HK1211303B

HK1211303B - 包含两个fab片段的无fc的抗体及使用方法

Info

Publication number: HK1211303B
Application number: HK15112088.1A
Authority: HK
Inventors: Peter Bruenker; Tanja FAUTI; Christiane Jaeger; Christian Klein; Pablo Umaña
Original assignee: Roche Glycart Ag
Priority date: 2012-10-08
Filing date: 2013-10-03
Publication date: 2021-01-15

Description

包含两个Fab片段的无Fc的抗体及使用方法

技术领域

本发明涉及包含至少两个Fab片段的双特异性抗体，其中第一Fab片段包含对第一抗原特异的至少一个抗原结合位点；并且第二Fab片段包含对第二抗原特异的至少一个抗原结合位点，其中将第二Fab重链和轻链的可变区或恒定区交换；并且两个Fab片段通过两个肽接头彼此连接，并且其中所述双特异性抗体缺少Fc结构域；涉及用于产生它们的方法，涉及含有所述抗体的药物组合物和其用途。

本发明进一步涉及特异性结合T细胞活化抗原和肿瘤抗原(TA)的双特异性抗体，其包含第一Fab片段和第二Fab片段，其中将第二Fab重链和轻链的可变区或恒定区交换和两个Fab片段通过两个肽接头彼此连接；并且其中双特异性抗体不包含Fc结构域；用于产生它们的方法、含有所述抗体的药物组合物和其用途。

背景

单克隆抗体(mAb)是一类日益重要的治疗剂。除由全尺寸形式的IgG组成的mAb产物之外，已经开发了类型广泛的多特异性重组抗体样式，例如由如IgG抗体样式与单链结构域融合的四价双特异性抗体(见例如Coloma,M.J.等人,Nature Biotech 15(1997)159-163；WO 2001/077342；和Morrison,S.L.,Nature Biotech 25(2007)1233-1234)。

已经开发了其中不再留下抗体核芯结构(IgA、IgD、IgE、IgG或IgM)的几种其他新样式如双体、三体或四体抗体、微型抗体，能够结合两种或更多种抗原的几种单链形式(scFv、双scFv)(Holliger,P.等人,Nature Biotech 23(2005)1126-1136；Fischer,N.,Léger,O.,Pathobiology 74(2007)3-14；Shen,J.等人,Journal of Immunological Methods318(2007)65-74；Wu,C.等人,Nature Biotech.25(2007)1290-1297)。

全部这类样式均使用接头以使抗体核芯(IgA、IgD、IgE、IgG或IgM)与其他结合蛋白(例如scFv)融合或以使例如两个Fab片段或scFv融合(Fischer,N.,Léger,O.,Pathobiology 74(2007)3-14)。串联scFV是通过额外肽接头连接的两个scFv片段并且也称作(scFv)₂。通过减小可变结构域之间肽接头的长度，产生双体抗体(diabody)。在两种多肽之间添加额外肽接头产生了所谓的单链双体抗体。US2007/0274985涉及包含单链Fab(scFab)片段的抗体。与全尺寸单克隆抗体相比，抗体片段作为治疗剂具有优点和缺点：一个优点在于它们更小并且更快地进入组织和肿瘤。此外，已经提出小尺寸的片段允许与全尺寸单克隆抗体不可及的表位结合。缺点在于，片段在人类中显示短循环半寿期，这可能归因于肾清除。较短半寿期可能妨碍治疗剂在靶向的部位充分积累。抗体片段的产生并不繁琐，因为片段可能形成聚集物并且可能比全尺寸单克隆抗体不稳定。此外，非相关重链和轻链的不想要配对导致无活性抗原结合位点和/或其他无功能的不想要的副产物的形成，这在临床规模生产和治疗性应用抗体片段中是主要问题。具体而言，其中两个或更多个Fab借助一种连接物彼此融合的串联-Fab构建体不是可行的，原因在于两条轻链的随机缔合产生无活性、不想要的副产物。这些缺点现在已经用本发明的新抗体样式克服。本文中提供一种新的双特异性抗体样式，所述双特异性抗体样式可以因错配副产物的量减少而以增加的产率容易地产生，比本领域已知的双特异性抗体片段显示更少聚集。使用交换方案纠正LC缔合可以在不需要产生共有轻链的情况下实现。常规的轻链法不可能用于现存的抗体。进一步，新的双特异性抗体样式是稳定的并且在比现存双特异性样式更高的温度不聚集，这允许更好的生产性和可发展性。此外，与许多常规双特异性抗体片段相比，这种新的双特异性抗体样式具有更高的分子量，因此防止过度肾清除并导致改进的体内半寿期。新的双特异性抗体样式具有完整功能并且具有与相应的常规双特异性抗体可比较的或改进的结合作用和活性。

在多种临床环境下经常希望选择性破坏单个细胞或特定细胞类型。例如，它是特异性摧毁肿瘤细胞，同时留下健康细胞和组织不受损害的癌疗法的主要目的。一个方案是选择性地诱导针对肿瘤的免疫反应，所述免疫反应引起免疫效应细胞如天然杀伤(NK)细胞或细胞毒T淋巴细胞(CTLs)攻击并随后破坏肿瘤细胞。CTL构成免疫系统的最强有力效应细胞，然而它们不能由常规治疗性抗体Fc结构域介导的效应细胞机制活化。在这个方面，能够与癌细胞上的表面抗原结合并能够结合至T细胞受体(TCR)复合物的不变活化组分的双特异性抗体近几年已经变得有意义。双特异性抗体与其两种靶同时结合迫使癌细胞和T细胞之间短暂相互作用，造成细胞毒T细胞活化和随后肿瘤细胞裂解。

已经开发了几种双特异性抗体样式并且研究了它们对T细胞介导的癌症免疫疗法的适用性。这些抗体样式当中，已经非常充分地表征了所谓的BiTE(双特异性T细胞衔接体(bispecific T cell engager))分子并且它们已经在临床上显示一些有前景的结果(综述见Nagorsen和Exp Cell Res 317,1255-1260(2011))。BiTE是其中两个scFv分子通过柔性接头融合的串联scFv分子。被评价T细胞衔接作用的其他双特异性样式包括双体抗体(diabody)(Holliger等人,Prot Eng 9,299-305(1996))及它们的衍生物，如串联双体抗体(Kipriyanov等人,J Mol Biol 293,41-66(1999))。更近的发展是所谓的DART(双亲和力再定向(dual affinity retargeting))分子，其是基于双体抗体样式，但是以起到额外稳定作用的C末端二硫键为特征(Moore等人,Blood 117,4542-51(2011))。所谓的三功能抗体(triomabs)，其是完整杂合小鼠/大鼠IgG分子并且目前还在临床试验中评价，代表一种较大尺寸的样式(综述见Seimetz等人，Cancer Treat Rev 36,458-467(2010))。

但是，迄今已知为T细胞介导的癌症免疫疗法所开发的双特异性抗体具有涉及其有效性、毒性和适用性的主要缺点。小构建体例如BiTE分子虽然能够有效地交联效应细胞和靶细胞，但具有非常短的血清半寿期，需要将它们通过连续输注施用至患者。在另一方面，IgG样样式虽然具有半寿期长的巨大益处，但遭遇与IgG分子内在的天然效应子功能相关的毒性。对于成功的治疗性开发而言，这种免疫原性潜力构成IgG样双特异性抗体的另一个不利特征。最后，在双特异性抗体的一般开发中的一个主要难题是以临床上足够的量和纯度产生双特异性抗体构建体。共表达时不同特异性的抗体重链和轻链的错误配对减少正确装配的构建体的产生并导致许多无功能的副产物。

鉴于与目前可用于T细胞介导的癌症免疫疗法的双特异性抗体相关的难题和缺点，仍需要这类分子的新颖改进样式。现在已经用本发明的新双特异性抗体克服了这些缺点。新的双特异性抗体能够容易地产生，同时由于错配副产物的量减少而增加了新的双特异性抗体的产量，所述抗体比本领域已知的双特异性抗体片段显示更少聚集。此外，与本领域已知的双特异性抗体样式相比，新的双特异性抗体在增加的温度是稳定的。使用交换方案能够实施正确的链缔合且不需要产生共有轻链。此外，与许多常规双特异性抗体片段相比，新的双特异性抗体具有较高的分子量，因此防止过度肾清除并导致改进的体内半寿期。进一步地，仅需要两种质粒以产生新的双特异性抗体。新的双特异性抗体具有完整功能并且具有与相应的常规双特异性抗体可比较的或改进的结合作用和活性。

本发明提供了设计用于T细胞活化和再定向的双特异性抗原结合分子，所述双特异性抗原结合分子组合了良好的有效性和可生产性及低毒性和有利药代动力学特性。

概述

本发明涉及包含至少两个Fab片段的双特异性抗体，其中第一Fab片段包含对第一抗原特异的至少一个抗原结合位点；并且第二Fab片段包含对第二抗原特异的至少一个抗原结合位点，其中将第二Fab重链和轻链的可变区或恒定区交换；并且两个Fab片段通过两个肽接头彼此连接，并且其中所述双特异性抗体缺少Fc结构域。优选地，所述肽接头是(G₄S)₂接头。

在一个实施方案中，所述抗体额外地包含第三Fab片段。在另一个实施方案中，所述第三Fab片段包含对第一或第二抗原特异、优选地对第一抗原特异的至少一个抗原结合位点。

在一个实施方案中，第三Fab片段与第一Fab片段的轻链或重链连接。在另一个实施方案中，第三Fab片段与第二Fab片段的轻链或重链的N或C末端连接。在一个实施方案中，第三Fab片段通过一个或多个肽接头与第一或第二Fab片段连接。优选地，所述肽接头是(G₄S)₂接头。

本发明的双特异性抗体至少是双价的并可以是三价或多价的，例如四价。在一个实施方案中，所述双特异性抗体是双价的(1+1样式)，其中一个结合位点分别各自靶向第一抗原和第二抗原。在另一个实施方案中，所述双特异性抗体是三价的(2+1样式)，其中两个结合位点分别各自靶向第一抗原，并且一个结合位点靶向第二抗原，如以下部分中详述。

本发明涉及特异性结合T细胞活化抗原和肿瘤抗原(TA)的双特异性抗体，其包含第一Fab片段和第二Fab片段，其中将第二Fab重链和轻链的可变区或恒定区交换和两个Fab片段通过两个肽接头彼此连接；并且其中双特异性抗体不包含Fc结构域。

本发明的抗体与肿瘤细胞表面上的肿瘤抗原特异性结合并且同时与T细胞活化抗原结合。因此，这种双特异性抗体能够在肿瘤部位特异性激发免疫反应，随后导致靶细胞凋亡。

在一个方面，提供了特异性结合T细胞活化抗原和肿瘤抗原(TA)的双特异性抗体，所述抗体包含通过两个肽接头彼此连接的至少两个Fab片段，其中第一Fab片段包含对肿瘤抗原(TA)特异的至少一个抗原结合位点；并且第二Fab片段包含对T细胞活化抗原特异的至少一个抗原结合位点，其中将第二Fab重链和轻链的可变区或恒定区交换；并且其中双特异性抗体缺少Fc结构域。

特别地，本发明涉及其中T细胞活化抗原是CD3T细胞共同受体(CD3)导引抗原的双特异性抗体。在一个实施方案中，肿瘤抗原选自黑素瘤相关的硫酸软骨素蛋白聚糖(MCSP)、表皮生长因子受体(EGFR)、癌胚抗原(CEA)、成纤维细胞活化蛋白(FAP)和CD33。在一个优选的实施方案中，肿瘤抗原是MCSP。

在一个方面，提供了特异性结合CD3T细胞共同受体(CD3)抗原和肿瘤抗原(TA)的双特异性抗体，所述抗体包含通过两个肽接头彼此连接的至少两个Fab片段，其中第一Fab片段包含对肿瘤抗原(TA)特异的至少一个抗原结合位点；并且第二Fab片段包含对CD3T细胞共同受体(CD3)特异的至少一个抗原结合位点，其中将第二Fab重链和轻链的可变区或恒定区交换；并且其中双特异性抗体缺少Fc结构域。优选地，所述肽接头是(G₄S)₂接头。

在一个实施方案中，所述抗体额外地包含通过一个或两个肽接头与第一或第二片段连接的第三Fab片段。在另一个实施方案中，所述第三Fab片段包含对肿瘤抗原特异的至少一个抗原结合位点。在一个实施方案中，第三Fab片段与第一Fab片段的轻链或重链的N末端或C末端连接。在另一个实施方案中，第三Fab片段与第二Fab片段的轻链或重链的N或C末端连接。在一个实施方案中，第三Fab片段通过一个或两个肽接头与第一或第二Fab片段连接。优选地，所述肽接头是(G₄S)₂接头。

本发明的双特异性抗体至少是双价的并可以是三价或多价的，例如四价或六价的。在一个实施方案中，所述双特异性抗体是双价的(1+1样式)，其中一个结合位点分别各自靶向肿瘤抗原(TA)和T细胞活化抗原。在另一个实施方案中，所述双特异性抗体是三价的(2+1样式)，两个结合位点各自靶向肿瘤抗原(TA)，并且一个结合位点靶向T细胞活化抗原，如以下部分中详述。在一个优选实施方案中，所述T细胞活化抗原是CD3。

在第二目的中，本发明涉及一种包含本发明双特异性抗体的药物组合物。

在第三目的中，本发明涉及用于治疗癌症的本发明双特异性抗体。在另一个实施方案中，提供了该双特异性抗体作为药物的用途。优选地，所述用途是用于治疗癌症。

在其他目的中，本发明涉及包含编码本发明双特异性抗体的重链的序列的核酸序列、包含编码本发明双特异性抗体的轻链的序列的核酸序列、包含本发明核酸序列的表达载体和包含本发明载体的原核或真核宿主细胞。此外，提供了产生抗体的方法，包括培养宿主细胞，从而产生所述抗体。

在又一个实施方案中，提供了包含本发明双特异性抗体和细胞毒性剂的免疫缀合物。

附图简述

图1:其中两个Fab片段通过一个接头彼此连接的示例性双特异性抗体样式的示意图。a)Fab-Crossfab分子C端，b)Fab-Crossfab分子N端，c)(Fab)₂-Crossfab分子C端，d)(Fab)₂-Crossfab分子N端，e)Fab-Crossfab-Fab分子。

图2：人Fab(MCSP)-CrossFab(CD3)产生和纯化的分析：SDS-PAGE：4-12％Bis/Tris(NuPage[invitrogen]；考马斯染色)：a)1-Mark 12(invitrogen)，2-未还原的人Fab(MCSP)-CrossFab(CD3)；b)1-Mark 12(Invitrogen；)，2-还原的人Fab(MCSP)-CrossFab(CD3)。

图3：Fab(MCSP)-CrossFab(CD3)产生和纯化的分析。分析性大小排阻层析，色谱图A280(Superdex 20010/300GL[GE Healthcare]；2mM MOPS pH7.3，150mM NaCl，0.02％(w/v)NaCl；注入50μg样品)。

图4：人Fab(MCSP)-Fab(MCSP)-CrossFab(CD3)产生和纯化的分析：SDS-PAGE：4-12％Bis/Tris(NuPage[invitrogen]；考马斯染色)：a)1-Mark12(invitrogen)，2-未还原的人Fab(MCSP)-Fab(MCSP)-CrossFab(CD3)；b)1-Mark 12(Invitrogen；)，2-还原的人Fab(MCSP)-Fab(MCSP)-CrossFab(CD3)。

图5：人Fab(MCSP)-Fab(MCSP)-CrossFab(CD3)产生和纯化的分析。分析性大小排阻层析，色谱图A280(Superdex 20010/300GL[GE Healthcare]；2mM MOPS pH 7.3，150mMNaCl，0.02％(w/v)NaCl；注入50μg样品)。

图6：hu Fab(MCSP)-Crossfab(CD3)-Fab(MCSP)产生和纯化的分析。SDS-PAGE：4-12％Bis/Tris(NuPage[invitrogen]；考马斯染色)：a)1-Mark 12(invitrogen)，2-未还原的人Fab(MCSP)-Crossfab(CD3)-Fab(MCSP)；b)1-Mark12(Invitrogen；)，2-还原的人Fab(MCSP)-Crossfab(CD3)-Fab(MCSP)。

图7：hu Fab(MCSP)-Crossfab(CD3)-Fab(MCSP)产生和纯化的分析。分析性大小排阻层析，色谱图A280(Superdex 20010/300GL[GE Healthcare]；2mM MOPS pH 7.3，150mMNaCl，0.02％(w/v)NaCl；注入50μg样品)。

图8：鼠Crossfab(CD3)-Fab(MCSP)-Fab(MCSP)产生和纯化的分析。SDS-PAGE：4-12％Bis/Tris(NuPage[invitrogen]；考马斯染色)：a)1-Mark 12(invitrogen)，2-未还原的鼠CrossFab(CD3)-Fab(MCSP)-Fab(MCSP)；b)1-Mark 12(Invitrogen；)，2-还原的鼠CrossFab(CD3)-Fab(MCSP)-Fab(MCSP)。

图9：鼠Crossfab(CD3)-Fab(MCSP)-Fab(MCSP)产生和纯化的分析。分析性大小排阻层析，色谱图A280(Superdex 20010/300GL[GE Healthcare]；2mM MOPS pH 7.3，150mMNaCl，0.02％(w/v)NaCl；注入50μg样品)。

图10：与人泛T细胞(E:T比率＝5:1)共培养并且由不同浓度的hu Fab(MCSP)-Crossfab(CD3)(＝“Fab-Crossfab”)、hu Fab(MCSP)-Crossfab(CD3)-Fab(MCSP)(＝“Fab-Crossfab-Fab”)、hu Fab(MCSP)-Fab(MCSP)-Crossfab(CD3)(＝“(Fab)₂-Crossfab”)以及(scFv)₂(抗MCSP/抗huCD3e)(＝“(scFv)₂”)双特异性分子活化20小时的情况下，对MDA-MB-435肿瘤细胞的杀伤作用(如通过LDH释放所测量)。与“(scFv)₂”构建体相比，具有双价MCSP靶向作用的构建体显示可比较的细胞毒活性，然而具有单价MCSP结合作用的“Fab-Crossfab”构建体明显效力较小。

图11:hu Fab(MCSP)-Fab(MCSP)-Crossfab(CD3)(＝“(Fab)₂-Crossfab”)和(scFv)₂(抗MCSP/抗huCD3e)(＝“(scFv)₂”)构建体的比较，描述了与人泛T细胞(E/T比率＝5:1)共培养并且由不同浓度的双特异性构建体和相应IgG活化21小时的情况下，来自MDA-MB-435肿瘤细胞的LDH释放。“(Fab)₂-CrossFab”至少可比地与(scFv)₂分子同样良好地在靶细胞中诱导凋亡。

图12：hu Fab(MCSP)-Fab(MCSP)-Crossfab(CD3)(＝“(Fab)₂-Crossfab”)和(scFv)₂(抗MCSP/抗huCD3e))(＝“(scFv)₂”)构建体的比较。描述了与人PBMC(E/T比率＝10:1)共培养并且由不同浓度的双特异性构建体和相应IgG活化26小时的情况下，来自MV-3人黑素瘤肿瘤细胞的LDH释放。“(Fab)₂-CrossFab”至少可比地与(scFv)₂分子同样良好地在靶细胞中诱导凋亡。

图13：通过用靶向人MCSP以及鼠CD3的鼠Crossfab(CD3)-Fab(MCSP)-Fab(MCSP)构建体(＝(Fab)₂-CrossFab)活化原代鼠T细胞所诱导的来自B16/F10-人MCSP Fluc2(克隆48肿瘤细胞)的LDH释放。效应细胞对靶细胞比率是5:1。在37℃，5％CO₂温育23.5小时后分析该测定法。该构建体诱导浓度依赖性T细胞介导的表达人MCSP的靶细胞凋亡。

图14：通过用靶向人MCSP以及鼠CD3的50nM鼠Crossfab(CD3)-Fab(MCSP)-Fab(MCSP)构建体(＝(Fab)₂-CrossFab)活化原代鼠T细胞所诱导的来自B16/F10-人MCSPFluc2(克隆48肿瘤细胞)的LDH释放。效应细胞对靶细胞比率是5:1。在37℃，5％CO₂温育23.5小时后分析该测定法。该构建体诱导T细胞介导的表达人MCSP的靶细胞凋亡。在构建体的这种浓度时，仅存在弱的T细胞过度活化。

图15：在用1nM不同的CD3-MCSP双特异性构建体(hu Fab(MCSP)-Fab(MCSP)-Crossfab(CD3)(＝“(Fab)₂-Crossfab”)和(scFv)₂(抗MCSP/抗huCD3e)(＝“(scFv)₂”))在Colo-38肿瘤细胞存在(A、B)或不存在(C、D)下处理后24小时后，测量全血的上清液中不同细胞因子水平。将280μl全血铺种96孔板的每个孔并添加30000个Colo-38细胞，如所示。在Colo-38肿瘤细胞存在下活化T细胞时分泌的主要细胞因子是IL-6，随后是IFNγ。此外，粒酶B的水平也在靶细胞存在下活化T细胞时极大地增加。通常，与其他双特异性构建体相比，“(scFv)₂”构建体升高TNF和IFNγ的水平，以及在靶细胞存在下(A和B)略微升高粒酶B的水平。

在靶细胞存在或不存在下由双特异性构建体活化T细胞时，不存在Th2细胞因子(IL-10和IL-4)的明显分泌。在这种测定法中，还存在微弱IFNγ分泌，所述分泌由“(Fab)₂-CrossFab”构建体在靶细胞不存在的情况下诱导。

图16：从脾细胞分离的鼠泛T细胞上晚期活化标记物CD25的表面表达水平。鼠泛T细胞在B16/F10-人MCSP Fluc2克隆48肿瘤靶细胞存在或不存在下与50nM鼠Crossfab(CD3)-Fab(MCSP)-Fab(MCSP)构建体(＝(Fab)₂-Crossfab)双特异性构建体(靶向鼠CD3，以及人MCSP)温育，如所示(E:T比率是10:1)。描述了70小时后CD8⁺T细胞上晚期活化标记物CD25的表达水平。在具有(Fab)₂-CrossFab构建体的CD8⁺T细胞上CD25的上调仅在靶细胞存在的情况下出现。所用的调节至相同体积摩尔浓度的参比IgG不能够上调CD25。

图17：Fab(CD33)-CrossFab(CD3)产生和纯化的分析。SDS-PAGE：a)3-8％Tris/乙酸盐(NuPage[invitrogen]；考马斯染色)：a)1-HiMark(invitrogen)，2-未还原的鼠Fab(CD33)-CrossFab(CD3)；b)4-12％Bis/Tris(NuPage[invitrogen]：1-Mark 12(invitrogen)，2-还原的Fab(CD33)-CrossFab(CD3)。

图18：Fab(CD33)-CrossFab(CD3)产生和纯化的分析。分析性大小排阻层析，色谱图A280(Superdex 20010/300GL[GE Healthcare]；2mM MOPS pH7.3，150mM NaCl，0.02％(w/v)NaCl；注入50μg样品)。

图19：与人PBMC(E:T比率＝10:1)共培养并且由不同浓度的CD3-MCSP双特异性构建体(hu Fab(MCSP)-Crossfab(CD3)；称为“1+1无Fc”和(scFv)₂(抗MCSP/抗huCD3e)(＝“(scFv)₂”)参考分子)活化24小时的情况下，对MV-3肿瘤细胞的杀伤作用(如通过LDH释放所测量)。“1+1无Fc”构建体在MV-3靶细胞中以计算的EC₅₀25.4pM诱导凋亡，而“(scFv)₂”参考分子的计算的EC₅₀是57pM，这显示“1+1无Fc”分子就EC₅₀而言略微更好的效力。

图20：CD4⁺或CD8⁺T细胞的活化，如在人MCSP阳性MV-3肿瘤细胞存在下，与用CD3-MCSP双特异性构建体(分别是hu Fab(MCSP)-Crossfab(CD3)，称为“1+1无Fc”；和(scFv)₂(抗MCSP/抗huCD3e)(＝“(scFv)₂”)参考分子)处理约24小时的人PBMC(E:T比率＝10:1)共培养时CD69的上调(A)、CD69阳性细胞相应增加(B)所度量。通常，与CD4⁺T细胞相比，CD69中位值在CD8⁺T细胞上更高。对于两种构建体，存在CD69中位值的明显浓度依赖性增加，以及CD69阳性细胞百分比的明显浓度依赖性增加。

图21:(scFv)₂参考分子的图示。

图22:(scFv)₂(抗MCSP/抗huCD3e)产生和纯化的分析。SDS-PAGE：4-12％Bis/Tris(NuPage[invitrogen]；考马斯染色)：1-Mark 12(invitrogen)，2-还原的(scFv)₂(抗MCSP/抗huCD3e)；3-未还原的(scFv)₂(抗MCSP/抗huCD3e)

图23：(scFv)₂(抗MCSP/抗huCD3e)产生和纯化的分析。分析性大小排阻层析，色谱图A280(Superdex 7510/300GL[GE Healthcare]；2mM MOPS pH7.3，150mM NaCl，0.02％(w/v)NaCl；注入50μg样品((scFv)₂(抗MCSP/抗huCD3e)))。

图24：其中两个Fab片段通过两个接头彼此连接的示例性双特异性抗体样式的示意图a)Fab＝Crossfab分子C末端，b)Fab＝Crossfab分子N末端，c)Fab-Fab＝Crossfab分子和Fab＝Fab＝Crossfab分子C末端，d)Fab-Fab＝Crossfab分子和Fab＝Fab＝Crossfab分子N末端，e)Fab-Crossfab＝Fab和Fab＝Crossfab＝Fab分子。

图25：hu Fab(MCSP)＝Crossfab(CD3)产生和纯化的分析：SDS-PAGE：4-12％Bis/Tris(NuPage[invitrogen]；考马斯染色：A)还原的hu Fab(MCSP)＝Crossfab(CD3)；B)Mark12(invitrogen)，C)非还原的hu Fab(MCSP)＝Crossfab(CD3)；

图26：与用不同CD3-MCSP双特异性构建体(分别是：hu Fab(MCSP)＝Crossfab(CD3)，称为“1+1无Fc，连接的LC”；hu Fab(MCSP)-Crossfab(CD3)，称为“1+1无Fc”；和(scFv)₂(抗MCSP/抗huCD3e))(＝“(scFv)₂”)参考分子)处理约24小时的人PBMC(E:T比率＝10:1)共培养时，对MCSP-阳性MV-3人黑素瘤细胞的杀伤作用(如通过LDH释放所测量)。从健康志愿者的新鲜血液分离人PBMC。使用Graph Pad Prism软件确定EC₅₀值。

图27：在表达MCSP的人MV-3黑素瘤靶细胞(E:T比率＝10:1)存在下与10nM，80pM或16pM靶向人CD3和人MCSP的无Fc的T细胞双特异性构建体(分别是hu Fab(MCSP)＝Crossfab(CD3)，称为“1+1无Fc，连接的LC”；hu Fab(MCSP)-Crossfab(CD3)，称为“1+1无Fc”；和(scFv)₂(抗MCSP/抗huCD3e))(＝“(scFv)₂”)参考分子))温育24小时后人CD4和CD8T细胞上早期活化标记物CD69的表面表达水平。(A)显示CD69的中位数表达值，(B)描述CD69阳性T细胞百分数。

图28：与“(scFv)₂”参考分子(抗MCSP/抗huCD3)相比，具有两个接头的Fab-Crossfab分子(抗MCSP/抗huCD3)的热稳定性。在25–75℃以0.05℃/分钟的上升温变测量的动态光散射。具有两个接头的Fab-Crossfab分子以黑色显示并且“(scFv)₂”参考分子以灰色显示。

本发明实施方案的详细描述

I.定义

“构架”或“FR”指除高变区(HVR)残基之外的可变结构域残基。可变结构域的FR通常由以下4个FR结构域组成：FR1、FR2、FR3和FR4。因此，HVR序列和FR序列通常按以下序列出现在VH(或VL)中：FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4。

出于本文目的，“接纳体人类构架”是这样的构架，它包含源自人免疫球蛋白构架的轻链可变结构域(VL)构架或重链可变结构域(VH)构架或如下文定义的人共有序列构架的氨基酸序列。“衍生自”人免疫球蛋白构架或人共有构架的接纳体人类构架可以包含其相同的氨基酸序列，或它可以含有氨基酸序列变化。在一些实施方案中，氨基酸变化的数目是10或更小、9或更小、8或更小、7或更小、6或更小、5或更小、4或更小、3或更小、或2或更小。在一些实施方案中，VL接纳体人类构架在序列上与VL人免疫球蛋白构架序列或人类共有构架序列相同。

“人类共有构架”是这样的构架，它代表在人免疫球蛋白VL或VH构架序列的选项中最常出现的氨基酸残基。通常，人免疫球蛋白VL或VH构架序列的选项来自可变结构域序列的亚组。通常，序列亚组是如Kabat等人,Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest(目的免疫蛋白质的序列)，第5版，NIH Publication 91-3242,Bethesda MD(1991)，第1-3卷中描述的亚组。在一个实施方案中，对于VL，该亚组是如上文Kabat等人中描述的亚组κI。在一个实施方案中，对于VH，该亚组是如上文Kabat等人中描述的亚组III。

