HK1204921B - 依那西普的稳定液体制剂 - Google Patents

Description

依那西普的稳定液体制剂

本申请是申请日为2012年06月01日、申请号为201280026919.7、发明名称为“依那西普的稳定液体制剂”的发明专利申请的分案申请。

技术领域

本发明涉及一种依那西普(etanercept，重组p75sTNFR：Fc融合蛋白)的稳定的液体制剂，具体地，涉及一种液体制剂，其包含一种或多种选自下组的稳定剂：甲硫氨酸、赖氨酸、组氨酸及其药学上可接受的盐，稳定剂的量足以降低储存过程中依那西普副产物形成。

背景技术

依那西普是一种生物炎症调节剂，其作为TNF-α的竞争性抑制剂，结合细胞表面TNF-α受体，抑制TNF-α介导的免疫反应。依那西普是分子量约150kDa的大分子，是两个Fc融合蛋白通过二硫键连接的同型二聚体，其中各Fc融合蛋白由偶联于人免疫球蛋白G亚类1的Fc部分的人可溶性p75TNF受体构成(Goldenberg，Clinical Therapeutics，21(1)：75-87，1999；Moreland等人，Ann.Intern.Med.，130(6)：478-486，1999)。

该原型融合蛋白最早在20世纪90年代初由Bruce A.Beutler(德克萨斯大学西南医学中心，University of Texas Southwestern Medical Center)合成，并在2002年由安进公司(Amgen)以依那西普(Enbrel)为商品名上市。依那西普是一种TNF-α抑制剂，用于治疗类风湿关节炎、银屑病和强直性脊柱炎，并为治疗脉管炎、阿尔茨海默病和克罗恩病而进行临床试验。

与蛋白药物相似，抗体药物具有非常短的半衰期，不利的温度、剪切应力、振动、冻融、紫外线照射、过度的pH变化、有机溶剂和微生物污染易于引起化学和物理变性。化学变性包括二聚体离解、氧化、脱酰胺化、异构化和多聚化，受到构成抗体的氨基酸和含有抗体的溶剂条件(盐、pH和温度)的影响。物理变性包括丧失三级结构、单体的共价/非共价凝聚和粘附，受到由包含抗体的周围环境，如溶剂，复杂的蛋白结构，如电荷分布以及热稳定而改变的蛋白表面疏水区域(patch)的影响。抗体的物理或化学变性导致其生理活性丧失。由于变性是不可逆的过程，一旦变性，抗体可能无法将其天然性质恢复至初始状态，从而导致其疗效降低。还有提示说单体聚集引起免疫反应。因此，对含有生理有效量的抗体但无聚集体的制剂已进行了许多研究(Ishikawa等，Biol.Pharm.Bull.，33(8):1413-1417，2010；Levin等编，《治疗性单克隆抗体产品的发展》(The Development of Therapeutic Monoclonal Antibody Products)，波士顿(马萨诸塞州)：BPTC公司(BioProcess Technology Consultants,Inc)，第9章)。

防止液体制剂中蛋白质变性有许多方法可用。在某些蛋白药物中，通过冻干解决稳定性问题。例如，美国专利号7,592,004公开了达利珠单抗(daclizumab)的冻干制剂，其用5至25mM的组氨酸缓冲液(pH 5.5至6.5)，0.005至0.03％的非离子表面活性剂(聚山梨醇酯)和100至300mM的非还原性糖(蔗糖)使之稳定。美国专利公开号2010-0158925公开了西妥昔单抗的冻干制剂，其用组氨酸缓冲液和乳糖酸(lactobionic acid)使之稳定。然而，冻干过程产生冷冻和干燥应激(stress)，如冰晶形成、pH变化以及高浓度的溶质，这些应激可导致抗体变性。此外，由于冷冻干燥过程在生产中需要大容量的冻干机，大规模生产时生产成本升高。在使用前将冻干产品在无菌水性介质中溶解使之重建也带来不便。

作为解决这些局限性的替代方法，是在液体制剂中加入稳定剂以提高抗体稳定性。表面活性剂、血清白蛋白、多糖，氨基酸、聚合物、盐等是已知的用于蛋白(包括抗体)的稳定剂(Wang，Int.J.Pharm.,185：129-188，1999；Wang等，J.Pharm.Sci.,96(1)：1-26，2007)。

美国专利公开号2011-0070231公开了一种IgG抗体的稳定的液体组合物，其中，所述稳定的药物液体制剂在20至60mM的琥珀酸盐缓冲液(pH 5.5至6.5)，0.02至0.04％的聚山梨酯和75至150mM的氯化钠中含有50mg/ml或更高的达利珠单抗。

美国专利公开号2011-0020328公开了一种治疗有效量的抗CD20抗体制剂，其中，所述药学上稳定的组合物包含10至100mM的醋酸钠，25至100mM的氯化钠，0.5％至5％的精氨酸游离碱，0.02至0.2mM的EDTA和0.01至0.2％聚山梨醇酯80，其pH为5.0至7.0。

美国专利号7,785,592公开了一种稳定的制剂，其中，通过使用组氨酸缓冲液和甘氨酸而不利用离子盐和表面活性剂使得75mg/mL或更高的帕利珠单抗稳定，其在2至8℃下至少稳定15个月。

