HK1244301B - High throughput detection of molecular markers based on aflp and high troughput sequencing - Google Patents

Claims (21)

1. Méthode pour détecter des polymorphismes dans des fragments de restriction de deux échantillons ou plus, comprenant les étapes de :

   (a) fournir deux ou plus échantillons d'acide nucléique;

   (b) digérer chaque échantillon d'acide nucléique avec au moins une endonucléase de restriction pour obtenir un ensemble de fragments de restriction ;

   (c) fournir des adaptateurs synthétiques bicaténaires comprenant

   - une séquence compatible avec une amorce 5', suivie d'une section d'identification spécifique à un échantillon, et

   - une extrémité 3' qui peut être ligaturée à l'extrémité émoussée ou faisant saillie d'un fragment de restriction ;

   (d) ligaturer les adaptateurs synthétiques bicaténaires aux fragments de restriction dans l'ensemble, pour fournir un ensemble d'adaptateurs-fragments de restriction ligaturés ;

   (e) facultativement amplifier l'ensemble d'adaptateurs-fragments de restriction ligaturés, avec une ou plusieurs amorces qui sont au moins complémentaires de :

   - la section d'identification spécifique à un échantillon,

   - une section qui est complémentaire aux restes de la séquence de reconnaissance de l'endonucléase de restriction,

   afin de fournir des adaptateurs-fragments de restriction ligaturés amplifiés (amplicons) ;

   (f) déterminer la séquence d'au moins

   - la section d'identification spécifique à un échantillon ;

   - les restes de la séquence de reconnaissance de l'endonucléase de restriction ; et

   - une partie de la séquence du fragment de restriction située adjacente aux restes de la séquence de reconnaissance de l'endonucléase de restriction ; et

   (g) détecter des polymorphismes dans la séquence des adaptateurs-fragments de restriction ligaturés dans les deux échantillons ou plus obtenus à l'étape (f).
2. Méthode selon la revendication 1, dans laquelle les fragments de restriction sont des marqueurs moléculaires.
3. Méthode selon la revendication 2, dans laquelle les fragments de restriction sont des marqueurs AFLP.
4. Méthode selon la revendication 1, dans laquelle deux échantillons ou plus sont comparés pour la présence ou l'absence de fragments de restriction et/ou de marqueurs moléculaires.
5. Méthode selon la revendication 1, dans laquelle deux échantillons ou plus sont combinés en un groupe après l'étape de ligature des adaptateurs.
6. Méthode selon la revendication 5, dans laquelle pour chaque échantillon dans le groupe, un identifiant spécifique à un échantillon est utilisé, qui diffère des autres identifiants spécifiques à un échantillon dans le groupe.
7. Méthode selon la revendication 1, dans laquelle les amorces contiennent un ou plusieurs nucléotides sélectifs à l'extrémité 3'.
8. Méthode selon la revendication 1, dans laquelle l'endonucléase de restriction est une endonucléase de restriction de type II.
9. Méthode selon la revendication 1, dans laquelle l'endonucléase de restriction est une endonucléase de restriction de type Ils.
10. Méthode selon la revendication 1, dans laquelle deux endonucléases de restriction ou plus sont utilisées.
11. Méthode selon la revendication 1, dans laquelle le séquençage est effectué au moyen d'un séquençage à haut débit.
12. Méthode selon la revendication 11, dans laquelle le séquençage à haut débit est effectué sur un support solide.
13. Méthode selon la revendication 11, dans laquelle le séquençage à haut débit est basé sur un séquençage par synthèse.
14. Méthode selon la revendication 11, dans laquelle le séquençage à haut débit comprend les étapes de :

    - recuire les amplicons ou les adaptateurs-fragments de restriction ligaturés par rapport à des billes, chaque bille recuisant avec un seul adaptateur-fragment de restriction ligaturé ou amplicon ;

    - émulsionner les billes dans des micro-réacteurs eau-dans-huile, chaque micro-réacteur eau-dans-huile comprenant une seule bille ;

    - effectuer une PCR en émulsion pour amplifier des adaptateurs-fragments de restriction ligaturés ou amplicons sur la surface des billes ;

    - facultativement, sélectionner/enrichir les billes contenant des amplicons amplifiés ;

    - charger les billes dans des puits, chaque puits comprenant une seule bille ; et

    - déterminer la séquence nucléotidique des adaptateurs-fragments de restriction ligaturés amplifiés ou des amplicons amplifiés en utilisant la génération d'un signal pyrophosphate.
15. Méthode selon la revendication 11, dans laquelle le séquençage à haut débit comprend les étapes de :

    - recuire les adaptateurs-fragments de restriction ligaturés ou amplicons de restriction par rapport à une surface contenant respectivement des première et seconde amorces ou des première et seconde séquences de liaison d'amorces,

    - effectuer une amplification en pont pour fournir des grappes d'adaptateurs-fragments de restriction ligaturés amplifiés ou d'amplicons amplifiés,

    - déterminer la séquence nucléotidique des adaptateurs-fragments de restriction ligaturés amplifiés ou des amplicons amplifiés en utilisant des nucléotides de terminaison réversibles marqués.
16. Méthode selon la revendication 1, dans laquelle l'identifiant est de 4 à 16 pb, de préférence de 4 à 10, de manière plus préférée de 4 à 8, de la manière la plus préférée de 4 à 6 pb.
17. Méthode selon la revendication 1, dans laquelle l'identifiant ne contient pas 2 bases consécutives identiques ou plus.
18. Méthode selon la revendication 1, dans laquelle pour deux échantillons ou plus, les identifiants correspondants contiennent au moins deux nucléotides différents.
19. Utilisation de la méthode de l'une quelconque des revendications 1 à 18 pour l'identification de marqueurs moléculaires, pour un génotypage, une analyse de ségrégants en vrac, une cartographie génétique, un rétrocroisement assisté par marqueur, une cartographie des locus de caractères quantitatifs, une cartographie de déséquilibre de liaison.
20. Kit à utiliser dans la méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 18, comprenant :

    - un ou plusieurs adaptateurs comprenant une séquence compatible avec une amorce 5', suivie d'une section d'identification spécifique à un échantillon, et une extrémité 3' qui peut être ligaturée à l'extrémité émoussée ou a l'extrémité saillante d'un fragment de restriction pour fournir des adaptateurs-fragments de restriction ligaturés, et

    - une ou plusieurs amorces capables de s'hybrider aux adaptateurs-fragments de restriction ligaturés, comprenant une partie qui est complémentaire des un ou plusieurs adaptateurs et comprenant à l'extrémité 3' un ou plusieurs nucléotides sélectifs pour fournir un sous-ensemble d'adaptateurs-fragments de restriction ligaturés amplifiés par amplification sélective.
21. Kit à utiliser dans la méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 18, comprenant :

    - un ou plusieurs adaptateurs comprenant une séquence compatible avec une amorce 5', suivie d'une section d'identification spécifique à un échantillon, et une extrémité 3' qui peut être ligaturée à l'extrémité émoussée ou a l'extrémité saillante d'un fragment de restriction pour fournir des adaptateurs-fragments de restriction ligaturés, et

    - une ou plusieurs amorces capables de s'hybrider aux adaptateurs-fragments de restriction ligaturés, comprenant une partie qui est complémentaire des un ou plusieurs adaptateurs et comprenant à l'extrémité 3' un ou plusieurs nucléotides sélectifs pour fournir un sous-ensemble d'adaptateurs-fragments de restriction ligaturés amplifiés par amplification sélective, et

    - une ou plusieurs amorces pour une amplification non sélective qui sont complémentaires des un ou plusieurs adaptateurs uniquement.