HK1261325B - Zika virus purification - Google Patents

Claims (13)

1. Utilisation d'une centrifugation en gradient de saccharose optimisé pour l'élimination du sulfate de protamine de particules infectieuses de virus Zika purifiées, dans laquelle ladite centrifugation en gradient de saccharose optimisé comprend une fraction comprenant le virus Zika dans une solution de saccharose à 10 % (p/p) et trois autres couches de solutions de saccharose avec différentes densités, à savoir une première solution de saccharose avec 15 % (p/p) de saccharose, une deuxième solution de saccharose avec 35 % (p/p) de saccharose et une troisième solution de saccharose avec 50 % (p/p) de saccharose.
2. Procédé de purification de particules infectieuses de virus Zika, comprenant les étapes consistant à :

   a) fournir une récolte brute (a) comprenant des particules de virus Zika et des impuretés, dans lequel les impuretés sont générées par la croissance desdites particules de virus Zika sur un substrat cellulaire ;

   b) réduire les impuretés de la récolte brute (a) par précipitation avec un agent comprenant du sulfate de protamine pour obtenir une préparation de virus Zika (b) ;

   c) purifier encore la préparation de virus Zika (b) pour obtenir une préparation de virus Zika (c) par une centrifugation en gradient de densité de saccharose optimisé, dans lequel le gradient de saccharose optimisé est fourni de telle sorte que la protamine peut être complètement ou presque complètement séparée de la fraction de virus Zika ; et dans lequel la concentration de protamine dans ladite préparation de virus Zika (c) est inférieure à 1 µg/ml, telle que mesurée par spectroscopie de masse,

   dans lequel ladite centrifugation en gradient de densité de saccharose optimisé comprend une fraction comprenant le virus Zika dans une solution de saccharose à 10 % (p/p) et trois autres couches de solutions de saccharose avec différentes densités, à savoir une première solution de saccharose avec 15 % (p/p) de saccharose, une deuxième solution de saccharose avec 35 % (p/p) de saccharose et une troisième solution de saccharose avec 50 % (p/p) de saccharose.
3. Procédé selon la revendication 2, comprenant en outre une autre étape de purification consistant à : d) faire passer ladite préparation de virus Zika (c) à travers une matrice en phase solide introduite dans une colonne comprenant un noyau activé par ligand et une enveloppe inactive comprenant des pores, dans laquelle le seuil de rétention de molécules des pores empêche que les particules de virus Zika ne pénètrent dans le noyau activé par ligand, et dans laquelle une molécule plus petite que le seuil de rétention de molécules des pores pénètre dans le noyau activé par ligand, et collecter les particules de virus Zika pour obtenir une préparation de virus Zika (d).
4. Procédé selon la revendication 2, dans lequel la teneur en ADN de cellule hôte de la préparation de virus Zika (c) est inférieure à 10 ng/mL et la teneur en protéines de cellule hôte de la préparation de virus Zika (c) est inférieure à 100 ng/mL.
5. Procédé selon l'une quelconque des revendications 2 à 4, dans lequel ladite récolte brute (a) comprenant des particules de virus Zika et des impuretés est soumise à une ou plusieurs étapes de pré-purification avant l'étape b), dans lequel lesdites une ou plusieurs étapes de pré-purification comprennent

   i) la filtration à l'aide d'un filtre ayant une taille de pores inférieure ou égale à 0,2 µm ; et/ou

   ii) la digestion de l'ADN génomique de cellule hôte par traitement enzymatique ; et/ou

   iii) l'ultra/diafiltration à l'aide d'une membrane à fibres creuses ayant une taille de pores supérieure ou égale à 100 kDa.
6. Procédé selon la revendication 2, dans lequel la concentration dudit sulfate de protamine dans l'étape b) est de 0,5 à 3 mg/ml.
7. Procédé selon l'une quelconque des revendications 2 à 6, dans lequel les particules infectieuses de virus Zika dans ladite préparation de virus Zika (c) ou (d), par rapport aux produits viraux totaux dans la récolte brute (a), sont enrichies dans la plage d'au moins 50 % à 95 %.
8. Procédé selon l'une quelconque des revendications 2 à 7, dans lequel l'impureté résiduelle de ladite préparation de virus Zika (c) est inférieure à 10 %, dans lequel ladite impureté résiduelle comprend une protéine de cellule hôte, de l'ADN, des agrégats de virus Zika et du sulfate de protamine.
9. Procédé selon l'une quelconque des revendications 2 à 8, dans lequel ledit virus Zika se propage dans une lignée cellulaire Vero.
10. Procédé selon l'une quelconque des revendications 2 à 9, dans lequel ledit procédé conduisant à la préparation de virus Zika (c) ou (d) est suivi d'une étape d'inactivation, dans lequel le virus Zika est inactivé par formaldéhyde.
11. Procédé selon l'une quelconque des revendications 2 à 10, dans lequel ladite particule de virus Zika est un virus Zika de souche H/PF/2013 ayant un génome d'ARN correspondant à la séquence d'ADN fournie par la séquence d'acides nucléiques de SEQ ID n° : 72, ou une variante de séquence d'acides nucléiques qui est au moins identique à 88 % à SEQ ID n° : 72 et capable de contenir un virus Zika virulent.
12. Procédé selon l'une quelconque des revendications 2 à 11, dans lequel ladite particule de virus Zika comprend une protéine E de souche de virus Zika H/PF/2013 telle que définie par la séquence d'acides aminés de SEQ ID n° : 47 ou une variante de séquence d'acides aminés qui est au moins identique à 95 % à SEQ ID n° : 47 et capable de contenir un virus Zika virulent.
13. Procédé selon l'une quelconque des revendications 2 à 12 pour fabriquer une composition d'immunisation contre une infection par le virus Zika.