRNA。在目前的优选实施例中，siRNA是以滴眼剂传输为配方。在某些优选实施例中，该目标眼部mRNA如任一SEQ ID NO:48-53所述。在一些实施例中，siRNA的正义和反义链是选自表4、28-32中的序列，如SEQ ID NO:2669-3648和25575-29594所述。

不希望受理论束缚，糖尿病视网膜病变损伤的血管可从两方面导致视力丧失：脆弱的，异常血管可能生长，并渗漏血液进入眼睛中心，使视力模糊。这是增殖性视网膜病变，是该病的第四阶段和最晚期。该液体可渗入黄斑中心，导致视力模糊。这种疾病被称为黄斑水肿。它可以发生在糖尿病性视网膜病变的任何阶段，但更可能会随着病情的发展而发生，被称为糖尿病黄斑水肿(DME)。

老年性黄斑变性(AMD)

降低的最佳矫正的最常见原因，在美国65岁以上受试者视力是被称为老年性黄斑变性(AMD)的视网膜疾病。眼睛受AMD影响的区域是黄斑，其是视网膜中心的小区域，主要由感光细胞组成。随着AMD的发展，这种疾病的特点是中心视力的突然丧失。所谓的“干”AMD占AMD病人的85％-90％，并涉及到眼色素分布的改变，感光细胞的损伤和视网膜功能的减弱，这是由于整体细胞的萎缩。“湿”AMD涉及到视网膜下腔内导致血栓或疤痕的异常脉络膜血管的增生。因此，“湿”AMD的发病是由于神经视网膜下方异常脉络膜新生血管网络(脉络膜新生血管，CNV)的形成。新形成的血管过于渗漏。这导致视网膜下积液以及引起视敏度丧失的血液的积聚。最终，所涉及区域的视网膜功能完全丧失，作为一个包括脉络膜和视网膜形式的大型盘状疤痕。而干AMD病人可以保持质量下降的视力，湿AMD往往导致视力失明(Hamdi&Kenney,Frontiers in Bioscience,e305-314,May2003)。

一方面，本发明提供一种减弱患有AMD或DME受试者眼睛的目标眼部mRNA表达的方法，其中包括局部(无创伤性)向受试者眼睛表面施用至少一种化学修饰siRNA的有效量和药学上可接受的载体。在一些实施例中，该目标眼部mRNA是选自表A3所列的人类基因产物，其含有任一SEQ ID NO:1-2、3、5、6-7、8-10、12、13、24-25、26-27、30-35、45-53所述的mRNA。在目前的优选实施例中，siRNA是以滴眼剂传输为配方。在某些优选实施例中，该目标眼部mRNA是人类CTSD、RTP801和BNIP3的产物。

另一方面，本发明提供一种治疗所需受试者AMD或DME的方法，其中包括局部(无创伤性)向受试者眼睛表面施用至少一种化学修饰siRNA的治疗有效量，所述化学修饰siRNA抑制目标基因在受试者眼睛中的表达。在一些实施例中，该目标基因是选自表A3所列的人类基因，其含有任一SEQ ID NO:1-2、3、5、6-7、8-10、12、13、24-25、26-27、30-35、45-53所述的mRNA。在目前的优选实施例中，siRNA是以滴眼剂传输为配方。在某些优选实施例中，该目标眼部mRNA是人类CTSD、RTP801和BNIP3的目标人类基因。

由本发明化合物治疗的附加眼部疾病

病毒和细菌性疾病

与眼部组织相关的病毒和细菌性疾病可以由本发明的化合物治疗。结膜炎和其他眼睑疾病或病症可以被治疗，特别是根据本发明方法施用对目标基因复制和/或生物体存活必需的寡核苷酸(如siRNAs)。

与肿瘤相关的视力丧失

另一方面，本发明提供治疗与所需受试者肿瘤相关的视力丧失的方法，其中包括局部地无创伤性向受试者眼睛表面施用至少一种化学修饰的siRNA的治疗有效量，所述化学修饰的siRNA抑制与受试者肿瘤相关的至少一种基因的表达，其以一定量有效治疗视力丧失。

根据本发明，肿瘤导致视力丧失，其包括恶性肿瘤(癌症)和良性肿瘤。肿瘤包括任何眼部组织或任何眼部细胞的肿瘤，包括，但不仅限于，脉络膜肿瘤、结膜肿瘤、眼睑肿瘤、浸润性眼内肿瘤、虹膜肿瘤、转移性眼部肿瘤、视神经肿瘤、眼眶肿瘤及视网膜肿瘤。更具体地说，本发明涉及治疗的肿瘤及癌症的非详尽名单包括脉络膜肿瘤，如脉络膜血管瘤、脉络膜黑色素瘤、脉络膜转移瘤、脉络膜痣、脉络膜骨瘤、睫状体黑色素瘤和Ota痣；结膜肿瘤，如结膜卡波西氏肉瘤、眼球表面皮样囊肿、结膜淋巴瘤、非典型性的黑色素瘤和PAM、染色结膜肿瘤、睑裂黄斑、翼状胬肉、鳞状细胞癌及结膜上皮内瘤；眼睑肿瘤，如基底细胞癌、毛细血管瘤、汗腺囊瘤、睑缘痣、脂溢性角化病、眼睑恶性黑色素瘤、眼睑皮脂腺癌和眼睑鳞状细胞癌；浸润性眼内肿瘤，如慢性淋巴性白血病、眼睑肿瘤癌脉络膜及眼内淋巴瘤；浸润性脉络膜病和眼内淋巴瘤；虹膜肿瘤，如前段葡萄膜转移瘤、虹膜囊肿、虹膜黑色素细胞瘤、虹膜黑色素瘤和虹膜珍珠状囊肿；转移性眼部肿瘤，如转移性脉络膜黑色素瘤；视神经肿瘤，如影响视神经的脉络膜黑色素瘤、视神经病变的乳头周围转移瘤、视神经黑色素细胞瘤和视神经鞘脑膜瘤；眼眶肿瘤，如泪腺的腺样囊性癌、眼眶的海绵状血管瘤、眼眶的淋巴管瘤、眼眶黏液囊肿、眼眶炎性假瘤、眼眶横纹肌肉瘤、儿童眼周血管瘤及硬化型炎性假瘤；视网膜肿瘤，如视网膜色素上皮(RPE)增生、视网膜色素上皮(RPE)肿瘤、成视网膜细胞瘤、vonHippel血管瘤。

药物组合物

虽然本发明寡核苷酸化合物作为原料药施用也是可能的，最好是将其作为药物组合物施用。因此，本发明提供了一种药物组合物，其中包括本发明的一种或多种化合物；以及药学上可接受的载体。这种组合物可包括两种或多种/不同的寡核苷酸/siRNA的混合物.

本发明还提供了一种药物组合物，其中包括与本发明的一种或多种化合物共价或非共价连接的本发明的至少一种化合物，其以一定量有效抑制上述所公开的一种或多种基因；以及药学上可接受的载体。该化合物可通过内源性细胞复合物在细胞内生成，以产生本发明的一种或多种寡核糖核苷酸。

本发明还提供一种药物组合物，其中包括药学上可接受的载体和本发明的一种或多种化合物，其以一定量有效下调患有眼部疾病或障碍的受试者眼睛中的人类基因的表达。

本发明还提供了一种制备药物组合物的方法，包括：

提供本发明的一种或多种化合物；及

使所述化合物与药学上可接受的载体混合。

药学上可接受的载体，最好是由眼科给药领域的普通技术人员选择。

在不同实施例中，本发明的药物组合物包括至少一种本发明的siRNA化合物或其盐类，以重量计达99％，其与生理学上可接受的眼用载体介质混合，如水、氯化钠、缓冲剂、盐水(例如磷酸盐缓冲剂(PBS))、甘露醇等及其组合，以形成一种水相的眼用悬液或溶液。

该药物组合物可选择地另外包括至少一种眼科上可接受的防腐剂，比如苯扎氯铵。此外，眼科药物组合物可能包括眼科上可接受的表面活性剂，以协助溶解siRNA。

本发明的眼科药物组合物可能通过溶解或混合一种或多种干扰RNA与眼科上可接受的载体，比如一种生理学上可接受的等渗水相缓冲剂。

在优选实施例中，用于制备眼科药物组合物的siRNA化合物是与眼科上可接受的载体在药学上的有效剂量内混合。在某些优选实施例中，眼科上可接受的载体是PBS。

在一些实施例中，本发明的眼科药物组合物还包括附加的药学活性剂或药学活性剂的组合，如非甾体抗炎药、类固醇、抗生素等。

此外，相比于包括本发明一种或多种化合物与本发明基因的mRNA转录物接触的对照，本发明提供了一种抑制至少20％本发明基因的表达。在一些实施例中，相比于对照，活性siRNA化合物能够抑制至少20％、30％、40％、50％、60％或70％的基因表达水平。在某些优选实施例中，相比于对照，抑制至少75％、80％或90％的表达水平。

在一个实施例中，寡核糖核苷酸是抑制本发明的一种或多种基因，据此，该抑制是选自由基因功能抑制、多肽抑制和mRNA表达抑制组成的组。

在一个实施例中，该化合物能够抑制一种多肽，即该抑制是选自由功能抑制(尤其可能是通过具有已知的天然基因/多肽反应器进行酶法测定或键能测定)、蛋白质抑制(尤其可能是通过免疫印迹、酶联免疫吸附试验或免疫沉淀检测)及mRNA表达抑制(尤其可能是通过印迹法、定量RT–PCR、原位杂交或基因芯片杂交检测)组成的组。

联合治疗

本发明的化合物可以单独施用或与用于治疗眼部疾病或障碍的其他治疗药物组合施用。

在一些实施例中，本发明的眼科药物组合物还包括附加的药学活性剂或药学活性剂的组合，如寡核苷酸，例如：siRNA、非甾体抗炎药、类固醇、抗生素等。

在一个实施例中，两种或多种治疗剂的联合施用实现了协同效应，即，治疗剂的影响要大于对组合中单个成分的治疗作用总和。在另一个实施例中，两种或多种治疗剂的联合施用达到了累加效应。

包括联合治疗的有效成分可通过单剂量形式一起施用或每种活性剂单独施用。在某些实施例中，第一种和第二种治疗剂是以单剂量形式施用。该药剂可配制成局部施用的单一溶液。此外，第一种和第二种治疗剂可作为单独组合物施用。第一种活性剂可与第二种活性剂同时施用或者第一种活性剂可与第二种活性剂间歇性地施用。第一种和第二种治疗剂之间的时间长度可以调整，以达到理想的治疗效果。例如，第二种治疗剂可在施用第一种治疗剂几分钟(如1、2、5、10、30或60分钟)或几小时(如2、4、6、10、12、24或36小时)后施用。在某些实施例中，在第二种治疗剂施用之间施用治疗剂之一的一种以上剂量可能是有利的。例如，第二种治疗剂可在第一种治疗剂施用2小时后施用，然后10小时后施用。或者，在第二种治疗剂施用之间施用第一种治疗剂的一种以上剂量也可能是有利的。在某些实施例中，优选地，每种活性剂的治疗效果在每种治疗剂持续时间的至少一部分重叠，这样整体的联合治疗的治疗效果部分是由于该联合治疗的合并或协同效应。

传输

此处所公开的siRNA分子通过载体或稀释剂制得的分子直接施用被传输到眼睛的目标组织。

术语“裸siRNA”指的是不受用于协助、促进或方便进入细胞的任何传输载体或制剂(包括病毒序列、病毒粒子、脂质体制剂、脂质体或沉淀剂等)影响的siRNA分子。例如，PBS或眼科上可接受的制剂中的siRNA是“裸siRNA”。在本发明的某些实施例中，siRNA被作为裸siRNA传输。对于某些应用，增加siRNA在眼睛或鼻腔停留时间的制剂可能是需要的，例如，通过添加聚合物或增稠剂。

已经开发出特别涉及提高或改善siRNA传输的传输系统，(见，如，Shen et alFEBS Let.2003,539:111-114；Xia et al.,Nat.Biotech.2002,20:1006-1010；Reich etal.,Mol.Vision 2003,9:210-216；Sorensen et al.,J.Mol.Biol.2003.327:761-766；Lewis et al.,Nat.Gen.2002,32:107-108和SiMeoni et al.,NAR 2003,31,11:2717-2724)。

药学上可接受的载体、溶剂、稀释剂、赋形剂、佐剂和载体以及植入载体一般指的是惰性的无毒固体或液体填料，稀释剂或不与本发明活性成分反应的封装材料，它们包括脂质体和微球体。用于本发明的传输系统实例包括美国专利No.5,225,182；5,169,383；5,167,616；4,959,217；4,925,678；4,487,603；4,486,194；4,447,233；4,447,224；4,439,196和4,475,196。许多其他类似的植入物，传输系统和构件是所属领域的技术人员众所周知的。

局部眼部传输或鼻内传输的眼科药物组合物制备应考虑到多项因素，见Bar-Ilanand Neumann,in Textbook of Ocular Pharmacology,ZimMerman et al eds.,Lippencott-Raven 1997。

优选地，局部给药途径是向受试者提供有效剂量的治疗siRNA化合物。剂型可包括乳液、悬浮液、溶液、药膏等。在某些优选实施例中，包括至少一种siRNA本发明的药物组合物是以滴眼剂传输。在另一个实施例中，包括至少一种siRNA本发明的药物组合物是以喷雾或薄雾传输。例如，美国专利No.4,052,985披露了眼科喷雾涂抹器。

在本发明的某些实施例中，siRNA局部地达到其目标细胞，例如，直接接触或通过细胞、组织或细胞内液扩散。本发明的siRNA或药物组合物是根据良好医疗实践的剂量给药，同时考虑到个别病人的临床状况、治疗的疾病、给药计划、病人年龄、性别、体重及医生公知的其他因素。

因此，此处所涉及的“治疗有效剂量”是通过所属技术领域的这种考虑确定的。剂量必须是有效的，以实现改善，包括但不限于病程的改善，更迅速的恢复，症状的改善，症状的消除和由所属技术领域的普通技术人员视情况而选择的其它指标。本发明的siRNA可以单剂量或多剂量给药。

一般来说，人类化合物的活性剂量范围为1ng/kg至约20-100mg/kg体重每天，优选为0.01mg/kg至约2-10mg/kg体重每天，在单剂量或多剂量的方案中，每天一剂到每天两次、三次或多次。在某些实施例中，siRNA化合物被配制成滴眼剂局部施用到眼睛上，按组合物体积计包括约5μg/μl至约60μg/μl、按组合物体积计包括约6.6μg/μl、按组合物体积计包括约25μg/μl、按组合物体积计包括约33.3μg/μl、按组合物体积计包括约50μg/μl。

配方的pH值为约pH 5至约pH 8，或约pH 5至约pH 7，或pH5至约pH 6。在某些实施例中，pH值为约pH5.9、约pH 6.15、约pH 6.25、约pH 6.3、约pH 6.5、约pH 7.25。本发明的化合物可以局部施用到眼睛表面上。应当指出，优选地，该化合物被作为化合物或药学上可接受的盐活性成分与药学上可接受的载体、溶剂、稀释剂、赋形剂、佐剂和或载体结合使用。此处所披露的优选传输方法是向眼睛局部施用眼科组合物。

液体形式可通过滴剂或喷雾制得。液体组合物包括水溶液、有或无有机共溶剂、水相或油相悬浮液、含食用油的乳液以及类似的药物载体。

这些化合物可通过任何适当的给药路径向人类和其它动物的眼睛给药以进行治疗，通过，例如，喷雾或滴剂给药，以及通过药膏或滴剂局部给药。

治疗方法

一方面，本发明涉及一种治疗与所需受试者眼睛中表A1-A4所列基因的表达相关的眼部疾病或障碍的方法，其中包括局部无创伤性地向受试者眼睛表面施用一定量的化学修饰siRNA，所述化学修饰siRNA抑制至少一种基因的表达。在某些优选实施例中，施用一种或多种目标基因的多种siRNA。

在优选实施例中，正在接受治疗的受试者是温血动物，尤其是，包括人类的哺乳动物。

本发明的方法包括局部无创伤性地向受试者施用一种或多种下调表A1-A4的基因表达的抑制化合物；尤其是有效治疗剂量的siRNA，从而治疗该受试者。

术语“治疗”指的是治疗和预防疾病或预防措施，其中目的是防止或减缓，减轻如上述的相关眼部疾病。需要治疗者包括那些已经患有疾病或病症、那些具有发生疾病或病症倾向以及那些预防疾病或病症的人。本发明的化合物可在眼部疾病或病症或与其相关的症状发病之前、期间或之后施用。在治疗是为了预防的情况下，那么本发明涉及一种延迟发病或避免疾病或障碍发展的方法。

眼部疾病包括急性带状隐匿性外层视网膜病变、艾迪综合征、老年性黄斑变性、弱视、无虹膜、瞳孔不等、无眼畸胎、无晶状体、睑缘炎、上睑下垂、睑痉挛、失明、白内障、睑板腺囊肿、脉络膜视网膜炎、无脉络膜、缺损、结膜疾病、结膜炎、角膜疾病、角膜营养不良、角膜水肿、角膜溃疡、糖尿病黄斑水肿、糖尿病视网膜病变、复视、双行睫，干眼综合征、眼球后退综合征、睑外翻、眼内炎、睑内翻、内斜视、剥脱综合征、外斜视、眼部畸形、眼肿瘤、广泛纤维化综合征、青光眼、回旋形萎缩、偏盲、白化病综合症、麦粒肿、霍纳综合征、远视、眼前房出血、虹膜炎、卡恩斯-萨耶尔综合症、角膜炎、圆锥形角膜、泪器疾病、泪道阻塞、晶状体疾病、黄斑变性、眼球震颤、病理性疾病、眼球运动障碍、动眼神经神经疾病、眼肌麻痹、视神经萎缩、遗传性疾病、视神经疾病、视神经炎、缺血性视神经病变、眶蜂窝织炎、视神经乳头水肿、老花眼、翼状胬肉、瞳孔畸形、屈光不正、视网膜脱离、视网膜病、视网膜静脉阻塞、视网膜母细胞瘤、视网膜色素变性、早产儿视网膜病、视网膜裂、巩膜炎、盲点、斜视、小儿干燥综合征，Thygeson浅层点状角膜炎、沙眼、葡萄膜炎。

寡核苷酸

优选地，用于此处披露方法的寡核苷酸是双链寡核苷酸和siRNA化合物，并包括未修饰和化学和/或结构修饰的化合物。

与已知基因相应的siRNA的选择与合成已被广泛报道；见，例如，Ui-Tei et al.,JBioMed Biotechnol.2006；65052；Chalk et al.,BBRC.2004,319(1):264-74；Sioud&Leirdal,Met.Mol Biol.2004,252:457-69；Levenkova et al.,Bioinform.2004,20(3):430-2；Ui-Tei et al.,NAR.2004,32(3):936-48.例如，修饰siRNA的使用和生产，见，例如，Braasch et al.,Biochem.2003,42(26):7967-75；Chiu et al.,RNA.2003,9(9):1034-48；PCT公布第WO 2004/015107号和WO 02/44321号以及美国专利第5,898,031号和第6,107,09号。

本发明提供了下调所需基因表达的双链寡核苷酸(如siRNAs)。本发明的siRNA是寡核糖核苷酸双链，其中正义链是来自所需基因的mRNA序列，反义链是与正义链互补的。一般而言，目标mRNA序列的一些偏差是可接受的，也不会破坏siRNA活性(见，如Czauderna etal.,NAR.2003,31(11):2705-2716)。本发明的siRNA在破坏或不破坏mRNA的情况下能在转录后水平上抑制基因表达。不希望受理论束缚，siRNA可能靶向mRNA，进行特异性裂解和降解和/或可能会抑制目标信息的转录。

在一些实施例中，siRNA是钝端的，即Z和Z'是缺失的，在一端或两端。更具体地说，siRNA可能在由第一链5'-端和第二链3'-末端和/或由第一链3'-端和第二链5'-端规定的末端是钝端的。

在其他的实施例中，至少一条或两条链可能在至少一种核苷酸的5'端具有悬突；该悬突可能由至少一个脱氧核苷酸组成。至少一条链也可能选择性地在至少一种核苷酸3'-端具有悬突。该悬突可能由1至5个核苷酸组成。

RNA双链的长度是约18至40个核糖核苷酸，优选为19、21或23个核苷酸。此外，每一条链的长度可能独立地选自由约15至约40个碱基组成的组的长度，优选为18至23个碱基，较优选为19、21或23个核糖核苷酸。在一些实施例中，20或22个碱基分子可能是预期的。

在某些实施例中，所述第一链和目标核酸之间的互补性是完美的(100％)。在一些实施例中，链是基本上互补的，即所述第一链和目标核酸之间有1个、2个或最多3个错配。基本上互补指的是与另一个序列的互补性大于约84％。例如，由19个碱基对及1个错配组成的双链区域造成94.7％的互补性，2个错配造成约89.5％的互补性，3个错配造成约84.2％的互补性，表现为大量的双链区域基本上互补。因此基本上相同指的是与另一个序列的同一性大于约84％。

第一条链和第二链可通过循环结构连接，其可能是由非核酸聚合物组成，特别是，如聚乙二醇。另外，循环结构可能是由核酸组成，其中包括修饰和非修饰核糖核苷酸以及修饰和非修饰脱氧核糖核苷酸。

此外，siRNA第一链的5'-末端可能与第二链的3'-末端连接，或第一链的3'-末端可能与第二链的5'-末端连接，所述通过核酸连接键的连接通常具有2-100个核碱基的长度，优选为约2至约30个核碱基。

在本发明化合物的优选实施例中，所述化合物的至少一个正义和反义链上具有交替的核苷酸修饰，反义链5’和3’末端的19个碱基和23个碱基低聚物的核糖核苷酸在其糖残基是修饰的，而正义链5’和3’末端的核糖核苷酸在其糖残基是未修饰的。正义链5’和3’末端的21个碱基低聚物的核糖核苷酸在其糖残基是修饰的，而反义链5’和3’末端的核糖核苷酸在其糖残基是未修饰的，或者可能在3'末端有可选的其他修饰。如上所述，优选地，反义链中间的核苷酸链是未修饰的。

此外，本发明提供一种包括双链核酸分子的siRNA，其中一条链或两条链上的1、2或3个核苷酸被取代，从而提供至少一个错配的碱基对。每一条链的取代核苷酸优选为在一条链或两条链的末端区域。

根据本发明的一个优选实施例，寡核苷酸/siRNA的正义和反义链只在3'-末端是磷酸化的，而不是在5'-末端。根据本发明的另一个优选实施例，反义和正义链都是非磷酸化的。根据本发明的又一个优选的实施例，正义链的5'末端核糖核苷酸是修饰的，以取消体内5'-磷酸化的任何可能性。

此处所披露的任何siRNA序列可以制成具有任何的修饰/结构。序列加上结构的组合是新的，可用于治疗此处披露的疾病。

siRNA结构

与已知基因相应的siRNA的选择与合成已被广泛报道；(见，如Ui-Tei et al.,JBioMed Biotech.2006；2006:65052；Chalk et al.,BBRC.2004,319(1):264-74；Sioud&Leirdal,Met.Mol Biol.；2004,252:457-69；Levenkova et al.,Bioinform.2004,20(3):430-2；Ui-Tei et al.,NAR.2004,32(3):936-48)。

有关修饰siRNA使用和生产的实例，例如，Braasch et al.,Biochem.2003,42(26):7967-75；Chiu et al.,RNA,2003,9(9):1034-48；PCT申请WO 2004/0151072004/015107(atugen AG)和WO 02/44321(Tuschl et al)。美国专利No.5,898,031和2005/0042647披露了化学修饰低聚物。美国专利申请No.2005/0080246和2005/0042647分别涉及到具有化学修饰核苷间连接的一个交替序列和双链RNA化合物。

其他修饰已经披露。5'-磷酸基团的引入提高了果蝇胚胎中siRNA的活性(Boutla,et al.,Curr.Biol.2001,11:1776-1780)，对人类HeLa细胞中siRNA功能是必要的(Schwarzet al.,Mol.Cell,2002,10:537-48)。Amarzguioui et al.,(NAR,2003,31(2):589-95)显示siRNA活性取决于2’-O-甲基(2’-OMe)修饰物的位点。据Holen et al(NAR.2003,31(9):2401-07)报道，与原生型相比，具有少量2’-OMe修饰核苷的siRNA显示出良好的活性，但活性随着2’-OMe修饰核苷数量的增加而降低。Chiu和Rana(RNA.2003,9:1034-48)指出正义或反义链(完全修饰的链)中2’-OMe修饰核苷的引入相对于未修饰的siRNA，大大降低了siRNA的活性。据报道，2’-OMe基在反义链5'-末端的位置严重限制了活性，而反义链3'-末端的位点和正义链的两个末端是可接受的(Czauderna et al.2003,31(11):2705-16；WO 2004/015107)。本发明的分子提供了一种优势，这是因为它们是无毒的，并可以配制成治疗各种疾病的药物组合物。

核苷酸可以从天然或合成修饰的碱基中选择。天然碱基包括腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶和尿嘧啶。核苷酸的修饰碱基包括次黄嘌呤核苷、黄嘌呤、次黄嘌呤、2-氨基腺嘌呤、6-甲基、2-丙基和其他烷基腺嘌呤、5-卤尿嘧啶、5-卤胞嘧啶、6-氮杂胞嘧啶和6-氮杂胸腺嘧啶、假尿嘧啶、4-硫脲嘧啶、8-卤腺嘌呤，8-氨基腺嘌呤、8-巯基腺嘌呤、8-巯基烷基腺嘌呤、8-羟基腺嘌呤和其他8-取代腺嘌呤、8-卤鸟嘌呤、8-氨基鸟嘌呤、8-巯基鸟嘌呤、8-巯基烷基鸟嘌呤、8-羟基鸟嘌呤和其他取代鸟嘌呤、其他氮杂和去氮杂腺嘌呤、其他氮杂和去氮杂鸟嘌呤、5-三氟甲基尿嘧啶和5-三氟胞嘧啶。本发明包括一种或多种脱碱基基团(非常规的或假核苷酸)的分子，以及包括交替RNA和DNA核苷酸的分子。

此外，多核苷酸类似物可以制得，其中一种或多种核苷酸的结构根本地改变，更好地适合作为治疗或实验试剂。一种核苷酸类似物的实例是肽核酸(PNA)，其中DNA(或RNA)中的脱氧核糖(或核糖)磷酸骨架被与肽发现相似的聚酰胺骨架取代。PNA类似物已被证明能抗酶降解，并能在体内和体外延长生命。

对糖残基的可能修饰是多方面的，包括2'-O烷基、锁核酸(LNA)、乙二醇核酸(GNA)、苏糖核酸(TNA)、阿拉伯糖苷、阿卓糖醇(ANA)以及包括吗啉代和环己菌素基的其他六元糖。此外，所述分子可以另外包含对糖的修饰，如2'烷基、2'氟、2'O烯丙基、2'胺基和2'烷氧基。此处将讨论另外的糖基修饰。

LNA化合物在国际专利申请No.WO 00/47599,WO 99/14226和WO 98/39352中有所披露。包括LNA核苷酸的siRNA化合物的实例在ElMen et al.,(NAR 2005.33(1):439-447)和PCT专利申请No.WO 2004/083430有所披露。

本发明的化合物可以采用一种或多种反向核苷酸合成，例如，反向胸苷倒或反向腺嘌呤(例如，见Takei,et al.,2002.JBC277(26):23800-06)。

骨架修饰，如乙基(产生磷酸三乙酯)；丙基(产生磷酸三丙酯)和丁基(产生磷酸三丁酯)也是可能的。其他骨架修饰包括聚合物骨架、环骨架、非环骨架、硫代磷酸酯-D-核糖骨架、酰胺化物和磷酰基乙酸衍生物。某些结构包括具有一个或多个2'-5'核苷酸间连键(桥或骨架)的siRNA化合物。

