HK1138036B

HK1138036B - 分泌高水平植酸酶的耐胆汁芽孢杆菌组合物

Info

Publication number: HK1138036B
Application number: HK10104204.2A
Authority: HK
Inventors: 英吉‧奈普; 艾恩‧纳莱伯格; 托马斯‧达尔曼‧莱泽; 本特‧隆德
Original assignee: 科‧汉森有限公司
Priority date: 2007-07-06
Filing date: 2008-06-11
Publication date: 2013-11-08

Description

分泌高水平植酸酶的耐胆汁芽孢杆菌组合物

技术领域

本发明涉及一种芽孢杆菌组合物，其特征在于在胆盐(模拟肠道环境)中快速出芽和增生以及分泌高水平的植酸酶。该芽孢杆菌组合物可用作动物饲料补充剂，在饲料中其具有益生(健康促进)作用并增加动物饲料中营养的消化和可利用度。

背景技术

益生菌诸如枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌在动物饲料工业中用作膳食补充剂。其使用与芽孢杆菌代替或减少抗生素使用的能力有关，其在动物饲料工业中用作生长促进剂。

Christian Hansen A/S(丹麦)将此益生的生长促进产品的一个实例以商品名 (保藏号为DSM 17231)实现商业化。为枯草芽孢杆菌孢子细胞组合物。

除了推荐的作用方式以外(例如，免疫调节、肠道菌群调节剂)，益生的芽孢杆菌能够产生许多有益的成分，诸如酶类，当其用作动物饲料补充剂时酶类被分泌至胃肠道(GIT)中。诸如植酸酶的酶类被分泌并改善动物饲料的消化和较好的摄取(较高的消化率)。膳食(饲料)主要为植物来源诸如谷物、玉米、大豆、豆油和氨基酸。所有这些作用都有利于生产低成本的动物产品。

在动物饲料工业中广泛使用的酶类之一是植酸酶。植酸酶被应用于改善动物膳食中磷的消化率。植酸盐是谷物、油籽和豆类中磷的主要形式。然而，单胃动物诸如猪、家禽和鱼类对此磷酸盐源的利用很差，因为它们缺乏用于从植酸盐的有机络合物中释放磷酸盐的必需胃肠道酶。因此，被消费的饲料中大部分的植酸盐经过胃肠道并排泄在粪便中。在土壤和水环境中发生磷酸盐的催化释放，且粪便中的植酸盐构成了严重的磷污染问题，导致地表水的富营养化。另外，生产者不得不使用昂贵的磷补充饲料来满足动物膳食的需求。此外，植酸盐具有抗营养特性包括与蛋白质和二价阳离子形成络合物，从而降低其生物利用度。

文献中已经很好地证明补充植酸酶能改善单胃动物饲养中植酸盐的利用，并且对于矿物质的生物利用度具有积极作用。

芽孢杆菌孢子可通过酸性胃屏障，并在动物的胃肠道(GIT)内出芽和增生。此特性具有很大的优点，因为当被摄入时，它们可分泌许多类型的有益成分，例如，细菌素，并且还分泌有用的酶类诸如植酸酶。而且，在饲料粒化过程中，芽孢杆菌孢子是耐热的，因此其是使细菌素和酶类都进入胃肠道的优异的递送系统。

在芽孢杆菌在胃肠道中的生存和增殖过程中，胆汁的作用很重要。胆汁在肝脏中产生并储存在胆囊中。胆汁含有水、卵磷脂、胆红素和胆绿素以及胆盐。

从文献中知道，胆汁对芽孢杆菌孢子细胞在动物胃肠道中的生存以及出芽并增生为营养细胞具有一些负面影响。因此正在进行研究以找到益生的耐胆汁的芽孢杆菌菌株。

论文(Antonie Van Leeuwenhoek.2006 Aug；90(2)：139-46.Epub 2006年7月4日)说明了直接从鸡肠中分离许多芽孢杆菌标本/细胞。检测分离的芽孢杆菌细胞的益生活性。检测具有最高益生活性的6种芽孢杆菌的耐胆盐性，并且发现益生性特别高的芽孢杆菌具有相对高水平的耐胆盐性。

