[go: up one dir, main page]

HK1204571B - 蛋白酶調節的抗體 - Google Patents

蛋白酶調節的抗體 Download PDF

Info

Publication number
HK1204571B
HK1204571B HK15105185.7A HK15105185A HK1204571B HK 1204571 B HK1204571 B HK 1204571B HK 15105185 A HK15105185 A HK 15105185A HK 1204571 B HK1204571 B HK 1204571B
Authority
HK
Hong Kong
Prior art keywords
ser
gly
pro
val
thr
Prior art date
Application number
HK15105185.7A
Other languages
English (en)
Other versions
HK1204571A1 (zh
Inventor
Zhuozhi Wang
Ruth WINTER
John Murphy
Original Assignee
Bayer Healthcare Llc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Bayer Healthcare Llc filed Critical Bayer Healthcare Llc
Priority claimed from PCT/US2013/031363 external-priority patent/WO2013148248A1/en
Publication of HK1204571A1 publication Critical patent/HK1204571A1/zh
Publication of HK1204571B publication Critical patent/HK1204571B/zh

Links

Description

蛋白酶调节的抗体
本申请要求2012年3月30日提交的系列号61/617,837的权益，其通过引用以其整体并入本文。
本公开引用的所有文件通过引用以其整体并入本文。
本申请通过引用并入2012年3月26日建立并命名为“0297301274sequencelisting.txt”的64kb文本文件，其为本申请的序列表。
技术领域
技术领域是血友病和其它凝血病的治疗。
附图说明
图1.蛋白酶调节的抗体的实施方案的图解说明。VH，重链可变区；VL，轻链可变区；CH，重链恒定区；CL，轻链恒定区。
图2.有和没有凝血酶消化的两个蛋白酶调节的抗TFPI Fab片段（“Fab-1”和“Fab-2”）的蛋白印迹。
图3.图形显示通过ELISA测定的有和没有凝血酶消化的Fab-1和Fab-2的组织因子途径抑制剂（TFPI）结合。
图4.图形显示有和没有凝血酶消化的Fab-1（Fab1）和Fab-2（Fab2）的TFPI结合的BIACORETM测量。
图5.在HEK293 6E细胞中表达的纯化的IgG抗体的SDS-PAGE。
图6.亲本IgG（“亲本IgG”；顶部）和IgG2-接头1（底部）的蛋白印迹。泳道1，用凝血酶（1单位）消化；泳道2，无蛋白酶（对照）；泳道3，用牛纤溶酶消化；泳道4，用肠激酶（0.02 µg）消化；泳道5，用牛因子Xa（1 µg）消化；泳道6，用蛋白裂解酶（matriptase，MTSP）（0.5 µg）消化；泳道7，用尿激酶（uPA）（0.25 µg）消化；泳道8，用人鼻病毒3C蛋白酶（HRV 3C）（2单位）消化。
图7.图形显示通过ELISA测定的有和没有凝血酶消化的IgG的TFPI结合。
图8.图形显示有和没有凝血酶消化的亲本IgG和IgG-接头1的TFPI结合的BIACORETM测量。
图9.蛋白印迹，显示用人蛋白酶的IgG-接头1和WT抗体的蛋白酶消化。
发明详述
本公开提供了蛋白酶调节的抗体，其特异性结合组织因子途径抑制剂（TFPI）。所述抗体可用于治疗出血性疾病，例如血友病。在一些实施方案中，蛋白酶调节的抗TFPI抗体可以被凝血酶和/或纤溶酶切割。通过初始抑制TFPI，这些蛋白酶调节的抗TFPI抗体促进凝血酶和/或纤溶酶的生成，其依次切割抗体并去除或显著降低它们对TFPI的结合活性。此负反馈允许所述抗体促进在安全的治疗窗口内的凝血。
1.蛋白酶调节的抗TFPI抗体
本文公开的蛋白酶调节的抗体特异性结合TFPI，即，它们结合TFPI的亲和力高于（例如，至少两倍高于）它们对于不相关抗原（例如BSA，酪蛋白）的结合亲和力。如本文所用术语“组织因子途径抑制剂”或“TFPI”指细胞天然表达的人TFPI的任何变体、同种型和物种同源物。
在一些实施方案中，蛋白酶调节的抗体结合TFPI，具有至少约105 M-1至约1012 M-1的亲和力(例如105 M-1、105.5 M-1、106 M-1、106.5 M-1、107 M-1、107.5 M-1、108 M-1、108.5 M-1、109 M-1、109.5 M-1、1010 M-1、1010.5 M-1、1011 M-1、1011.5 M-1、1012 M-1)。抗体结合抗原的亲和力(Kd)可以使用任何本领域已知的方法测定，例如免疫测定诸如酶联免疫特异性测定（ELISA）、生物分子相互作用分析（BIA）(例如，Sjolander & Urbaniczky; Anal. Chem.63:2338-2345, 1991; Szabo, 等, Curr. Opin. Struct. Biol. 5:699-705, 1995)，和用于对表达抗原的细胞上结合的抗体定量的荧光激活细胞分选(FACS)。BIA是用于实时分析生物特异性相互作用，而不标记任何相互作用物的技术（例如BIACORETM）。光学现象表面等离子体共振（SPR）中的变化可以用作生物分子之间的实时反应的指示。
蛋白酶调节的抗TFPI抗体可以使用基本上全长的免疫球蛋白分子（例如IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3、IgG4、IgM、IgD、IgE、IgA），其抗原结合片段，例如Fab或F(ab′)2或包含抗原结合位点能够特异性结合TFPI的构建体，例如scFv、Fv或二体（diabody）进行构建。术语“抗体”还包括其它蛋白支架，所述其它蛋白支架能够容纳抗体互补决定区（CDR）插入与天然抗体中发现的相同活性结合构象，使得对这些嵌合蛋白观察到的对TFPI的结合相对于所述CDR衍生自的天然抗体的TFPI结合活性得以保留。
如本文所用“分离的抗体”是基本上不含具有不同抗原特异性的其它抗体的抗体（例如，结合TFPI的分离的抗体基本上不含结合TFPI之外的抗原的抗体）。但是，结合人TFPI的表位、同种型或变体的分离的抗体可以具有对其它相关抗原的的交叉反应性，例如来自其它物种的抗原（例如，TFPI物种同源物）。分离的抗体可以基本上不含其它细胞材料和/或化学品。
本文公开的蛋白酶调节的抗体被工程改造以包含被一种或多种蛋白酶识别的蛋白酶切割位点。如本文所用，“蛋白酶切割位点”指被蛋白酶识别并切割的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述蛋白酶切割位点位于其可变和恒定区之间的位置。在一些实施方案中，所述蛋白酶调节的抗TFPI抗体包括可以被凝血酶、纤溶酶和/或因子Xa切割的一个或多个蛋白酶切割位点。在一些实施方案中，蛋白酶调节的抗TFPI抗体的可变和恒定区之间的氨基酸序列除了蛋白酶切割位点之外还包含多肽接头（如例如图1中图解说明）。所述接头可以是单个氨基酸或多肽序列（例如，至多100个氨基酸）。例如所述接头可以是GGGGS（SEQ IDNO：149）。其它可用的接头包括SEQ ID NO：151-176中所示的那些。在其它实施方案中，不存在接头，并且切割位点本身插入在可变和恒定区之间。
已经确定了至少两个最优的凝血酶切割位点：(1) X1-X2-P-R-X3-X4 (SEQ ID NO:147)，其中X1和X2是疏水氨基酸，并且X3和X4是非酸性氨基酸，和(2) GRG。凝血酶特异性在精氨酸残基后切割。纤溶酶也可以切割上述两个切割位点，但是相比凝血酶具有较低的特异性。其它可用的凝血酶切割位点提供为SEQ ID NO：1-60。其它可用的纤溶酶切割位点提供为SEQ ID NO：12、47、48、53和61-130。在一些实施方案中，所述切割位点是LVPRGS (SEQID NO:137)。
在一些实施方案中，使用因子Xa切割位点，例如I-(E或D)-G-R (SEQ ID NO:148)。其它可用的因子Xa切割位点提供为SEQ ID NO：29、59和61-69。其它凝血酶和FXa切割位点或序列可以见于先前的发表，作者为 Bianchini [Bianchini EP 等 2002 JBC]。一种蛋白酶调节的抗体可以包括超过一种蛋白酶切割位点。
除了切割位点，还可以将一个第二蛋白酶结合位点称为外位点（exosite）导入蛋白酶调节的TFPI抗体以使切割更加有效。凝血酶的外位点可以来自蛋白酶底物或抑制剂例如PAR1、纤维蛋白原和水蛭素的天然外位点。所述外位点还可以是天然外位点的衍生物。
蛋白酶调节的TFPI抗体可以合成或重组产生。可利用一些技术产生抗体。例如，可使用噬菌体-抗体技术生成抗体(Knappik等, J. Mol. Biol. 296:57-86, 2000)。另一个获得抗体的方法是筛选来自B细胞的DNA文库，例如WO 91/17271和WO 92/01047中所述。在这些方法中，产生噬菌体文库，其中的成员在它们的外表面展示不同的抗体。抗体通常展示为Fv或Fab片段。通过亲和力富集选择结合所选蛋白的噬菌体展示的抗体。也可以使用三源杂交瘤技术产生抗体(例如, Oestberg 等, Hybridoma 2:361-367, 1983; 美国专利4,634,664; 美国专利4,634,666)。
还可以从任何表达抗体的细胞纯化抗体，包括已用编码抗体的表达构建体转染的宿主细胞。所述宿主细胞可以在抗体从中表达的条件下培养。使用本领域熟知的方法，纯化的抗体可以与其它细胞组分分离，所述其它细胞组分在细胞中可以与抗体关联，例如某些蛋白、碳水化合物或脂质。这些方法包括但不限于，尺寸排阻层析、硫酸铵分级、离子交换层析、亲和层析和制备型凝胶电泳。制备物的纯度可以通过任何本领域已知的手段评估，例如SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳。纯化的抗体的制备物可以包含超过一种类型的抗体。
可替代地，蛋白酶调节的抗TFPI抗体可以使用合成其氨基酸序列的化学方法产生，例如通过使用固相技术直接肽合成（例如，Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 85:2149-2154, 1963; Roberge 等, Science 269:202-204, 1995）。可以使用手工技术或通过自动化进行蛋白合成。任选地，抗体片段可以使用化学方法单独合成和组合以产生全长分子。
蛋白酶调节的抗TFPI抗体还可以构建为“单链Fv（scFv）形式”，其中蛋白酶切割位点插入scFv的轻链可变区和重链可变区之间的肽接头中或在其附近。因为肽接头对于将用于抗原结合的scFv的两个可变区保持在一起是必需的，所以肽接头或侧翼区域的切割使得目标蛋白酶失活或下调scFv对其抗原的结合。氨基酸序列SEQ ID NO:179（其可以由SEQ IDNO:180编码）是以scFv形式的蛋白酶调节的抗TFPI抗体的实例。
在一些实施方案中，蛋白酶调节的TFPI抗体构建成“IgG形式”，具有两个结合位点，并可以在重链、轻链或两者上包含一个、两个、三个或四个蛋白酶切割位点。在每种情况下，蛋白酶切割位点可以在任一端或两端侧接接头。此外，在每种情况下，所述切割位点可以是相同的或不同的。“IgG-接头1”（实施例5）和“IgG-接头2”是以IgG形式的蛋白酶调节的抗TFPI抗体的实例：
。
2.负反馈
蛋白酶调节的抗体可以包含作为抗体功能的结果上调或生成的蛋白酶的蛋白酶切割位点。这些蛋白酶可以然后切割蛋白酶调节的抗体，由此提供负反馈环，其可以用于防止蛋白酶调节的抗体的过度活性。
例如，可以被凝血酶和/或纤溶酶切割的蛋白酶调节的抗TFPI抗体可以展示这样的负反馈效果。这样的蛋白酶调节的抗TFPI抗体促进凝血酶和/或纤溶酶的生成。凝血酶和纤溶酶会依次切割蛋白酶调节的抗TFPI抗体并去除或显著降低它们对TFPI的结合活性。此负反馈使得所述抗体促进在安全的治疗窗口内的凝血。
3.多核苷酸
本公开还提供编码蛋白酶调节的抗体的多核苷酸。这些多核苷酸可以用于，例如产生用于治疗用途的抗体量。
编码抗体的cDNA分子可以用标准分子生物学技术使用mRNA作为模板制备。此后，可以使用本领域已知的和公开于手册（例如，Sambrook，等，Molecular Cloning: ALaboratory Manual, (第二版, Cold Spring Harbor Laboratory Press; Cold SpringHarbor, N.Y.; 1989)第1-3卷）的分子生物学技术复制cDNA分子。可以使用扩增技术，例如PCR，获得所述多核苷酸的额外拷贝。可替代地，可以使用合成化学技术合成编码蛋白酶调节的抗TFPI抗体的多核苷酸。
为了表达编码抗体的多核苷酸，可以将所述多核苷酸插入表达载体，所述表达载体包含对于插入的编码序列的转录和翻译的必需元件。可以使用本领域技术人员熟知的方法构建包含编码抗体的序列和适当的转录和翻译控制元件的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术，合成技术和体内遗传重组。这些技术描述于，例如Sambrook, 等 (1989)和Ausubel, 等, (Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NewYork, N.Y., 1995)。
可以利用多种表达载体/宿主系统来包含和表达编码抗体的序列。这些包括但不限于，微生物，例如用重组细菌噬菌体、质粒或粘粒DNA表达载体转化的细菌；用酵母表达载体转化的酵母；用病毒表达载体（例如，杆状病毒）转染的昆虫细胞系统；用病毒表达载体（例如，花椰菜花叶病毒、CaMV、烟草花叶病毒、TMV）转化的植物细胞系统；或细菌表达载体（例如Ti或pBR22质粒），或动物细胞系统。
控制元件或调节序列是那些载体的非翻译区——增强子、启动子、5'和3'非翻译区——其与宿主细胞蛋白相互作用以进行转录和反应。这些元件的强度和特异性可以变化。取决于载体系统和宿主，可以使用任何数目的合适的转录和翻译元件，包括组成型和诱导型启动子。例如，当在细菌系统中克隆时，可以使用诱导型启动子。在昆虫细胞中可以使用杆状病毒多角体启动子。可以将衍生自植物细胞的基因组（例如，热休克，RUBISCO和贮藏蛋白基因）的启动子或增强子或衍生自植物病毒的启动子或增强子（例如，病毒启动子或前导序列）克隆到载体中。在哺乳动物细胞系统中，可以使用来自哺乳动物基因或来自哺乳动物病毒的启动子。如果有必要生成包含编码抗体的核苷酸序列的多个拷贝的细胞系，可以使用具有适当的可选择标志物的基于SV40或EBV的载体。
描述另外的有用的分子生物学技术（包括抗体的制备）的一般文件是Berger和Kimmel (Guide to Molecular Cloning Techniques, Methods in Enzymology, Vol.152, Academic Press, Inc.); Sambrook, 等, (Molecular Cloning: A LaboratoryManual, (Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press; Cold SpringHarbor, N.Y.; 1989) Vol. 1-3); Current Protocols in Molecular Biology, (F. M.Ausabel et al. [Eds.], Current Protocols, a joint venture between GreenPublishing Associates, Inc. and John Wiley & Sons, Inc. (supplemented through2000)); Harlow 等, (Monoclonal Antibodies: A Laboratory Manual, Cold SpringHarbor Laboratory Press (1988), Paul [Ed.]); Fundamental Immunology,(Lippincott Williams & Wilkins (1998)); 以及Harlow,等(Using Antibodies: ALaboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1998))。
4.药物组合物
