HK1253001B - Novel crispr enzymes and systems - Google Patents

Claims (25)

1. Système de Courtes Répétitions Palindromiques Groupées et Régulièrement Espacées (CRISPR)-protéine associée à CRISPR (Cas) (CRISPR-Cas), génétiquement modifié et non naturellement présent, comprenant :

   a) un ou plusieurs ARN guides qui comprennent une séquence guide liée à une séquence répétée directe, où la séquence guide est capable de s'hybrider avec une séquence cible, ou une ou plusieurs séquences nucléotidiques codant pour un ARN guide, et

   b) une protéine effectrice Cpfl, ou une ou plusieurs séquences nucléotidiques codant pour la protéine effectrice Cpfl ;

   où les une ou plusieurs séquences guides sont capables de s'hybrider avec ladite séquence cible, ladite séquence cible se trouve en 3' par rapport à un Motif Adjacent au Proto-espaceur (PAM), et ledit ARN guide est capable de former un complexe avec la protéine effectrice Cpfl.
2. Système de vecteur de Courtes Répétitions Palindromiques Groupées et Régulièrement Espacées (CRISPR)-protéine associée à CRISPR (Cas) (CRISPR-Cas), génétiquement modifié et non naturellement présent, comprenant un ou plusieurs vecteurs comprenant :

   a) un premier élément régulateur lié de manière opérante à une ou plusieurs séquences nucléotidiques codant chacune pour un ARN guide qui comprend une séquence guide liée à une séquence répétée directe, où la séquence guide est capable de s'hybrider avec une séquence cible,

   b) un deuxième élément régulateur lié de manière opérante à une séquence nucléotidique codant pour une protéine effectrice Cpfl ;

