HK1253001B - Novel crispr enzymes and systems - Google Patents

Claims (25)

1. Technisch erzeugtes, nicht natürlich vorkommendes Clustered Regularly Interspersed Short Palindromic Repeat (CRISPR)-CRISPR-assoziiertes (Cas) (CRISPR-Cas) System, umfassend

   a) eine oder mehrere Guide-RNAs, die eine Führungssequenz umfasst/umfassen, welche an eine Direct-Repeat-Sequenz (direkte Wiederholungssequenz) gebunden ist, wobei die Führungssequenz mit einer Zielsequenz hybridisieren kann, oder eine oder mehrere Nukleotidsequenzen, die eine Guide-RNA codiert/codieren, und

   b) ein Cpf1-Effektorprotein oder eine oder mehrere Nukleotidsequenzen, die das Cpf1-Effektorprotein codiert/codieren;

   wobei die eine oder mehreren Führungssequenzen mit der Zielsequenz hybridisieren kann/können, die Zielsequenz sich 3' eines Protospacer Adjacent Motif (PAM) befindet und die Guide-RNA mit dem Cpf1-Effektorprotein einen Komplex bilden kann.
2. Technisch erzeugtes, nicht natürlich vorkommendes Clustered Regularly Interspersed Short Palindromic Repeat (CRISPR)-CRISPR-assoziiertes (Cas) (CRISPR-Cas) Vektorsystem, das ein oder mehrere Vektoren umfasst, umfassend

   a) ein erstes regulatorisches Element, das funktionsfähig an eine oder mehrere Nukleotidsequenzen gebunden ist, die jeweils eine Guide-RNA codieren, die eine Führungssequenz umfasst, die an eine Direct-Repeat-Sequenz gebunden ist, wobei die Führungssequenz mit einer Zielsequenz hybridisieren kann,

   b) ein zweites regulatorisches Element, das funktionsfähig an eine Nukleotidsequenz gebunden ist, die ein Cpf1-Effektorprotein codiert;