如本文所用，术语“高变区”或“HVR”指抗体可变结构域中在序列方面高度变化和/或形成结构上限定的环(“高变环”)的每个区域。通常，天然四链抗体包含六个HVR；VH中三个(H1、H2、H3)和VL中三个(L1、L2、L3)。HVR通常包含来自高变环和/或来自“互补决定区”(CDR)的氨基酸残基，后者具有最高序列变异性和/或参与抗原识别。示例性高变环存在于第26-32(L1)、50-52(L2)、91-96(L3)、26-32(H1)、53-55(H2)和96-101(H3)位氨基酸残基处。(Chothia和Lesk J.Mol.Biol.196:901-917(1987))。示例性CDR(CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3、CDR-H1、CDR-H2、和CDR-H3)存在于L1的第24-34位氨基酸残基、L2的第50-56位氨基酸残基、L3的第89-97位氨基酸残基、H1的第31-35B位氨基酸残基、H2的第50-65位氨基酸残基和H3的第95-102位氨基酸残基处。(Kabat等人,Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest(目的免疫蛋白质的序列),第5版.Public Health Service,NationalInstitutes of Health,Bethesda,MD(1991))。在谈及形成抗原结合区的可变区部分时，术语“高变区(HVR)”和“互补决定区(CDR)”在本文中可互换地使用。这种特定区域已经由描述Kabat等人,美国卫生和公众服务部(U.S.Dept.of Health and Human Services)，"Sequences of Proteins of Immunological Interest(目的免疫蛋白质的序列)"(1983)并且由Chothia等人,J.Mol.Biol.196:901-917(1987)描述，其中所述定义包括彼此比较时氨基酸残基的重叠或子集。然而，谈及抗体或其变体的CDR的任一个定义的应用意在处于如本文中定义和使用的术语范围内。作为比较，下文在表1中描述了构成如上文所引用每篇参考文献所定义的CDR的适宜氨基酸残基。构成特定CDR的确切残基数目将根据该CDR的序列和尺寸变动。根据抗体的可变区氨基酸序列，本领域技术人员可以常规地确定哪种残基构成特定CDR。

表1.CDR定义¹

CDR	Kabat	Chothia
				31-35	26-32	26-35
	50-65	52-58	50-58
				95-102	95-102	95-102
	24-34	26-32	24-34
				50-56	50-52	50-56
	89-97	91-96	89-97

¹根据Kabat等人(见下文)所述的编号惯例对表1中全部CDR定义编号

²如表1中使用的具有小写体“b”的“AbM”指如Oxford Molecular“AbM”抗体建模软件所定义的CDR。

Kabat等人还定义了适用于任何抗体的可变区序列编号体系。本领域普通技术人员可以毫无疑义地将这种Kabat编号体系应用至任何可变区序列，不依赖于除序列本身之外的任何实验数据。如本文所用，“Kabat编号”指Kabat等人,美国卫生和公众服务部(U.S.Dept.of Health and Human Services)，"Sequences of Proteins ofImmunological Interest(目的免疫蛋白质的序列)"(1983)所述的编号体系。除非另外说明，否则根据Kabat编号体系来提及抗体可变区中特定氨基酸残基位置的编号。

除了VH中的CDR1外，CDR通常包含形成高变环的氨基酸残基。CDR还包含“特异性决定残基”或“SDR”，它们是接触抗原的残基。SDR含于称作缩写-CDR或a-CDR的CDR区域内部。示例性a-CDR(a-CDR-L1、a-CDR-L2、a-CDR-L3、a-CDR-H1、a-CDR-H2和a-CDR-H3)存在于L1的第31-34位氨基酸残基、L2的第50-55位氨基酸残基、L3的第89-96位氨基酸残基、H1的第31-35B位氨基酸残基、H2的第50-58位氨基酸残基和H3的第95-102位氨基酸残基处。(见Almagro和Fransson,Front.Biosci.13:1619-1633(2008))。除非另外说明，否则可变结构域中的HVR残基和其他残基(例如，FR残基)在本文中根据上文Kabat等人所述编号。

术语“抗体”在本文中以最广意义使用并且涵盖多种抗体结构物，包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体(例如，双特异性抗体)和抗体片段，只要它们显示出所需的抗原结合活性。特别地，术语“抗体”还包括本发明的双特异性抗体，所述双特异性抗体包含通过两个接头彼此连接的至少两个Fab片段并缺少Fc结构域。

“人抗体”是这样一种抗体，其拥有对应于人或人细胞产生的抗体的氨基酸序列或从利用人抗体库或其他编码人抗体的序列的非人来源衍生。人抗体的这种定义特别排除包含非人抗原结合残基的人源化抗体。

如本文所用，术语“重组人抗体”意在包括通过重组手段所制备、表达、产生或分离的全部人抗体，如从宿主细胞如NS0或CHO细胞或从相对于人免疫球蛋白基因为转基因的动物(例如小鼠)中分离的抗体或使用转染至宿主细胞中的重组表达载体所表达的抗体。此类重组人抗体具有重排形式的可变区和恒定区。本发明的重组人抗体已经经历体内体细胞超变。因此，重组抗体的VH和VL区的氨基酸序列是尽管源自人种系VH和VL序列并且与之相关，但可以不天然存在于体内人抗体种系库内部的序列。

“人源化”抗体指包含来自非人类HVR的氨基酸残基和来自人FR的氨基酸残基的嵌合抗体。在某些实施方案中，人源化抗体将包含至少1个、并且一般2个可变结构域的基本上全部，其中全部或基本上全部的HVR(例如，CDR)与非人抗体的那些HVR对应并且全部或基本上全部的FR区与人抗体的那些FR对应。人源化抗体任选地可以包含从人抗体衍生的抗体恒定区的至少一部分。抗体的“人源化形式”例如，非人抗体，指已经历过人源化的抗体。由本发明涵盖的其他形式的“人源化抗体”是这些抗体，其中恒定区已经从原始抗体的恒定区被额外地修饰或改变以产生本发明的特性，尤其在C1q结合和/或Fc受体(FcR)结合方面。

术语“嵌合抗体”指一种抗体，其中重链和/或轻链的一部分源自特定来源或物种，而重链和/或轻链的剩余部分源自不同的来源或物种，通常借助重组DNA技术制备。优选包含鼠可变区和人恒定区的嵌合抗体。由本发明涵盖的其他优选形式的“嵌合抗体”是这样的抗体，其中恒定区已经从原始抗体的恒定区被修饰或改变以产生本发明的特性，尤其在C1q结合和/或Fc受体(FcR)结合方面。这类嵌合抗体也称作“类转换抗体”。嵌合抗体是表达的免疫球蛋白基因的产物，所述免疫球蛋白基因包含编码免疫球蛋白可变区的DNA区段和编码免疫球蛋白恒定区的DNA区段。用于产生嵌合抗体的方法涉及常规重组DNA并且基因转染技术是本领域熟知的。见，例如Morrison,S.L.等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81(1984)6851-6855；美国专利号5,202,238和5,204,244。

如本文中所用的术语“单克隆抗体”指从基本上均一的抗体群体获得的抗体，即，包含于该群体的各个抗体是相同的和/或结合相同的表位，除了可能的变体抗体之外(例如，含有天然存在突变或在产生单克隆抗体制备物期间出现)，这类变体通常以微小的量存在。与一般包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制备物相反，单克隆抗体制备物的每种单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。因此，修饰语“单克隆的”指示该抗体的特征为从基本上均一的抗体群体获得，并且不得解释为要求通过任何特定方法产生该抗体。例如，可以通过多种技术产生待根据本发明使用的单克隆抗体，所述技术包括但不限于杂交瘤方法、重组DNA方法、噬菌体展示方法和利用含有全部或部分的人免疫球蛋白基因座的转基因动物的方法，本文中描述了用于产生单克隆抗体的这类方法和其他示例性方法。

“抗体片段”指不为完整抗体的、包含完整抗体的一部分的分子，所述部分结合至与完整抗体结合的抗原。抗体片段的例子包括但不限于Fv、Fab'、Fab'-SH、F(ab')₂；双体抗体；线性抗体；单链抗体分子(例如scFv)；和从抗体片段形成的多特异性抗体。scFv抗体例如在Houston,J.S.,Methods in Enzymol.203(1991)46-96)中描述。此外，抗体片段包括单链多肽，所述单链多肽具有VH结构域的特征，即能够与VL结构域一起装配成有功能的抗原结合位点，或具有VL结构域的特征，即能够与VH结构域一起装配成有功能的抗原结合位点，并因而提供全长抗体的抗原结合特性。

如本文所用，“Fab片段”指包含轻链片段的抗体片段，所述轻链片段包含轻链的VL结构域和恒定结构域(CL)以及重链的VH结构域和第一恒定结构域(CH1)。本发明的双特异性抗体包含至少两个Fab片段，其中将第二Fab片段的重链和轻链的可变区或恒定区交换。由于可变区或恒定区的交换，所述第二Fab片段也称作“cross-Fab片段”或“xFab片段”或“交换(crossover)Fab片段”。交换Fab分子的两种不同链组合是可能的并且包含于本发明的双特异性抗体中：在一方面，Fab重链和轻链的可变区是交换的，即交换Fab分子包含由轻链可变区(VL)和重链恒定区(CH1)组成的肽链，和由重链可变区(VH)和轻链恒定区(CL)组成的肽链。这种交换Fab分子也称作CrossFab_(VLVH)。在另一方面，当Fab重链和轻链的恒定区交换时，交换Fab分子包含由重链可变区(VH)和轻链恒定区(CL)组成的肽链，和由轻链可变区(VL)和重链恒定区(CH1)组成的肽链。这种交换Fab分子是也称作CrossFab_(CLCH1)。

Fab片段通过至少两个肽接头彼此连接，如下文所述。

如果不另外定义，“连接”意指Fab片段直接或通过一个或多个肽接头由肽键连接。如在本发明中所用，术语“肽接头”指具有氨基酸序列的肽，所述肽优选地是合成来源的。本发明的这些肽接头用来使Fab片段之一与另一个Fab片段的C末端或N末端连接以形成本发明的多特异性抗体。优选地，所述肽接头是具有至少5个氨基酸长度、优选地具有5至100个、更优选地10至50个氨基酸长度的氨基酸序列的肽。在一个实施方案中，所述肽接头是(GxS)n或(GxS)nGm，其中G＝甘氨酸，S＝丝氨酸并且(x＝3，n＝3、4、5或6，以及m＝0、1、2或3)或(x＝4，n＝2、3、4或5和m＝0、1、2或3)，优选地x＝4并且n＝2或3，更优选地x＝4，n＝2。另外，接头可以包含(一部分的)免疫球蛋白铰链区。在一个实施方案中，所述肽接头是(G₄S)₂(SEQID:NO 28)。适于连接Fab片段的其他肽接头，例如(G₄S)₆-GG(SEQ ID NO:147)或(SG₃)₂-(SEG₃)₄-(SG₃)-SG(SEQ ID NO:148)，或EPKSC(D)-(G₄S)₂(SEQ ID Nos:145和146)。

术语“抗原结合结构域”指抗原结合分子的部分，所述部分包含与部分或完整抗原特异性结合并且与之互补的区域。在抗原是大抗原的情况下，抗原结合分子仅可以与抗原的特定部分结合，所述部分称作表位。抗原结合结构域可以由例如一个或多个抗体可变结构域(也称作抗体可变区)提供。优选地，抗原结合结构域包含抗体轻链可变区(VL)和抗体重链可变区(VH)。

术语“可变区”或“可变结构域”指抗体重链或轻链的参与抗体结合至抗原的结构域。天然抗体重链和轻链的可变结构域(分别是VH和VL)通常具有相似的结构，每种结构域包含四个保守的构架区(FR)和三个高变区(HVR)。(见，例如，Kindt等人，Kuby Immunology，第6版，W.H.Freeman and Co.，第91页(2007))。单个VH结构域或VL结构域可能足以赋予抗原结合特异性。另外，结合特定抗原的抗体可以利用来自结合该抗原的抗体的VH或VL结构域进行分离以分别筛选互补性VL结构域或VH结构域的文库。见，例如，Portolano等人,J.Immunol.150:880-887(1993)；Clarkson等人,Nature 352:624-628(1991)。

在本文中使用时，术语“抗体的抗原结合位点”指抗体的负责抗原结合的氨基酸残基。抗体的抗原结合部分包含来自“互补决定区”或“CDR”的氨基酸残基。“构架”或“FR”区是除如本文中定义的高变区残基之外的那些可变结构域区域。因此，抗体的轻链和重链可变结构域从N端至C末端包含结构域FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。特别地，重链的CDR3是对抗原结合作用贡献最大并限定抗体特性的区域。根据Kabat等人,Sequences ofProteins of Immunological Interest(目的免疫蛋白质的序列)，第5版，美国公共卫生署(Public Health Service)，国家健康研究所，Bethesda，MD(1991)的标准定义和/或来自“高变环”的那些残基确定CDR区和FR区。

术语“表位“包括能够与抗体特异性结合的任何多肽决定簇。在某些实施方案中，表位决定簇包括化学活跃的分子表面基团，如氨基酸、糖侧链、磷酰基或磺酰基，并且在某些实施方案中，可以具有特定的三维结构特征，和/或特定的电荷特征。表位是抗原上被抗体结合的区域。

术语“Fc结构域”在本文中用来定义免疫球蛋白重链的含有恒定区的至少一部分的C端区域。例如在天然抗体中，Fc结构域由源自处于IgG、IgA和IgD同种型的抗体的两条重链的第二和第三恒定结构域的两个相同蛋白质片段组成；IgM和IgE Fc结构域在每种多肽链中含有三个重链恒定结构域(C_H结构域2-4)。本发明的双特异性抗体缺少Fc结构域。如本文所用，“缺少Fc结构域”意指本发明的双特异性抗体不包含CH2、CH3或CH4结构域；即恒定重链仅由一个或多个CH1结构域组成。

“亲和力”指分子(例如，抗体)的单一结合位点及其结合配偶体(例如，抗原)之间总计非共价相互作用的强度。除非另外指出，否则如本文所用，“结合亲和力”指反映结合对子的成员(例如，抗体和抗原)之间1:1相互作用的固有结合亲和力。分子X对其配偶体Y的亲和力可以通常由解离常数(KD)代表。亲和力可以由本领域已知的常见方法测量，包括本文所述的那些方法。在下文中描述用于测量结合亲和力的具体示意性和示例性实施方案。

如本文所用，术语“结合”或“特异性结合”意指结合作用对抗原是选择性的并且可以与不想要的或非特异的相互作用区别。抗原结合部分与特定抗原决定簇结合的能力可以通过酶联免疫吸附测定法(ELISA)或本领域技术人员熟悉的其他技术，例如表面等离子体共振(SPR)技术(在BIAcore仪上分析)(Liljeblad等人,Glyco J 17,323-329(2000))和常规结合测定法(Heeley，Endocr Res 28,217-229(2002))测量。在一个实施方案中，抗原结合部分与不相关蛋白质结合的程度小于约10％抗原结合部分与抗原结合的程度，如通过SPR测量。在某些实施方案中，与抗原结合的抗原结合部分或包含该抗原结合部分的抗原结合分子具有≤1μM、≤100nM、≤10nM、≤1nM、≤0.1nM、≤0.01nM或≤0.001nM(例如10^-8M或更小，例如从10^-8M至10^-13M，例如，从10^-9M至10^-13M)的解离常数(K_D)。

“亲和力成熟的”抗体指在一个或多个高变区(HVR)中存在一个或多个改变的抗体，其中与不拥有这些改变的亲本抗体相比，这类改变导致抗体对抗原的亲和力改善。

在一个实施方案中，特异性结合第一抗原和第二抗原的双特异性抗体与不相关蛋白质结合的程度小于约10％该抗体与第一或第二抗原结合的程度，如通过放射免疫测定法(RIA)或流式细胞术(FACS)测量。在某些实施方案中，特异性结合第一抗原和第二抗原的双特异性抗体具有≤1μM、≤100nM、≤10nM、≤1nM、≤0.1nM、≤0.01nM或≤0.001nM(例如10^-8M或更小，例如从10^-8M至10^-13M，例如，从10^-9M至10^-13M)的解离常数(K_D)。在某些实施方案中，特异性结合第一抗原和第二抗原的双特异性抗体与第一抗原或第二抗原的表位结合，所述表位在来自不同物种的第一或第二抗原之间是保守的。

在一个实施方案中，与T细胞活化抗原和肿瘤抗原(TA)特异性结合的双特异性抗体与不相关蛋白质结合的程度小于约10％该抗体与T细胞活化抗原或肿瘤抗原(TA)结合的程度，如通过放射免疫测定法(RIA)或流式细胞术(FACS)测量。在某些实施方案中，特异性结合T细胞活化抗原和肿瘤抗原(TA)的双特异性抗体具有≤1μM、≤100nM、≤10nM、≤1nM、≤0.1nM、≤0.01nM或≤0.001nM(例如10^-8M或更小，例如从10^-8M至10^-13M，例如，从10^-9M至10^-13M)的解离常数(K_D)。在某些实施方案中，特异性结合T细胞活化抗原和肿瘤抗原(TA)的双特异性抗体与T细胞活化抗原或肿瘤抗原(TA)的在来自不同物种的T细胞活化抗原或肿瘤抗原(TA)之间保守的表位结合。

术语“特异性结合T细胞活化抗原和肿瘤抗原(TA)的双特异性抗体”指这样的双特异性抗体，所述抗体能够以足够的亲和力结合T细胞活化抗原和肿瘤抗原，从而该抗体可用于在表达肿瘤抗原的细胞中或其附近介导T细胞介导的免疫反应。在一个具体实施方案中，T细胞活化抗原是CD3T细胞共同受体(CD3)抗原，特别地是人或食蟹猴CD3，最特别地是人CD3。在一些实施方案中，T细胞活化抗原是CD3的ε亚基。在其他实施方案中，T细胞活化抗原是CD3的α或β亚基。

在一个实施方案中，特异性结合T细胞活化抗原和肿瘤抗原(TA)的双特异性抗体可以与单克隆抗体H2C(在PCT公开号WO2008/119567中描述)竞争结合CD3的表位。在另一个实施方案中，特异性结合T细胞活化抗原和肿瘤抗原(TA)的双特异性抗体可以与单克隆抗体V9(在Rodrigues等人,Int J Cancer Suppl 7,45-50(1992)和美国专利号6,054,297中描述)竞争结合CD3的表位。在又一个实施方案中，特异性结合T细胞活化抗原和肿瘤抗原(TA)的双特异性抗体可以与单克隆抗体FN18(在Nooij等人,Eur J Immunol 19,981-984(1986)中描述)竞争结合CD3的表位。在一个实施方案中，双特异性抗体包含可以与单克隆抗体CH2527(序列ID 157和158)或其亲和力成熟变体竞争与CD3的表位结合的抗原结合部分。

如本文所用，“T细胞活化抗原”指在T淋巴细胞、特别地细胞毒T淋巴细胞的表面上表达的抗原决定簇，其中与抗原结合分子相互作用时，所述抗原决定簇能够诱导T细胞活化。具体而言，抗原结合分子与T细胞活化抗原相互作用可以通过触发T细胞受体复合物的信号传导级联，诱导T细胞活化。在一个具体实施方案中，T细胞活化抗原是CD3。

如本文所用，“T细胞活化”指T淋巴细胞、特别地细胞毒T淋巴细胞的一种或多种细胞反应，所述细胞反应选自：增殖、分化、细胞因子分泌、细胞毒效应分子释放、细胞毒活性和活化标志物表达。活化T细胞的本发明双特异性抗原结合分子能够诱导T细胞活化。测量T细胞活化的合适测定法是本领域已知和本文所述的。

如本文所用，术语“CD3T细胞共同受体(CD3)”，指蛋白质复合物并且由四条不同链组成。在哺乳动物中，该复合物含有一条CD3γ链、一条CD3δ链和两条CD3ε链。这些链与称作T细胞受体的分子(TCR)和ζ-链缔合以在T淋巴细胞中产生活化信号。除非另外说明，否则术语“CD3T细胞共同受体(CD3)”包括来自任何脊椎动物来源、优选地来自人来源的任何天然CD3，所述脊椎动物来源包括哺乳动物如灵长类(例如人)和啮齿类(例如，小鼠和大鼠)。本术语涵盖“全长”、未加工的CD3以及因细胞中加工而产生的任何形式的CD3。本术语还涵盖CD3的天然存在变体，例如，剪接变体或等位变体。在一个优选实施方案中，术语CD3T细胞共同受体指人或食蟹猴CD3，特别地人CD3。在一些实施方案中，T细胞活化抗原是CD3的ε亚基。在其他实施方案中，T细胞活化抗原是CD3的α或β亚基。在SEQ ID NO.:103中给出人CD3的示例性序列。

如本文所用，术语“肿瘤抗原(TA)”指肿瘤相关抗原以及肿瘤特异性抗原，即肿瘤细胞表达的任何有免疫原性的表位(例如，蛋白质)。该蛋白质可以由非肿瘤细胞表达，但是仅由肿瘤细胞表达时才有免疫原性。备选地，该蛋白质可以由肿瘤细胞表达，但是正常细胞不表达。优选地，本发明的抗TA抗体与TA的胞外结构域结合。在一个优选的实施方案中，所述肿瘤抗原是人肿瘤抗原。示例性肿瘤抗原包括但不限于黑素瘤相关的硫酸软骨素蛋白聚糖(MCSPB、UniProt Q6UVK1、NCBI登录号NP_001888)、成纤维细胞活化蛋白(FAP、Uni ProtQ12884、Q86Z29、Q99998；NCBI登录号NP_004451)、表皮生长因子受体(EGFR，也称作ErbB1和Her1，UniProt P00533；NCBI登录号NP_958439、NP_958440)、癌胚抗原(CEA，也称作癌胚抗原相关的细胞黏附分子5或CD66e；UniProt P06731、NCBI登录号NP_004354)和CD33(也称作gp76或结合唾液酸的Ig样凝集素3(Siglec-3)、UniProt P20138、NCBI登录号NP_001076087、NP_001171079)。

在一个实施方案中，本发明的双特异性抗体包含对黑素瘤相关的硫酸软骨素蛋白聚糖(MCSP)特异的至少一个抗原结合位点。

抗体特异性指抗体对抗原特定表位的选择性识别作用。例如，天然抗体是单特异的。本发明的“双特异性抗体”是具有两种不同抗原结合特异性的抗体。本发明的抗体对两种不同抗原特异，即对第一抗原和第二抗原特异。本文提供对肿瘤抗原(TA)和T细胞活化抗原具有结合特异性的双特异性抗体。在某些实施方案中，双特异性抗体可以结合TA的2个不同表位。双特异性抗体也可以用来使细胞毒性剂定位至表达TA的细胞。

如本文所用，术语“单特异性”抗体指具有一个或多个结合位点的抗体，所述位点的每一个与相同抗原的相同表位结合。

如本文所用，术语“双特异性”抗体指具有至少两个结合位点的抗体，所述位点的每一个与相同抗原或不同抗原的不同表位结合。

本文提供的抗体是多特异性抗体，例如双特异性抗体。多特异性抗体是对至少两个不同位点具有结合特异性的单克隆抗体。本文提供了双特异性抗体，其具有针对第一抗原和第二抗原的结合特异性。在某些实施方案中，双特异性抗体可以与第一抗原或第二抗原的两个不同表位结合。

双特异性抗体也可以用来使细胞毒性剂定位至表达第一抗原或第二抗原的细胞。

在一个实施方案中，与T细胞活化抗原和肿瘤抗原(TA)特异性结合的双特异性抗体与不相关蛋白质结合的程度小于约10％该抗体与T细胞活化抗原和肿瘤抗原(TA)结合的程度，如通过放射免疫测定法(RIA)或流式细胞术(FACS)测量。在某些实施方案中，特异性结合T细胞活化抗原和肿瘤抗原(TA)的双特异性抗体具有≤1μM、≤100nM、≤10nM、≤1nM、≤0.1nM、≤0.01nM或≤0.001nM(例如10^-8M或更小，例如从10^-8M至10^-13M，例如，从10^-9M至10^-13M)的解离常数(K_D)。在某些实施方案中，特异性结合T细胞活化抗原和肿瘤抗原(TA)的双特异性抗体与T细胞活化抗原或肿瘤抗原(TA)的在来自不同物种的T细胞活化抗原或肿瘤抗原(TA)之间保守的表位结合。

如本申请中所用，术语“价态”指抗体分子中存在指定数目的结合位点。就这一点而论，术语“双价”、“四价”和“六价”指抗体分子中分别存在两个结合位点、四个结合位点和六个结合位点。本发明的双特异性抗体至少是“双价的”并且可以是“三价”或“多价的”(例如“四价”或“六价”)。

本发明的抗体具有两个或更多个结合位点并且是双特异性的。即，这些抗体可以是双特异性的，甚至在存在多于两个结合位点的情况下(即该抗体是三价或多价的)也是如此。

“与参考抗体结合相同表位的抗体”指在竞争测定法中阻断参考抗体与其抗原结合达50％或更多的抗体，并且反过来，参考抗体在竞争测定法中阻断该抗体与其抗原结合达50％或更多。本文提供示例性竞争测定法。

“没有实质交叉反应性”意指分子(例如，抗体)不识别或不特异性结合与该分子的实际靶抗原不同的抗原(例如与靶抗原密切相关的抗原)，特别地与该靶抗原相比时。例如，抗体可以结合小于约10％至小于约5％的与实际靶抗原不同的抗原，或可以按选自小于约10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.5％、0.2％、或0.1％的量结合与实际靶抗原不同的所述抗原，优选地按小于约2％、1％或0.5％并且最优选地小于约0.2％或0.1％的量结合与实际靶抗原不同的抗原。

相对于参考多肽序列，将“氨基酸序列同一性百分数(％)”定义为比对序列并根据需要引入空位以实现最大序列同源性百分数并且不考虑任何保守性置换作为序列同一性的部分之后，候选序列中与参考多肽序列中的氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分数。为了确定氨基酸序列同一性百分数的比对可以按本领域能力范围内的多种方式实现，例如，使用可公开获得的计算机软件如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件。本领域技术人员可以确定用于比对序列的适宜参数，包括为实现正在比较的全长序列范围内最大比对所需要的任何算法。然而，出于本文目的，使用序列比较计算机程序ALIGN-2产生氨基酸序列同一性％值。ALIGN-2序列比较计算机程序由Genentech,Inc.授权，并且源代码已经随用户文档提交至华盛顿特区20559的美国版权局，在那里它以美国版权登记号TXU510087登记。ALIGN-2程序从Genentech,Inc.,South San Francisco,加利福尼亚州可公开获得或可以从源代码汇编。应当将ALIGN-2程序汇编在UNIX操作系统(包括数字式UNIX V4.0D)上使用。全部序列比较参数由ALIGN-2程序设定并且不变动。

在使用ALIGN-2比较氨基酸序列的情况下，如下计算给定氨基酸序列A与给定氨基酸序列B、同给定氨基酸序列B或针对给定氨基酸序列B(这可以备选地描述为与给定氨基酸序列B、同给定氨基酸序列B或针对给定氨基酸序列B具有或包含某个氨基酸序列同一性％的给定氨基酸序列A)的氨基酸序列同一性％：

100乘以分数X/Y

其中X是由序列比对程序ALIGN-2在该程序的A和B比对结果中评定为相同匹配的氨基酸残基的数目，并且其中Y是B中氨基酸残基的总数。将可以理解在氨基酸序列A的长度不等于氨基酸序列B的长度时，A相对于B的氨基酸序列同一性％将不等于B相对于A的氨基酸序列同一性％。除非另外特别声明，否则本文所用的全部氨基酸序列同一性值％如紧接前段中所述那样使用ALIGN-2计算机程序获得。

“分离的”抗体是已经与其自然环境的组分分离的一种抗体。在一些实施方案中，将抗体纯化至大于95％或99％纯度，如通过例如电泳(例如，SDS-PAGE、等电聚焦(IEF)、毛细管电泳法)或色谱(例如，离子交换或反相HPLC)所确定。关于评估抗体纯度的方法的综述，见，例如，Flatman等人,J.Chromatogr.B848:79-87(2007)。

“分离的”核酸指已经与其自然环境的组分分离的核酸分子。分离的核酸包括含于细胞内的核酸分子，所述细胞通常含有该核酸分子，但是该核酸分子存在于染色体外或与其天然染色体位置不同的染色体位置处。

“编码本发明双特异性抗体的分离核酸”指编码抗体重链和轻链(或其片段)的一个或多个核酸分子，包括在单一载体或独立载体中的这类核酸分子和在宿主细胞中一个或多个位置处存在的这类核酸分子。

“编码特异性结合T细胞活化抗原和肿瘤抗原(TA)的双特异性抗体的分离的核酸”指编码抗体重链和轻链(或其片段)的一个或多个核酸分子，包括在单一载体或独立载体中的这类核酸分子和在宿主细胞中一个或多个位置处存在的这类核酸分子。

如本申请中所用，术语”氨基酸”是指一组天然存在的羧基α-氨基酸，包括丙氨酸(三字母代码：ala，单字母代码：A)、精氨酸(arg，R)、天冬酰胺(asn，N)、天冬氨酸(asp，D)、半胱氨酸(cys，C)、谷氨酰胺(gln，Q)、谷氨酸(glu，E)、甘氨酸(gly，G)、组氨酸(his，H)、异亮氨酸(ile，I)、亮氨酸(leu，L)、赖氨酸(lys，K)、甲硫氨酸(met，M)、苯丙氨酸(phe，F)、脯氨酸(pro，P)、丝氨酸(ser，S)、苏氨酸(thr，T)、色氨酸(trp，W)、酪氨酸(tyr，Y)和缬氨酸(val，V)。

如本文所用，术语“载体”指能够增殖与其连接的另一种核酸的核酸分子。该术语包括作为自我复制型核酸结构的载体以及并入宿主细胞基因组的载体，其中已经在宿主细胞中导入了该载体。某些载体能够指导与它们有效连接的核酸表达。此类载体在本文中称作“表达载体”。

如本文所用，表述“细胞”、“细胞系”和“细胞培养物”互换使用并且全部这类名称包括后代。因而，词语“转化体”和“经转染的细胞”包括原代主题细胞和从其衍生的培养物，而无论转移次数是多少。还应当理解，全部后代可以在DNA含量方面不是精确地相同，原因在于有意或不经意突变。包括具有与最初转化细胞中所筛选的相同功能或生物活性的变体后代。