此外，本发明抑制核酸分子可能包括一个或多个缺口和/或一个或多个裂口和/或一个或多个错配。不希望受理论束缚，缺口、裂口和错配由于处于使核酸/siRNA部分动摇的优势，因此更可能通过内生的细胞机器如DROSHA或RISC加工成抑制成分。

除了编码这种分子或其他抑制核酸分子的其他核酸序列或分子外，本发明的分子还可包括siRNA、合成的siRNA、shRNA和合成的shRNA。

本发明的化合物可进一步包括末端修饰。生物素基团可以连接到第一和/或第二链5'末端或3'末端或两端的核苷酸上。在一个较优选实施例中，生物素基团是耦合到多肽或蛋白质上。这也是在本发明的范围，该多肽或蛋白质是通过上述其他任何修饰而连接。

优选地，此处所披露的各种末端修饰，是在核酸的核糖核苷酸的核糖基。特别是，末端修饰可能连接或取代核糖基的任何OH-基，包括但不仅限于2'OH、3'OH和5'OH位置，条件是，修饰的核苷酸是末端核苷酸。反向脱碱基或脱碱基是核苷酸，脱氧核糖核苷酸或者核糖核苷酸不具有核苷碱基。这种化合物是，特别是在Sternberger,et al.,(AntisenseNucleic Acid Drug Dev,2002.12,131-43)有所描述。

在本发明的背景下，核酸的缺口指的是一条链缺乏一个或多个内部核苷酸，而核酸的裂口指的是一条链缺乏两个相邻核苷酸之间的核苷酸间连键。本发明的任何分子可包括一个或多个缺口和/或一个或多个裂口。本发明进一步提供由此处披露的任何分子编码的一种siRNA分子，编码此处披露任何分子的一种载体及包括编码它们的此处披露的任何分子或载体的一种药物组合物；以及药学上可接受的载体。

根据本发明方法施用的特定分子通过下面的标题“结构基序”进行了披露。为清楚起见，任何这些分子可以根据本发明的任何方法施用。

结构基序

此处所披露的siRNA化合物是根据以下结构所述的一种修饰或用于本发明方法的串联siRNA或RNAstar(见下文)进行化学和/或结构修饰。表1-36提供了正义和反义的寡核苷酸对，如SEQ ID NO:59-33596所述，用于制备相应的siRNA化合物。

一方面，本发明提供一种如结构(A)所述的化合物：

(A) 5’ (N)_x–Z 3’(反义链)

3’ Z’-(N’)_y 5’(正义链)

其中，每个N和N’是选自未修饰核糖核苷酸、修饰核糖核苷酸、未修饰脱氧核糖核苷酸或修饰脱氧核糖核苷酸的核苷酸；

其中，每个(N)_x和(N’)_y是每个连续的N或N’通过共价键连接到下一个N或N’的寡核苷酸；

其中，每个x和y是介于18至40的整数；

其中，Z和Z'可能是存在或不存在的，但如果存在1-5个连续核苷酸的链在3’末端共价连接的话，其是存在的；以及

其中，(N)_x的序列包括与基因的mRNA中约18至约40个连续核苷酸大体互补的反义序列，所述基因在视网膜内表达且与眼部疾病或障碍相关。在一些实施例中，mRNA如任一SEQ ID NO:1-58所述。

在某些实施例中，本发明提供一种如结构B所述的化合物：

(B) 5’(N)_x 3’ 反义链

3’(N’)_y 5’ 正义链

其中，每个(N)_x和(N’)_y是每个连续的N或N’通过共价键连接到下一个N或N’的寡核苷酸；

其中，每个x和y＝19、21或23，且(N)_x和(N‘)_y是完全互补的

其中，每个(N)_x和(N’)_y中的交替核糖核苷酸包括2’-OMe糖基修饰核糖核苷酸；

其中，(N’)_y的序列是与(N)_x互补的序列；且其中(N)_x的序列包括与任一SEQ IDNO:1-58所述mRNA中的约18至约40个连续核糖核苷酸大体互补的反义序列。

在一些实施例中，每个(N)_x和(N’)_y在3’和5’末端是独立磷酸化或非磷酸化的。

在本发明的某些实施例中，该化合物的反义和正义链中的交替核糖核苷酸是修饰的。

在某些实施例中，其中，每个x和y＝19或23，(N)x的5’和3’末端上的每个N是修饰的；以及

在(N’)y的5’和3’末端上的每个N’上是修饰。

在某些实施例中，其中，(N)x的5’和3’末端上的每个N是修饰的；(N’)y的5’和3’末端上的每个N’是修饰的。

在特定的实施例中，当x和y＝19时，siRNA是由反义链(N)x的第一、第三、第五、第七、第九、第十一、第十三、第十五、第十七和第十九个核苷酸上的2’OMe修饰核糖核苷酸和正义链(N’)y的第二、第四、第六、第八、第十、第十二、第十四、第十六和第十八个核苷酸上的2’OMe修饰核糖核苷酸组成。在不同实施例中，这些特定的siRNA化合物在两末端是钝端的。

在某些实施例中，本发明提供一种如结构(C)所述的化合物：

(C) 5’ (N)_x-Z 3’ 反义链

3’ Z’-(N’)_y 5’ 正义链

其中，每个N和N’是独立选自未修饰核糖核苷酸、修饰核糖核苷酸、未修饰脱氧核糖核苷酸和修饰脱氧核糖核苷酸的核苷酸；

其中，每个(N)x和(N’)y是每个连续的N或N’通过共价键连接到下一个N或N’的寡核苷酸且每个X和Y是介于18至40的整数；

其中，在(N)x中，核苷酸是未修饰的或(N)x包括交替2’O Me糖基修饰核糖核苷酸和未修饰核糖核苷酸；其中，核糖核苷酸在被2’O Me糖基修饰或未修饰的(N)x的中间位置，优选为未修饰的；

其中，(N’)y包括在末端或倒数第二位置进一步含有一个修饰核苷酸的未修饰核糖核苷酸，其中修饰核苷酸是选自由镜像核苷酸、双环核苷酸、2’-糖基修饰核苷酸、阿卓糖醇核苷酸或通过选自2’-5’磷酸二酯键、P-烷氧基连键或PACE连键的核苷酸间连键与相邻核苷酸连接的核苷酸组成的组。

其中，如果(N’)y中一个以上的核苷酸是修饰的，则修饰核苷酸可能是连续的；

其中，Z和Z'可能是存在或不存在的，但如果存在1-5个连续核苷酸的链在3’末端共价连接的话，其是存在的；以及

其中，(N’)y的序列包括与(N)x大体互补的序列；其中，(N)x的序列包括与任一SEQID NO:1-58所述mRNA中的约18至约40个连续核糖核苷酸大体互补的反义序列。

在特定实施例中，x＝y＝19，且在(N)x中，每个修饰核糖核苷酸是2’-OMe糖基修饰的，(N)x中间的核糖核苷酸是未修饰的。因此，在化合物中，其中x＝19，(N)x包括在位点1、3、5、7、9、11、13、15、17和19是2’-OMe糖基修饰的核糖核苷酸。在其他实施例中，(N)x包括在位点2、4、6、8、11、13、15、17和19是2’-OMe糖基修饰的核糖核苷酸，可能还包括一种脱碱基或反向脱碱基假核苷酸，例如在位点5。在其他实施例中，(N)x包括在位点2、4、8、11、13、15、17和19是2’-OMe修饰的核糖核苷酸，可能还包括一种脱碱基或反向脱碱基假核苷酸，例如在位点6。在其他实施例中，(N)x包括在位点2、4、6、8、11、13、17和19是2’-OMe修饰的核糖核苷酸，可能还包括一种脱碱基或反向脱碱基假核苷酸，例如在位点15。在其他实施例中，(N)x包括在位点2、4、6、8、11、13、15、17和19是2’-OMe修饰的核糖核苷酸，可能还包括一种脱碱基或反向脱碱基假核苷酸，例如在位点14。在其他实施例中，(N)x包括在位点1、2、3、7、9、11、13、15、17和19是2’-OMe修饰的核糖核苷酸，可能还包括一种脱碱基或反向脱碱基假核苷酸，例如在位点5。在其他实施例中，(N)x包括在位点1、2、3、5、7、9、11、13、15、17和19是2’-OMe修饰的核糖核苷酸，可能还包括一种脱碱基或反向脱碱基假核苷酸，例如在位点6。在其他实施例中，(N)x包括在位点1、2、3、5、7、9、11、13、17和19是2’-OMe修饰的核糖核苷酸，可能还包括一种脱碱基或反向脱碱基假核苷酸，例如在位点15。在其他实施例中，(N)x包括在位点1、2、3、5、7、9、11、13、15、17和19是2’-OMe修饰的核糖核苷酸，可能还包括一种脱碱基或反向脱碱基假核苷酸，例如在位点14。在其他实施例中，(N)x包括在2、4、6、7、9、11、13、15、17和19是2’-OMe修饰的核糖核苷酸，可能还包括一种脱碱基或反向脱碱基假核苷酸，例如在位点5。在其他实施例中，(N)x包括在位点1、2、4、6、7、9、11、13、15、17和19是2’-OMe修饰的核糖核苷酸，可能还包括一种脱碱基或反向脱碱基假核苷酸，例如在位点5。在其他实施例中，(N)x包括在位点2、4、6、8、11、13、14、16、17和19是2’-OMe修饰的核糖核苷酸，可能还包括一种脱碱基或反向脱碱基假核苷酸，例如在位点15。在其他实施例中，(N)x包括在位点1、2、3、5、7、9、11、13、14、16、17和19是2’-OMe修饰的核糖核苷酸，可能还包括一种脱碱基或反向脱碱基假核苷酸，例如在位点15。在其他实施例中，(N)x包括在位点2、4、6、8、11、13、15、17和19是2’-OMe修饰的核糖核苷酸，可能还包括一种脱碱基或反向脱碱基假核苷酸，例如在位点7。在其他实施例中，(N)x包括在位点2、4、6、11、13、15、17和19是2’-OMe修饰的核糖核苷酸，可能还包括一种脱碱基或反向脱碱基假核苷酸，例如在位点8。在其他实施例中，(N)x包括在位点2、4、6、8、11、13、15、17和19是2’-OMe修饰的核糖核苷酸，可能还包括一种脱碱基或反向脱碱基假核苷酸，例如在位点9。在其他实施例中，(N)x包括在2、4、6、8、11、13、15、17和19是2’-OMe修饰的核糖核苷酸，可能还包括一种脱碱基或反向脱碱基假核苷酸，例如在位点10。在其他实施例中，(N)x包括在2、4、6、8、13、15、17和19是2’-OMe修饰的核糖核苷酸，可能还包括一种脱碱基或反向脱碱基假核苷酸，例如在位点11。在其他实施例中，(N)x包括在2、4、6、8、11、13、15、17和19是2’-OMe修饰的核糖核苷酸，可能还包括一种脱碱基或反向脱碱基假核苷酸，例如在位点12。在其他实施例中，(N)x包括在2、4、6、8、11、15、17和19是2’-OMe修饰的核糖核苷酸，可能还包括一种脱碱基或反向脱碱基假核苷酸，例如在位点13。

在另一个实施例中，相比于目标基因，(N)x包括至少一个核苷酸错配。在某些优选实施例中，(N)x包括一个在位点5、6或14的单核苷酸错配。在结构(C)的一个实施例中，(N’)y的至少两个核苷酸在任何或所有的5’和3’末端通过2’-5’磷酸二酯键连接。在某些优选实施例中，x＝y＝19或x＝y＝23；在(N)x中，核苷酸在2’-OMe糖基修饰核糖核苷酸和未修饰核糖核苷酸以及未被修饰的(N)x中间的核糖核苷酸这几种状态间交替变化；(N’)y的3’末端的3个核苷酸通过2’-5’磷酸二酯键(如此处的结构I所示)连接。在其他优选实施例中，x＝y＝19或x＝y＝23；在(N)x中，核苷酸在2’-OMe糖基修饰核糖核苷酸和未修饰核糖核苷酸以及未被修饰的(N)x中间的核糖核苷酸这几种状态间交替变化；(N’)y的5’末端的4个连续核苷酸通过2’-5’磷酸二酯键(如此处结构I所述)连接。在一个进一步的实施例中，(N)y中间的附加核苷酸是2’-OMe糖基修饰。在另一个优选实施例中，在(N)x中，核苷酸在2’-OMe糖基修饰核糖核苷酸和未修饰核糖核苷酸这两种状态间交替变化；(N’)y的5’末端的4个连续核苷酸通过2’-5’磷酸二酯键(如此处结构I所述)连接。5’末端核苷酸或5’末端的2个或3个连续核苷酸包括3’-O-甲基(3’-OMe)修饰物。

在结构C的某些优选实施例中，x＝y＝19；在(N’)y中，至少一个位点包括脱碱基或反向脱碱基假核苷酸，优选为在位点5包括脱碱基或反向脱碱基假核苷酸。在不同实施例中，以下位点包括脱碱基或反向脱碱基假核苷酸：位点1及16-19、位点15-19、位点1-2和17-19、位点1-3和18-19、位点1-4和19、位点1-5。(N’)y可能还包括至少一个LNA核苷酸。

在结构C的某些优选实施例中，x＝y＝19；在(N’)y中，核苷酸的至少一个位点包括镜像核苷酸、脱氧核糖核苷酸以及通过2’-5’磷酸二酯键连接的核苷酸。

在结构C的某些优选实施例中，x＝y＝19，(N’)y包括镜像核苷酸。在不同实施例中，镜像核苷酸是L-DNA核苷酸。在某些实施例中，L-DNA是脱氧核糖胞啶。在一些实施例中，(N’)y包括位点18上的L-DNA。在其他实施例中，(N’)y包括位点17和18上的L-DNA。在某些实施例中，(N’)y包括位点2以及位点17和18中的一个或两个上的L-DNA取代基。在某些实施例中，(N’)y还包括终端帽核苷酸，如5’-O-甲基DNA或脱碱基或反向脱碱基假核苷酸作为悬突。

在另一个实施例中，相对于目标基因，(N’)y包括至少一个核苷酸错配。在某些优选实施例中，(N’)y包括位点6、14或15上的单核苷酸错配。

在另一个实施例中，(N’)y包括位点15上的DNA以及位点17和18中的一个或两个上的L-DNA。在这种结构中，位点2还可能包括L-DNA或脱碱基假核苷酸。

结构C的其他实施例是设想的，其中x＝y＝21或x＝y＝23；在这些实施例中，上文讨论的(N’)y修饰中，对于21个碱基和23个碱基，修饰位点是17、18、19、20和19、20、21、22，而不是15、16、17、18；同样地，对于21个碱基，修饰位点是17和18中的一个或两个或19和20中的一个或两个；对于23个碱基，修饰位点是21和22。对于21个碱基和23个碱基，19个碱基的所有修饰是同样调整的。

根据结构C的不同实施例，在(N’)y中，3'末端的2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14个连续核糖核苷酸通过2’-5’核苷酸间连键连接。在一个优选实施例中，(N’)y中3'末端的4个连续核苷酸通过3个2’-5’磷酸二酯键连接，其中，一个或多个2’-5’核苷酸形成磷酸二酯键，还包括3’-O-甲基糖基修饰。优选地，(N’)y的3’末端核苷酸包括2’-O-甲基糖基修饰。在结构C的某些优选实施例中，x＝y＝19，(N’)y中位点15、16、17、18和19的两个或多个连续核苷酸包括通过2’-5’核苷酸间键与相邻核苷酸连接的核苷酸。在不同实施例中，形成2’-5’核苷酸间键的核苷酸包括3’脱氧核糖核苷酸或3’甲氧基核苷酸。在一些实施例中，(N’)y中位点17和18的核苷酸通过2’-5’核苷酸间键连接。在其他实施例中，(N’)y中位点16、17、18、16-17、17-18或16-18的核苷酸通过2’-5’核苷酸间键连接。

在某些实施例中，(N’)y包括位点2的L-DNA和位点16、17、18、16-17、17-18或16-18的核苷酸间键。在某些实施例中，(N’)y包括位点16、17、18、16-17、17-18或16-18的2’-5’核苷酸间键和5’终端帽核苷酸。

根据结构(C)的不同实施例，在(N’)y中，任何末端的2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14个连续核糖核苷酸或每个5’和3'末端的2-8个修饰核苷酸是独立的镜像核苷酸。在一些实施例中，镜像核苷酸是L-核糖核苷酸。在其他施例中，镜像核苷酸是L-脱氧核糖核苷酸。镜像核苷酸还可在糖基或碱基或核苷酸间连键内进行修饰。

在结构(C)的一个优选实施例中，3’末端核苷酸或(N’)y中3’末端的2个或3个连续核苷酸是L-脱氧核糖核苷酸。

在结构(C)的其他实施例中，(N’)y中任何末端的2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14个连续核糖核苷酸或每个5’和3'末端的2-8个修饰核苷酸是独立的2’糖基修饰核苷酸。在一些实施例中，2’糖基修饰包括氨基、氟代、烷氧基或烷基。在某些实施例中，2’糖基修饰包括甲氧基(2’-OMe)。

在一系列的优选实施例中，(N’)y中5’末端的3、4或5个连续核苷酸包括2’-OMe修饰。在另一个优选实施例中，(N’)y中3’末端的3个连续核苷酸包括2’-O-甲基修饰。

在结构(C)的一些实施例中，(N’)y中任何末端的2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14个连续核糖核苷酸或每个5’和3'末端的2-8个修饰核苷酸是独立的双环核苷酸。在不同实施例中，双环核苷酸是锁核酸(LNA)。2'-O,4'-C-乙烯基-桥接核酸(ENA)是一种LNA(见下文)。

在不同实施例中，(N’)y包括5’末端或3’和5’末端的修饰核苷酸。

在结构(C)的一些实施例中，(N’)y的5’和3’末端中的一个或两个的至少两个核苷酸是通过P-乙氧基骨架修饰连接。在某些优选实施例中，x＝y＝19或x＝y＝23；在(N)x中，核苷酸在修饰核糖核苷酸或未修饰核糖核苷酸这两个状态间交替变化，每个修饰核糖核苷酸的修饰是为了在其糖基和未修饰(N)x的中间位置的核糖核苷酸上具有2’-O-甲基；(N’)y中3’末端或5’末端的4个连续核苷酸是通过3个P-乙氧基骨架修饰连接。在另一个优选实施例中，(N’)y中3’末端或5’末端的3个连续核苷酸是通过2个P-乙氧基骨架修饰连接。

在结构(C)的一些实施例中，(N’)y中每个5’和3'末端的2、3、4、5、6、7或8个连续核糖核苷酸是独立的镜像核苷酸、通过2’-5磷酸二酯键连接的核苷酸、2’糖基修饰核苷酸或双环核苷酸。在一个实施例中，(N’)y中5’和3'末端的修饰是相同的。在一个优选实施例中，(N’)y中5’末端的4个连续核苷酸通过2’-5磷酸二酯键连接以及3个连续核苷酸通过2个2’-5磷酸二酯键连接。在另一个实施例中，(N’)y中5’末端修饰不同于(N’)y中3’末端修饰。在一个特定实施例中，(N’)y中5’末端的修饰核苷酸是镜像核苷酸，(N’)y中3’末端的修饰核苷酸通过2’-5磷酸二酯键连接。在另一个特定实施例中，(N’)y中5’末端的3个连续核苷酸是LNA核苷酸，(N’)y中3’末端的3个连续核苷酸通过2个2’-5磷酸二酯键连接。在(N)x中，核苷酸在修饰核糖核苷酸或未修饰核糖核苷酸这两个状态间交替变化，每个修饰核糖核苷酸的修饰是为了在糖基和未修饰(N)x的中间位置或未修饰(N)x的核糖核苷酸上具有2’-O-甲基。

在结构(C)的另一个实施例中，本发明提供一种化合物，其中x＝y＝19或x＝y＝23；在(N)x中，核苷酸在修饰核糖核苷酸或未修饰核糖核苷酸这两个状态间交替变化，每个修饰核糖核苷酸的修饰是为了在糖基和未修饰(N)x的中间位置的核糖核苷酸上具有2’-O-甲基；(N’)y中3’末端的修饰核苷酸通过2个2’-5磷酸二酯键连接，(N’)y中5’末端的3个核苷酸是LNA，如ENA。

在结构(C)的另一个实施例中，(N’)y中5’末端的5个连续核苷酸包括2’-O-甲基糖基修饰，(N’)y中3’末端的2个连续核苷酸是L-DNA。

在另一个实施例中，本发明提供一种化合物，其中x＝y＝19或x＝y＝23；(N)x是由未修饰核糖核苷酸组成；(N’)y中3’末端的3个连续核苷酸通过2个2’-5磷酸二酯键连接，(N’)y中5’末端的3个核苷酸是LNA，如ENA。

根据结构(C)的其他实施例，(N’)y中5’和3'末端的核苷酸或任何末端的2、3、4、5或6个连续核苷酸或每个5’和3'末端的1-4个修饰核苷酸是独立的膦酰基羧酸酯核苷酸或膦化羧酸酯核苷酸(PACE核苷酸)。在一些实施例中，PACE核苷酸是脱氧核糖核苷酸。在一些优选实施例中，(N’)y中每个5’和3'末端的1或2个连续核苷酸是PACE核苷酸。PACE核苷酸及类似物的实例在美国专利No.6,693,187和7,067,641中有所披露，在此全部以引用方式纳入。

在其他的实施例中，本发明提供一种具有结构(D)的化合物：

(D) 5’ (N)_x-Z 3’反义链

3’ Z’-(N’)_y 5’正义链

其中，每个N和N’是选自未修饰核糖核苷酸、修饰核糖核苷酸、未修饰脱氧核糖核苷酸或修饰脱氧核糖核苷酸的核苷酸；

其中，每个(N)x和(N’)y是每个连续的N或N’通过共价键连接到下一个N或N’的寡核苷酸，且每个X和Y是介于18至40的整数；；

其中，(N)x包括在3’末端或倒数第二位置进一步含有一个修饰核苷酸的未修饰核糖核苷酸，其中，修饰核苷酸是选自由双环核苷酸、2’糖基修饰核苷酸、镜像核苷酸、阿卓糖醇核苷酸或或通过选自2’-5’磷酸二酯键、P-烷氧基连键或PACE连键的核苷酸间连键与相邻核苷酸连接的核苷酸组成的组；

其中，(N’)y包括在5’末端或倒数第二位置进一步包含有一个修饰核苷酸的未修饰核糖核苷酸，其中，修饰核苷酸是选自由双环核苷酸、2’糖基修饰核苷酸、镜像核苷酸、阿卓糖醇核苷酸或或通过选自2’-5’磷酸二酯键、P-烷氧基连键或PACE连键的核苷酸间连键与相邻核苷酸连接的核苷酸组成的组；

其中，在每个(N)x和(N’)y中，修饰和未修饰的核苷酸是不交替的；

其中，Z和Z'可能是存在或不存在的，但如果存在1-5个连续核苷酸的链在任何低聚物的3’末端共价连接的话，其是存在的；以及

其中，(N’)y的序列是与(N)x大体互补的序列；其中(N)x的序列包括与任一SEQ IDNO:1-58所述mRNA中约18至约40个连续核苷酸大体互补的反义序列。

在结构(D)的一个实施例中，x＝y＝19或x＝y＝23；(N)x包括3’末端的2个连续核苷酸通过一个2’-5’核苷酸间连键连接的未修饰核糖核苷酸；(N’)y包括5’末端的2个连续核苷酸通过一个2’-5’核苷酸间连键连接的未修饰核糖核苷酸。

在一些实施例中，x＝y＝19或x＝y＝23；(N)x包括3’末端的4个连续核苷酸通过3个2’-5’核苷酸间连键连接的未修饰核糖核苷酸；(N’)y包括5’末端的4个连续核苷酸是通过3个2’-5’磷酸二酯键(如此处结构II所述)连接的未修饰核糖核苷酸。

根据结构(D)的不同实施例，(N)x中3'末端的终端或倒数第二位置的2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14个连续核糖核苷酸起始于(N’)y中5'末端的终端或倒数第二位置，并是通过2’-5’核苷酸间连键连接。

根据结构(D)的一个优选实施例，(N’)y中5’末端的4个连续核苷酸是通过3个2’-5’核苷酸间连键连接，(N’)x中3’末端的3个连续核苷酸是通过2个2’-5’核苷酸间连键连接。(N’)y中5’末端的3个核苷酸和(N’)x中3’末端的2个核苷酸也可包括3’-O-甲基修饰。

根据结构(D)的不同实施例，(N)x中3'末端的终端或倒数第二位置的2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14个连续核糖核苷酸起始于(N’)y中5'末端的终端或倒数第二位置，是独立的镜像核苷酸。在一些实施例中，镜像核苷酸是L-核糖核苷酸。在其他实施例中，镜像核苷酸是L-脱氧核糖核苷酸。

在结构(D)的其他实施例中，在(N)x中，3'末端的终端或倒数第二位置的2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14个连续核糖核苷酸起始于(N’)y中5'末端的终端或倒数第二位置，是独立的2’糖基修饰核苷酸。在一些实施例中，2’糖基修饰包括氨基、氟代、烷氧基或烷基。在某些实施例中，2’糖基修饰包括甲氧基(2’-OMe)。

在结构(D)的一个优选实施例中，(N’)y中5’末端的5个连续核苷酸包括2’-O-甲基修饰。(N’)x中3’末端的5个连续核苷酸包括2’-O-甲基修饰。在结构(D)的另一个优选实施例中，(N’)y中5’末端的10个连续核苷酸包括2’-O-甲基修饰。(N’)x中3’末端的5个连续核苷酸包括2’-O-甲基修饰。在结构(D)的另一个优选实施例中，(N’)y中5’末端的13个连续核苷酸包括2’-O-甲基修饰。(N’)x中3’末端的5个连续核苷酸包括2’-O-甲基修饰。

在结构(D)的一些实施例中，(N’)y中3'末端的终端或倒数第二位置的2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14个连续核糖核苷酸起始于(N)x中5'末端的终端或倒数第二位置，是独立的双环核苷酸。在不同实施例中，双环核苷酸是锁核酸(LNA)，如2'-O,4'-C-乙烯基-桥接核酸(ENA)。

在结构(D)的不同实施例中，(N’)y包括选自双环核苷酸、2’-糖基修饰核苷酸、镜像核苷酸、阿卓糖醇核苷酸或通过选自2’-5’磷酸二酯键、P-烷氧基连键或PACE连键的核苷酸间连键与相邻核苷酸连接的核苷酸的修饰核苷酸；

在结构(D)的不同实施例中，(N)x包括选自双环核苷酸、2’-糖基修饰核苷酸、镜像核苷酸、阿卓糖醇核苷酸或通过选自2’-5’磷酸二酯键、P-烷氧基连键或PACE连键的核苷酸间连键与相邻核苷酸连接的核苷酸的修饰核苷酸；

在实施例中，其中相同链的每个3’和5’末端包括修饰核苷酸，5’和3’末端的修饰是相同的。在另一个实施例中，5’末端的修饰不同于同样链的3’末端的修饰。在一个特定实施例中，5’末端的修饰核苷酸是镜像核苷酸，同样链的3’末端的修饰核苷酸是通过2’-5’磷酸二酯键连接。

在结构(D)的一个特定实施例中，(N’)y中5’末端的5个连续核苷酸包括2’-O-甲基修饰，(N’)y中3’末端的2个连续核苷酸是L-DNA。此外，该化合物还可包括(N’)x中3’末端的5个连续的2’-O-甲基修饰核苷酸。