   wobei sich die Komponenten (a) und (b) auf demselben oder verschiedenen Vektoren des Systems befinden, wobei die eine oder mehreren Führungssequenzen nach der Transkription mit der Zielsequenz hybridisiert/hybridisieren, die Zielsequenz sich 3' eines Protospacer Adjacent Motif (PAM) befindet, und die Guide-RNA mit dem Cpf1-Effektorprotein einen Komplex bildet.
3. System nach Anspruch 1 oder 2, wobei die eine oder mehreren Führungssequenzen nach der Transkription mit der Zielsequenz hybridisiert/hybridisieren und die Guide-RNA mit dem Cpf1-Effektorprotein einen Komplex bildet, der distal der Zielsequenz eine Spaltung bewirkt, wobei die Spaltung gegebenenfalls einen gestaffelten Doppelstrangbruch mit einem 4- oder 5-nt 5'-Überhang erzeugt.
4. System nach Anspruch 1 oder 2, wobei das PAM ein 5'-T-reiches Motiv umfasst, wobei die PAM-Sequenz vorzugsweise TTN ist, wobei N A/C/G oder T ist und das Effektorprotein FnCpfl ist oder wobei die PAM-Sequenz TTTV ist, wobei V A/C oder G ist und das Effektorprotein PaCpf1p, LbCpfl oder AsCpfl ist.
5. System nach Anspruch 1 oder 2, wobei das Effektorprotein ein Cpf1-Effektorprotein ist, das von einer in Figur 64 aufgelisteten Bakterienart stammt oder wobei das Cpf1-Effektorprotein von einer Bakterienart stammt, die ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Francisella tularensis 1, Francisella tularensis subsp. novicida, Prevotella albensis, Lachnospiraceae-Bakterium MC2017 1, Butyrivibrio proteoclasticus, Peregrinibacteria-Bakterium GW2011_GWA2_33_10, Parcubacteria-Bakterium GW2011_GWC2_44_17, Smithella sp. SCADC, Acidaminococcus sp. BV3L6, Lachnospiraceae-Bakterium MA2020, Candidatus Methanoplasma termitum, Eubacterium eligens, Moraxella bovoculi 237, Leptospira inadai, Lachnospiraceae-Bakterium ND2006, Porphyromonas crevioricanis 3, Prevotella disiens und Porphyromonas macacae.
6. System nach Anspruch 1 oder 2, wobei die Nukleinsäuresequenz, die das Cpf1-Effektorprotein codiert, für die Expression in einer eukaryotischen Zelle codonoptimiert ist.
7. System nach Anspruch 1 oder 2, wobei die Komponenten (a) und (b) Nukleotidsequenzen auf einem Vektor sind.
8. In-vitro-Verfahren zum Modifizieren eines interessierenden Ziel-Locus, umfassend das Abgeben eines Systems nach Anspruch 1 oder 2 an den Ziel-Locus oder eine Zelle, die den Ziel-Locus enthält, wobei es sich bei dem Verfahren nicht um ein Verfahren zur Behandlung des Körpers eines Menschen oder Tieres durch Operation oder Therapie oder ein Verfahren zum Modifizieren der genetischen Keimbahn-Identität von Menschen handelt und wobei die Zelle kein menschlicher Embryo ist.
9. In-vitro-Verfahren zum Modifizieren eines interessierenden Ziel-Locus, wobei das Verfahren das Abgeben einer nicht natürlich vorkommenden oder technisch erzeugten Zusammensetzung, die ein Cpf1-Effektorprotein und eine oder mehrere Nukleinsäurekomponenten umfasst, an den Ziel-Locus umfasst, wobei das Cpf1-Effektorprotein mit der einen oder den mehreren Nukleinsäurekomponente(n) einen Komplex bildet und das Effektorprotein bei Bindung des Komplexes an den interessierenden Ziel-Locus, der sich 3' eines Protospacer Adjacent Motif (PAM) befindet, eine Modifikation des interessierenden Ziel-Locus induziert, wobei die nicht natürlich vorkommende oder technisch erzeugte Zusammensetzung, die ein Cpf1-Effektorprotein und eine oder mehrere Nukleinsäurekomponenten umfasst, gegebenenfalls als ein oder mehrere Polynukleotidmoleküle an die Zelle abgegeben wird, wobei es sich bei dem Verfahren nicht um ein Verfahren zur Behandlung des Körpers eines Menschen oder Tieres durch Operation oder Therapie oder ein Verfahren zum Modifizieren der genetischen Keimbahn-Identität von Menschen handelt und wobei die Zelle kein menschlicher Embryo ist.
10. System nach Anspruch 1 oder 2 oder Verfahren nach Anspruch 9, wobei sich die interessierende Zielsequenz oder der interessierende Ziel-Locus innerhalb einer Zelle, vorzugsweise einer eukaryotischen Zelle, befindet, wobei die Zelle gegebenenfalls eine tierische, menschliche oder pflanzliche Zelle ist.