在此论文中没有特别地将重点集中在检测耐胆汁性的任何时段。在试验部分，在胆盐存在5天后简单地检测了芽孢杆菌孢子细胞的耐受性(见141页的段落“Simulated small intestinal fluid tolerance test”(“模拟耐小肠液试验”))。

US2003/0124104A说明了益生的常规芽孢杆菌内生孢子对低浓度的胆盐敏感，即，甚至低浓度的胆盐的存在都会抑制孢子出芽和/或再水化。这与其他细菌诸如肠道病原体，诸如大肠杆菌或金黄色葡萄球菌相反(见段落[0014]至[0015])。就此而言，建议筛选/选择对胆盐的抑制性活性具有抗性并因此能出芽成为营养细胞，然后在结肠定植的芽孢杆菌孢子(见[0019])。

在该说明书中提供的都是工作实施例，没有提供实际筛选的具体芽孢杆菌细胞的真实试验数据。

此外，胆盐筛选条件的说明是相对概括的。具体地，没有指出选择耐胆汁性的任何时段。换句话说，基于此文献的粗略或概括性的说明，仅可选择仅可缓慢生长(出芽)的芽孢杆菌细胞，即，能够在适当量的胆盐的存在下在例如20小时后从孢子出芽成为营养细胞的芽孢杆菌细胞。

在此文献中，没有对迅速增生(出芽)的芽孢杆菌细胞，即，能够在适当量的胆盐的存在下在特定时间间隔内达到规定生长点的从孢子出芽并增生为营养细胞的芽孢杆菌细胞有任何描述或建议。

总之，关于耐胆汁芽孢杆菌细胞的选择/筛选的现有技术参考文献没有集中在从孢子细胞迅速增生/出芽成为芽孢杆菌营养细胞。

现有技术说明了用于选择产生植酸酶的芽孢杆菌菌株的许多检测/筛选系统。

US6255098中的一个实施例中鉴定了产生植酸酶的芽孢杆菌菌株。但没有提到鉴定的芽孢杆菌菌株的耐胆汁性。

发明内容

本发明要解决的问题是提供一种芽孢杆菌组合物，其在动物的胃肠道(GIT)中分泌大量的植酸酶。

该技术方案基于：本发明人已经开发了一种用于鉴定的新的改良芽孢杆菌组合物的新选择方法。

本文所述的新选择方法的新的重要步骤是特异地筛选/选择在胆盐的存在下较快/迅速地从孢子出芽并增生为营养细胞的芽孢杆菌孢子细胞。

如上所述，现有技术已经说明了用于筛选能够在胆盐的存在下生长的芽孢杆菌的许多方法，但现有的筛选/选择方法没有将重点集中于在胆盐的存在下出芽并增生的速度。因此，现有技术中筛选的耐胆汁细胞出芽并增生的速度不符合本文所述出芽并增生的速度标准。例如，在肠道环境中从例如鸡肠中直接分离的芽孢杆菌细胞(如，例如在上面讨论的Antonie VanLeeuwenhoek的论文中所述)没有被选择(在常压下)为在肠内迅速地出芽并增生。

如在本文中的工作实施例中所示，对于市售的芽孢杆菌组合物也是如此，在生理水平的胆盐的存在下，其出芽和增生太缓慢，并在第一个20小时内不能达到规定的生长点，不符合本文所述的出芽并增生的速度标准。是在商业上成功的一种枯草芽孢杆菌组合物。

通过使用作为起始菌株以及如本文所述的选择压力法和随后的分离在胆盐的存在下迅速地从孢子出芽并增生成为营养细胞的菌株而选择了本文所述的新的DSM 19467。

进一步的细节见表1(在本文中也可称为DSM 17231)。

在本文的图1中对此进行了示意性地图示。

总之，相信现有技术中没有说明一种分离的芽孢杆菌组合物，其包括10⁵-10¹²CFU/g芽孢杆菌细胞，其中所述芽孢杆菌组合物的细胞符合如本文所述的在胆盐的存在下迅速出芽并增生的标准。

