HK1244301B - High throughput detection of molecular markers based on aflp and high troughput sequencing - Google Patents

Claims (21)

1. Verfahren zum Nachweisen von Polymorphismen in Restriktionsfragmenten von zwei oder mehreren Proben, umfassend die Schritte von:

   (a) Bereitstellen von zwei oder mehreren Nukleinsäureproben;

   (b) Verdauen jeder Nukleinsäureprobe mit mindestens einer Restriktionsendonuklease, um einen Satz von Restriktionsfragmenten zu erhalten;

   (c) Bereitstellen von doppelsträngigen synthetischen Adaptern, umfassend

   - eine 5'-Primer-kompatible Sequenz, gefolgt durch einen probenspezifische Identifikatorabschnitt, und

   - ein 3'-Ende, das an das glatte oder vorspringende Ende eines Restriktionsfragments ligieren kann;

   (d) Ligieren der doppelsträngigen synthetischen Adapter an die Restriktionsfragmente in dem Satz, um einen Satz Adapter-ligierte Restriktionsfragmente bereitzustellen;

   (e) optional Amplifikation des Satzes der Adapter-ligierten Restriktionsfragmente mit einem oder mehreren Primern, die mindestens komplementär sind zu:

   - dem probenspezifischen Identifikatorabschnitt,

   - einem Abschnitt, der komplementär zu den Resten der Erkennungssequenz der Restriktionsendonuklease ist,

   um amplifizierte Adapter-ligierte Restriktionsfragmente (Amplikons) bereitzustellen;

   (f) Bestimmen der Sequenz von mindestens

   - dem probenspezifischen Identifikatorabschnitt;

   - der Reste der Erkennungssequenz der Restriktionsendonuklease; und

   - einem Teil der Sequenz des Restriktionsfragments, die benachbart zu den Resten der Erkennungssequenz der Restriktionsnuklease verbleibt; und

   (g) Nachweisen von Polymorphismen in der Sequenz der Adapter-ligierten Restriktionsfragmente in den im Schritt (f) erhaltenen zwei oder mehreren Proben.
2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Restriktionsfragmente molekulare Marker sind.
3. Verfahren nach Anspruch 2, wobei die molekularen Marker AFLP-Marker sind.
4. Verfahren nach Anspruch 1, wobei zwei oder mehrere Proben auf die Anwesenheit oder Abwesenheit von Restriktionsfragmenten und/oder molekularen Markern verglichen werden.
5. Verfahren nach Anspruch 1, wobei zwei oder mehrere Proben nach dem Schritt des Ligierens der Adapter in einem Pool kombiniert werden.
6. Verfahren nach Anspruch 5, wobei für jede Probe im Pool ein probenspezifischer Identifikator verwendet wird, der sich von den anderen probenspezifischen Identifikatoren in dem Pool unterscheidet.
7. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Primer ein oder mehrere selektive Nukleotide am 3'-Ende enthalten.
8. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Restriktionsendonuklease eine Restriktionsendonuklease vom Typ-II ist.
9. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Restriktionsendonuklease eine Restriktionsendonuklease vom Typ-IIs ist.
10. Verfahren nach Anspruch 1, wobei zwei oder mehrere Restriktionsendonukleasen verwendet werden.
11. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Sequenzieren mittels Hochdurchsatz-Sequenzieren erfolgt.
12. Verfahren nach Anspruch 11, wobei das Hochdurchsatz-Sequenzieren auf einem festen Träger erfolgt.
13. Verfahren nach Anspruch 11, wobei das Hochdurchsatz-Sequenzieren auf Sequencing-by-Synthesis basiert.
14. Verfahren nach Anspruch 11, wobei das Hochdurchsatz-Sequenzieren die Schritte umfasst von:

    - Annealen des Amplikons oder der Adapter-ligierten Restriktionsfragmente an Perlen, wobei jede Perle mit einem einzelnen Adapter-ligierten Restriktionsfragment oder Amplikon annealt wird;

    - Emulgieren der Perlen in Wasser-In-Öl-Mikroreaktoren, wobei jeder einzelne Wasser-In-ÖI-Mikroreaktor eine einzelne Perle umfasst;