在结构(D)的不同实施例中，(N)x中的修饰核苷酸不同于(N’)y中的修饰核苷酸。例如，(N)x中的修饰核苷酸是2’糖基修饰核苷酸，(N’)y中的修饰核苷酸是通过核酸间连键连接。在另一个实例中，(N)x中的修饰核苷酸是镜像核苷酸，(N’)y中的修饰核苷酸是通过核酸间连键连接。在另一个实例中，(N)x中的修饰核苷酸是通过核酸间连键连接，(N’)y中的修饰核苷酸是镜像核苷酸。

在其他的实施例中，本发明提供一种具有结构(E)的化合物：

(E) 5’ (N)_x-Z 3’反义链

3’ Z’-(N’)_y 5’正义链

其中，每个N和N’是选自未修饰核糖核苷酸、修饰核糖核苷酸、未修饰脱氧核糖核苷酸或修饰脱氧核糖核苷酸的核苷酸；

其中，每个(N)x和(N’)y是每个连续的N或N’通过共价键连接到下一个N或N’的寡核苷酸，且每个X和Y是介于18至40的整数；

其中，(N)x包括在5’末端或倒数第二位置进一步包含有一个修饰核苷酸的未修饰核糖核苷酸，其中，修饰核苷酸是选自由双环核苷酸、2’糖基修饰核苷酸、镜像核苷酸、阿卓糖醇核苷酸或或通过选自2’-5’磷酸二酯键、P-烷氧基连键或PACE连键的核苷酸间连键与相邻核苷酸连接的核苷酸组成的组；

其中，(N’)y包括在3’末端或倒数第二位置进一步包含有一个修饰核苷酸的未修饰核糖核苷酸，其中，修饰核苷酸是选自由双环核苷酸、2’糖基修饰核苷酸、镜像核苷酸、阿卓糖醇核苷酸或或通过选自2’-5’磷酸二酯键、P-烷氧基连键或PACE连键的核苷酸间连键与相邻核苷酸连接的核苷酸组成的组；

其中，在每个(N)x和(N’)y中，修饰和未修饰的核苷酸是不交替的；

其中，Z和Z'可能是存在或不存在的，但如果存在1-5个连续核苷酸的链在任何低聚物的3’末端共价连接的话，其是存在的；以及

其中，(N’)y的序列是与(N)x大体互补的序列；其中(N)x的序列包括与任一SEQ IDNO:1-58所述mRNA中约18至约40个连续核糖核苷酸大体互补的反义序列。

在某些优选实施例中，(N)x中5’末端的终端核苷酸是未修饰的。

根据结构(E)的不同实施例，(N)x中5'末端的终端或倒数第二位置的2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14个连续核糖核苷酸起始于(N’)y中5'末端的终端或倒数第二位置，优选为起始于5'末端的倒数第二位置；起始于(N’)y中3'末端的终端或倒数第二位置的2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14个连续核糖核苷酸是通过2’-5’核酸间连键连接。

根据结构(E)的不同实施例，(N)x中5'末端的终端或倒数第二位置的2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14个连续核糖核苷酸起始于(N’)y中5'末端的倒数第二位置；起始于(N’)y中3'末端的终端或倒数第二位置的2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14个连续核糖核苷酸是独立的镜像核苷酸。在一些实施例中，镜像核苷酸是L-核糖核苷酸。在其他实施例中，镜像核苷酸是L-脱氧核糖核苷酸。

在结构(E)的其他实施例中，2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14个连续核糖核苷酸起始于(N)x中5'末端的终端或倒数第二位置，优选为起始于5'末端的倒数第二位置；起始于(N’)y中3'末端的终端或倒数第二位置的2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14个连续核糖核苷酸是2’糖基修饰核苷酸。在一些实施例中，2’糖基修饰包括氨基、氟代、烷氧基或烷基。在某些实施例中，2’糖基修饰包括甲氧基(2’-OMe)。

在结构(E)的一些实施例中，(N’)y中的2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14个连续核糖核苷酸起始于(N)x中5'末端的终端或倒数第二位置，优选为起始于5'末端的倒数第二位置；起始于(N’)y中3'末端的终端或倒数第二位置的2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14个连续核糖核苷酸是独立的双环核苷酸。在不同实施例中，双环核苷酸是锁核酸(LNA)，如2'-O,4'-C-乙烯基-桥接核酸(ENA)。

在结构(E)的不同实施例中，(N’)y包括选自双环核苷酸、2’-糖基修饰核苷酸、镜像核苷酸、阿卓糖醇核苷酸或通过选自3’末端或每个3’和5’末端的2’-5’磷酸二酯键、P-烷氧基连键或PACE连键的核苷酸间连键与相邻核苷酸连接的核苷酸的修饰核苷酸。

在结构(E)的不同实施例中，(N)x包括选自双环核苷酸、2’-糖基修饰核苷酸、镜像核苷酸、阿卓糖醇核苷酸或通过选自3’末端或每个3’和5’末端的2’-5’磷酸二酯键、P-烷氧基连键或PACE连键的核苷酸间连键与相邻核苷酸连接的核苷酸的修饰核苷酸。

在一个实施例中，同样的链的3’和5’末端包括修饰核苷酸，5’和3’末端的修饰是相同的。在另一个实施例中，5’末端的修饰不同于同样的链的3’末端的修饰。在一特定实施例中，5’末端的修饰核苷酸是镜像核苷酸，同样的链的3’末端的修饰核苷酸是通过选自2’-5’磷酸二酯键连接。

在结构(E)的不同实施例中，(N)x中的修饰核苷酸不同于(N’)y中的修饰核苷酸。例如，(N)x中的修饰核苷酸是2’糖基修饰核苷酸，(N’)y中的修饰核苷酸是通过2’-5’核酸间连键连接。在另一个实例中，(N)x中的修饰核苷酸是镜像核苷酸，(N’)y中的修饰核苷酸是通过2’-5’核酸间连键连接。在另一个实例中，(N)x中的修饰核苷酸是通过2’-5’核酸间连键连接，(N’)y中的修饰核苷酸是镜像核苷酸。

在其他的实施例中，本发明提供一种具有结构(F)的化合物：

(F) 5’ (N)_x-Z 3’反义链

3’ Z’-(N’)_y 5’ 正义链

其中，每个N和N’是选自未修饰核糖核苷酸、修饰核糖核苷酸、未修饰脱氧核糖核苷酸或修饰脱氧核糖核苷酸的核苷酸；

其中，每个(N)x和(N’)y是每个连续的N或N’通过共价键连接到下一个N或N’的寡核苷酸，且每个X和Y是介于18至40的整数；

其中，每个(N)x和(N’)y包括未修饰核糖核苷酸，其中，每个(N)x和(N’)y独立地包括3’末端或倒数第二位置一个修饰核苷酸，其中，修饰核苷酸是选自由双环核苷酸、2’糖基修饰核苷酸、镜像核苷酸或或通过选自P-烷氧基骨架修饰与相邻核苷酸连接或通过2’-5’磷酸二酯键与相邻核苷酸连接的核苷酸组成的组；

其中，在每个(N)x和(N’)y中，修饰和未修饰的核苷酸是不交替的；

其中，Z和Z'可能是存在或不存在的，但如果存在1-5个连续核苷酸的链在任何低聚物的3’末端共价连接的话，其是存在的；

其中，(N’)y的序列是与(N)x大体互补的序列；其中(N)x的序列包括与任一SEQ IDNO:1-58所述mRNA中约18至约40个连续核苷酸大体互补的反义序列。

在结构(F)的一些实施例中，x＝y＝19或x＝y＝23；(N’)y包括未修饰核糖核苷酸，其中3’末端的2个连续核苷酸包括2个连续镜像脱氧核糖核苷酸；(N)x包括未修饰核糖核苷酸，其中3’末端的1个核苷酸包括1个镜像脱氧核糖核苷酸(如结构III所述)。

根据结构(F)的不同实施例，2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14个连续核糖核苷酸独立地起始于(N)x和(N’)y中3'位置的终端或倒数第二位置，是通过2’-5’核酸间连键连接。

根据结构(F)的一个优选实施例，(N’)y中3'末端的3个连续核苷酸是通过2个2’-5’磷酸二酯键键连接，(N’)x中3'末端的3个连续核苷酸是通过2个2’-5’磷酸二酯键键连接。

根据结构(F)的不同实施例，2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14个连续核苷酸独立地起始于(N)x和(N’)y中3'末端的终端或倒数第二位置，是独立的镜像核苷酸。在一些实施例中，镜像核苷酸是L-核糖核苷酸。在其他实施例中，镜像核苷酸是L-脱氧核糖核苷酸。

在结构(F)的其他实施例中，2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14个连续核糖核苷酸起始于(N)x和(N’)y中3'末端的终端或倒数第二位置，是独立的2’糖基修饰核苷酸。在一些实施例中，2’糖基修饰包括氨基、氟代、烷氧基或烷基。在某些实施例中，2’糖基修饰包括甲氧基(2’-OMe)。

在结构(F)的一些实施例中，2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14个连续核糖核苷酸独立地起始于(N)x和(N’)y中3'末端的终端或倒数第二位置，是独立的双环核苷酸。在不同实施例中，双环核苷酸是锁核酸(LNA)，如2'-O,4'-C-乙烯基-桥接核酸(ENA)。

在结构(F)的不同实施例中，(N’)y包括选自双环核苷酸、2’-糖基修饰核苷酸、镜像核苷酸、阿卓糖醇核苷酸或通过选自3’末端或每个3’和5’末端的2’-5’磷酸二酯键、P-烷氧基连键或PACE连键的核苷酸间连键与相邻核苷酸连接的核苷酸的修饰核苷酸。

在结构(F)的不同实施例中，(N)x包括选自双环核苷酸、2’-糖基修饰核苷酸、镜像核苷酸、阿卓糖醇核苷酸或通过选自3’末端或每个3’和5’末端的2’-5’磷酸二酯键、P-烷氧基连键或PACE连键的核苷酸间连键与相邻核苷酸连接的核苷酸的修饰核苷酸。

在一个实施例中，同样的链的3’和5’末端包括修饰核苷酸，5’和3’末端的修饰是相同的。在另一个实施例中，5’末端的修饰不同于同样的链的3’末端的修饰。在一特定实施例中，5’末端的修饰核苷酸是镜像核苷酸，同样的链的3’末端的修饰核苷酸是通过选自2’-5’磷酸二酯键连接。

在结构(F)的不同实施例中，(N)x中的修饰核苷酸不同于(N’)y中的修饰核苷酸。例如，(N)x中的修饰核苷酸是2’糖基修饰核苷酸，(N’)y中的修饰核苷酸是通过2’-5’核酸间连键连接的核苷酸。在另一个实例中，(N)x中的修饰核苷酸是镜像核苷酸，(N’)y中的修饰核苷酸是通过2’-5’核酸间连键连接的核苷酸。在另一个实例中，(N)x中的修饰核苷酸是通过2’-5’核酸间连键连接的核苷酸，(N’)y中的修饰核苷酸是镜像核苷酸。

在其他的实施例中，本发明提供一种具有结构(G)的化合物：

5’ (N)_x-Z 3’反义链

3’ Z’-(N’)_y 5’正义链

其中，每个N和N’是选自未修饰核糖核苷酸、修饰核糖核苷酸、未修饰脱氧核糖核苷酸或修饰脱氧核糖核苷酸的核苷酸；

其中，每个(N)x和(N’)y是每个连续的N或N’通过共价键连接到下一个N或N’的寡核苷酸，且每个X和Y是介于18至40的整数；

其中，每个(N)x和(N’)y包括未修饰核糖核苷酸，每个(N)x和(N’)y独立地包括3’末端或倒数第二位置一个修饰核苷酸，其中，修饰核苷酸是选自由双环核苷酸、2’糖基修饰核苷酸、镜像核苷酸或或通过选自P-烷氧基骨架修饰与相邻核苷酸连接或通过2’-5’磷酸二酯键与相邻核苷酸连接的核苷酸组成的组；

其中，对(N)x来说，修饰核苷酸优选为在5’末端的倒数第二；

其中，在每个(N)x和(N’)y中，修饰和未修饰的核苷酸是不交替的；

其中，Z和Z'可能是存在或不存在的，但如果存在1-5个连续核苷酸的链在任何低聚物的3’末端共价连接的话，其是存在的；以及

其中，(N’)y的序列是与(N)x大体互补的序列；其中(N)x的序列包括与任一SEQ IDNO:1-58所述mRNA中约18至约40个连续核苷酸大体互补的反义序列。

在结构(G)的一些实施例中，x＝y＝19。

根据结构(G)的不同实施例，2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14个连续核糖核苷酸独立地起始于(N)x和(N’)y中5'末端的终端或倒数第二位置，是通过2’-5’核酸间连键连接。对(N)x来说，修饰核苷酸优选为起始于5'末端的倒数第二位置。

根据结构(G)的不同实施例，2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14个连续核苷酸独立地起始于(N)x和(N’)y中3'末端的终端或倒数第二位置，是独立的镜像核苷酸。在一些实施例中，镜像核苷酸是L-核糖核苷酸。在其他实施例中，镜像核苷酸是L-脱氧核糖核苷酸。对(N)x来说，修饰核苷酸优选为起始于5'末端的倒数第二位置。

在结构(G)的其他实施例中，2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14个连续核糖核苷酸起始于(N)x和(N’)y中5'末端的终端或倒数第二位置，是独立的2’糖基修饰核苷酸。在一些实施例中，2’糖基修饰包括氨基、氟代、烷氧基或烷基。在某些实施例中，2’糖基修饰包括甲氧基(2’-OMe)。在一些实施例中，连续修饰核苷酸优选为起始于(N)x中5'末端的倒数第二位置。

在结构(G)的一个优选实施例中，(N’)y中5’末端的5个连续核糖核苷酸包括2’-O-甲基修饰，(N’)x中5’倒数第二位置的一个核糖核苷酸包括2’-O-甲基修饰。在结构(G)的另一个优选实施例中，(N’)y中5’末端的5个连续核糖核苷酸包括2’-O-甲基修饰，N’)x中5’末端的2个连续核糖核苷酸包括2’-O-甲基修饰。

在结构(G)的一些实施例中，2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14个连续核糖核苷酸起始于(N)x和(N’)y中5'末端的终端或倒数第二位置，是双环核苷酸。在不同实施例中，双环核苷酸是锁核酸(LNA)，如2'-O,4'-C-乙烯基-桥接核酸(ENA)。在一些优选实施例中，连续修饰核苷酸优选为起始于(N)x中5'末端的倒数第二位置。

在结构(G)的不同实施例中，(N’)y包括选自双环核苷酸、2’-糖基修饰核苷酸、镜像核苷酸、阿卓糖醇核苷酸或通过选自3’末端或每个3’和5’末端的2’-5’磷酸二酯键、P-烷氧基连键或PACE连键的核苷酸间连键与相邻核苷酸连接的核苷酸的修饰核苷酸。

在结构(G)的不同实施例中，(N)x包括选自双环核苷酸、2’-糖基修饰核苷酸、镜像核苷酸、阿卓糖醇核苷酸或通过选自3’末端或每个3’和5’末端的2’-5’磷酸二酯键、P-烷氧基连键或PACE连键的核苷酸间连键与相邻核苷酸连接的核苷酸的修饰核苷酸。

在一个实施例中，同样的链的3’和5’末端包括修饰核苷酸，5’和3’末端的修饰是相同的。在另一个实施例中，5’末端的修饰不同于同样的链的3’末端的修饰。在一特定实施例中，5’末端的修饰核苷酸是镜像核苷酸，同样的链的3’末端的修饰核苷酸是通过选自2’-5’磷酸二酯键连接。在结构(G)的不同实施例中，(N)x中的修饰核苷酸不同于(N’)y中的修饰核苷酸。例如，(N)x中的修饰核苷酸是2’糖基修饰核苷酸，(N’)y中的修饰核苷酸是通过2’-5’核酸间连键连接的核苷酸。在另一个实例中，(N)x中的修饰核苷酸是镜像核苷酸，(N’)y中的修饰核苷酸是通过2’-5’核酸间连键连接的核苷酸。在另一个实例中，(N)x中的修饰核苷酸是通过2’-5’核酸间连键连接的核苷酸，(N’)y中的修饰核苷酸是镜像核苷酸。

在其他的实施例中，本发明提供一种具有结构(H)的化合物：

(H) 5’ (N)_x-Z 3’ 反义链

3’ Z’-(N’)_y 5’ 正义链

其中，每个N和N’是选自未修饰核糖核苷酸、修饰核糖核苷酸、未修饰脱氧核糖核苷酸或修饰脱氧核糖核苷酸的核苷酸；

其中，每个(N)x和(N’)y是每个连续的N或N’通过共价键连接到下一个N或N’的寡核苷酸，且每个X和Y是介于18至40的整数；

其中，(N)x包括在3’末端或倒数或者5’末端或倒数或第二位置进一步包含有一个修饰核苷酸的未修饰核糖核苷酸，其中，修饰核苷酸是选自由双环核苷酸、2’糖基修饰核苷酸、镜像核苷酸、阿卓糖醇核苷酸或或通过选自2’-5’磷酸二酯键、P-烷氧基连键或PACE连键的核苷酸间连键与相邻核苷酸连接的核苷酸组成的组；

其中，(N’)y包括在内部位点进一步包含有一个修饰核苷酸的未修饰核糖核苷酸，其中，修饰核苷酸是选自由双环核苷酸、2’糖基修饰核苷酸、镜像核苷酸、阿卓糖醇核苷酸或或通过选自2’-5’磷酸二酯键、P-烷氧基连键或PACE连键的核苷酸间连键与相邻核苷酸连接的核苷酸组成的组；

其中，在每个(N)x和(N’)y中，修饰和未修饰的核苷酸是不交替的；

其中，Z和Z'可能是存在或不存在的，但如果存在1-5个连续核苷酸的链在任何低聚物的3’末端共价连接的话，其是存在的；

其中，(N’)y的序列是与(N)x大体互补的序列；其中(N)x的序列包括与任一SEQ IDNO:1-58所述mRNA中约18至约40个连续核苷酸大体互补的反义序列。

在结构(H)的一个实施例中，独立地起始于(N)x中3'末端或者5'末端的终端或倒数第二位置或者两个末端的2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14个连续核糖核苷酸是独立的2’糖基修饰核苷酸、双环核苷酸、镜像核苷酸、阿卓糖醇核苷酸或通过2’-5’磷酸二酯键与相邻核苷酸连接的核苷酸。(N’)y中2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14个连续内部核糖核苷酸是独立的2’糖基修饰核苷酸、双环核苷酸、镜像核苷酸、阿卓糖醇核苷酸或通过2’-5’磷酸二酯键与相邻核苷酸连接的核苷酸。在一些实施例中，2’糖基修饰包括氨基、氟代、烷氧基或烷基。在某些实施例中，2’糖基修饰包括甲氧基(2’-OMe)。

在结构(H)的另一个实施例中，独立地起始于3'末端或者5'末端的终端或倒数第二位置的2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14个连续核糖核苷酸或(N’)y中每个5’和3’末端的2-8个连续核苷酸是独立的2’糖基修饰核苷酸、双环核苷酸、镜像核苷酸、阿卓糖醇核苷酸或通过2’-5’磷酸二酯键与相邻核苷酸连接的核苷酸。(N)x中2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14个连续内部核糖核苷酸是独立的2’糖基修饰核苷酸、双环核苷酸、镜像核苷酸、阿卓糖醇核苷酸或通过2’-5’磷酸二酯键与相邻核苷酸连接的核苷酸。

在一个实施例中，同样的链的3’和5’末端包括修饰核苷酸，5’和3’末端的修饰是相同的。在另一个实施例中，5’末端的修饰不同于同样的链的3’末端的修饰。在一特定实施例中，5’末端的修饰核苷酸是镜像核苷酸，同样的链的3’末端的修饰核苷酸是通过选自2’-5’磷酸二酯键连接。

在结构(H)的不同实施例中，(N)x中的修饰核苷酸不同于(N’)y中的修饰核苷酸。例如，(N)x中的修饰核苷酸是2’糖基修饰核苷酸，(N’)y中的修饰核苷酸是通过2’-5’核酸间连键连接的核苷酸。在另一个实例中，(N)x中的修饰核苷酸是镜像核苷酸，(N’)y中的修饰核苷酸是通过2’-5’核酸间连键连接的核苷酸。在另一个实例中，(N)x中的修饰核苷酸是通过2’-5’核酸间连键连接的核苷酸，(N’)y中的修饰核苷酸是镜像核苷酸。

在结构((H)的一个优选实施例中，x＝y＝19；(N’)y中核苷酸位点9-11的3个连续核糖核苷酸包括2’-O-甲基修饰，(N’)x中3’末端的5个连续核糖核苷酸包括2’-O-甲基修饰。

一方面，本发明提供一种如下结构(I)所述的化合物：

(I) 5’ (N)_x–Z 3’(反义链)

3’ Z’-(N’)_y-z” 5’ (正义链)

其中，每个N和N’是选自未修饰核糖核苷酸、修饰核糖核苷酸、未修饰脱氧核糖核苷酸或修饰脱氧核糖核苷酸的核苷酸；

其中，每个(N)x和(N’)y是每个连续的N或N’通过共价键连接到下一个N或N’的寡核苷酸；

其中，Z和Z'可能是存在或不存在的，但如果存在1-5个连续核苷酸的链在任何低聚物的3’末端共价连接的话，其是存在的；以及

其中，z”可能是存在或不存在的，但如果帽端基团在(N’)y的5’末端共价连接的话，其是存在的；

其中x＝18至27；

其中y＝18至27；

其中，(N)x包括修饰和未修饰核糖核苷酸，每个修饰核糖核苷酸在其糖基上具有2’-O-甲基，其中(N)x中3’末端的N是修饰核糖核苷酸，(N)x包括至少5个起始于3’末端的交替修饰核糖核苷酸，且总共至少9个修饰核糖核苷酸。每个剩余的N是未修饰核糖核苷酸；

其中，(N’)y中至少一个非常规基团是存在的，其中非常规基团可能是脱碱基核糖基、脱碱基脱氧核糖基、修饰或未修饰脱氧核糖核苷酸、镜像核苷酸以及通过2’-5’磷酸二酯键与相邻核苷酸连接的核苷酸；以及

其中，(N’)y的序列是与(N)x大体互补的序列；其中(N)x的序列包括与任一SEQ IDNO:1-58所述mRNA中约18至约40个连续核苷酸大体互补的反义序列。

在一些实施例中，x＝y＝19。在其他实施例中，x＝y＝23。在一些实施例中，至少一个非常规基团存在于(N’)y的位点15、16、17或18。在一些实施例中，非常规基团是选自镜像核苷酸、脱碱基核糖基和脱碱基脱氧核糖基。在一些优选实施例中，非常规基团是镜像核苷酸，优选为L-DNA基。在一些实施例中，L-DNA基存在于位点17、位点18或位点17和位点18。

在其他实施例中，非常规基团是脱碱基。在不同实施例中，(N’)y包括至少5个脱碱基核糖基或脱碱基脱氧核糖基。

在其他实施例中，(N’)y包括至少5个脱碱基核糖基或脱碱基脱氧核糖基，且至少一个N’是LNA。

在(I)的一些实施例中，(N)x包括9个交替修饰核糖核苷酸。在(I)的一些实施例中，(N)x包括在位点2进一步包含2’O修饰核苷酸的9个交替修饰核糖核苷酸。在一些实施例中，(N)x包括在奇数位点1、3、5、7、9、11、13、15、17、19的2’-OMe糖基修饰核糖核苷酸。在其他实施例中，(N)x还包括在位点2和18的2’-OMe糖基修饰核糖核苷酸。

在其他实施例中，(N’)y包括在位点2、4、6、8、11、13、15、17、19的2’-OMe糖基修饰核糖核苷酸。

在不同实施例中，z”是存在的，且是选自脱碱基核糖基、脱氧核糖基；反向脱碱基核糖基、脱氧核糖基；C6-氨基-Pi；镜像核苷酸。

另一方面，本发明提供一种如下结构(J)所述的化合物：

(J) 5’ (N)_x–Z 3’(反义链)

3’ Z’-(N’)_y-z” 5’(正义链)

其中，每个N和N’是选自未修饰核糖核苷酸、修饰核糖核苷酸、未修饰脱氧核糖核苷酸或修饰脱氧核糖核苷酸的核苷酸；

其中，每个(N)x和(N’)y是每个连续的N或N’通过共价键连接到下一个N或N’的寡核苷酸；

其中，Z和Z'可能是存在或不存在的，但如果独立的1-5个连续核苷酸与链的3’末端共价连接的话，其是存在的；

其中，z”可能是存在或不存在的，但如果帽端基团与(N’)y的5’末端共价连接的话，其是存在的；

其中x＝18至27；

其中y＝18至27；

其中，(N)x包括修饰或未修饰核糖核苷酸，以及可选择性地至少一种非常规基团；

其中，(N’)y中至少一个非常规基团是存在的，其中非常规基团可能是脱碱基核糖基、脱碱基脱氧核糖基、修饰或未修饰脱氧核糖核苷酸、镜像核苷酸、非碱基配对核苷酸类似物或通过2’-5’核酸间磷酸键与相邻核苷酸连接的核苷酸；以及

其中，(N)x的序列是与(N’)y大体互补的序列；其中(N)x的序列包括与任一SEQ IDNO:1-58所述mRNA中约18至约40个连续核苷酸大体互补的反义序列。

在一些实施例中，x＝y＝19。在其他实施例中，x＝y＝23。在一些优选实施例中，(N)x包括修饰和未修饰核糖核苷酸，以及至少一种非常规基团。

在一些实施例中，(N)x中3'末端的N是修饰核糖核苷酸，(N)x包括至少8种修饰核糖核苷酸。在其他实施例中，至少8种修饰核糖核苷酸的至少5种交替起始于3'末端。在一些实施例中，(N)x包括在位点5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15之一的脱碱基。

在一些实施例中，(N’)y中的至少一种非常规基团存在于位点15、16、17或18。在一些实施例中，非常规基团是选自镜像核苷酸、脱碱基核糖基和脱碱基脱氧核糖基。在一些优选实施例中，非常规基团是镜像核苷酸，优选为L-DNA基。在一些实施例中，L-DNA基存在于位点17、位点18或位点17和位点18。在其他实施例中，(N’)y中的至少一种非常规基团是脱碱基核糖基和脱碱基脱氧核糖基。

在结构(X)的不同实施例中，z”是存在的，且是选自脱碱基核糖基、脱氧核糖基；反向脱碱基核糖基、脱氧核糖基；C6-氨基-Pi；镜像核苷酸。

在另一方面，本发明提供一种具有如下结构(K)的化合物：

(K) 5’ (N)_x-Z 3’(反义链)

3’ Z’-(N’)_y-z” 5’(正义链)

其中，每个N和N’可能是未修饰或修饰核糖核苷酸，或非常规基团；

其中，每个(N)x和(N’)y是每个连续的N或N’通过共价键连接到下一个N或N’的寡核苷酸；

其中，Z和Z'可能是存在或不存在的，但如果与独立的1-5个连续核苷酸与链的3’末端共价连接的话，其是存在的；

其中，z”可能是存在或不存在的，但如果帽端基与(N’)y的5’末端共价连接的话，其是存在的；

其中x＝18至27；

其中y＝18至27；

其中(N)x包括修饰或未修饰核糖核苷酸、非常规基团以及在糖基上具有2’-O-甲基的任何修饰核糖核苷酸的组合；

其中(N)x包括修饰或未修饰核糖核苷酸以及可选择性地一种非常规基团，在糖基上具有2’OMe的任何修饰核糖核苷酸；

其中，(N)x的序列是与(N’)y大体互补的序列；其中(N)x的序列包括与任一SEQ IDNO:1-58所述mRNA中约18至约40个连续核苷酸大体互补的反义序列；其中具有与mRNA互补的不超过15个连续核苷酸。