美国专利号6,991,790公开了一种稳定的水性药物制剂，包含治疗有效量的抗体、pH约4.8至5.5的醋酸盐缓冲液、表面活性剂和多元醇，不含等渗剂(如氯化钠)。

美国专利号7,648,702公开了一种液体制剂，其中用10至200mM的L-精氨酸作为抗凝剂来稳定与人免疫球蛋白G1(IgG1)的Fc部分连接的人p75肿瘤坏死因子受体的融合蛋白。只有该专利使用依那西普作为活性成分。

然而，考虑到各个活性成分的理化性质，应采用适当的稳定剂，以制备稳定的制剂。当组合利用稳定剂时，它们之间的竞争和不利影响可能导致不利的效果。此外，抗体的浓度应在适于稳定的范围内，且其浓度高于蛋白质药物浓度。因此，稳定溶液中的抗体需要更努力和小心(Shire等，J.Pharm.Sci.，93(6)：1390-1402，2004)。

鲜有关于依那西普的稳定液体制剂的研究，发明人所知的用于稳定依那西普的唯一方法是在液体制剂中使用L-精氨酸。因此，迫切需要开发一种新的液体制剂，其能够长时间稳定地维持依那西普的活性，与已知的含有L－精氨酸的制剂相比，能更有效地稳定依那西普。

发明内容

技术问题

本发明人作出许多努力来开发一种制备能稳定维持依那西普活性的液体制剂的方法。结果发现，一种或多种选自下组的稳定剂：甲硫氨酸、赖氨酸和组氨酸在稳定溶液中依那西普方面效果显著，从而完成了本发明。

技术方案

本发明的目的是提供一种水性制剂，其包含溶液中的稳定剂，用于降低储存过程中依那西普副产物的形成以及长时间维持依那西普的活性。

本发明的有益效果

就长期储存而言，本发明的液体制剂能有效地防止依那西普副产物的形成和稳定地维持其药学功效。因此，不需要在施用前重建，无菌制剂可给予患者以确保患者的安全。因此，预计其可应用于需要依那西普的诸领域。

本发明的最佳实施方式

为实现上述目的，在一方面，本发明提供一种液体制剂，其包含一种或多种选自下组的稳定剂：甲硫氨酸、赖氨酸、组氨酸及其药学上可接受的盐。

本发明的制剂可为依那西普的液体制剂，包含依那西普、一种或多种选自下组的稳定剂：甲硫氨酸、赖氨酸、组氨酸及其药学上可接受的盐。

该制剂减少了储存过程中因变性而产生的依那西普副产物，提高了储存稳定剂。

作为稳定剂，甲硫氨酸、赖氨酸、组氨酸及其药学上可接受的盐在制剂中的含量可为0.1至250mM。

依那西普在制剂中的含量可为1至100mg/mL。

该制剂还可包含一种或多种选自下组的材料：缓冲液、等渗剂、赋形剂和防腐剂。

所述缓冲液可选自下组：柠檬酸盐、磷酸盐、琥珀酸盐、酒石酸盐、富马酸盐、葡萄糖酸盐、草酸盐、乳酸盐、醋酸盐，组氨酸和Tris，缓冲液的含量可为0.1至100mM。

所述等渗剂可选自下组：氯化钠、氯化钾、硼酸、硼酸钠、甘露醇、丙三醇、丙二醇、聚乙二醇、麦芽糖、蔗糖、赤藓醇、阿糖醇、木糖醇、山梨醇和葡萄糖，等渗剂的含量可为1至1000mM。

本发明的依那西普制剂可以是液体制剂，其包含1至100mg/mL的依那西普、0.1至250mM的甲硫氨酸或其药学上可接受的盐、0.1至100mM的磷酸缓冲液以及1到1000mM的氯化钠。

本发明的依那西普制剂可以是液体制剂，其包含1至100mg/mL的依那西普、0.1至250mM的赖氨酸或其药学上可接受的盐、0.1至100mM的磷酸缓冲液以及1至1000mM的氯化钠。

本发明的依那西普制剂可以是液体制剂，其包含1至100mg/mL的依那西普、0.1至250mM的组氨酸或药学上可接受的盐、0.1至100mM的磷酸缓冲液以及1至1000mM的氯化钠。

本发明的依那西普制剂可以是液体制剂，其包含1至100mg/mL的依那西普、0.1至250mM的组氨酸或药学上可接受的盐、0.1至250mM的赖氨酸或其药学上可接受的盐、0.1至100mM的磷酸缓冲液以及1至1000mM的氯化钠。

本发明的依那西普制剂可以是液体制剂，其包含1至100mg/mL的依那西普、0.1至250mM的组氨酸或药学上可接受的盐、0.1至250mM的甲硫氨酸或其药学上可接受的盐、0.1至100mM的磷酸缓冲液以及1至1000mM的氯化钠。

本发明的依那西普制剂可以是液体制剂，其包含1至100mg/mL的依那西普、0.1至250mM的甲硫氨酸或其药学上可接受的盐、0.1至250mM的赖氨酸或其药学上可接受的盐、0.1至100mM的磷酸缓冲液以及1至1000mM的氯化钠。

本发明进行如下详细说明。

本发明第一次证明：就长期储存而言，甲硫氨酸、赖氨酸、组氨酸及其药学上可接受的盐具有减少溶液中依那西普副产物的形成，以及稳定地维持其活性，从而提出了它们的新用途，作为药学有效量的依那西普的稳定剂。