    - Durchführen von Emulsions-PCR, um die Adapter-ligierten Restriktionsfragmente oder Amplikons auf der Oberfläche der Perlen zu amplifizieren;

    - optional Auswählen/Anreichern von die Perlen, die amplifizierte Amplikons enthalten;

    - Füllen der Perlen in Vertiefungen, wobei jede Vertiefung eine einzelne Perle enthält; und

    - Bestimmen der Nukleotidsequenz der amplifizierten Adapter-ligierten Restriktionsfragmente oder amplifizierten Amplikons unter Verwendung der Erzeugung eines Pyrophosphatsignals.
15. Verfahren nach Anspruch 11, wobei das Hochdurchsatz-Sequenzieren den Schritt umfasst von:

    - Annealen der Adapter-ligierten Restriktionsfragmente oder Amplikons an eine Oberfläche, die erste und zweite Primer bzw. erste und zweite Primerbindende Sequenzen enthält;

    - Durchführen von Brückenamplifikation, um Cluster von amplifizierten Adapter-ligierten Restriktionsfragmenten oder amplifizierte Amplikons bereitzustellen,

    - Bestimmen der Nukleotidsequenz der amplifizierten Adapter-ligierten Restriktionsfragmente oder amplifizierten Amplikons unter Verwendung von markierten reversiblen Terminatornukleotiden.
16. Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Identifikator von 4-16 bp, bevorzugt 4-10, bevorzugter von 4-8, am bevorzugtesten von 4-6 bp ist.
17. Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Identifikator keine 2 oder mehr identische aufeinander folgende Basen enthält.
18. Verfahren nach Anspruch 1, wobei für zwei oder mehrere Proben die entsprechenden Identifikatoren mindestens zwei unterschiedliche Nukleotide enthalten.
19. Verwendung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1-18 für die Identifikation von molekularen Markern für die Genotypifizierung, die Massenseparationsanalyse, das genetische Kartieren, das Markerunterstützte Rückkreuzen, das Kartieren einer Region eines quantitativen Merkmals, das Kopplungsungleichgewichtskartieren.
20. Kit zur Verwendung in dem Verfahren nach einem der Ansprüche 1-18, umfassend:

    - einen oder mehrere Adapter, die eine 5'-Primer-kompatible Sequenz umfassen, gefolgt durch einen probenspezifische Identifikatorabschnitt, und ein 3'-Ende, das zu dem glatten oder vorspringenden Ende eines Restriktionsfragments für die Bereitstellung von Adapter-ligierten Restriktionsfragmenten ligieren kann, und

    - einen oder mehrere Primer, die an die Adapter-ligierten Restriktionsfragmente hybridisieren können, umfassend einen Teil, der komplementär zu einem oder mehreren Adaptern ist und an dem 3'-Ende ein oder mehrere selektive Nukleotide umfasst, für die Bereitstellung einer Teilmenge von amplifizierten Adapter-ligierten Restriktionsfragmenten durch selektive Amplifikation.
21. Kit zur Verwendung in dem Verfahren nach einem der Ansprüche 1-18, umfassend:

    - einen oder mehrere Adapter, die eine 5'-Primer-kompatible Sequenz umfassen, gefolgt durch einen probenspezifischen Identifikatorabschnitt, und ein 3'-Ende, das zu dem glatten oder vorspringenden Ende eines Restriktionsfragments für die Bereitstellung von Adapter-ligierten Restriktionsfragmenten ligieren kann, und

    - einen oder mehrere Primer, die an die Adapter-ligierten Restriktionsfragmente hybridisieren können, umfassend einen Teil, der komplementär zu einem oder mehreren Adaptern ist und an dem 3'-Ende ein oder mehrere selektive Nukleotide umfasst, für die Bereitstellung einer Teilmenge von amplifizierten Adapter-ligierten Restriktionsfragmenten durch selektive Amplifikation, und

    - einen oder mehrere Primer für nichtselektive Amplifikation, die nur zu dem einen oder mehreren Adaptern komplementär sind.