术语“宿主细胞”、“宿主细胞系”和“宿主细胞培养物”互换使用并且指已经向其中引入外源核酸的细胞，包括这类细胞的后代。宿主细胞包括“转化体”和“经转化的细胞”，其包括原代转化细胞和从其衍生的后代，而无论传代次数是多少。后代可以在核酸含量方面不与亲本细胞完全相同，反而可以含有突变。本文包括具有与最初转化细胞中所筛选或选择的相同功能或生物活性的突变后代。

“裸抗体”指不与异源部分(例如，细胞毒部分)或放射标记物缀合的抗体。裸抗体可以存在于药物制剂中。

“免疫缀合物”是与一个或多个异源分子(包括但不限于细胞毒性剂)缀合的抗体。

如本文所用，术语“细胞毒性剂”指抑制或阻止细胞功能和/或造成细胞死亡或破坏的物质。细胞毒性剂包括但不限于放射性同位素(例如，At²¹¹、I¹³¹、I¹²⁵、Y⁹⁰、Re¹⁸⁶、Re¹⁸⁸、Sm¹⁵³、Bi²¹²、P³²、Pb²¹²和Lu的放射性同位素)；化疗药或药物(例如，甲氨蝶呤、阿霉素、长春碱类生物碱(长春新碱、长春碱、依托泊苷)、多柔比星、美法仑、丝裂霉素C、苯丁酸氮芥、佐柔比星或其他嵌入剂)；生长抑制剂；酶及其片段如溶核酶；抗生素；毒素如细菌源、真菌源、植物源或动物源的小分子毒素或酶活性毒素，包括其片段和/或变体；和下文公开的各种抗肿瘤剂或抗癌剂。

术语“N末端”指N末端的最末氨基酸，术语“C末端”指C末端的最末氨基酸。

术语“药物制剂”指一种制备物，所述制备物处于这类形式从而允许其中所含的有效成分的生物活性有效，并且不含有对于将会施用该制剂的受试者不可接受地有毒的额外组分。

“可药用载体”指药物制剂中除有效成分之外的对受试者无毒的成分。可药用载体包括但不限于缓冲剂、赋形剂、稳定剂或防腐剂。

如本文所用，名词“治疗”(和其语法变型如动词“治疗”或分词“治疗”)指意欲改变正在治疗的个体的天然过程的临床介入，并且可以为了预防或在临床病理学过程期间实施。想要的治疗效果包括，但不限于防止疾病出现或复发、减轻症状、减小疾病的任何直接或间接病理学后果、防止转移、降低病情进展速率、改善或缓和疾病状态，以及缓解或预后改善。在一些实施方案中，本发明的抗体用来延缓疾病发展或用来减慢疾病的进展。

“个体”或“受试者”是哺乳动物。哺乳动物包括但不限于驯化动物(例如，奶牛、绵羊、猫、犬和马)、灵长类(例如，人和非人灵长类如猴)、兔和啮齿类(例如，小鼠和大鼠)。在某些实施方案中，个体或受试者是人。

药剂(例如，药物制剂)的“有效量”指以需要的剂量并持续需要的时间段，有效实现所需治疗性或预防性结果的量。

如本文所用，术语“癌症”指增殖性疾病，如淋巴瘤、淋巴细胞白血病、肺癌、非小细胞肺癌(NSCL)、支气管肺泡细胞肺癌、骨癌、胰腺癌、皮肤癌、头或颈癌、皮肤或眼球内黑素瘤、子宫癌、卵巢癌、直肠癌、肛区癌、胃癌、胃癌、结肠癌、乳腺癌、子宫癌、输卵管癌、子宫内膜癌、子宫颈癌、阴道癌、外阴癌、霍奇金病、食道癌、小肠癌、内分泌系统癌、甲状腺癌、甲状旁腺癌、肾上腺癌、软组织肉瘤、尿道癌、阴茎癌、前列腺癌、膀胱癌、肾或输尿管癌、肾细胞癌、肾盂癌、间皮瘤、肝细胞癌、胆道癌、中枢神经系统(CNS)肿瘤、脊枢椎肿瘤、脑干胶质瘤、多形性胶质母细胞瘤、星形细胞瘤、神经鞘瘤、室管膜瘤、髓母细胞瘤、脑膜瘤、鳞状细胞癌、垂体腺瘤和Ewings肉瘤，包括前述任一癌症的难治形式或一种或多种上述癌症的组合。

术语“包装插页”用来指治疗产品的商业包装中习惯性包括的说明书，所述说明书含有关于适应症、用法、剂量、施用、联合疗法、禁忌症和/或涉及此类治疗产品用途之警告的信息。

II.组合物和方法

A.示例性双特异性抗体

本发明涉及了包含至少两个Fab片段的双特异性抗体，其中第一Fab片段包含对第一抗原特异的至少一个抗原结合位点；并且第二Fab片段包含对第二抗原特异的至少一个抗原结合位点，其中将第二Fab片段的重链和轻链的可变区或恒定区交换；并且其中两个Fab片段通过两个肽接头彼此连接，并且其中所述双特异性抗体缺少Fc结构域。优选地，所述肽接头是具有至少5个氨基酸长度、优选地具有5至100个、更优选地10至50个氨基酸长度的氨基酸序列的肽。在一个实施方案中，所述肽接头是(GxS)n或(GxS)nGm，其中G＝甘氨酸，S＝丝氨酸并且(x＝3，n＝3、4、5或6，以及m＝0、1、2或3)或(x＝4，n＝2、3、4或5和m＝0、1、2或3)，优选地x＝4并且n＝2或3，更优选地其中x＝4，n＝2。在一个实施方案中，所述肽接头是(G₄S)₂。肽接头用来连接第一和第二Fab片段。

在一个实施方案中，第一Fab片段通过两个肽接头与第二Fab片段的N末端连接。取决于第二Fab片段的重链和轻链的可变结构域或恒定结构域是否交换，当第一Fab片段通过两个肽接头与第二Fab片段的N末端连接时，不同的双特异性抗体分子是可能的。

在一个实施方案中，交换第二Fab片段的可变结构域(即第二Fab片段是CrossFab_(VHVL))，并且第一Fab片段的重链的C末端通过肽接头与第二Fab片段的VLCH1链的N末端连接，并且第一Fab片段的轻链的C末端通过肽接头与第二Fab片段的VHCL链的N末端连接。因而，在一个实施方案中，双特异性抗体包含两条链：通过肽接头与第二Fab片段的VHCL链连接的第一Fab片段的轻链(VLCL)(VLCL-接头-VHCL)和通过肽接头与第二Fab片段的VLCH1链连接的第一Fab片段的重链(VHCH1)(VHCH1-接头-VLCH1)。

在另一个实施方案中，交换第二Fab片段的恒定结构域(即第二Fab片段是CrossFab_(CLCH1))，并且第一Fab片段的重链的C末端通过肽接头与第二Fab片段的VHCL链的N末端连接，并且第一Fab片段的轻链通过肽接头与VLCH1链的N末端连接。因而，在一个实施方案中，双特异性抗体包含两条链：通过肽接头与第二Fab片段的VLCH1链连接的第一Fab片段的轻链(VLCL)(VLCL-接头-VLCH1)和通过肽接头与第二Fab片段的VHCL链连接的第一Fab片段的重链(VHCH1)(VHCH1-接头-VHCL)。

在一个实施方案中，第一Fab片段通过两个肽接头与第二Fab片段的C末端连接。取决于第二Fab片段的重链和轻链的可变结构域或恒定结构域是否交换，当第一Fab片段通过两个肽接头与第二Fab片段的C末端连接时，不同的双特异性抗体分子是可能的。

在一个实施方案中，交换第二Fab片段的可变结构域(即第二Fab片段是CrossFab_(VHVL))，并且第一Fab片段的重链的N末端通过肽接头与第二Fab片段的VLCH1链的C末端连接，并且第一Fab片段的轻链的N末端通过肽接头与第二Fab片段的VHCL链的C末端连接。因此，在一个实施方案中，双特异性抗体包含两条链：通过肽接头与第一Fab片段的轻链(VLCL)连接的第二Fab片段的VHCL链(VHCL-接头-VLCL)和通过肽接头与第一Fab片段的重链(VHCH1)连接的第二Fab片段的VLCH1链(VLCH1-接头-VHCH1)。

在另一个实施方案中，交换第二Fab片段的恒定结构域(即第二Fab片段是CrossFab_(CLCH1))，并且第一Fab片段的重链的N末端通过肽接头与第二Fab片段的VHCL链的C末端连接，并且第一Fab片段的轻链的N末端通过肽接头与VLCH1链的C末端连接。因此，在一个实施方案中，双特异性抗体包含两条链：通过肽接头与第一Fab片段的轻链(VLCL)连接的第二Fab片段的VLCH1链(VLCH1-接头-VLCL)和通过肽接头与第一Fab片段的重链(VHCH1)连接的第二Fab片段的VHCL链(VHCL-接头-VHCH1)。本发明的双特异性抗体至少是双价的并可以是三价或多价的，例如四价。在一个实施方案中，所述双特异性抗体是双价的(1+1样式)，其中一个结合位点分别各自靶向第一抗原和第二抗原。在另一个实施方案中，所述双特异性抗体是三价的(2+1样式)，其中两个结合位点分别各自靶向第一抗原，并且一个结合位点靶向第二抗原，如以下部分中详述。

在一个实施方案中，第三Fab片段与第一Fab片段的N末端或C末端连接。在一个实施方案中，第三Fab片段通过至少一个肽接头与第一Fab片段连接。优选地，所述肽接头是(G₄S)₂接头。

在一个实施方案中，第三Fab片段与第一Fab片段的轻链或重链的N末端或C末端连接。取决于第一Fab片段的哪个末端与第二Fab片段连接(如上文详述)，第三Fab片段在第一片段的相对(游离)末端上连接。第三Fab片段可以由一个或两个接头连接。

在一个实施方案中，本发明的双特异性抗体包含三个Fab片段，其中所述Fab片段和所述接头是从N端至C端方向按以下顺序连接：Fab片段3-(1个或2个接头)-Fab片段1-(2个接头)-Fab片段2，其中将第二Fab片段的重链和轻链的可变区或恒定区交换。在这个实施方案中，第三Fab片段的C末端与第一Fab片段的N末端连接。如上文详述，Fab片段可以借助重链或轻链彼此连接。在一个实施方案中，第三Fab片段的重链的C末端通过肽接头与第一Fab片段的重链的N末端连接；并且第一Fab片段通过两个接头与第二Fab片段连接，其中将第二Fab片段的重链和轻链的可变区或恒定区交换。取决于第二Fab片段的重链和轻链的可变结构域或恒定结构域是否交换，不同的双特异性抗体分子是可能的。

在一个实施方案中，交换第二Fab片段的可变结构域(即第二Fab片段是CrossFab_(VHVL))，并且三个Fab片段的链从N端至C端方向按以下顺序连接：VHCH1-接头-VHCH1-接头-VLCH1。在一个实施方案中，双特异性抗体包含三条链：第三Fab片段的轻链(VLCL)、通过肽接头与第二Fab片段的VHCL链连接的第一Fab片段的轻链(VLCL)(VLCL-接头-VHCL)和通过肽接头与第一Fab片段的重链连接的第三片段重链，所述第一Fab片段的重链本身与第二Fab片段的VLCH1链连接(VHCH1-接头-VHCH1-接头-VLCH1)。在另一个实施方案中，所述第三Fab片段通过两个接头与第一Fab片段连接，并且双特异性抗体包含两条链：通过接头与第一Fab片段的轻链(VLCL)连接的第三Fab片段的轻链(VLCL)，所述第一Fab片段的轻链转而通过肽接头与第二Fab片段的VHCL链连接(VLCL-接头-VLCL-接头-VHCL)，和与第一Fab片段的重链连接的第三片段重链，所述第一Fab片段的重链本身通过肽接头与第二Fab片段的VLCH1链连接(VHCH1-接头-VHCH1-接头-VLCH1)。

在一个实施方案中，交换第二Fab片段的恒定结构域(即第二Fab片段是CrossFab_(CLCH1))，并且三个Fab片段的链从N端至C端方向按以下顺序连接：VHCH1-接头-VHCH1-接头-VHCL。在一个实施方案中，双特异性抗体包含三条链：第三Fab片段的轻链(VLCL)、通过肽接头与第二Fab片段的VLCH1链连接的第一Fab片段的轻链(VLCL)(VLCL-接头-VLCH1)、和通过肽接头与第一Fab片段的重链连接的第三片段重链，所述第一Fab片段的重链本身与第二Fab片段的VHCL链连接(VHCH1-接头-VHCH1-接头-VHCL)。在另一个实施方案中，所述第三Fab片段通过两个接头与第一Fab片段连接，并且双特异性抗体包含两条链：通过接头与第一Fab片段的轻链(VLCL)连接的第三Fab片段轻链(VLCL)，所述第一Fab片段的轻链转而通过肽接头与第二Fab片段的VLCH1链连接(VLCL-接头-VLCL-接头-VLCH1)，和与第一Fab片段的重链连接的第三片段重链，所述第一Fab片段的重链本身通过肽接头与第二Fab片段的VHCL链连接(VHCH1-接头-VHCH1-接头-VHCL)。

在一个实施方案中本发明的双特异性抗体包含三个Fab片段，其中所述Fab片段和所述接头是从N端至C端方向按以下顺序连接：Fab片段2-(2个接头)-Fab片段1-(1个或2个接头)-Fab片段3，其中将第二Fab片段的重链和轻链的可变区或恒定区交换。在这个实施方案中，第三Fab片段的N末端与第一Fab片段的C末端连接。如上文详述，Fab片段可以借助重链或轻链彼此连接。在一个实施方案中，第三Fab片段的重链的N末端通过肽接头与第一Fab片段的重链的C末端连接；并且第一Fab片段通过两个接头与第二Fab片段连接，其中将第二Fab片段的重链和轻链的可变区或恒定区交换。取决于第二Fab片段的重链和轻链的可变结构域或恒定结构域是否交换，不同的双特异性抗体分子是可能的。

在一个实施方案中，交换第二Fab片段的可变结构域(即第二Fab片段是CrossFab_(VHVL))，并且三个Fab片段的链从N端至C端方向按以下顺序连接：VLCH1-接头-VHCH1-接头-VHCH1。在一个实施方案中，双特异性抗体包含三条链：第三Fab片段的轻链(VLCL)、通过肽接头与第一Fab片段的轻链(VLCL)连接的第二Fab片段的VHCL链(VHCL-接头-VLCL)，和与第一片段的重链连接的第二Fab片段的VLCH1链，所述第一片段的重链本身通过肽接头与第一Fab片段的重链连接(VLCH1-接头-VHCH1-接头-VHCH1)。在另一个实施方案中，所述第三Fab片段通过两个接头与第一Fab片段连接，并且双特异性抗体包含两条链：通过肽接头与第一Fab片段的轻链(VLCL)连接的第二Fab片段的VHCL链，所述第一Fab片段的轻链转而通过肽接头与第三Fab片段的轻链(VLCL)连接(VHCL-接头-VLCL-接头-VLCL)，和与第一片段的重链连接的第二Fab片段VLCH1链，所述第一片段的重链本身通过肽接头与第一Fab片段的重链连接(VLCH1-接头-VHCH1-接头-VHCH1)。

在一个实施方案中，交换第二Fab片段的恒定结构域(即第二Fab片段是CrossFab_(CLCH1))，并且三个Fab片段的链从N端至C端方向按以下顺序连接：VHCL-接头-VHCH1-接头-VHCH1。在一个实施方案中，双特异性抗体包含三条链：第三Fab片段的轻链(VLCL)，和与第一Fab片段的轻链(VLCL)连接的第二Fab片段的VLCH1链(VLCH1-接头-VLCL)，和与第一片段的重链连接的第二Fab片段的VHCL链，所述第一片段的重链本身通过肽接头与第一Fab片段的重链连接(VHCL-接头-VHCH1-接头-VHCH1)。在另一个实施方案中，所述第三Fab片段通过两个接头与第一Fab片段连接，并且双特异性抗体包含两条链：与第一Fab片段的轻链(VLCL)连接的第二Fab片段VLCH1链，所述第一Fab片段的轻链转而通过肽接头与第三片段的轻链连接(VLCH1-接头-VLCL-接头-VLCL)，和与第一片段的重链连接的第二Fab片段的VHCL链，所述第一片段的重链本身通过肽接头与第一Fab片段的重链连接(VHCL-接头-VHCH1-接头-VHCH1)。

在另一个实施方案中，第三Fab片段与第二Fab片段的轻链或重链的N或C末端连接。在一个实施方案中，第三Fab片段通过肽接头与第二Fab片段连接。优选地，所述肽接头是(G₄S)₂接头。如上文详述，Fab片段可以借助重链或轻链彼此连接。

在一个实施方案中本发明的双特异性抗体包含三个Fab片段，其中所述Fab片段和所述接头是从N端至C端方向按以下顺序连接：Fab片段1-(2个接头)-Fab片段2-(1个或2个接头)-Fab片段3，其中将第二Fab片段的重链和轻链的可变区或恒定区交换。在一个实施方案中，第三Fab片段的N末端与第二Fab片段的C末端连接。

在另一个实施方案中，第三Fab片段的重链的C末端通过肽接头与第二Fab片段的N末端连接；并且第一Fab片段通过两个接头与第二Fab片段连接，其中将第二Fab片段的重链和轻链的可变区或恒定区交换。

取决于第二Fab片段的重链和轻链的可变结构域或恒定结构域是否交换，不同的双特异性抗体分子是可能的。

在一个实施方案中，交换第二Fab片段的可变结构域(即第二Fab片段是CrossFab_(VHVL))，并且三个Fab片段的链从N端至C端方向按以下顺序连接：VHCH1-接头-VLCH1-接头-VHCH1。在一个实施方案中，双特异性抗体包含三条链：第三Fab片段的轻链(VLCL)、通过接头与第二Fab片段的VHCL链连接的第一Fab片段的轻链(VLCL)(VLCL-接头-VHCL)，和与第二Fab片段的VLCH1链的N末端连接的第三片段重链，以及通过肽接头与第一Fab片段的重链的N末端连接的所述VLCH1链的C末端(VHCH1-接头-VLCH1-接头-VHCH1)。在另一个实施方案中，所述第三Fab片段通过两个接头与第二Fab片段连接，并且双特异性抗体包含两条链：通过接头与第二Fab片段的VHCL链连接的第一Fab片段的轻链(VLCL)，所述第二Fab片段的VHCL链转而与第三Fab片段的轻链连接(VLCL-接头-VHCL-接头-VLCL)，和与第二Fab片段的VLCH1链的N末端连接的第三片段的重链，以及通过肽接头与第一Fab片段的重链的N末端连接的所述VLCH1链的C末端(VHCH1-接头-VLCH1-接头-VHCH1)。

在一个实施方案中，交换第二Fab片段的恒定结构域(即第二Fab片段是CrossFab_(CLCH1))，并且三个Fab片段的链从N端至C端方向按以下顺序连接：VHCH1-接头-VHCL-接头-VHCH1。在一个实施方案中，双特异性抗体包含三条链：第三Fab片段的轻链(VLCL)、通过肽接头与第二Fab片段的VLCH1链连接的第一Fab片段的轻链(VLCL)(VLCL-接头-VHCH1)，和与第二Fab片段的VHCL链的N末端连接的第三片段重链，以及通过肽接头与第一Fab片段的重链的N末端连接的所述(VHCL)链的C末端(VHCH1-接头-VHCL-接头-VHCH1)。在另一个实施方案中，所述第三Fab片段通过两个接头与第二Fab片段连接，并且双特异性抗体包含两条链：通过肽接头与第二Fab片段的VLCH1链连接的第一Fab片段的轻链(VLCL)，所述第二Fab片段的VHCL链转而与第三Fab片段的轻链连接(VLCL-接头-VHCH1-接头-VLCL)，和与第二Fab片段的VLCL链的N末端连接的第三片段的重链，以及通过肽接头与第一Fab片段的重链的N末端连接的所述VLCL链的C末端(VHCH1-接头-VHCL-接头-VHCH1)。

B.与T细胞活化抗原和肿瘤抗原(TA)结合的示例性双特异性抗体

本发明涉及将T细胞活化抗原结合位点与靶向肿瘤抗原(TA)的第二抗原结合位点组合的双特异性抗体。本发明的抗体与肿瘤细胞表面上的肿瘤抗原特异性结合并且同时与细胞毒T淋巴细胞表面上的抗原结合。优选地所述抗原是CD3T细胞共同受体(CD3)抗原。这种双特异性抗体能够在肿瘤部位特异性激发免疫反应，随后导致靶细胞凋亡。可以理解，本节中例举的序列可以按上节A的实施方案中例举的任何抗体样式布置。

在本发明的一个具体实施方案中，活化T细胞的双特异性抗体能够与肿瘤细胞抗原和T细胞活化抗原同时结合。在一个实施方案中，活化T细胞的双特异性抗体能够通过与肿瘤细胞抗原和T细胞活化抗原同时结合来交联T细胞和肿瘤细胞。在一个甚至更具体的实施方案中，这类同时结合导致肿瘤细胞裂解。在一个实施方案中，这类同时结合导致T细胞活化。在其他实施方案中，这类同时结合导致T淋巴细胞、特别地是细胞毒T淋巴细胞的细胞反应，所述细胞反应选自：增殖、分化、细胞因子分泌、细胞毒效应分子释放、细胞毒活性和活化标志物表达。在一个实施方案中，活化T细胞的双特异性抗体与T细胞活化抗原在不与靶细胞抗原同时结合的情况下的结合不导致T细胞活化。

在一个实施方案中，活化T细胞的双特异性抗体能够将T细胞的细胞毒活性再指向靶细胞。在一个具体实施方案中，所述再指向与MHC介导的靶细胞呈递肽抗原和/或T细胞的特异性无关。特别地，根据本发明任何实施方案的T细胞是细胞毒T细胞。在一些实施方案中，T细胞是CD4⁺或CD8⁺T细胞，特别地是CD8⁺T细胞。

在一个实施方案中，提供了特异性结合T细胞活化抗原和肿瘤抗原(TA)的双特异性抗体，其包含第一Fab片段和第二Fab片段，其中将第二Fab重链和轻链的可变区或恒定区交换和两个Fab片段通过两个肽接头彼此连接；并且其中双特异性抗体不包含Fc结构域，如上节A中详。

在一个方面，提供了特异性结合T细胞活化抗原和肿瘤抗原(TA)的双特异性抗体，所述抗体包含通过两个肽接头连接的至少两个Fab片段，其中第一Fab片段包含对肿瘤抗原(TA)特异的至少一个抗原结合位点；并且第二Fab片段包含对T细胞活化抗原特异的至少一个抗原结合位点，其中将第二Fab重链和轻链的可变区或恒定区交换；并且其中双特异性抗体缺少Fc结构域。

在一个具体实施方案中，T细胞活化抗原是CD3T细胞共同受体(CD3)抗原，特别地是人或食蟹猴CD3，最特别地是人CD3。在一些实施方案中，T细胞活化抗原是CD3的ε亚基。在其他实施方案中，T细胞活化抗原是CD3的α或β亚基。

在一个方面，提供了特异性结合CD3T细胞共同受体(CD3)抗原和肿瘤抗原(TA)的双特异性抗体，所述抗体包含通过两个肽接头连接的至少两个Fab片段，其中第一Fab片段包含对肿瘤抗原(TA)特异的至少一个抗原结合位点；并且第二Fab片段包含对CD3T细胞共同受体(CD3)特异的至少一个抗原结合位点，其中将第二Fab重链和轻链的可变区或恒定区交换；并且其中双特异性抗体缺少Fc结构域。

本发明的双特异性抗体至少是双价的并可以是三价或多价的，例如四价或六价的。在一个实施方案中，所述双特异性抗体是双价的(1+1样式)，其中一个结合位点分别各自靶向肿瘤抗原(TA)和T细胞活化抗原。在另一个实施方案中，所述双特异性抗体是三价的(2+1样式)，两个结合位点各自靶向肿瘤抗原(TA)，并且一个结合位点靶向T细胞活化抗原，如以下部分中详述。

在一个实施方案中，所述抗体额外地包含第三Fab片段，如上节A中详述。在一个实施方案中，所述第三Fab片段包含对肿瘤抗原特异的至少一个抗原结合位点。在一个实施方案中，所述第三Fab片段的抗原结合位点对与第一Fab片段的抗原结合位点相同的肿瘤抗原是特异的。

在一个实施方案中，所述第三Fab片段的抗原结合位点对与第一Fab片段的抗原结合位点相同的肿瘤抗原是特异的，并且本发明的双特异性抗体包含由肽接头按以下顺序(从N端至C端方向或从C端至N端方向)连接的三个Fab片段：Fab_(TA)–(1个或2个接头)-Fab_(TA)–(2个接头)-xFab_{(T细胞活化抗原)}，其中Fab_(TA)指具有对肿瘤抗原特异的抗原结合位点的Fab片段并且xFab_{(T细胞活化抗原)}指具有对T细胞活化抗原特异的抗原结合位点的Fab片段，其中重链和轻链的可变区或恒定区交换。

在一个实施方案中，所述第三Fab片段的抗原结合位点对与第一Fab片段的抗原结合位点相同的肿瘤抗原是特异的，并且本发明的双特异性抗体包含由肽接头按以下顺序(从N端至C端方向或从C端至N端方向)连接的三个Fab片段：Fab_(TA)–(2个接头)-xFab_{(T细胞活化抗原)}–(1个或2个接头)-Fab_(TA)，其中Fab_(TA)指具有对肿瘤抗原特异的抗原结合位点的Fab片段并且xFab_{(T细胞活化抗原)}指具有对T细胞活化抗原特异的抗原结合位点的Fab片段，其中重链和轻链的可变区或恒定区交换。

在一个实施方案中，双特异性抗体包含可以与单克隆抗体V9竞争与CD3的表位结合的抗原结合部分。参见例如通过引用方式完整并入本文的Rodigues等人,Int J CancerSuppl 7(1992),45-50；US 6,054,297。

在一个实施方案中，双特异性抗体包含可以与单克隆抗体FN18竞争与CD3的表位结合的抗原结合部分。参见通过引用方式完整并入本文的Nooij等人,Eur J Immunol 19(1986),981-984。

在一个实施方案中，双特异性抗体包含可以与单克隆抗体CH2527(序列ID157和158和人源化变体)或其亲和力成熟变体竞争与CD3的表位结合的抗原结合部分。

在一个实施方案中，双特异性抗体包含与CD3特异性结合的第二Fab片段，其中重链可变区包含SEQ ID.NO.10或SEQ ID.NO.32的CDR1、SEQ ID.NO.11或SEQ ID.NO.33的CDR2和SEQ ID.NO.12或SEQ ID.NO.34的CDR3；并且其中轻链可变区包含SEQ ID.NO.7或SEQID.NO.29的CDR1、SEQ ID.NO.8或SEQ ID.NO.30的CDR2和SEQ ID.NO.9或SEQ ID.NO.31的CDR3。

在一个实施方案中，双特异性抗体包含与CD3特异性结合的第二Fab片段，其中重链可变区包含SEQ ID.NO.10的CDR1、SEQ ID.NO.11的CDR2和SEQ ID.NO.12的CDR3；并且其中轻链可变区包含SEQ ID.NO.7的CDR1、SEQ ID.NO.8的CDR2和SEQ ID.NO.9的CDR3。

在一个实施方案中，双特异性抗体包含与CD3特异性结合的第二Fab片段，其中重链可变区包含SEQ ID.NO.32的CDR1、SEQ ID.NO.33的CDR2和SEQ ID.NO.34的CDR3；并且其中轻链可变区包含SEQ ID.NO.29的CDR1、SEQ ID.NO.30的CDR2和SEQ ID.NO.31的CDR3。

在一个实施方案中，双特异性抗体包含与CD3特异性结合的第二Fab片段，其中重链可变区包含SEQ ID.NO.170的CDR1、SEQ ID.NO.171的CDR2和SEQ ID.NO.172的CDR3；并且其中轻链可变区包含SEQ ID.NO.174的CDR1、SEQ ID.NO.175的CDR2和SEQ ID.NO.176的CDR3。

在一个实施方案中，双特异性抗体包含与CD3特异性结合的第二Fab片段的轻链和重链，其中重链可变区序列与SEQ ID.NO.20或SEQ ID.NO.36至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一；其中轻链可变区序列与SEQ ID.NO.19或SEQ ID.NO 35至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一，或其保留功能的变体。在一个实施方案中，双特异性抗体包含与CD3特异性结合的第二Fab片段的轻链和重链，其中重链可变区包含SEQ ID.NO.20的氨基酸序列；并且轻链可变区包含SEQ ID.NO.19的氨基酸序列，或其保留功能的变体。

在一个实施方案中，双特异性抗体包含与CD3特异性结合的第二Fab片段的轻链和重链，其中重链可变区包含SEQ ID.NO.36的氨基酸序列；并且轻链可变区包含SEQID.NO.35的氨基酸序列，或其保留功能的变体。

在一个实施方案中，双特异性抗体包含与CD3特异性结合的第二Fab片段的轻链和重链，其中重链可变区包含SEQ ID.NO.158的氨基酸序列；并且轻链可变区包含SEQID.NO.157的氨基酸序列，或其保留功能的变体。在一个实施方案中，双特异性抗体包含与CD3特异性结合的第二Fab片段的轻链和重链，其中重链可变区序列与SEQ ID.NO.158至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一；其中轻链可变区序列与SEQID.NO.157至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一，或其保留功能的变体。在一个实施方案中，双特异性抗体包含与CD3特异性结合的第二Fab片段的轻链和重链，其中重链可变区序列是SEQ ID.NO.158的亲和力成熟变体并且其中轻链可变区序列是SEQ ID.NO.157的亲和力成熟变体。在这个实施方案中，亲和力成熟变体意指独立地交换SEQ ID.NO.158和/或SEQ ID.NO.157的1、2、3或4个氨基酸。