11. Verfahren nach Anspruch 9, wobei die Zusammensetzung eine einzelne Nukleinsäurekomponente umfasst, wobei die einzelne Nukleinsäurekomponente vorzugsweise eine Führungssequenz umfasst, die an eine Direct-Repeat-Sequenz gebunden ist.
12. Verfahren nach Anspruch 9, wobei die Modifikation des interessierenden Ziel-Locus ein Strangbruch ist, wobei der Strangbruch gegebenenfalls einen gestaffelten DNA-Doppelstrangbruch mit einem 4- oder 5-nt 5'-Überhang umfasst.
13. Verfahren nach Anspruch 12, wobei der interessierende Ziel-Locus durch die Integration eines DNA-Inserts in den gestaffelten DNA-Doppelstrangbruch modifiziert wird.
14. System nach Anspruch 1 oder 2 oder Verfahren nach Anspruch 9, wobei das Cpf1-Effektorprotein ein oder mehrere Kernlokalisierungssignal(e) (NLS(s)) umfasst.
15. Verfahren nach Anspruch 9, wobei das eine oder die mehreren Polynukleotidmoleküle in einem oder mehreren Vektoren enthalten ist/sind, wobei das eine oder die mehreren Polynukleotidmoleküle oder der eine oder die mehreren Vektoren gegebenenfalls in einem Abgabesystem enthalten ist/sind.
16. Verfahren nach Anspruch 9, wobei das eine oder die mehreren Polynukleotidmoleküle ein oder mehrere regulatorische Elemente umfasst/umfassen, das/die funktionsfähig derart konfiguriert ist/sind, dass es/sie das Cpf1-Effektorprotein und/oder die Nukleinsäurekomponente(n) exprimiert/exprimieren, wobei das eine oder die mehreren regulatorischen Elemente gegebenenfalls induzierbare Promotoren umfasst/umfassen.
17. Verfahren nach Anspruch 9, wobei das eine oder die mehreren Polynukleotidmoleküle über Partikel, Vesikel oder einen oder mehrere virale Vektoren abgegeben wird/werden, wobei die Partikel ein Lipid, einen Zucker, ein Metall oder ein Protein umfassen, wobei die Vesikel gegebenenfalls Exosomen oder Liposomen umfassen, wobei der eine oder die mehreren viralen Vektoren gegebenenfalls ein oder mehrere Adenoviren, ein oder mehrere Lentiviren oder ein oder mehrere Adeno-assoziierte Viren umfasst/umfassen.
18. Verfahren nach Anspruch 9, bei dem es sich um ein Verfahren zum Modifizieren einer Zelle, einer Zelllinie durch Manipulieren einer oder mehrerer Zielsequenzen an interessierenden genomischen Loci handelt.
19. Isolierte Wirtszelle oder Zelllinie oder deren Nachkommen, umfassend ein System nach Anspruch 1 oder 2, wobei die Zelle vorzugsweise eine eukaryotische Zelle ist, wobei die Zelle vorzugsweise eine tierische Zelle, eine menschliche oder eine Pflanzenzelle ist, wobei es sich bei der Zelle nicht um eine menschliche Keimzelle oder einen menschlichen Embryo handelt.
20. Isolierte Wirtszelle, Zelllinie oder deren Nachkommen nach Anspruch 19, umfassend eine Stammzelle oder Stammzelllinie.
21. Verfahren zur Herstellung einer Pflanze mit einem modifizierten interessierenden Merkmal, das von einem interessierenden Gen codiert wird, wobei das Verfahren das Inkontaktbringen einer Pflanzenzelle, Pflanzenzelllinie oder von Pflanzenkeimplasma mit einem System nach Anspruch 1 oder 2 oder das Unterziehen der Pflanzenzelle, Pflanzenzelllinie oder des Pflanzenkeimplasmas einem Verfahren nach Anspruch 9, wodurch das interessierende Gen entweder modifiziert oder eingeführt wird, und Regenerieren einer Pflanze aus der Pflanzenzelle, Pflanzenzelllinie oder dem Pflanzenkeimplasma umfasst.
22. Verfahren zum Identifizieren eines interessierenden Merkmals in einer Pflanze, wobei das interessierende Merkmal durch ein interessierendes Gen codiert wird, wobei das Verfahren das Inkontaktbringen einer Pflanzenzelle mit einem System nach Anspruch 1 oder 2 oder das Unterziehen der Pflanzenzelle einem Verfahren nach Anspruch 9 umfasst, wodurch das interessierende Gen identifiziert wird.
23. Partikel, umfassend ein System nach Anspruch 1 oder 2, wobei das Partikel gegebenenfalls das mit der Guide-RNA komplexierte Cpf1-Effektorprotein enthält.
24. System oder Verfahren nach Anspruch 1, 2 oder 9, wobei der Komplex, die Guide-RNA oder das Protein an mindestens eine Zuckereinheit, gegebenenfalls N-Acetylgalactosamin (GalNAc), insbesondere GalNAc mit drei Antennen, konjugiert ist.
25. System nach einem der Ansprüche 1 bis 7 zur Verwendung als Arzneimittel.