在一些实施例中，x＝y＝19。在其他实施例中，x＝y＝23。在一些优选实施例中，至少一个非常规基团存在于(N)x中，且是脱碱基核糖基和脱碱基脱氧核糖基。在其他实施例中，至少一个非常规基团存在于(N)x中，且是非碱基配对核苷酸类似物，在不同实施例中，(N’)y包括未修饰核糖核苷酸。在一些实施例中，(N)x包括至少5种脱碱基核糖基或脱碱基脱氧核糖基或其组合。在某些实施例中，(N)x和/或(N’)y包括修饰核糖核苷酸，并不与(N’)y和/或(N)x中相应的修饰或未修饰核糖核苷酸发生碱基配对。

在不同实施例中，本发明提供一种如结构(L)所示的siRNA：

(L) 5’ (N)_x–Z 3’(反义链)

3’ Z’-(N’)_y 5’(正义链)

其中，每个N和N’是选自未修饰核糖核苷酸、修饰核糖核苷酸、未修饰脱氧核糖核苷酸或修饰脱氧核糖核苷酸的核苷酸；

其中，每个(N)x和(N’)y是每个连续的N或N’通过共价键连接到下一个N或N’的寡核苷酸；

其中，Z和Z'可能是存在的；

其中x＝19；

其中，在(N’)y中，15、16、17、18和19中至少一个位点的核苷酸包括选自脱碱基假核苷酸、镜像核苷酸、脱氧核糖核苷酸以及通过2’-5’核酸间键与相邻核苷酸连接的核苷酸；

其中，(N)x包括交替修饰核糖核苷酸和未修饰核糖核苷酸，每个被修饰的核糖核苷酸是为了在其糖基上具有2’-O-甲基。(N)x中间位置是修饰或未修饰的，优选为未修饰的；以及

其中，(N)x的序列是与(N’)y大体互补的序列；其中(N)x的序列包括与任一SEQ IDNO:1-58所述mRNA中约18至约40个连续核苷酸大体互补的反义序列。

在(L)的一些实施例中，(N’)y中位点17和18中的一个或两个包括选自脱碱基假核苷酸、镜像核苷酸以及通过2’-5’核酸间键与相邻核苷酸连接的核苷酸。在一些实施例中，镜像核苷酸是选自L-DNA和L-RNA。在不同实施例中，镜像核苷酸是L-DNA。

在不同实施例中，(N’)y包括在位点15的修饰核苷酸，其中修饰核苷酸是选自镜像核苷酸和脱氧核糖核苷酸。

在某些实施例中，(N’)y还包括在位点2的修饰核苷酸或假核苷酸，其中假核苷酸可能是脱碱基假核苷酸类似物，修饰核苷酸是可选的镜像核苷酸。

在不同实施例中，反义链(N)x包括在奇数位点(5’至3’)的2’O-Me修饰核糖核苷酸；位点1、3、5、7、9、11、13、15、17、19)。在一些实施例中，(N)x还包括在位点2和18中的一个或两个的2’O-Me修饰核糖核苷酸。在其他实施例中，(N’)y包括在位点2、4、6、8、11、13、15、17、19的2’-OMe糖基修饰核糖核苷酸。

结构(L)、(I)和(J)的其他实施例是设想的，其中x＝y＝21或其中x＝y＝23；在这些实施例中，上文讨论的(N’)y修饰中，对于21个碱基的寡核苷酸，修饰位点分别为19、20，而不是17和18；对于23个碱基长度的寡核苷酸，修饰位点分别为21、22，而不是17和18。同样地，对于21个碱基长度的寡核苷酸，修饰位点是17、18、19、20或21，而不是15、16、17、18或19；对于23个碱基长度的寡核苷酸，修饰位点是19、20、21、22或23，而不是15、16、17、18或19。反义链上的2’-OMe修饰是同样调整的。在一些实施例中，(N)x包括在奇数位点(5’至3’；对于21个碱基长度的寡核苷酸[未修饰的位点11的核苷酸])，修饰位点为1、3、5、7、9、12、14、16、18、20；对于23个碱基长度的寡核苷酸[未修饰的位点12的核苷酸]，修饰位点为1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23)的2’-OMe糖基修饰核糖核苷酸。在其他实施例中，(N)x包括修饰位点为2、4、6、8、10、12、14、16、18、20的2’-OMe糖基修饰核糖核苷酸[对于21个碱基的寡核苷酸，位点11的核苷酸未修饰；对于23个碱基的寡核苷酸，修饰位点为2、4、6、8、10、13、15、17、19、21、23[位点12的核苷酸未修饰]]。

在一些实施例中，(N’)y还包括5’末端帽核苷酸。在不同实施例中，末端帽基是选自脱碱基假核苷酸类似物、反向脱碱基假核苷酸类似物、L-DNA核苷酸和C6-亚胺基磷酸酯(C6氨基在末端与磷酸酯连接键)。

在其他实施例中，本发明提供一种如下结构(M)所示的化合物：

5’ (N)_x–Z 3’(反义链)

3’ Z’-(N’)_y 5’(正义链)

其中，每个N和N’是选自假核苷酸和核苷酸；

其中，每个核苷酸是选自未修饰核糖核苷酸、修饰核糖核苷酸、未修饰脱氧核糖核苷酸和修饰脱氧核糖核苷酸的核苷酸；

其中，每个(N)x和(N’)y是每个连续的N或N’通过共价键连接到下一个N或N’的寡核苷酸；

其中，Z和Z'是存在的；

其中x＝18至27；

其中y＝18至27；

其中，(N)x的序列是与(N’)y大体互补的序列；其中(N)x的序列包括与任一SEQ IDNO:1-58所述mRNA中约18至约40个连续核苷酸大体互补的反义序列；

其中至少一个N是选自脱碱基假核苷酸、非配对核苷酸类似物和(N)x中目标基因的mRNA错配的核苷酸，以使得(N)x包括与目标基因的mRNA互补的不超过15个连续核苷酸。

在其他实施例中，本发明提供一种具有如结构(N)所示的双链化合物：

(N) 5’ (N)_x–Z 3’(反义链)

3’ Z’-(N’)_y 5’(正义链)

其中，每个N和N’是选自未修饰核糖核苷酸、修饰核糖核苷酸、未修饰脱氧核糖核苷酸或修饰脱氧核糖核苷酸的核苷酸；

其中，每个(N)x和(N’)y是每个连续的N或N’通过共价键连接到下一个N或N’的寡核苷酸；

其中，Z和Z'是存在的；

其中，每个X和Y是介于18至40的整数；

其中，(N)x的序列是与(N’)y大体互补的序列；其中(N)x的序列包括与任一SEQ IDNO:1-58所述mRNA中约18至约40个连续核苷酸大体互补的反义序列。

其中，(N)x、(N’)y或(N)x和(N’)y包括非碱基配对修饰核苷酸，以使得(N)x和(N’)y在双链化合物中形成不超过15个碱基对。

在其他实施例中，本发明提供一种具有如下结构(O)所述的化合物：

(O) 5’ (N)_x–Z 3’(反义链)

3’ Z’-(N’)_y 5’(正义链)

其中，每个N和N’是选自未修饰核糖核苷酸、修饰核糖核苷酸、未修饰脱氧核糖核苷酸或修饰脱氧核糖核苷酸的核苷酸；

其中，每个N’是选自6元环糖基核苷酸、7元环糖基核苷酸、吗啉代基、肽核酸或其组合的核苷酸类似物；

其中，每个(N)x和(N’)y是每个连续的N或N’通过共价键连接到下一个N或N’的寡核苷酸；

其中，Z和Z'是存在的；

其中每个x和y是介于18至40的整数；

其中，(N)x的序列是与(N’)y大体互补的序列；其中(N)x的序列包括与任一SEQ IDNO:1-58所述mRNA中约18至约40个连续核苷酸大体互补的反义序列。

在其他实施例中，本发明提供一种具有如下结构(P)所述的化合物：

(P) 5’ (N)_x–Z 3’(反义链)

3’ Z’-(N’)_y 5’(正义链)

其中，每个N和N’是选自未修饰核糖核苷酸、修饰核糖核苷酸、未修饰脱氧核糖核苷酸或修饰脱氧核糖核苷酸的核苷酸；

其中，每个(N)x和(N’)y是每个连续的N或N’通过共价键连接到下一个N或N’的寡核苷酸；

其中，Z和Z'是存在的；

其中每个x和y是介于18至40的整数；

其中，(N)x或(N’)y内部位点的一个N或N’或者(N)x或(N’)y末端位点的一个或多个N或N’包括脱碱基或2’修饰核苷酸；

其中，(N)x的序列是与(N’)y大体互补的序列；其中(N)x的序列包括与任一SEQ IDNO:1-58所述mRNA中约18至约40个连续核苷酸大体互补的反义序列。

在不同实施例中，(N’)y包括在位点15的修饰核苷酸，其中修饰核苷酸是选自镜像核苷酸和脱氧核糖核苷酸。

在某些实施例中，(N’)y还包括在位点2的修饰核苷酸，其中修饰核苷酸是选自镜像核苷酸和脱碱基假核苷酸类似物。

在不同实施例中，(N)x的反义链包括在奇数位点(5’至3’；位点1、3、5、7、9、11、13、15、17、19)的2’-OMe修饰核糖核苷酸。在一些实施例中，

(N)x还包括在位点2和18中的一个或两个的2’-OMe修饰核糖核苷酸。在其他实施例中，N)x包括在位点2、4、6、8、11、13、15、17、19的2’-OMe修饰核糖核苷酸。

上述的(A)-(P)的结构序列用于哺乳动物或非哺乳动物基因的任何寡核苷酸配对(正义和反义链)。在一些实施例中，哺乳动物基因是优选自表A1-A4中提供如SEQ ID NO:1-58所述mRNA的基因的人类基因。在某些优选实施例中，siRNA的正义和反义寡核苷酸是选自如SEQ ID NO:59-33,596所述的任一siRNA对。以下表A5显示了某些优选的正义和反义寡核苷酸对。

表A5

目标基因	正义链(N’)y5’-3’	反义链(N)x5’-3’
			P53	GAGAAUAUUUCACCCUUCA	UGAAGGGUGAAAUAUUCUC
CASP2	GCCAGAAUGUGGAACUCCU	AGGAGUUCCACAUUCUGGC
			RTP801	GUGCCAACCUGAUGCAGCU	AGCAGCAUCAGGUUGGCAC
RTP801	UACUGUAGCAUGAAACAAA	UUUGUUUCAUGCUACAGUA
			RTP801	CAGUACUGUAGCAUGAAAC	GUUUCAUGCUACAGUACUG
TP53BP2	CACCCAGAGAACAUUUAUU	AAUAAAUGUUCUCUGGGUG
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RAC1	GAGUCCUGCAUCAUUUGAA	UUCAAAUGAUGCAGGACUC

SPP1	GUGCCAUACCAGUUAAACA	UGUUUAACUGGUAUGGCAC
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ASPP1	CGAACUCAGAGAAAUGUAA	UUACAUUUCUCUGAGUUCG
			ASPP1	GGAGAAAAACGUACUGAAA	UUUCAGUACGUUUUUCUCC
SOX9	CCUUCAUGAAGAUGACCGA	UCGGUCAUCUUCAUGAAGG

所有的上述结构(A)-(P)，在不同实施例中，x＝y，每个x和y是19、20、21、22或23。在优选实施例中，x＝y＝19。在其他实施例中，化合物包括在交替位置的修饰核糖核苷酸，其中(N)x中5’和3’末端的每个N在其糖残基上是修饰的，中间的核糖核苷酸是未修饰的，例如，19个碱基链的位点10、21个碱基链的位点11以及23个碱基链的位点12的核糖核苷酸。

在一些实施例中，其中x＝y＝19或x＝y＝23。19个碱基的修饰位点被调整为21个碱基和23个碱基，其附带条件是反义链的中间核苷酸优选为不被修饰。

所有的上述结构(A)-(P)，在一些实施例中，(N)x和(N’)y在3’和5’末端都是非磷酸化的。在其他实施例中，(N)x和(N’)y的一个或两个在3’末端是磷酸化的。在另一个实施例中，(N)x和(N’)y的一个或两个在3’末端采用非剪切磷酸基使其磷酸化。在另一个实施例中，(N)x和(N’)y的一个或两个在末端2’末端位点采用剪切或非剪切磷酸基使其磷酸化。这些特定的siRNA化合物也是钝端的，且在末端是非磷酸化的；然而，比较实验已显示3’末端的一个或两个磷酸化的siRNA化合物在体内与非磷酸化合物具有相似的活性。

所有的上述结构(A)-(P)，在一些实施例中，该化合物是钝端的，例如，其中Z和Z’是不存在的。在一个交替的实施例中，该化合物包括至少3个悬突，其中至少一个Z或Z’是存在的。Z和Z’独立地包括一个或多个共价连接修饰或未修饰的核苷酸，例如，反向dT或dA；dT、LNA、镜像核苷酸等。在一些实施例中，每个Z和Z’是独立地选自dT和dTdT。Z和/或Z’存在时的siRNA具有与Z和/或Z’不存在时相似的活性和稳定性。

在所有上述结构的某些实施例中，该化合物包括一个或多个锁核酸(LNA)，也可定义为桥接核酸或双环核酸。优选的锁核酸是2′-O,4′-C-乙烯基核酸(ENA)或2′-O,4′-C-亚甲基核酸。LNA和ENA核酸的其他实例在WO 98/39352、WO 00/47599和WO 99/14226中有所披露，在此全部以引用方式纳入。

在所有上述结构的某些实施例中，该化合物包括一个或多个阿卓糖醇单体(核苷酸)，也解释为1,5脱水-2-脱氧-D-阿卓糖醇-己糖醇(见，例如,Allart,et al.,1998.Nucleosides&Nucleotides17:1523-1526；Herdewijn et al.,1999.Nucleosides&Nucleotides18:1371-1376；Fisher et al.,2007,NAR 35(4):1064-1074；在此全部以引用方式纳入)。

本发明明确地包括每个N和或N’是脱氧核糖核苷酸(D-A、D-C、D-G、D-T)的化合物。在某些实施例中，(N)x和(N’)y可能独立地包括1、2、3、4、5、6、7、8或9个脱氧核糖核苷酸。在某些实施例中，本发明提供一种每个N是未修饰核糖核苷酸的化合物；3’末端核苷酸或(N’)y中3’末端的2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14个连续核苷酸是脱氧核糖核苷酸。在其他的实施例中，每个N是未修饰核糖核苷酸；5’末端核苷酸或(N’)y中5’末端的2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14个连续核苷酸是脱氧核糖核苷酸。在其他的实施例中，5’末端核苷酸或(N’)y中5’末端的2、3、4、5、6、7、8或9个连续核苷酸以及(N)x 3’末端的1、2、3、4、5、6个连续核苷酸是脱氧核糖核苷酸；每个N’是未修饰核糖核苷酸。在其他的实施例中，(N)x包括未修饰核糖核苷酸和每个5’和3’末端独立的1、2、3或4个连续脱氧核糖核苷酸以及内部位点的1、2、3、4、5或6个连续脱氧核糖核苷酸；每个N’是未修饰核糖核苷酸。在某些实施例中，3’末端核苷酸或(N’)y中3’末端的2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14个连续核苷酸以及或(N)x中5’末端的2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14个连续核苷酸是脱氧核糖核苷酸。本发明不包括每个N和或N’是脱氧核糖核苷酸的化合物。在一些实施例中，N中的5’末端核苷酸或N中的2或3个连续核苷酸或N’中的1、2或3个连续核苷酸是脱氧核糖核苷酸。活性DNA/RNA siRNA嵌合体的某些实例在美国专利2005/0004064和Ui-Tei,2008(NAR 36(7):2136-2151)中有所披露，在此以全文引用方式纳入。

除非另有说明，此处所述结构的优选实施例，每个连续N和N'之间的共价键是磷酸二酯键。

本发明提供的另外一个新分子是包括连续核苷酸的寡核苷酸，其中这些核苷酸的第一段编码第一抑制RNA分子，这些核苷酸的第二段编码第二抑RNA分子，而这些核苷酸的第三段编码第三抑制RNA分子。第一、第二和第三段中的每个可包括双链RNA的一条链，第一、第二和第三段可通过连接键结合在一起。此外，寡核苷酸可包括通过一个或多个连接键结合在一起的三个双链段。

因此，本发明提供的一种分子是包括编码3个抑制RNA分子的连续核苷酸的寡核苷酸；所述寡核苷酸可能具有一个三链结构，使得3个双链臂通过一个或多个连接键连接在一起，例如，此处上述的任何一个连接键。这种分子形成了一个“星”型结构，此处也可称为RNAstar。这种结构在PCT专利申请WO 2007/091269中有所披露，被分配给本发明的受托人，在此以全文引用方式纳入。

共价键指的是一种连接一个核苷酸单体和其相邻核苷酸单体的核苷酸间连接键。共价键包括(例如)磷酸二酯键、硫代磷酸键、P-烷氧基键、P-羧基键等。RNA和DNA的正常核苷酸间连接键是3'-5'磷酸二酯键。在某些优选实施例中，共价键是磷酸二酯键。共价键包括非磷核苷酸间连接键，特别如WO 2004/041924所披露。除非另有说明，在此处所述结构的优选实施例中，每个连续N和N'之间的共价键是磷酸二酯键。

所有上述结构，在一些实施例中，(N)x的寡核苷酸序列与(N')y的寡核苷酸序列是完全互补的。在其他实施例中，(N)x和(N’)y是大体互补的。在某些实施例中，(N)x与目标序列是完全互补的。在其他实施例中，(N)x与目标序列是大体互补的。

在一些实施例中，(N)x或(N’)y在3’和5’末端都是非磷酸化的。在其他实施例中，(N)x和(N’)y中的一个或两个在3’末端(3'Pi)是磷酸化的。在另一个实施例中，(N)x和(N’)y中的一个或两个在含有非剪切磷酸基的3’末端是磷酸化的。在另一个实施例中，(N)x和(N’)y中的一个或两个在含有剪切或非剪切磷酸基的2’末端是磷酸化的。此外，本发明的抑制核酸分子可包括一个或多个缺口和/或一个或多个裂口一个和/或多个错配。不希望受理论束缚，缺口、裂口和错配由于处于使核酸/siRNA部分动摇的优势，因此更可能通过内生的细胞机器如DROSHA或RISC加工成抑制成分。

在本发明的背景下，核酸的缺口指的是一条链缺乏一个或多个内部核苷酸，而核酸的裂口指的是一条链缺乏两个相邻核苷酸之间的核苷酸间连键。本发明的任何分子可包括一个或多个缺口和/或一个或多个裂口。

此处披露的结构，当被并入反义链和任何目标基因相应的正义核酸序列后，其提供了用于降低目标基因表达的siRNA化合物。该目标基因是哺乳动物或非哺乳动物基因。本发明的方法包括局部无创伤性地向受试者眼睛施用一种或多种siRNA化合物，所述siRNA化合物降低目标基因在受试者眼睛中的表达。

siRNA合成

本发明的化合物可通过核糖核酸(或脱氧核糖核酸)寡核苷酸技术领域公知的任何方法合成。这种合成，除了别的之外，在Beaucage and Iyer,Tetrahedron 1992；48:2223-2311；Beaucage and Iyer,Tetrahedron 1993；49:6123-6194 and Caruthers,et.al.,Methods Enzymol.1987；154:287-313中有所描述；thioates的合成，除了别的之外，在Eckstein,Annu.Rev.Biochem.1985；54:367-402中有所描述，RNA分子的合成在Herdewijn P.编辑的Sproat,in Humana Press2005中有所描述；代表性的下游方法，除了别的之外，在Oliver编辑的Pingoud et.al.,in IRL Press 1989中有所描述；Kap.7:183-208。

所属领域已知的其他合成方法，例如，该方法在Usman et al.,J.Am.Chem.Soc.,1987,109:7845；Scaringe et al.,NAR,1990,18:5433；Wincott et al.,NAR 1995,.23:2677-2684；以及Wincott et al.,Methods Mol.Bio.,1997,74:59中有所描述。这些方法可充分利用普通核酸保护和连接基团，如5′末端的二甲氧基三苯甲基和3′末端的亚磷酰胺。修饰(如2′-O-甲基化)核苷酸和未修饰核苷酸根据需要纳入。

本发明的寡核苷酸可通过分别地合成以及后合成结合在一起，例如，通过连接反应(Moore et al.,Science 1992,256:9923；国际专利公开No.WO 93/23569；Shabarova etal.,NAR 1991,19:4247；Bellon et al.,Nucleosides&Nucleotides,1997,16:951；Bellonet al.,Bioconjugate Chem 1997,8:204)，或者根据合成和/或脱保护杂交。

据指出，市售的机器(可用，特别是得自Applied Biosystems))可以使用；寡核苷酸根据此处披露的序列制得。化学合成片段的重叠对可使用所属领域已知的方法结扎(例如，见美国专利No.6,121,426)。先分别地合成链，然后在真空管中对其退火。然后，通过高效液相色谱法分离双链siRNA与不退火的单链寡核苷酸(例如，因为其中之一过量)。相对于本发明的siRNAs或siRNA片段，两个或多个这样的序列可以合成和连接在一起用于本发明。

本发明的化合物也可通过串联合成方法合成，例如美国专利申请No.2004/0019001(McSwiggen)和PCT专利申请No.WO 2007/091269(分配给本发明的受托人，并以全文引用方式纳入)中所述，其中两个siRNA链被合成为通过裂解键分离的一个单一的连续寡核苷酸片段或链，之后裂解为能杂交并允许siRNA双链纯化的单独siRNA片段或链。连接键可以是一个多核苷酸连接键或非核苷酸连接键。

本发明还提供一种用于治疗任何此处提及的任何疾病和病症的包括两个或多个siRNA分子的药物组合物，从而所述两个分子以一定量在药物组合物中物理混合在一起，产生相同或相反的有益活性，或者可能是共价或非共价键结合，或通过长度范围为2-100的核酸连接键连接，优选为2-50或2-30个核苷酸。

因此，siRNA分子可能是共价键或非共价键结合，或通过键连接，以形成一个串联siRNA化合物。包括两个siRNA序列的这些串联siRNA化合物通常为约38-150个核苷酸长，较优选为38或40-60个核苷酸长，并相应地延长，如果超过两个siRNA序列被包括在串联分子中。包括两个或多个较长序列的较长串联化合物通过细胞内加工编码siRNA的序列，如长dsRNA也是设想为编码两个或多个shRNA的串联分子。这种串联分子也被认为是本发明的一部分。包括本发明的两个或多个siRNA序列的串联化合物是设想的。

此外，此处披露的siRNA或包括或编码这种siRNA的任何核酸分子可以连接或键合(共价或非共价)到目标细胞中表达的细胞表面内生分子的抗体(包括aptaMer分子)上，以达到加强对此处所披露疾病的目标治疗。例如，抗Fas抗体(优选为中和抗体)可与任何siRNA化合物结合(共价或非共价)。

本发明的化合物可以直接或与病毒或非病毒载体传输。当直接传输时，序列一般都呈现抗核酸酶性。另外，序列可以被包含入表达试剂盒或结构，使得该序列在本文以下所讨论的细胞中表达。一般来说，该结构包含适当的调控序列或启动子，以允许该序列在目标细胞中表达。任选地用于本发明化合物传输的载体是市售的，并可修饰以用于所属技术领域公知的方法传输本发明化合物。

还设想，包括一个或多个茎环结构的一种长寡核苷酸(通常25-500个核苷酸长)，其中茎区域包括本发明的寡核苷酸序列，可通过载体传输，优选为药学上可接受的载体，也可通过内生细胞复合物(如上面DROSHA和DICER所述)进行胞内加工，以产生本发明寡核苷酸的一个或多个较小的双链寡核苷酸(siRNA)。这种寡核苷酸可以被称为串联shRNA结构。据设想，这种长寡核苷酸是括一个或多个茎环结构的一种单链寡核苷酸，其中每个茎区域包括本发明基因的一个正义及相应的反义siRNA序列。

RNA干扰

最近已发表许多与RNAi现象有关的PCT申请。这些包括：PCT公布WO 00/44895；PCT公布WO 00/49035；PCT公布WO 00/63364；PCT WO 01/36641；PCT公布WO 01/36646；PCT公布WO 99/32619；PCT公布WO 00/44914；PCT公布WO 01/29058；以及PCT公布WO 01/75164。

RNA干扰(RNAi)是基于双链RNA分子，进入细胞质蛋白复合体，然后有针对性地补充细胞RNA，并特异性地降解它。RNA干扰响应以含siRNA的核酸内切酶复合体为特征，即通常所说的RNA诱导的沉默复合体(RISC)，其介导具有与siRNA双螺旋结构的反义链互补序列的单链RNA的裂解。目标的裂解可发生在与siRNA双螺旋结构(Elbashir et al.,GenesDev.,2001,15(2):188-200)的反义链互补的中间区域。更详细的说，较长的dsRNA通过III型核糖核酸酶(DICER,DROSHA,etc.；Bernstein et al.,Nature,2001,409(6818):363-6；Lee et al.,Nature,2003,425(6956):415-9)裂解为短(17-29 BP)的双链RNA片段(也称为短抑制RNA，“siRNA”)。RISC蛋白复合体识别这些片段和互补的mRNA。整个过程通过目标mRNA的核酸内切酶裂解达到顶峰(McManus&Sharp,Nature Rev Genet,2002,3(10):737-47；Paddison&Hannon,Curr Opin Mol Ther.2003,5(3):217-24).(For additionalinformation on these terms and proposed Mechanisms，见，例如，Bernstein et al.,RNA 2001,7(11):1509-21；Nishikura,Cell 2001,107(4):415-8和PCT公开WO01/36646)。

几组已描述了能够在细胞内产生siRNA的DNA载体的发展。该方法通常涉及短发夹RNA的转录，其能高效地加工，以在细胞内(Paddison et al.PNAS USA 2002,99:1443-1448；Paddison et al.Genes&Dev 2002,16:948-958；Sui et al.PNAS USA 2002,8:5515-5520；和BrumMelkamp et al.Science 2002,296:550-553)形成siRNA。这些报道描述能够特异性地靶向内源性和外源性基因表达的方法。

本发明已通过说明性的方式进行了描述，要了解的是，所使用的术语是为了说明而不是限制词的性质。

显然地，本发明的许多修改和变化可能是根据上述精神。因此，应当理解为所附权利要求范围内，除了具体描述外本发明可以实施。

在整个申请中，包括美国专利的各种出版物，都是通过作者、年份和专利号而引用。这些出版物和专利申请在此以全文纳入本申请并引用的披露，是为了更充分地描述本发明所属技术领域的方法水平。

以下通过有关实例对本发明进行详细说明，但不应被解释为是对本发明的限制。

此处的任何文件引用并非为了承认此文件是有关现有技术，或本申请任何权利要求的考虑材料。关于任何文件内容或日期的任何声明是基于申请人在申请日期提供的资料，并不构成这种声明正确性的承认。

实例

如果没有进一步阐述，据认为，所属技术领域的普通技术人员可以通过前述说明，充分利用本发明。以下优选的具体实施例，因此，被解释为仅仅是说明之用，并不以任何方式限定所声明的发明。