在一个实施方案中，双特异性抗体包含与CD3特异性结合的第二Fab片段的轻链和重链，其中重链可变区包含SEQ ID.NO.169的氨基酸序列；并且轻链可变区包含SEQID.NO.173的氨基酸序列。

在一个实施方案中，双特异性抗体包含与CD3特异性结合的第二Fab片段的轻链和重链，其中所述重链包含了含有SEQ ID NO:22或SEQ ID.NO.38的氨基酸序列的恒定区或其保留功能的变体。在一个实施方案中，双特异性抗体包含与CD3特异性结合的第二Fab片段的轻链和重链，其中所述重链包含了含有SEQ ID NO:22或SEQ ID.NO 38的氨基酸序列的恒定区，和对肿瘤抗原(TA)特异的第一Fab片段的轻链和重链，所述轻链和重链包含如本文所述的任一实施方案中所定义的一个或多个氨基酸序列。

在一个实施方案中，双特异性抗体包含与CD3特异性结合的第二Fab片段的轻链和重链，其中所述重链包含了含有SEQ ID NO:22的氨基酸序列的恒定区。在一个实施方案中，双特异性抗体包含与CD3特异性结合的第二Fab片段的轻链和重链，其中所述重链包含了含有SEQ ID NO:22的氨基酸序列的恒定区，和对肿瘤抗原(TA)特异的第一Fab片段的轻链和重链，所述轻链和重链包含如本文所述的任一实施方案中所定义的一个或多个氨基酸序列。

在一个实施方案中，双特异性抗体包含与CD3特异性结合的第二Fab片段的轻链和重链，其中所述轻链包含了含有SEQ ID NO:21或SEQ ID.NO.37的氨基酸序列的恒定区。在一个实施方案中，双特异性抗体包含与CD3特异性结合的第二Fab片段的轻链和重链，其中所述轻链包含了含有SEQ ID NO:21或SEQ ID.NO.37的氨基酸序列的恒定区，和对肿瘤抗原(TA)特异的第一Fab片段的轻链和重链，所述轻链和重链包含如本文所述的任一实施方案中所定义的一个或多个氨基酸序列。

在一个实施方案中，双特异性抗体包含与CD3特异性结合的第二Fab片段的轻链和重链，其中所述轻链包含了含有SEQ ID NO:21的氨基酸序列的恒定区。在一个实施方案中，双特异性抗体包含与CD3特异性结合的第二Fab片段的轻链和重链，其中所述轻链包含了含有SEQ ID NO:21的氨基酸序列的恒定区，和对肿瘤抗原(TA)特异的第一Fab片段的轻链和重链，所述轻链和重链包含如本文所述的任一实施方案中所定义的一个或多个氨基酸序列。

在又一个具体实施方案中，本发明的双特异性抗体包含与CD3特异性结合的第二Fab片段的轻链和重链，所述重链包含了含有SEQ ID NO:22或SEQ ID.NO.38的氨基酸序列的重链恒定区；并且所述轻链包含了含有SEQ ID NO:21或SEQ ID.NO.37的氨基酸序列的轻链恒定区。

在又一个具体实施方案中，本发明的双特异性抗体包含与CD3特异性结合的第二Fab片段的轻链和重链，所述重链包含了含有SEQ ID NO:22的氨基酸序列的重链恒定区；并且所述轻链包含了含有SEQ ID NO:21的氨基酸序列的轻链恒定区。

在又一个具体实施方案中，本发明的双特异性抗体包含与CD3特异性结合的第二Fab片段的轻链和重链，所述重链包含了含有SEQ ID NO:22的氨基酸序列的重链恒定区；并且所述轻链包含了含有SEQ ID NO:21的氨基酸序列的轻链恒定区，和对肿瘤抗原(TA)特异的第一Fab片段的轻链和重链，所述轻链和重链包含如本文所述的任一实施方案中所定义的一个或多个氨基酸序列。

在一个实施方案中，本发明的双特异性抗体包含与CD3特异性结合的第二Fab片段的轻链和重链，所述轻链和重链包含SEQ ID NO:19的可变轻链和SEQ ID NO:20的可变重链，以及含有SEQ ID NO:22的氨基酸序列的重链恒定区和含有SEQ ID NO:21的氨基酸序列的轻链恒定区。

在一个实施方案中，本发明的双特异性抗体包含与CD3特异性结合的第二Fab片段的轻链和重链，所述轻链和重链包含SEQ ID NO:19的可变轻链和SEQ ID NO:20的可变重链，以及含有SEQ ID NO:22的氨基酸序列的重链恒定区和含有SEQ ID NO:21的氨基酸序列的轻链恒定区，和对肿瘤抗原(TA)特异的第一Fab片段的轻链和重链，所述轻链和重链包含如本文所述的任一实施方案中所定义的一个或多个氨基酸序列。

在一个实施方案中，本发明的双特异性抗体包含与CD3特异性结合的第二Fab片段的轻链和重链，所述轻链和重链包含SEQ ID NO:35的可变轻链和SEQ ID NO:36的可变重链，以及含有SEQ ID NO:38的氨基酸序列的重链恒定区和含有SEQ ID NO:37的氨基酸序列的轻链恒定区。

在一个实施方案中，本发明的双特异性抗体包含与CD3特异性结合的第二Fab片段的轻链和重链，所述轻链和重链包含SEQ ID NO:35的可变轻链和SEQ ID NO:36的可变重链，以及含有SEQ ID NO:38的氨基酸序列的重链恒定区和含有SEQ ID NO:37的氨基酸序列的轻链恒定区，和对肿瘤抗原(TA)特异的第一Fab片段的轻链和重链，所述轻链和重链包含如本文所述的任一实施方案中所定义的一个或多个氨基酸序列。

在一个实施方案中，本发明的双特异性抗体包含与CD3特异性结合的第二Fab片段的轻链和重链，所述轻链和重链包含SEQ ID NO:173的可变轻链和SEQ ID NO:169的可变重链，以及含有SEQ ID NO:38的氨基酸序列的重链恒定区和含有SEQ ID NO:37的氨基酸序列的轻链恒定区。

在一个实施方案中，本发明的双特异性抗体包含与CD3特异性结合的第二Fab片段的轻链和重链，所述轻链和重链包含SEQ ID NO:173的可变轻链和SEQ ID NO:169的可变重链，以及含有SEQ ID NO:38的氨基酸序列的重链恒定区和含有SEQ ID NO:37的氨基酸序列的轻链恒定区，和对肿瘤抗原(TA)特异的第一Fab片段的轻链和重链，所述轻链和重链包含如本文所述的任一实施方案中所定义的一个或多个氨基酸序列。

在一个实施方案中，本发明的双特异性抗体包含与CD3特异性结合的第二Fab片段的轻链和重链，所述轻链和重链包含SEQ ID NO:157的可变轻链和SEQ ID NO:158的可变重链，以及含有SEQ ID NO:22的氨基酸序列的重链恒定区和含有SEQ ID NO:21的氨基酸序列的轻链恒定区。

在一个实施方案中，本发明的双特异性抗体包含与CD3特异性结合的第二Fab片段的轻链和重链，所述轻链和重链包含SEQ ID NO:157的可变轻链或其亲和力成熟变体和SEQID NO:158的可变重链或其亲和力成熟变体，以及含有SEQ ID NO:22的氨基酸序列的重链恒定区和含有SEQ ID NO:21的氨基酸序列的轻链恒定区。在这个实施方案中，亲和力成熟变体意指独立地交换SEQ ID.NO.158和/或SEQ ID.NO.157的1、2、3或4个氨基酸。

在一个实施方案中，本发明的双特异性抗体包含与CD3特异性结合的第二Fab片段的轻链和重链，所述轻链和重链包含SEQ ID NO:157的可变轻链和SEQ ID NO:158的可变重链，以及含有SEQ ID NO:22的氨基酸序列的重链恒定区和含有SEQ ID NO:21的氨基酸序列的轻链恒定区，和对肿瘤抗原(TA)特异的第一Fab片段的轻链和重链，所述轻链和重链包含如本文所述的任一实施方案中所定义的一个或多个氨基酸序列。

在一个实施方案中，本发明的双特异性抗体包含与CD3特异性结合的第二Fab片段的轻链和重链，所述轻链和重链包含SEQ ID NO:157的可变轻链或其亲和力成熟变体和SEQID NO:158的可变重链或其亲和力成熟变体，以及含有SEQ ID NO:22的氨基酸序列的重链恒定区和含有SEQ ID NO:21的氨基酸序列的轻链恒定区，和对肿瘤抗原(TA)特异的第一Fab片段的重链，所述第一Fab片段包含如本文所述的任一实施方案中所定义的一个或多个氨基酸序列。在这个实施方案中，亲和力成熟变体意指独立地交换SEQ ID.NO.158和/或SEQID.NO.157的1、2、3或4个氨基酸。

在一个实施方案中，肿瘤抗原选自黑素瘤相关的硫酸软骨素蛋白聚糖(MCSP)、表皮生长因子受体(EGFR)、癌胚抗原(CEA)、成纤维细胞活化蛋白(FAP)和CD33。在一个优选的实施方案中，肿瘤抗原是MCSP。

在一个实施方案中，活化T细胞的双特异性抗体包含对黑素瘤相关的硫酸软骨素蛋白聚糖(MCSP)特异的至少一个抗原结合位点。在另一个实施方案中，活化T细胞的双特异性抗体包含至少一个、一般两个或更多个抗原结合部分，所述抗原结合部分可以与单克隆抗体M4-3ML2(序列ID 161和162)或其亲和力成熟变体竞争与MCSP的表位结合。

在一个实施方案中，双特异性抗体包含与MCSP特异性结合的第一Fab片段的轻链和重链，其中可变重链包含SEQ ID.NO.4的CDR1、SEQ ID.NO.5的CDR2和SEQ ID.NO.6的CDR3；并且可变轻链包含SEQ ID.NO.1的CDR1、SEQ ID.NO.2的CDR2和SEQ ID.NO.3的CDR3。

在一个实施方案中，双特异性抗体包含与MCSP特异性结合的第一Fab片段的轻链和重链，其中可变重链包含SEQ ID.NO.180的CDR1、SEQ ID.NO.181的CDR2和SEQ ID.NO.6的CDR3；并且可变轻链包含SEQ ID.NO.183的CDR1、SEQ ID.NO.2的CDR2和SEQ ID.NO.184的CDR3。

在一个实施方案中，双特异性抗体包含与MCSP特异性结合的第一Fab片段的轻链和重链，其中重链可变区序列与SEQ ID.NO.14至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一；并且轻链可变区与SEQ ID.NO.13至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一。

在一个实施方案中，双特异性抗体包含与MCSP特异性结合的第一Fab片段的轻链和重链，其中重链可变区序列与SEQ ID.NO.161至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一；并且轻链可变区与SEQ ID.NO.162至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一。

在一个实施方案中，双特异性抗体包含与MCSP特异性结合的第一Fab片段的轻链和重链，其中重链可变区序列是SEQ ID.NO.161的亲和力成熟变体并且其中轻链可变区序列是SEQ ID.NO.162的亲和力成熟变体。在这个实施方案中，亲和力成熟变体意指独立地交换SEQ ID.NO.161和/或SEQ ID.NO.162的1、2、3或4个氨基酸。

在一个实施方案中，所述亲和力成熟变体包含了含有SEQ ID.NO.180的CDR1、SEQID.NO.181的CDR2和SEQ ID.NO.6的CDR3的可变重链；和含有SEQ ID.NO.183的CDR1、SEQID.NO.2的CDR2和SEQ ID.NO.184的CDR3的可变轻链。在另一个实施方案中，所述亲和力成熟变体包含SEQ ID.NO.179的重链可变区序列并且其中轻链可变区序列是SEQ ID.NO.182的亲和力成熟变体。

在一个实施方案中，双特异性抗体包含与MCSP特异性结合的第一Fab片段的轻链和重链，其中所述重链包含了含有SEQ ID NO:16的氨基酸序列的恒定区。在一个实施方案中，双特异性抗体包含与MCSP特异性结合的第一Fab片段的轻链和重链，其中所述重链包含了含有SEQ ID NO:16的氨基酸序列的恒定区，和对CD3特异的第二Fab片段的轻链和重链，所述轻链和重链包含如本文所述的任一实施方案中所定义的一个或多个氨基酸序列。

在一个实施方案中，双特异性抗体包含与MCSP特异性结合的第一Fab片段的轻链和重链，其中所述轻链包含了含有SEQ ID NO:15的氨基酸序列的恒定区。在一个实施方案中，双特异性抗体包含与MCSP特异性结合的第二抗体的轻链和重链，其中所述轻链包含了含有SEQ ID NO:15的氨基酸序列的恒定区，和对CD3特异的第二Fab片段的轻链和重链，所述轻链和重链包含如本文所述的任一实施方案中所定义的一个或多个氨基酸序列。

在一个实施方案中，双特异性抗体包含与MCSP特异性结合的第一Fab片段的轻链和重链，其中重链恒定区包含SEQ ID.NO.16的氨基酸序列；并且轻链恒定区包含SEQID.NO.15的氨基酸序列。

在一个实施方案中，双特异性抗体包含与MCSP特异性结合的第一Fab片段的轻链和重链，其中重链可变区包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列；并且轻链可变区包含SEQ IDNO:13的氨基酸序列，并且其中重链恒定区包含SEQ ID.NO.16的氨基酸序列；并且轻链恒定区包含SEQ ID.NO.15的氨基酸序列。

在一个实施方案中，本发明的双特异性抗体包含与CD3特异性结合的第二Fab片段的轻链和重链，所述轻链和重链包含SEQ ID NO:19的可变轻链和SEQ ID NO:20的可变重链，和对MCSP特异的第一Fab片段的轻链和重链，所述轻链和重链包含SEQ ID NO:13的可变轻链和SEQ ID NO:14的可变重链。

在一个实施方案中，双特异性抗体包含与MCSP特异性结合的第一Fab片段的轻链和重链，其中重链可变区包含SEQ ID NO:161的氨基酸序列；并且轻链可变区包含SEQ IDNO:162的氨基酸序列，并且其中重链恒定区包含SEQ ID.NO.16的氨基酸序列；并且轻链恒定区包含SEQ ID.NO.15的氨基酸序列。

在一个实施方案中，本发明的双特异性抗体包含与CD3特异性结合的第二Fab片段的轻链和重链，所述轻链和重链包含SEQ ID NO:19的可变轻链和SEQ ID NO:20的可变重链，和对MCSP特异的第一Fab片段的轻链和重链，所述轻链和重链包含SEQ ID NO:161的可变轻链和SEQ ID NO:162的可变重链。

在一个实施方案中，双特异性抗体包含与MCSP特异性结合的第一Fab片段的轻链和重链，其中重链可变区包含SEQ ID NO:161的氨基酸序列或其亲和力成熟变体；并且轻链可变区包含SEQ ID NO:162的氨基酸序列或其亲和力成熟变体，并且其中重链恒定区包含SEQ ID.NO.16的氨基酸序列；并且轻链恒定区包含SEQ ID.NO.15的氨基酸序列。在这个实施方案中，亲和力成熟变体意指独立地交换SEQ ID.NO.161和/或SEQ ID.NO.162的1、2、3或4个氨基酸。

在一个实施方案中，本发明的双特异性抗体包含与CD3特异性结合的第二Fab片段的轻链和重链，所述轻链和重链包含SEQ ID NO:19的可变轻链和SEQ ID NO:20的可变重链，和对MCSP特异的第一Fab片段的轻链和重链，所述轻链和重链包含SEQ ID NO:161的可变轻链或其亲和力成熟变体和SEQ ID NO:162的可变重链或其亲和力成熟变体。在这个实施方案中，亲和力成熟变体意指独立地交换SEQ ID.NO.161和/或SEQ ID.NO.162的1、2、3或4个氨基酸。

在又一个实施方案中，本发明的双特异性抗体包含与CD3特异性结合的第二Fab片段的轻链和重链，所述轻链和重链包含SEQ ID NO:158的可变轻链和SEQ ID NO:157的可变重链，和对MCSP特异的第一Fab片段的轻链和重链，所述轻链和重链包含SEQ ID NO:161的可变轻链和SEQ ID NO:162的可变重链。

在又一个实施方案中，本发明的双特异性抗体包含与CD3特异性结合的第二Fab片段的轻链和重链，所述轻链和重链包含SEQ ID NO:158的可变轻链或其亲和力成熟变体和SEQ ID NO:157的可变重链或其亲和力成熟变体，和对MCSP特异的第一Fab片段的轻链和重链，所述轻链和重链包含SEQ ID NO:161的可变轻链或其亲和力成熟变体和SEQ ID NO:162的可变重链或其亲和力成熟变体。在这个实施方案中，亲和力成熟变体意指独立地交换SEQID.NO.157、SEQ ID.NO.158、SEQ ID.NO.161和/或SEQ ID.NO.162中一个或多个序列的1、2、3或4个氨基酸。

在一个实施方案中，双特异性抗体包含第三Fab片段，所述第三Fab片段包含与MCSP特异性结合的轻链和重链，其中可变重链包含SEQ ID.NO.4的CDR1、SEQ ID.NO.5的CDR2和SEQ ID.NO.6的CDR3；并且可变轻链包含SEQ ID.NO.1的CDR1、SEQ ID.NO.2的CDR2和SEQ ID.NO.3的CDR3。

在一个实施方案中，双特异性抗体包含第三Fab片段，所述第三Fab片段包含与MCSP特异性结合的轻链和重链，其中重链可变区序列与SEQ ID.NO.14至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一；并且轻链可变区与SEQ ID.NO.13至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一。

在一个实施方案中，双特异性抗体包含第三Fab片段，所述第三Fab片段包含与MCSP特异性结合的轻链和重链，其中重链可变区序列与SEQ ID.NO.161至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一；并且轻链可变区与SEQ ID.NO.162至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一。

在一个实施方案中，双特异性抗体包含第三Fab片段，所述第三Fab片段包含与MCSP特异性结合的轻链和重链，其中重链可变区序列是SEQ ID.NO.161的亲和力成熟变体并且其中轻链可变区序列是SEQ ID.NO.162的亲和力成熟变体。在这个实施方案中，亲和力成熟变体意指独立地交换SEQ ID.NO.161和/或SEQ ID.NO.162的1、2、3或4个氨基酸。

在一个实施方案中，双特异性抗体包含第三Fab片段，所述第三Fab片段包含与MCSP特异性结合的轻链和重链，其中所述重链包含了含有SEQ ID NO:16的氨基酸序列的恒定区。在一个实施方案中，双特异性抗体包含第三Fab片段，所述第三Fab片段包含与MCSP特异性结合的轻链和重链，其中所述重链包含了含有SEQ ID NO:16的氨基酸序列的恒定区，和对CD3特异的第二Fab片段的轻链和重链，所述轻链和重链包含如本文所述的任一实施方案中所定义的一个或多个氨基酸序列，和对MCSP特异的第一Fab片段的轻链和重链，所述轻链和重链包含如本文所述的任一个实施方案中所定义的一个或多个氨基酸序列。

在一个实施方案中，双特异性抗体包含第三Fab片段，所述第三Fab片段包含与MCSP特异性结合的轻链和重链，其中所述轻链包含了含有SEQ ID NO:15的氨基酸序列的恒定区。在一个实施方案中，双特异性抗体包含与MCSP特异性结合的第二抗体的轻链和重链，其中所述轻链包含了含有SEQ ID NO:15的氨基酸序列的恒定区，和对CD3特异的第二Fab片段的轻链和重链，以及对MCSP特异的第一Fab片段的轻链和重链，所述轻链和重链包含如本文所述的任一实施方案中所定义的一个或多个氨基酸序列。

在一个实施方案中，双特异性抗体包含第三Fab片段，所述第三Fab片段包含与MCSP特异性结合的轻链和重链，其中重链恒定区包含SEQ ID.NO.16的氨基酸序列；并且轻链恒定区包含SEQ ID.NO.15的氨基酸序列。

在一个实施方案中，双特异性抗体包含第三Fab片段，所述第三Fab片段包含与MCSP特异性结合的轻链和重链，其中重链可变区包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列；并且轻链可变区包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列，并且其中重链恒定区包含SEQ ID.NO.16的氨基酸序列；并且轻链恒定区包含SEQ ID.NO.15的氨基酸序列。

在一个实施方案中，双特异性抗体包含第三Fab片段，所述第三Fab片段包含与MCSP特异性结合的轻链和重链，其中重链可变区包含SEQ ID NO:161的氨基酸序列；并且轻链可变区包含SEQ ID NO:162的氨基酸序列，并且其中重链恒定区包含SEQ ID.NO.16的氨基酸序列；并且轻链恒定区包含SEQ ID.NO.15的氨基酸序列。

在一个实施方案中，双特异性抗体包含第三Fab片段，所述第三Fab片段包含与MCSP特异性结合的轻链和重链，其中重链可变区序列是SEQ ID.NO.161的亲和力成熟变体并且其中轻链可变区序列是SEQ ID.NO.162的亲和力成熟变体，并且其中重链恒定区包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列；并且轻链恒定区包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列。在这个实施方案中，亲和力成熟变体意指独立地交换SEQ ID.NO.161和/或SEQ ID.NO.162的1、2、3或4个氨基酸。

在又一个实施方案中，本发明的双特异性抗体包含与CD3特异性结合的第二Fab片段的轻链和重链，所述轻链和重链包含SEQ ID NO:19的可变轻链和SEQ ID NO:20的可变重链，和对MCSP特异的第一Fab片段的轻链和重链，所述轻链和重链包含SEQ ID NO:13的可变轻链和SEQ ID NO:14的可变重链，和对MCSP特异的第三Fab片段的轻链和重链，所述轻链和重链包含SEQ ID NO:13的可变轻链和SEQ ID NO:14的可变重链。

在又一个实施方案中，本发明的双特异性抗体包含与CD3特异性结合的第二Fab片段的轻链和重链，所述轻链和重链包含SEQ ID NO:19的可变轻链和SEQ ID NO:20的可变重链，和对MCSP特异的第一Fab片段的轻链和重链，所述轻链和重链包含SEQ ID NO:162的可变轻链和SEQ ID NO:161的可变重链，和对MCSP特异的第三Fab片段的轻链和重链，所述轻链和重链包含SEQ ID NO:162的可变轻链和SEQ ID NO:161的可变重链。

在又一个实施方案中，本发明的双特异性抗体包含与CD3特异性结合的第二Fab片段的轻链和重链，所述轻链和重链包含SEQ ID NO:19的可变轻链和SEQ ID NO:20的可变重链，和对MCSP特异的第一Fab片段的轻链和重链，所述轻链和重链包含SEQ ID NO:162的可变轻链或其亲和力成熟变体和SEQ ID NO:161的可变重链或其亲和力成熟变体，和对MCSP特异的第三Fab片段的轻链和重链，所述轻链和重链包含SEQ ID NO:162的可变轻链或其亲和力成熟变体和SEQ ID NO:161的可变重链或其亲和力成熟变体。在这个实施方案中，亲和力成熟变体意指独立地交换SEQ ID.NO.161和/或SEQ ID.NO.162的1、2、3或4个氨基酸。

在又一个实施方案中，本发明的双特异性抗体包含与CD3特异性结合的第二Fab片段的轻链和重链，所述轻链和重链包含SEQ ID NO:157的可变轻链和SEQ ID NO:158的可变重链，和对MCSP特异的第一Fab片段的轻链和重链，所述轻链和重链包含SEQ ID NO:162的可变轻链和SEQ ID NO:161的可变重链，和对MCSP特异的第三Fab片段的轻链和重链，所述轻链和重链包含SEQ ID NO:162的可变轻链和SEQ ID NO:161的可变重链。

在又一个实施方案中，本发明的双特异性抗体包含与CD3特异性结合的第二Fab片段的轻链和重链，所述轻链和重链包含SEQ ID NO:157的可变轻链和SEQ ID NO:158的可变重链，和对MCSP特异的第一Fab片段的轻链和重链，所述轻链和重链包含SEQ ID NO:162的可变轻链或其亲和力成熟变体和SEQ ID NO:161的可变重链或其亲和力成熟变体，和对MCSP特异的第三Fab片段的轻链和重链，所述轻链和重链包含SEQ ID NO:162的可变轻链或其亲和力成熟变体和SEQ ID NO:161的可变重链或其亲和力成熟变体。在这个实施方案中，亲和力成熟变体意指独立地交换SEQ ID.NO.161和/或SEQ ID.NO.162的1、2、3或4个氨基酸。

在又一个实施方案中，所述双特异性抗体包含选自SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO.41和SEQ ID NO.43的一个或多个氨基酸序列。

在一个实施方案中，所述双特异性抗体包含SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:25、SEQ IDNO:26、SEQ ID NO:27。

在一个优选的实施方案中，所述双特异性抗体包含SEQ ID NO:163和SEQ ID NO:164。

在一个实施方案中，活化T细胞的双特异性抗体包含对表皮生长因子受体(EGFR)特异的至少一个抗原结合位点。在另一个实施方案中，活化T细胞的双特异性抗体包含至少一个、一般两个或更多个抗原结合部分，所述抗原结合部分可以与单克隆抗体GA201竞争与EGFR的表位结合。参见通过引用方式完整并入本文的PCT公开WO 2006/082515。在一个实施方案中，对EGFR特异的抗原结合位点包含SEQ ID NO:68的重链CDR1、SEQ ID NO:69的重链CDR2、SEQ ID NO:70的重链CDR3、SEQ ID NO:71的轻链CDR1、SEQ ID NO:72的轻链CDR2和SEQ ID NO:73的轻链CDR3。在又一个实施方案中，对EGFR特异的抗原结合位点包含与SEQID NO:74至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一的重链可变区序列和与SEQ ID NO:75至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一的轻链可变区序列，或其保留功能的变体。

在又一个实施方案中，双特异性抗体包含第一Fab片段，所述第一Fab片段包含对EGFR特异的抗原结合位点，所述抗原结合位点包含与SEQ ID NO:74至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一的重链可变区序列和与SEQ ID NO:75至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一的轻链可变区序列，或其保留功能的变体，和对CD3特异的第二Fab片段的轻链和重链，所述轻链和重链包含如本文所述的任一个实施方案中所定义的一个或多个氨基酸序列。

在又一个实施方案中，双特异性抗体包含第一和第三Fab片段，所述第一和第三Fab片段包含对EGFR特异的抗原结合位点，所述抗原结合位点包含与SEQ ID NO:74至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一的重链可变区序列和与SEQ IDNO:75至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一的轻链可变区序列，或其保留功能的变体，和对CD3特异的第二Fab片段的轻链和重链，所述轻链和重链包含如本文所述的任一个实施方案中所定义的一个或多个氨基酸序列。

在一个实施方案中，活化T细胞的双特异性抗体包含对成纤维细胞活化蛋白(FAP)特异的至少一个抗原结合位点。在另一个实施方案中，活化T细胞的双特异性抗体包含至少一个、一般两个或更多个抗原结合部分，所述抗原结合部分可以与单克隆抗体3F2竞争与FAP的表位结合。参见通过引用方式完整并入本文的欧洲专利申请号EP10172842.6。在一个实施方案中，对FAP特异的抗原结合位点包含SEQ ID NO:76的重链CDR1、SEQ ID NO:77的重链CDR2、SEQ ID NO:78的重链CDR3、SEQ ID NO:79的轻链CDR1、SEQ ID NO:80的轻链CDR2和SEQ ID NO:81的轻链CDR3。在又一个实施方案中，对FAP特异的抗原结合位点包含与SEQ IDNO:82至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一的重链可变区序列和与SEQ ID NO:83至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一的轻链可变区序列，或其保留功能的变体。

在又一个实施方案中，双特异性抗体包含第一Fab片段，所述第一Fab片段包含对FAP特异的抗原结合位点，所述抗原结合位点包含与SEQ ID NO:82至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一的重链可变区序列和与SEQ ID NO:83至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一的轻链可变区序列，或其保留功能的变体，和对CD3特异的第二Fab片段的轻链和重链，所述轻链和重链包含如本文所述的任一个实施方案中所定义的一个或多个氨基酸序列。

在又一个实施方案中，双特异性抗体包含第一和第三Fab片段，所述第一和第三Fab片段包含对FAP特异的抗原结合位点，所述抗原结合位点包含与SEQ ID NO:82至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一的重链可变区序列和与SEQ IDNO:83至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一的轻链可变区序列，或其保留功能的变体，和对CD3特异的第二Fab片段的轻链和重链，所述轻链和重链包含如本文所述的任一个实施方案中所定义的一个或多个氨基酸序列。

在一个实施方案中，活化T细胞的双特异性抗体包含对癌胚抗原(CEA)特异的至少一个抗原结合位点。在另一个实施方案中，活化T细胞的双特异性抗体包含至少一个、一般两个或更多个抗原结合部分，所述抗原结合部分可以与单克隆抗体CH1A1A竞争与CEA的表位结合。在一个实施方案中，活化T细胞的双特异性抗体包含至少一个、一般两个或更多个抗原结合部分，所述抗原结合部分可以与单克隆抗体CH1A1A克隆98/99(CH1A1_(98/99))竞争与CEA的表位结合。参见通过引用方式完整并入本文的PCT专利申请号PCT/EP2010/062527。在一个实施方案中，对CEA特异的抗原结合位点包含SEQ ID NO:84的重链CDR1、SEQ ID NO:85的重链CDR2、SEQ ID NO:86的重链CDR3、SEQ ID NO:87的轻链CDR1、SEQ ID NO:88的轻链CDR2和SEQ ID NO:89的轻链CDR3。在又一个实施方案中，对CEA特异的抗原结合位点包含与SEQ ID NO:90或SEQ ID NO:159至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一的重链可变区序列和与SEQ ID NO:91或SEQ ID NO:160至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一的轻链可变区序列，或其保留功能的变体。