为了制备稳定的制剂，考虑到各个活性成分的理化性质，应采用合适的稳定剂。根据制剂所含材料的种类、浓度以及组合的差异，制剂中这些材料之间的竞争可能会导致不利的效果。因此，难以制备稳定的特定药物制剂。

鉴于上述背景技术，本发明人发现，与不含稳定剂的制剂相比，包含一种或多种选自下组稳定剂的液体制剂通过减少储存期间溶液中的依那西普副产物来提高依那西普的储存稳定性：甲硫氨酸、赖氨酸、组氨酸及其药学上可接受的盐。

具体地，在本发明的一个实施方式中，为了研究用于制备依那西普的稳定液体制剂的最佳稳定剂，添加了各种氨基酸、表面活性剂和聚合物，以测试它们的稳定效果。结果发现赖氨酸、组氨酸、甲硫氨酸或其组合在稳定依那西普方面效果显著，其防止存储时在高温下溶液中依那西普的变性。

进一步发现，本发明制剂的依那西普稳定效果与已知的包含L-精氨酸的依那西普稳定制剂(美国专利号7,648,702)相当或更好。特别发现，甲硫氨酸比L-精氨酸具有更优异的依那西普稳定效果。

具体地，通过尺寸排阻－HPLC(SE-HPLC)检测储存期间形成的依那西普副产物。结果是，与采用L-精氨酸作为稳定剂(如美国专利号7,648,702)制备的依那西普制剂中的杂质总量相比，采用赖氨酸作为稳定剂制备的制剂显示相似的杂质含量，采用组氨酸或甲硫氨酸作为稳定剂制备的制剂显示杂质含量较少(见表2)。疏水相互作用-高效液相色谱法(HI-HPLC)分析也显示了类似的结果。这些结果表明，组氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸防止依那西普变性，以抑制其副产物的形成(见表3)。

因此，本发明的液体制剂可以通过有效降低依那西普副产物的形成而长时间稳定地维持依那西普的药效。

如本文所用，术语“依那西普(重组p75sTNFR：Fc融合蛋白)”是指一种通过二硫键连接的两个Fc融合蛋白的同型二聚体蛋白质，各Fc融合蛋白由与人IgG1的Fc部分偶联的人可溶性75千道尔顿(p75)TNF(肿瘤坏死因子)受体构成。

具体地，依那西普是通过3个二硫键连接的两个Fc融合蛋白的同型二聚体形式，其中，各Fc融合蛋白由连接于人IgG1的Fc部分的人可溶性p75TNF受体的胞外配体结合部分构成。依那西普的Fc部分含有CH2结构域，CH3结构域和铰链区，但没有IgG1的CH1结构域。依那西普可具有约150千道尔顿(kDa)的分子量。该依那西普目前以商品名(安进公司，千橡树市，加利福尼亚州)销售，CAS号为185243-69-0。

依那西普可以通过重组DNA技术制备，但不限于此。

本发明的依那西普是一种生物炎症调节剂，其作为TNF-α的竞争性抑制剂，结合于细胞表面TNF-α受体，抑制TNF-α介导的免疫反应，并且用于治疗类风湿关节炎、银屑病和强直性脊柱炎，并为治疗血管炎、阿尔茨海默病和克罗恩病进行临床试验。

本发明的液体制剂包含治疗有效量的依那西普。优选地，依那西普的量为1-100mg/mL。

如本文所用，术语“稳定化的液体制剂”或“稳定的液体制剂”是指一种制剂，其在储存期间保留了溶液中的治疗活性成分，依那西普的物理和化学一致性及完整性。依那西普稳定性的分析测定可以根据本领域众所周知的蛋白质稳定性分析进行。可在预定的温度下在预定时间内测定稳定性。为快速测定，可将制剂在较高的或“升高的”温度，例如40℃下，存储2周至1个月或更长时间，此时测试其时间依赖的稳定性。

本文所用的术语“稳定剂”是指与制剂中的生物分子和/或一般药物赋形剂相互作用以提高其稳定性的特定化学物质。稳定剂通常保护蛋白免遭导致蛋白质凝聚的空气/溶液界面诱导的应激和溶液/表面诱导的应激。在本发明中，所述稳定剂是这样一种组分，它减少储存期间溶液中依那西普副产物的形成，从而长时间维持其活性；优选一种或多种选自下组的稳定剂：甲硫氨酸、赖氨酸、组氨酸及其药学上可接受的盐。

就氨基酸而言，L型和D型均在本发明的范围内。不仅是氨基酸本身(例如甲硫氨酸、赖氨酸和组氨酸)，其类似物、溶剂化物、水合物和立体异构体及其药学上可接受的盐均在本发明的范围内，只要它们显示出大致相同的效果。

本文所用的术语“药学上可接受的盐”是指制成氨基酸，例如甲硫氨酸、赖氨酸和组氨酸的盐形式的化合物，只要维持其功能如本发明的稳定剂一样。具体地，可通过酸加成成盐，例如，可与以下酸成盐：无机酸(如盐酸、氢溴酸，磷酸，硝酸，硫酸等)，有机羧酸(如乙酸、卤代乙酸(如三氟乙酸)、丙酸、马来酸、琥珀酸、苹果酸、柠檬酸、酒石酸、水杨酸)，糖酸(如葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、葡糖酸、抗坏血酸)，酸性多糖(如透明质酸、硫酸软骨素、精氨酸)，有机磺酸，包括磺酸糖酯，如硫酸软骨素(如甲烷磺酸、对甲苯磺酸)。

