HK1208045B - Crispr-cas component systems, methods and compositions for sequence manipulation - Google Patents

Claims (16)

1. Procédé pour la sélection d'une ou de plusieurs cellules procaryotes par l'introduction d'une ou de plusieurs mutations dans une ou plusieurs cellules procaryotes, le procédé consistant à:

   introduire un ou plusieurs vecteurs dans la ou les cellules procaryotes;

   dans lequel les un ou plusieurs vecteurs conduisent l'expression d'une ou de plusieurs parmi: une enzyme CRISPR, une séquence de guidage liée à une séquence d'appariement de tracr, une séquence tracr et une matrice d'édition pour une recombinaison dans un locus chromosomique ciblé comprenant un polynucléotide cible;

   et la totalité parmi une enzyme CRISPR, une séquence de guidage liée à une séquence d'appariement de tracr et une séquence tracr et une matrice d'édition est produite dans la ou les cellules procaryotes;

   introduire la matrice d'édition dans un polynucléotide cible par une recombinaison, dans lequel la matrice d'édition comprend les une ou plusieurs mutations du polynucléotide cible qui modifient soit la séquence de motif adjacent au protoespaceur (PAM), soit la séquence du protoespaceur et qui abolissent le clivage de l'enzyme CRISPR du polynucléotide cible;

   permettre à un complexe CRISPR de se lier au polynucléotide cible pour effectuer le clivage du polynucléotide cible;

   dans lequel le complexe CRISPR comprend l'enzyme CRISPR complexée avec (1) la séquence de guidage qui est hybridée à une séquence cible dans le polynucléotide cible et (2) la séquence d'appariement de tracr qui est hybridée à une séquence tracr;

   dans lequel le clivage du polynucléotide cible par le complexe CRISPR induit une mort cellulaire;

   permettre ainsi à une ou plusieurs cellules procaryotes dans lesquelles une ou plusieurs mutations ont été introduites d'être sélectionnées.
2. Procédé pour la génération d'une mutation ou de multiples mutations dans une ou plusieurs cellules procaryotes par l'introduction de la mutation ou des multiples mutations dans une ou plusieurs cellules procaryotes, consistant à:

   A. générer une mutation dans une ou plusieurs cellules procaryotes par l'introduction de la mutation dans une ou plusieurs cellules procaryotes, par un procédé consistant à:

   introduire un ou plusieurs vecteurs dans la ou les cellules procaryotes;

   dans lequel les un ou plusieurs vecteurs conduisent l'expression d'une ou de plusieurs parmi: une enzyme CRISPR, une séquence de guidage liée à une séquence d'appariement de tracr, une séquence tracr et une matrice d'édition;

   et la totalité parmi une enzyme CRISPR, une séquence de guidage liée à une séquence d'appariement de tracr et une séquence tracr et une matrice d'édition est produite dans la ou les cellules procaryotes;

   permettre à un complexe CRISPR de se lier à un locus chromosomique ciblé comprenant un polynucléotide cible pour effectuer le clivage du polynucléotide cible, en conséquence de quoi la matrice d'édition comprenant la mutation est introduite par une recombinaison dans les un ou plusieurs procaryotes; et

   dans lequel le complexe CRISPR comprend l'enzyme CRISPR complexée avec (1) la séquence de guidage qui est hybridée à une séquence cible dans le polynucléotide cible et (2) la séquence d'appariement de tracr qui est hybridée à une séquence tracr;

   générant ainsi une ou plusieurs cellules procaryotes dans lesquelles la mutation a été introduite; ou

   B. générer de multiples mutations dans une ou plusieurs cellules procaryotes par l'introduction des multiples mutations dans une ou plusieurs cellules procaryotes, par un procédé consistant à:

   introduire un ou plusieurs vecteurs dans la ou les cellules procaryotes;

   dans lequel les un ou plusieurs vecteurs conduisent l'expression d'une ou de plusieurs parmi: une enzyme CRISPR, une séquence de guidage liée à une séquence d'appariement de tracr, une séquence tracr et une matrice d'édition;

   et la totalité parmi une enzyme CRISPR, une séquence de guidage liée à une séquence d'appariement de tracr et une séquence tracr et une matrice d'édition est produite dans la ou les cellules procaryotes;

   permettre à un complexe CRISPR de se lier à un locus chromosomique ciblé comprenant un polynucléotide cible pour effectuer le clivage du polynucléotide cible, en conséquence de quoi la matrice d'édition comprenant les multiples mutations est introduite par une recombinaison dans les un ou plusieurs procaryotes; et

   dans lequel le complexe CRISPR comprend l'enzyme CRISPR complexée avec (1) la séquence de guidage qui est hybridée à une séquence cible dans le polynucléotide cible et (2) la séquence d'appariement de tracr qui est hybridée à une séquence tracr;

   générant ainsi une ou plusieurs cellules procaryotes dans lesquelles de multiples mutations ont été introduites; ou