不限于理论，本发明人已经鉴定出迅速出芽和增生是本发明的一个非常重要的方面，因为芽孢杆菌孢子对胆汁有耐受性，但不能足够快速的出芽和增生，会在芽孢杆菌营养细胞发挥任意显著的积极特性诸如产生显著量的植酸酶之前被排泄掉。

出芽太缓慢的芽孢杆菌孢子在细菌可产生任意显著量的例如植酸酶之前仅仅通过胃肠道(GIT)。

在进行了大量详尽的试验和分析后，本发明人因此选择在多达20小时的时间范围进行工作，并且在此时段内在很高的生理浓度的胆盐的存在下选择最快出芽和增生的孢子。不限于理论并基于本文详细公开的试验工作，本发明人已经鉴定出在4和6mM胆盐的存在下，分别在第一个18和19小时内迅速出芽和增生是很重要的。

本发明人然后鉴定出一旦选择出在胆盐培养基中迅速出芽和增生的芽孢杆菌细胞，这些细胞非常有用的用作起始细胞用于突变以获得具有提高的植酸酶生产能力的新细胞。

如在图1和表2中所示，迅速增生的耐胆汁选择株DSM 19467用作起始菌株用于经典突变，并且选择出高植酸酶产量的DSM 19489株。类似地，通过使用DSM 19467作为起始菌株制备基因修饰生物(GMO)DSM 19466株。如表2和实施例4的相关描述可见，DSM 19489和DSM 19466比DSM19467和产生显著更多的植酸酶。重新检查高植酸酶产量的DSM19489和DSM 19466株的如本文所述那样快速出芽和增生的能力，它们保持了迅速增生的耐胆汁选择株DSM 19467的迅速出芽和增生特性(见本文的实施例5)。

在本文的图1中，对此进行了示意性地图示。

由此本文公开的新的益生的芽孢杆菌细胞是一种耐胆汁的，迅速出芽和增生的，并且分泌大量植酸酶的芽孢杆菌细胞。获得的菌株非常有用的用作添加至动物饲料中的益生芽孢杆菌组合物。其综合了益生菌在动物的肠道(存在高胆盐水平)中生存和增殖，抑制病原菌(产生细菌素)，并另外地分泌大量的益于和用于消化和摄取获自植酸盐的磷的植酸酶的所有有益能力。

因此，本发明的第一个方面涉及一种芽孢杆菌组合物，其包括10⁵-10¹²CFU/g芽孢杆菌孢子细胞，其中芽孢杆菌组合物的特征在于：

(i)：芽孢杆菌孢子在包括4和6mM胆盐的胆盐培养基的存在下从孢子快速出芽和增生为营养细胞，其中快速出芽和增生定义为芽孢杆菌孢子分别在小于18小时和19小时内达到OD₆₃₀为0.4的营养细胞生长点，其中营养细胞生长点是生长曲线中OD值开始以连续的方式增加(由营养细胞的生长所引起)并达到OD₆₃₀为0.4的点；

(I)：其中胆盐培养基是本文实施例1的补充了胆盐混合物的标准已知非选择性小牛肉浸出液肉汤(VIB)培养基，所述胆盐混合物包括结合型胆盐牛磺脱氧胆酸盐和甘氨脱氧胆酸盐以及去结合型胆盐脱氧胆酸盐，其比例为60％的牛磺脱氧胆酸盐、30％的甘氨脱氧胆酸盐和10％的脱氧胆酸盐；以及

其中OD测定分析通过下列步骤进行：

(a)：在微量滴定板的孔内装入0.150ml的每ml培养基10⁸芽孢杆菌孢子的胆盐培养基(即，此为0时刻)；以及

(b)：将滴定板在37℃下在大气条件下孵育，使用分光光度计测定OD₆₃₀值并在每次读数之前搅动，从而获得代表性的随时间变化的生长曲线；

以及

(ii)芽孢杆菌营养细胞产生植酸酶的量比参考芽孢杆菌细胞DSM19467多至少1.25倍，其中产生的植酸酶的量是在本文实施例2的标准已知非选择性心浸液肉汤(HIB)培养基中在37℃下生长4小时后通过本文实施例2的标准植酸酶测定法来测定；以及