本文所用的术语“类似物”是指与如甲硫氨酸、赖氨酸和组氨酸等氨基酸具有相同功能的化合物，用作本发明的稳定剂。在本发明中，如甲硫氨酸、赖氨酸和组氨酸的氨基酸包括它们的类似物。在本发明中，所述类似物的示例可包括甲硫氨酸类似物，即，硒代甲硫氨酸、羟甲基丁酸、乙硫氨酸和三氟甲硫氨酸，但不限于此。

本文所用的术语“副产物”是指不利的产物，其降低制剂中治疗活性成分依那西普的比例。典型的副产物包括依那西普因脱氨或水解而变性产生的“低分子量产物”，以及“高分子量产物”，如低聚物和凝聚物，或其组合。

本文所用的术语“高分子量产物”包括随后会因变性而聚集的依那西普片段(例如，因脱氨或水解引起多肽降解而产生)，或它们的混合物。典型地，高分子量产物是指分子量高于治疗性单体依那西普的复合物，分子量可大于约150kDa。

本文所用的术语“低分子量产物”包括，例如，因脱氨或水解产生的治疗性多肽，即，依那西普片段。典型地，低分子量产物是指分子量低于治疗性单体依那西普的复合物，其分子量可小于约150kDa。

本发明的液体制剂包括一种或多种选自下组的稳定剂：甲硫氨酸、赖氨酸、组氨酸及其药学上可接受的盐。具体地，所述液体制剂包含甲硫氨酸、赖氨酸或组氨酸作为稳定剂，或两种稳定剂，如甲硫氨酸和赖氨酸、甲硫氨酸和组氨酸，或赖氨酸和组氨酸，或三种稳定剂，如甲硫氨酸、赖氨酸和组氨酸。在上述包含氨基酸组合的制剂中，还可添加甲硫氨酸、赖氨酸、组氨酸的药学上可接受的盐，或甲硫氨酸、赖氨酸和组氨酸可以分别是其药学上可接受的盐的修饰形式。优选地，所述液体制剂包含甲硫氨酸、赖氨酸、组氨酸、甲硫氨酸和赖氨酸、甲硫氨酸和组氨酸，或赖氨酸和组氨酸作为稳定剂；更优选地，包含甲硫氨酸作为稳定剂。

甲硫氨酸是必需氨基酸，其化学式为C₅H₁₁NO₂S和分子量为149.21。甲硫氨酸是非极性氨基酸，在其侧链中包含硫醚基(-S-CH₃)。其pK1值为2.28，pK2值为9.21，等电点值(PI)为5.74。甲硫氨酸通过与抗体中的甲硫氨酸残基竞争与游离羟基自由基反应来防止液体制剂中抗体的氧化，从而稳定抗体(Lam等，J.Pharm.Sci.，86(11)：1250-1255，1997年；Wang，Inc.J.Pharm.，185：129-188，1999)。

赖氨酸是必需氨基酸，其化学式为C₆H₁₄N₂O₂和分子量为146.19。赖氨酸是碱性氨基酸，pK1值为2.18，pK2值为8.95，pK3值为10.53和PI值为9.74。

组氨酸是必需氨基酸，在其侧链具有带正电荷的咪唑官能团，其化学式为C₆H₉N₃O₂和分子量为155.15。组氨酸是碱性氨基酸，其pK1值为1.82，pK2值为9.17，pK3值为6.0和PI值为7.59。

与此相反，L-精氨酸是已知市售依那西普制剂中的必需氨基酸，化学式为C₆H₁₄N₄O₂和分子量为174.2。精氨酸是碱性氨基酸，pK1值为2.17，pK2值为9.04，pK3值为12.48和PI值为10.76。也就是说，本发明中作为稳定剂的甲硫氨酸、赖氨酸和组氨酸，与已知的依那西普稳定剂精氨酸在结构、化学式、理化性质和离子化倾向完全不同。本发明首次证明如甲硫氨酸、赖氨酸和组氨酸的氨基酸适合作为依那西普的稳定剂。

本发明液体制剂中稳定剂的含量为0.1至250mM，优选为1至100mM，更优选为5至50mM。

根据一种或多种选自下组的稳定剂：甲硫氨酸、赖氨酸、组氨酸及其药学上可接受的盐，本发明的液体制剂可进一步包含任何一种蛋白质药物或抗体药物的制剂中常规含有的材料，以提高依那西普稳定性，除了那些损害本发明功能的材料。例如，已知的依那西普稳定剂L-精氨酸可加入到本发明的液体制剂中。

除了稳定剂,本发明的液体制剂还可以包含缓冲液。如本文所用，术语“缓冲液”是指提高制剂等渗性和化学稳定性的组分，用于维持生理上合适的pH。缓冲液防止液体制剂pH快速变化，以维持溶液pH来稳定依那西普。缓冲液的优选例包括柠檬酸盐、磷酸盐，琥珀酸盐，酒石酸盐，富马酸盐，葡萄糖酸盐，草酸盐，乳酸盐，醋酸盐，组氨酸和Tris，但不限于此。在具体的实施方式中，缓冲液是磷酸盐缓冲液。该缓冲液可以单独使用或以两种或多种的组合使用。