   C. générer de multiples mutations dans une ou plusieurs cellules procaryotes par l'introduction des multiples mutations dans une ou plusieurs cellules procaryotes, par un procédé consistant à:

   introduire un ou plusieurs vecteurs dans la ou les cellules procaryotes;

   dans lequel les un ou plusieurs vecteurs conduisent l'expression d'une ou de plusieurs parmi: une enzyme CRISPR, une séquence de guidage liée à une séquence d'appariement de tracr, une séquence tracr et une matrice d'édition;

   et la totalité parmi une enzyme CRISPR, une séquence de guidage liée à une séquence d'appariement de tracr et une séquence tracr et une matrice d'édition est produite dans la ou les cellules procaryotes;

   permettre à un complexe CRISPR de se lier à un locus chromosomique ciblé comprenant un polynucléotide cible pour effectuer le clivage du polynucléotide cible, en conséquence de quoi la matrice d'édition comprenant une première mutation est introduite par une recombinaison dans les un ou plusieurs procaryotes; et

   dans lequel le complexe CRISPR comprend l'enzyme CRISPR complexée avec (1) la séquence de guidage qui est hybridée à une séquence cible dans le polynucléotide cible et (2) la séquence d'appariement de tracr qui est hybridée à une séquence tracr;

   générant ainsi une ou plusieurs cellules procaryotes dans lesquelles la première mutation a été introduite; introduire un ou plusieurs vecteurs dans la ou les cellules procaryotes possédant la première mutation; dans lequel les un ou plusieurs vecteurs conduisent l'expression d'une ou de plusieurs parmi: une enzyme CRISPR, une séquence de guidage liée à une séquence d'appariement de tracr, une séquence tracr et une matrice d'édition; et la totalité parmi une enzyme CRISPR, une séquence de guidage liée à une séquence d'appariement de tracr et une séquence tracr et une matrice d'édition est produite dans la ou les cellules procaryotes; permettre à un complexe CRISPR de se lier à un locus chromosomique ciblé comprenant un polynucléotide cible pour effectuer le clivage du polynucléotide cible, en conséquence de quoi la matrice d'édition comprenant une deuxième mutation est introduite par une recombinaison dans les un ou plusieurs procaryotes; et dans lequel le complexe CRISPR comprend l'enzyme CRISPR complexée avec (1) la séquence de guidage qui est hybridée à une séquence cible dans le polynucléotide cible et (2) la séquence d'appariement de tracr qui est hybridée à une séquence tracr; générant ainsi une ou plusieurs cellules procaryotes dans lesquelles la première et la deuxième mutation ont été introduites.
3. Procédé selon la revendication 1 ou 2, dans lequel l'enzyme CRISPR est une enzyme du système CRISPR de type II.
4. Procédé selon la revendication 1 ou 2, dans lequel l'enzyme CRISPR est Cas9.
5. Procédé selon la revendication 4, dans lequel la Cas9 est une Cas9 de S. pyogenes.
6. Procédé selon la revendication 1 ou 2, dans lequel l'enzyme CRISPR n'est pas endogène au ou aux procaryotes.
7. Procédé selon la revendication 1 ou 2, dans lequel le ou les procaryotes est S. pneumoniae ou E. coli.
8. Procédé selon la revendication 1 ou 2, dans lequel les un ou plusieurs vecteurs sont des plasmides.
9. Procédé pour l'introduction d'une ou de plusieurs mutations dans un procaryote comprenant l'introduction de la ou des mutations par une recombinaison et la sélection du ou des procaryotes possédant la ou les mutations, consistant à:

   introduire un ou plusieurs vecteurs dans la ou les cellules procaryotes;

   dans lequel les un ou plusieurs vecteurs conduisent l'expression d'un ou de plusieurs parmi: une enzyme CRISPR, une séquence de guidage liée à une séquence d'appariement de tracr, une séquence tracr et un oligonucléotide d'édition pour une recombinaison dans un locus chromosomique ciblé comprenant un polynucléotide cible;

   et la totalité parmi une enzyme CRISPR, une séquence de guidage liée à une séquence d'appariement de tracr et une séquence tracr et une matrice d'édition est produite dans la ou les cellules procaryotes;

   introduire l'oligonucléotide d'édition comprenant la ou les mutations dans un polynucléotide cible par une recombinaison, dans lequel la matrice d'édition comprend la ou les mutations du polynucléotide cible qui modifient soit la séquence de motif adjacent au protoespaceur (PAM), soit la séquence du protoespaceur et qui abolissent le clivage de l'enzyme CRISPR du polynucléotide cible;

   permettre à un complexe CRISPR de se lier au polynucléotide cible pour effectuer le clivage du polynucléotide cible, dans lequel la séquence cible est dans le ou les procaryotes ne possédant pas la ou les mutations provenant de la recombinaison; et

   dans lequel le complexe CRISPR comprend l'enzyme CRISPR complexée avec (1) la séquence de guidage qui est hybridée à une séquence cible dans le polynucléotide cible et (2) la séquence d'appariement de tracr qui est hybridée à une séquence tracr;

   dans lequel la liaison du complexe CRISPR au polynucléotide cible conduit à un clivage dirigé vers l'enzyme CRISPR à un site ciblé dans le ou les procaryotes ne possédant pas la ou les mutations et induit une mort cellulaire.
10. Procédé selon la revendication 9, dans lequel l'enzyme CRISPR est une enzyme du système CRISPR de type II.
11. Procédé selon la revendication 9, dans lequel l'enzyme CRISPR est Cas9.
12. Procédé selon la revendication 11, dans lequel la Cas9 est une Cas9 de S. pyogenes.
13. Procédé selon la revendication 9, dans lequel l'enzyme CRISPR n'est pas endogène au ou aux procaryotes.
14. Procédé selon la revendication 9, dans lequel le ou les procaryotes est E. coli.
15. Procédé selon la revendication 1 ou la revendication 9, dans lequel la ou les mutations modifient la séquence PAM du polynucléotide cible.
16. Procédé selon la revendication 1 ou la revendication 9, dans lequel la ou les mutations modifient la séquence du protoespaceur du polynucléotide cible.