HK1261325B - Zika virus purification - Google Patents

Claims (13)

1. Verwendung einer optimierten Saccharose-Gradientenzentrifugation zur Entfernung von Protaminsulfat aus gereinigten infektiösen Zika-Virus-Partikeln, wobei die genannte optimierte Saccharose-Gradientenzentrifugation eine das Zika-Virus umfassende Fraktion in einer 10%igen (Gew.-%) Saccharoselösung und drei weitere Schichten von Saccharoselösungen mit unterschiedlichen Dichten, also eine erste Saccharoselösung mit 15% (Gew.-%) Saccharose, eine zweite Saccharoselösung mit 35% (Gew.-%) Saccharose und eine dritte Saccharoselösung mit 50% (Gew.-%) Saccharose, umfasst.
2. Verfahren zur Reinigung von infektiösen Zika-Virus-Partikeln, das die folgenden Schritte umfasst:

   a) Bereitstellen einer Rohernte (a), die Zika-Virus-Partikel und Verunreinigungen umfasst, wobei die Verunreinigungen durch Züchten der genannten Zika-Virus-Partikel auf einem Zellsubstrat entstanden sind;

   b) Reduzieren von Verunreinigungen aus der Rohernte (a) durch Ausfällen mit einem Protaminsulfat enthaltenden Mittel, um ein Zika-Virus-Präparat (b) zu erhalten;

   c) weiteres Reinigen des Zika-Virus-Präparats (b), um ein Zika-Virus-Präparat (c) durch eine optimierte Saccharose-Dichtegradientenzentrifugation zu erhalten, wobei der optimierte Saccharose-Gradient so bereitgestellt wird, dass das Protamin vollständig oder fast vollständig von der Zika-Virus-Fraktion abgetrennt werden kann; und wobei die Protamin-Konzentration in dem genannten Zika-Virus-Präparat (c) unter 1 µg/ml liegt, wie durch Massenspektroskopie gemessen,

   wobei die genannte optimierte Saccharose-Dichtegradientenzentrifugation eine das Zika-Virus umfassende Fraktion in einer 10%igen (Gew.-%) Saccharoselösung und drei Saccharoseschichten mit unterschiedlichen Dichten, also eine erste Saccharoselösung mit 15% (Gew.-%) Saccharose, eine zweite Saccharoselösung mit 35% (Gew.-%) Saccharose und eine dritte Saccharoselösung mit 50% (Gew.-%) Saccharose, umfasst.
3. Verfahren nach Anspruch 2, das zusätzlich den folgenden weiteren Reinigungsschritt umfasst: d) Hindurchleiten des genannten Zika-Virus-Präparats (c) durch eine Festphasenmatrix, die in eine Säule gepackt ist, die einen ligandenaktivierten Kern und eine inaktive Hülle mit Poren umfasst, wobei die Molekulargewichts-Ausschlussgrenze der Poren die Zika-Virus-Partikel vom Eintritt in den ligandenaktivierten Kern ausschließt, und wobei ein Molekül, das kleiner als die Molekulargewichts-Ausschlussgrenze der Poren ist, in den ligandenaktivierten Kern eintritt, und Sammeln der Zika-Virus-Partikel, um ein Zika-Virus-Präparat (d) zu erhalten.
4. Verfahren nach Anspruch 2, wobei der Wirtszell-DNA-Gehalt der Zika-Virus-Präparation (c) weniger als 10 ng/ml und der Wirtszell-Proteingehalt des Zika-Virus-Präparats (c) weniger als 100 ng/ml beträgt.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 4, wobei die genannte Rohernte (a), die Zika-Virus-Partikel und Verunreinigungen umfasst, vor Schritt b) einem oder mehreren Vorreinigungsschritt(en) unterzogen wird, wobei der eine oder die mehreren genannte(n) Vorreinigungsschritt(e) Folgendes umfassen:

   i) Filtration unter Verwendung eines Filters mit einer Porengröße von 0,2 µm oder weniger; und/oder

   ii) Verdauung der genomischen DNA der Wirtszelle durch enzymatische Behandlung; und/oder

   iii) Ultra-/Diafiltration unter Verwendung einer Hohlfasermembran mit einer Porengröße von 100 kDa oder mehr.
6. Verfahren nach Anspruch 2, wobei die Konzentration des genannten Protaminsulfats in Schritt b) 0,5 bis 3 mg/ml beträgt.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 6, wobei die infektiösen Zika-Virus-Partikel im genannten Zika-Viruspräparat (c) oder (d), bezogen auf die gesamten Virusprodukte in der Rohernte (a), im Bereich von mindestens 50% bis 95% angereichert sind.
8. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 7, wobei die Restverunreinigung des genannten Zika-Virus-Präparats (c) weniger als 10% beträgt, wobei die genannte Restverunreinigung Wirtszell-Protein, DNA, Zika-Virus-Aggregate und Protaminsulfat umfasst.
9. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 8, wobei das genannte Zika-Virus in einer Vero-Zelllinie vermehrt wird.
10. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 9, wobei auf das genannte Verfahren, das zu dem Zika-Virus-Präparat (c) oder (d) führt, ein Inaktivierungsschritt folgt, wobei das Zika-Virus durch Formaldehyd inaktiviert wird.
11. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 10, wobei es sich bei dem genannten Zika-Virus-Partikel um einen Zika-Virusstamm H/PF/2013 handelt, der ein RNA-Genom aufweist, das der DNA-Sequenz entspricht, die durch die Nukleinsäuresequenz der SEQ ID NO: 72 bereitgestellt wird, oder eine Nukleinsäuresequenz-Variante, die zu mindestens 88 % mit SEQ ID NO: 72 identisch ist und ein virulentes Zika-Virus verpacken kann.
12. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 11, wobei das genannte Zika-Virus-Partikel ein E-Protein des Zika-Virusstammes H/PF/2013 umfasst, wie es durch die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 47 definiert ist, oder eine Variante der Aminosäuresequenz, die zu mindestens 95% identisch mit SEQ ID NO: 47 ist und in der Lage ist, ein virulentes Zika-Virus zu verpacken.
13. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 12 zur Herstellung einer Zusammensetzung zur Immunisierung gegen eine Zika-Virus-Infektion.