在一个实施方案中，双特异性抗体包含与CEA特异性结合的第一Fab片段的轻链和重链，其中重链可变区包含SEQ ID NO:159的亲和力成熟变体并且轻链可变区包含SEQ IDNO:160的亲和力成熟变体。在这个实施方案中，亲和力成熟变体意指独立地交换SEQID.NO.159和/或SEQ ID.NO.160的1、2、3或4个氨基酸。

在又一个实施方案中，双特异性抗体包含第一Fab片段，所述第一Fab片段包含对CEA特异的抗原结合位点，所述抗原结合位点包含与SEQ ID NO:90至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一的重链可变区序列和与SEQ ID NO:91至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一的轻链可变区序列，或其保留功能的变体，和对CD3特异的第二Fab片段的轻链和重链，所述轻链和重链包含如本文所述的任一个实施方案中所定义的一个或多个氨基酸序列。

在又一个实施方案中，双特异性抗体包含第一Fab片段，所述第一Fab片段包含对CEA特异的抗原结合位点，所述抗原结合位点包含与SEQ ID NO:159至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一的重链可变区序列和与SEQ ID NO:160至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一的轻链可变区序列，或其保留功能的变体，和对CD3特异的第二Fab片段的轻链和重链，所述轻链和重链包含如本文所述的任一个实施方案中所定义的一个或多个氨基酸序列。

在一个实施方案中，双特异性抗体包含与CEA特异性结合的第一Fab片段的轻链和重链，其中重链可变区包含SEQ ID NO:159的亲和力成熟变体并且轻链可变区包含SEQ IDNO:160的亲和力成熟变体，和对CD3特异的第二Fab片段的轻链和重链，所述轻链和重链包含如本文所述的任一实施方案中所定义的一个或多个氨基酸序列。在这个实施方案中，亲和力成熟变体意指独立地交换SEQ ID.NO.159和/或SEQ ID.NO.160的1、2、3或4个氨基酸。

在又一个实施方案中，双特异性抗体包含第一和第三Fab片段，所述第一和第三Fab片段包含对CEA特异的抗原结合位点，所述抗原结合位点包含与SEQ ID NO:90或SEQ IDNO:159至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一的重链可变区序列和与SEQ ID NO:91或SEQ ID NO:160至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一的轻链可变区序列，或其保留功能的变体，和对CD3特异的第二Fab片段的轻链和重链，所述轻链和重链包含如本文所述的任一个实施方案中所定义的一个或多个氨基酸序列。在这个实施方案中，亲和力成熟变体意指独立地交换SEQ ID.NO.159和/或SEQID.NO.160的1、2、3或4个氨基酸。

在又一个实施方案中，双特异性抗体包含第一和第三Fab片段，所述第一和第三Fab片段包含对CEA特异的抗原结合位点，其中重链可变区包含SEQ ID NO:159的亲和力成熟变体；并且轻链可变区包含SEQ ID NO:160的亲和力成熟变体。在这个实施方案中，亲和力成熟变体意指独立地交换SEQ ID.NO.159和/或SEQ ID.NO.160的1、2、3或4个氨基酸。

在一个实施方案中，活化T细胞的双特异性抗体包含对CD33特异的至少一个抗原结合位点。在一个实施方案中，对CD33特异的抗原结合位点包含SEQ ID NO:92的重链CDR1、SEQ ID NO:93的重链CDR2、SEQ ID NO:94的重链CDR3、SEQ ID NO:95的轻链CDR1、SEQ IDNO:96的轻链CDR2和SEQ ID NO:97的轻链CDR3。在又一个实施方案中，对CD33特异的抗原结合位点包含与SEQ ID NO:98至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一的重链可变区序列和与SEQ ID NO:99至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一的轻链可变区序列，或其保留功能的变体。

在又一个实施方案中，双特异性抗体包含第一Fab片段，所述第一Fab片段包含对CD33特异的抗原结合位点，所述抗原结合位点包含与SEQ ID NO:98至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一的重链可变区序列和与SEQ ID NO:99至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一的轻链可变区序列，或其保留功能的变体，和对CD3特异的第二Fab片段的轻链和重链，所述轻链和重链包含如本文所述的任一个实施方案中所定义的一个或多个氨基酸序列。

在一个具体实施方案中，活化T细胞的双特异性抗体包含由多核苷酸序列编码的多肽序列，所述多核苷酸序列与选自SEQ ID NO:100、SEQ ID NO:101和SEQ ID NO:102的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一。

在一个实施方案中，活化T细胞的双特异性抗体包含由多核苷酸序列编码的多肽序列，所述多核苷酸序列与选自SEQ ID NO:151、SEQ ID NO.152和SEQ ID NO.153的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一。

在又一个实施方案中，所述双特异性抗体包含选自SEQ ID NO:100、SEQ ID NO:101、SEQ ID NO:151、SEQ ID NO.152和SEQ ID NO.153的一个或多个氨基酸序列。

在本发明的一个实施方案中，双特异性抗体是人源化抗体，如下文详述。

在本发明的另一个实施方案中，双特异性抗体是人抗体，如下文详述。

在一个具体实施方案中，活化T细胞的双特异性抗体包含由多核苷酸序列编码的多肽序列，所述多核苷酸序列与选自SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:46、SEQ IDNO:47、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:52、SEQ IDNO:53、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:57、SEQ ID NO:58、SEQ IDNO:59、SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:61、SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:63、SEQ ID NO:64、SEQ IDNO:65、SEQ ID NO:66和SEQ ID NO:67的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一。

在一个具体实施方案中，活化T细胞的双特异性抗体包含由多核苷酸序列编码的多肽序列，所述多核苷酸序列与选自SEQ ID NO:107、SEQ ID NO:108、SEQ ID NO:109、SEQID NO:110、SEQ ID NO:111和SEQ ID NO:112的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一。

在一个具体实施方案中，活化T细胞的双特异性抗体包含由多核苷酸序列编码的多肽序列，所述多核苷酸序列与选自SEQ ID NO:113、SEQ ID NO:114、SEQ ID NO:115、SEQID NO:116、SEQ ID NO:117、SEQ ID NO:118、SEQ ID NO:119和SEQ ID NO:120的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一。

在一个具体实施方案中，活化T细胞的双特异性抗体包含由多核苷酸序列编码的多肽序列，所述多核苷酸序列与选自SEQ ID NO:121、SEQ ID NO:122、SEQ ID NO:123、SEQID NO:124、SEQ ID NO:125、SEQ ID NO:126、SEQ ID NO:127和SEQ ID NO:128的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一。

在一个具体实施方案中，活化T细胞的双特异性抗体包含由多核苷酸序列编码的多肽序列，所述多核苷酸序列与选自SEQ ID NO:129、SEQ ID NO:130、SEQ ID NO:131、SEQID NO:132、SEQ ID NO:133、SEQ ID NO:134、SEQ ID NO:135和SEQ ID NO:136的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一。

在一个具体实施方案中，活化T细胞的双特异性抗体包含由多核苷酸序列编码的多肽序列，所述多核苷酸序列与选自SEQ ID NO:105、SEQ ID NO:106、SEQ ID NO:137、SEQID NO:138、SEQ ID NO:139、SEQ ID NO:140、SEQ ID NO:141、SEQ ID NO:142、SEQ ID NO:143、SEQ ID NO:144、SEQ ID NO:154、SEQ ID NO:155和SEQ ID NO:156的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一。

在一个具体实施方案中，活化T细胞的双特异性抗体包含由多核苷酸序列编码的多肽序列，所述多核苷酸序列与选自SEQ ID NO:165和SEQ ID NO:166的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一。

在又一个方面，根据任一个以上实施方案的双特异性抗体可以单独或以组合方式合并如下文1-5部分中所述的任一特征：

1.抗体亲和力

可以根据实施例中所述的方法，通过表面等离子体共振(SPR)，使用标准仪器如BIAcore仪(GE Healthcare)确定本文提供的双特异性抗体针对靶抗原的亲和力，并且可以通过重组表达获得受体或靶蛋白。备选地，双特异性抗体对不同受体或靶抗原的结合作用可以使用表达特定受体或靶抗原的细胞系评价，例如通过流式细胞术(FACS)评价。

在某些实施方案中，本文提供的双特异性抗体具有≤1μM、≤100nM、≤10nM、≤1nM、≤0.1nM、≤0.01nM或≤0.001nM(例如10^-8M或更小，例如从10^-8M至10^-13M，例如，从10^-9M至10^-13M)的解离常数(K_D)。

根据一个实施方案，使用表面等离子体共振测定法，使用-2000或-3000(BIAcore,Inc.,Piscataway,NJ)在25℃采用固定抗原CM5芯片以约10个响应单位(RU)，测量KD。简而言之，根据供应商说明书，以盐酸N-乙基-N'-(3-二甲氨基丙基)-碳二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)活化羧甲基化葡聚糖生物传感器芯片(CM5,BIACORE,Inc.)。抗原用10mM乙酸钠，pH 4.8稀释至5μg/ml(约0.2μM)，随后以5μl/分钟的流速上样以实现偶联蛋白的大约10个响应单位(RU)。注射抗原后，注入1M乙醇胺以封闭未反应的基团。对于动力学测量，将Fab的两倍连续稀释物(0.78nM至500nM)在25℃以大约25μl/分钟的流速注射于具有0.05％聚山梨醇酯20(Tween-20^TM)表面活性剂的PBS中(PBST)。使用简单的一对一朗格缪尔结合模型(评价软件3.2版)通过同时拟合缔合和解离传感图(sensorgram)，计算缔合速率(ka或k_on)和解离速率(kd或k_off)。将平衡解离常数(KD)计算为比率k_off/k_on。见，例如，Chen等人,J.Mol.Biol.293:865-881(1999)。如果通过以上表面等离子体共振测定法显示缔合速率超过10⁶M-1_s-1，则缔合速率可以使用荧光猝灭技术测定，其中所述的荧光猝灭技术在如光谱仪(如配备止流法(stop-flow)的分光光度计(Aviv Instruments)或具有搅拌型比色皿的8000-系列SLM-AMINCO^TM分光光度计(ThermoSpectronic))中所测量的增加浓度的抗原存在下，在25℃测量在PBS,pH 7.2中的20nM抗抗原抗体(Fab形式)的荧光发射强度(激发＝295nm；发射＝340nm，16nm带通)增加或减少。

2.嵌合和人源化抗体

在某些实施方案中，本文提供的双特异性抗体是嵌合抗体。某些嵌合抗体例如在美国专利号4,816,567；和Morrison等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81:6851-6855(1984))中描述。在一个例子中，嵌合抗体包含非人类可变区(例如，源自小鼠、大鼠、仓鼠、兔或非人灵长类如猴的可变区)和人类恒定区。在又一个例子中，嵌合抗体是“类转换”抗体，其中类或亚类已经相对亲本抗体发生改变。嵌合抗体包括其抗原结合其片段。

在某些实施方案中，嵌合抗体是人源化抗体。一般地，将非人抗体人源化以降低对人的免疫原性，同时保留亲本非人抗体的特异性和亲和力。通常，人源化抗体包含其中HVR例如CDR(或其部分)源自非人抗体并且FR(或其部分)源自人抗体序列的一个或多个可变结构域。人源化抗体任选地也将包含人恒定区的至少一部分。在一些实施方案中，将人源化抗体中的一些FR残基置换为来自非人类抗体(例如，从中衍生HVR残基的抗体)的相应残基，例如，以恢复或改善抗体特异性或亲和力。

人源化抗体和制造它们的方法综述于例如Almagro和Fransson，Front.Biosci.13:1619-1633(2008)中，并且例如还在Riechmann等人,Nature332:323-329(1988)；Queen等人,Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 86:10029-10033(1989)；美国专利号5,821,337,7,527,791,6,982,321,和7,087,409；Kashmiri等人,Methods 36:25-34(2005)(描述SDR(a-CDR)移植)；Padlan,Mol.Immunol.28:489-498(1991)(描述“表面重塑(resurfacing)”)；Dall'Acqua等人,Methods36:43-60(2005)(描述“FR改组”)；和Osbourn等人,Methods 36:61-68(2005)和Klimka等人,Br.J.Cancer,83:252-260(2000)(描述针对FR改组的“导向选择”方案)中描述。

可以用于人源化的人构架区包括但不限于：使用“最佳配合”法选择的构架区(见，例如，Sims等人,J.Immunol.151:2296(1993))；从具有特定亚组的轻链可变区或重链可变区的人抗体的共有序列衍生的构架区(见，例如，Carter等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA，89:4285(1992)；和Presta等人,J.Immunol.,151:2623(1993))；人成熟(体细胞突变)构架区或人种系构架区(见，例如，Almagro和Fransson,Front.Biosci.13:1619-1633(2008))；和从筛选FR文库衍生的构架区(见，例如，Baca等人,J.Biol.Chem.272:10678-10684(1997)和Rosok等人,J.Biol.Chem.271:22611-22618(1996))。

3.人抗体

在某些实施方案中，本文提供的双特异性抗体是人抗体。可以使用本领域已知的多种技术产生人抗体。人抗体总体上在van Dijk和van de Winkel,Curr.Opin.Pharmacol.5:368-74(2001)和Lonberg,Curr.Opin.Immunol.20:450-459(2008)中描述。

可以通过施用免疫原至转基因动物制备人抗体，其中所述转基因动物已经被修饰成响应于抗原攻击而产生完整人抗体或具有人可变区的完整抗体。这类动物一般含有替换内源免疫球蛋白基因座或在染色体外存在或随机整合入动物染色体的全部或部分人免疫球蛋白基因座。在这类转基因小鼠中，内源免疫球蛋白基因座通常已经失活。关于从转基因动物获得人抗体的方法的综述，见Lonberg,Nat.Biotech.23:1117-1125(2005)。还见，例如，描述XENOMOUSE^TM技术的美国专利号6,075,181和6,150,584；描述技术的美国专利号5,770,429；描述K-M小鼠技术的美国专利号7,041,870，和描述Veloci技术的美国专利申请公开号US 2007/0061900)。可以进一步修饰来自这类动物产生的完整抗体的人可变区，例如，通过与不同的人类恒定区组合。

也可以通过基于杂交瘤的方法产生人抗体。已经描述了用于产生人单克隆抗体的人骨髓瘤细胞系和小鼠-人杂合骨髓瘤细胞系。(见，例如，Kozbor J.Immunol.,133:3001(1984)；Brodeur等人,Monoclonal Antibody Production Techniques andApplications,第51-63页(Marcel Dekker,Inc.,New York,1987)；和Boerner等人,J.Immunol.,147:86(1991))。借助人B-细胞杂交瘤技术产生的人抗体还在Li等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA，103:3557-3562(2006)中描述。额外的方法包括例如在美国专利号7,189,826(描述从杂交瘤细胞系产生单克隆人IgM抗体)和Ni,Xiandai Mianyixue,26(4):265-268(2006)(描述人-人杂交瘤)中描述的那些。人杂交瘤技术(三体瘤技术)还在Vollmers和Brandlein,Histology and Histopathology,20(3):927-937(2005)以及Vollmers和Brandlein,Methods and Findings in Experimental and ClinicalPharmacology,27(3):185-91(2005)中描述。

也可以通过分离从人衍生的噬菌体展示文库中选择的Fv克隆可变结构域序列产生人抗体。这类可变结构域序列随后可以与所需的人恒定结构域组合。下文描述用于从抗体文库选出人抗体的技术。

4.文库衍生的抗体

可以通过对组合文库筛选具有所需活性或多种活性的抗体，分离本发明的双特异性抗体。例如，本领域已知用于产生噬菌体展示文库并对这类文库筛选拥有所需结合特征的抗体的多种方法。这类方法例如综述于Hoogenboom等人，引自Methods in MolecularBiology 178:1-37(O'Brien等人编著,Human Press,Totowa,NJ,2001)中并且例如还在McCafferty等人,Nature 348:552-554；Clackson等人,Nature 352:624-628(1991)；Marks等人,J.Mol.Biol.222:581-597(1992)；Marks和Bradbury,引自Methods in MolecularBiology248:161-175(Lo编著,Human Press,Totowa,NJ,2003)；Sidhu等人,J.Mol.Biol.338(2):299-310(2004)；Lee等人,J.Mol.Biol.340(5):1073-1093(2004)；Fellouse,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 101(34):12467-12472(2004)；和Lee等人,J.Immunol.Methods 284(1-2):119-132(2004)中描述。

在某些噬菌体展示法中，VH基因和VL基因库分别由聚合酶链反应(PCR)克隆并且在噬菌体文库中随机重组，其中随后可以对所述噬菌体文库筛选结合抗原的噬菌体，如Winter等人,Ann.Rev.Immunol.,12:433-455(1994)中所述。噬菌体一般将抗体片段展示为单链Fv(scFv)片段或展示为Fab片段。来自已免疫来源的文库提供针对免疫原的高亲和力抗体，无需构建杂交瘤。备选地，可以(例如，从人)克隆天然库以在不进行任何免疫的情况下，提供针对广泛类型非自身抗原的抗体和还针对自身抗原的抗体的单一来源，如Griffiths等人,EMBO J,12:725-734(1993)所述。最后，也可以通过从干细胞克隆未重排的V-基因区段并使用含有随机序列以编码高度可变的CDR3区并实现体外重排的PCR引物，合成地产生天然文库，如Hoogenboom和Winter,J.Mol.Biol.,227:381-388(1992)所述。描述人抗体噬菌体文库的专利公布例如包括：美国专利号5,750,373和美国专利公开号2005/0079574、2005/0119455、2005/0266000、2007/0117126、2007/0160598、2007/0237764、2007/0292936和2009/0002360。

认为从人抗体文库分离的抗体或抗体片段是本文中的人抗体或人抗体片段。

5.抗体变体

在某些实施方案中，构思了本文提供的双特异性抗体的氨基酸序列变体。例如，可能想要改善双特异性抗体的结合亲和力和/或其他生物学特性。可以通过向编码双特异性抗体的核苷酸序列引入适宜修饰或通过肽合成制备双特异性抗体的氨基酸序列变体。此类修饰包括例如，从抗体的氨基酸序列内部缺失残基和/或将残基插入所述氨基酸序列中和/或置换所述氨基酸序列中的残基。可以产生缺失、插入和置换的任意组合以获得最终构建体，只要所述最终构建体拥有想要的特征，例如抗原结合作用。

a)置换变体、插入变体和缺失变体

在某些实施方案中，提供具有一个或多个氨基酸置换的抗体变体。用于置换诱变的目的位点包括HVR和FR。表2中在“保守性置换”标题下显示保守性置换。表2中在“示例性置换”标题下显示并且参考氨基酸侧链类别如下文进一步描述更明显的变化。可以将氨基酸置换引入目的抗体中并且对产物筛选所需的活性，例如，保留/改善的抗原结合作用或降低的免疫原性。

表2

氨基酸可以根据常见的侧链特性分组：

(1)疏水性：正亮氨酸、Met、Ala、Val、Leu；Ile；

(2)中性亲水：Cys、Ser、Thr、Asn；Gln；

(3)酸性：Asp、Glu；

(4)碱性：His、Lys、Arg；

((5)影响链方向的残基：Gly、Pro；

(6)芳族：Trp、Tyr、Phe。

非保守性置换将使这些分类之一的成员交换为另一个分类的成员。

一个置换变体类型涉及置换亲本抗体(例如，人源化或人抗体)的一个或多个高变区残基。通常，经选择用于进一步研究的所得变体相对于亲本抗体在某些生物学特性方面(例如，增加的亲和力、降低的免疫原性)具有修饰(例如，改善)和/或将具有亲本抗体的基本上保留的某些生物学特性。示例性置换变体是亲和力成熟抗体，所述抗体可以例如，使用基于噬菌体展示的亲和力成熟技术如本文所述的那些技术便利地产生。简而言之，将一个或多个HVR残基突变并且将变体抗体在噬菌体上展示并筛选特定生物活性(例如结合亲和力)。

可以在HVR中做出改变(例如，置换)，例如以改善抗体亲和力。这类改变可以在HVR“热点”(即，在体细胞成熟过程期间以高频率经历突变的密码子所编码的残基(见，例如，Chowdhury,Methods Mol.Biol.207:179-196(2008))和/或SDR(a-CDR)中做出，同时对所产生的变体VH或VL测试结合亲和力。已经例如在Hoogenboom等人，引自Methods inMolecular Biology 178:1-37(O'Brien等人编著，Human Press,Totowa,NJ,(2001))中描述了通过构建次级文库并从中重新选择实现亲和力成熟。在亲和力成熟的一些实施方案中，通过多种方法(例如，易错PCR、链改组或寡核苷酸定向诱变)的任一种，将多样性引入所选择用于成熟的可变基因中。随后产生次级文库。随后筛选该文库以鉴定具有所需亲和力的任何抗体变体。另一种引入多样性的方法涉及HVR指导的方案，其中将几种HVR残基(例如，一次4-6个残基)随机分组。可以特别地鉴定参与抗原结合的HVR残基，例如，使用丙氨酸扫描法诱变或建模。特别地经常靶向CDR-H3和CDR-L3。

在某些实施方案中，置换、插入或缺失可以在一个或多个HVR内部出现，只要这类改变不实质降低抗体结合抗原的能力。例如，可以在HVR中做出不实质降低结合亲和力的保守性改变(例如，如本文中提供的保守性置换)。这类改变可以在HVR“热点”或SDR的外部。在上文提供的变体VH和VL序列的某些实施方案中，每个HVR不予改变或含有不多于一个、两个或三个氨基酸置换。

一种用于鉴定可以被靶向以便诱变的抗体残基或区域的有用方法称作“丙氨酸扫描法诱变法”，如Cunningham和Wells(1989)Science,244:1081-1085所述。在这种方法中，鉴定一个残基或靶残基组(例如，带电荷残基如arg、asp、his、lys和glu)并且用中性或带负电荷的氨基酸(例如，丙氨酸或聚丙氨酸)替换以确定该抗体与抗原的相互作用是否受影响。可以在对于初始置换显示功能敏感的氨基酸位置处引入其他置换。备选地或额外地，测定抗原-抗体复合物的晶体结构以鉴定抗体和抗原之间的接触点。可以将这类接触残基和邻近残基作为置换候选物打靶或消除。可以筛选变体以确定它们是否含有所需的特性。

氨基酸序列插入包括长度从1个残基至含有成百个或更多个残基的多肽间变动的氨基端和/或羧基端融合，以及单个或多个氨基酸残基的序列内插入。末端插入的例子包括具有N末端甲硫氨酰基残基的抗体。抗体分子的其他插入性变体包括抗体的N末端或C末端与酶(例如针对ADEPT的酶)或增加该抗体血清半寿期的多肽融合。

b)半胱氨酸工程化抗体变体

在某些实施方案中，可能想要产生半胱氨酸工程化的双特异性抗体，例如，“硫代MAb”，其中双特异性抗体的一个或多个残基用半胱氨酸残基置换。在具体的实施方案中，置换的残基出现在双特异性抗体的可及位点处。通过用半胱氨酸置换这些残基，因而将反应性巯基安置在抗体的可及位点处并且可以用来使抗体缀合至其他部分，如药物部分或接头-药物部分以产生免疫缀合物，如本文中进一步所述。在某些实施方案中，可以用半胱氨酸置换以下残基的任何一个或多个：轻链的V205(Kabat编号)和重链的A118(EU编号)。可以如美国专利号7,521,541中所述那样产生半胱氨酸工程化的抗体。

c)抗体衍生物

在某些实施方案中，可以进一步修饰本文提供的双特异性抗体以含有本领域已知并轻易可获得的额外的非蛋白质部分。适于衍生双特异性抗体的部分包括但不限于水溶性聚合物。水溶性聚合物的非限制性例子包括但不限于聚乙二醇(PEG)、乙二醇/丙二醇的共聚物、羧甲基纤维素、葡聚糖、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚1,3-二氧戊环、聚1,3,6-三烷、亚乙基/马来酐共聚物、聚氨基酸(均聚物或无规共聚物)和葡聚糖或聚(n-乙烯基吡咯烷酮)聚乙二醇、丙二醇均聚物、聚环氧丙烷/环氧乙烷共聚物、聚氧乙基化多元醇(例如，丙三醇)、聚乙烯醇和它们的混合物。聚乙二醇丙醛可以具有制造方面的优点，原因在于其在水中的稳定性。这种聚合物可以具有任何分子量，并可以是分枝或不分枝的。与抗体连接的聚合物的数目可以变动，并且如果连接多于一个聚合物，它们可以是相同或不同的分子。通常，用于衍生化的聚合物的数目和/或类型可以基于以下考虑事项确定，包括但不限于待改善的抗体特定特性或功能、抗体衍生物是否将用于限定情况下的疗法中等等。

在另一个实施方案中，提供了双特异性抗体和可以通过暴露于辐射而选择性加热的非蛋白质部分的缀合物。在一个实施方案中，非蛋白质部分是碳纳米管(Kam等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 102:11600-11605(2005))。辐射可以具有任何波长，并包括，但不限于这样的波长，所述波长不伤害普通细胞，但是使非蛋白质部加热至杀伤临近于抗体-非蛋白质部分的细胞的温度。

C.重组方法和组合物

本发明的双特异性抗体可以例如通过固态肽合成(例如Merrifield固相合成)或重组生产获得。为了重组生产，将编码双特异性抗体(片段)的一个或多个多核苷酸(例如，如上文所述)分离并插入一个或多个载体中以便进一步在宿主细胞中克隆和/或表达。使用常规方法，可以轻易地分离这种多核苷酸并将其测序。在一个实施方案中，提供包含本发明的一种或多种多核苷酸的载体，优选地表达载体。本领域技术人员熟知的方法可以用来构建表达载体，所述表达载体含有双特异性抗体(片段)的编码序列，以及适宜的转录/翻译控制信号。这些方法包括体外重组DNA技术，合成技术和体内重组/遗传重组。参见，例如在Maniatis等人,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring HarborLaboratory,N.Y.(1989)和Ausubel等人,Current Protocols in Molecular Biology,Greene Publishing Associates and Wiley Interscience,N.Y(1989)中描述的技术。表达载体可以是质粒、病毒的部分，或可以是核酸片段。表达载体包括将编码双特异性抗体(片段)的多核苷酸(即编码区)以与启动子和/或其他转录或翻译控制元件有效连接的方式克隆的表达盒。如本文所用，“编码区”是由翻译成氨基酸的密码子组成的核酸的一部分。虽然“终止密码子”(TAG、TGA或TAA)不翻译成氨基酸，但是如果存在的话，可以将它视为编码区的部分，但是任何侧翼序列，例如启动子、核糖体结合位点、转录终止子、内含子、5'和3'非翻译区等，均不是编码区的部分。两个或更多个编码区可以存在于单一多核苷酸构建体中，例如存在于单一载体上或存在于分立的多核苷酸构建体中，例如存在于分立(不同)的载体上。另外，任何载体可以含有单个编码区，或可以包含两个或更多个编码区，例如，本发明的载体可以编码一种或多种多肽，所述多肽借助蛋白酶剪切作用以翻译后方式或以共翻译方式分离成最终的蛋白质。此外，本发明的载体、多核苷酸或核酸可以编码异源编码区，所述异源编码区与编码本发明双特异性抗体(片段)的多核苷酸或变体或其衍生物融合或不融合。异源编码区包括但不限于专用元件或基序，如分泌信号肽或异源功能性结构域。有效连接是以下情况，此时基因产物(例如多肽)的编码区与一种或多种调节序列以如此方式连接，从而将基因产物的表达置于调节序列的影响或控制下。如果启动子功能的诱导导致编码所需基因产物的mRNA转录并且如果两个DNA片段之间连接的性质不干扰表达调节序列指导基因产物表达的能力或不干扰DNA模板被转录的能力，则这两个DNA片段(如多肽编码区和与之连接的启动子)是“有效连接”的。因而，如果启动子能够实现编码多肽的核酸的转录，则该启动子区与该核酸有效连接。启动子可以是指导DNA仅在预定细胞中大量转录的细胞特异性启动子。其除启动子之外的他转录控制元件，例如增强子、操纵基因、阻遏蛋白和转录终止信号，可以与多核苷酸有效连接以指导细胞特异转录。本文中公开了合适的启动子和其他转录控制区。多种转录控制区是本领域技术人员已知的。这些包括但不限于，在脊椎动物细胞中发挥功能的转录控制区，例如，但不限于，来自巨细胞病毒(例如立即早期启动子，连同内含子-A一起)、猴病毒40(例如早期启动子)和逆转录病毒(如，例如劳斯肉瘤病毒)的启动子和增强子区段。其他转录控制区包括源自脊椎动物基因如肌动蛋白、热休克蛋白、牛生长激素和兔α-珠蛋白的那些，以及能够控制真核细胞中基因表达的其他序列。额外的合适转录控制区包括组织特异性启动子和增强子以及诱导型启动子(例如四环素诱导型启动子)。类似地，多种翻译控制元件是本领域普通技术人员已知的。这些包括但不限于核糖体结合位点、翻译起始和终止密码子和源自病毒系统的元件(特别是内部核糖体进入位点，或IRES，也称作CITE序列)。表达盒也可以包括其他特征如复制起点，和/或染色体整合元件如逆转录病毒长末端重复序列(LTR)或腺相关病毒(AAV)反向末端重复序列(ITR)。