其中植酸酶测定分析通过下列步骤进行：

(a)：在增菌培养基中制备芽孢杆菌营养细胞的过夜培养物；以及

(b)：从过夜培养物中将1％接种物转移至HIB培养基中(即，此为0时刻)并在37℃下孵育直至进行植酸酶活性测定。

如上所述，通过使用作为起始菌株选择参考芽孢杆菌细胞DSM 19467在胆盐的存在下的迅速出芽和增生。未选择出DSM 19467的植酸酶产量有提高。不限于理论，相信DSM 19467的相关植酸酶产量与相当。

关于特征(i)，的营养细胞生长点为在4和6mM胆盐中孵育后的至少20小时，并且对于新的DSM 19489株，如本文所述，其营养细胞生长点在4和6mM胆盐中分别在14和15小时后(见本文的图2和工作实施例3)。

在此要注意，本发明人还测试了市售产品 (Calpis Co.，Ltd.，Japan)以测定在第一方面的特征(i)的条件下的营养细胞生长点。至于市售产品是用作益生饲料添加剂的一种枯草芽孢杆菌组合物。对于在第一方面的特征(i)的条件下的营养细胞生长点为分别在4和6mM胆盐中20小时以上。这大大超过了在特征(i)中所需的18和19小时，并且此说明，迄今为止，没有一种市售产品能被选择用于迅速出芽和增生。如上所述，“天然”芽孢杆菌细胞不能在任何选择压力下迅速出芽和增生。不限于理论，因此相信“天然”芽孢杆菌细胞不符合第一方面的特征(i)的条件。

[特征(i)]的耐胆汁性测定和[特征(ii)]的植酸酶测定都基于已知的市售的标准要素(诸如，例如，标准培养基、胆盐；标准OD测定法和标准检测)。

参考芽孢杆菌细胞保藏为DSM 19467，因此是公众可以得到的。枯草芽孢杆菌细胞保藏为DSM 17231(命名为 )，并且因此也是公众可以获得的。

因此，基于本文详细的测定说明(见，例如，本文的实施例1的耐胆汁性测定和实施例2的植酸酶测定)，专业技术人员能够常规地重复这些测定以客观地确定特定的目的芽孢杆菌细胞是否符合本发明的第一方面的[特征(i)]的耐胆汁性和[特征(ii)]的植酸酶水平。

如本文所述的新芽孢杆菌组合物可用作动物饲料的益生补充剂。剂量和施用可根据本领域，例如现有技术芽孢杆菌组合物所采用的方案来进行。

因此，本发明的第二方面涉及一种饲养动物的方法，包括将第一方面和本文所述的相关实施方式的芽孢杆菌组合物结合其他动物饲料成分给予动物。

本发明的第三方面涉及一种筛选和分离新芽孢杆菌细胞的方法，包括下列步骤：

(a)：从单芽孢杆菌孢子细胞库内筛选并分离出新芽孢杆菌孢子细胞，该新芽孢杆菌孢子细胞能够迅速地出芽和增生，使得其在第一方面的特征(i)的条件下在小于18和19小时内达到营养细胞生长点；

(b)：从步骤(a)的分离孢子细胞制备芽孢杆菌营养细胞，并且将新的选择和分离的细胞突变以得到新单芽孢杆菌营养细胞的库；

(c)：从步骤(b)的新单芽孢杆菌营养细胞库中选择和分离新芽孢杆菌营养细胞，该新芽孢杆菌营养细胞能够在第一方面的特征(ii)的条件下产生的植酸酶的量比以DSM保藏号19467保藏的参考芽孢杆菌细胞多至少1.25倍；以及

(d)：分析步骤(c)的高产的芽孢杆菌营养细胞以确认其保持了步骤(a)的迅速出芽和增生能力，并分离所述被选择的细胞。

对于专业技术人员显而易见的是，一旦本发明人在本文中公开了相关的检测测定法(特别是实施例1的用于检测迅速出芽和增生的测定法)加上参考菌株DSM 19467，对于专业技术人员来说，选择符合本文第一方面的标准的其他新的芽孢杆菌细胞将是常规的工作。