此处并不具体说明的所属技术领域已知的标准分子生物学试验，通常基本上参见Sambrook et al.,Molecular cloning:A laboratory manual,Cold Springs HarborLaboratory,New-York(1989,1992),以及如Ausubel et al.,Current Protocols inMolecular Biology,John Wiley and Sons,Baltimore,Maryland(1988),以及Ausubel etal.,Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley and Sons,Baltimore,Maryland(1989)以及Perbal,A Practical Guide to Molecular Cloning,John Wiley&Sons,New York(1988),以及Watson et al.,Recombinant DNA,Scientific AmericanBooks,New York and in Birren et al(eds)Genome Analysis:A Laboratory ManualSeries,Vols.1-4 Cold Spring Harbor Laboratory Press,New York(1998)以及美国专利No.4,666,828；4,683,202；4,801,531；5,192,659和5,272,057所示的方法，并在此以引用方式纳入。聚合酶链反应(PCR)依照标准PCR操作规程:A Guide To Methods AndApplications,Academic Press,San Diego,CA(1990)进行。原位PCR与流式细胞术(FACS)联合可用于检测含特异DNA和mRNA序列的细胞(Testoni et al.,Blood 1996,87:3822.)。RT-PCR的测试方法是所属技术领域公知的。

细胞培养

如Czauderna,et al.(NAR,2003.31:670-82)所述，对海拉细胞(美国菌种保藏中心)进行了培养。对人体角质化细胞在37℃含10％FCS的Dulbecco修饰Eagle培养基(DMEM)中进行培养。对小鼠标细胞系，B16V(美国菌种保藏中心)在37℃含10％FCS的Dulbecco修饰Eagle培养基(DMEM)中进行培养。培养条件在(Methods Find Exp Clin Pharmacol.1997,19(4):231-9)中有所描述。

在每一种情况下，细胞受到此处所述每孔细胞密度约50,000的实验影响，根据本发明的双链核酸是以20 nM的浓度添加，即双链核酸是使用如下所述1μg/ml的专有脂质合成。

在组织化学/微观图像中，添加箭头是为了提示组织染色。

动物模型

青光眼和视网膜神经节细胞死亡的模型系统(RGC)

大鼠的ONC模型

不同动物模型是用于研究siRNA疗法对青光眼的治疗效果。在大鼠视神经损伤模型中，麻醉大鼠的眼窝视神经(ON)显露是通过眼眶路径、切断的脑膜以及通过使用钳子10秒内将筛状板压碎成2mm的横断ON的所有轴突。对治疗或预防青光眼的本发明(如siRNA)活性抑制剂进行测试，例如，在Pease et al.(J.Glaucoma,2006,15(6):512-9所述的动物模型中(J.Glaucoma,2006,15(6):512-9.)。患有实验性青光眼的大鼠与正常小鼠的TonoLab和TonoPen眼压计测压校准和比较)。

成年大鼠的视神经损伤(ONC)模型也是研究视网膜神经节细胞(RGC)死亡的可接受模型。RGC发病和死亡的动力学模型重现性非常好；RGC细胞凋亡在RGC后4-5天开始；在RGC后7-10天观察到大量的RGC缺失(约50-60％)；和95％的RGC缺失在RGC后3-4天按周发生。这种模型允许建立测试药物在体内的神经保护功效。

在一些非限制性实例中，对表A1-A4所示基因靶向siRNA化合物在动物模型中进行测试，其显示当局部无创伤性传输到眼睛后，这些siRNA化合物能治疗和/或预防青光眼和/或RGC死亡。

小鼠的IOP模型

眼内压(IOP)是眼内液体压力的测量。这种流体称为房水，通过专门的外流途径流通和流出。如果排水系统不能正常运行，如青光眼的普遍形式，眼内压力积聚。Dr.J.Morrison和collaborators在Casey眼科研究所(Portland,Oregon)研究的灰色挪威鼠高眼压模型用于这项研究。Morrison模型涉及到高渗生理盐水静脉注射入巩膜，导致房水外流途径的阻塞。此过程会导致眼睛压力的逐渐增加以及RGC的逐渐死亡。重要的是，这个模型中观察到的内层视网膜萎缩、视神经退化、视神经头重建与人类青光眼类似。因此，Morrison模型被认为是最好的啮齿动物青光眼临床前模型。

大鼠体内轴索切断模型

在这个模型中，RGC细胞凋亡是通过成年Sprague-Dawley大鼠(ON)的视神经切断诱导的。这个模型系统中RGC死亡的发生和动力学的重现性非常好，并考虑到建立体内无创伤性地施用siRNA化合物的神经保护功效。使用这种方法，RGC死亡随时间的变化遵循一个可预测的过程：细胞死亡从第5天开始，并继续下去到2周后，这些神经细胞超过90％的迅速丧失。

载体配方和典型的滴眼剂配方

水相滴眼剂配方可选择地包含各种通常加入的添加剂，如缓冲剂(例如，磷酸盐缓冲液、硼酸盐缓冲液、柠檬酸盐缓冲液、酒石酸盐缓冲液、醋酸盐缓冲液、氨基酸、醋酸钠、柠檬酸钠等)，等渗性(例如，糖类，如山梨醇、葡萄糖和甘露醇，多元醇，如丙三醇、浓缩丙三醇、聚乙二醇和丙二醇，盐类，如氯化钠)，抗菌剂或防腐剂(例如，苯扎氯铵、苄索氯铵、对-氧化苯甲酸酯，如甲基对-氧化苯甲酸酯或乙基对-氧化苯甲酸酯、苯甲醇、苯乙醇、山梨酸或其盐，硫柳汞、氯丁醇等)，增溶酸或稳定剂(例如，环糊精及其衍生物，水溶性聚合物，如聚乙烯吡咯烷酮)，表面活性剂，如聚山梨酯80(吐温80))，pH值调节剂(例如，盐酸、醋酸、磷酸、氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化铵等)，螯合剂(如，乙二胺四乙酸钠、柠檬酸钠、浓缩磷酸钠)等。

水相悬浮形式的滴眼剂配方还可能包含悬浮剂(例如，聚乙烯吡咯烷酮、单硬脂酸丙三醇酯)和分散剂(例如，表面活性剂，如，泰洛沙泊和聚山梨酯80，离子聚合物，如海藻酸钠)，除上面列出的添加剂外，从而确保滴眼剂配方是进一步均一的微粒物和令人满意的分散水性悬液。

眼软膏可包括已知的软膏基质，如纯净绵羊油、凡士林、液体石腊和聚乙烯的复合软膏基质、液状石蜡、聚乙二醇等。

典型滴眼剂制剂1：

PBS中的siRNA化合物制剂(“赤裸siRNA配方”)通常是通过在PBS中溶解干的siRNA制得。该制剂包括至少一种按组合物体积计通常存在量为约5μg/μl至约60μg/μl的siRNA化合物。

在一个非限制性实例中，siRNA化合物在PBS中的制剂制备如下：在无菌条件下，将500mg干的siRNA溶解于25ml无菌双蒸水(DDW)中，以获得20mg/ml的溶液。将该溶液储存在80℃下，待用。然后DDW中的20mg/ml原溶液在PBS中采用100μg/3μl的工作浓度，情况如下：将325μl 20mg/ml的siRNA原液(6.5mg)通过0.15M NaCl和EtOH沉淀，并在组织培养层(不育条件)条件下干燥。将6.5mg干的siRNA溶解于130μlPBS中，以形成滴眼剂制剂1。

典型滴眼剂制剂2：

在一些实施例中，在1M的三(羟甲基)甲胺(TRIS)中(pH 8.0)配制(得自，例如，Sigma(目录#T-1503))至少一种siRNA化合物。

在一个非限制性实例中，将121.1g TRIS基质(Sigma#T1503)溶解于700ml ddH2O中。通过添加浓HCl.达到所需的pH 8。添加DDW以得到最终的1L溶液。在无菌条件下，将42.426mg siRNA化合物粉末溶解于2.1ml无菌双蒸水中，以获得一20mg/ml(1.5mM)的原液。将该原液储存在80℃下，待用。在无菌条件下，将相应量的siRNA原液冻干，并悬浮于相应量的1M TRIS(pH 8)中。

典型滴眼剂制剂3：

所用的增粘剂浓度通常在约0.05至约5.0％(w/v)之间，较理想地，在约0.1至约3.0％(w/v)之间。一种优选的眼科组合物包括约0.01至约0.075％(w/v)的有效成分；约0.15至约2.5％((w/v)的硬脂酸聚烃氧(40)酯；约0.1至约3.0％(w/v)的选自25羟丙甲纤维素或羟乙纤维素的纤维素增稠剂；以及约0.0001％至约0.01％(w/v)的选自丁羟甲苯或硫代硫酸钠的抗氧化剂。

表面活性剂的组合，如含siRNA的硬脂酸聚烃氧(40)酯或十六烷基聚氧乙烯醚或辛基苯基聚氧乙烯醚制成的滴眼剂制剂，对眼睛的刺激低，并在眼睛中提供更好的分布，具有更高的稳定性。抗氧化剂和纤维素增稠剂的加入进一步提高了活性治疗剂(即siRNA)在眼睛中的分布和稳定性。

也可以增加其它赋形剂，例如，等渗剂、缓冲剂、防腐剂和/或pH值控制剂。存在有适量的无菌纯净水，以获得所需的滴眼剂制剂。

眼科组合物的pH值在本领域公知的范围内，通常用作眼科制剂，但在5至8范围内是理想的。该制剂进一步包括至少一种按组合物体积计通常存在量为约6.6μg/μl至约50μg/μl的siRNA化合物。

典型滴眼剂制剂4：

在药物到晶状体的局部传输中，药物在眼睛表面的保留被认为是重要的。不希望被理论束缚，增加眼睛表面的保留导致通过角膜进入房水以及随后的晶状体增加眼部的药物吸收。

在一些实施例中，优选为局部悬浮。局部悬浮的非限制性实例包括：(1)羟丙甲纤维素(HPMC,0.5％w/v)，(2)黄原胶(0.5％w/v),(3)结冷胶(0.5％w/v)，(4)卡波姆(0.25％w/v)和(5)卡波姆(0.25％w/v)-羟丙甲纤维素(HPMC)(0.25％w/v)。使用粘度计进行粘度测量。

该制剂进一步包括至少一种按组合物体积计通常存在量为约5μg/μl至约60μg/μl的siRNA化合物。

典型滴眼剂制剂5：

在眼科组合物中，可任选地使用螯合剂，以提高防腐效果。合适的螯合剂是本领域公知的，而且，虽然不是旨在限制，如乙二胺四乙酸二钠、乙二胺四乙酸二钠钙、乙二胺四乙酸钠、乙二胺四乙酸三钠和乙二胺四乙酸二钾的乙二胺四乙酸盐(EDTA)是有用的螯合剂实例。据了解，EDTA指的是一种具有四个羧酸官能团的物质，而这些羧酸官能团可能是质子化或去质子化的(即以盐的形式)，这取决于它所处组合物的pH值。

缓冲剂通常用来调整pH值至所需的眼用范围。一般来说，大约5-8的pH值是所需的，然而，这可能需要加以调整，如因考虑到治疗活性剂或其他赋形剂的稳定性或溶解度。

另一种常用于眼科组合物的赋形剂是一种增粘剂或增稠剂。增稠剂可用于各种原因，从改善简便给药的制剂类型到改善与眼睛的接触，以提高生物利用度。增粘剂包括含亲水基，如单糖、多糖、环氧乙烷基、羟基、羧酸或其他带电官能团的聚合物。虽然不是旨在限制一些实例，有用的增粘剂是羧甲基纤维素钠、羟丙基甲基纤维素、聚维酮、聚乙烯醇、聚乙二醇。

该制剂进一步包括至少一种按组合物体积计通常存在量为约5μg/μl至约60μg/μl的siRNA化合物。

典型滴眼剂制剂6(“制剂A”)：

制剂“A”:配制2份溶液,A和B.

溶液A的配制：4％的甲基纤维素水溶液，将0.4g甲基纤维素25(ScienceLab.com,Cat#SLM2050)溶解于最终体积为10ml无热源注射用水(WFI)的50mL无菌管(Norbook,Cat#7082-51)中。将无菌搅拌器放入，并关闭帽。置于沸水浴中并搅拌至少5分钟，直到形成一乳白色甲基纤维素溶液。

溶液B的配制：2％丙三醇；0.02％(v/v)EDTA溶液。添加333.3uL的60％丙三醇溶液(Sigma,Cat#G6279)及2μl的0.5M EDTA，pH＝8(Sigma,Cat#E9884)(最终-100uM)到9.665mlWFI(Norbook,Cat#7082-51)中最终体积-10mL。

在溶液B中配制siRNA 2倍(关于工作浓度)溶液。注意：如果储备siRNA体积相当高，溶液B的最终体积最好保持在低于10mL，以允许在siRNA溶液中调节体积。

工作siRNA溶液的配制：

将溶液A在手中冷却至40-50℃(还是液体)，并与溶液B中等体积的siRNA 2倍溶液混合至所需体积。

最终siRNA制剂包含WFI中的2％甲基纤维素、1％丙三醇和0.01％(v/v)(50uM)EDTA。最终pH值应为～7.4和渗透摩尔浓度-类似于人类的泪膜。siRNA在最终制剂中的浓度为33.3mg/ml。

必须每周重新配制一次，分成为小份以备日常使用。将小份保存于4℃下。使用前，药剂在室温下预热20-30分钟。

甲基纤维素的最终浓度为约0.1％至约3％w/v，约0.1％至约2％w/v，约0.1％至约1.5％w/v甲基纤维素，优选为约2％w/v。丙三醇的最终浓度为约0.1％到约5％v/v,，约0.5％至约2％，优选为约1％v/v。EDTA的最终浓度为约0.001％至约0.05％，约0.005％至约0.01％，优选为约0.01％w/v。

典型滴眼剂制剂7：

在一些实施例中，siRNA是在市售的润滑滴眼剂中配制。市售润滑滴眼剂的非限制性实例是得自Alcon Inc的这种市售润滑滴眼剂的制剂通常包括聚乙二醇和/或丙二醇，抗菌剂和/或抗病毒剂，如硼酸，胶凝剂，如羟丙基瓜尔胶、氯化钾和/或氯化钠和/或氯化镁和/或氯化钙和/或氯化锌，防腐剂，如和纯净水。在无菌条件下，将300mg siRNA粉末溶解于15ml无菌双蒸水中，以得到一清澈的20mg/ml溶液。将该溶液储存于-80℃下，待用。然后在制剂中将200mg/ml双蒸水原溶液稀释为100μg/3μl工作浓度，具体如下：

为得到最终配制量为1.7mg的siRNA：将85μl的20mg/ml siRNA原液通过0.155MNaCl和EtOH而沉淀，并在组织培养层(无菌条件下)干燥。

为得到33.3mg/ml的siRNA溶液，将1.7mg干的siRNA溶解于51μL中。

siRNA化合物诱导目标基因的抑制(KD)

实施例1：siRNA化合物的体外试验

大约1.5-2x10⁵个测试细胞(siRNA目标基因和NRK52(正常大鼠肾脏肾小管上皮细胞)细胞和/或siRNA目标大鼠/小鼠基因的NMuMG细胞(小鼠乳腺上皮细胞系)的HeLa细胞和/或293T细胞)在6孔板(70-80％融合)中分别接种于每孔。

约24小时后，在最终浓度为5nM或20nM时使用Lipofectamine^TM2000试剂(Invitrogen)将siRNA化合物转染细胞。这些细胞分别置于37℃的CO₂培养箱中培养72小时。

至于转磷酸酶和张力蛋白同源(PTEN)-Cy3标记siRNA化合物的阳性对照也被用到。对含有交替修饰和未修饰核苷酸(在正义和反义链的糖残基的位点2'是修饰的，其中位点2’的基团是甲氧基)的各种化学修饰的钝端siRNA化合物进行了测试，其中反义链5’和3’末端的核糖核苷酸在其糖残基是修饰的，正义链5’和3’末端的核糖核苷酸在其糖残基是未修饰的。另一个siRNA化合物包括含有甲氧基基团和通过3’末端的2’5’桥连接的具有3个核糖核苷酸的正义链的交替模型的含反义链钝端结构；包括含有3个通过3’末端的2’5’桥连接的核糖核苷酸的反义链和正义链的另一个siRNA化合物被用到。一些测试化合物包括含有甲氧基基团和3’末端或3’倒数第二位置的一个或两个L-核苷酸的正义链的交替模型的含反义链钝端结构。

绿色荧光蛋白的siRNA化合物被用作siRNA活性的阴性对照。在转染72h后，收获细胞，从细胞中提取RNA。通过荧光显微镜检测转染效率。使用特定的优选siRNA结构对基因表达的抑制比例进行了测定，并在表达内源性基因的细胞内进行了定量PCR分析。

一般情况下，被选出进行体外检测的具有特定序列的siRNA对人类和第二个物种，如非人类的灵长类动物，老鼠或兔子的基因是特定的，类似的结果，使用含有这些RNA序列和此处所述修饰的siRNAs得到类似的结果。

通过相似的步骤对与细胞凋亡和神经保护作用相关的siRNA定位基因进行了测试，并被发现能够主动诱导其相应目标基因的抑制。

将无创伤性施用的备用siRNA通过滴眼剂传输到体内的目标视网膜组织

实施例2:通过荧光显微术和共焦显微术监测鼠科动物眼部组织中(PBS中配制的siRNA)Cy3标记的siRNA的分布

目前研究显示，体内的siRNA通过局部眼路径传输到泪腺和眼部结构。

缩写词：E.D.＝滴眼剂；ISH＝原位杂交

这项研究的目的是对DDIT4-Cy3标记siRNA(siRNA化合物靶向RTP801基因)通过无创伤性局部眼路径传输到泪腺进行测试。已经评价了siRNA传输到泪腺、眼前房、视网膜和视神经的局部眼路径。

材料和方法

表C1:动物

种/株:	小鼠/ICR,雄性
		年龄:	6-10周
体重范围:	27-32g
		组大小:	2
动物总数:	26

在PBS中将DDIT4-Cy3 siRNA(小鼠RTP801的siRNA)配制为20m-/ml原液，并在–80oC下保存，待用。

实验步骤

该研究包括如下文表C2所述的6个实验组：使用单siRNA DDIT4-Cy3对小鼠进行处理如下：

组V(A和B)：剂量方案：50μg/小鼠/3μl/眼睛，给药途径：右眼，滴眼剂(E.D.)；

组Am-V-A、Am3-VIII、Am3-IX：剂量方案：50μg/小鼠/3μl/眼睛，给药途径：两只眼睛，滴眼剂(E.D.)；

组VI-A：剂量方案：20μg/小鼠/3μl/眼睛，给药途径：右眼，滴眼剂(E.D.)；

组VII、Am-VII：未处理对照。

表C2研究设计

在无菌条件下，配制siRNA的剂量。在给药前，将小份siRNA在室温下解冻至少30分钟。总量的每小份(每只小鼠)包括了计算量的另外20％。将指定的siRNA剂量以每眼量3μl(实验组V-VI)传输。

麻醉：使用如下的氯胺酮/甲苯噻嗪组合对小鼠进行麻醉：0.85ml氯胺酮+0.15ml甲苯噻嗪+0.9ml生理盐水，0.1ml混合溶液20g体重(BW)。

滴眼剂(E.D.)传输：使用钝吸管端将一3μL样品量缓缓滴入经处理的眼睛(角膜表面)中；将动物安置于温暖的环境中，以防止麻醉引起的低体温，并在恢复意识后返回笼子。

预定的安乐死：治疗后，根据研究设计对各组小鼠施行安乐死(表C2，时间点终止)。

通过心脏穿刺采血完成终止步骤；将收集的血清/血浆储存(-20℃)，以作进一步的siRNA血液检测分析。

组织收集：包括所有动物离体的视神经、泪腺(左和右)的左眼和右眼、各组动物(V-A到VII、Am3-VIII、Am3-IX)离体的脑组织(大脑的前部和中部，正面导向部分)在最佳切削温度(OCT)嵌入化合物，用低温恒温器分段成8μm切片并置于显微镜载玻片(Superfrost/Plus^TM)上。将切片在95％乙醇中固定7分钟，然后用DAPI(1μg/ml)染色，在纯乙醇中培养1分钟，在二甲苯培养5分钟，风干，并安装。

组织评价：利用光学显微镜和数码图像对siRNA的传输进行评价。只有当组织学(微观)检测显示在特定细胞或结构内，如腺泡单独或与泪腺的导管细胞结合结构内有清晰的荧光信号时，组织片段才被认为是阳性的(即成功的Cy3标记DDIT4 siRNA细胞内纳入)。背景DAPI染色有助于组织结构鉴定：对于眼前房结构，如角膜、角、睫状体或眼后房，如视网膜(视网膜色素上皮细胞(RPE)、视网膜神经节细胞(RGC))。如果组织学检测将显示：一组中的所有动物实验表明在被研究的细胞类型/组织中出现相同的荧光信号，传输被认为是阳性的。(即时间点或给药路径)。

结果与讨论

在光学显微镜(明视野，BF)和荧光共聚焦显微镜下，对所有的冰冻切片进行了分析。荧光信号在以下组织中是可视化的：

视网膜E.D.传输(视网膜色素上皮细胞，视网膜神经节细胞)1A-1B：Cy3标记的siRNA DDIT4纳入小鼠视网膜的典型图像。

图1A：在E.D.给药后1小时的视网膜的荧光显微镜图像(上图，放大X40)。右箭头标识Cy3染色视网膜神经节细胞(RGC)，左箭头标识Cy3染色视网膜色素上皮细胞(RPE)。视网膜神经节细胞层的共聚焦显微镜图像(下图，放大X60)。9个下位图显示了Cy3标记组织(左)，明视野(BF，中心)和两个的合并(M，右)。箭头指向标记的RGC。

图1B：在E.D.给药后4小时的视网膜的共聚焦显微镜图像，给药(上X40，下X60)。RGC的Cy3染色是显著的。

siRNA到泪腺的滴眼剂传输(腺泡细胞，导管细胞)图2A-2D：代表的Cy3标记的siRNA DDIT4纳入小鼠泪腺导管及腺泡细胞的典型图像。

图2A：在E.D.给药后1小时的视网膜的荧光显微镜图像(M＝合并的DAPI-Cy3染色)。中心箭头指向腺泡细胞，右箭头指向导管上皮细胞，灰色的左箭头指向泪管(放大X60)

图2B：在E.D.给药后1小时的泪腺的共聚焦显微镜图像(上X40，下X60)。合并后图像M的箭头指向泪管。

图2C：在E.D.给药后1小时的泪腺的共聚焦显微镜图像(X40)。箭头指向腺泡细胞。

图2D：在E.D.给药后4小时的泪腺的共聚焦显微镜图像(X60)。

图3A-3C显示通过滴眼剂给药1到4小时后大鼠脉络膜的Cy3-siRNA的累积随时间的变化过程。脉络膜、外核层、RPE和感光细胞外段层显示Cy3染色。

图4显示在滴眼剂给药后1小时的Cy3–siRNA传输到小梁网末端睫状体。

使用小鼠Cy3标记的siRNA对不同的化学修饰siRNA(构造动机)进行了测试。对上面显示的所有测试结构观察得到类似的组织分布：在两条链上含有交替的天然核糖核苷酸和2'O-Me糖基修饰核糖核苷酸的结构B，在反义链和通过正义链3’末端的2’5’核酸间连键连接的3个核糖核苷酸上含有交替的天然核糖核苷酸和2'O-Me糖基修饰核糖核苷酸的结构I，以及含有通过每个反义和正义链3’末端的2’5’核酸间连键连接的3个核糖核苷酸的结构。

实施例3：大鼠体内配制siRNA的眼局部传输路径的测试(PBS或2％甲基纤维素中 配制的siRNA(“制剂A“))

在目前的研究中，PBS或制剂A中配制的DDIT4-Cy3 siRNA的眼部传输，通过对大鼠施用滴眼剂进行了研究。

表C3：研究设计

实验设计：

1)第I、第II、第III、第IV、第V组：剂量方案：制剂A中配制的siRNA；100μg/大鼠/3μl/眼，给药路径：双侧滴眼剂(E.D.)；

2)第Ia、第IIa、第IIIa,、第IVa、第Va组：剂量方案：PBS中配制的siRNA；100μg/大鼠/3μl/眼，给药路径：双侧滴眼剂(E.D.)；

3)第VI组：剂量方案：经制剂A(无siRNA)中载体处理的对照组；100μg/大鼠/3μl/眼，给药路径：双侧滴眼剂(E.D.)；

4)第VII组：完整对照

在无菌条件下，配制siRNA的剂量。在给药前，将小份siRNA在室温下解冻至少30分钟。总量的每小份(每只小鼠)包括了计算量的另外20％。将指定的siRNA剂量以每眼量3μl传输。

麻醉：使用Equithesine(4ml/kg)对组I-VII的大鼠进行麻醉

终止步骤：在研究结束时，通过Equithesine(4ml/kg)将动物深度麻醉。此后，根据蠕动泵标准方案对大鼠皮质内灌注新鲜的10％中性缓冲用福尔马林。

组织收集：摘除包括所有动物视神经的左眼和右眼，在室温下穿孔后固定在缓慢转动的10％中性缓冲福尔马林中另外1小时，通过蔗糖梯度逐步冷沉淀保护于4℃下过夜，冷沉淀保护最佳的切削温度(OCT)化合物后于4℃下过夜旋转，将OCT化合物嵌入，并用低温恒温器分段成12μm切片置于显微镜载玻片(Superfrost/Plus)上。将切片用DAPI(1μg/ml)进行反染色，并安装。

利用光学显微镜和数码图像对siRNA的传输进行评价。如果组织学检测将显示：一实验组中的所有动物实验表明在特定的组织/细胞类型中出现相同的荧光信号，组织片段被认为是阳性的(即，眼前房、视网膜和视神经中成功的Cy3 DDIT4_1 siRNA转移被认为是阳性的)。

结果：在光学显微镜(明视野，BF)和共聚焦荧光显微镜下对所有的冰冻切片进行分析。视网膜色素上皮细胞和视网膜神经节细胞中的荧光信号是可视化的。值得注意的是，给药3小时后，PBS中配制的化合物在眼组织中达到最大分布，且在6h时间点清理所述组织。然而，在给药后24小时，制剂A中配制的化合物在眼组织中达到最大分布。

实施例4：食蟹猴的siRNA(在PBS中配制)眼分布

表C4:实验设计

ED＝滴眼剂,局部地

这项研究的目的在于分析向Cynomolgus Macaca fascicularis猴眼睛表面眼单一局部给药后，PBS中配制的siRNA的组织分布。将所有组织以一式三份～1～2g样品或作为整体进行适当地捕捉冷冻。

RNA纯化

将冷冻样品在液氮中粉碎成细粉。将少量粉状组织用于RNA提取。剩余组织储存在80℃下，待用。使用MicroPoly(A)Purist mRNA纯化试剂盒(#1919)从每个样品中提取多聚腺苷酸RNA，并根据poly(A)RNA从组织或细胞分离的制造商说明书进行处理。RNA的最终产量和光谱特征总结于下表C5中。

表C5:猴子的多聚腺苷酸RNA

组织	260/280	260/230	浓度μg/μl	产量μg
					淋巴结	1.58	0.92	0.104	1.55
脾脏	1.74	1.27	0.175	2.62

将得自脾的1μg和得自淋巴结的0.7μg多聚腺苷酸RNA制剂用于采用随机引物合成的cDNA。从两次cDNA制备中成功地扩增出Casp2基因。

结果总结于下表C6中。

表C6：结果

治疗	分析的组织	终止时间	Av	SD	组大小
						ED(REDD14)	神经视网膜	1h	0.2	[+/-0]	1(2只眼)
ED(REDD14)	神经视网膜	5h	0.05	[+/-0.03]	1(2只眼)
						ED(REDD14)	视网膜色素上皮	1h	0.62	[+/-0.05]	1(2只眼)
ED(REDD14)	视网膜色素上皮	5h	0.1	[+/-0.07]	1(2只眼)
						ED(REDD14)	视神经	1h	8.9	[+/-2.6]	1(2只眼)
ED(REDD14):	视神经	5h	3	[+/-1.9]	1(2只眼)

结论：向Cynomolgus Macaca fascicularis猴眼睛表面眼单一局部给药后，PBS中配制的siRNA到达神经视网膜，并可以由S&L定量PCR法测定。

实施例5：siRNA(TRIS中配制)传输到小鼠目标视网膜组织

不同荧光标记的siRNA分子的局部传输的测试。

1小时给药后，(TRIS)(1M,pH 8)中配制的20ug不同荧光标记的siRNA局部传输到小鼠。

测试的siRNA：

Cy3-QM5；Cy3-DDIT4；Cy3.5-DDIT4；DDIT4_1 Dy-649/C6；FITC-CNL_1；3'Cy3-CNL_1；Cy3-Casp2_4 L-DNA；Cy3-AS-Casp2_4；TGASEII-FAM；HNOEL-FAM.(QM5是p53靶向大鼠/小鼠siRNA；CNL是对照无规则的siRNA)

典型的化学修饰Casp2 siRNA化合物，分别如下：

1.正义:GCCAGAAUGUGGAACUC2pC2pU,17和18是2'-5'-桥接反义:mAGmGAmGUmUCmCAmCAmUUmCUmGGmC-cy3

2.正义:GCCAGAAUGUGGAACUC；LdC；LdT 18和19是L-DNA

反义:mAGmGAmGUmUCmCAmCAmUUmCUmGGmC-cy3

3.正义:GCCAGAAUGUGGAACUC；LdC；U 18是L-DNA基

反义:mAGmGAmGUmUCmCAmCAmUUmCUmGGmC-cy3

LdC,LdT指的是L-DNA核苷酸,mA,mC,Mg,Mu的是2’O-甲氧基核糖核苷酸。

配制的(配制的化合物):以下siRNA是1M Tris pH 8.0中的siRNA:QM5-Cy3#1,QM5-Cy3#10,DDIT4_1-Cy3,DDIT4_1Cy3.5,Redd14(DDIT4_1)Dy-649/C6,FITC-CNL_1RD/CNL_1FD,不规则的3'Cy3CNL 1,Cy3-AS-CASP2_4-Struc-L-DNA-s(正义链3'末端的2残基)-plus-alt AS,Cy3AS-CASP2_4-Struc2-5-s(正义链3'末端的2残基)-plus-alt AS,TGASEII-FAM,HNOEL-FAM。

配制(配制的化合物):以下siRNA是1M Tris pH 8.0中的siRNA:QM5-Cy3#1,QM5-Cy3#10,DDIT4_1-Cy3,DDIT4_1Cy3.5,Redd14(DDIT4_1)Dy-649/C6,FITC-CNL_1RD/CNL_1FD,不规则的3'Cy3CNL 1,Cy3-AS-CASP2_4-Struc-L-DNA-s(正义链3'末端的2残基)-加-alt AS,Cy3AS-CASP2_4-Struc2-5-s(正义链3'末端的2残基)-plus-alt AS,TGASEII-FAM,HNOEL-FAM。

表C7:制剂

测试材料的描述：在无菌条件下，将相应量的siRNA原料冻干，并在相应量的1MTris pH8(见表C7)中再悬浮。

供给量：每个测试siRNA的一个基质(由Biospring,AG合成)

储存条件：冷冻，待用。使用前，将样品解冻，并在室温保持30分钟。

对照物(S)

阳性对照–PBS中的DDIT4_1-Cy3,批次#:117821

测试材料的描述：在无菌条件下，将42.426mg DDIT4_1-Cy3粉末(BioSpring)溶解于2.1ml无菌双蒸水，以得到一清晰的20mg/ml(1.5mM)溶液。将该溶液储存在–80℃下，待用。

载体-1M Tris pH 8.0–外购自Sigma(目录#T-1503)。降121.1g Tris碱(Sigma公司#T1503)溶解于700ml双蒸水中。使用浓盐酸得到所需的pH值8。添加DDW，以达到最终1L溶液。

载体-PBSX10-外购自Biological Industries(目录#02-023-5A；(10x PBS)批次#:619113)

测试系统

动物：

物种：小鼠；株：RTP-801WT；CMF-608WT

来源：Harlan Laboratories,Jerusalem,Israel.