在本发明的各种实施例中，所述制剂pH应为约5至7.5，或约5.8至6.8。在具体实施方式中，所述制剂pH为约6.0至6.6。从中间值至上述pH水平的范围，例如，约pH 5.2至约pH 6.4(例如，pH 6.2),也是本发明的一部分。例如，应包括利用任何上述值的组合作为上限和/或下限的范围。如有必要，可通过本领域已知技术来调节pH。例如，可以通过加入HCl或通过加入组氨酸将pH调节到任何期望的范围内，如果必要的话。

在另一个实施方式中，缓冲液浓度为0.1至100mM，优选为1至50mM，更优选为5至25mM。从中间值至上述浓度的范围也应是本发明的一部分。例如，应包括利用上述浓度的组合作为上限和/或下限的范围。在具体实施方式中，缓冲液的含量应足以维持生理上足够的pH。

除稳定剂外，本发明的液体制剂还可以包含等渗剂。本文所用的术语“等渗剂”是指这样一种组分，其作用是部分维持制剂的等渗性和蛋白质水平以及部分维持制剂中治疗活性多肽的水平、比例或配比。所述等渗剂的渗透压与血浆相同，因此可以通过静脉内输注给受试者而不改变受试者血浆的渗透压。事实上，在本发明的一个实施方式中，等渗剂的含量足以使制剂适于静脉输注。通常，等渗剂也作为填充剂。因此，等渗剂可使蛋白质克服各种应激，例如冷冻和剪切。

等渗剂的作用是当依那西普溶液给予体内时，维持体内适当的等渗压。等渗剂的示例可包括常用的氯化钠、氯化钾、硼酸、硼酸钠、甘露醇、丙三醇、丙二醇、聚乙二醇、麦芽糖、蔗糖、赤藓醇、阿糖醇、木糖醇、山梨醇和葡萄糖，但是不限定于此。在具体实施方式中，等渗剂是氯化钠。这些等渗剂可以单独使用或以两种或多种的组合使用。

在另一个实施方式中，等渗剂(如氯化钠)浓度为1至1000mM，优选为10至500mM，更优选为50至250mM。从中间到上述浓度的范围也是本发明的一部分。例如，应包括利用任何上述浓度的组合作为上限和/或下限的范围。等渗剂的含量应足以维持制剂的渗透性。

本发明的液体制剂还可以包含药学上可接受的赋形剂，赋形剂的例子可包括糖和多元醇、表面活性剂、聚合物等。糖和多元醇的示例可包括蔗糖、海藻糖、乳糖、麦芽糖、半乳糖、甘露糖醇、山梨糖醇、甘油；表面活性剂的示例可包括非离子表面活性剂，如聚山梨酯20、聚山梨酯80和泊洛沙姆；聚合物的示例可包括葡聚糖、聚乙二醇、羧甲基纤维素、透明质酸和环糊精。

本发明的液体制剂还可以包含防腐剂。所述防腐剂是指加入药物制剂作为抗微生物剂的化学物质。防腐剂的示例可包括苯扎氯铵、苄索、氯己定、苯酚、间甲酚、苄醇、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、氯丁醇、ο-甲酚、ρ-甲酚、氯甲酚、硝酸苯汞、硫柳汞和苯甲酸，但不限于此。这些防腐剂可以单独使用或以两种或多种的组合使用。

在具体实施方案中，本发明的制剂是稳定的液体制剂，其包含1至100mg/mL的依那西普，0.1至250mM的甲硫氨酸或其药学上可接受的盐，0.1至100mM的磷酸盐缓冲液和1至1000mM的氯化钠。更具体地，本发明的制剂是稳定的液体制剂，其包含1至100mg/mL的依那西普，0.1至100mM的甲硫氨酸或其药学上可接受的盐，0.1至50mM的磷酸缓冲液和1至500mM的氯化钠，pH为6.0至6.6。

在具体实施方案中，本发明的制剂是稳定的液体制剂，其包含1至100mg/mL的依那西普，0.1至250mM的组氨酸或其药学上可接受的盐，0.1至100mM的磷酸盐缓冲液和1至1000mM的氯化钠。更具体地，本发明的制剂是稳定的液体制剂，其包含1至100mg/mL的依那西普，0.1至100mM的组氨酸或其药学上可接受的盐，0.1至50mM的磷酸缓冲液和1至500mM的氯化钠，pH为6.0至6.6。

在具体实施方案中，本发明的制剂是稳定的液体制剂，其包含1至100mg/mL的依那西普，0.1至250mM的赖氨酸或其药学上可接受的盐，0.1至100mM的磷酸盐缓冲液和1至1000mM的氯化钠。更具体地，本发明的制剂是稳定的液体制剂，其包含1至100mg/mL的依那西普，0.1至100mM的赖氨酸或其药学上可接受的盐，0.1至50mM的磷酸缓冲液和1至500mM的氯化钠，pH为6.0至6.6。