蛋白酶调节的抗TFPI抗体可以在包含药学可接受的载体的药物组合物中提供。所述药学可接受的载体优选是非热原的。包含蛋白酶调节的抗TFPI抗体的药物组合物可以单独施用或组合至少一种其它试剂（例如稳定化组合物）施用，其可以在任何无菌、生物相容的药物载体中使用，所述载体包括但不限于盐水、缓冲盐水、葡萄糖和水。可以采用各种水性载体，例如0.4%盐水、0.3%甘氨酸等。这些溶液是无菌的并且通常无微粒物质。这些溶液可以通过常规、熟知的灭菌技术（例如，过滤）灭菌。根据需要所述组合物可以包含药学可接受的辅助物质以接近生理条件，如pH调节剂和缓冲剂等。根据所选特定施用方式，药物组合物中蛋白酶调节的抗TFPI抗体的浓度可以广泛地变化，即从少于约0.5％，通常在或至少约1％至高达15％或20％（重量），并且将主要基于流体体积，粘度等进行选择。参见美国专利号5,851,525。如果需要，在药物组合物中可以包括超过一种不同的蛋白酶调节的抗TFPI抗体。
除了活性成分之外，药物组合物可以包含合适的药学可接受的载体，所述载体包含促进组合物加工成可以作为药物使用的制剂的赋形剂和助剂。药物组合物可通过任何数量的途径施用，包括但不限于，口服、静脉内、肌内、动脉内、髓内、鞘内、心室内、经皮、皮下、腹膜内、鼻内、肠胃外、局部、舌下或直肠方式。
已制备药物组合物后，它们可以被放置在适当的容器中，并​​标记用于指示状况的治疗。这样的标记将包括施用的量、频率和方法。
5.方法
包含一种或多种蛋白酶调节的抗TFPI抗体的药物组合物可以单独施用给患者，或组合其它试剂、药物或凝血因子施用给患者以治疗血友病或其它凝血障碍。蛋白酶调节的抗TFPI抗体的“治疗有效剂量”指会促进凝血或减少出血时间的蛋白酶调节的抗TFPI抗体的量。治疗有效剂量的确定完全在本领域技术人员能力范围内。
最初可以在细胞培养测定中或动物模型（通常是大鼠、小鼠、兔、犬或猪）中评价治疗有效剂量。可以使用动物模型确定适当的浓度范围和施用途径。然后可以使用这些信息确定用于在人中施用的有用的剂量和途径。
可以通过标准药学程序在细胞培养或实验动物中确定蛋白酶调节的抗TFPI抗体的治疗效力和毒性，例如ED50（50%的群体中治疗有效的剂量）和LD50（对50%的群体致命的剂量）。毒性对治疗效果的剂量比例是治疗指数，并且其可以表示为比例LD50/ED50。
优选展示大治疗指数的药物组合物。在配制用于人使用的剂量范围中使用获得自细胞培养测定和动物研究的数据。在这些组合物中包含的剂量优选在循环浓度范围内，其包括具有很少或无毒性的ED50。剂量取决于所采用的剂型、患者敏感度和施用途径在此范围内变化。
确切的剂量将由医生根据需要治疗的患者相关的因素来确定。调节剂量和施用以提供足够水平的蛋白酶调节的TFPI抗体或保持所希望的效果。可考虑的因素包括疾病状态的严重性，对象的一般健康状况，对象的年龄、体重和性别，饮食，施用时间和频率，一种或多种药物组合，反应敏感性和对治疗的耐受性/反应。长效药物组合物可以每3至4天，每周，或每两周一次施用，取决于特定制剂的半衰期和清除率。
在一些实施方案中，治疗有效的蛋白酶调节的抗TFPI抗体的体内剂量范围在约5μg至约100mg/kg，约1mg至约50mg/kg，约10mg至约50mg/kg患者体重。
包含蛋白酶调节的抗TFPI抗体的药物组合物的施用模式可以是任何合适的途径，其将抗体递送至宿主（例如，皮下、肌内、静脉内或鼻内施用）。
在一些实施方案中，蛋白酶调节的抗TFPI抗体不与其它治疗剂一起施用。在一些实施方案中，蛋白酶调节的抗TFPI抗体与其它试剂（例如药物或凝血因子）组合施用，以增强凝血酶的初始产生，同时保证凝血酶水平保持低于在一些具有凝血功能障碍的人中可能导致血栓的范围。蛋白酶调节的抗TFPI抗体的施用可以在其它试剂的施用之前、之后或基本上同时。
本说明书中任何内容都不应被认为限制本公开的范围。提出的所有实施例都是代表性和非限制性的。由本领域技术人员根据所述教导的理解，可以对上述实施方案进行修改或变化。因此，应当理解，在权利要求和它们的等价物的范围内，本文公开的实施方案可以以具体描述的之外的其它方式实施。
实施例1
蛋白酶调节的抗TFPI Fab片段的构建
两种蛋白酶调节的抗TFPI Fab，“Fab-1”和“Fab-2”基于SEQ ID NO:177（重链）和SEQ ID NO:178（轻链）中所示的抗TFPI抗体序列。两种Fab都具有插入到两个可变结构域的C端的凝血酶/纤溶酶蛋白酶切割位点LVPRGS (SEQ ID NO:137)。Fab-1中的切割位点侧接(Gly)4Ser接头。Fab-2仅包含六氨基酸切割位点，不存在接头。凝血酶和纤溶酶将切割相对LVPRGS (SEQ ID NO:137)的Arg（R）残基的C端。编码Fab的DNA由GenScript合成，具有优化的密码子，用于细菌表达。下表中鉴定了用于Fab的氨基酸和DNA序列。
用限制性酶BsaI和HindIII(New England Biolabs)消化Fab编码区。使用琼脂糖凝胶纯化DNA片段并亚克隆到pBADmycHisA (Invitrogen)中。使用标准技术连接和转化克隆的DNA。通过DNA测序证实阳性克隆并用于BL21大肠杆菌表达。
实施例2
凝血酶切割的Fab的蛋白印迹
约2.5 µg粗纯化的Fab-1和Fab-2用0、2或10个单位的凝血酶(Novagen)在37℃消化1小时。消化物在4-15% CRITEREONTM TGXTM凝胶(Bio-Rad)上运行。将蛋白转移到硝酸纤维素膜上并用抗人Fab抗体(Southern Biotech)探测。
Fab-1和Fab-2切割的蛋白印迹显示于图2。所有样品是还原的。当用凝血酶处理时，对于两种Fab均观察到约12kDA的条带。在无凝血酶消化的样品中不存在这些条带，表明凝血酶切割的产物是小尺寸蛋白。
实施例3
凝血酶消化的Fab-1和Fab-2的TFPI ELISA。
约2.5 µg部分纯化的Fab-1和Fab-2用2个单位的生物素化的凝血酶（Novagen）在23℃消化过夜。将链霉亲和素琼脂糖小珠（100 µL）添加到消化物中以耗尽凝血酶。将消化的Fab样品施加到捕获琼脂糖小珠/凝血酶复合物的柱上。洗脱物包含消化的Fab。
MAXISORP® 96-孔板(Nunc)用1 µg/mL的TFPI在PBS中在4℃包被过夜。板在室温下在5%脱脂干乳PBS/0.5%TWEEN-20® (PBS-T)中封闭1小时。将未消化和消化的Fab-1和Fab-2的系列两倍稀释添加到孔中（100 µL/孔）并在RT孵育1小时。板用PBS-T洗涤5次。添加二级HRP缀合的抗Fab抗体（100 µL，1:10,000稀释）以用AMPLEX® Red (Invitrogen)溶液检测。如图3所示，凝血酶消化显著减少了TFPI结合的信号。
实施例4
凝血酶消化的Fab-1和Fab-2的BIACORE TM 测量
约2.5 µg粗纯化的Fab-1和Fab-2用2个单位的生物素化的凝血酶（Novagen）在23℃消化过夜。将链霉亲和素琼脂糖小珠（100 µL）添加到消化物中以耗尽凝血酶。将消化的Fab样品施加到捕获琼脂糖小珠/凝血酶复合物的柱上。洗脱物包含消化的Fab。
对于BIACORETM分析，使用胺偶联以100相对单位（RU）的目标水平将人TFPI(American Diagnostica)固定化，并且在流动相中注射抗体。使用HBS-p作为运行缓冲液。使用其中使表面活化并然后失活的不具有任何固定化的蛋白的空白固定化制备参考通道。进行手动运行以测量Fab和缓冲液对照的升高的RU。
如图4所示，相比未消化的Fab-1（25.6RU）和Fab2（27.9RU），不含可切割的接头的亲本Fab生成24.6RU。凝血酶切割后，Fab-1和Fab-2的结合信号减少超过50%，表明切割的Fab-1和Fab-2不仅丧失恒定结构域还丧失对TFPI的结合活性。
实施例5
IgG表达和纯化
基于SEQ ID NO:177（重链）和SEQ ID NO:178（轻链）中所示的亲本抗TFPI抗体序列构建蛋白酶调节的抗TFPI免疫球蛋白分子“IgG-接头1”。为了促进分子克隆，将BlpI位点导入到重链编码序列中。相比Fab-1中蛋白酶可切割的接头的位置，BlpI位点的导入使IgG-接头1的接头位置向恒定区迁移两个氨基酸。
HEK293 6E细胞用构建的IgG表达载体转染，并且收获包含IgG抗体的培养物上清液。使用MABSELECT SURETM亲和柱然后通过SUPERDEXTM 200层析纯化抗体。在SDS-PAGE上纯化的IgG-接头1显示在图5。
实施例6
亲本IgG和IgG-接头1的蛋白印迹
用凝血酶、牛纤溶酶、牛因子Xa、蛋白裂解酶（MTSP）、尿激酶（uPA）或人鼻病毒3C蛋白酶（HRV 3C）消化纯化的亲本IgG和IgG-接头1（0.5 µg）。抗体与蛋白酶一起在37℃孵育1小时。在4-20% CRITEREONTM TGXTM凝胶(Bio-Rad)上运行消化物。将蛋白转移到硝酸纤维素膜上并用抗人IgG重链和轻链抗体（Pierce）探测。IgG2和IgG2-接头1的蛋白印迹显示在图6中。所有样品是还原的。
完整的IgG在还原条件下产生两个条带。所述两个条带对应重链（50kD）和轻链（25kD）。消化的抗体IgG-接头1显示相对未消化的抗体的分子量迁移。使用下列蛋白酶消化抗体：凝血酶、纤溶酶、牛因子Xa、MTSP和uPA。消化的IgG-接头1抗体显示从50kD至37kD的重链的分子量迁移。此大小迁移与VH结构域从重链的丧失有关。还存在25kD轻链向约16kDa的模糊条带的分子量迁移，这表明VL结构域从轻链上切割下来。蛋白酶不切割亲本IgG，表明分子量丧失是由于工程改造进抗体的切割位点的蛋白酶消化的结果。
实施例7
凝血酶消化的亲本IgG和IgG-接头1的TFPI-结合ELISA
一微克全长抗体、亲本IgG和IgG-接头1用1单位的生物素化的凝血酶（Novagen）在37℃消化1小时。然后将50µL链霉亲和素琼脂糖小珠添加到消化物中以耗尽凝血酶。将消化的IgG样品施加到捕获琼脂糖小珠/凝血酶复合物的柱上。洗脱物包含消化的IgG。
MAXISORP® 96-孔板(Nunc)用1 µg/mL的TFPI在PBS中在4℃包被过夜。板在室温（RT）下在5%脱脂干乳PBS/0.5%TWEEN-20® (PBS-T)中封闭1小时。将未消化和消化的亲本IgG和IgG1-接头1的系列两倍稀释添加到孔中（100 µL/孔）并在RT孵育1小时。板在PBS-T中洗涤5次。添加二级HRP缀合的抗Fab抗体（100 µL，1:10,000稀释）用于用AMPLEX® Red(Invitrogen)溶液检测。
TFPI结合ELISA的结果显示于图7。显示了凝血酶消化的IgG接头-1的TFPI结合的丧失。未消化的IgG-接头1的TFPI结合与未消化的和凝血酶消化的亲本IgG的TFPI结合类似。
实施例8
亲本IgG和IgG-接头1的BIACORE TM 分析
使用胺偶联试剂盒(GE HealthCare)用低密度人TFPI固定化CM4传感器芯片。使用不同浓度的抗体进行亲本IgG和IgG-接头1的动力学测定，随后用pH1.5的甘氨酸缓冲液再生。浓度1 µg的亲本IgG和IgG-接头1抗体用1个单位的生物素化的凝血酶（Novagen）在37℃消化1小时。将消化或未消化的抗体注射到BIACORETM系统用于TFPI结合分析。下图显示从注射45 µl 6.25 µg/ml抗体或对照样品生成的信号。
在动力学测定中，亲本IgG和IgG2-接头1分别具有1.536x106 /Ms和1.902 x 106/Ms的结合速率（ka）。所述两种抗体在30分钟内不具有可测量的解离。这表明接头1的插入不显著改变所述抗体的结合活性。
凝血酶切割对抗体的效果显示于图8。凝血酶消化略减少亲本IgG在TFPI上的结合，而凝血酶消化将IgG2-接头1在TFPI上的结合从20RU减少到5RU，75%的减少。
实施例9
蛋白酶/凝血因子处理的IgG-接头1和亲本IgG的蛋白印迹
使用下列人蛋白酶/凝血因子消化80nM的IgG-接头1和WT抗体：凝血酶(0.1μM)、纤溶酶(0.1μM)、因子VIIa (0.01μM)、因子IXa (0.089μM)、因子Xa (13μM)、因子XIa ( 0.031μM)、因子XIIIa (0.03μM)。在4-15% CRITEREONTM TGX凝胶(Bio-Rad)上运行处理的材料。将蛋白转移到硝酸纤维素膜上并用抗人IgG抗体(Pierce)探测。
人凝血酶、纤溶酶和因子Xa消化的IgG-接头1、凝血酶消化最有效（图9），如通过37kDa条带的外观所示。蛋白酶不切割亲本IgG，表明分子量丧失是由于工程改造进抗体的切割位点的蛋白酶消化的结果。
序列表
<110> TBD
<120> 蛋白酶调节的抗体
<130> 012973.01274
<160> 180
<170> FastSEQ用于Windows Version 4.0
<210> 1
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 蛋白酶切位点
<400> 1
Ala His Pro Arg Ile Ile Ser Ala
1 5
<210> 2
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 蛋白酶切位点
<400> 2
Ala Arg Thr Arg Ala Arg Arg Pro
1 5
<210> 3
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 蛋白酶切位点
<400> 3
Ala Ser Ala Arg Thr Thr Gly Ser
1 5
<210> 4
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 蛋白酶切位点
<400> 4
Ala Thr Pro Arg Gly Ala Ala Pro
1 5
<210> 5
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 蛋白酶切位点
<400> 5
Ala Val Val Arg Thr Pro Pro Lys
1 5
<210> 6
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 蛋白酶切位点
<400> 6
Glu Arg Thr Arg Ser Phe Gln Leu
1 5
<210> 7
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 蛋白酶切位点
<400> 7
Phe Gly Leu Arg Phe Tyr Ala Tyr
1 5
<210> 8
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 蛋白酶切位点
<400> 8
Phe Asn Pro Arg Thr Phe Gly Ser
1 5
<210> 9
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 蛋白酶切位点
<400> 9
Phe Arg Pro Lys His Thr Arg Ile
1 5
<210> 10
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 蛋白酶切位点
<400> 10
Phe Ser Ala Arg Gly His Arg Pro
1 5
<210> 11
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 蛋白酶切位点
<400> 11
Gly Asp Ile Arg Gly Pro Arg Ile
1 5
<210> 12
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 蛋白酶切位点
<400> 12
Gly Gly Val Arg Gly Pro Arg Val
1 5
<210> 13
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 蛋白酶切位点
<400> 13
Gly Ser Phe Arg Ala Gly Leu Phe
1 5
<210> 14
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 蛋白酶切位点
<400> 14
His Lys Gly Arg Ser Ala Leu Val
1 5
<210> 15
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 蛋白酶切位点
<400> 15
Ile Ala Gly Arg Ser Leu Asn Pro
1 5
<210> 16
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 蛋白酶切位点
<400> 16
Ile Asp Gly Arg Ile Val Glu Gly
1 5
<210> 17
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 蛋白酶切位点
<400> 17
Ile Glu Pro Arg Ser Phe Ser Gln
1 5
<210> 18
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 蛋白酶切位点
<400> 18