年龄：8-12周；体重范围：17-28g

性别：雄性；组大小：1；动物总数：14

畜牧业：饮食：向动物提供任意的市售啮齿动物食物，并能自由获得饮用水。环境：(i)至少5天的驯化。(ii)在整个研究期间，将所有动物关在一个控制居住条件的专用设施中，并根据规定的操作规程(SOP)维持不变。

实验设计

综述：该研究包括表C8所述的14个实验组：

实验组1-12，通过滴眼剂传输siRNA，组13，通过滴眼剂传输载体[经TRIS 1M pH8处理的对照组]以及组14(未处理的对照组)。使用单siRNA处理小鼠如下：

-组1-9和12:剂量方案：20μg/眼/3μl/SiRNA,组10:剂量方案：5.81μg/eye/3μl/siRNA,组11:剂量方案：2.24μg/眼/3μl/siRNA给药路径:滴眼剂(E.D.)；

-组13：载体(TRIS 1M pH8)3μl/眼对照

-组14:未处理对照

表C8.研究设计

在无菌条件下，配制siRNA的剂量，并储存在-20℃下。在给药前，将小份siRNA在室温下解冻至少30分钟。总量的每小份(每只眼睛)包括了计算量的另外20％。将指定的siRNA剂量以每眼量3.5.μl(实验组1至9和12)传输。将指定的siRNA剂量以每眼量3.2.μl(实验组10和11)传输。

麻醉：使用如下的氯胺酮/甲苯噻嗪组合对小鼠进行麻醉：0.85ml氯胺酮+0.15ml甲苯噻嗪+0.9ml生理盐水，0.1ml混合溶液20g体重(BW)。

滴眼剂传输：使用钝吸管端将一3μL样品量缓缓滴入经处理的眼睛(角膜表面)中；将动物安置于温暖的环境中，以防止麻醉引起的低体温，并在恢复意识后返回笼子。

预定的安乐死：治疗后，根据研究设计对各组小鼠施行安乐死(表C8，时间点终止)。

通过颈椎脱臼法完成终止步骤。

组织收集：摘除包括所有动物视神经的左眼和右眼，用刀片将视网膜横向切开，将晶状体/玻璃体轻轻取出。用4％PFA(在PBS中pH 7.4)固定剩下的眼罩30分钟，然后用30％的蔗糖在4℃下浸润3小时。用冰冷的PBS清洗3X5分钟。预冷0.01M pH7.4。然后将其嵌入最佳切削温度(OCT)化合物中，并用低温恒温器纵向分段成4μm切片置于显微镜载玻片(Superfrost/Plus)上。将该切片用DAPI(1μg/ml)进行反染色，并安装。

将所有的动物全滴血用盖玻片涂抹在滑板上，并覆盖。然后用指甲油胶合。

评价

组织评价：利用光学显微镜和数码图像对siRNA的传输进行评价。只有当组织学(微观)检测显示在特定细胞或者眼前房或眼后房结构和视网膜内有清晰的荧光信号时，组织片段才被认为是阳性的(即成功的siRNA转移\细胞内纳入)。背景DAPI染色有助于组织结构鉴定。如果组织学测试在组(双边相同的细胞类型或结构染色)内是一致的，传输被认为是阳性的。同样的实验组中的所有细胞类型/组织(眼前房、视网膜和视神经)出现相同的荧光信号，传输被认为是阳性的。

结果

图5A-5B：p53基因靶向QM5–siRNA的滴眼剂给药后1小时视网膜的共聚焦显微镜(放大X60)图像。Cy3标记荧光显示了视网膜(视网膜色素上皮细胞，视网膜神经节细胞)的siRNA。

图6A-6B是Cy3标记的DDIT4 siRNA纳入小鼠视网膜的典型图像。

图6b显示滴眼剂给药后1小时DDIT4_1 Cy3-siRNA的累积。脉络膜、外核层、RPE和感光细胞外段层显示Cy3标记染色。

图7显示滴眼剂在RGC细胞内给药1小时后使用Dy-649/C6染色的累积。

图8A-8C表示对照siRNA FITC-CNL_1RD/CNL_1FD和不规则的3'cy3-CNL_1通过不同染色方法传输到视网膜组织。

图9A和9B显示的是Casp2的不同结构传输到小鼠视网膜组织。

图10A和10B显示的是TGASEII-FAM和HNOEL-FAM的传输。

图11显示了作为阳性对照组的PBS中p53基因靶向siRNA的视网膜传输，和

图12A和12B显示在完整的动物中，或当不含siRNA的滴眼剂给药时，视网膜上没有得到任何荧光信号。

结论：没有序列依赖性的差异，在传输到视网膜时也未发现荧光团或基因依赖性的差异也没有发现相关的差异。该研究结果显示CASP2、RTP801、TIGASEII和p53目标基因靶向Cy3共轭siRNA化合物能有效传输到眼结构：RGC、RPE、光感受细胞、脉络膜。

实施例6：Casp2 siRNA(在PBS或MC 2％(制剂“A”)中配制)传输到大鼠体内目标视网膜组织的量化

siRNA传输到视网膜的不同滴眼剂制剂。这项研究的目的是在单一局部施用滴眼剂制剂后，测定大鼠视网膜在时间点1、3、6及24h时的CASP2_4_S510 siRNA量。

测试物

物质(未配制的化合物)：CASP2_4_S510(CASP2靶向siRNA)

Agilent提供(制造商产品目录#QPI-1007，批次#：Q02F08002N)

测试材料的说明：CASP2_4_S510:S-反向-脱碱基5’-帽端，L-DNA 18/AS-AL。一个19个碱基长度的化学修饰钝端双螺旋结构含具有两个独立链，其中，包括未修饰核糖核苷酸(大写字母)、位点18的L-脱氧核糖核苷酸(粗体，下划线)和SEN链5'末端的反向脱氧脱碱基(IB)的正义链(SEN)，以及包括未修饰核糖核苷酸(大写字母)和式I所示位点2、4、6、8、11、13、15、17和19的2’OMe糖基修饰核糖核苷酸(小写字母)的反义链(AS)：

式I

SEN 5’ iB-GCCAGAAUGUGGAACUCCU 3'

AS 3' cGgUcUuAcACcUuGaGgA 5'

储存条件：-80℃

PBS中配制的siRNA：PBS中的33.3mg/ml CASP2_4_S510(滴眼剂溶液)

测试材料的说明：在无菌条件下，将300mg干的CASP2_4_S510siRNA溶解于15ml无菌双蒸水中，以得到一清晰的20mg/ml的溶液。将该溶液储存在-80℃下，待用。然后DDW中的20mg/ml原溶液在PBS中采用100μg/3μl的工作浓度，情况如下：

6.5mg CASP2_4_S510 siRNA：325μl 20mg/ml的CASP2_4(6.5mg)原料，通过0.15MNaCl和乙醇而沉淀并在组织培养层(无菌条件下)干燥。siRNA溶液33.3mg/ml：将6.5mg干的siRNA溶解于195μl PBSx1中配制的量：6.5mg/195μl分装成4管。储存条件：重新配制。

制剂A中配制的siRNA：在2％(w/v)甲基纤维素及1％(v/v)无菌丙三醇及无热原水(滴眼剂溶液)中0.01％(w/v)EDTA溶液中的33.3mg/ml CASP2_4_S510 siRNA溶液。

测试材料的说明：在无菌条件下，将300mg干的CASP2_4_S510siRNA溶解于15ml无菌双蒸水中，以得到一清晰的20mg/ml的溶液。将该溶液储存在-80℃下，待用。然后DDW中的20mg/ml原溶液在PBS中采用100μg/3μl的工作浓度，情况如下：

6.5mg CASP2_4_S510 siRNA：325μl 20 mg/ml的CASP2_4(6.5mg)原液，通过0.15MNaCl和乙醇而沉淀并在组织培养层(无菌条件下)干燥。

siRNA溶液33.3mg/ml：将6.5mg干的siRNA溶解于195μl的制剂A溶液中

配制的量：6.5mg/195μl分装成4管

储存条件：重新配制

对照物

甲基纤维素制剂(无siRNA)-无热原水中的2％甲基纤维素及1％v/V无菌丙三醇及0.01％w/v EDT A溶液，配制如下：

溶液A：将0.4g甲基纤维素25(ScienceLab.com,Cat#SLM2050)溶解于终体积为10ml的热开水(80-90℃)中，(Norbrook)，冷却至室温，并以1:1(终浓度2％)的比例添加到溶液B中。

溶液B：9.66ml注射用水(Norbrook)中332μl的60％丙三醇(Sigma,Cat#G6279)和2μl的EDTA溶液。

500μL的溶液A和500μL的溶液B混合，以得到：2％的甲基纤维素及1％v/V的无菌丙三醇及无热原水中的0.01％w/v EDTA溶液(最终pH值为约7.4，渗透压类似于人类泪膜)。

PBS由Biological industries提供(制造商目录#02-023-5A(为10x PBS)；批次#619113)。

测试系统

所用的动物：物种：大鼠；属：成年，Sprague-Dawley(SD)

来源：Harlan,Jerusalem Israel

年龄：8-10周；体重范围：180-250g

性别：雄性；组大小：n＝6/3；动物总数：54

畜牧业：饮食：向动物提供任意的市售啮齿动物食物，并能自由获得饮用水。

环境

(i)至少5天的驯化。

(ii)在整个研究期间，将所有动物关在一个控制居住条件的专用设施中，并根据规定的操作规程(SOP)维持不变。向动物提供任意的市售啮齿动物食物(rlan Teklad2018S总量含18％蛋白质的啮齿动物食物)和过滤、加氯消过毒的酸化水。

在整个研究期间，将大鼠关在含有过滤器顶部的微型隔离器笼子中，1-6大鼠/笼。将笼子维持在受控制的环境下，温度条件(20-24℃)，相对湿度(30-70％)，12-小时光照/12小时黑暗的周期，由控制计算机监控。

实验设计

研究设计：siRNA给药后，在不同时间点终止的研究小组中通过定量PCR测定眼部制剂的滴眼剂施用后CASP2_4 siRNA的视网膜浓度。每个实验siRNA治疗组包括6只大鼠。在研究设计表C9将滴眼剂详细地双侧给药。

siRNA给药后的终止时间点：根据研究设计表C9施行终止设置。剂量和实验组的终止在不同天进行。

表C9：研究设计

麻醉：在实验过程中，在滴眼剂给药时和/或终止之前使用Equithesine(I.P.4ml/kg)对动物与进行麻醉。

滴眼剂传输：使用钝吸管端(10μl无菌过滤嘴(短))将一3μL样品量施用到麻醉动物的双侧角膜表面。将动物安置于温暖的环境中，以防止麻醉引起的低体温，并在恢复意识后(实验组7和8)返回笼子。根据研究设计终止所有研究小组的动物。根据研究设计收集组织。

预定的安乐死：将所有动物深度麻醉，并根据研究设计对各组小鼠施行安乐死(表C9，终止)。

灌注计划：用PBS对大鼠经心脏进行灌胃(在2-3分钟后20-50ml/min)。

组织收集：灌注后，摘除双眼(左，右)的细胞核，储存于冰中。用显微镜解剖眼睛，并根据样品分级标准选择总病理学分级。沿角膜缘切开角膜，轻轻取出晶状体，小心翼翼地将玻璃体及视网膜与巩膜分离。收集全视网膜及玻璃体(humor)(视网膜包括：“神经视网膜”+视网膜色素上皮细胞+脉络膜)，独立适当地分成两份，适当地标记试管。用大量的PBS清洗解剖的视网膜(新配制PBS单独管中的每一个视网膜)，用除去多余的液体，在液氮下捕捉冷冻视网膜。对视网膜和玻璃体样品进行了RNA提取。

评价

RNA提取：

视网膜：通过双提取分别从每个视网膜样品(左和右)中提取RNA。对RNA进行cDNA制备和定量PCR分析。

玻璃体：使用以下操作规程获得从玻璃体检测的Casp2_4 siRNA材料：

各组大鼠玻璃体约为10μl。将500μl试剂A EZ-RNA(Biological Industries Catno.20-410-100)添加到每个玻璃体中。样品经均质化后，添加10μgtRNA(10mg/m原液的1μl)。将该样品储存在室温下5分钟。随后：分别加入Z-RNA II B:400μl和EZ-RNA II C:90μ，并混匀。将该样品储存在室温下10分钟，然后在4℃、12000g下离心15分钟。

将上相转移到一个异丙醇的500μl新管中，添加线性丙烯酰胺5μl。将该样品储存在-20℃下过夜，在4℃、12000g下离心20分钟，用75％乙醇洗涤两次。将颗粒溶解于15μl水中。

siRNA的量化：视网膜和玻璃体中siRNA的量(siRNA的量化通过每玻璃体施行)通过定量PCR siRNA测定。根据Quark标准操作规程进行定量PCR。对CASP2_4 siRNA和参照基因表达进行了测试。结果总结在表C10中。

表C10：结果

结论：研究表明在给药1和3小时后，siRNA有效传输到视网膜。定量PCR分析表明，施用100μg siRNA后，在制剂A中，按总RNA计，在1小时后视网膜得到平均11fmol/μg siRNA，在3小时后视网膜得到平均2fmol/μg siRNA。当在PBS中施用相同浓度时，按总RNA计，在1小时后视网膜得到6fmol/μg siRNA的量，在3小时后视网膜得到8fmol/μg siRNA的量。

实施例7：大鼠目标视网膜组织中无创伤性给药的siRNA化合物(在各种制剂中配制)的量化。

siRNA的不同滴眼剂制剂在体内无创伤性地传输到视网膜的检测。

这项研究的目的是作为滴眼剂(ED)给药的不同siRNA制剂单一局部施用后3小时对正常大鼠视网膜中CASP2_4_S510 siRNA的量进行评价。

测试物

物质(未配制的化合物)CASP2_4_S510(CASP2靶向siRNA)由Agilent(制造商目录#QPI-1007；批次#:Q02F08002N)提供。

测试材料的说明：CASP2_4_S510：S–反向-脱碱基5'-帽，L-DNA18/AS-AL。含有反向-脱碱基5'-帽、正义链位点18的L-DNA和反义链位点2、4、6、8、11、13、15和19的交替2’-OMe的一个19个碱基长度的稳定双链RNA。

储存条件：-80℃

PBS中配制siRNA：PBS中的33.3mg/ml CASP2_4_S510(滴眼剂溶液)-

测试材料的说明：在无菌条件下，将300mg干的CASP2_4_S510siRNA溶解于15ml无菌双蒸水中，以得到一清晰的20mg/ml的溶液。将该溶液储存在-80℃下，待用。然后DDW中的20mg/ml原溶液在PBS中采用100μg/3μl的工作浓度，情况如下：

1.7mg CASP2_4_S510 siRNA：85μl 20mg/ml的CASP2_4(1.7mg)原液，通过0.15MNaCl和乙醇而沉淀并在组织培养层(无菌条件下)干燥。

siRNA溶液33.3mg/ml：将1.7mg干的siRNA溶解于PBSx1中，以得到51μl。

配制的量：每管1.7mg/51μl PBS。储存条件：重新配制。

市售润滑油溶液中配制的siRNA：33.3mg/ml CASP2_4_S510的Systane溶液(滴眼剂溶液)-组II。购自Alcone Inc.；批次#:Lot 165228F。

测试材料的说明：在无菌条件下，将300mg干的CASP2_4_S510siRNA溶解于15ml无菌双蒸水中，以得到一清晰的20mg/ml的溶液。将该溶液储存在-80℃下，待用。然后DDW中的20mg/ml原溶液在PBS中采用100μg/3μl的工作浓度，情况如下：

1.7mg CASP2_4_S510 siRNA：85μl 20mg/ml的CASP2_4(1.7mg)原料，通过0.15MNaCl和乙醇而沉淀并在组织培养层(无菌条件下)干燥。

siRNA溶液33.3mg/ml：将1.7mg干的siRNA溶解于51μl的市售润滑油溶液(即)中。

配制的量：每小瓶1.7mg siRNA/51μL溶液。

丙三醇+EDTA溶液及甲基纤维素(MC)溶液中配制的siRNA：丙三醇+EDTA制剂及0.5％、2％或3％(w/v)甲基纤维素及1％(v/v)无菌丙三醇及无热原水中0.01％(w/v)EDTA溶液中的CASP2_4_S510siRNA的33.3mg/ml溶液组-III–VI。

测试材料的说明：在无菌条件下，将300mg CASP2_4_S510粉末(Aligent,批次#Q02F08002N)溶解于15ml无菌双蒸水中，以得到一清晰的20mg/ml的溶液。将该溶液储存在-80℃下，待用。然后DDW中的20mg/ml原溶液在PBS中采用100μg/3μl的工作浓度，情况如下：

7个小瓶的1.7mg CASP2_4_S510 siRNA：85μl 20mg/ml的CASP2_4_S510(1.7mg)原液，通过0.15M NaCl和乙醇而沉淀并在组织培养层(无菌条件下)干燥。

组III：0.5％MC制剂：混合比为1:7的溶液A和溶液B溶液A[将12.5μL溶液A与50μL溶液B及37.5μl注射用水混合，以得到0.5％甲基纤维素及1％v/v无菌丙三醇及无热原水中的0.01％w/v EDTA溶液(最终pH值约为7.4，渗透压类似于人类泪膜)]

0.5％MC制剂中配制的33.3mg/ml siRNA，将1.7mg干的siRNA溶解于所述配制的0.5％MC制剂中，以得到一51μL siRNA配制溶液的0.5％MC制剂。

组III：1％MC制剂：混合比为1:3的溶液A和溶液B溶液A[将25μL溶液A与50μL溶液B及25μl注射用水混合，以得到1％甲基纤维素及1％v/v无菌丙三醇及无热原水中的0.01％w/v EDTA溶液(最终pH值约为7.4，渗透压类似于人类泪膜)]

1％MC制剂中配制的33.3mg/ml siRNA，将1.7mg干的siRNA溶解于所述配制的1％MC制剂中，以得到一51μL siRNA配制溶液的1％MC制剂。

组V：2％MC制剂：混合比为1:1的溶液A和溶液B溶液A[将50μL溶液A与50μL溶液B混合，以得到2％甲基纤维素及1％v/v无菌丙三醇及无热原水中的0.01％w/v EDTA溶液(最终pH值约为7.4，渗透压类似于人类泪膜)]

2％MC制剂中配制的33.3mg/ml siRNA，将1.7mg干的siRNA溶解于所述配制的2％MC制剂中，以得到一51μL siRNA配制溶液的2％MC制剂。

组VI：3％MC制剂：混合比为1:1的溶液A和溶液B溶液A[将50μL溶液A与50μL溶液C混合，以得到3％甲基纤维素及1％v/v无菌丙三醇及无热原水中的0.01％w/v EDTA溶液(最终pH值约为7.4，渗透压类似于人类泪膜)]

3％MC制剂中配制的33.3mg/ml siRNA，将1.7mg干的siRNA溶解于所述配制的3％MC制剂中，以得到一51μL siRNA配制溶液的4％MC制剂。

组VII：3％MC制剂：混合比为1:1的溶液A和溶液B溶液A[将50μL溶液A与50μL溶液C混合，以得到3％甲基纤维素及1％v/v无菌丙三醇及无热原水中的0.01％w/v EDTA溶液(最终pH值约为7.4，渗透压类似于人类泪膜)]

33.3mg/ml丙三醇+EDTA制剂中配制的siRNA溶液：将1.7mg干的siRNA溶解于所述配制的丙三醇+EDTA制剂中，以得到一51μL siRNA配制溶液的丙三醇+EDTA制剂。

配制的量：7个小瓶，如下：

1小瓶1.7mg siRNA的51μLPBS制剂

1小瓶1.7mg siRNA的制剂

1小瓶1.7mg siRNA的0.5％MC制剂

1小瓶1.7mg siRNA的1％MC制剂

1小瓶1.7mg siRNA的2％MC制剂

1小瓶1.7mg siRNA的3％MC制剂

1小瓶1.7mg siRNA的丙三醇+EDTA制剂

储存条件：重新制得

对照物

1.PBS-由Biological industries提供(制造商目录#02-023-5A(10x PBS)；批次#619113).