在具体实施方案中，本发明的制剂是稳定的液体制剂，其包含1至100mg/mL的依那西普，0.1至250mM的组氨酸或其药学上可接受的盐，0.1至250mM的赖氨酸或其药学上可接受的盐，0.1至100mM的磷酸盐缓冲液和1至1000mM的氯化钠。更具体地，本发明的制剂是稳定的液体制剂，其包含1至100mg/mL的依那西普，1至50mM的组氨酸或其药学上可接受的盐，1至100mM的赖氨酸或其药学上可接受的盐，0.1至50mM的磷酸缓冲液和1至500mM的氯化钠，pH为6.0至6.6。

在具体实施方案中，本发明的制剂是稳定的液体制剂，其包含1至100mg/mL的依那西普，0.1至250mM的组氨酸或其药学上可接受的盐，0.1至250mM的甲硫氨酸或其药学上可接受的盐，0.1至100mM的磷酸盐缓冲液和1至1000mM的氯化钠。更具体地，本发明的制剂是稳定的液体制剂，其包含1至100mg/mL的依那西普，1至50mM的组氨酸或其药学上可接受的盐，1至100mM的甲硫氨酸或其药学上可接受的盐，0.1至50mM的磷酸缓冲液和1至500mM的氯化钠，pH为6.0至6.6。

在具体实施方案中，本发明的制剂是稳定的液体制剂，其包含1至100mg/mL的依那西普，0.1至250mM的甲硫氨酸或其药学上可接受的盐，0.1至250mM的赖氨酸或其药学上可接受的盐，0.1至100mM的磷酸盐缓冲液和1至1000mM的氯化钠。更具体地，本发明的制剂是稳定的液体制剂，其包含1至100mg/mL的依那西普，1至50mM的甲硫氨酸或其药学上可接受的盐，1至50mM的赖氨酸或其药学上可接受的盐，0.1至50mM的磷酸缓冲液和1至500mM的氯化钠，pH为6.0至6.6。

本发明的制剂可用于治疗依那西普有疗效的疾病。依那西普是一种生物炎症调节剂，以抑制TNF-α介导的免疫反应，本发明的制剂用于治疗类风湿关节炎、银屑病、强直性脊柱炎、脉管炎、阿尔茨海默病或克罗恩病，不限于此。本发明的制剂可口服或肠胃外给药，即皮下、肌内、腹膜内、腹腔内、经皮途径和/或静脉内给药，但不限于此。

在另一方面，本发明提供了一种提高依那西普稳定性的方法，采用包含一种或多种选自下组的稳定剂的液体制剂：甲硫氨酸、赖氨酸、组氨酸及其药学上可接受的盐。

液体制剂可以通过减少因储存过程中变性而产生的依那西普副产物来提高依那西普的储存稳定性。

发明的实施方式

以下，参照实施例对本发明进行更详细地说明。然而，这些实施例仅用于说明目的，本发明不受这些实施例的限制。

<实施例1>根据稳定剂的添加情况测试依那西普水性制剂的稳定性

为研究用于制备稳定的依那西普水性制剂的最佳稳定剂，将组氨酸作为稳定剂加入5mM的磷酸盐溶液，向其中加入依那西普至浓度为50mg/mL，加入氯化钠作为等渗剂，以制备制剂1。

另外，将依那西普加入10mM的磷酸盐溶液至浓度为50mg/mL，加入氯化钠作为等渗剂。然后，分别加入赖氨酸、精氨酸、甲硫氨酸、甘氨酸、聚山梨醇酯20、聚山梨酯80、泊洛沙姆188、丙二醇、硫酸鱼精蛋白、蔗糖和盐酸胍，以制备制剂2-12。

最后，将氯化钠作为等渗剂加入10mM磷酸盐溶液，向其中加入依那西普至浓度为50mg/mL，以制备不含稳定剂的制剂。制剂中的稳定剂组成如下表1所示。将0.5ml的各制剂放入1.0mL的玻璃注射器中，密封，并贮存于50℃。

表1

[表1]

	稳定剂组成
		制剂1	组氨酸10mM
制剂2	赖氨酸25mM
		制剂3	精氨酸25mM
制剂4	甲硫氨酸25mM
		制剂5	甘氨酸1％
制剂6	吐温200.1％
		制剂7	吐温800.1％
制剂8	F680.1％
		制剂9	丙二醇0.1％
制剂10	硫酸鱼精蛋白0.03％
		制剂11	蔗糖2％
制剂12	盐酸胍0.2％
		不含稳定剂的制剂	-

在50℃储存7天后，采用SE-HPLC分析表1的制剂1-12和不含稳定剂的制剂，以检测低分子量产物和高分子量产物的类型，如依那西普变性产生的低聚物和凝聚物，这些产物的总量代表杂质总和。此外，采用HI-HPLC检测依那西普的结构变化。HI-HPLC中，依那西普相关物质被分为4个峰，包括预峰、峰1、峰2和峰3。预峰和峰1代表低分子量产物，峰2代表依那西普，峰3代表低凝聚或低活性的二聚物。因此，预峰，峰1和峰3的总量代表杂质总和。结果分别如表2和表3所示。

表2

[表2]

表3

[表3]