Ile Lys Pro Arg Ile Val Gly Gly
1 5
<210> 19
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 蛋白酶切位点
<400> 19
Ile Gln Ile Arg Ser Val Ala Lys
1 5
<210> 20
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 蛋白酶切位点
<400> 20
Ile Gln Ile Arg Ser Val Ala Lys
1 5
<210> 21
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 蛋白酶切位点
<400> 21
Lys Asn Val Lys Ser Lys Ile Gly
1 5
<210> 22
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 蛋白酶切位点
<400> 22
Lys Pro Lys Asp Ser Ser Val Asp
1 5
<210> 23
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 蛋白酶切位点
<400> 23
Leu Asp Pro Arg Ser Phe Leu Leu
1 5
<210> 24
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 蛋白酶切位点
<400> 24
Leu Gly Ile Arg Ser Phe Arg Asn
1 5
<210> 25
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 蛋白酶切位点
<400> 25
Leu Pro Ile Lys Thr Phe Arg Gly
1 5
<210> 26
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 蛋白酶切位点
<400> 26
Leu Arg Pro Arg Phe Lys Ile Ile
1 5
<210> 27
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 蛋白酶切位点
<400> 27
Leu Arg Pro Arg Ile Ile Gly Gly
1 5
<210> 28
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 蛋白酶切位点
<400> 28
Leu Ser Pro Arg Gly Val His Ile
1 5
<210> 29
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 蛋白酶切位点
<400> 29
Leu Ser Pro Arg Thr Phe His Pro
1 5
<210> 30
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 蛋白酶切位点
<400> 30
Met Thr Pro Arg Ser Glu Gly Ser
1 5
<210> 31
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 蛋白酶切位点
<400> 31
Met Thr Pro Arg Ser Gly Gly Ser
1 5
<210> 32
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 蛋白酶切位点
<400> 32
Met Thr Pro Arg Ser Arg Gly Ser
1 5
<210> 33
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 蛋白酶切位点
<400> 33
Met Val Pro Arg Ala Val Tyr Leu
1 5
<210> 34
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 蛋白酶切位点
<400> 34
Asn Val Pro Arg Ile Leu Ser Pro
1 5
<210> 35
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 蛋白酶切位点
<400> 35
Pro Ala Pro Arg Gly Tyr Pro Gly
1 5
<210> 36
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 蛋白酶切位点
<400> 36
Pro Asp Leu Arg Ser Cys Val Asn
1 5
<210> 37
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 蛋白酶切位点
<400> 37
Pro Gly Pro Arg Gly Pro Pro Pro
1 5
<210> 38
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 蛋白酶切位点
<400> 38
Pro Gly Ser Arg Ser Arg Thr Pro
1 5
<210> 39
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 蛋白酶切位点
<400> 39
Pro Gln Gly Arg Ile Val Gly Gly
1 5
<210> 40
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 蛋白酶切位点
<400> 40
Pro Gln Gly Arg Thr Thr Ala His
1 5
<210> 41
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 蛋白酶切位点
<400> 41
Pro Arg Ser Phe Leu Leu Arg Asn
1 5
<210> 42
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 蛋白酶切位点
<400> 42
Gln Ser Pro Arg Ser Phe Gln Lys
1 5
<210> 43
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 蛋白酶切位点
<400> 43
Gln Ser Pro Arg Ser Phe Gln Lys
1 5
<210> 44
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 蛋白酶切位点
<400> 44
Gln Tyr Leu Arg Val Pro Leu Val
1 5
<210> 45
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 蛋白酶切位点
<400> 45
Ser Glu Phe Arg Cys Leu Thr Pro
1 5
<210> 46
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 蛋白酶切位点
<400> 46
Ser Ile Gly Arg Ala Ser Leu His
1 5
<210> 47
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 蛋白酶切位点
<400> 47
Ser Lys Gly Arg Ser Leu Ile Gly
1 5
<210> 48
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 蛋白酶切位点
<400> 48
Ser Arg Leu Arg Ala Tyr Leu Leu
1 5
<210> 49
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 蛋白酶切位点
<400> 49
Thr Cys Leu Arg Ser Thr Lys Phe
1 5
<210> 50
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 蛋白酶切位点
<400> 50
Val Cys Leu Arg Ser Phe Gln Thr
1 5
<210> 51
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 蛋白酶切位点
<400> 51
Val Asp Pro Arg Leu Ile Asp Gly
1 5
<210> 52
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 蛋白酶切位点
<400> 52
Val Glu Val Lys Ser Glu Lys Leu
1 5
<210> 53
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 蛋白酶切位点
<400> 53
Val Ile Pro Lys Arg Ile Ser Pro
1 5
<210> 54
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 蛋白酶切位点
<400> 54
Val Ile Pro Arg Ser Gly Gly Ser
1 5
<210> 55
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 蛋白酶切位点
<400> 55
Val Asn Pro Arg Gly Ile Val Thr
1 5
<210> 56
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 蛋白酶切位点
<400> 56
Val Gln Pro Arg Ala Gln Lys Ile
1 5
<210> 57
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 蛋白酶切位点
<400> 57
Val Ser Pro Arg Ala Ser Ala Ser
1 5
<210> 58
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 蛋白酶切位点
<400> 58
Val Val Pro Arg Gly Val Asn Leu
1 5
<210> 59
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 蛋白酶切位点
<400> 59
Trp Tyr Leu Arg Ser Asn Asn Gly
1 5
<210> 60
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 蛋白酶切位点
<400> 60
Trp Tyr Leu Arg Ser Asn Thr Gly
1 5
<210> 61
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 蛋白酶切位点
<400> 61
Ala Phe Trp Lys Thr Asp Ala Ser
1 5
<210> 62
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 蛋白酶切位点
<400> 62
Ile Glu Gly Arg Thr Ala Thr Ser
1 5
<210> 63
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 蛋白酶切位点
<400> 63
Thr Ala Ala Arg Gln Ser Thr Asn
1 5
<210> 64
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 蛋白酶切位点
<400> 64
Ile Asp Gly Arg Ile Val Glu Gly
1 5
<210> 65
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 蛋白酶切位点
<400> 65
Phe Asn Pro Arg Thr Phe Gly Ser
1 5
<210> 66
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 蛋白酶切位点
<400> 66
Arg Val Pro Lys Ser Phe Pro Phe
1 5
<210> 67
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 蛋白酶切位点
<400> 67
Pro Gln Leu Arg Met Lys Asn Asn
1 5
<210> 68
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 蛋白酶切位点
<400> 68
Ser Ser Trp Arg Leu Thr Ser Ser
1 5
<210> 69
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 蛋白酶切位点
<400> 69
Leu Gly Ile Arg Ser Phe Arg Asn
1 5
<210> 70
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 蛋白酶切位点
<400> 70
Ala Met Ser Arg Met Ser Leu Ser
1 5
<210> 71
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 蛋白酶切位点
<400> 71
Ala Asn Asn Arg Asp Asn Thr Tyr
1 5
<210> 72
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 蛋白酶切位点
<400> 72
Ala Asn Val Arg Arg Lys Arg Tyr
1 5
<210> 73
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 蛋白酶切位点
<400> 73
Ala Arg Gly Arg Ala Phe Pro Gln
1 5
<210> 74
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 蛋白酶切位点
<400> 74
Ala Thr Leu Lys Ser Arg Lys Met
1 5
<210> 75
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 蛋白酶切位点
<400> 75
Ala Thr Gln Lys Lys Val Glu Arg
1 5
<210> 76
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 蛋白酶切位点
<400> 76
Ala Thr Trp Lys Thr Arg Trp Tyr
1 5
<210> 77
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 蛋白酶切位点
<400> 77
Asp Val Gly Glu Tyr Asn Val Phe
1 5
<210> 78
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 蛋白酶切位点
<400> 78
Glu Ala Arg Gly Ser Val Ile Leu
1 5
<210> 79
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 蛋白酶切位点
<400> 79
Glu Ala Tyr Arg Arg Phe Tyr Gly
1 5
<210> 80
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 蛋白酶切位点
<400> 80
Glu Asp Asn Arg Asp Ser Ser Met
1 5
<210> 81
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 蛋白酶切位点
<400> 81
Glu Thr Leu Lys Val Ile Asp Glu
1 5
<210> 82
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 蛋白酶切位点
<400> 82
Phe Arg Ala Arg Ala Tyr Gly Phe
1 5
<210> 83
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 蛋白酶切位点