   où les composants (a) et (b) sont situés sur des vecteurs identiques ou différents du système, où, lors de leur transcription, les une ou plusieurs séquences guides s'hybrident avec ladite séquence cible, ladite séquence cible est en 3' par rapport à un Motif Adjacent au Proto-espaceur (PAM), et ledit ARN guide forme un complexe avec la protéine effectrice Cpf1.
3. Système selon la revendication 1 ou 2, dans lequel, lors de leur transcription, les une ou plusieurs séquences guides s'hybrident avec la séquence cible, et l'ARN guide forme un complexe avec la protéine effectrice Cpfl, qui provoque un clivage de manière distale par rapport à la séquence cible, éventuellement où ledit clivage génère une cassure de double brin cohésive avec une saillie en 5' de 4 ou 5 nt.
4. Système selon la revendication 1 ou 2, dans lequel le PAM comprend un motif en 5' riche en T, préférablement où la séquence de PAM est TTN, où N est A/C/G ou T et la protéine effectrice est FnCpfl, ou où la séquence de PAM est TTTV, où V est A/C ou G et la protéine effectrice est PaCpf1p, LbCpfl ou AsCpf1.
5. Système selon la revendication 1 ou 2, dans lequel la protéine effectrice est une protéine effectrice Cpfl dérivée d'une espèce bactérienne énumérée dans la Figure 64, ou où la protéine effectrice Cpfl est dérivée d'une espèce bactérienne choisie dans le groupe constitué par Francisella tularensis 1, Francisella tularensis subsp. novicida, Prevotella albensis, Lachnospiraceae bacterium MC2017 1, Butyrivibrio proteoclasticus, Peregrinibacteria bacterium GW2011_GWA2_33_10, Parcubacteria bacterium GW2011_GWC2_44_17, Smithella sp. SCADC, Acidaminococcus sp. BV3L6, Lachnospiraceae bacterium MA2020, Candidatus Methanoplasma termitum, Eubacterium eligens, Moraxella bovoculi 237, Leptospira inadai, Lachnospiraceae bacterium ND2006, Porphyromonas crevioricanis 3, Prevotella disiens et Porphyromonas macacae.
6. Système selon la revendication 1 ou 2, dans lequel la séquence d'acide nucléique codant pour la protéine effectrice Cpfl est à codons optimisés pour une expression dans une cellule eucaryote.
7. Système selon la revendication 1 ou 2, dans lequel les composants (a) et (b) sont des séquences nucléotidiques sur un seul vecteur.
8. Méthode in vitro de modification d'un locus cible d'intérêt, comprenant l'administration d'un système selon la revendication 1 ou 2, audit locus cible ou à une cellule contenant ledit locus cible, où la méthode n'est pas une méthode de traitement du corps humain ou animal par chirurgie ou thérapie ou une méthode de modification de l'identité génétique de la lignée germinale d'êtres humains, et où la cellule n'est pas un embryon humain.
9. Méthode in vitro de modification d'un locus cible d'intérêt, la méthode comprenant l'administration audit locus cible d'une composition non présente naturellement ou modifiée comprenant une protéine effectrice Cpfl et un ou plusieurs composants d'acide nucléique, où la protéine effectrice Cpfl forme un complexe avec les un ou plusieurs composants d'acide nucléique, et, lors de la fixation dudit complexe audit locus cible d'intérêt qui se trouve en 3' par rapport à un Motif Adjacent au Proto-espaceur (PAM), la protéine effectrice induit une modification dudit locus cible d'intérêt, éventuellement où ladite composition non présente naturellement ou modifiée comprenant une protéine effectrice Cpfl et un ou plusieurs composants d'acide nucléique est administrée à la cellule sous forme d'une ou plusieurs molécules polynucléotidiques ; où la méthode n'est pas une méthode de traitement du corps humain ou animal par chirurgie ou thérapie ou une méthode de modification de l'identité génétique de la lignée germinale d'êtres humains, et où la cellule n'est pas un embryon humain.
10. Système selon la revendication 1 ou 2, ou méthode selon la revendication 9, dans lequel ou laquelle la séquence cible ou le locus cible d'intérêt se trouve au sein d'une cellule, préférablement une cellule eucaryote, éventuellement où la cellule est une cellule animale, humaine ou végétale.
11. Méthode selon la revendication 9, dans laquelle la composition comprend un composant d'acide nucléique unique, préférablement où le composant d'acide nucléique unique comprend une séquence guide liée à une séquence répétée directe.
12. Méthode selon la revendication 9, dans laquelle la modification du locus cible d'intérêt est une cassure de brin, éventuellement où la cassure de brin comprend une cassure de double brin d'ADN cohésive avec une saillie en 5' de 4 ou 5 nt.
13. Méthode selon la revendication 12, dans laquelle le locus cible d'intérêt est modifié par l'intégration d'un insert d'ADN dans la cassure de double brin d'ADN cohésive.
14. Système selon la revendication 1 ou 2, ou méthode selon la revendication 9, dans lequel ou laquelle la protéine effectrice Cpf1 comprend un ou plusieurs signaux de localisation nucléaire (NLS).
15. Méthode selon la revendication 9, dans laquelle les une ou plusieurs molécules polynucléotidiques sont comprises au sein d'un ou plusieurs vecteurs, éventuellement où les une ou plusieurs molécules polynucléotidiques ou les un ou plusieurs vecteurs sont compris dans un système d'administration.
16. Méthode selon la revendication 9, dans laquelle les une ou plusieurs molécules polynucléotidiques comprennent un ou plusieurs éléments régulateurs configurés de manière opérante afin d'exprimer la protéine effectrice Cpf1 et/ou le ou les composants d'acide nucléique, éventuellement où les un ou plusieurs éléments régulateurs comprennent des promoteurs inductibles.
17. Méthode selon la revendication 9, dans laquelle les une ou plusieurs molécules polynucléotidiques sont administrées via des particules, des vésicules, ou un ou plusieurs vecteurs viraux, éventuellement où les particules comprennent un lipide, un sucre, un métal ou une protéine, éventuellement où les vésicules comprennent des exosomes ou des liposomes, éventuellement où les un ou plusieurs vecteurs viraux comprennent un ou plusieurs parmi un adénovirus, un ou plusieurs lentivirus ou un ou plusieurs virus adéno-associés.
18. Méthode selon la revendication 9, qui est une méthode de modification d'une cellule, d'une lignée cellulaire par manipulation d'une ou plusieurs séquences cibles au niveau de loci génomiques d'intérêt.
19. Cellule hôte isolée ou lignée cellulaire ou descendance de celles-ci, comprenant un système selon la revendication 1 ou 2, préférablement où la cellule est une cellule eucaryote, préférablement où la cellule est une cellule animale, une cellule humaine, ou une cellule végétale, où ladite cellule n'est pas une cellule germinale humaine ou un embryon humain.
20. Cellule hôte isolée ou lignée cellulaire ou descendance de celles-ci, selon la revendication 19, comprenant une cellule souche ou une lignée de cellules souches.
21. Méthode de production d'une plante ayant un caractère d'intérêt modifié et codé par un gène d'intérêt, ladite méthode comprenant la mise en contact d'une cellule végétale, d'une lignée de cellules végétales, ou d'un plasma germinatif végétal avec un système selon la revendication 1 ou 2, ou la soumission de la cellule végétale, de la lignée de cellules végétales, ou du plasma germinatif végétal à une méthode selon la revendication 9, modifiant ou bien introduisant ainsi ledit gène d'intérêt, et la régénération d'une plante à partir de ladite cellule végétale, de ladite lignée de cellules végétales, ou dudit plasma germinatif végétal.
22. Méthode d'identification d'un caractère d'intérêt dans une plante, ledit caractère d'intérêt étant codé par un gène d'intérêt, ladite méthode comprenant la mise en contact d'une cellule végétale avec un système selon la revendication 1 ou 2, ou la soumission de la cellule végétale à une méthode selon la revendication 9, identifiant ainsi ledit gène d'intérêt.
23. Particule comprenant un système selon la revendication 1 ou 2, éventuellement où la particule contient la protéine effectrice Cpf1 complexée avec l'ARN guide.
24. Système ou méthode selon la revendication 1, 2 ou 9, dans lequel ou laquelle le complexe, l'ARN guide ou la protéine est conjugué(e) avec au moins un motif de sucre, éventuellement la N-acétylgalactosamine (GalNAc), en particulier la GalNAc triantennaire.
25. Système selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, pour une utilisation comme médicament.