如本文所讨论的，通过使用如本文所述的新的筛选/选择方法，本发明人已经选择和分离了许多新的改良芽孢杆菌细胞，这些细胞已被保藏。

因此，本发明的第四方面涉及选自下列的芽孢杆菌细胞：

(a)保藏号为DSM 19467的枯草芽孢杆菌细胞；

(b)保藏号为DSM 19489的枯草芽孢杆菌细胞；和

(c)保藏号为DSM 19466的枯草芽孢杆菌细胞；

或其突变株，其中所述突变株通过使用所述保藏菌株之一作为起始原料而获得，并且其中所述突变株保留了所述保藏菌株的基本特性。

下面仅通过实施例说明本发明的实施方式。

定义

本文相关术语的所有定义均与本文相关技术内容所属领域的专业技术人员所理解的一致。

本文中术语“芽孢杆菌细胞”是指芽孢杆菌孢子细胞和芽孢杆菌营养细胞。

关于芽孢杆菌孢子细胞，本文中术语“芽孢杆菌孢子”所指的孢子根据本领域其特征可以是由芽孢杆菌产生的休眠的、坚韧的、无生殖力的结构。孢子的主要功能通常是在环境应激期间确保细菌的生存。因此它们对紫外线和γ射线照射、干燥、溶菌酶、温度、饥饿和化学消毒剂有耐受性。孢子通常见于土壤和水中，它们在此可以生存很长的时间。孢子壳对许多毒性分子不通透，并且还含有参与出芽的酶类。核心具有正常的细胞结构，诸如DNA和核糖体，但是代谢不活跃的。当细菌检测到环境条件变得不利时，它可启动孢子形成过程，需要大约8小时。

术语“芽孢杆菌营养细胞”是指功能性营养芽孢杆菌细胞，其可分裂产生更多的营养细胞。

术语“出芽和增生”是指芽孢杆菌孢子出芽并增生为芽孢杆菌营养细胞。如专业技术人员所公知的那样，当条件有利时发生孢子的复活，并涉及出芽和增生。出芽是指休眠孢子开启代谢活性并由此打断休眠。其普遍的特征在于孢子壳的破裂或吸收，孢子的肿胀，代谢活性的增加，以及对环境应激的耐受性丧失。增生在出芽之后发生，并涉及孢子核心制造新的化学成分并脱离老的孢子壳以发育成为功能性营养细菌细胞，该营养细胞壳分裂以产生更多的细胞。

细菌细胞的生长曲线(OD随时间变化)显示不同的生长期。当孢子被转移至富营养培养基中时，开始出芽，紧接着OD暂时下降(I期)，这是由于吡啶二羧酸的释放以及因此孢子壳的水合作用而造成的。在第二期(II期＝增生期)中，有一个时期OD的变化相对小，直至孢子发育成为功能性营养细菌细胞，该营养细胞可分裂以产生更多的细胞，从而使OD值连续增加。当OD值开始持续增加达到0.4的OD时的点，在本文中被称为“营养细胞生长点”。

术语“光密度”被定义为使用分光光度计测定吸光度的指标。光密度(OD)是光学元件对给定波长λ每单位距离的吸光度。如果，例如，OD在波长630nm下测定，则其可称为OD₆₃₀。

附图说明

图1：在此图中，图示了得到本文的新的改良株的步骤。本文的工作实施例从DSM 17231 开始，其被典型地突变并筛选/选择在胆盐的存在下迅速出芽并增生以得到新的选择株DSM 19467。DSM 19467用作用于典型突变的起始菌株，并选择高植酸酶产量的DSM 19489株。类似地，通过使用DSM 19467作为起始菌株制备基因修饰生物(GMO)DSM19466株。