<400> 83
Gly Glu Ala Arg Gly Ser Val Ile
1 5
<210> 84
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 蛋白酶切位点
<400> 84
Gly Gly Tyr Arg Ala Arg Pro Ala
1 5
<210> 85
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 蛋白酶切位点
<400> 85
Gly Ile Leu Lys Glu Asn Ala Ala
1 5
<210> 86
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 蛋白酶切位点
<400> 86
Gly Pro Lys Arg Gly Thr Glu Pro
1 5
<210> 87
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 蛋白酶切位点
<400> 87
Ile Ile Arg Arg Ser Ile Gln Ile
1 5
<210> 88
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 蛋白酶切位点
<400> 88
Ile Thr Phe Arg Met Asn Val Ala
1 5
<210> 89
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 蛋白酶切位点
<400> 89
Lys His Ser Lys Arg His Ile His
1 5
<210> 90
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 蛋白酶切位点
<400> 90
Lys Lys Asp Arg Ala Arg Gln Glu
1 5
<210> 91
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 蛋白酶切位点
<400> 91
Lys Lys Pro Arg Cys Gly Val Pro
1 5
<210> 92
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 蛋白酶切位点
<400> 92
Lys Gln Val Lys Asp Asn Glu Asn
1 5
<210> 93
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 蛋白酶切位点
<400> 93
Leu Asp Pro Arg Ser Phe Leu Leu
1 5
<210> 94
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 蛋白酶切位点
<400> 94
Leu Pro Pro Lys Ser Gln Pro Pro
1 5
<210> 95
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 蛋白酶切位点
<400> 95
Leu Ser Phe Arg Ala Arg Ala Tyr
1 5
<210> 96
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 蛋白酶切位点
<400> 96
Met Ser Met Arg Val Arg Arg His
1 5
<210> 97
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 蛋白酶切位点
<400> 97
Asn Ser Gly Arg Ala Val Thr Tyr
1 5
<210> 98
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 蛋白酶切位点
<400> 98
Pro Ala Pro Arg Gly Tyr Pro Gly
1 5
<210> 99
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 蛋白酶切位点
<400> 99
Pro Glu Ala Lys Ala Ser Cys Tyr
1 5
<210> 100
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 蛋白酶切位点
<400> 100
Pro Glu Ser Lys Ala Thr Asn Ala
1 5
<210> 101
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 蛋白酶切位点
<400> 101
Pro Gly Pro Lys Arg Gly Thr Glu
1 5
<210> 102
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 蛋白酶切位点
<400> 102
Pro Lys Ala Lys Ser His Ala Pro
1 5
<210> 103
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 蛋白酶切位点
<400> 103
Pro Leu Asp Lys Lys Arg Glu Glu
1 5
<210> 104
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 蛋白酶切位点
<400> 104
Pro Leu Gln Lys Gln Leu Pro Ala
1 5
<210> 105
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 蛋白酶切位点
<400> 105
Pro Gln Phe Arg Ile Lys Gly Gly
1 5
<210> 106
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 蛋白酶切位点
<400> 106
Pro Gln Leu Arg Leu Pro His Thr
1 5
<210> 107
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 蛋白酶切位点
<400> 107
Pro Gln Leu Arg Arg Gly Trp Arg
1 5
<210> 108
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 蛋白酶切位点
<400> 108
Pro Gln Ser Arg Ser Val Pro Pro
1 5
<210> 109
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 蛋白酶切位点
<400> 109
Pro Arg Phe Lys Ile Ile Gly Gly
1 5
<210> 110
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 蛋白酶切位点
<400> 110
Pro Tyr Leu Lys Val Phe Asn Pro
1 5
<210> 111
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 蛋白酶切位点
<400> 111
Gln Lys Ser Arg Asn Gly Leu Arg
1 5
<210> 112
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 蛋白酶切位点
<400> 112
Gln Leu Ile Lys Ala Ile Gln Leu
1 5
<210> 113
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 蛋白酶切位点
<400> 113
Gln Arg Tyr Lys Val Asp Tyr Glu
1 5
<210> 114
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 蛋白酶切位点
<400> 114
Arg Ala Gln Arg Ser Ala Gly Ala
1 5
<210> 115
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 蛋白酶切位点
<400> 115
Arg Gly Pro Arg Val Val Glu Arg
1 5
<210> 116
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 蛋白酶切位点
<400> 116
Arg Pro Ala Lys Ala Ala Ala Thr
1 5
<210> 117
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 蛋白酶切位点
<400> 117
Arg Arg Lys Arg Tyr Ala Ile Gln
1 5
<210> 118
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 蛋白酶切位点
<400> 118
Arg Ser Ser Lys Gly Arg Ser Leu
1 5
<210> 119
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 蛋白酶切位点
<400> 119
Arg Ser Thr Arg Phe Ala Ala Thr
1 5
<210> 120
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 蛋白酶切位点
<400> 120
Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys
1 5
<210> 121
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 蛋白酶切位点
<400> 121
Ser Ile Asn Lys Ser Ser Pro Leu
1 5
<210> 122
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 蛋白酶切位点
<400> 122
Ser Gln Pro Pro Glu Lys Thr Glu
1 5
<210> 123
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 蛋白酶切位点
<400> 123
Ser Gln Arg Lys His Ser Lys Arg
1 5
<210> 124
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 蛋白酶切位点
<400> 124
Ser Ser Met Lys Leu Ser Phe Arg
1 5
<210> 125
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 蛋白酶切位点
<400> 125
Thr Glu Pro Lys Val Lys Leu Pro
1 5
<210> 126
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 蛋白酶切位点
<400> 126
Thr Glu Tyr Arg Leu Val Ser Ile
1 5
<210> 127
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 蛋白酶切位点
<400> 127
Thr His Glu Lys Gly Arg Gln Ser
1 5
<210> 128
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 蛋白酶切位点
<400> 128
Thr Tyr Ser Lys Ala Ser Thr Pro
1 5
<210> 129
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 蛋白酶切位点
<400> 129
Thr Tyr Ser Arg Ser Arg Tyr Leu
1 5
<210> 130
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 蛋白酶切位点
<400> 130
Val Ser Asn Lys Val Ser Met Ser
1 5
<210> 131
<211> 228
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Fab-1轻链
<400> 131
Ser Tyr Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ser Pro Gly Gln
1 5 10 15
Thr Ala Arg Ile Thr Cys Ser Gly Asp Asn Leu Pro Lys Tyr Tyr Ala
20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Val Val Ile Phe
35 40 45
Tyr Asp Val Asn Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Thr Gln Ala Met
65 70 75 80
Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ala Trp Trp Ser Ser Thr Pro Val
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gly Gly Gly Ser Leu
100 105 110
Val Pro Arg Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gln Pro Lys Ala Ala
115 120 125
Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu Leu Gln Ala Asn
130 135 140
Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr Pro Gly Ala Val
145 150 155 160
Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val Lys Ala Gly Val Glu
165 170 175
Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr Ala Ala Ser Ser
180 185 190
Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser His Arg Ser Tyr Ser
195 200 205
Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys Thr Val Ala Pro
210 215 220
Thr Glu Cys Ser
225
<210> 132
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 蛋白酶切位点和接头
<400> 132
Gly Gly Gly Gly Ser Leu Val Pro Arg Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
<210> 133
<211> 245
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Fab-1重链
<400> 133
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Gly Met Asp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ser Ile Arg Gly Ser Arg Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Leu Tyr Arg Tyr Trp Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Leu Val Pro Arg Gly Ser
115 120 125
Gly Gly Gly Gly Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu
130 135 140
Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys
145 150 155 160
Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser
165 170 175
Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser
180 185 190
Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Asn
195 200 205
Phe Gly Thr Gln Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn
210 215 220
Thr Lys Val Asp Lys Thr Val Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys His
225 230 235 240
His His His His His
245
<210> 134
<211> 1590
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 编码Fab-1的序列
<400> 134
ggtctcacat gaaaaaaacc gctatcgcta tcgccgtcgc actggctggc ttcgcaaccg 60
tggcacaggc atcctatgaa ctgacccaac cgccgagtgt ctccgtgtca ccgggtcaga 120
cggcacgtat tacctgcagc ggtgataacc tgccgaaata ttacgcgcat tggtatcagc 180
aaaaaccggg ccaagccccg gtggttgtca tcttttatga cgttaatcgt ccgtccggta 240
tcccggaacg cttctcgggc agcaactctg gtaatacggc aaccctgacg atcagcggca 300
cccaggcaat ggatgaagct gactattact gtcaagcatg gtggagctct acgccggtgt 360
ttggcggtgg cacgaaactg accgtgctgg gtggcggtgg ctctctggtt ccgcgtggct 420
ccggtggcgg tggctcaggc cagccgaaag cagcaccgag tgttaccctg tttccgccga 480
gttccgaaga actgcaagca aacaaagcta ccctggtgtg cctgattagc gatttctatc 540
cgggcgcagt tacggtcgcg tggaaagccg actcatcgcc ggtgaaagct ggtgttgaaa 600
ccacgacccc gtcaaaacag tcgaacaata aatatgcagc tagctcttac ctgtctctga 660
ccccggaaca gtggaaaagt catcgcagtt actcctgtca agttacgcac gaaggctcca 720
cggtcgaaaa aaccgtggca ccgacggaat gctcatgata agcatgcgta ggagaaaata 780
aaatgaaaca gtctaccatc gcactggcac tgctgccgct gctgtttacg ccggtgacca 840
aagcagaagt tcagctggtc gaaagtggtg gcggtctggt tcaaccgggc ggttcactgc 900
gtctgtcgtg cgcagcaagc ggttttacct tcagttccta tggtatggat tgggtccgtc 960
aggcaccggg taaaggtctg gaatgggtgt catcgattcg tggcagccgc ggttctacct 1020
attacgccga ttcagttaaa ggccgtttta ccatctctcg cgacaacagt aaaaatacgc 1080
tgtatctgca gatgaacagc ctgcgcgcgg aagataccgc cgtgtattac tgtgcccgtc 1140
tgtatcgcta ctggttcgac tactggggcc agggtacgct ggtgaccgtt agctctggcg 1200
gtggcggttc gctggtcccg cgtggcagcg gcggtggcgg ttcagcgagc accaaaggtc 1260
cgagcgtgtt tccgctggca ccgtgcagcc gctctaccag tgaatccacg gcagctctgg 1320
gttgtctggt gaaagattat tttccggaac cggtcaccgt gagttggaac tccggcgcac 1380
tgacctcggg tgttcatacg ttcccggctg tcctgcagag ttccggcctg tatagcctgt 1440
catcggtggt taccgttccg agctctaatt tcggcaccca aacgtacacc tgcaacgtcg 1500
atcacaaacc gtctaatacc aaagttgaca aaacggttga ttacaaagac gacgacgaca 1560
aacaccacca ccaccaccat tgataagctt 1590
<210> 135
<211> 218
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Fab-2轻链
<400> 135
Ser Tyr Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ser Pro Gly Gln
1 5 10 15
Thr Ala Arg Ile Thr Cys Ser Gly Asp Asn Leu Pro Lys Tyr Tyr Ala
20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Val Val Ile Phe
35 40 45
Tyr Asp Val Asn Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Thr Gln Ala Met
65 70 75 80
Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ala Trp Trp Ser Ser Thr Pro Val
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Leu Val Pro Arg Gly Ser
100 105 110
Gly Gln Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser
115 120 125
Glu Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp
130 135 140
Phe Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro
145 150 155 160
Val Lys Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn
165 170 175
Lys Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys
180 185 190
Ser His Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val
195 200 205
Glu Lys Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser
210 215
<210> 136
<211> 235
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Fab-2重链
<400> 136
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Gly Met Asp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ser Ile Arg Gly Ser Arg Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Leu Tyr Arg Tyr Trp Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser Leu Val Pro Arg Gly Ser Ala Ser Thr Lys Gly
115 120 125
Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser
130 135 140
Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val
145 150 155 160
Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe
165 170 175
Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val
180 185 190
Thr Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr Tyr Thr Cys Asn Val
195 200 205
Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Thr Val Asp Tyr Lys
210 215 220
Asp Asp Asp Asp Lys His His His His His His
225 230 235
<210> 137
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 蛋白酶切位点
<400> 137
Leu Val Pro Arg Gly Ser
1 5
<210> 138
<211> 1530
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Fab-2编码序列
<400> 138
ggtctcacat gaaaaaaacg gctatcgcaa tcgctgtggc actggcaggc ttcgcaacgg 60
tcgcgcaggc atcctatgaa ctgacgcaac cgccgagtgt ctccgtgtca ccgggtcaga 120
cggcacgtat tacctgctct ggtgataacc tgccgaaata ttacgcgcat tggtatcagc 180
aaaaaccggg ccaagccccg gtggttgtca tcttttatga cgttaatcgt ccgtcgggta 240
tcccggaacg cttctcgggc agcaactctg gtaatacggc caccctgacg atctcaggca 300
cccaggcaat ggatgaagct gactattact gccaagcatg gtggagctct acgccggtgt 360
ttggcggtgg cacgaaactg accgttctgc tggtcccgcg tggctccggt cagccgaaag 420
cagccccgtc agttaccctg tttccgccga gttccgaaga actgcaagca aacaaagcta 480
ccctggtgtg tctgattagc gatttctatc cgggcgcagt tacggtcgcg tggaaagccg 540
actcatcgcc ggtcaaagct ggtgtggaaa ccaccacccc gtcaaaacag tcgaacaata 600
aatatgcagc tagctcttac ctgtcgctga ccccggaaca gtggaaaagc catcgcagtt 660
actcctgcca agttacgcac gaaggctcta cggttgaaaa aaccgtcgca ccgacggaat 720
gcagttgata agcatgcgta ggagaaaata aaatgaaaca gagcaccatc gcactggcac 780
tgctgccgct gctgtttacg ccggtcacca aagcagaagt gcagctggtt gaatctggtg 840
gcggtctggt gcaaccgggc ggttcactgc gtctgtcgtg tgcggccagc ggctttacct 900
tcagttccta tggtatggat tgggtccgtc aggcaccggg taaaggtctg gaatgggtgt 960
catcgattcg tggcagccgc ggttctacct attacgccga ttccgttaaa ggccgtttca 1020
ccatctctcg cgacaacagt aaaaatacgc tgtatctgca gatgaacagt ctgcgcgcgg 1080
aagataccgc cgtgtattac tgcgcccgtc tgtatcgcta ctggtttgac tactggggcc 1140
agggtacgct ggtgaccgtt agctctctgg ttccgcgtgg ctcagcgagc accaaaggtc 1200
cgagtgtctt cccgctggca ccgtgcagcc gctctaccag tgaatccacg gcagctctgg 1260
gttgtctggt gaaagattat tttccggaac cggtcaccgt gagttggaac tccggcgcac 1320
tgacctccgg tgtgcatacg ttcccggctg ttctgcagag ttccggcctg tattcactgt 1380
catcggtggt taccgtgccg agctctaatt ttggcaccca aacgtacacc tgtaacgttg 1440
atcacaaacc gagcaatacc aaagttgaca aaaccgttga ctacaaagac gacgacgaca 1500
aacaccacca ccaccaccac tgataagctt 1530
<210> 139
<211> 228
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> IgG2-接头1, 轻链氨基酸序列
<400> 139
Ser Tyr Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ser Pro Gly Gln
1 5 10 15
Thr Ala Arg Ile Thr Cys Ser Gly Asp Asn Leu Pro Lys Tyr Tyr Ala
20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Val Val Ile Phe
35 40 45
Tyr Asp Val Asn Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Thr Gln Ala Met
65 70 75 80
Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ala Trp Trp Ser Ser Thr Pro Val
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gly Gly Gly Ser Leu
100 105 110
Val Pro Arg Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gln Pro Lys Ala Ala
115 120 125
Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu Leu Gln Ala Asn
130 135 140
Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr Pro Gly Ala Val
145 150 155 160
Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val Lys Ala Gly Val Glu
165 170 175
Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr Ala Ala Ser Ser
180 185 190
Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser His Arg Ser Tyr Ser
195 200 205
Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys Thr Val Ala Pro
210 215 220
Thr Glu Cys Ser
225
<210> 140
<211> 458
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> IgG2-接头1, 重链氨基酸序列
<400> 140
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Gly Met Asp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ser Ile Arg Gly Ser Arg Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Leu Tyr Arg Tyr Trp Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Gly Gly Gly Gly Ser Leu Val Pro Arg
115 120 125
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu
130 135 140
Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys
145 150 155 160
Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser
165 170 175
Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser
180 185 190
Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Asn
195 200 205
Phe Gly Thr Gln Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn
210 215 220
Thr Lys Val Asp Lys Thr Val Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro
225 230 235 240
Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro
245 250 255
Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr
260 265 270
Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn
275 280 285
Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg
290 295 300
Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val
305 310 315 320
Val His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser
325 330 335
Asn Lys Gly Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys
340 345 350
Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu
355 360 365
Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe
370 375 380
Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu
385 390 395 400
Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe
405 410 415
Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly
420 425 430
Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr
435 440 445
Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
450 455
<210> 141
<211> 684
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> IgG2-接头1，轻链DNA序列
<400> 141
tcctacgagc tgacccagcc cccttccgtg tccgtgtctc ctggccagac cgcccggatc 60
acctgttccg gcgacaacct gcccaagtac tacgcccact ggtatcagca gaagcccggc 120
caggcccccg tggtggtcat cttctacgac gtgaaccggc cctccggcat ccccgagaga 180
ttctccggct ccaactccgg caacaccgcc accctgacca tctccggcac ccaggccatg 240
gacgaggccg actactactg ccaggcttgg tggtcctcca cccccgtgtt tggcggcgga 300
acaaagttaa ccgtgctggg cggtggagga tcactggttc cgcgtggctc tggcggtgga 360
ggatcaggcc agcccaaggc cgctccttcc gtgaccctgt tccccccatc ctccgaggaa 420
ctgcaggcca acaaggccac cctggtctgc ctgatctccg acttctaccc tggcgccgtg 480
accgtggcct ggaaggccga cagctctcct gtgaaggccg gcgtggaaac caccaccccc 540
tccaagcagt ccaacaacaa atacgccgcc tcctcctacc tgtccctgac ccccgagcag 600
tggaagtccc accggtccta cagctgccag gtcacacacg agggctccac cgtggaaaag 660
acagtggccc ccaccgagtg ctct 684
<210> 142
<211> 1374
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> IgG2-接头1, 重链DNA序列
<400> 142
gaggtgcagc tggtggaatc cggcggaggc ctggtccagc ctggcggatc tctgagactg 60
tcctgcgccg cctccggctt caccttctcc agctacggca tggactgggt ccgacaggcc 120
cctggcaagg gcctggaatg ggtgtcctcc atccggggct ctcggggctc cacctactac 180
gccgactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgggaca actccaagaa caccctgtac 240
ctgcagatga actccctgcg ggccgaggac accgccgtgt actactgcgc cagactgtac 300
cggtattggt tcgactactg gggccagggc accctggtca ccgtcagctc agcttctggc 360
ggaggcggct ctctggtgcc tagaggatct ggcggcggag gctccaccaa gggcccttcc 420
gtgttccctc tggccccttg ctcccggtcc acctccgagt ctaccgccgc tctgggctgc 480
ctggtcaagg attacttccc cgagcccgtg accgtgtcct ggaactctgg cgccctgacc 540
agcggcgtgc acaccttccc tgccgtgctg cagtcctccg gcctgtactc cctgtcctcc 600
gtcgtgacag tgccctcctc caacttcggc acccagacct acacctgtaa cgtggaccac 660
aagccctcca acaccaaggt ggacaagacc gtggaacgga agtgctgcgt ggaatgcccc 720
ccctgtcctg cacctcctgt ggctggacct agcgtgttcc tgttcccccc aaagcccaag 780
gacaccctga tgatctcccg gacccccgaa gtgacctgcg tggtggtgga cgtgtcccac 840
gaggaccccg aggtgcagtt caattggtac gtggacggcg tggaagtgca caacgccaag 900
accaagccca gagaggaaca gttcaactcc accttccggg tggtgtccgt gctgaccgtg 960
gtgcaccagg actggctgaa cggcaaagag tacaagtgca aggtctccaa caagggcctg 1020
cctgccccca tcgaaaagac catcagcaag accaagggcc agccccgcga gccccaggtg 1080
tacacactgc cacctagccg ggaagagatg accaagaacc aggtgtccct gacctgtctg 1140
gtcaagggct tctacccatc cgacattgcc gtggaatggg agtccaacgg ccagcccgag 1200
aacaactaca agaccacccc ccccatgctg gactccgacg gctcattctt cctgtactcc 1260
aagctgacag tggacaagtc ccggtggcag cagggcaacg tgttctcctg ctccgtgatg 1320
cacgaggccc tgcacaacca ctacacccag aagtccctgt ccctgagccc cggc 1374
<210> 143
<211> 218
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> IgG2-接头2, 轻链氨基酸序列
<400> 143
Ser Tyr Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ser Pro Gly Gln
1 5 10 15
Thr Ala Arg Ile Thr Cys Ser Gly Asp Asn Leu Pro Lys Tyr Tyr Ala
20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Val Val Ile Phe
35 40 45
Tyr Asp Val Asn Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Thr Gln Ala Met
65 70 75 80
Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ala Trp Trp Ser Ser Thr Pro Val
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Leu Val Pro Arg Gly Ser
100 105 110
Gly Gln Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser
115 120 125
Glu Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp
130 135 140
Phe Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro
145 150 155 160
Val Lys Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn
165 170 175
Lys Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys
180 185 190
Ser His Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val
195 200 205
Glu Lys Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser
210 215
<210> 144
<211> 448
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> IgG2-接头2, 重链氨基酸序列
<400> 144
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Gly Met Asp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ser Ile Arg Gly Ser Arg Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Leu Tyr Arg Tyr Trp Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Leu Val Pro Arg Gly Ser Thr Lys Gly
115 120 125
Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser
130 135 140
Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val
145 150 155 160
Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe
165 170 175
Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val
180 185 190
Thr Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr Tyr Thr Cys Asn Val
195 200 205
Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Thr Val Glu Arg Lys
210 215 220
Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro
225 230 235 240
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
245 250 255
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp
260 265 270
Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
275 280 285
Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Val
290 295 300
Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
305 310 315 320
Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys
325 330 335
Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr
340 345 350
Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr
355 360 365
Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu
370 375 380
Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met Leu
385 390 395 400
Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys
405 410 415
Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
420 425 430
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
435 440 445
<210> 145
<211> 654
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> IgG2-接头2，轻链DNA序列
<400> 145
tcctacgagc tgacccagcc cccttccgtg tccgtgtctc ctggccagac cgcccggatc 60
acctgttccg gcgacaacct gcccaagtac tacgcccact ggtatcagca gaagcccggc 120
caggcccccg tggtggtcat cttctacgac gtgaaccggc cctccggcat ccccgagaga 180
ttctccggct ccaactccgg caacaccgcc accctgacca tctccggcac ccaggccatg 240
gacgaggccg actactactg ccaggcttgg tggtcctcca cccccgtgtt tggcggcgga 300
acaaagttaa ccgtgctgct ggttccgcgt ggctctggcc agcccaaggc cgctccttcc 360
gtgaccctgt tccccccatc ctccgaggaa ctgcaggcca acaaggccac cctggtctgc 420
ctgatctccg acttctaccc tggcgccgtg accgtggcct ggaaggccga cagctctcct 480
gtgaaggccg gcgtggaaac caccaccccc tccaagcagt ccaacaacaa atacgccgcc 540
tcctcctacc tgtccctgac ccccgagcag tggaagtccc accggtccta cagctgccag 600
gtcacacacg agggctccac cgtggaaaag acagtggccc ccaccgagtg ctct 654
<210> 146
<211> 1344
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> IgG2-接头2, 重链DNA序列
<400> 146
gaggtgcagc tggtggaatc cggcggaggc ctggtccagc ctggcggatc tctgagactg 60
tcctgcgccg cctccggctt caccttctcc agctacggca tggactgggt ccgacaggcc 120
cctggcaagg gcctggaatg ggtgtcctcc atccggggct ctcggggctc cacctactac 180
gccgactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgggaca actccaagaa caccctgtac 240
ctgcagatga actccctgcg ggccgaggac accgccgtgt actactgcgc cagactgtac 300
cggtattggt tcgactactg gggccagggc accctggtca ccgtcagctc agcttctctg 360
gtgcctagag gatctaccaa gggcccttcc gtgttccctc tggccccttg ctcccggtcc 420
acctccgagt ctaccgccgc tctgggctgc ctggtcaagg attacttccc cgagcccgtg 480
accgtgtcct ggaactctgg cgccctgacc agcggcgtgc acaccttccc tgccgtgctg 540
cagtcctccg gcctgtactc cctgtcctcc gtcgtgacag tgccctcctc caacttcggc 600
acccagacct acacctgtaa cgtggaccac aagccctcca acaccaaggt ggacaagacc 660
gtggaacgga agtgctgcgt ggaatgcccc ccctgtcctg cacctcctgt ggctggacct 720
agcgtgttcc tgttcccccc aaagcccaag gacaccctga tgatctcccg gacccccgaa 780
gtgacctgcg tggtggtgga cgtgtcccac gaggaccccg aggtgcagtt caattggtac 840
gtggacggcg tggaagtgca caacgccaag accaagccca gagaggaaca gttcaactcc 900
accttccggg tggtgtccgt gctgaccgtg gtgcaccagg actggctgaa cggcaaagag 960
tacaagtgca aggtctccaa caagggcctg cctgccccca tcgaaaagac catcagcaag 1020
accaagggcc agccccgcga gccccaggtg tacacactgc cacctagccg ggaagagatg 1080
accaagaacc aggtgtccct gacctgtctg gtcaagggct tctacccatc cgacattgcc 1140
gtggaatggg agtccaacgg ccagcccgag aacaactaca agaccacccc ccccatgctg 1200
gactccgacg gctcattctt cctgtactcc aagctgacag tggacaagtc ccggtggcag 1260
cagggcaacg tgttctcctg ctccgtgatg cacgaggccc tgcacaacca ctacacccag 1320
aagtccctgt ccctgagccc cggc 1344
<210> 147
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 凝血酶切割位点
<221> 变体
<222> (1)...(2)
<223> Xaa = 疏水氨基酸
<221> 变体
<222> (5)...(6)
<223> Xaa = 非酸性氨基酸
<400> 147
Xaa Xaa Pro Arg Xaa Xaa
1 5
<210> 148
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 因子Xa切割位点
<221> 变体
<222> (2)...(2)
<223> Xaa = Glu或Asp
<400> 148
Ile Xaa Gly Arg
1
<210> 149
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 氨基酸接头
<400> 149
Gly Gly Gly Gly Ser
1 5
<210> 150
<211> 58
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SEQ ID NO:133的氨基酸95-152
<400> 150
Tyr Cys Ala Arg Leu Tyr Arg Tyr Trp Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
1 5 10 15
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Gly Ser Gly Gly Gly Leu Val
20 25 30
Pro Arg Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
35 40 45
Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser
50 55
<210> 151
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 氨基酸接头
<400> 151
Ala Lys Thr Thr Pro Lys Leu Glu Glu Gly Glu Phe Ser Glu Ala Arg
1 5 10 15
<210> 152
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 氨基酸接头
<400> 152
Ala Lys Thr Thr Pro Lys Leu Glu Glu Gly Glu Phe Ser Glu Ala Arg
1 5 10 15
Val
<210> 153
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 氨基酸接头
<400> 153
Ala Lys Thr Thr Pro Lys Leu Gly Gly
1 5
<210> 154
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 氨基酸接头
<400> 154
Ser Ala Lys Thr Thr Pro Lys Leu Gly Gly
1 5 10
<210> 155
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 氨基酸接头
<400> 155
Ser Ala Lys Thr Thr Pro
1 5
<210> 156
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 氨基酸接头
<400> 156
Arg Ala Asp Ala Ala Pro
1 5
<210> 157
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 氨基酸接头
<400> 157
Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser
1 5
<210> 158
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 氨基酸接头
<400> 158
Arg Ala Asp Ala Ala Ala Ala Gly Gly Pro Gly Ser
1 5 10
<210> 159
<211> 27
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 氨基酸接头
<400> 159
Arg Ala Asp Ala Ala Ala Ala Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
1 5 10 15
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
20 25
<210> 160
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 氨基酸接头
<400> 160
Ser Ala Lys Thr Thr Pro Lys Leu Glu Glu Gly Glu Phe Ser Glu Ala
1 5 10 15
Arg Val
<210> 161
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 氨基酸接头
<400> 161
Ala Asp Ala Ala Pro
1 5
<210> 162
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 氨基酸接头
<400> 162
Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro
1 5 10
<210> 163
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 氨基酸接头
<400> 163
Thr Val Ala Ala Pro
1 5
<210> 164
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 氨基酸接头
<400> 164
Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro
1 5 10
<210> 165
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 氨基酸接头
<400> 165
Gln Pro Lys Ala Ala Pro
1 5
<210> 166
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 氨基酸接头
<400> 166
Gln Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro
1 5 10
<210> 167
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 氨基酸接头
<400> 167
Ala Lys Thr Thr Pro Pro
1 5
<210> 168
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 氨基酸接头
<400> 168
Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser Val Thr Pro Leu Ala Pro
1 5 10
<210> 169
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 氨基酸接头
<400> 169
Ala Lys Thr Thr Ala Pro
1 5
<210> 170
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 氨基酸接头
<400> 170
Ala Lys Thr Thr Ala Pro Ser Val Tyr Pro Leu Ala Pro
1 5 10
<210> 171
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 氨基酸接头
<400> 171
Ala Ser Thr Lys Gly Pro
1 5
<210> 172
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 氨基酸接头
<400> 172
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro
1 5 10
<210> 173
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 氨基酸接头
<400> 173
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
<210> 174
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 氨基酸接头
<400> 174
Gly Glu Asn Lys Val Glu Tyr Ala Pro Ala Leu Met Ala Leu Ser
1 5 10 15
<210> 175
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 氨基酸接头
<400> 175
Gly Pro Ala Lys Glu Leu Thr Pro Leu Lys Glu Ala Lys Val Ser
1 5 10 15
<210> 176
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 氨基酸接头
<400> 176
Gly His Glu Ala Ala Ala Val Met Gln Val Gln Tyr Pro Ala Ser
1 5 10 15
<210> 177
<211> 442
<212> PRT
<213> 智人
<400> 177