如表2的SE-HPLC结果所示，在50℃下储存7天后，含组氨酸作为稳定剂的制剂1显示杂质总和为22.2％，含赖氨酸作为稳定剂的制剂2显示杂质总和为24.8％，含精氨酸作为稳定剂的制剂3显示杂质总和为24.2％，含甲硫氨酸作为稳定剂的制剂4显示杂质总和为20.8％。不含稳定剂的制剂显示杂质总和为30.2％，相比之下，它们均显示了相当低的杂质总和。与利用L-精氨酸作为稳定剂(美国专利号7648702)的制剂3相比，含赖氨酸的制剂2显示相似的杂质总和24.8％，而含组氨酸的制剂1和含甲硫氨酸的制剂4显示较低的杂质总和，分别为22.2％和20.8％。

表3所示的HI-HPLC结果与SE-HPLC结果类似。不含稳定剂的制剂显示杂质总和为41.9％。与此相反，制剂1、2、3和4各自的杂质总和分别为33.7％、34.9％、34.3％和30.3％，这表明各制剂中添加的组氨酸、赖氨酸、L-精氨酸和甲硫氨酸具有防止依那西普变性的效果。特别是，含甲硫氨酸的制剂4显示了最低的杂质总和，这表明甲硫氨酸对依那西普的稳定最有效。

因此，本发明证明：赖氨酸、组氨酸和甲硫氨酸通过防止依那西普变性而具有稳定依那西普的效果，该效果与L-精氨酸相当或更好，尤其是甲硫氨酸稳定依那西普的效果比L-精氨酸更好。

<实施例2>根据甲硫氨酸的浓度测试依那西普水性制剂的稳定性

为研究稳定依那西普的最佳甲硫氨酸浓度，将120mM氯化钠加入10mM磷酸溶液，然后分别加入25mM和12.5mM的甲硫氨酸，随后加入50mg/mL的依那西普，以分别制备制剂13和14。根据市售的依那西普水性制剂的制法，将25mM L-精氨酸加入含有100mM氯化钠和1％蔗糖的10mM磷酸盐溶液，然后加入依那西普至50mg/mL，以制备对照组。将0.5ml的各制剂放入1.0mL玻璃注射器中，密封，保存于40℃，25℃和4℃。制得的水性制剂的组成如下表4所示。

表4

[表4]

制剂13、制剂14和对照组在40℃下储存1周和3周后，在25℃和4℃储存4周和8周后，用SE-HPLC和HI-HPLC检测其杂质总和(如实施例1)。其结果分别如表5和表6所示。

表5

[表5]

表6

[表6]

如表5和表6的结果所示，与根据市售的依那西普水性制剂的制备方法制得的对照组相比，在全部的40℃、25℃和4℃储存条件下，含甲硫氨酸作为稳定剂的制剂13和制剂14均显示了低杂质形成。具体地，SE-HPLC和HI-HPLC结果表明，与对照组相比，含25mM甲硫氨酸的制剂13和含12.5mM甲硫氨酸的制剂14，在40℃下储存3周后和在25℃下储存8周后均显示了更低的杂质形成，在4℃下储存8周后显示相似的杂质形成。这些结果表明，为长时间维持依那西普活性，本发明的含甲硫氨酸的制剂是比市售制剂更稳定的制剂。

总之，本发明表明，含甲硫氨酸的依那西普水性制剂防止依那西普变性以长时间维持其活性，且甲硫氨酸是用于依那西普水性制剂的非常有效的稳定剂。

<实施例3>含组氨酸和赖氨酸或组氨酸和甲硫氨酸的依那西普水性制剂的稳定性测试

将组氨酸5mM和赖氨酸25mM作为稳定剂加入10mM磷酸盐溶液中，向其中加入依那西普至浓度为50mg/mL和氯化钠作为等渗剂，以制备制剂15。

此外，将组氨酸5mM和甲硫氨酸25mM作为稳定剂加入10mM磷酸盐溶液中，向其中加入依那西普至浓度为50mg/mL和氯化钠作为等渗剂，以制备制剂16。

最后，将氯化钠作为等渗剂加入10mM磷酸盐溶液，向其中加入依那西普至浓度为50mg/mL，以制备不含稳定剂的制剂。

将0.5ml的各制得制剂放入1.0mL玻璃注射器中，密封，并贮存于50℃。

制剂的稳定剂组成如下表7所示。

表7

[表7]

	稳定剂组成
		制剂15	组氨酸5mM+赖氨酸25mM
制剂16	组氨酸5mM+甲硫氨酸25mM
		不含稳定剂的制剂	-

在50℃储存7天后，如实施例1所述通过SE-HPLC分析表7中的制剂15、16和不含稳定剂的制剂，以检测它们的杂质总和。结果如表8所示。

表8

[表8]

如表8的SE-HPLC结果所示，在50℃下储存7天后，含组氨酸作为稳定剂的制剂16显示杂质总和为21.5％，相比于不含稳定剂的制剂30.2％的杂质总和，其杂质总和非常低。相比于含10mM组氨酸的制剂1显示杂质总和为22.2％和含25mM赖氨酸的制剂2显示杂质总和为24.8％，制剂16显示了非常低的杂质总和。

也就是说，本发明表明，相比于不含稳定剂的制剂和分别含组氨酸、赖氨酸和甲硫氨酸的各制剂，含组氨酸和赖氨酸的制剂通过减少储存时的杂质总量而具有防止依那西普变性的优异效果。

另外，如表8的SE-HPLC结果所示，在50℃储存7天后，含组氨酸作为稳定剂的制剂16显示杂质总和为20.9％，相比于不含稳定剂的制剂显示30.2％的杂质总和，这是非常低的。具体地，相比于含组氨酸和赖氨酸作为稳定剂的制剂15，制剂16呈现更低的杂质总和。