本发明的多核苷酸和核酸编码区可以与编码分泌肽或信号肽的额外编码区连接，所述分泌肽或信号肽指导由本发明多核苷酸编码的多肽分泌。例如，如果需要分泌双特异性抗原结合分子，则可以将编码信号序列的DNA置于编码本发明双特异性抗体或其片段的核酸上游。根据信号假设，由哺乳动物细胞分泌的蛋白质具有一旦已经启动正在增长的蛋白质链跨糙面内质网输出则从成熟蛋白切下的信号肽或分泌前导序列。本领域普通技术人员知晓由脊椎动物细胞分泌的多肽通常具有与多肽N末端融合的信号肽，所述信号肽从翻译的多肽被切下以产生分泌或“成熟”形式的多肽。在某些实施方案中，使用天然信号肽，例如免疫球蛋白重链或轻链的信号肽，或该序列的功能衍生物，所述功能衍生物保留指导与该序列有效连接的多肽分泌的能力。备选地，可以使用异源哺乳动物信号肽或其功能衍生物。例如，野生型前导序列可以用人组织纤维蛋白溶酶原激活物(TPA)或小鼠β-葡糖醛酸糖苷酶的前导序列替换。

可以在编码双特异性抗体(片段)的多核苷酸的内部或末端处包含编码短蛋白质序列的DNA，所述短蛋白质序列可以用来促进稍后的纯化(例如组氨酸标签)或辅助标记双特异性抗体。

在又一个实施方案中，提供了包含一种或多种本发明多核苷酸的宿主细胞。在某些实施方案中，提供了包含一种或多种本发明载体的宿主细胞。多核苷酸和载体可以分别相对于多核苷酸和载体，单独或以组合方式合并本文中所述的任一特征。在一个这样的实施方案中，宿主细胞包含载体(例如已经用所述载体转化或转染)，所述载体包含编码本发明双特异性抗体(部分)的多核苷酸。如本文所用，术语“宿主细胞”指可以工程化以产生本发明双特异性抗体或其片段的任何种类的细胞系统。适于复制和支持双特异性抗体表达的宿主细胞是本领域熟知的。根据需要，这类细胞可以用特定表达载体转染或转导，并且可以培育大量含有载体的细胞用于接种大规模发酵器以获得足够量的双特异性抗体用于临床应用。合适的宿主细胞包括原核微生物，如大肠杆菌，或各种真核细胞，如中国仓鼠卵巢细胞(CHO)、昆虫细胞等。例如，可以在细菌中产生多肽，特别是当不需要糖基化时可以在细菌中产生多肽。在表达后，可以将多肽从细菌细胞糊状物分离于可溶性级分中并且可以进一步纯化多肽。除原核生物之外，真核微生物如丝状真菌或酵母是编码多肽的载体的合适克隆宿主或表达宿主，包括其糖基化途径已经“人源化”的真菌和酵母菌株，导致产生具有部分或完全人类糖基化模式的多肽。见Gerngross,Nat Biotech 22,1409-1414(2004)和Li等人,Nat Biotech 24,210-215(2006)。用于表达(糖基化)多肽的合适宿主细胞还源自多细胞生物(无脊椎动物和脊椎动物)。无脊椎动物细胞的例子包括植物细胞和昆虫细胞。已经鉴定了可以与昆虫细胞一起使用、尤其用于转染草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)细胞的众多杆状病毒毒株。也可以利用植物细胞培养物作为宿主。见，例如美国专利号5,959,177、6,040,498、6,420,548、7,125,978和6,417,429(描述在转基因植物中产生抗体的PLANTIBODIES^TM技术)。也可以使用脊椎动物细胞作为宿主。例如，适应于悬浮培育的哺乳动物细胞系可以是有用的。有用的哺乳动物宿主细胞系的其他例子是由SV40转化的猴肾CV1系(COS-7)；人胚肾系(293或293T细胞，如Graham等人,J Gen Virol 36,59(1977)中所述那样)、幼仓鼠肾细胞(BHK)、小鼠支持细胞(如在例如Mather,Biol Reprod 23,243-251(1980)中所述的TM4细胞)、猴肾细胞(CV1)、非洲绿猴肾细胞(VERO-76)、人宫颈癌细胞(HELA)、犬肾细胞(MDCK)、布法罗大鼠肝脏细胞(BRL 3A)、人肺细胞(W138)、人肝脏细胞(Hep G2)、小鼠乳腺瘤细胞(MMT060562)、TRI细胞(如在例如Mather等人,Annals N.Y.AcadSci 383,44-68(1982中所述那样))、MRC5细胞和FS4细胞。其他有用的哺乳动物宿主细胞系包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，包括dhfr^-CHO细胞(Urlaub等人,Proc Natl Acad Sci USA77,4216(1980))；和骨髓瘤细胞系如YO、NS0、P3X63和Sp2/0。关于适于产生蛋白质的某些哺乳动物宿主细胞系的综述，参见，例如，Yazaki和Wu，Methods in Molecular Biology，第248卷(B.K.C.Lo编著，Humana Press，Totowa，NJ)，第255-268页(2003)。宿主细胞包括培养的细胞，例如，培养的哺乳动物细胞、酵母细胞、昆虫细胞、细菌细胞和植物细胞，这里仅提到数种，还包括含于转基因动物、转基因植物或培养的植物组织或动物组织内部的细胞。在一个实施方案中，宿主细胞是真核细胞，优选地是哺乳动物细胞，如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、人胚肾(HEK)细胞或淋巴样细胞(例如，Y0、NS0、Sp20细胞)。

本领域已知在这些系统中表达外来基因的标准技术。可以工程化表达包含抗原结合结构域(如抗体)的重链或轻链的多肽的细胞，目的在于还表达抗体的其他链，由此表达产物是具有重链和轻链这两者的抗体。

在一个实施方案中，提供了产生本发明双特异性抗体的方法，其中所述方法包括在适于表达双特异性抗原结合分子的条件下培养如本文中提供的宿主细胞，所述宿主细胞包含编码双特异性抗体的多核苷酸，并且从宿主细胞(或宿主细胞培养基)回收双特异性抗体。

双特异性抗体的组件以遗传方式彼此融合。可以如此设计双特异性抗体，从而其组件彼此直接融合或通过接头序列间接融合。接头的组成和长度可以根据本领域熟知的方法确定并且可以就功效进行测试。在双特异性抗体的不同组件之间的接头序列的例子存在于本文提供的序列中。如果需要，也可以包括额外的序列以并入切割位点以便分隔融合物的各种组分，例如内肽酶识别序列。

在某些实施方案中，双特异性抗体的一个或多个抗原结合部分至少包含能够结合抗原决定簇的抗体可变区。可变区可以形成天然或非天然存在的抗体及其片段的部分，并且可变区可以衍生自天然或非天然存在的抗体及其片段。产生多克隆抗体和单克隆抗体的方法是本领域熟知的(见例如Harlow和Lane，"Antibodies,a laboratory manual",ColdSpring Harbor Laboratory,1988)。非天然存在的抗体可以使用固相肽合成法构建，可以重组产生(例如，如美国专利号4,186,567中所述)，或可以例如通过筛选包含可变重链和可变轻链的组合文库获得(见例如授予McCafferty的美国专利号5,969,108)。

任何动物种类的抗体、抗体片段、抗原结合结构域或可变区可以用于本发明的双特异性抗体中。可用于本发明中的非限制性抗体、抗体片段、抗原结合结构域或可变区可以是鼠源、灵长类源或人源的。如果抗体意图用于人类，则可以使用嵌合形式的抗体，其中该抗体的恒定区来自人类。也可以根据本领域熟知的方法制备人源化或完全人形式的抗体(见例如授予Winter的美国专利号5,565,332)。人源化可以通过各种方法实现，所述方法包括但不限于(a)在保留或不保留关键构架残基(例如对保留良好抗原结合亲和力或抗体功能重要的那些残基)的情况下，将非人类(例如，供体抗体)CDR移植到人类(例如受体抗体)构架和恒定区上，(b)仅将非人类特异性决定区(SDR或a-CDR；对抗体-抗原相互作用至关重要的残基)移植到人构架和恒定区上，或(c)移植整个非人类可变结构域，但是通过更换表面残基用人样部分“掩蔽”它们。人源化抗体和制造它们的方法例如在Almagro和Fransson,Front Biosci 13,1619-1633(2008)中综述，并且例如还在Riechmann等人,Nature 332,323-329(1988)；Queen等人,Proc Natl Acad Sci USA 86,10029-10033(1989)；美国专利号5,821,337、7,527,791、6,982,321和7,087,409；Jones等人,Nature 321,522-525(1986)；Morrison等人,Proc Natl Acad Sci 81,6851-6855(1984)；Morrison和Oi,AdvImmunol 44,65-92(1988)；Verhoeyen等人,Science 239,1534-1536(1988)；Padlan,MolecImmun 31(3),169-217(1994)；Kashmiri等人,Methods 36,25-34(2005)(描述SDR(a-CDR移植)；Padlan,Mol Immunol 28,489-498(1991)(描述“表面重塑”)；Dall'Acqua等人,Methods 36,43-60(2005)(描述“FR改组”)；和Osbourn等人,Methods 36,61-68(2005)和Klimka等人,Br J Cancer 83,252-260(2000)(描述针对FR改组的“导向选择”方案)中描述。人抗体和人可变区可以使用本领域已知的多种技术产生。人抗体总体上在van Dijk和van de Winkel,Curr Opin Pharmacol 5,368-74(2001)和Lonberg,Curr Opin Immunol20,450-459(2008)中描述。人可变区可以形成通过杂交瘤方法产生的人单克隆抗体的部分，并且人可变区可以衍生自所述人单克隆抗体(见例如Monoclonal AntibodyProduction Techniques and Applications(单克隆抗体生产技术及应用)，第51-63页(Marcel Dekker,Inc.,New York,1987))。人抗体和人可变区也可以通过施用免疫原至转基因动物制备，其中所述转基因动物已经被修饰以应答于抗原攻击而产生完整人抗体或具有人可变区的完整抗体(见例如Lonberg，Nat Biotech 23,1117-1125(2005)。也可以通过分离从人衍生的噬菌体展示文库中选择的Fv克隆可变结构域序列产生人抗体和人可变区(见例如，Hoogenboom等人，引自Methods in Molecular Biology 178，1-37(O'Brien等人编著,Human Press,Totowa,NJ,2001)；和McCafferty等人,Nature 348,552-554；Clackson等人,Nature 352,624-628(1991))。噬菌体一般将抗体片段展示为单链Fv(scFv)片段或展示为Fab片段。

在某些实施方案中，根据例如在美国专利申请公开号2004/0132066中公开的方法，将本发明的双特异性抗体工程化以具有增强的结合亲和力，所述文献的完整内容因而通过引用的方式并入本文作为参考。本发明的双特异性抗体与特定抗原决定簇结合的能力可以通过酶联免疫吸附测定(ELISA)或本领域技术人员熟悉的其他技术，例如表面等离子体共振技术(在BIACORE T100系统上分析)(Liljeblad等人,Glyco J 17,323-329(2000))和传统结合测定法(Heeley，Endocr Res 28,217-229(2002))测量。竞争测定法可以用来鉴定与参考抗体竞争结合至特定抗原的抗体、抗体片段、抗原结合结构域或可变结构域，例如，与V9抗体竞争结合至CD3的抗体。在某些实施方案中，这种竞争性抗体与参考抗体结合的相同表位(例如线性表位或构象表位)结合。用于定位与抗体结合的表位的详细示例性方法在Morris(1996)“Epitope Mapping Protocols(表位定位法)”,引自Methods inMolecular Biology第66卷(Humana Press,Totowa,NJ)中提供。在示例性竞争测定法中，将固定的抗原(例如CD3)在溶液中温育，所述溶液包含与该抗原结合的第一标记抗体(例如V9抗体)和正在测试与第一抗体竞争结合至该抗原的能力的第二未标记抗体。第二抗体可以存在于杂交瘤上清液中。作为对照，将固定的抗原在包含第一标记抗体但是不包含第二未标记抗体的溶液中温育。在允许第一抗体与该抗原结合的条件下温育后，移除过多的未结合的抗体，并且测量与固定抗原结合的标记物的量。如果与固定抗原结合的标记物的量在测试样品中相对于对照样品实质降低，则这表示第二抗体正在与第一抗体竞争结合至该抗原。参见Harlow和Lane(1988)Antibodies:A Laboratory Manual第14章(Cold SpringHarbor Laboratory，Cold Spring Harbor，NY)。

如本文所述那样制备的双特异性抗体可以通过现有已知的技术如高效液相色谱、离子交换层析、凝胶电泳、亲和层析、大小排阻层析等纯化。用来纯化特定蛋白质的实际条件将部分取决于诸多因素，如净电荷、疏水性、亲水性等并且将是本领域技术人员显而易见的。对于亲和层析纯化，可以使用与双特异性抗体结合的抗体、配体、受体或抗原。例如，对于本发明双特异性抗体的亲和层析纯化，可以使用具有蛋白A或蛋白G的基质。基本上如实施例中所述，依次的蛋白A或G亲和层析和大小排阻层析可以用来分离双特异性抗体。双特异性抗体的纯度可以由多种熟知分析方法的任一种方法确定，所述熟知分析方法包括凝胶电泳、高压液相色谱等。

D.测定法

可以通过本领域已知的多种测定法，鉴定、筛选或表征本文提供的双特异性抗体的物理/化学特性和/或生物学活性。

1.结合测定法和其他测定法

在一个方面，例如，通过已知的方法如ELISA、蛋白质印迹法等，对本发明的双特异性抗体测试其抗原结合活性。

在另一个方面，竞争测定法可以用来鉴定与特定抗体竞争结合于第一或第二抗原的抗体。在某些实施方案中，这种竞争性抗体与特定抗体结合的相同表位(例如线性表位或构象表位)结合。用于定位与抗体结合的表位的详细示例性方法在Morris(1996)“EpitopeMapping Protocols(表位定位法)”,引自Methods in Molecular Biology第66卷(HumanaPress,Totowa,NJ)中提供。

2.活性测定法

在一个方面，提供了用于鉴定具有生物活性的双特异性抗体的测定法。生物活性可以包括例如裂解所靶向的细胞或诱导凋亡。还提供在体内和/或在体外具有这类生物活性的抗体。

在某些实施方案中，对本发明的双特异性抗体测试这类生物活性。用于检测细胞裂解(例如通过测量LDH释放)或凋亡(例如使用TUNEL测定法)的测定法是本领域熟知的。

E.免疫缀合物

本发明也提供了包含与一种或多种细胞毒性剂如化疗剂或药物、生长抑制剂、毒素(例如，细菌源、真菌源、植物源或动物源的蛋白质毒素、酶活性毒素)或放射性同位素缀合的本发明双特异性抗体的免疫缀合物。

在一个实施方案中，免疫缀合物是抗体-药物缀合物(ADC)，其中抗体与一种或多种药物缀合，所述药物包括但不限于类美登素(maytansinoid)(见美国专利号5,208,020，5,416,064和欧洲专利EP0 425 235B1)；澳瑞司他汀如单甲基澳瑞司他汀药物部分DE和DF(MMAE和MMAF)(见美国专利号5,635,483和5,780,588和7,498,298)；海兔毒素(dolastatin)；刺孢霉素或其衍生物(见美国专利号5,712,374,5,714,586,5,739,116,5,767,285,5,770,701,5,770,710,5,773,001和5,877,296；Hinman等人,Cancer Res.53:3336-3342(1993)；和Lode等人,Cancer Res.58:2925-2928(1998))；蒽环类如柔红霉素或多柔比星(见Kratz等人,Current Med.Chem.13:477-523(2006)；Jeffrey等人,Bioorganic&Med.Chem.Letters16:358-362(2006)；Torgov等人,Bioconj.Chem.16:717-721(2005)；Nagy等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97:829-834(2000)；Dubowchik等人,Bioorg.&Med.Chem.Letters 12:1529-1532(2002)；King等人,J.Med.Chem.45:4336-4343(2002)；和美国专利号6,630,579)；甲氨蝶呤；长春地辛；紫杉烷如多西紫杉醇、紫杉醇、larotaxel、tesetaxel和ortataxel；单端孢霉烯族化合物；和CC1065。

在另一个实施方案中，免疫缀合物包含与酶活性毒素或其片段缀合的如本文所述的双特异性抗体，所述酶活性毒素或其片段包括但不限于白喉毒素A链、白喉毒素的无结合活性片段、外毒素A链(来自铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa))、蓖麻毒蛋白A链、相思豆毒蛋白A链、蒴莲根毒蛋白A链、α-帚曲菌素、油桐(Aleurites fordii)蛋白、香石竹毒蛋白、垂序商陆(Phytolaca americana)蛋白(PAPI、PAPII和PAP-5)、苦瓜(momordicacharantia)抑制蛋白、麻疯树毒蛋白、巴豆毒蛋白、肥皂草(sapaonaria officinalis)抑制蛋白、多花白树毒蛋白、丝林霉素(mitogellin)、局限曲菌素、酚霉素、伊诺霉素和单端孢霉烯族类化合物。

在另一个实施方案中，免疫缀合物包含与放射性原子缀合以形成放射缀合物的如本文所述的双特异性抗体。多种放射性同位素可用于产生放射缀合物。例子包括At²¹¹、I¹³¹、I¹²⁵、Y⁹⁰、Re¹⁸⁶、Re¹⁸⁸、Sm¹⁵³、Bi²¹²、P³²、Pb²¹²和Lu的放射性同位素。当放射缀合物用于检测时，它可以包含用于闪烁法研究的放射性原子，例如tc^99m或I¹²³，或核磁共振(NMR)成像的自旋标记物(也称作磁共振成像，mri)，再次如碘-123、碘-131、铟-111、氟-19、碳-13、氮-15、氧-17、钆、锰或铁。

可以使用多种双官能蛋白质偶联剂产生双特异性抗体和细胞毒性剂的缀合物，所述双官能蛋白质偶联剂如N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)、4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯(SMCC)、亚氨基硫烷(IT)、亚氨酯的双官能衍生物(如己二亚氨盐酸二甲酯)、活性酯(如辛二酸二琥珀酰亚胺酯)、醛(如戊二醛)、双-叠氮化合物(如双(对-重氮盐苯甲酰基)己二胺)、双-重氮盐衍生物(如双-(对-重氮盐苯甲酰基)-乙二胺)、二异氰酸酯(如2,6-二异氰酸甲苯酯)和双活性氟化合物(如1,5-二氟-2,4-二硝基苯)。例如，可以如Vitetta等人,Science 238:1098(1987)中所述那样制备蓖麻毒蛋白免疫毒素。碳-14-标记的1-异硫氰酸根合苄基-3-甲基二乙三胺五乙酸(MX-DTPA)是用于放射性核素与抗体缀合的示例性螯合剂。见WO94/11026。接头可以是促进细胞毒性剂在细胞中释放的“可切割接头”。例如，可以使用酸不稳定接头、肽酶敏感的接头、光不稳定接头、二甲基接头或含有二硫键的接头(Chari等人,Cancer Res.52:127-131(1992)；美国专利号5,208,020)。

免疫缀合物或ADC在本文中明确地构思，但不限于采用交联剂试剂制备的这类缀合物，所述交联剂试剂包括但不限于BMPS、EMCS、GMBS、HBVS、LC-SMCC、MBS、MPBH、SBAP、SIA、SIAB、SMCC、SMPB、SMPH、磺基-EMCS、磺基-GMBS、磺基-KMUS、磺基-MBS、磺基-SIAB、磺基-SMCC、和磺基-SMPB、和可商业获得的SVSB(琥珀酰亚胺基-(4-乙烯砜)苯甲酸酯)(例如，获自PPierce Biotechnology,Inc.，Rockford，伊利诺伊州，美国)。

F.用于诊断和检测的方法和组合物

在某些实施方案中，本文提供的任一种双特异性抗体可用于检测第一和/或第二抗原在生物样品中的存在。如本文所用，术语“检测”涵盖定量性或定性检测。在某些实施方案中，生物样品包括细胞或组织。

在一个实施方案中，提供在诊断或检测方法中使用的双特异性抗体。在又一个方面，提供一种检测第一和/或第二抗原在生物样品中存在的方法。在某些实施方案中，该方法包括使生物样品与如本文所述的双特异性抗体在允许双特异性抗体与第一和/或第二抗原结合的条件下接触并且检测复合物是否在双特异性抗体和第一和/或第二抗原之间形成。这种方法可以是体外或体内方法。在一个实施方案中，将双特异性抗体用来选择对采用双特异性抗体的疗法敏感的受试者，例如其中第一和/或第二抗原是用于选择患者的生物标记物。

可以使用本发明抗体诊断的示例性病症包括癌症。

在某些实施方案中，提供了标记的双特异性抗体。标记物包括但不限于，直接检测到的标记物或部分(如荧光、发色、电子致密、化学发光和放射性的标记物)，以及间接检测到(例如借助酶促反应或分子相互作用)的部分，如酶或配体。示例性标记物包括但不限于放射性同位素³²P、¹⁴C、¹²⁵I、³H和¹³¹I、荧光团如稀土元素螯合物或荧光素及其衍生物、罗丹明及其衍生物、丹磺酰、伞形酮、萤光素酶例如萤火虫萤光素酶和细菌萤光素酶(美国专利号4,737,456)、萤光素、2,3-二氢二氮杂萘二酮、辣根过氧化物酶(HRP)、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、溶菌酶、糖氧化酶例如葡萄糖氧化酶、半乳糖氧化酶和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、杂环氧化酶如尿酸酶和黄嘌呤氧化酶，其与利用过氧化氢来氧化染料前体的酶如HRP、乳过氧化物酶或微过氧化物酶偶联，生物素/亲和素、自旋标记物、噬菌体标记物、稳定自由基等。

G.药物制剂

通过以下方式制备冻干制剂或水溶液剂形式的如本文所述的双特异性抗体的药物制剂：将具有所需纯度的这种双特异性抗体与一种或多种任选的可药用载体混合(Remington's Pharmaceutical Sciences第16版,Osol,A.编著(1980))。可药用载体总体上在所用的剂量和浓度对接受者无毒，并且包括但不限于：缓冲剂如磷酸盐、柠檬酸和其他有机酸；抗氧化剂(包括抗坏血酸和甲硫氨酸)；防腐剂(如十八烷基苄基二甲基氯化铵；六甲氯铵；苯扎氯铵、苯扎溴铵；苯酚、丁醇或苄醇；烷基尼泊金酯如尼泊金甲酯或丙酯；儿茶酚；雷琐辛；环己醇；3-戊醇和间甲酚)；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质，如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水聚合物如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其他糖类包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂如EDTA；糖如蔗糖、甘露糖、海藻糖或山梨糖；形成盐的反荷离子如钠；金属复合物(例如Zn-蛋白质复合物)和/或非离子表面活性剂如聚乙二醇(PEG)。本文中的示例性可药用载体还包括间质药物分散剂如可溶性中性活性透明质酸酶糖蛋白(sHASEGP)，例如，人可溶性PH-20透明质酸酶糖蛋白，如rHuPH20(Baxter International,Inc.)。在美国专利公开号2005/0260186和2006/0104968中描述了某些示例性sHASEGP和使用方法，包括rHuPH20。在一个方面，sHASEGP与一种或多种额外的糖胺聚糖酶如软骨素酶组合。

示例性冻干抗体制剂在美国专利号6,267,958中描述。水质抗体制剂包括在美国专利号6,171,586和WO2006/044908中描述的那些制剂，后一类制剂包含组氨酸-乙酸盐缓冲剂。

本文中的制剂也可以根据正在治疗的特定适应症需要而含有多于一种有效成分，优选地是具有并未相互不利影响的互补活性的那些有效成分。这种有效成分以有效用于预期目的的量适当地存在。

有效成分可以包埋于例如分别通过凝聚技术或界面聚合制备的微胶囊(例如，羟甲基纤维素微胶囊或明胶微胶囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊)、胶态药物递送系统(例如，脂质体、白蛋白微球体、微乳液、纳米粒子和纳米胶囊)或乳浊液中。此类技术在Remington's Pharmaceutical Sciences第16版,Osol,A.编著(1980)中公开。

可以制备持续释放制品。持续释放制品的合适例子包括含有抗体的固态疏水性聚合物半通透性基质，所述基质处于成型制品(例如薄膜或微胶囊)形式。

待用于体内施用的制剂通常是无菌的。可以例如通过借助无菌滤膜过滤轻易地实现无菌性。

H.治疗方法和组合物

本文提供的任何双特异性抗体可以用于治疗方法中。

在一个方面，提供了作为药物使用的双特异性抗体。在其他方面，提供了用于治疗癌症的双特异性抗体。在某些实施方案中，提供了用于治疗方法中的双特异性抗体。在某些实施方案中，本发明提供了双特异性抗体用于治疗患有癌症的个体的方法中，所述方法包括向个体施用有效量的双特异性抗体。在一个这种实施方案中，该方法还包括向该个体施用有效量的至少一种额外的治疗剂，例如，如下文描述。根据以上实施方案中任一个实施方案的“个体”优选地是人。

在又一个方面，本发明提供双特异性抗体在制造或制备药物中的用途。在一个实施方案中，该药物用于治疗癌症。在又一个实施方案中，该药物用于治疗癌症的方法中，所述方法包括向患有癌症的个体施用有效量的药物。在一个这种实施方案中，该方法还包括向该个体施用有效量的至少一种额外的治疗剂，例如，如下文描述。根据以上实施方案中任一个实施方案的“个体”可以是人。

在又一个方面，本发明提供用于治疗癌症的方法。在一个实施方案中，该方法包括向患有癌症的个体施用有效量的双特异性抗体。在一个这种实施方案中，该方法还包括向该个体施用有效量的至少一种额外的治疗剂，如下文描述。根据以上实施方案中任一个实施方案的“个体”可以是人。

在又一个方面，本发明提供了包含本文提供的任何双特异性抗体的药物制剂，例如，用于前述任一个治疗方法中。在一个实施方案中，药物制剂包含本文提供的任何双特异性抗体和可药用载体。在另一个实施方案中，药物制剂包含本文提供的任何双特异性抗体的和至少一种额外的治疗剂，例如，如下文描述。

本发明的双特异性抗体可以在疗法中单独或与其他药物组合使用。例如，本发明的双特异性抗体可以与至少一种额外的治疗剂共施用。

上文所示的这类联合疗法涵盖联合施用(其中在相同或独立的制剂中包含两种或更多种治疗剂)，和独立施用，在这种情况下，本发明抗体的施用可以在施用额外的治疗剂和/或辅助剂之前、同时和/或之后进行。本发明的双特异性抗体也可以与放射疗法组合使用。

本发明的双特异性抗体(和任何额外的治疗剂)可以通过任何合适的手段施用，所述的合适手段包括肠胃外、肺内和鼻内以及(如果局部治疗需要)病灶内施用。肠胃外输注包括肌内、静脉内、动脉内、腹内或皮下施用。给药可以通过任何合适的途径进行，例如通过注射，如静脉内或皮下注射，这部分地取决于施用是否为短暂或长期。本文中构思了各种给药方案，包括但不限于单次或在各种时间点多次施用、快速浓注施用和脉冲输注。

本发明的双特异性抗体将以符合良好医学实践的方式配制、定剂量和施用。在这种情况下考虑的因素包括正在治疗的具体病症、正在治疗的具体哺乳动物、个体患者的临床状况、病症原因、送递药物的部位、施用方法、施用计划和医疗执业者已知的其他因素。双特异性抗体不需要与目前用来预防或治疗所讨论病症的一种或多种药物一起配制，但是任选地与它们一起配制。这类其他药物的有效量取决于该制剂中存在的抗体的量、疾病类型或疗法和上文讨论的其他因素。这些药物通常以与本文所述相同的剂量并且采用与本文所述相同的施用途径使用，或以约1％至99％的本文所述剂量使用，或以经验地/临床上确定适宜的任何剂量和任何途径使用。

对于预防或治疗疾病，本发明双特异性抗体的适宜剂量(当单独或与一种或多种其他额外治疗剂组合使用时)将取决于待治疗疾病的类型、抗体的类型、疾病的严重性和过程，双特异性抗体是否出于预防或治疗目的施用，先前疗法、患者的临床史和对双特异性抗体的应答以及主治医师的决定。将抗体适当地按一次或经过一系列治疗施用至患者。取决于疾病的类型和严重性，约1μg/kg至15mg/kg(例如0.1mg/kg-10mg/kg)双特异性抗体可以是向患者施用的起始候选剂量，无论是否例如通过一个或多个单独施用或通过连续输注来施用。取决于上文提到的因素，一个常见的每日剂量可能是从约1μg/kg至100mg/kg或更多。对于在几日或更长时间范围内重复施用，取决于病状，治疗通常将持续直至对疾病症状的所需抑制作用出现。双特异性抗体的一个示例性剂量将处于约0.05mg/kg至约10mg/kg范围内。因此，可以向患者施用约0.5mg/kg、2.0mg/kg、4.0mg/kg或10mg/kg的一种或多种剂量(或其任意组合)。这类剂量可以间歇地施用，例如每周或每3周施用(例如从而该患者接受双特异性抗体的约2个至约20个剂量，或例如约6个剂量)。可以施用较高的初始负荷剂量，随后是一个或多个较低剂量。然而，可以使用其他剂量方案。通过常规技术和测定法容易地监测这种疗法的进程。

可以理解，前述任一种制剂或治疗方法可以使用本发明的免疫缀合物替代本发明的双特异性抗体来实施，或者可以除了使用本发明的双特异性抗体之外还使用本发明的免疫缀合物来实施。

I.制造物

在本发明的另一个方面，提供了一种制造物，所述制造物含有上文描述的可用于治疗、预防和/或诊断病症的物质。该制造物包括容器和在该容器上或与之结合的标签或包装插页。合适的容器包括例如瓶、小药瓶、注射器、静脉内输液袋等。容器可以从多种材料如玻璃或塑料形成。该容器容纳了本身或与另一种组合物组合时有效治疗、预防和/或诊断病症的组合物并且可以具有无菌接入口(例如该容器可以是静脉内输液袋或是具有皮下注射针头可穿透的瓶塞的小药瓶)。组合物中的至少一种活性物质是本发明的双特异性抗体。标签或包装插页说明该组合物用于治疗选择的病状。而且，制造物可以包含(a)其中含有组合物的第一容器，其中所述组合物包含本发明的双特异性抗体；和(b)其中含有组合物的第二容器，其中所述组合物包含其他细胞毒性剂或治疗剂。在本发明的这个实施方案中制造物还可以包含指示组合物可以用来治疗特定病状的包装插页。备选地或额外地，该制造物可以还包含第二(或第三)容器，其包含可药用缓冲剂，如抑菌注射用水(BWFI)、磷酸盐缓冲盐水、林格液和葡萄糖溶液。它可以还包括从商业和用户观点看受欢迎的其他材料，包括其他缓冲剂、稀释剂、滤器、针头和注射器。