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Gly Met Asp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ser Ile Arg Gly Ser Arg Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Leu Tyr Arg Tyr Trp Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu
115 120 125
Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys
130 135 140
Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser
145 150 155 160
Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser
165 170 175
Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Asn
180 185 190
Phe Gly Thr Gln Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn
195 200 205
Thr Lys Val Asp Lys Thr Val Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro
210 215 220
Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro
225 230 235 240
Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr
245 250 255
Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn
260 265 270
Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg
275 280 285
Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val
290 295 300
Val His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser
305 310 315 320
Asn Lys Gly Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys
325 330 335
Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu
340 345 350
Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe
355 360 365
Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu
370 375 380
Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe
385 390 395 400
Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly
405 410 415
Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr
420 425 430
Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
435 440
<210> 178
<211> 212
<212> PRT
<213> 智人
<400> 178
Ser Tyr Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ser Pro Gly Gln
1 5 10 15
Thr Ala Arg Ile Thr Cys Ser Gly Asp Asn Leu Pro Lys Tyr Tyr Ala
20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Val Val Ile Phe
35 40 45
Tyr Asp Val Asn Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Thr Gln Ala Met
65 70 75 80
Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ala Trp Trp Ser Ser Thr Pro Val
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln Pro Lys Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu Leu Gln Ala Asn
115 120 125
Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr Pro Gly Ala Val
130 135 140
Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val Lys Ala Gly Val Glu
145 150 155 160
Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr Ala Ala Ser Ser
165 170 175
Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser His Arg Ser Tyr Ser
180 185 190
Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys Thr Val Ala Pro
195 200 205
Thr Glu Cys Ser
210
<210> 179
<211> 239
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 蛋白酶可切割的抗TFPI scFv抗体
<400> 179
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Gly Met Asp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ser Ile Arg Gly Ser Arg Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Leu Tyr Arg Tyr Trp Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Leu Val Pro Arg Gly Ser
115 120 125
Gly Gly Gly Gly Ser Ser Tyr Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser
130 135 140
Val Ser Pro Gly Gln Thr Ala Arg Ile Thr Cys Ser Gly Asp Asn Leu
145 150 155 160
Pro Lys Tyr Tyr Ala His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro
165 170 175
Val Val Val Ile Phe Tyr Asp Val Asn Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu
180 185 190
Arg Phe Ser Gly Ser Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser
195 200 205
Gly Thr Gln Ala Met Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ala Trp Trp
210 215 220
Ser Ser Thr Pro Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
225 230 235
<210> 180
<211> 717
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 蛋白酶可切割的抗TFPI scFv抗体编码序列
<400> 180
gaagttcagc tggtcgaaag tggtggcggt ctggttcaac cgggcggttc actgcgtctg 60
tcgtgcgcag caagcggttt taccttcagt tcctatggta tggattgggt ccgtcaggca 120
ccgggtaaag gtctggaatg ggtgtcatcg attcgtggca gccgcggttc tacctattac 180
gccgattcag ttaaaggccg ttttaccatc tctcgcgaca acagtaaaaa tacgctgtat 240
ctgcagatga acagcctgcg cgcggaagat accgccgtgt attactgtgc ccgtctgtat 300
cgctactggt tcgactactg gggccagggt acgctggtga ccgttagctc tggtggcggt 360
ggctctctgg ttccgcgtgg ctccggtggc ggtggctcat cctatgaact gacccaaccg 420
ccgagtgtct ccgtgtcacc gggtcagacg gcacgtatta cctgcagcgg tgataacctg 480
ccgaaatatt acgcgcattg gtatcagcaa aaaccgggcc aagccccggt ggttgtcatc 540
ttttatgacg ttaatcgtcc gtccggtatc ccggaacgct tctcgggcag caactctggt 600
aatacggcaa ccctgacgat cagcggcacc caggcaatgg atgaagctga ctattactgt 660
caagcatggt ggagctctac gccggtgttt ggcggtggca cgaaactgac cgtgctg 717

Claims (18)

1.蛋白酶调节的抗体，其特异性结合组织因子途径抑制剂（TFPI），包含可变结构域、恒定结构域和将可变结构域连接到恒定结构域的氨基酸序列，其中所述氨基酸序列包含蛋白酶切割位点，
所述蛋白酶调节的抗体包含选自下列的氨基酸序列：
(1) SEQ ID NO:131所示的Fab-1轻链和SEQ ID NO:133的氨基酸1-239所示的Fab-1重链；
(2) SEQ ID NO:135所示的Fab-2轻链和SEQ ID NO:136的氨基酸1-229所示的Fab-2重链；
(3) SEQ ID NO:139所示的IgG2-接头1轻链氨基酸序列和SEQ ID NO:140所示的IgG2-接头1重链氨基酸序列；或
(4) SEQ ID NO:143所示的IgG2-接头2轻链氨基酸序列和SEQ ID NO:144所示的IgG2-接头2重链氨基酸序列。
2.权利要求1的蛋白酶调节的抗体，其中所述蛋白酶切割位点是凝血酶切割位点。
3.权利要求1的蛋白酶调节的抗体，其中所述蛋白酶切割位点是纤溶酶切割位点。
4.权利要求1的蛋白酶调节的抗体，其中所述蛋白酶切割位点是因子Xa切割位点。
5.权利要求1-4任一项的蛋白酶调节的抗体，其中所述氨基酸序列进一步包含氨基酸接头。
6.权利要求1-4任一项的蛋白酶调节的抗体，其是全长抗体。
7.权利要求1-4任一项的蛋白酶调节的抗体，其是抗体片段。
8.药物组合物，其包含权利要求1-7任一项的蛋白酶调节的抗体和药学可接受的媒介物。
9.分离的核酸分子，其编码根据权利要求1-7任一项的蛋白酶调节的抗体。
10.权利要求1-7任一项的蛋白酶调节的抗体在制备用于治疗凝血功能障碍的药物中的用途。
11.权利要求10的用途，其中所述凝血功能障碍是血友病。
12.调节抗TFPI抗体的促凝活性的方法，其包括在所述抗TFPI抗体中添加蛋白酶切割位点，
所述抗TFPI抗体包含选自下列的氨基酸序列：
(1) SEQ ID NO:131所示的Fab-1轻链和SEQ ID NO:133的氨基酸1-239所示的Fab-1重链；
(2) SEQ ID NO:135所示的Fab-2轻链和SEQ ID NO:136的氨基酸1-229所示的Fab-2重链；
(3) SEQ ID NO:139所示的IgG2-接头1轻链氨基酸序列和SEQ ID NO:140所示的IgG2-接头1重链氨基酸序列；或
(4) SEQ ID NO:143所示的IgG2-接头2轻链氨基酸序列和SEQ ID NO:144所示的IgG2-接头2重链氨基酸序列。
13.权利要求12的方法，其中所述蛋白酶切割位点是凝血酶切割位点。
14.权利要求12的方法，其中所述蛋白酶切割位点是纤溶酶切割位点。
15.权利要求12的方法，其中所述蛋白酶切割位点是因子Xa切割位点。
16.权利要求1-7任一项的蛋白酶调节的抗体在制备用于促进凝血酶或纤溶酶的生成的药物中的用途。
17.蛋白酶调节的抗体，其特异性结合组织因子途径抑制剂（TFPI），包含：
(a) SEQ ID NO: 131的氨基酸序列所示的Fab-1轻链，其包含所述蛋白酶调节的抗体的轻链可变结构域和轻链恒定结构域；
(b) SEQ ID NO: 133的氨基酸序列所示的Fab-1重链，其包含所述蛋白酶调节的抗体的重链可变结构域和重链恒定结构域；和
(c) 蛋白酶切割位点，其包含SEQ ID NO: 131和SEQ ID NO: 133的一部分，
其中所述蛋白酶调节的抗体结合TFPI并且促进凝血酶或纤溶酶的生成。
18.权利要求17的蛋白酶调节的抗体，其中所述蛋白酶切割位点的氨基酸序列如SEQID NO: 137所示。
HK15105185.7A 2012-03-30 2013-03-14 蛋白酶調節的抗體 HK1204571B (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201261617837P 2012-03-30 2012-03-30
US61/617837 2012-03-30
PCT/US2013/031363 WO2013148248A1 (en) 2012-03-30 2013-03-14 Protease-regulated antibodies

Publications (2)

Publication Number Publication Date
HK1204571A1 HK1204571A1 (zh) 2015-11-27
HK1204571B true HK1204571B (zh) 2018-06-15

Family

ID=

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN104185474B (zh) 蛋白酶调节的抗体
JP7764565B2 (ja) プラスミノーゲン活性化因子阻害剤－１（ｐａｉ－１）に対する抗体及びその使用
CN110248964B (zh) 促凝血抗体
EP2734552B1 (en) Inhibitory anti-factor xii/xiia monoclonal antibodies and their uses
EP3033359B1 (en) Antibodies to plasminogen activator inhibitor-1 (pai-1) and uses thereof
KR101974980B1 (ko) 조직 인자 경로 억제제 (ｔｆｐｉ)에 대한 최적화된 모노클로날 항체
CN112513096B (zh) 改进的促凝血抗体
US20220380440A1 (en) Truncated multivalent multimers
CN115611986B (zh) 针对人活化蛋白c的单克隆抗体及其制备和应用
HK1239705A1 (zh) 蛋白酶调节的抗体
NL2022013B1 (en) Polypeptide Conjugates
HK1204571B (zh) 蛋白酶調節的抗體
RU2810094C2 (ru) Прокоагулянтные антитела
CN116284412A (zh) 一种抗masp-2抗体及其制备方法与用途
HK40023283A (zh) 纤溶酶原激活剂抑制剂-1(pai-1)的抗体及其用途
HK1198334B (zh) 抑制性的抗因子xii/xiia 单克隆抗体及其用途