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HK1208045B - Crispr-cas component systems, methods and compositions for sequence manipulation - Google Patents

Crispr-cas component systems, methods and compositions for sequence manipulation Download PDF

Info

Publication number
HK1208045B
HK1208045B HK15108120.9A HK15108120A HK1208045B HK 1208045 B HK1208045 B HK 1208045B HK 15108120 A HK15108120 A HK 15108120A HK 1208045 B HK1208045 B HK 1208045B
Authority
HK
Hong Kong
Prior art keywords
sequence
crispr
tracr
target
cas9
Prior art date
Application number
HK15108120.9A
Other languages
English (en)
French (fr)
Chinese (zh)
Other versions
HK1208045A1 (en
Inventor
Feng Zhang
David Olivier Bikard
David Benjamin Turitz Cox
Wenyan Jiang
Luciano MARRAFFINI
Original Assignee
The Broad Institute, Inc.
Massachusetts Institute Of Technology
President And Fellows Of Harvard College
The Rockefeller University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by The Broad Institute, Inc., Massachusetts Institute Of Technology, President And Fellows Of Harvard College, The Rockefeller University filed Critical The Broad Institute, Inc.
Publication of HK1208045A1 publication Critical patent/HK1208045A1/en
Publication of HK1208045B publication Critical patent/HK1208045B/en

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Claims (16)