可以理解，前述任一制造物可以包括替代本发明的双特异性抗体的本发明免疫缀合物，或可以在本发明的双特异性抗体之外还包括本发明的免疫缀合物。

III.实施例

以下是本发明的方法和组合物的例子。应当理解，鉴于上文提供的一般性描述，可以实施多种其他实施方案。

虽然已经出于清晰理解的目的，以说明和举例方式某种程度地详细描述前述发明，但是这些说明和例子不应当解释为限制本发明的范围。本文中援引的全部专利和科学文献的公开内容通过引用方式明确地完整并入本文作为参考。

实施例1:Fab(MCSP)-CrossFab(CD3)的制备

已经将所产生的重链和轻链的可变区DNA序列与预先插入相应受体哺乳动物表达载体中的恒定重链或恒定轻链按照符合可读框方式亚克隆。抗体表达受MPSV启动子驱动并且在CDS的3'末端携带合成的polyA信号序列。此外，每个载体含有EBV OriP序列。

通过使用磷酸钙转染法用该哺乳动物表达载体共转染HEK293-EBNA细胞，产生该分子。通过磷酸钙法转染指数生长的HEK293-EBNA细胞。备选地，通过聚氮丙啶转染以悬浮方式生长的HEK293-EBNA细胞。将细胞用相应的表达载体以1:1:1比率(“载体CH1-VH-CK-VH”:“载体轻链”:“载体轻链CH1-VL”)转染。

对于使用磷酸钙法的转染，在T型瓶中使用补充有10％(v/v)FCS的DMEM培养基，将细胞培育为贴壁单层培养物，并且在细胞达到50和80％汇合度时转染细胞。对于T150瓶的转染，将1500万个细胞在转染之前24小时接种于补充有FCS(终浓度10％v/v)的25ml DMEM培养基中，并且将细胞在37℃置于具有5％CO₂气氛的培养箱中过夜。对于每个待转染的T150瓶，通过混合按相应比例划分的94μg总质粒载体DNA、水至终体积469μl并混合469μl1M CaCl₂溶液，制备DNA、CaCl₂和水的溶液。向这种溶液添加938μl 50mM HEPES、280mMNaCl、1.5mM pH 7.05的Na₂HPO₄溶液，立即混合10秒并在室温静置20秒。将该悬液用补充有2％(v/v)FCS的10ml DMEM稀释并添加至T150替代现存培养基。随后添加额外的13ml转染培养基。将细胞在37℃，5％CO₂温育约17至20小时，随后将培养基替换为25ml DMEM，10％FCS。交换培养基后大约7日，通过以210xg离心15分钟收获条件培养基，将溶液无菌过滤(0.22μm滤器)，并且以终浓度0.01％(w/v)添加叠氮钠并在4℃保持。

对于使用聚氮丙啶的转染，在CD CHO培养基中以无血清悬浮方式培育HEK293EBNA细胞。为了在500ml摇瓶中生产，在转染之前24小时接种四亿个HEK293EBNA细胞。为了转染，将细胞通过210xg离心5分钟，上清液由预温的20ml CD CHO培养基替换。将表达载体混合于20ml CD CHO培养基中至最终量200μg DNA。在添加540μl PEI后，将溶液涡旋混合15秒并随后在室温温育10分钟。此后，将细胞与DNA/PEI溶液混合，转移至500ml摇瓶并在37℃在具有5％CO₂气氛的培养箱中温育3小时。在温育时间后，添加160ml F17培养基并且将细胞培育24小时。在转染后1日添加1mM丙戊酸并且添加7％Feed 1(Lonza)。在7日后，通过以210xg离心15分钟收集培养上清液用于纯化，将溶液无菌过滤(0.22μm滤器)，并且以终浓度0.01％w/v添加叠氮钠并在4℃保持。

通过使用蛋白A和蛋白G亲和层析的亲和层析，随后使用大小排阻层析步骤，从细胞培养上清液纯化分泌的蛋白。对于亲和层析，将上清液加载于连接至HiTrap蛋白G HP柱(CV＝5ml，GE Healthcare)的HiTrap蛋白A HP柱(CV＝5ml，GE Healthcare)上，每根柱用30ml 20mM磷酸钠，20mM柠檬酸钠，pH 7.5平衡。通过用6个柱体积的20mM磷酸钠，20mM柠檬酸钠，pH 7.5洗涤该柱移除未结合的蛋白质。随后，需要额外的洗涤步骤以使用至少8个柱体积的20mM磷酸钠，20mM柠檬酸钠，pH 7.5仅洗涤HiTrap蛋白G HP柱。使用步骤梯度以7个柱体积的8.8mM甲酸，pH 3.0，从HiTrap蛋白G HP柱洗脱靶蛋白。通过添加1/10的0.5M磷酸钠，pH8.0中和蛋白溶液。将靶蛋白浓缩并且过滤，之后加载于用25mM磷酸钾、125mM氯化钠、100mM pH 6.7甘氨酸溶液平衡的HiLoad Superdex 200柱(GE Healthcare)上。

通过使用基于氨基酸序列计算的摩尔消光系数，在280nm测量光密度(OD)确定纯化蛋白质样品的蛋白质浓度。在还原剂(5mM 1,4-二硫苏糖醇)存在和不存在下通过SDS-PAGE并用考马斯(来自Invitrogen的SimpleBlue^TMSafeStain)染色，分析抗体的纯度和分子量。根据制造商的说明书使用预制凝胶系统(Invitrogen，美国)(4-12％Tris-乙酸盐凝胶或4-12％Bis-Tris)。在25℃使用Superdex 20010/300GL大小排阻分析柱(GE Healthcare，瑞典)在2mM MOPS，150mM NaCl，0.02％(w/v)NaN₃，pH 7.3运行缓冲液中分析抗体样品的聚集物含量。

在图2和图3中显示示例性Fab-Crossfab分子(由三条链组成：VHCH1(MCSP)-VLCH1(CD3_V9)＝SEQ ID NO:25、VLCL(MCSP)＝SEQ ID NO:17和VHCL(CD3_V9)＝SEQ ID NO:23；取向如图1a)中所示)的产生和纯化的分析。这种分子又称作Fab(MCSP)-CrossFab(CD3)或huFab(MCSP)-CrossFab(CD3)。

实施例2：Fab(MCSP)-Fab(MCSP)-Crossfab(CD3)和Fab(MCSP)-CrossFab(CD3)-Fab(MCSP)的制备

将所产生的重链和轻链的可变区DNA序列与预先插入相应受体哺乳动物表达载体中的恒定重链或恒定轻链按照符合可读框方式亚克隆。抗体表达受MPSV启动子驱动并且在CDS的3'末端携带合成的polyA信号序列。此外，每个载体含有EBV OriP序列。

通过使用磷酸钙转染法用该哺乳动物表达载体共转染HEK293-EBNA细胞，产生该分子。通过磷酸钙法转染指数生长的HEK293-EBNA细胞。备选地，通过聚氮丙啶转染以悬浮方式生长的HEK293-EBNA细胞。将细胞用相应的表达载体以1:2:1比率(“载体CH1-VH-CH1-VH-CK-VH”:“载体轻链”:“载体轻链CH1-VL”)转染。

对于使用磷酸钙法的转染，在T型瓶中使用补充有10％(v/v)FCS的DMEM培养基，将细胞培育为贴壁单层培养物，并且在细胞达到50和80％汇合度时转染细胞。对于T150瓶的转染，将1500万个细胞在转染之前24小时接种于补充有FCS(终浓度10％v/v)的25ml DMEM培养基中，并且将细胞在37℃置于具有5％CO₂气氛的培养箱中过夜。对于每个待转染的T150瓶，通过混合按相应比例划分的94μg总质粒载体DNA、水至终体积469μl并混合469μl1M CaCl₂溶液，制备DNA、CaCl₂和水的溶液。向这种溶液添加938μl 50mM HEPES、280mMNaCl、1.5mM pH 7.05的Na₂HPO₄溶液，立即混合10秒并在室温静置20秒。将该悬液用补充有2％(v/v)FCS的10ml DMEM稀释并添加至T150替代现存培养基。随后添加额外的13ml转染培养基。将细胞在37℃，5％CO₂温育约17至20小时，随后将培养基替换为25ml DMEM，10％FCS。交换培养基后大约7日，通过以210xg离心15分钟收获条件培养基，将溶液无菌过滤(0.22μm滤器)，并且以终浓度0.01％(w/v)添加叠氮钠并在4℃保持。对于使用聚氮丙啶的转染，在CD CHO培养基中以无血清悬浮方式培育HEK293EBNA细胞。为了在500ml摇瓶中生产，在转染之前24小时接种四亿个HEK293EBNA细胞。为了转染，将细胞通过210xg离心5分钟，上清液由预温的20ml CD CHO培养基替换。将表达载体混合于20ml CD CHO培养基中至最终量200μgDNA。在添加540μl PEI后，将溶液涡旋混合15秒并随后在室温温育10分钟。此后，将细胞与DNA/PEI溶液混合，转移至500ml摇瓶并在37℃在具有5％CO₂气氛的培养箱中温育3小时。在温育时间后，添加160ml F17培养基并且将细胞培育24小时。在转染后1日添加1mM丙戊酸并且添加7％Feed 1(Lonza)。在7日后，通过以210xg离心15分钟收集培养上清液用于纯化，将溶液无菌过滤(0.22μm滤器)，并且以终浓度0.01％w/v添加叠氮钠并在4℃保持。

通过使用蛋白A和蛋白G亲和层析的亲和层析，随后使用大小排阻层析步骤，从细胞培养上清液纯化分泌的蛋白。

对于亲和层析，将上清液加载于连接至HiTrap蛋白G HP柱(CV＝5ml，GEHealthcare)的HiTrap蛋白A HP柱(CV＝5ml，GE Healthcare)上，每根柱用30ml 20mM磷酸钠，20mM柠檬酸钠，pH 7.5平衡。通过用6个柱体积的20mM磷酸钠，20mM柠檬酸钠，pH 7.5洗涤该柱移除未结合的蛋白质。随后，需要额外的洗涤步骤以使用至少8个柱体积的20mM磷酸钠，20mM柠檬酸钠，pH 7.5仅洗涤HiTrap蛋白G HP柱。使用步骤梯度以7个柱体积的8.8mM甲酸，pH 3.0，从HiTrap蛋白G HP柱洗脱靶蛋白。通过添加1/10的0.5M磷酸钠，pH8.0中和蛋白溶液。将靶蛋白浓缩并且过滤，之后加载于用25mM磷酸钾、125mM氯化钠、100mM pH 6.7甘氨酸溶液平衡的HiLoad Superdex 200柱(GE Healthcare)上。

通过使用基于氨基酸序列计算的摩尔消光系数，在280nm测量光密度(OD)确定纯化蛋白质样品的蛋白质浓度。在还原剂(5mM 1,4-二硫苏糖醇)存在和不存在下通过SDS-PAGE并用考马斯(来自Invitrogen的SimpleBlue^TMSafeStain)染色，分析抗体的纯度和分子量。根据制造商的说明书使用预制凝胶系统(Invitrogen，美国)(4-12％Tris-乙酸盐凝胶或4-12％Bis-Tris)。在25℃使用Superdex 20010/300GL大小排阻分析柱(GE Healthcare，瑞典)在2mM MOPS，150mM NaCl，0.02％(w/v)NaN₃，pH 7.3运行缓冲液中分析抗体样品的聚集物含量并且与现有技术的抗体片段(scFv)₂比较(结果见下表)。

HMW＝高分子量；LMW＝低分子量

在图4和图5中显示示例性Fab-Fab-Crossfab分子(由四条链组成：VHCH1(MCSP)-VHCH1(MCSP)-VLCH1(CD3_V9)＝SEQ ID NO:26、2条VLCL(MCSP)链＝SEQ ID NO:17和一条VHCL(CD3_V9)链＝SEQ ID NO:23；取向如图1c)中所示)的产生和纯化的分析。这种分子又称作Fab(MCSP)-Fab(MCSP)-CrossFab(CD3)或hu Fab(MCSP)-Fab(MCSP)-CrossFab(CD3)。

在图6和图7中显示示例性Fab-Crossfab-Fab分子(由四条链组成：VHCH1(MCSP)-VLCH1(CD3_V9)-VHCH1(MCSP)＝SEQ ID NO:27、2条VLCL(MCSP)链＝SEQ ID NO:17和一条VHCL(CD3_V9)链SEQ ID NO:23；取向如图1e)中所示)的产生和纯化的分析。这种分子又称作Fab(MCSP)-Fab(MCSP)-CrossFab(CD3)或hu Fab(MCSP)-Fab(MCSP)-CrossFab(CD3)。

在图8和图9中显示示例性CrossFab-Fab-Fab分子(由四条链组成：VLCH1(CD3_2C11)-VHCH1(MCSP)-VHCH1(MCSP)＝SEQ ID NO:42、2条VLCL(MCSP)链＝SEQ ID NO:17和一条VHCL(CD3_2C11)链＝SEQ ID NO:43；取向如图1d)中所示)的产生和纯化的分析。这种分子又称作鼠CrossFab(CD3)-Fab(MCSP)-Fab(MCSP)。

实施例3：Fab(CD33)-CrossFab(CD3)的制备

在图17和图18中显示示例性Fab-Crossfab分子(由三条链组成：VHCH1(CD33)-VLCH1(CD3_V9)＝SEQ ID NO:102、VLCL(CD33)＝SEQ ID NO:100和VHCL(CD3_V9)＝SEQ ID NO:23或SEQ ID NO:101；取向如图1a)中所示)的产生和纯化的分析。这种分子又称作Fab(CD33)-CrossFab(CD3)或hu Fab(CD33)-CrossFab(CD3)。

实施例4：参考分子(scFv)₂的制备

克隆和产生

将所产生的重链和轻链可变区DNA序列按照符合可读框方式亚克隆至相应的受体哺乳动物表达载体中。抗体表达受MPSV启动子驱动并且在CDS的3'末端携带合成的polyA信号序列。此外，每个载体含有EBV OriP序列。

通过使用聚氮丙啶用该哺乳动物表达载体转染HEK293-EBNA细胞，产生该分子。在CD CHO培养基中以无血清悬浮方式培育HEK293EBNA细胞。为了在500ml摇瓶中生产，在转染之前24小时接种四亿个HEK293EBNA细胞。为了转染，将细胞通过210xg离心5分钟，上清液由预温的20ml CD CHO培养基替换。将表达载体混合于20ml CD CHO培养基中至最终量200μgDNA。在添加540μl PEI后，将溶液涡旋混合15秒并随后在室温温育10分钟。此后，将细胞与DNA/PEI溶液混合，转移至500ml摇瓶并在37℃在具有5％CO₂气氛的培养箱中温育3小时。在温育时间后，添加160ml F17培养基并且将细胞培育24小时。在转染后1日添加1mM丙戊酸并且添加7％Feed 1(LONZA)。在7日后，通过以210xg离心15分钟收集培养上清液用于纯化，将溶液无菌过滤(0.22μm滤器)，并且以终浓度0.01％w/v添加叠氮钠并在4℃保持。

(scFv)₂(抗MCSP/抗huCD3)的纯化

通过使用固定金属离子亲和层析(IMAC)的亲和层析，随后使用大小排阻层析步骤，从细胞培养上清液纯化分泌的蛋白。

在第一纯化步骤之前，通过使用配备5.000MWCO膜(Sartocon Slice Cassette,Hydrosart；Sartorius)的切线流过滤系统Sarcojet(Sartorius)渗滤移除来自上清液的干扰组分。将上清液浓缩至210ml并随后稀释于中1升20mM磷酸钠，500mM氯化钠，pH 6.5中。将蛋白溶液再次浓缩至210ml。这个过程重复2次以确保彻底的缓冲液交换。

对于亲和层析，将渗滤过程的截留物质加载于用25ml 20mM磷酸钠、500mM氯化钠、15mM咪唑，pH 6.5平衡的NiNTA超流管柱(CV＝5mL，Qiagen)上。通过用至少2个柱体积的20mM磷酸钠、500mM氯化钠、15mM咪唑，pH 6.5洗涤，随后一个使用3个柱体积的20mM磷酸钠、500mM氯化钠、62.5mM咪唑，pH 6.5的额外洗涤步骤，移除未结合的蛋白质。将靶蛋白洗脱于2个柱体积的20mM磷酸钠，500mM氯化钠，125mM咪唑，pH 6.5中。随后用20mM磷酸钠，500mM氯化钠，250mM咪唑，pH 6.5洗涤柱。

将靶蛋白浓缩，随后加载于用25mM KH₂PO₄，125mM NaCl，200mM精氨酸，pH 6.7平衡的HiLoad Superdex 75柱(GE Healthcare)上。

上表中显示产率、第一纯化步骤后的聚集物含量和最终单体含量。第一纯化步骤后的聚集物含量的比较显示Fab-Crossfab构建体的优越稳定性，这与(scFv)₂是相反的。

(scFv)₂的表征

通过使用基于氨基酸序列计算的摩尔消光系数，在280nm测量光密度(OD)确定纯化蛋白质样品的蛋白质浓度。在还原剂(5mM 1,4-二硫苏糖醇)存在和不存在下通过SDS-PAGE并用考马斯(来自Invitrogen的SimpleBlue^TMSafeStain)染色，分析抗体的纯度和分子量。根据制造商的说明书使用预制凝胶系统(Invitrogen，美国)(4-12％Tris-乙酸盐凝胶或4-12％Bis-Tris)。在25℃使用Superdex 75 10/300GL大小排阻分析柱(GE Healthcare，瑞典)在2mM MOPS，150mM NaCl，0.02％(w/v)NaN₃，pH 7.3运行缓冲液中分析抗体样品的聚集物含量。

在图21中显示(scFv)₂分子的示意图。

在图22和图23中显示示例性(scFv)₂分子(抗MCSP/抗huCD3；由两条单链Fv：VL-VH(MCSP)和VH-VL(CD3_V9)＝SEQ ID NO:149组成)的产生和纯化的分析。这种分子又称作(scFv)₂(抗MCSP/抗huCD3e)。

实施例5：从PBMC分离原代人泛T细胞

通过Histopaque密度离心从富集的淋巴细胞制备物(暗黄覆盖层)制备外周血单个核细胞(PBMCs)，所述淋巴细胞制备物从本地血库或从健康人类供体的新鲜血液获得。

使用泛T细胞分离试剂盒II(Miltenyi Biotec#130-091-156)，根据制造商的说明书从PBMC富集T-细胞。简而言之，将细胞沉淀物按每1千万个细胞稀释于40μl冷缓冲液(无菌过滤的含有0.5％BSA，2mM EDTA的PBS)中并且在4℃按每1千万个细胞与10μl生物素-抗体混合物温育10分钟。

按每1千万个细胞添加30μl冷缓冲液和20μl抗生物素磁珠，并且将混合物4℃温育另外15分钟。

通过添加10-20倍的标记体积并随后以300g离心10分钟的步骤，洗涤细胞。将多达一亿个细胞重悬于500μl缓冲液中。

根据制造商的说明书，使用LS柱(Miltenyi Biotec#130-042-401)磁性分离未标记的人泛T细胞。将所得到的T细胞群体自动计数(ViCell)并于37℃，5％CO₂贮藏在培养箱中的AIM-V培养基内直至开始测试(不超过24小时)。

实施例6：从脾细胞分离鼠泛T细胞

将脾脏从C57BL/6小鼠分离，转移至含有MACS缓冲液(PBS+0.5％BSA+2mM EDTA)的GentleMACS C-管(Miltenyi Biotech#130-093-237)中并且根据制造商的说明书用GentleMACS解离器解离以获得单细胞悬液。

使细胞悬液通过预分离滤器以除去剩余的未解离的组织块。在4℃以400g离心4分钟后，添加ACK裂解缓冲液以裂解红细胞(在室温温育5分钟)。将剩余的细胞用MACS缓冲液洗涤2次，计数并用于鼠泛T细胞的分离。使用来自Miltenyi Biotec的泛T细胞分离试剂盒(#130-090-861)，按照制造商的说明书进行负向(磁性)选择。将所得到的T细胞群体自动计数(ViCell)并立即用于进一步测定。

实施例7：由靶向T细胞上的CD3和肿瘤细胞上的MCSP的交联双特异性构建体介导的再定向的T细胞细胞毒性(LDH释放测定法)

通过LDH释放测定法分析靶向人T细胞或小鼠T细胞上的CD3和肿瘤细胞上的人MCSP的双特异性构建体诱导T细胞介导的靶细胞凋亡的潜力。

简而言之，将靶细胞(人Colo-38、人MDA-MB-435、人黑素瘤MV-3或鼠B16/F10-人MCSP Fluc 2克隆48细胞(均表达人MCSP)用细胞解离缓冲液(MCSP是胰蛋白酶敏感的)或胰蛋白酶收获(并随后在此日前铺种)，洗涤并重悬在适宜细胞培养基中(见不同图的详细描述)。在圆底96孔平板中每孔铺种20000－30000个细胞并且如所示添加相应的抗体稀释物(一式三份)。添加效应细胞以获得最终E:T比率5:1(对于人泛T细胞)和10:1(对于人PBMC)。

此外，使用1-10μg/ml PHA-M(Sigma#L8902)(从菜豆(Phaseolus vulgaris)分离的同工凝集素混合物)作为促有丝分裂刺激物以诱导人或食蟹猴T细胞活化。对于鼠T细胞，使用“ConA刺激的大鼠T-Stim”(BD#354115)的5％溶液作为T细胞活化的阳性对照。

为了归一化，通过将靶细胞与终浓度1％的Triton-X-100温育实现靶细胞的最大裂解(＝100％)。最小裂解(＝0％)涉及与效应细胞共温育，但不与任何构建体或抗体共温育的靶细胞。

在37℃，5％CO₂至少18小时温育过夜后，用LDH检测试剂盒(Roche AppliedScience，#11 644 793 001)，根据制造商的说明书测量凋亡/坏死的靶细胞向上清液的LDH释放。

采用Fab(MCSP)-Crossfab(CD3)和Fab(MCSP)-Fab(MCSP)-CrossFab(CD3)双特异性构建体的LDH释放测定法

对纯化的Fab(MCSP)-Crossfab(CD3)、Fab(MCSP)-Fab(MCSP)-Crossfab(CD3)和(scFv)₂(抗MCSP/抗huCD3e)参考分子分析它们在通过使两种靶向部分均与细胞上的相应抗原结合而交联构建体时在肿瘤靶细胞中诱导T细胞介导的凋亡的潜力。简而言之，将表达huMCSP的MDA-MB-435人黑素瘤靶细胞用细胞解离缓冲液收获，洗涤并重悬于AIM-V培养基(Invitrogen#12055-091)中。在圆底96孔平板中每孔铺种30000个细胞并且以所示的浓度添加相应的抗体稀释物。将全部构建体和对照调节至相同的体积摩尔浓度。

添加人泛T效应细胞以获得最终E:T比率5:1。作为活化人泛T细胞的阳性对照，使用1μg/ml PHA-M(Sigma#L8902)。为了归一化，通过将靶细胞与终浓度1％的Triton-X-100温育确定靶细胞的最大裂解(＝100％)。最小裂解(＝0％)涉及与效应细胞共温育，但不与任何构建体或抗体共温育的靶细胞。

在37℃，5％CO₂二十小时温育过夜后，用LDH检测试剂盒(Roche AppliedScience，#11 644 793 001)，根据制造商的说明书测量凋亡/坏死的靶细胞向上清液的LDH释放。

如图10中所示，与“(scFv)₂(抗MCSP/抗huCD3e)”构建体相比，具有双价MCSP靶向作用的构建体显示可比较的细胞毒活性，而具有单价MCSP结合作用的“Fab(MCSP)-CrossFab(CD3)”构建体明显效力较小。

采用Fab(MCSP)-Fab(MCSP)-Crossfab(CD3)双特异性构建体和MDA-MB-435人黑素瘤靶细胞的LDH释放测定法

对纯化的Fab(MCSP)-Fab(MCSP)-Crossfab(CD3)和(scFv)₂(抗MCSP/抗huCD3e)参考分子分析它们在通过使两种靶向部分均与细胞上的相应抗原结合而交联构建体时在肿瘤靶细胞中诱导T细胞介导的凋亡的潜力。

简而言之，将表达huMCSP的MDA-MB-435人黑素瘤靶细胞用细胞解离缓冲液收获，洗涤并重悬于AIM-V培养基(Invitrogen#12055-091)中。在圆底96孔平板中每孔铺种30000个细胞并且以所示的浓度添加相应的抗体稀释物。将全部构建体和对照调节至相同的体积摩尔浓度。

添加人泛T效应细胞以获得最终E:T比率5:1。作为活化人泛T细胞的阳性对照，使用5μg/ml PHA-M(Sigma#L8902)。为了归一化，通过将靶细胞与终浓度1％的Triton-X-100温育确定靶细胞的最大裂解(＝100％)。最小裂解(＝0％)涉及与效应细胞共温育，但不与任何构建体或抗体共温育的靶细胞。

在37℃，5％CO₂二十一小时温育过夜后，用LDH检测试剂盒(Roche AppliedScience，#11 644 793 001)，根据制造商的说明书测量凋亡/坏死的靶细胞向上清液的LDH释放。

如图11中所示，Fab(MCSP)-Fab(MCSP)-Crossfab(CD3)至少与(scFv)₂(抗MCSP/抗huCD3e)分子可比地同样好地在靶细胞中诱导凋亡。

采用Fab(MCSP)-Fab(MCSP)-Crossfab(CD3)双特异性构建体和MV-3人黑素瘤靶细胞的LDH释放测定法

对纯化的(MCSP)-Fab(MCSP)-Crossfab(CD3)和(scFv)₂(抗MCSP/抗huCD3e)分子分析它们在通过使两种靶向部分均与细胞上的相应抗原结合而交联构建体时在肿瘤靶细胞中诱导T细胞介导的凋亡的潜力。

简而言之，在启动LDH释放测定法之前一天用胰蛋白酶收获表达huMCSP的MV-3人黑素瘤靶细胞。将细胞洗涤并重悬于适宜的细胞培养基中。在圆底96孔平板中每孔铺种30000个细胞。次日，抛弃上清液，并添加100μl/孔AIM-V培养基(Invitrogen#12055-091)以及以所示的浓度添加相应的抗体稀释物。将全部构建体和对照调节至相同的体积摩尔浓度。

添加人PBMC效应细胞以获得最终E:T比率10:1。作为活化人泛T细胞的阳性对照，使用5μg/ml PHA-M(Sigma#L8902)。为了归一化，通过将靶细胞与终浓度1％的Triton-X-100温育确定靶细胞的最大裂解(＝100％)。最小裂解(＝0％)涉及与效应细胞共温育，但不与任何构建体或抗体共温育的靶细胞。

在37℃，5％CO₂二十六小时温育过夜后，用LDH检测试剂盒(Roche AppliedScience，#11 644 793 001)，根据制造商的说明书测量凋亡/坏死的靶细胞向上清液的LDH释放。

如图12中所示，Fab(MCSP)-Fab(MCSP)-Crossfab(CD3)至少与(scFv)₂(抗MCSP/抗huCD3e)分子可比地同样好地在靶细胞中诱导凋亡。

采用Fab(MCSP)-Crossfab(CD3)双特异性构建体和MV-3人黑素瘤靶细胞的LDH释放测定法

如上文概述的那样实施LDH释放测定法。图19显示当与人PBMC(E:T比率＝10:1)共培养，用Fab(MCSP)-Crossfab(CD3)、相应的(scFv)₂(抗MCSP/抗huCD3e)参考分子处理约24小时时，对huMCSP阳性MV-3肿瘤细胞的杀伤作用。

采用鼠Crossfab(CD3)-Fab(MCSP)-Fab(MCSP)双特异性构建体的LDH释放测定法

对纯化的靶向鼠CD3以及人MCSP的鼠Crossfab(CD3)-Fab(MCSP)-Fab(MCSP)分析其在通过使两种靶向部分均与细胞上的相应抗原结合而交联构建体时在肿瘤靶细胞中诱导T细胞介导的凋亡的潜力。

简而言之，将表达huMCSP的B16/F10-huMCSP Fluc 2克隆48肿瘤靶细胞用细胞解离缓冲液收获，洗涤并重悬于包含1x NEAA，10mM Hepes，50μm2-b-ME和1mM丙酮酸钠的RPMI1640培养基中。

在圆底96孔平板中每孔铺种20 000个细胞并且以所示的浓度添加相应的抗体稀释物。将双特异性构建体和不同的IgG对照调节至相同的体积摩尔浓度。作为活化鼠T细胞的额外对照，使用以测试培养基1:160稀释的“ConA刺激的T细胞”(BD#354115)。

添加从(C57BL/6小鼠)脾细胞分离的鼠泛T效应细胞以获得最终E:T比率10:1。为了归一化，通过将靶细胞与终浓度1％的Triton-X-100温育确定靶细胞的最大裂解(＝100％)。最小裂解(＝0％)涉及与效应细胞共温育，但不与任何构建体或抗体共温育的靶细胞。

在37℃，5％CO₂温育70小时后，用LDH检测试剂盒(Roche Applied Science，#11644 793 001)，根据制造商的说明书测量凋亡/坏死的靶细胞向上清液的LDH释放。