也就是说，本发明表明，相比于不含稳定剂的制剂，含组氨酸和甲硫氨酸的制剂通过减少储存时杂质总量而具有防止依那西普变性的卓越效果。

<实施例4>含甲硫氨酸和赖氨酸的依那西普水性制剂的稳定性测试

将甲硫氨酸12.5mM和赖氨酸12.5mM作为稳定剂加入10mM磷酸盐溶液，向其中加入依那西普至浓度50mg/mL和氯化钠作为等渗剂，以制备制剂17。

另外，将氯化钠作为等渗剂加入10mM磷酸盐溶液，加入依那西普至浓度为50mg/mL，以制备不含稳定剂的制剂。

将0.5ml的各制得制剂放入1.0mL玻璃注射器中，密封，并贮存于50℃。制剂中稳定剂组成如下表9所示。

表9

[表9]

	稳定剂组成
		制剂17	甲硫氨酸12.5mM+赖氨酸12.5mM
不含稳定剂的制剂	-

在50℃储存7天后，如实施例1所述通过SE-HPLC分析表9的制剂17和不含稳定剂的制剂以检测它们的杂质总和。结果如表10所示。

表10

[表10]

如表10的SE-HPLC结果所示，在50℃下储存7天后，含甲硫氨酸和赖氨酸作为稳定剂的制剂17显示杂质总和为27％，相比于不含稳定剂的制剂显示杂质总和为32.8％，这是非常低的。

也就是说，本发明表明，相比于不含稳定剂的制剂，含甲硫氨酸和赖氨酸的制剂通过减少储存时杂质总量而具有防止依那西普变性的卓越效果。

Claims (16)

1.一种依那西普的液体制剂，其包含依那西普，以及一种或多种选自下组的稳定剂：甲硫氨酸、赖氨酸、组氨酸及其药学上可接受的盐。

2.如权利要求1所述的液体制剂，其特征在于，所述稳定剂是甲硫氨酸和/或其药学上可接受的盐。

3.如权利要求1所述的液体制剂，其特征在于，所述稳定剂的含量为0.1至250mM。

4.如权利要求1所述的液体制剂，其特征在于，所述依那西普的含量为1至100mM。

5.如权利要求1所述的液体制剂，其特征在于，与不含稳定剂的制剂相比，所述液体制剂通过减少因储存过程中变性而产生的依那西普副产物，而具有提高的依那西普储存稳定性。

6.如权利要求1所述的液体制剂，其特征在于，还包含一种或多种选自下组的材料：缓冲液、等渗剂、赋形剂或防腐剂。

7.如权利要求6所述的液体制剂，其特征在于，所述缓冲液选自下组：柠檬酸盐、磷酸盐、琥珀酸盐、酒石酸盐、富马酸盐、葡萄糖酸盐、草酸盐、乳酸盐、醋酸盐、组氨酸和Tris。

8.如权利要求6所述的液体制剂，其特征在于，所述缓冲液的含量为0.1至100mM。

9.如权利要求6所述的液体制剂，其特征在于，所述等渗剂选自下组：氯化钠、氯化钾、硼酸、硼酸钠、甘露醇、丙三醇、丙二醇、聚乙二醇、麦芽糖、蔗糖、赤藓醇、阿糖醇、木糖醇、山梨醇和葡萄糖。

10.如权利要求6所述的液体制剂，其特征在于，所述等渗剂的含量为1至1000mM。

11.如权利要求1所述的液体制剂，其特征在于，所述液体制剂包含1至100mg/mL的依那西普，0.1至250mM的甲硫氨酸或其药学上可接受的盐，0.1至100mM的磷酸盐缓冲液和1至1000mM的氯化钠。

12.如权利要求1所述的液体制剂，其特征在于，所述液体制剂包含1至100mg/mL的依那西普，0.1至250mM的赖氨酸或其药学上可接受的盐，0.1至100mM的磷酸盐缓冲液和1至1000mM的氯化钠。

13.如权利要求1所述的液体制剂，其特征在于，所述液体制剂包含1至100mg/mL的依那西普，0.1至250mM的组氨酸或其药学上可接受的盐，0.1至100mM的磷酸盐缓冲液和1至1000mM的氯化钠。

14.如权利要求1所述的液体制剂，其特征在于，所述液体制剂包含1至100mg/mL的依那西普，0.1至250mM的组氨酸或其药学上可接受的盐，0.1至250mM的赖氨酸或其药学上可接受的盐，0.1至100mM的磷酸盐缓冲液和1至1000mM的氯化钠。

15.如权利要求1所述的液体制剂，其特征在于，所述液体制剂包含1至100mg/mL的依那西普，0.1至250mM的组氨酸或其药学上可接受的盐，0.1至250mM的甲硫氨酸或其药学上可接受的盐，0.1至100mM的磷酸盐缓冲液和1至1000mM的氯化钠。

16.如权利要求1所述的液体制剂，其特征在于，所述液体制剂包含1至100mg/mL的依那西普，0.1至250mM的甲硫氨酸或其药学上可接受的盐，0.1至250mM的赖氨酸或其药学上可接受的盐，0.1至100mM的磷酸盐缓冲液和1至1000mM的氯化钠。