  1. Verfahren zum Auswählen einer oder mehrerer prokaryotischer Zellen durch Einbringen einer oder mehrerer Mutationen in eine oder mehrere prokaryotische Zellen, wobei das Verfahren umfasst:
    Einbringen eines oder mehrerer Vektoren in die prokaryotische(n) Zelle(n);
    wobei der eine oder die mehreren Vektoren Expression eines oder mehrerer steuern von: einem CRISPR-Enzym, einer Führungssequenz, verknüpft mit einer tracr-Mate-Sequenz, einer tracr-Sequenz und einem Editier-Template zur Rekombination in einen angezielten chromosomalen Lokus, der ein Ziel-Polynukleotid umfasst;
    und alle von einem CRISPR-Enzym, einer Führungssequenz, verknüpft mit einer tracr-Mate-Sequenz, und einer tracr-Sequenz, wobei ein Editier-Template in der bzw. den prokaryotischen Zellen produziert wird;
    Einbringen des Editier-Templates in ein Ziel-Polynukleotid durch Rekombination, wobei das Editier-Template die eine oder mehreren Mutationen des Ziel-Polynukleotids umfasst, welche entweder die Protospacer-adjacent-Motif- (PAM-) Sequenz oder die Protospacer-Sequenz verändern, und welche CRISPR-Enzym-Spaltung des Ziel-Polynukleotids unterbinden;
    Binden lassen eines CRISPR-Komplexes an das Ziel-Polynukleotid, um Spaltung des Ziel-Polynukleotids zu bewirken;
    wobei der CRISPR-Komplex das CRISPR-Enzym umfasst, komplexiert mit (1) der Führungssequenz, die an eine Zielsequenz innerhalb des Ziel-Polynukleotids hybridisiert wird, und (2) der tracr-Mate-Sequenz, die an eine tracr-Sequenz hybridisiert wird;
    wobei Spaltung des Ziel-Polynukleotids durch den CRISPR-Komplex Zelltod herbeiführt;
    wodurch ermöglicht wird, dass eine oder mehrere prokaryotische Zellen, in die eine oder mehrere Mutationen eingebracht worden sind, ausgewählt werden.
  2. Verfahren zum Erzeugen einer Mutation oder multipler Mutationen in einer oder mehreren prokaryotischen Zellen durch Einbringen der einen Mutation oder der multiplen Mutationen in eine oder mehrere prokaryotische Zellen, umfassend:
    A. Erzeugen einer Mutation in einer oder mehreren prokaryotischen Zellen durch Einbringen der Mutation in eine oder mehrere prokaryotische Zellen, durch ein Verfahren, das umfasst:
    Einbringen eines oder mehrerer Vektoren in die prokaryotische(n) Zelle(n);
    wobei der eine oder die mehreren Vektoren Expression eines oder mehrerer steuern von: einem CRISPR-Enzym, einer Führungssequenz, verknüpft mit einer tracr-Mate-Sequenz, einer tracr-Sequenz und einem Editier-Template;
    und alle von einem CRISPR-Enzym, einer Führungssequenz, verknüpft mit einer tracr-Mate-Sequenz, und einer tracr-Sequenz, wobei ein Editier-Template in der bzw. den prokaryotischen Zellen produziert wird;
    Binden lassen eines CRISPR-Komplexes an einen ein Ziel-Polynukleotid umfassenden angezielten chromosomalen Lokus, um Spaltung des Ziel-Polynukleotids zu bewirken, wodurch das Editier-Template, das die Mutation umfasst, durch Rekombination in den einen oder die mehreren Prokaryoten eingebracht wird; und
    wobei der CRISPR-Komplex das CRISPR-Enzym umfasst, komplexiert mit (1) der Führungssequenz, die an eine Zielsequenz innerhalb des Ziel-Polynukleotids hybridisiert wird, und (2) der tracr-Mate-Sequenz, die an eine tracr-Sequenz hybridisiert wird;
    wodurch eine oder mehrere prokaryotische Zellen erzeugt werden, in die die Mutation eingebracht worden ist;
    oder
    B. Erzeugen multipler Mutationen in einer oder mehreren prokaryotischen Zellen durch Einbringen der multiplen Mutationen in eine oder mehrere prokaryotische Zellen, durch ein Verfahren, das umfasst:
    Einbringen eines oder mehrerer Vektoren in die prokaryotische(n) Zelle(n);
    wobei der eine oder die mehreren Vektoren Expression eines oder mehrerer steuern von: einem CRISPR-Enzym, einer Führungssequenz, verknüpft mit einer tracr-Mate-Sequenz, einer tracr-Sequenz und einem Editier-Template;
    und alle von einem CRISPR-Enzym, einer Führungssequenz, verknüpft mit einer tracr-Mate-Sequenz, und einer tracr-Sequenz, wobei ein Editier-Template in der bzw. den prokaryotischen Zellen produziert wird;
    Binden lassen eines CRISPR-Komplexes an einen ein Ziel-Polynukleotid umfassenden angezielten chromosomalen Lokus, um Spaltung des Ziel-Polynukleotids zu bewirken, wodurch das Editier-Template, das die multiplen Mutationen umfasst, durch Rekombination in den einen oder die mehreren Prokaryoten eingebracht wird; und
    wobei der CRISPR-Komplex das CRISPR-Enzym umfasst, komplexiert mit (1) der Führungssequenz, die an eine Zielsequenz innerhalb des Ziel-Polynukleotids hybridisiert wird, und (2) der tracr-Mate-Sequenz, die an eine tracr-Sequenz hybridisiert wird;
    wodurch eine oder mehrere prokaryotische Zellen erzeugt werden, in die multiple Mutationen eingebracht worden sind;
    oder
    C. Erzeugen multipler Mutationen in einer oder mehreren prokaryotischen Zellen durch Einbringen der multiplen Mutationen in eine oder mehrere prokaryotische Zellen, durch ein Verfahren, das umfasst:
    Einbringen eines oder mehrerer Vektoren in die prokaryotische(n) Zelle(n);
    wobei der eine oder die mehreren Vektoren Expression eines oder mehrerer steuern von: einem CRISPR-Enzym, einer Führungssequenz, verknüpft mit einer tracr-Mate-Sequenz, einer tracr-Sequenz und einem Editier-Template;
    und alle von einem CRISPR-Enzym, einer Führungssequenz, verknüpft mit einer tracr-Mate-Sequenz, und einer tracr-Sequenz, wobei ein Editier-Template in der bzw. den prokaryotischen Zellen produziert wird;