如图13中所示，双特异性构建体诱导浓度依赖性来自靶细胞的LDH释放，它与采用“ConA刺激的T细胞”的阳性对照是可比较的。

在圆底96孔平板中每孔铺种20 000个细胞并且添加相应的抗体稀释物以获得终浓度50nM。将双特异性构建体和不同的IgG对照调节至相同的体积摩尔浓度。

添加从(C57BL/6小鼠)脾细胞分离的鼠泛T效应细胞以获得最终E:T比率10:1。为评估鼠T细胞在靶细胞不存在情况下过度活化的水平，相应地铺种具有50nM双特异性构建体和T细胞的对照孔。

为了归一化，通过将靶细胞与终浓度1％的Triton-X-100温育确定靶细胞的最大裂解(＝100％)。最小裂解(＝0％)涉及与效应细胞共温育，但不与任何构建体或抗体共温育的靶细胞。

如图14中所示，双特异性构建体诱导来自靶细胞的强烈LDH释放。在靶细胞不存在的情况下，相比于未处理的与靶细胞共温育的鼠T细胞，仅存在轻微LDH增加(反映T细胞的过度活化)。对照IgG均不诱导靶细胞的LDH释放。

实施例8：细胞因子释放测定法(CBA分析)

为了评估当T细胞在靶细胞存在或不存在下用CD3-双特异性构建体活化时不同细胞因子的从头分泌，从暗黄覆盖层分离人PBMC并且将每孔三十万个细胞铺种至圆底96孔板中。备选地，深孔96孔板的每个孔铺种280μl来自健康供体的全血。

添加肿瘤靶细胞(例如对于CD3-MCSP-双特异性构建体，添加MDA-MB-435细胞)以获得最终E/T比率10:1。如所示添加双特异性构建体和对照。在37℃，5％CO₂温育直至24小时后，将测试平板以350g离心5分钟并将上清液转移至新的深孔96孔板中用于后续分析。

根据制造商的FACS CantoII说明书，使用以下CBA Flex Set的组合进行CBA分析：人粒酶B(BD560304)、人IFN-γFlex Set(BD558269)、人TNF Flex Set(BD558273)、人IL-10Flex Set(BD558274)、人IL-6Flex Set(BD558276)、人IL-4Flex Set(BD558272)。

采用MCSP-CD3双特异性构建体的细胞因子释放测定法

对以下靶向人MCSP和人CD3的纯化的双特异性构建体分析它们在肿瘤靶细胞存在(A、B)或不存在(C、D)下诱导T细胞介导的细胞因子从头分泌的能力：“Fab(MCSP)-Fab(MCSP)-Crossfab(CD3)和(scFv)₂(抗MCSP/抗huCD3e)参考分子。

简而言之，深孔96孔板的每个孔铺种280μl来自健康供体的全血。添加30000个表达人MCSP的Colo-38肿瘤靶细胞以及以1nM终浓度添加不同的双特异性构建体和IgG对照。将细胞在37℃，5％CO2温育24小时并随后以350xg离心5分钟。将上清液转移至新的深孔96孔板用于后续分析。

图15描述不同的细胞因子水平，其中在用1nM不同的CD3-MCSP双特异性构建体(Fab(MCSP)-Fab(MCSP)-CrossFab(CD3)和(scFv)₂(抗MCSP/抗huCD3e))在Colo-38肿瘤细胞存在(A、B)或不存在(C、D)下处理后24小时后，在全血的上清液中测得所述细胞因子水平。将280μl全血铺种96孔板的每个孔并添加30000个Colo-38细胞，如所示。

在Colo-38肿瘤细胞存在下活化T细胞时分泌的主要细胞因子是IL-6，随后是IFNγ。此外，粒酶B的水平也在靶细胞存在下活化T细胞时极大地增加。通常，与其他双特异性构建体相比，(scFv)₂(抗MCSP/抗huCD3e)构建体升高TNF和IFNγ的水平，以及在靶细胞存在下(A和B)略微升高粒酶B的水平。

在靶细胞存在(或不存在)下由双特异性构建体活化T细胞时，不存在Th2细胞因子(IL-10和IL-4)的明显分泌。

在这种测定法中，还存在微弱IFNγ分泌，所述分泌由Fab(MCSP)-Fab(MCSP)-CrossFab(CD3)构建体在靶细胞不存在的情况下诱导。

采用MCSP-鼠CD3双特异性构建体的细胞因子释放测定法

通过流式细胞术对纯化的靶向huMCSP-muCD3的双特异性分子如鼠Crossfab(CD3)-Fab(MCSP)-Fab(MCSP)测试其在表达人MCSP的肿瘤细胞存在下上调CD8⁺T细胞上晚期活化标记物CD25的潜力。

简而言之，将MCSP阳性B16/F10-huMCSP Fluc 2克隆48肿瘤细胞用细胞解离缓冲液收获，计数并检查生存力。将细胞在RPMI1640培养基(包含1xNEAA，10mM Hepes，50μm 2-b-ME，1mM丙酮酸钠)中调节至0.3x10⁶个(活)细胞/ml，将100μl这种细胞悬液逐孔吸入圆底96孔板中(如所示)。将50μl(稀释的)双特异性构建体添加至含有细胞的孔以获得终浓度50nM。将人鼠T效应细胞从(C57BL/6小鼠)脾细胞分离并在AIM-V培养基中调节至3x10⁶个(活)细胞/ml。将50μl这种细胞悬液添加至测试平板的每个孔(见上文)以获得最终E:T比率10:1。为了分析双特异性构建体是否能够仅在表达huMCSP的靶细胞存在的情况下活化T细胞，测试中包括下述孔，所述孔含有50nM相应的双特异性分子以及T效应细胞，但是不含靶细胞。

在37℃，5％CO₂温育70小时后，将细胞离心(5分钟，350xg)并用150μl/孔包含0.1％BSA的PBS洗涤两次。

根据供应商的建议进行针对CD8a(大鼠IgG2a；克隆53-6.7；BioLegend#100712)和CD25(大鼠IgG2b；克隆3C7；BD#553075)的表面染色。将细胞用150μl/孔包含0.1％BSA的PBS洗涤两次并在4℃使用100μl/孔的固定缓冲液(BD##554655)固定15分钟。

在离心后，使样品重悬于200μl/孔PBS，0.1％BSA中并使用FACS CantoII仪(Software FACS Diva)分析。

图16显示鼠Crossfab(CD3)-Fab(MCSP)-Fab(MCSP)构建体仅在靶细胞存在的情况下诱导CD25上调。

实施例9：当双特异性构建体结合时原代人T细胞上表面活化标记物的表达

为检验在肿瘤靶细胞存在的情况下仅CD3双特异性构建体结合时T细胞的特异性活化，将(如上文所述分离的)原代人PBMC与所示浓度的双特异性构建体在肿瘤抗原阳性靶细胞存在或不存在下温育至少24小时。

简而言之，平底96孔板每孔铺种三十万个原代人PBMC，所述孔含有huMCSP阳性靶细胞(MV-3肿瘤细胞)或培养基。效应细胞对靶细胞(E:T)的最终比率是10:1。将细胞与所示浓度的CD3-MCSP双特异性构建体(Fab(MCSP)-Crossfab(CD3)；称为“1+1无Fc”，和(scFv)₂(抗MCSP/抗huCD3e)参考分子(称为“(scFv)₂”)在37℃，5％CO₂温育所示的温育时间。将效应细胞对CD8染色，并且通过FACS CantoII分析早期活化标记物CD69或晚期活化标记物CD25。

图20显示这个实验的结果。

实施例10：Fab-CrossFab连接的轻链(具有两个接头的Fab-Crossfab)的制备

通过使用聚氮丙啶，用哺乳动物表达载体共转染悬浮生长的HEK293-EBNA细胞，产生该分子。将细胞用相应的表达载体按1:1比例(“载体重链”:“载体连接的轻链”)转染。

在CD CHO培养基中以无血清悬浮方式培育HEK293EBNA细胞。为了在500ml摇瓶中生产，在转染之前24小时接种四亿个HEK293EBNA细胞。为了转染，将细胞通过210xg离心5分钟，上清液由预温的20ml CD CHO培养基替换。将表达载体混合于20ml CD CHO培养基中至最终量200μg DNA。在添加540μl PEI后，将溶液涡旋混合15秒并随后在室温温育10分钟。此后，将细胞与DNA/PEI溶液混合，转移至500ml摇瓶并在37℃在具有5％CO₂气氛的培养箱中温育3小时。在温育时间后，添加160ml F17培养基并且将细胞培育24小时。在转染后1日添加1mM丙戊酸并且添加7％Feed 1。在7日后，通过以210xg离心15分钟，收集培养上清液用于纯化，将溶液无菌过滤(0.22μm滤器)，并且以终浓度0.01％w/v添加叠氮钠并在4℃保持。

通过使用蛋白G亲和层析的亲和层析，随后使用大小排阻层析步骤，从细胞培养上清液纯化分泌的蛋白。

对于亲和层析，将上清液加载于用30ml 20mM磷酸钠，20mM柠檬酸钠，pH 7.5平衡的HiTrap蛋白G HP柱(CV＝5mL，GE Healthcare)上。通过用6个柱体积的20mM磷酸钠，20mM柠檬酸钠，pH 7.5洗涤该柱移除未结合的蛋白质。随后，使用至少8个柱体积的20mM磷酸钠，20mM柠檬酸钠，pH7.5，洗涤柱。使用步骤梯度以7个柱体积的8.8mM甲酸，pH 3.0，从HiTrap蛋白G HP柱洗脱靶蛋白。将蛋白质溶液直接加载于用25mM磷酸钾、125mM氯化钠、100mM pH6.7甘氨酸溶液平衡的HiLoad Superdex 200柱(GE Healthcare)上。

通过使用基于氨基酸序列计算的摩尔消光系数，在280nm测量光密度(OD)确定纯化蛋白质样品的蛋白质浓度。

在还原剂(5mM 1,4-二硫苏糖醇)存在和不存在下通过SDS-PAGE并用考马斯(来自Invitrogen的SimpleBlue^TMSafeStain)染色，分析构建体的纯度和分子量。根据制造商的说明书使用预制凝胶系统(Invitrogen，美国)(4-12％Bis-Tris)。

在25℃使用TSKgel G3000SW XL分析性大小排阻柱(Tosoh)在25mM K₂HPO₄、125mMNaCl、200mM L-精氨酸单盐酸盐、0.02％(w/v)NaN₃，pH6.7运行缓冲液中分析抗体样品的聚集物含量。最终单体含量是99.4％。

在图25中显示具有两个接头的示例性Fab-Crossfab分子(由二条链组成：VHCH1(MCSP)-(G₄S)₂-VLCH1(CD3_V9)＝SEQ ID NO:164，VLCL(MCSP)-(G₄S)₂-VHCL(CD3_V9)＝SEQ IDNO:163；取向如图24a)中所示)的产生和纯化的分析。这种分子又称作Fab(MCSP)＝Crossfab(CD3)或hu Fab(MCSP)＝Crossfab(CD3)。

Fab-CrossFab连接的轻链的热稳定性

通过动态光散射法(DLS)监测该蛋白质的热稳定性。将蛋白质浓度为1mg/ml的30μg已过滤蛋白质样品一式两份施加至Dynapro平板读数仪(Wyatt TechnologyCorporation；美国)。温度变化是以0.05℃/分钟从25℃至75℃，收集半径和总散射强度。

图28中显示结果。与(scFv)₂分子相比，分析了具有两个接头的示例性Fab-Crossfab分子(由二条链组成：VHCH1(MCSP)-(G₄S)₂-VLCH1(CD3_V9)＝SEQ ID NO:164，VLCL(MCSP)-(G₄S)₂-VHCL(CD3_V9)＝SEQ ID NO:163；取向如图24a)中所示)的热稳定性。Fab-CrossFab连接的轻链分子的聚集温度经测量处于63℃(黑线)。(scFv)₂分子劣于具有两个接头的Fab-Crossfab分子，因为它在45℃已经开始聚集(灰线)。

具有两个接头的Fab-Crossfab分子具有更高稳定性并且因此比(scFv)₂分子具有更多可开发性。

实施例11:具有两个接头的Fab-Crossfab(Fab(MCSP)＝Crossfab(CD3))的分析

从新鲜血液或暗黄覆盖层分离原代人PBMC

通过Histopaque密度离心从富集的淋巴细胞制备物(暗黄覆盖层)制备外周血单个核细胞(PBMC)，所述淋巴细胞制备物从本地血库或从健康人类供体的新鲜血液获得。简而言之，将血液用无菌PBS稀释并小心地铺在Histopaque梯度(Sigma，H8889)上。在室温以450xg离心30分钟(关闭制动)后，弃去PBMC之上含有中间相的血浆部分。将PBMC转移至新的50ml falcon管中并用PBS填充该管至50ml总体积。打开制动并且在室温以400xg离心10分钟。弃去上清液并且用无菌PBS洗涤PBMC沉淀物2次(在4℃以350xg持续10分钟的离心步骤)。

自动计数所得的PBMC群(ViCell)并在培养箱中于37℃，5％CO₂贮存在含有10％FCS和1％L-丙氨酰-L-谷氨酰胺(Biochrom，K0302)的RPMI1640培养基中直至开始分析。

当双特异性构建体结合时原代人T细胞上表面活化标记物的FACS分析

为检验在肿瘤靶细胞存在的情况下仅CD3双特异性构建体结合时T细胞的特异性活化，将原代人PBMC与所示浓度的双特异性构建体在MCSP阳性靶细胞存在或不存在下温育至少22小时。简而言之，平底96孔板每孔铺种三十万个原代人PBMC，所述孔含有MCSP阳性靶细胞(或培养基)。效应细胞对靶细胞(E:T)的最终比率是10:1。将细胞在37℃，5％CO₂与所示浓度的双特异性构建体和对照温育所示的温育时间。将效应细胞对CD8染色，并且通过FACS CantoII分析早期活化标记物CD69或晚期活化标记物CD25。

图27显示这个测定法的结果：24小时后(E:T＝10:1)在MCSP-阳性MV-3肿瘤细胞存在与不存在下，由不同CD3-MCSP双特异性构建体介导的CD4⁺和CD8⁺T细胞活化，以上调CD69中位数荧光(A)、相应的CD69阳性细胞百分数(B)来度量。

LDH释放测定法

通过LDH释放测定法分析靶向人T细胞上的CD3和肿瘤细胞上的人MCSP的双特异性构建体诱导T细胞介导的靶细胞凋亡的潜力。简而言之，在分析当日用细胞解离缓冲液(或在开始分析之前用胰蛋白酶)收获靶细胞(人Colo-38或人MV-3黑素瘤细胞)，洗涤并重悬于适宜的细胞培养基(如所示)中。在平底96孔板中每孔铺种20 000-30 000个细胞并且如所示添加相应的抗体稀释物(一式三份)。添加效应细胞以获得最终E:T比率10:1。将全部构建体和对照调节至相同的体积摩尔浓度。为了归一化，通过将靶细胞与终浓度1％的Triton-X-100温育实现靶细胞的最大裂解(＝100％)。最小裂解(＝0％)涉及与效应细胞共温育，但不与任何双特异性构建体共温育的靶细胞。在37℃，5％CO₂至少22小时温育过夜后，使用LDH检测试剂盒(Roche Applied Science，#11 644793 001)，根据制造商的说明书测量凋亡/坏死的靶细胞向上清液的LDH释放。

图26显示这个测定法的结果：用不同CD3-MCSP双特异性构建体处理约24小时，与人PBMC共培养时，对MCSP-阳性MV-3肿瘤细胞(E:T比率＝10:1)的杀伤作用(如通过LDH释放所测量)。

使用Graph Pad Prism软件确定EC₅₀值。

尽管显示并描述了本发明当前的优选实施方案，但是应当清楚理解本发明不限于此，本发明可以在以下权利要求范围内多样地体现和实施。

实施例12：抗-MCSP抗体M4-3/ML2的亲和力成熟

在通过引用的方式完整并入的欧洲专利申请EP 13156686.1中描述了亲和力成熟。

通过寡核苷酸定向诱变操作实施亲和力成熟。为此目的，将重链变体M4-3和轻链变体ML2克隆至噬菌粒载体中，与Hoogenboom(Hoogenboom等人,Nucleic Acids Res.1991,19,4133–4137)所述相似地实施。通过以下方式确定待随机化的残基：首先通过经典同源性建模产生这种抗体的3D模型并且随后确定重链和轻链的互补决定区(CDR)的溶剂可及性残基。从Ella-biotech(Munich，德国)购买如表3中所示的基于三核苷酸合成的带有随机化的寡核苷酸。通过经典的PCR生成三个独立子文库，并且它们在CDR-H1和CDR-H2中或在CDR-L1和CDR-L2中含有随机化，CDR-L3以独立方法随机化。将这些文库的DNA片段通过限制性消化和连接克隆至噬菌粒中并随后电穿孔至TG1细菌中。

文库选择

将如此产生的抗体变体以单价形式从丝状噬菌体粒子中展示为与每个粒子内部包装的M13的基因III产物的融合物。随后筛选噬菌体展示变体的生物活性(这里：结合亲和力)并且具有一种或多种改善活性的候选物用于进一步开发。用于产生噬菌体展示文库的方法可以在Lee等人,J.Mol.Biol.(2004)340,1073–1093)中找到。

根据以下操作在溶液中用全部亲和力成熟文库实施选择：1.每个亲和力成熟文库的约10¹²个噬菌粒粒子在总体积1ml中与100nM生物素酰化的hu-MCSP(D3结构域)-avi-his(SEQ ID NO.118)结合0.5小时，2.通过添加5.4×10⁷个链霉亲和素包被的磁珠维持10分钟，捕获生物素酰化的hu-MCSP(D3结构域)-avi-his和特异性结合的噬菌体粒子，3.使用5-10x 1ml PBS/Tween20和5-10x 1ml PBS洗涤所述珠，4.通过添加1ml 100mM TEA(三乙胺)持续10分钟洗脱噬菌体粒子并通过添加500ul 1M Tris/HCl pH7.4中和，以及5.再次感染指数生长的大肠杆菌TG1细菌，用辅助噬菌体VCSM13感染并随后PEG/NaCl沉淀待用于后续选择轮次的噬菌粒粒子。使用恒定或减少的(从10^-7M至2x10^-9M)抗原浓度，实施3-5轮选择。在第2轮中，使用中性亲和素平板而非是链霉亲和素珠，捕获抗原:噬菌体复合物。通过ELISA如下鉴定特异性结合物：将100ul 10nM生物素酰化的hu-MCSP(D3结构域)-avi-his/孔包被在中性亲和素平板上。添加含有Fab的细菌上清液，并且通过使用抗Flag/HRP第二抗体借助它们的Flag-标签，检测结合的Fab。ELISA阳性克隆按96孔样式用细菌表达为可溶性Fab片段，并且通过SPR分析，使用ProteOn XPR36(BioRad)，对上清液进行动力学筛选实验。鉴定到表达具有最高亲和力常数的Fab的克隆并且将相应的噬菌粒测序。

表3(总是排除Cys和Met。在寡核苷酸是反向引物的那些情况下首先排除Lys)

重链随机化仅在CDR1和CDR2中进行。轻链随机化在CDR1和CDR2中进行，并且在CDR3中独立地进行。

在选择期间，在构架中出现一些突变，如克隆G3中的F71Y或克隆E10中的Y87H。

人IgG1的产生和纯化

将亲和力成熟变体的重链和轻链的可变区DNA序列与预先插入相应接受体哺乳动物表达载体中的恒定重链或恒定轻链按照符合可读框方式亚克隆。抗体表达受MPSV启动子驱动并且在CDS的3'末端携带合成的polyA信号序列。此外，每个载体含有EBV OriP序列。

通过使用聚氮丙啶，用哺乳动物表达载体共转染HEK293-EBNA细胞，产生该分子。将细胞用相应的表达载体按1:1比例转染。为了转染，在CD CHO培养基中以无血清悬浮方式培育HEK293EBNA细胞。为了在500ml摇瓶中生产，在转染之前24小时接种四亿个HEK293EBNA细胞。为了转染，将细胞通过210xg离心5分钟，上清液由预温的20ml CD CHO培养基替换。将表达载体混合于20ml CD CHO培养基中至最终量200μg DNA。在添加540μl PEI后，将溶液涡旋混合15秒并随后在室温温育10分钟。此后，将细胞与DNA/PEI溶液混合，转移至500ml摇瓶并在37℃在具有5％CO₂气氛的培养箱中温育3小时。在温育时间后，添加160ml F17培养基并且将细胞培育24小时。在转染后1日添加1mM丙戊酸并且添加7％Feed 1。在7日后，通过以210xg离心15分钟，收集培养上清液用于纯化，将溶液无菌过滤(0.22μm滤器)，并且以终浓度0.01％w/v添加叠氮钠并在4℃保持。

通过使用蛋白A的亲和层析，从细胞培养上清液纯化分泌的蛋白。将上清液加载于用40ml 20mM磷酸钠，20mM柠檬酸钠，0.5M氯化钠，pH 7.5平衡的HiTrap蛋白A HP柱(CV＝5mL，GE Healthcare)上。通过用至少10个柱体积的20mM磷酸钠，20mM柠檬酸钠，0.5M氯化钠，pH7.5洗涤移除未结合的蛋白质。经过从20mM柠檬酸钠，0.5M氯化钠，pH 7.5至20mM柠檬酸钠，0.5M氯化钠，pH 2.5的多于20个柱体积的梯度期间洗脱靶蛋白。通过添加1/10的0.5M磷酸钠，pH8中和蛋白溶液。将靶蛋白浓缩并且过滤，之后加载于用pH 6.0，20mM组氨酸，140mM氯化钠溶液平衡的HiLoad Superdex 200柱(GE Healthcare)上。

通过使用基于氨基酸序列计算的摩尔消光系数，在280nm测量光密度(OD)确定纯化蛋白质样品的蛋白质浓度。通过CE-SDS分析在还原剂存在和不存在下分析分子的纯度和分子量。根据制造商的说明书使用Caliper LabChip GXII系统(Caliper lifescience)。2ug样品用于分析。在25℃使用TSKgel G3000SW XL分析性大小排阻柱(Tosoh)在25mMK₂HPO₄、125mM NaCl、200mM L-精氨酸单盐酸盐、0.02％(w/v)NaN₃，pH 6.7运行缓冲液中分析抗体样品的聚集物含量。

亲和力确定

ProteOn分析

在25℃使用ProteOn XPR36仪(BioRad)，通过表面等离子体共振测量KD，其中抗人F(ab’)₂片段特异性捕获抗体(Jackson ImmunoResearch#109-005-006)通过胺偶联法固定在CM5芯片上并且随后从细菌上清液或从纯化的Fab制备物捕获Fab。简而言之，根据供应商说明书，用盐酸N-乙基-N'-(3-二甲氨基丙基)-碳二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)活化羧甲基化葡聚糖生物传感器芯片(CM5,GE Healthcare)。用10mM乙酸钠，pH 5.0稀释抗人F(ab’)₂片段特异性捕获抗体为50μg/ml，之后以流速10μl/分钟注射以实现大约达10000个响应单位(RU)的偶联捕获抗体。在注射捕获抗体后，注入1M乙醇胺以封闭未反应的基团。对于动力学测量，来自细菌上清液的Fab或纯化的Fab以流速10ul/分钟注射300秒并且解离300秒以稳定捕获基线。捕获水平处于100–500RU范围内。在后续步骤中，将人MCSP(D3结构域)-avi-his分析物在25℃以流速50μl/分钟作为单一浓度或(取决于范围在100nM和250pM之间的克隆亲和力)作为稀释于HBS-EP+(GE Healthcare，10mM HEPES，150mM NaCl，3mMEDTA，0.05％表面活性剂P20，pH 7.4)中的浓度系列注射。通过以90ul/分钟注射甘氨酸pH1.5持续30秒，随后以相同流速注入NaOH持续20秒，使传感器芯的表面再生。使用简单一对一Langmuir结合模型(ProteOn XPR36评价软件或Scrubber软件(BioLogic))，通过同时拟合结合和解离传感图(sensorgram)，计算结合速率(k_on)和解离速率(k_off)。将平衡解离常数(KD)计算为koff/kon比。该数据用来确定亲和力成熟变体相对于亲本抗体的对比结合亲和力。表4a显示从这些测定法产生的数据。

对于轻链，选择G3、E10、C5转化成人IgG1样式，并且对于重链，选择D6、A7、B7、B8、C1转化成人IgG1样式。由于轻链的CDR1和CDR2独立于CDR3随机化，所以将获得的CDR在IgG转化期间组合。

在IgG样式下，重新测量针对人MCSP抗原的亲和力，此外还测量食蟹猴同源物的亲和力。

除了用从哺乳动物生产纯化的IgG之外，完全使用如对Fab片段所述的方法。

表4a：MCSP亲和力成熟的克隆：Proteon数据

使用Biacore T200通过表面等离子体共振法(SPR)确定亲和力

在25℃在Biacore T200上进行表面等离子体共振(SPR)实验以确定亲和力成熟的IgG的亲和力和亲合力，以HBS-EP作为运行缓冲液(0.01M HEPES pH7.4，0.15M NaCl，3mMEDTA，0.005％表面活性剂P20，Biacore，Freiburg/德国)。

为了分析针对人MCSP D3和食蟹猴MCSP D3的不同抗MCSP IgG相互作用的亲合力，在pH 5.0使用标准胺偶联试剂盒(Biacore，Freiburg/德国)在CM5芯片上直接偶联约9,500个共振单位(RU)的抗五His抗体(Qiagen)。在30nM以10μl/分钟分别捕获抗原60秒。使IgG以0.0064-100nM的浓度，30μl/分钟流速经280秒流过流动小室。监测解离180秒。通过扣除在参比流动小室上获得的响应，修正本体折射率差异。这里，使IgG在下述表面上流过，所述表面具有固定的抗五His抗体，但是在其上面已经注射HBS-EP而非人MCSP D3或食蟹猴MCSPD3。

为了测量亲和力，在具有固定的抗人Fc的CM5传感器芯表面上捕获IgG。通过使用标准胺偶联试剂盒(Biacore，Freiburg/德国)在pH 5.0直接固定约9,500个共振单位(RU)，将捕获的IgG与传感器芯表面偶联。在10nM以30μl/分钟捕获IgG 25秒。使人MCSP D3和食蟹猴MCSP D3以2-500nM的浓度，30μl/分钟流速经120秒流过流动小室。监测解离60秒。分别监测166nM和500nM浓度的结合和解离1200秒和600秒。通过扣除在参比流动小室上获得的响应，修正本体折射率差异。这里，使抗原在下述表面上流过，所述表面具有固定的抗人Fc抗体，但是在其上面已经注射HBS-EP而非抗MCSP IgG。

使用Biacore T200评价软件(vAA，Biacore AB，Uppsala/瑞典)推算动力学常数，以通过数值积分拟合1:1朗格缪尔结合作用的速率方程。

使用Biacore T200，通过表面等离子体共振测量证实对人MCSP D3和食蟹猴MCSPD3的亲和力更高。此外，亲合力量值显示二价结合作用增加达3倍(表4b)。

表4b.针对人MCSP-D3和食蟹猴MCSP D3的抗MCSP IgG的亲和力和亲合力。

序列

图注：GA201＝EGFR结合物，3F2＝FAP结合物，CH1A1A＝CEA结合物。蛋白质序列

蛋白质序列：人源化CD3结合物和亲和力成熟的MCSP结合物

DNA序列

Claims

1.包含至少两个Fab片段的双特异性抗体，其中

第一Fab片段包含对第一抗原特异的至少一个抗原结合位点；并且第二Fab片段包含对第二抗原特异的至少一个抗原结合位点，其中将第二Fab重链和轻链的可变区或恒定区交换；并且两个Fab片段通过两个肽接头彼此连接，并且其中所述双特异性抗体缺少Fc结构域。

2.根据权利要求1所述的双特异性抗体，其额外地包含第三Fab片段。

3.根据权利要求2所述的双特异性抗体，其中第三Fab片段包含对第一或第二抗原特异的至少一个抗原结合位点。

4.根据权利要求3所述的双特异性抗体，其中第三Fab片段包含对第一抗原特异的至少一个抗原结合位点。

5.根据权利要求2至4中任一项所述的双特异性抗体，其中第三Fab片段通过一个或两个肽接头与第一Fab片段连接。

6.根据权利要求2至4所述的双特异性抗体，其中第三Fab片段通过一个或两个肽接头与第二Fab片段连接。

7.根据权利要求1至6中任一项所述的双特异性抗体，其中第一Fab片段包含对肿瘤抗原特异的至少一个抗原结合位点；并且第二Fab片段包含对T细胞活化抗原特异的至少一个抗原结合位点。

8.根据权利要求7所述的双特异性抗体，其中T细胞活化抗原是CD3T细胞共同受体(CD3)抗原。

9.根据权利要求7或8所述的双特异性抗体，其中肿瘤抗原选自黑素瘤相关的硫酸软骨素蛋白聚糖(MCSP)、表皮生长因子受体(EGFR)、癌胚抗原(CEA)、成纤维细胞活化蛋白(FAP)和CD33。

10.根据权利要求9所述的双特异性抗体，其中肿瘤抗原是MCSP。

11.药物组合物，其包含根据权利要求1至10所述的双特异性抗体。

12.根据权利要求1至10所述的双特异性抗体，用于治疗癌症。

13.根据权利要求1至10所述的双特异性抗体，用作药物。

14.根据权利要求1至10所述的双特异性抗体的用途，用于制造药物。

15.根据权利要求14所述的用途，其中药物用于治疗癌症。

16.原核或真核宿主细胞，其包含含有编码权利要求1至10中任一项所述的双特异性抗体的轻链和重链的核酸分子的载体。

17.产生抗体的方法，包括培养权利要求16所述的宿主细胞，从而产生所述抗体。