2.-市售滴眼剂溶液；由Alcon提供；批次#:Lot165228F；供应量：15ml；储存条件：RT；有效日期：02/2011。

制剂溶液A-无热原水溶液A中的甲基纤维素溶液)将0.4g甲基纤维素25(ScienceLab.com,Cat#SLM2050)溶解于终体积为10ml的热开水(80-90℃),(Norbrook)中，冷却至室温。

制剂溶液B-无热原水溶液B中的无菌丙三醇+EDTA溶液)9.666ml WFI(Norbrook)中332μl的60％丙三醇(Sigma,Cat#G6279)和2μl EDTA溶液pH8(得自Sigma,Cat#E9884)。

制剂溶液C-无热原水溶液C中的浓缩甲基纤维素溶液)将0.6g甲基纤维素25(ScienceLab.com,Cat#SLM2050)溶解于终体积为10ml的热开水(80-90℃),(Norbrook)中，冷却至室温。

上述甲基纤维素制剂中siRNA化合物的稳定性测试：

根据以下操作规程在甲基纤维素中对Casp2_4 Q02F08002N siRNA的稳定性进行测试：

将siRNA在含甲基纤维素的不同制剂中稀释为最终浓度为7μM的siRNA。0％、将0.5％、1％、2％和3％MC制剂在室温下培养。此外，3％MC制剂也在37℃下(含或不含核酸酶抑制剂)培养。

在以下时间点：0、10’、0.5、1、1.5、3、6h培养后，将每个溶液的5-μL小份转移到15μL的10x TBE负载缓冲剂中。然后，将该溶液在液氮中冷冻，并储存在-20℃下。

将每个样品的4μL负载到非变性20％聚丙烯酰胺凝胶上，并在80V下电泳2.5小时。

对于siRNA可视化，用溴化乙锭溶液(1.0μg/μL)对凝胶进行染色。

至于非降解siRNA凝胶迁移的阳性对照，将PBS中5μL的7μM测试siRNA溶液转移到15μL的10x TBE负载缓冲剂中，并负载到凝胶上。然后，将该溶液在液氮中冷冻，并储存在-20℃下。

作为降解单链siRNA的迁移模型的参考，对非相关单链siRNA进行了制备。

结果：Casp 2_4 siRNA在所有制剂中是稳定的。

体内研究：

测试系统：

所用的动物：大鼠；属：成年，Sprague-Dawley；修饰：SD

来源：Harlan,Jerusalem Israel

年龄：8-10周；体重范围：220-270g

性别：雄性；组大小：n＝6；动物总数：54

畜牧业：饮食：向动物提供任意的市售啮齿动物食物，并能自由获得饮用水。

环境：

(i)至少5天的驯化。

(ii)在整个研究期间，将所有动物关在一个控制居住条件的专用设施中，并根据规定的操作规程(SOP)维持不变。向动物提供任意的市售啮齿动物食物(rlan Teklad2018S总量含18％蛋白质的啮齿动物食物)和过滤、加氯消过毒的酸化水。

在整个研究期间，将大鼠关在含有过滤器顶部的微型隔离器笼子中，1-6大鼠/笼。将笼子维持在受控制的环境下，温度条件(20-24℃)，相对湿度(30-70％)，12-小时光照/12小时黑暗的周期，由控制计算机监控。

实验设计

实验设置包括9个实验组(每组6只大鼠)。将滴眼剂双侧给药。使用了不同的制剂(研究设计表C11)。在siRNA给药后的终止时间点(3小时)：终止设置根据表C11的研究设计施行。CASP2_4 siRNA的视网膜浓度通过定量PCR测定。

表C11：研究设计

*丙三醇+EDTA制剂(不含MC的制剂)＝1％v/v无菌丙三醇及无热原水的0.01％w/vEDTA溶液

麻醉：在实验过程中，所有滴眼剂治疗的动物都用Equithesine(I.P.4ml/kg)麻醉。

滴眼剂传输：使用钝吸管端(10μl无菌过滤嘴(短))将测试物或载体的3μL样品量施用到麻醉动物的双侧角膜表面。将该动物安置于温暖的环境中，以防止麻醉引起的低体温。根据研究设计(时间点3小时)终止所有研究小组的动物。根据研究设计收集组织。

预定的安乐死：将所有动物深度麻醉，并根据研究设计对各组小鼠施行安乐死(表C11，终止)。

灌注计划：用PBS对大鼠经心脏进行灌胃(在2-3分钟后20-50ml/min)。

组织收集：灌注后，摘除双眼(左，右)的细胞核，储存于冰中。用双筒显微镜解剖眼睛，并根据样品分级标准选择总病理学分级。沿角膜缘切开角膜，轻轻取出晶状体，小心翼翼地将玻璃体及视网膜与巩膜分离。收集全视网膜及玻璃体(humor)，独立适当地分成两份，并适当地标记试管。用大量的PBS清洗解剖的视网膜(新配制PBS单独管中的每一个视网膜)，用除去多余的液体，在液氮下捕捉冷冻视网膜。对视网膜和玻璃体样品进行了RNA提取。

评价：

RNA提取：视网膜：通过双提取分别从每个视网膜样品(左和右)中提取RNA。对RNA进行cDNA制备和定量PCR分析。

玻璃体：使用以下操作规程获得从玻璃体检测Casp2_4_S510siRNA的材料：每个大鼠玻璃体约为10μl。将500μl试剂A EZ-RNA(Biological Industries Cat no.20-410-100)添加到每个玻璃体中。样品经均质化后，添加10μgtRNA(10 mg/m原液的1μl)。将该样品储存在室温下5分钟。随后，分别加入EZ-RNA II B:400μl和EZ-RNA II C:90μ，并混匀。将该样品储存在室温下10分钟，然后在4℃、12000g下离心15分钟。

将上相转移到一个异丙醇的500μl新管中，添加线性丙烯酰胺5μl。将该样品储存在-20℃下过夜，在4℃、12000g下离心20分钟，用75％乙醇洗涤两次。将颗粒溶解于15μl水中。

siRNA的量化：根据Quark标准操作规程进行定量PCR分析，对视网膜和玻璃体液中siRNA的量(siRNA的量化通过每玻璃体施行)进行测定。

结果

研究表明，在无创伤性地向体内施用不同制剂3小时后，在大鼠视网膜内检测到下列的许多siRNA：

表C12：fmle/1μg RNA中的CASP2 siRNA标准化(miRNA)数量

组	简写	N	平均值	标准差
					IX	I-N/A	6	0.005	0.005
VIII	P-PBS	6	0.056	0.124
					VII	C-MC(0)	6	6.303	3.921
XA	C-MC(1/2)	4	17.831	16.628
					XIA	C-MC(1)	6	5.677	4.235
V	C-MC(2)	6	6.963	8.042
					VI	C-MC(3)	5	7.653	6.674
II	C-Systane	5	5.109	2.492
					I	C-PBS	6	4.228	6.758

MC(0)-MC(3)–包括0至3％不断增加甲基纤维素浓度的制剂。

结论：所有通过CASP2 siRNA治疗组显示目标视网膜组织中siRNA(>4fmole)的阳性数量。制剂组之间没发现显着差异(P值＝0.8425)。

无创伤性给药的siRNA诱导与目标眼部细胞的细胞凋亡相关的目标基因的体内抑制(KD)

实施例8：通过滴眼剂在大鼠视网膜内给药的p53基因靶向siRNA体内抑制活性的测定，MC 2％中配制的siRNA化合物(制剂“A”)

目的

这项研究的目的是为了测定无创伤性给药的siRNA化合物靶向p53mRNA在大鼠神经视网膜中的抑制活性。siRNA化合物被配制为通过滴眼剂给药。通过采用ELISA法测定蛋白水平评价抑制活性。

测试物

a.物质(未配制的化合物)：QM5(小鼠/大鼠p53靶向siRNA)

b.无创伤性(滴眼剂)传输的配制siRNA化合物(表C13中的组2和5)：在2％(w/v)甲基纤维素及1％(v/v)无菌丙三醇及无热原水(滴眼剂溶液)中0.01％(w/v)EDTA溶液中的100μg/3μQM5 siRNA溶液。

c.玻璃体内注射的配制siRNA化合物(表C13中的组1和4)140μl PBS中的280μgQM5 siRNA

d.无创伤性(滴眼剂)传输的配制载体溶液(表C13中的组3和6)：2％(w/v)甲基纤维素及1％(v/v)无菌丙三醇及无热原水(滴眼剂溶液)中的0.01％(w/v)EDTA溶液。

测试系统：

成年雄性，Sprague-Dawley(SD)大鼠Harlan,Jerusalem Israel,，6-8周龄，每个160-180g。

实验设计

研究设计：对组1-6的每个动物进行单侧切断(左眼，OS)。

组2、3、5和6：将测试化合物(3μl配制载体中的100μg测试物-组2及5)或配制载体单独(组3和6)从0天(切断后立即)开始作为每天的滴眼剂。根据表C13终止实验组。组7的左眼和右眼样品作为一个完整的正常对照。

组1和4：切断(0天)三分钟后，将10μL PBS中的20μg siRNA化合物通过显微注射入玻璃体内。使用胰岛素微型注射器(0.3ml)对玻璃体进行的显微注射垂直于巩膜。根据表C13终止动物。

表C13：研究设计

(见下表C14-C17和图11A和11B)

根据肾脏W.C.E标准曲线的p53信号

表C14：根据肾脏W.C.E标准曲线的p53信号值

表C15：未处理动物的p53信号比％

根据GST-hp53的p53信号

表C16：根据GST-hp53标准曲线的的p53信号值

表C17：未处理动物的p53信号比％

结论：这些研究表明：大鼠神经视网膜内无创伤性给药的siRNA化合物靶向p53mRNA诱导了p53蛋白的抑制。

siRNA化合物诱导眼神经损伤动物模型中的体内眼神经保护作用

实施例9：在IVT注射后通过ONC模型中siRNA化合物靶向蛋白酶2诱导的眼神经保护作用的评价

研究目标：是为了评价IVT注射后ONC模型中siRNA化合物靶向蛋白酶2的眼部神经保护功效

方法

RGC的逆行标记

将荧光金示踪物沿着视网膜神经节细胞轴突逆行传输(从脑到眼)，导致所有RGC形成完整和特定的标签。为了本研究的目的，通过应用逆行示踪物荧光金(2％，荧光染料，Englewood,CO)对所有RGC进行标记。简单地说，在头皮上方离囟喙6mm和两半球中线外侧1.2mm的坐标处钻个窗口。使用微量注射器，将3μL荧光金以1μl/min的速率向骨表面下方3.8mm，4mm和4.2mm处这三个深度注入上丘。然后将该针慢慢取回，缝合皮肤。在成年大鼠中，根据这个步骤得到所有RGC全部标记所需的时间为～1周。出于这个原因，在RGC逆行标记后一周，施行ONC。

视神经损伤：麻醉成年大鼠的眼窝视神经(ON)显露是通过眼眶路径、切断的脑膜以及通过使用钳子10秒内将筛状板压碎成2mm的横断ON的所有轴突。

玻璃体内(IVT)注射。使用微量吸液管将一个或两个20μg剂量(在10μL的PBS内)的测试或对照siRNA或10μL PBS载体显微注射到神经头2mm前的玻璃体内，并垂直于巩膜。IVT给药被认为是对照或目标基因的初步验证。

存活的视网膜神经节细胞的量化。在终止时，使用4％多聚甲醛对实验动物经心脏进行灌注。将含有视神经的眼睛摘除细胞核，用刀片切开角膜，轻轻取出晶状体/玻璃体。将两个视网膜解剖出来，固定另外30分钟，将玻璃体平面倒置安装在神经节细胞层测试的载玻片上。在荧光显微镜和紫外线过滤器(365/420nm)下对RGC进行测定。通过两个不同的，独立的“盲”研究者在16个不同区域计数对逆行荧光RGC的数量进行测定(视网膜半径中六分之一、二分之一、六分之五这3个不同的偏心率对应每视网膜象的四个区域)。在死亡的RGC吞噬后，可能纳入荧光金的小胶质细胞是以典型的形态为特征，并不能进行定量分析。

部分1

测试物：CASP2_4 siRNA–一个通过2’O-甲基化在其两条链是化学修饰的具有19个碱基长度的寡核苷酸双链。其他化合物包括使用正义链3’末端的L-DNA或3’末端的2’5’桥是化学修饰的siRNA。多物种中的蛋白酶2目标基因。

对照物：PBS

设计：通过将逆行示踪物荧光金应用到上丘上对视网膜神经节细胞(RGC)首先进行选择性地标记。一个星期后，动物受到视神经挤压伤(ONC)。在通过平面安装视网膜上荧光金标记的RGC计数的ONC后7和30天，对存活RGC进行量化，表C18的显示了组治疗。

表C18：组治疗

结果：使用20μg Casp2_4 siRNA治疗的眼睛的存活RGC的平均数，经视神经损伤后7天为2040±35个细胞/mm²，30天为298±25个细胞/mm²。这些计数均显著大于经PBS处理的眼睛RGC的平均计数，7天为941±27个细胞/mm²，30天为41±7个细胞/mm²。在非手术对照眼中，RGC平均数为2253±104个细胞/mm²，相当于文献中报道的RGC平均数。表C19提供了这项研究的结果。

表C19：在伤后不同时间点的存活视网膜神经节细胞平均数

给出了平均值±标准偏差的所有数据。采用单向方差分析(ANOVA)对值进行比较，并在P<0.02时被认为是显著差异。

结论：视网膜神经节细胞增加的存活并不是由于麻醉(氯胺酮是N-甲基-D-天冬氨酸受体的拮抗剂，二甲苯胺噻嗪是2-肾上腺素受体激动剂)的神经保护作用，因为对照组中的相同麻醉动物的视网膜神经节细胞计数，显著低于Casp2_4 siRNA治疗组中的动物，但却是由于在通过siRNA化合物靶向蛋白酶2基因治疗的视神经损伤后沉默促凋亡蛋白酶2激活和上调的神经保护作用。

部分2

测试物：CASP2_4 siRNA–一个通过反义链2’O-甲基化和正义链的L-DNA进行化学修饰的具有19个碱基长度的寡核苷酸双链。许多物种的目标蛋白酶2基因。

对照物：

-PBS

-siRNA靶向GFP-一个通过2’O-甲基化在其两条链进行化学修饰的具有21个碱基长度的寡核苷酸双链。

-CNL–与任何已知的哺乳动物转录物没有配对的siRNA；一个通过2’O-甲基化在其两条链进行化学修饰的具有19个碱基长度的寡核苷酸双链。

设计：通过将逆行示踪物荧光金应用到上丘上对视网膜神经节细胞(RGC)首先进行选择性地标记。一个星期后，动物受到视神经挤损伤(ONC)。在通过平面安装视网膜上荧光金标记的RGC计数的ONC后7天，对存活RGC进行量化，表C18的显示了组治疗。在ONC时，对测试或对照物进行注射。为了测试通过滴眼剂给药(见下例)的siRNA的活性和功效，进行了类似的实验。表C20显示了组治疗。

表C20：组治疗

结果：使用20μg Casp2_4 siRNA治疗的眼睛的存活RGC的平均数，经视神经损伤后7天为2040±35个细胞/mm²。这些计数均显著大于经PBS或GFP siRNA或CNL_1 siRNA处理的眼睛RGC的平均计数，经视神经损伤后7天分别为901±50个细胞/mm²、922±38个细胞/mm²、898±42个细胞/mm²。在非手术对照眼中，RGC平均数为2196±110个细胞/mm²，相当于文献中报道的RGC平均数。表C21显示了该结果。给出了平均值±标准偏差的所有数据。采用单向方差分析(ANOVA)对值进行比较，并在P<0.01时被认为是显著差异。

表C21：在伤后7天存活RGC的平均数(n＝4视网膜/组).

结论：视网膜神经节细胞存活的增加是由于在通过siRNA化合物靶向蛋白酶2基因治疗的视神经损伤后沉默促凋亡蛋白酶2激活和上调的神经保护作用。含有不同结构修饰/基序的Casp2_4 siRNA分子显示了视网膜神经节细胞存活范围的神经保护功效。

实施例10：IOP模型中siRNA化合物靶向蛋白酶2的眼部神经保护功效的评价

本次研究的目的是要建立在临床前大鼠青光眼IOP模型中单次注射20μg CASP2_4化合物或阴性对照GFP siRNA的神经保护功效。

研究概述

在研究小组的所有动物中，将荧光示踪DiI(1,1'-双十八烷基-3,3,3',3'-四甲基吲哚碳菁)应用到两个上丘对视网膜神经节细胞进行逆行标记。一个星期后，组2至5动物的左眼眼压单方面地增加。在2个星期内，每隔一天监测手术(左)眼和对侧(右)眼的眼压。在注射高渗盐水两星期后，将载体(PBS)或siRNA(PBS中的20μg，siRNA靶向Casp2或阴性对照siRNA siRNA靶向非哺乳动物基因，绿色荧光蛋白)，通过玻璃体内(IVT)注射到左(手术)眼中。对侧的非手术眼没有进行IVT注射。此外，在注射高渗盐水两星期后，将组2动物处死，在荧光显微镜下对DiI标记RGC进行计数，以评价在siRNA注射时RGC的缺失程度。对于接受IVT注射的所有组，在实验的第三周期间对IOP测量一次，以确认在手术眼增加的状态。在IOP增加3周时，或在测试和对照物注射后1周，将这些动物处死，在荧光显微镜下对DiI标记RGC进行计数。右视网膜作为标签质量的内部对照。实验一开始对其RGC进行逆行标记的一单独组的原生大鼠，被用作完整对照，以提供正常RGC密度的参考。在高眼压症2周时将这组4只大鼠处死(连同第2组)，剩余9只在3周时(连同组3至5)处死。实验设计见下表C22。

表C22动物

材料和设备物质

(未配制的化合物)CASP2_4_S510(CASP2_4；CASP2 SIRNA；siRNA靶向半胱天冬酶2mRNA)

由Agilent提供

测试材料的说明：一个19个碱基长度的化学修饰钝端双螺旋结构含具有两个独立链，其中，包括未修饰核糖核苷酸(大写字母)、位点18的L-脱氧核糖核苷酸(粗体，下划线)和SEN链5'末端的反向脱氧脱碱基(IB)的正义链(SEN)，以及包括未修饰核糖核苷酸(大写字母)和式I所述位点2、4、6、8、11、13、15、17和19的2’OMe糖基修饰核糖核

苷酸(小写字母)的反义链(AS)。

供应量:300mg

储存条件:-80℃

对照物(未配制的化合物)GFP_5_S763(siRNA靶向GFP mRNA)

外购(制造商名称):Agilent

制造商目录#N/A

供应量:220.8150mg

储存条件:-80℃；到期日:ND

测试/对照物(配制的)CASP2_4/GFP_520μg/5μL PBS

将0.5mg溶解于125μl以得到一4μg/μl的原液。随后将其分装入5μl的管中，并储存在–80℃下。

载体-PBS

多单元磷酸盐缓冲生理盐水，溶液1X，没有钙，也没有镁(目录编号：311-010-EL)。

将荧光显微镜和Zeiss Axioskop 2 Plu显微镜(Carl Zeiss Canada,Kirkland,QC)一起操作使用，使用电荷耦合摄像机(Retiga,Qimaging)拍摄图像，并用NorthernEclipse图像分析软件(Empix Imaging,Mississauga,ON)对其进行处理。将缩影影片放大拍摄25倍。

实验步骤

对成年雄性棕色挪威鼠进行手术，不育种，年龄介于10-12个月间(300-400g)，在全身麻醉下，通过由氯胺酮(100mg/mL)、甲苯噻嗪(20mg/mL)和乙酰丙嗪(10mg/mL)组成的1mL/Kg标准大鼠鸡尾酒的进行腹腔内注射。

高眼压症手术：通过使用Morrison模型诱导单侧慢性高IOP，涉及到将高渗盐水注射入巩膜静脉中，从而导致房水外流途径的阻塞。此过程导致眼压的逐渐增加，和RGS的逐步死亡。对这项研究中的所有动物，只进行单一盐水静脉注射。该步骤所选定的眼睛是与应用到眼球赤道的塑料环相适应的，以限制盐水注射到角膜缘。使用微型针(直径30-50μm)将50μL无菌NaCl溶液(1.85M)注入一巩膜静脉中。塑料环暂时封堵了将生理盐水压入巩膜静脉窦的其他巩膜静脉，以隔离疤痕。将动物关在一个恒定的低荧光灯(40-100lux)室内，以稳定昼夜眼压变化(8)。

眼内压(IOP)的测量：使用一个校准眼压计(TonoPen XL,Medotronic Solan,Jacksonville,FL)在清醒动物中测量青光眼和正常眼(对侧眼)的IOP。在高眼压症手术后前两周，每隔一天对IOP进行测量；在高眼压症手术后第2周和第3周之间至少一次。在高眼压条件下眼内注射后，眼睛变得脆弱，为此IOP测量次数是有限的，因为这涉及到将在角膜上的附加压力，以得到确实的读数。由于压力升高的发病，每只眼的平均IOP(毫米汞柱±标准差)被认为是为所有IOP读数的平均值。每个人眼睛的最高IOP，青光眼或正常对侧眼图测量定义为IOP高峰值，这个值被用来估计每个组的平均IOP峰值。

眼内压(IOP)的测量：由于压力升高的发病，每只眼的平均IOP(毫米汞柱±标准差)被认为是为所有IOP读数的平均值。每个人眼睛的最高IOP，青光眼或正常对侧眼图测量定义为IOP高峰值，这个值被用来估计每个组的平均IOP峰值。正整数IOP是根据青光眼减去从高眼压症手术到安乐死的正常眼的IOP曲线围成的面积。整数IOP表示的是在整个实验中，全部累积的IOP接触。

研究设计：

在诱导青光眼一周前，将荧光示踪DiI应用到两个上丘对RGC进行逆行标记。

一周后，IOP的单方面升高是通过将高渗盐溶液注射到巩膜静脉诱导的。此过程被称为高眼压手术。

在第一个实验中，药效研究前，在高眼压症手术后2周和3周，对“没有注射”组的RGC缺失状态(4只大鼠/组，总量＝8只大鼠)进行了评价。

在高眼压症手术后整整2周，进行每个siRNA的单一玻璃体内注射。

在高眼压症手术后整整3周，对动物施行安乐死，并制备RGC存活分析的视网膜。

在12个标准视网膜区域中量化存活RGC的密度

表C22：研究设计

*NA–未施用,组大小:n＝5

存活RGC体的量化：以复制和掩蔽的形式对存活RGC体进行量化。RGC密度计数，通过大鼠进行深度麻醉，然后用4％多聚甲醛(PFA)以0.1M磷酸缓冲剂经心脏进行灌注，之后将两只眼睛的细胞核立即摘除。将视网膜解剖出来，并将倒置的神经节细胞层平面安装在载玻片上。在荧光显微镜下对所述DiI标记神经细胞的12个标准视网膜区域进行计数。

结果与讨论

表C23：完整推论表的视网膜神经节细胞百分比

处理	N	平均值	Std	CV	Dunnett P-值
						PBS	6	62.37	5.86	9.40
CASP2_4	6	81.71	14.28	17.48	0.05
						2wIOP	4	71.25	6.75	9.47	0.19
GFPsiRNA	6	65.75	4.97	7.57	0.68
						完整的	13	100.00	2.84	2.84	0.00

PBS治疗组的比较

CASP2_4 siRNA-治疗的IOP升高的眼睛RGC防腐显著优于PBS处理组(比PBS结果高于1.31倍；p值＝0.05)。在绿色荧光蛋白siRNA治疗组中，至于PBS治疗组中没有发现显著差异(p值＝0.68)。

PBS(p值＝0.19)处理的IOP(2周)至IOP(3周)之间没有显著差异。

IOP(2周)组的比较

该完整组每mm²的RGC密度显著高大于IOP(2周)组(p值＝0.00)。IOP(2周)组和3周后将被处死的其他组(p值范围为0.16至0.44)之间的每mm²的RGC密度没有显著差异。

完整组的比较

该完整组每mm2的RGC密度显著高大于PBS、GFP siRNA治疗的IOP组和未治疗的IOP(2周)组(p值<0.01)。与完整组(p值＝0.06)相比，CASP2_4 siRNA治疗的IOP组间的每mm2的RGC密度没有显著差异。

这些数据表明，siRNA靶向半胱天冬酶2对IOP升高引起的RGC损伤提供保护，其IOP升高2周时的给药导致IOP进一步缺失的停止。

如上所述进行IOP测量。

IOP：Dunnett方法是用于PBS治疗组的结果比较。对另外的参数进行了计算和分析，如：AUC(曲线下面积)，在整个测量时间内的平均IOP和最高(IOP)。

大多数动物在高眼压手术1-2周后显示了IOP的显著增加。

在治疗组的手术眼(0.7746)之间没有发现显著的IOP水平差异。同样地，在IOP水平无差异，在治疗组的对侧眼和完整眼之间没有发现IOP水平差异。

结果表明，正当所有治疗组中的IOP保持升高时的Casp2 siRNA诱导的神经保护作用。

结果：在所有三个计算IOP参数的组之间没有发现显著差异。

实施例11：切断模型中siRNA化合物靶向半胱天冬酶2的神经保护功效的评价

本功效研究的目的是在成年Sprague-Dawley大鼠中使用视神经(ON)损伤诱导的RGC凋亡模型。这个模型系统中RGC死亡的发生和动力学的重现性非常好，并考虑到建立体内Casp2_4 siRNA的神经保护功效。使用这种方法，RGC死亡随时间的变化遵循一个可预测的过程：细胞死亡从第5天开始，并继续下去到2周后，这些神经细胞超过90％的迅速丧失。

方法

RGC逆行标记：为了本研究的目的，通过应用逆行示踪物荧光金(2％，荧光染料，Englewood,CO)对所有RGC进行标记。简单地说，将两个上丘露出，将浸润有荧光金一小块明胶海绵应用于其表面。在成年大鼠中，根据这个步骤得到所有RGC全部标记所需的时间为～1周。出于这个原因，在RGC逆行标记后一周，对其进行视神经切断和siRNA眼内注射。

视神经切断：通过横断靠近眼睛(0.5至1mm)的视神经对RGC的整个种群进行切断。在每次切断术后，进行常规的视网膜眼底检测，以检查手术后视网膜循环的完整性。动物表现出缺乏免疫力的血液供应迹象不属于本研究的范围。

对于玻璃体内注射，在手术时第0天使用玻璃微量吸液管将10μg l的每个5μl PBS试剂、Casp2_4 siRNA或siRNA显微注射入玻璃体内神经头前2mm，并垂直于巩膜，然后第7天重复。

存活RGC的量化：在视神经切断后14天，用4％多聚甲醛对实验和对照动物经心脏进行灌注。将左视网膜(处理)和右视网膜(未经治疗的对照组)解剖出来，固定另外30分钟，将玻璃体平面倒置安装在RGC层测试的载玻片上。对12个标准区域内回填有荧光金的RGC进行计数。在死亡的RGC吞噬后，可能纳入荧光金的小胶质细胞是以典型的形态为特征，并不能进行定量分析。

实验设计

测试物：CASP2_4 L siRNA–一个通过反义链2’O-甲基化和正义链的L-DNA进行化学修饰的具有19个碱基长度的寡核苷酸双链。

对照物

PBS

-siRNA靶向GFP-一个通过2’O-甲基化在其两条链进行化学修饰的具有21个碱基长度的寡核苷酸双链。

-CNL–与任何已知的哺乳动物转录物没有配对的siRNA；一个通过2’O-甲基化在其两条链进行化学修饰的具有19个碱基长度的寡核苷酸双链。表C24显示了组治疗。

表C24：组治疗

结果：使用10μg Casp2_4 siRNA治疗的眼睛的存活RGC的平均数，经视神经损伤后30天为533±24个细胞/mm²。这些计数均显著大于经PBS治疗的眼睛RGC的平均计数，其在30天为130±7个细胞/mm²。在非手术对照眼中，RGC平均数为2138±91个细胞/mm²，相当于文献中报道的RGC平均数。

表C25：伤后14天RGC存活的平均数(n＝6例视网膜/组)

治疗	GFP	Casp2_4
				130	533
SE	7	24
			全部RGC中的RGC存活％	6	25
SE	0.32	1.12

使用单向方差分析(ANOVA)的GraphPad Instat软件对进行数据分析和统计。给出了平均值±标准偏差的所有数据，并在P<0.02时被认为是显著差异。

结论：RGC存活的增加是由于通过siRNA化合物靶向半胱天冬酶2基因治疗的视神经损伤后沉默促凋亡半胱天冬酶2激活和上调的神经保护作用。

结论：在本研究中，Casp2_4 siRNA在视神经损伤模型中的神经保护至少为30天，在RGC缺失的切断模型中神经保护为14天。视神经损伤和切断实验提供了急性视神经病的逼真模型。

siRNA化合物的无创伤性给药诱导眼神经细胞损伤动物模型中的体内眼神经保护作用

实施例12：ONC模型中无创伤性给药的siRNA靶向半胱天冬酶2的眼神经保护功效的评价

测试物：CASP2_4 siRNA(式I化合物)

对照物：

-甲基纤维素

-CNL–与任何已知的哺乳动物转录物没有配对的siRNA；一个通过2’O-甲基化在其两条链进行化学修饰的具有19个碱基长度的寡核苷酸双链。

设计：通过将逆行示踪物荧光金应用到上丘上对视网膜神经节细胞(RGC)首先进行选择性地标记。一周后，动物受到视神经损伤(ONC)。一周内每隔一天施用滴眼剂(总共3次)，施用100μg/3μl CNL_1或Casp2_4 siRNA或3μl的MC载体，在ONC后10分钟施用第一剂量。在通过平面安装视网膜上荧光金标记RGC计数的ONC后7天，对存活RGC进行量化。

结果：使用20μg Casp2_4 siRNA治疗的眼睛的存活RGC的平均数，经损伤后7天为445±17个细胞/mm²。这些计数均显著大于经PBS或CNL_1 siRNA处理的眼睛RGC的平均计数，其在7天分别为337±11个细胞/mm²和341.6±13个细胞/mm²。表C26显示了该结果。给出了平均值±标准偏差的所有数据。使用单向方差分析(ANOVA)进行数据分析和统计，并在P<0.01时被认为是显著差异。

表C26：在伤后第7天存活RGC的平均数

	CNL_1	Casp2_4	MC载体
				平均值	341.625	445.4375	337.5
标准偏差	13.03265	17.222331	11.3389342
					934.6785	1218.7073	923.392613
Sd	35.65705	47.119921	31.0230758
RGC/视网膜	26470.1	34513.789	26150.4788
				标准偏差	1009.808	1334.4362	878.573505
				％总数	26.4701	34.513789	26.1504788
标准偏差	1.009808	1.3344362	0.87857351
				平均值	341.625	445.4375	337.5
标准偏差	13.03265	17.222331	11.3389342