    Binden lassen eines CRISPR-Komplexes an einen ein Ziel-Polynukleotid umfassenden angezielten chromosomalen Lokus, um Spaltung des Ziel-Polynukleotids zu bewirken, wodurch das Editier-Template, das eine erste Mutation umfasst, durch Rekombination in den einen oder die mehreren Prokaryoten eingebracht wird; und
    wobei der CRISPR-Komplex das CRISPR-Enzym umfasst, komplexiert mit (1) der Führungssequenz, die an eine Zielsequenz innerhalb des Ziel-Polynukleotids hybridisiert wird, und (2) der tracr-Mate-Sequenz, die an eine tracr-Sequenz hybridisiert wird;
    wodurch eine oder mehrere prokaryotische Zellen erzeugt werden, in die die erste Mutation eingebracht worden ist; Einbringen eines oder mehrerer Vektoren in die prokaryotische(n) Zelle(n) mit der ersten Mutation; wobei der eine oder die mehreren Vektoren Expression eines oder mehrerer steuern von: einem CRISPR-Enzym, einer Führungssequenz, verknüpft mit einer tracr-Mate-Sequenz, einer tracr-Sequenz und einem Editier-Template; und alle von einem CRISPR-Enzym, einer Führungssequenz, verknüpft mit einer tracr-Mate-Sequenz, und einer tracr-Sequenz, und einem Editier-Template in der bzw. den prokaryotischen Zellen produziert werden; Binden lassen eines CRISPR-Komplexes an einen ein Ziel-Polynukleotid umfassenden angezielten chromosomalen Lokus, um Spaltung des Ziel-Polynukleotids zu bewirken, wodurch das Editier-Template, das eine zweite Mutation umfasst, durch Rekombination in den einen oder die mehreren Prokaryoten eingebracht wird; und wobei der CRISPR-Komplex das CRISPR-Enzym umfasst, komplexiert mit (1) der Führungssequenz, die an eine Zielsequenz innerhalb des Ziel-Polynukleotids hybridisiert wird, und (2) der tracr-Mate-Sequenz, die an eine tracr-Sequenz hybridisiert wird; wodurch eine oder mehrere prokaryotische Zellen erzeugt werden, in die die erste und die zweite Mutation eingebracht worden sind.
  3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei das CRISPR-Enzym ein Typ-IICRISPR-System-Enzym ist.
  4. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei das CRISPR-Enzym Cas9 ist.
  5. Verfahren nach Anspruch 4, wobei das Cas9 S.-pyogenes-Cas9 ist.
  6. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei das CRISPR-Enzym dem bzw. den Prokaryoten nicht endogen ist.
  7. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei der bzw. die Prokaryoten S. pneumoniae oder E. coli sind.
  8. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei der eine oder die mehreren Vektoren Plasmide sind.
  9. Verfahren zum Einbringen von (einer) Mutation(en) in einen Prokaryoten, umfassend Einbringen der Mutation(en) durch Recombineering, und Auswählen nach (einem) Prokaryoten mit der bzw. den Mutationen, durch Einbringen eines oder mehrerer Vektoren in die prokaryotische(n) Zelle(n); wobei der eine oder die mehreren Vektoren Expression eines oder mehrerer steuern von: einem CRISPR-Enzym, einer Führungssequenz, verknüpft mit einer tracr-Mate-Sequenz, einer tracr-Sequenz und einem Editier-Oligonukleotid zur Rekombination in einen angezielten chromosomalen Lokus, der ein Ziel-Polynukleotid umfasst; und alle von einem CRISPR-Enzym, einer Führungssequenz, verknüpft mit einer tracr-Mate-Sequenz, einer tracr-Sequenz wobei ein Editier-Template in der bzw. den prokaryotischen Zellen produziert wird; Einbringen des Editier-Oligonukleotids, das die Mutation(en) umfasst, in ein Ziel-Polynukleotid durch Recombineering, wobei das Editier-Template die Mutation(en) des Ziel-Polynukleotids umfasst, welche entweder die Protospacer-adjacent-Motif- (PAM-) Sequenz oder die Protospacer-Sequenz verändern, und welche CRISPR-Enzym-Spaltung des Ziel-Polynukleotids unterbinden; Binden lassen eines CRISPR-Komplexes an das Ziel-Polynukleotid, um Spaltung des Ziel-Polynukleotids zu bewirken, wobei sich die Zielsequenz in (einem) Prokaryoten befindet, die die Mutation(en) aus dem Recombineering nicht aufweisen; und wobei der CRISPR-Komplex das CRISPR-Enzym umfasst, komplexiert mit (1) der Führungssequenz, die an eine Zielsequenz innerhalb des Ziel-Polynukleotids hybridisiert wird, und (2) der tracr-Mate-Sequenz, die an eine tracr-Sequenz hybridisiert wird; wobei Bindung des CRISPR-Komplexes an das Ziel-Polynukleotid in CRISPR-Enzym-ausgerichteter Spaltung an einer angezielten Stelle in dem bzw. den Prokaryoten, die die Mutation(en) nicht aufweisen, resultiert und Zelltod induziert.
  10. Verfahren nach Anspruch 9, wobei das CRISPR-Enzym ein Typ-II-CRISPR-System-Enzym ist.
  11. Verfahren nach Anspruch 9, wobei das CRISPR-Enzym Cas9 ist.
  12. Verfahren nach Anspruch 11, wobei das Cas9 S.-pyogenes-Cas9 ist.
  13. Verfahren nach Anspruch 9, wobei das CRISPR-Enzym dem bzw. den Prokaryoten nicht endogen ist.
  14. Verfahren nach Anspruch 9, wobei der bzw. die Prokaryoten E. coli sind.
  15. Verfahren nach Anspruch 1 oder Anspruch 9, wobei die Mutation(en) die PAM-Sequenz des Ziel-Polynukleotids verändern.
  16. Verfahren nach Anspruch 1 oder Anspruch 9, wobei die Mutation(en) die Protospacer-Sequenz des Ziel-Polynukleotids verändern.
HK15108120.9A 2012-12-12 2015-08-21 Crispr-cas component systems, methods and compositions for sequence manipulation HK1208045B (en)

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US201361835931P 2013-06-17

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