结论：RGC存活的增加是由于通过甲基纤维素制剂中含siRNA靶向半胱天冬酶2基因的滴眼剂治疗的ONC损伤后沉默促凋亡半胱天冬酶2的神经保护作用。

实施例13：IOP模型中无创伤性给药的siRNA靶向半胱天冬酶2的眼神经保护功效的评价

实验设置：

实验动物：根据加拿大议会关于实验动物使用的指导施行所有动物的步骤(http://www.ccac.ca/)。对成年雄性棕色挪威鼠进行手术，不育种，年龄介于10-12个月间(300-400g)，在全身麻醉下，通过由氯胺酮(100mg/mL)、甲苯噻嗪(20mg/mL)和乙酰丙嗪(10mg/mL)组成的1mL/Kg标准大鼠鸡尾酒进行腹腔内注射。

RGC逆行标记：对于神经细胞的存活实验，使用3％的荧光染料DiI(1,1'-双十八基-3,3,3’,3’-四甲基-吲哚碳菁高氯酸酯；Molecular Probes,Junction City,OR)对RGC进行逆行标记，荧光碳菁标记持续数个月不褪色或渗漏，并不影响标记细胞的功能。对于逆行标记，将两个上丘，大脑中RGC的主要目标，与外界接触，将浸润有DiI的一小块明胶海绵(Pharmacia and Upjohn Inc.,Mississauga,ON)应用于其表面上。DiI应用7天后，标记所有RGC所需的时间，如下所述动物经过高眼压手术。

高眼压症手术：通过使用一种方法诱导单侧慢性高IOP，涉及到将高渗盐水注射入巩膜静脉中。对这项研究中所涉及的所有动物，只进行单一盐水静脉注射。该步骤所选定的眼睛是与应用到眼球赤道的塑料环相适应的，以限制盐水注射到角膜缘。使用微型针(直径30-50μm)将50μL无菌NaCl溶液(1.85M)注入一巩膜静脉中。塑料环暂时封堵了将生理盐水压入巩膜静脉窦的其他巩膜静脉，以隔离疤痕。将动物关在一个恒定的低荧光灯(40-100lux)室内，以稳定昼夜眼压变化(8)。

眼内压(IOP)的测量：在清醒动物中使用一个校准眼压计(TonoPen XL,Medotronic Solan,Jacksonville,FL)测量青光眼和正常眼(对侧眼)的IOP。在高眼压症手术后前两周，每隔一天对IOP进行测量；在高眼压症手术后第2周和第3周之间至少一次。在高IOP条件下(见下文)眼内注射后，眼睛变得脆弱，为此IOP测量次数是有限的，因为这涉及到将在角膜上的附加压力，以得到确实的读数。由于压力升高的发病，每只眼的平均IOP(毫米汞柱±标准差)被认为是为所有IOP读数的平均值。每个人眼睛的最高IOP，青光眼或正常对侧眼被定义为IOP高峰值，这个值被用来估计每个组的平均IOP峰值。正整数IOP是根据青光眼减去从高眼压症手术到安乐死的正常眼的IOP曲线围成的面积。整数IOP表示的是在整个实验中，全部累积的IOP测光。

siRNA分子眼内注射：通过以20μg的浓度将每个siRNA化合物灌注入左眼的玻璃体腔内进行眼内注射(全部注射量：5μl)。右眼作为对侧对照。此外，将原生大鼠的非手术眼用作完整对照。使用配备有一支32-水位玻璃针的10μl Hamilton注射器进行玻璃体内注射。将针尖插入眼睛的上半球，在玻璃体水平上，以45°角穿过巩膜进入玻璃体。这种给药途径避免视网膜脱离或损伤眼结构，其中包括晶状体和光圈，其可以释放RGC再生和存活的因子。在2分钟内进行注射，并将针保持在位置内另外2分钟后，轻轻地移除。用手术胶(IIndermill,Tyco Health Care,Mansfield,MA,USA)密封注射部位。

siRNA分子的局部滴眼剂滴注：

在诱导IOP后3周间每天，使用钝吸管端(10μl无菌过滤嘴(短))将3μl样品量的100μg siRNA施用到麻醉动物的双侧角膜表面。将这些动物安置于温暖的环境中，以防止麻醉引起的低体温。

存活RGC体的量化：以复制和掩蔽的形式对存活RGC体进行量化。RGC密度计数，通过大鼠进行深度麻醉，然后用4％多聚甲醛(PFA)以0.1M磷酸缓冲剂经心脏进行灌注，之后将两只眼睛的细胞核立即摘除。将视网膜解剖出来，并将倒置的神经节细胞层平面安装在载玻片上。在荧光显微镜下对所述DiI标记神经细胞的12个标准视网膜区域进行计数。

诱导IOP(眼内压力)，并持续了2周。然后，将CASP2_4或对照siRNA通过滴眼剂(2％甲基纤维素制剂中的siRNA)或IVT(PBS中的siRNA)IVT施用，详见表C27的研究设计。

表C27：研究设计

*NA–未施用的,组大小：n＝5

结果显示，2％甲基纤维素制剂中配制的siRNA的无创伤性传输提供了神经保护作用，并增加了神经细胞的存活率。

实施例14：大鼠视神经损伤(ONC)模型：玻璃体内注射siRNA与外用滴眼剂传输的比较

对于视神经横切面，麻醉成年大鼠的眼窝视神经(ON)显露是通过眼眶路径、切断的脑膜以及通过使用钳子10秒内将筛状板压碎成2mm的横断ON的所有轴突。

siRNA化合物单独施用或与以5uL量作为滴眼剂(20ug/uL)施用。在视神经损伤后(ONC)，立即将20ug/10ul测试siRNA或10ul PBS通过IVT施用到成年大鼠的单眼或双眼上。在此之后，每隔一天将siRNA通过ED施用到眼睛上，并对所采取解剖的siRNA的水平以及在注射后5小时和1天，稍后的2天、4天、7天、14天和21天捕捉冷冻的整个视网膜进行了测定。进行类似的实验是为了测试通过滴眼剂给药的siRNA的活性和功效。

下表C28显示的实验步骤，是为了测定在ONC模型中siRNA(siTEST1；siTEST2)单独或组合使用的功效。附加的剂量参数、浓度、终止时间表、制剂等是预期的。

表C28：研究设计

结果：根据本研究所得的结果，为目标基因下调设计的siRNA化合物的无创伤性传输提供了神经保护，并增加了视网膜的神经细胞存活率。

表B1-B26披露了用于合成未修饰或化学修饰siRNA化合物的正义和反义核酸的寡核苷酸对。这些表披露了沿着mRNA fior至少一个变体的正义链位点。

表B1 ACHE-乙酰胆碱酯酶

表B2 ADRB1-肾上腺素,β-1-,受体

表B3 AIFM1-凋亡诱导因子,线粒体相关,1

表B4 AKR1B1-醛酮还原酶家族1,成员B1(醛糖还原酶)

表B5 ASPP1-蛋白磷酸酶1,调节(抑制剂)亚单元13B

表B6 BNIP3-BCL2/腺病毒E1B 19kDa相互作用蛋白3

表B7 CAPNS1-钙蛋白酶,小亚单元1

表B8 CASP1-半胱天冬酶1,凋亡相关半胱氨酸肽酶

表B9 CASP12-半胱天冬酶12

表B10 CASP2-半胱天冬酶2,凋亡相关半胱氨酸肽酶

表B11 CASP3-半胱天冬酶3,凋亡相关半胱氨酸肽酶

表B12 CTSD-组织蛋白酶D

表B13 CYBA-细胞色素b-245,α多肽

表B14 DDIT4-DNA-损伤诱导转录体4

表B15 DDIT4L-DNA-损伤诱导转录体4-类

表B16 FAS-Fas(TNF受体超家族,成员6)(FAS)

表B17 FASLG-Fas配位体(TNF超家族,成员6)

表B18 HTRA2-HtrA丝氨酸肽酶2

表B19 KEAP1-kelch-类ECH-相关的蛋白1

表B20 LGALS3-凝集素,半乳糖苷-结合,可溶,3

表B21 LRDD-富含亮氨酸的重复序列，含死亡域

表B22 NOS1-一氧化氮合酶1

表B23 NOS2A-一氧化氮合酶2A

表B24 P53-肿瘤蛋白p53

表B25 PARP1–聚(ADP-核糖)聚合酶1

表B26 RAC1-ras-相关的C3肉毒菌毒素底物1

表B27 SHC1-SHC转化蛋白1

表B28 SLC2A1-溶质载体家族2,成员1

表B29 SLC2A2-溶质载体家族2,成员2

表B30 SLC2A3-溶质载体家族2

表B31 SLC5A1-溶质载体家族5,成员1

表B32 SORD-山梨醇脱氢酶

表B33 SOX9-SRY(性别决定区域Y)-箱9

表B34 SPP1–分泌的磷蛋白1

表B35 TP53BP2-肿瘤蛋白p53结合蛋白,2

表B36 XIAP-X-连接凋亡抑制剂

在本发明的具体实施方式中，提供了

1.一种抑制受试者视网膜神经节细胞缺失的方法，包括无创伤性地向受试者眼睛表面施用眼科组合物，所述眼科组合包含治疗有效量的至少一种siRNA，所述siRNA下调与视网膜神经节细胞缺失相关的目标基因表达，从而抑制所述受试者视网膜神经节细胞的缺失。

2.根据项目1所述的方法，其中所述目标基因如SEQ ID NO:1-58任一所述。

3.根据项目1或2所述的方法，其中所述受试者是人类。

4.根据项目1至3任一所述的方法，其中所述受试者是患有眼部疾病、眼部障碍或眼部损伤、或存在发展眼部疾病、眼部障碍或眼部损伤的风险。

5.根据项目1至4任一所述的方法，其中所述视网膜神经节细胞的缺失与受试者的眼部疾病、眼部障碍或眼部损伤有关。

6.根据项目4或5所述的方法，其中所述眼部疾病、眼部障碍或眼部损伤包括神经变性。

7.根据项目1至6任一所述的方法，其中所述眼科组合物被配制为霜、泡沫、膏、软膏、乳剂、液体溶液、滴眼剂、凝胶、喷雾、悬浮液、微乳液、微球、微囊剂、纳米球、纳米粒子、脂质囊泡、脂质体、聚合物囊泡、眼罩或隐形眼镜。

8.根据项目7所述的方法，其中所述眼科组合物被配制为滴眼剂。

9.根据项目4至8任一所述的方法，其中所述疾病、障碍或损伤是选自由青光眼、干眼症、糖尿病视网膜病变(DR)、糖尿病性黄斑水肿(DME)、老年性黄斑变性(AMD)、视神经炎、视网膜中央静脉阻塞、视网膜分枝静脉阻塞、缺血性视神经病变、视神经损伤、早产儿视网膜病变(ROP)或色素性视网膜炎(RP)、视网膜神经节细胞变性、黄斑变性、遗传性视神经病变、代谢性视神经病变，以及由于毒剂或药物不良反应或维生素缺乏症引起的神经病变组成的组。

10.根据项目9所述的方法，其中所述疾病、障碍或损伤是青光眼，所述目标基因如SEQ ID NO:1-35任一所述。

11.根据项目10所述的方法，其中所述目标基因如SEQ ID NO:1-2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6-7、SEQ ID NO:12,SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:19-20、SEQ ID NO:21和SEQ IDNO:28-29任一所述。

12.根据项目11所述的方法，其中所述目标基因如SEQ ID NO:1-SEQ ID NO:2任一所述。

13.根据项目9所述的方法，其中所述疾病、障碍或损伤是干眼症，所述目标基因如SEQ IDNO:5、SEQ ID NO:8-10、SEQ ID NO:26-27和SEQ ID NO:30-44任一所述。

14.根据项目13所述的方法，其中所述目标基因如SEQ ID NO:36-SEQ ID NO:44任一所述。

15.根据项目9所述的方法，其中所述疾病、障碍或损伤是黄斑变性，所述目标基因如SEQ ID NO:1-3、SEQ ID NO:5-10、SEQ ID NO:12-13、SEQ ID NO:24-27、SEQ ID NO:30-35、SEQ ID NO:45-53任一所述。

16.根据项目15所述的方法，其中所述目标基因如SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:12和SEQ ID NO:47任一所述。

17.根据项目9所述的方法，其中所述疾病、障碍或损伤是糖尿病性黄斑水肿，所述目标基因如SEQ ID NO:1-3、SEQ ID NO:5-10、SEQ ID NO:12-13、SEQ ID NO:24-27、SEQ IDNO:30-35、SEQ ID NO:45-53任一所述。

18.根据项目17所述的方法，其中所述目标基因如SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:12和SEQ ID NO:47任一所述。

19.根据项目9所述的方法，其中所述疾病、障碍或损伤是糖尿病视网膜病变(DR)，所述目标基因如SEQ ID NO:1-3、SEQ ID NO:5-10、SEQ ID NO:12-13、SEQ ID NO:24-27、SEQ ID NO:30-35、SEQ ID NO:45-53任一所述。

20.根据项目19所述的方法，其中所述目标基因如SEQ ID NO:48-53任一所述。

21.根据项目9所述的方法，其中所述疾病、障碍或损伤是视网膜色素变性(RP)，所述目标基因如SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:26-35和SEQ ID NO:54-58任一所述。

22.根据项目21所述的方法，其中所述目标基因如SEQ ID NO:56-57任一所述。

23.一种拯救受试者视网膜神经节细胞的细胞凋亡的方法，包括无创伤性地向受试者眼睛表面施用眼科组合物，所述眼科组合物包含至所述受试者的视网膜的目标基因的治疗有效量的至少一种siRNA，从而拯救所述受试者视网膜神经节细胞的细胞凋亡。

24.根据项目23所述的方法，其中所述目标基因如SEQ ID NO:1-58任一所述。

25、一种提高呈现视神经病变体征或症状的受试者视网膜神经节细胞存活的方法，包括无创伤性地向受试者眼睛表面施用眼科组合物，所述眼科组合物包含至提高视网膜神经节细胞的存活的目标基因的治疗有效量的至少一种siRNA，从而提高所述受试者视网膜神经节细胞的存活。

26.根据项目25所述的方法，其中所述目标基因如SEQ ID NO:1-58任一所述。

27.根据项目25或26所述的方法，其中所述体征或症状是细胞凋亡介导的。

28.一种预防、治疗或减轻与受试者视网膜神经节细胞死亡相关的眼部疾病的方法，包括无创伤性地向受试者眼睛表面施用眼科组合物，所述眼科组合物包含至与所述眼部疾病相关的目标基因的治疗有效量的至少一种siRNA，从而预防、治疗或减轻与所述受试者视网膜神经节细胞死亡相关的眼部疾病。

29.根据项目28所述的方法，其中所述目标基因如SEQ ID NO:1-58任一所述。

30.一种治疗或预防受试者视网膜神经节细胞死亡的方法，包括无创伤性地向受试者眼睛表面施用眼科组合物，所述眼科组合物包含：(a)至与所述视网膜神经节细胞死亡相关的目标基因的治疗有效量的至少一种siRNA，和(b)药学上可接受的赋形剂或载体或其混合物，从而治疗或预防所述受试者视网膜神经节细胞死亡。

31.根据项目30所述的方法，其中所述目标基因如SEQ ID NO:1-58任一所述。

32、一种预防由于受试者眼中眼内压(IOP)升高介导的视网膜神经节细胞死亡的方法，包括无创伤性地向受试者眼睛表面施用眼科组合物，所述眼科组合包含至受试者视网膜的目标基因的治疗有效量的至少一种siRNA，从而预防所述受试者视网膜神经节细胞死亡。

33.根据项目32所述的方法，其中所述目标基因如SEQ ID NO:1-58任一所述。

34、一种延迟、预防或拯救患有高IOP受试者的视网膜细胞死亡的方法，包括无创伤性地向受试者眼睛表面施用眼科组合物，所述眼科组合物包含至与受试者视网膜中RGC死亡相关的目标基因的治疗有效量的至少一种siRNA，从而延迟、预防或拯救视网膜细胞的损伤或死亡，其中眼内压(IOP)保持基本上升高。

35.根据项目34所述的方法，其中所述目标基因如SEQ ID NO:1-58任一所述。

36.根据项目32至35任一所述的方法，其中所述受试者是患有青光眼。

37、一种治疗患有视网膜神经节细胞缺失或损伤的方法，包括无创伤性地向受试者眼睛表面施用眼科组合物，所述眼科组合物包含至与所述视网膜神经节细胞缺失或损伤相关的目标基因的治疗有效量的至少一种siRNA，从而治疗所述受试者或降低所述受试者视网膜细胞的死亡。

38.根据项目37所述的方法，其中所述目标基因如SEQ ID NO:1-58任一所述。

39.一种减弱视网膜神经节细胞缺失和提供给所需受试者神经保护的方法，包括向受试者眼睛表面局部施用眼科组合物，所述眼科组合物包含至视网膜神经节细胞缺失相关的目标基因的治疗有效量的至少一种siRNA，从而减弱视网膜神经节细胞缺失和提供给所述受试者神经保护。

40.根据项目39所述的方法，其中所述目标基因如SEQ ID NO:1-58任一所述。

41.一种预防与受试者视网膜神经节细胞缺失相关的视野丧失的方法，包括无创伤性地向受试者眼睛表面施用眼科组合物，所述眼科组合物包含至受试者视网膜目标基因的治疗有效量的至少一种siRNA，从而预防所述受试者的视野丧失。

42.根据项目41所述的方法，其中所述目标基因如SEQ ID NO:1-58任一所述。

43.一种无创伤性治疗与受试者视网膜神经节细胞缺失相关的眼部疾病的眼科组合物，包含：(a)至与眼部疾病相关的目标基因的治疗有效量的至少一种siRNA，和(b)药学上可接受的赋形剂或载体或其混合物。

44.一种无创伤治疗与视觉系统组织的病理性异常/变化有关的眼部疾病的局部眼科药物组合物，包含：(a)至与眼部疾病相关的目标基因的治疗有效量的至少一种siRNA，其中所述目标基因是SEQ ID NO:1-58所述的任一序列，和(b)药学上可接受的赋形剂或载体或其混合物。

45.根据项目44所述的组合物，其中所述眼部疾病与视觉系统中的视网膜神经节细胞缺失相关。

46.一种用于治疗受试者患有与视网膜神经节细胞死亡相关的眼部疾病的局部眼科药物组合物，包含：(a)至与眼部疾病相关的目标基因的治疗有效量的至少一种siRNA，其中所述目标基因是SEQ ID NO:1-58所述的任一序列，和(b)药学上可接受的赋形剂或载体或其混合物

47.根据项目43至46任一所述的组合物，其中所述siRNA最终存在浓度按组合物体积计为约5μg/μl至约60μg/μl。

48.根据项目47所述的组合物，其中所述siRNA最终存在浓度按组合物体积计为约6.6μg/μl。

49.根据项目47所述的组合物，其中所述siRNA最终存在浓度按组合物体积计为约25μg/μl。

50.根据项目47所述的组合物，其中所述siRNA最终存在浓度按组合物体积计为约33.3μg/μl。

51.根据项目47所述的组合物，其中所述siRNA最终存在浓度按组合物体积计为约50μg/μl。

52.根据项目43至51任一所述的组合物，其中所述疾病是选自由青光眼、干眼症、糖尿病视网膜病变(DR)、糖尿病性黄斑水肿(DME)、老年性黄斑变性(AMD)、视神经炎、视网膜中央静脉阻塞、视网膜分枝静脉阻塞、缺血性视神经病变、视神经损伤、早产儿视网膜病变(ROP)或色素性视网膜炎(RP)、视网膜神经节细胞变性，黄斑变性、遗传性视神经病变、代谢性视神经病变，以及由于毒剂或药物不良反应或维生素缺乏症引起的神经病变组成的组。

53.根据项目43至52任一所述的组合物，其中所述组合物被配制为霜、泡沫、膏、软膏、乳剂、液体溶液、滴眼剂、凝胶、喷雾、悬浮液、微乳液、微球、微囊剂、纳米球、纳米粒子、脂质囊泡、脂质体、聚合物囊泡、眼罩或隐形眼镜。

54.根据项目53所述的方法，其中所述组合物被配制为滴眼剂。

55.一种包装的药物制剂，包括(a)容器内根据项目43至54任一所述的药物组合物，(b)所述组合物用于治疗眼部疾病的说明书。

56.根据项目43至54任一所述的药物组合物在制备提高视网膜神经节细胞的存活的药物中的用途。

57.一种治疗需要治疗受试者青光眼的方法，所述方法包括局部向受试者眼睛表面施用至受试者眼睛目标基因的治疗有效量的至少一种siRNA，其中所述目标基因如SEQID NO:1-35任一所述。

58.根据项目57所述的方法，其中所述目标基因如SEQ ID NO:1-2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6-7、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:19-20、SEQ ID NO:21和SEQ IDNO:28-29任一所述。

59.根据项目58所述的方法，其中所述目标基因如SEQ ID NO:1-SEQ ID NO:2任一所述。

60.一种治疗需要治疗受试者干眼症的方法，所述方法包括局部向受试者眼睛表面施用至受试者眼睛目标基因的治疗有效量的至少一种siRNA，其中所述目标基因如SEQID NO:5、SEQ ID NO:8–10、SEQ ID NO:26-27和SEQ ID NO:30-44任一所述。

61.根据项目60所述的方法，其中所述目标基因如SEQ ID NO:36-SEQ ID NO:44任一所述。

62.一种治疗需要治疗受试者老年性黄斑变性(AMD)的方法，所述方法包括局部向受试者眼睛表面施用至受试者眼睛目标基因的治疗有效量的至少一种siRNA，其中所述目标基因如SEQ ID NO:1-3、SEQ ID NO:5-10、SEQ ID NO:12-13、SEQ ID NO:24-27、SEQ IDNO:30-35、SEQ ID NO:45-53任一所述。

63.根据项目62所述的方法，其中所述目标基因如SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:12和SEQ ID NO:47任一所述。

64.一种治疗需要治疗受试者糖尿病性黄斑水肿(DME)的方法，所述方法包括局部向受试者眼睛表面施用至受试者眼睛目标基因的治疗有效量的至少一种siRNA，其中所述目标基因如SEQ ID NO:1-3、SEQID NO:5-10、SEQ ID NO:12-13、SEQ ID NO:24-27、SEQ IDNO:30-35、SEQ ID NO:45-53任一所述。

65.根据项目64所述的方法，其中所述目标基因如SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:12和SEQ ID NO:47任一所述。

66.一种治疗需要治疗受试者糖尿病视网膜病变(DR)的方法，所述方法包括局部向受试者眼睛表面施用至受试者眼睛目标基因的治疗有效量的至少一种siRNA，其中所述目标基因如SEQIDNO:1-3、SEQ ID NO:5-10、SEQ ID NO:12-13、SEQ ID NO:24-27、SEQ IDNO:30-35、SEQ ID NO:45-53任一所述。

67.根据项目66所述的方法，其中所述目标基因如SEQ ID NO:48-53任一所述。

68.一种治疗需要治疗受试者色素性视网膜炎(RP)的方法，所述方法包括局部向受试者眼睛表面施用至受试者眼睛目标基因的治疗有效量的至少一种siRNA，其中所述目标基因如SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:26-35和SEQ ID NO:54–58任一所述。

69.根据项目68所述的方法，其中所述目标基因如SEQ ID NO:56-57任一所述。

70.根据项目57至69任一所述的方法，其中所述siRNA被配制用于向眼睛表面局部施用。

71.根据项目57或69任一所述的方法，其中所述siRNA被配制为霜、泡沫、膏、软膏、乳剂、液体溶液、滴眼剂、凝胶、喷雾、悬浮液、微乳液、微球、微囊剂、纳米球、纳米粒子、脂质囊泡、脂质体、聚合物囊泡、眼罩或隐形眼镜。

72.根据项目71所述的方法，其中所述siRNA被配制为滴眼剂。

73.根据项目57或72任一所述的方法，其中所述siRNA是以滴眼剂给药。

Claims (16)

1.具有如下结构的双链RNA化合物或其药学上可接受的盐：

5’iB-GCCAGAAUGUGGAACUCCU 3'(正义链；SEQ ID NO:9015)

3'CGGUCUUACACCUUGAGGA 5'(反义链；SEQ ID NO:9516)

其中每一个A、C、U和G是核糖核苷酸，并且每一个连续核糖核苷酸通过磷酸二酯键与下一个核糖核苷酸连接；

其中正义链包括，从5’末端数，在位点1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17和19的非修饰核糖核苷酸，位点18的L-脱氧胞苷，和反向脱氧脱碱基部分(iB)5’帽；并且

其中反义链包括，从5’末端数，在位点2、4、6、8、11、13、15、17和19的2’-O-Me糖基修饰核糖核苷酸，以及在位点1、3、5、7、9、10、12、14、16和18的非修饰核糖核苷酸，

其中所述反向脱氧脱碱基部分(iB)5’帽是反向脱碱基脱氧核糖部分。

2.根据权利要求1的化合物，其中所述反向脱氧脱碱基部分(iB)5’帽是3’,5’-反向脱碱基脱氧核糖5’-磷酸酯。

3.根据权利要求1－2中任一项的化合物在用于制备用于治疗的药物中的用途。

4.根据权利要求1－2中任一项的化合物在用于制备用于治疗患有眼部疾病、眼部障碍、眼部损伤、视野丧失的患者；或提供眼部神经保护的药物中的用途。

5.根据权利要求4的用途，其中所述眼部疾病、眼部障碍或眼部损伤与视觉系统组织的病理性异常/变化有关；和/或其中所述眼部疾病、眼部障碍或眼部损伤包括神经变性；和/或所述眼部疾病、眼部障碍或眼部损伤与视网膜神经节细胞缺失或视网膜神经节细胞损伤有关。

6.根据权利要求5的用途，其中所述视网膜神经节细胞缺失或视网膜神经节细胞损伤由眼内压(IOP)升高介导。

7.根据权利要求4的用途，其中所述视野丧失与视网膜神经节细胞死亡相关。

8.根据权利要求4的用途，其中所述眼部疾病、眼部障碍或眼部损伤选自眼部神经病变、眼内压升高(IOP)、青光眼、干眼症、小儿干燥综合症、糖尿病视网膜病变(DR)、糖尿病性黄斑水肿(DME)、老年性黄斑变性(AMD)、视神经炎、视网膜中央静脉阻塞、视网膜分枝静脉阻塞、缺血性视神经病变、视神经损伤、早产儿视网膜病变(ROP)、色素性视网膜炎(RP)、视网膜神经节细胞变性，黄斑变性、遗传性视神经病变、遗传视神经病、代谢性视神经病变，以及由于毒剂和药物不良反应或维生素缺乏症引起的视神经病变。

9.根据权利要求8的用途，其中所述缺血性视神经病变包括前部缺血性视神经病和/或后部缺血性视神经病变。

10.包括根据权利要求1－2中任一项的化合物或其药学上可接受的盐和药学可接受赋形剂或载体或其混合物的组合物。

11.包括根据权利要求1－2中任一项的化合物的组合物，其中所述化合物以有效在眼部细胞中下调CASP2基因表达的量，所述眼部细胞选自泪腺腺泡细胞、泪腺导管细胞、视网膜神经节细胞(RGC)、视网膜色素上皮(RPE)细胞、脉络膜细胞、角膜细胞、睫状突细胞和小梁网细胞或其组合。

12.根据权利要求10的组合物，其中所述化合物最终存在浓度按组合物体积计为5μg/μl至60μg/μl。

13.根据权利要求10的组合物，其中所述组合物被配制为霜、泡沫、膏、乳剂、液体溶液、滴眼剂、凝胶、喷雾、悬浮液、微乳液、微球、微囊剂、纳米球、纳米粒子、脂质囊泡、脂质体、聚合物囊泡、眼罩或隐形眼镜。

14.根据权利要求10的组合物，其中所述组合物被配制为软膏。

15.根据权利要求13的组合物，其中所述组合物被配制成滴眼剂。

16.根据权利要求13的组合物，其中所述组合物被配制成用于玻璃体内注射的液体溶液。