图2a和2b：这些图清楚地显示与DSM 17231相比，在如本文所述的4和6mM胆盐的存在下，本发明的DSM 19489芽孢杆菌孢子较快地出芽和增生。

具体实施方式

芽孢杆菌组合物：

术语“芽孢杆菌组合物”应该根据本领域进行理解。在本文中其被理解为包括许多具有目的特性的芽孢杆菌孢子细胞的芽孢杆菌组合物。

芽孢杆菌组合物可包括不同类型的芽孢杆菌细胞(例如，枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌)。本质上，该组合物应当简单地包括一定量的本文第一方面中指定的芽孢杆菌孢子细胞，其中所述芽孢杆菌细胞符合第一方面中指定的标准。

如专业技术人员所公知的，本文中市售的适当芽孢杆菌孢子细胞组合物通常通过发酵来制备。获得的孢子细胞通过被浓缩、干燥、与载体混合并被包装在合适的容器中。

组合物的适当的，例如，10⁵-10¹²CFU/g芽孢杆菌细胞可以专业技术人员所公知的市售的适当形式存在。

因此，在一个实施方式中，组合物的10⁵-10¹²CFU/g芽孢杆菌细胞作为干燥的(例如，喷雾干燥的)细胞或作为冷冻的孢子细胞存在。

在一个优选的实施方式中，芽孢杆菌组合物包括10⁶-10¹²CFU/g芽孢杆菌细胞，更优选10⁷-10¹²CFU/g芽孢杆菌细胞。

术语“CFU/g”是指此组合物的克重量，包括组合物中存在的合适的相关添加剂。其不包括用来包装芽孢杆菌组合物的合适容器的重量。

一个实施方式涉及芽孢杆菌组合物被包装在合适的容器中。

如专业技术人员所公知的，市售的相关细菌组合物通常还包括其他相关的添加剂诸如，例如，属于乳清、乳清渗透物、碳酸钙/石灰石和防结块剂诸如硅酸铝和硅藻土的一种载体/成分。

除了本文的相关芽孢杆菌细胞以外，组合物还克包括其他相关的目的微生物，诸如，例如，目的乳酸菌。

芽孢杆菌细胞

芽孢杆菌细胞可以是任何相关的目的芽孢杆菌细胞。

在一个优选的实施方式中，芽孢杆菌细胞是选自下列芽孢杆菌种的至少一种芽孢杆菌细胞：

枯草芽孢杆菌、单鞭毛枯草芽孢杆菌(Bacillus uniflagellatus)，侧孢芽孢杆菌(Bacillus laterosporus)、侧孢芽孢杆菌BOD、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)、多粘芽孢杆菌(Bacillus polymyxa)、地衣芽孢杆菌、短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)和嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillussterothermophilus)、凝固芽胞杆菌(Bacillus coagulans)、嗜热芽孢杆菌(Bacillus thermophilus)、蕈状芽孢杆菌(Bacillus mycoides)、蜡样芽胞杆菌(Bacillus cereus)和环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)。

在一个更优选的实施方式中，芽孢杆菌细胞是枯草芽孢杆菌细胞或地衣芽孢杆菌细胞。

最优选的是其中芽孢杆菌细胞是枯草杆菌细胞。

选择在胆盐的存在下迅速出芽和增生的测定

如上所述，第一方面的特征(i)的耐胆汁性测定基于已知的市售标准要素(诸如，例如，标准培养基、胆盐；标准OD测定法)。

因此，基于本文详细的测定说明(见，例如本文的实施例1)，专业技术人员能够常规地重复该测定以客观地确定特定的目的芽孢杆菌孢子细胞是否符合如特征(i)中所述的从孢子迅速出芽并增生为营养细胞的标准。

在特征(i)中，解释了营养细胞生长点是在生长曲线中从对应于0.2-0.3左右的OD的10⁸孢子/ml开始直至OD值已经以连续方式增加(由于营养细胞的生长所引起)，并达到OD 0.4的点的时刻。如本文所解释的，即根据专业技术人员如何理解此营养细胞生长点并基于生长曲线，在约±30分钟的有限误差范围内，专业技术人员可常规地确定此生长点。

本文的工作实施例1提供了适于选择在胆盐的存在下迅速出芽和增生的耐胆汁性测定的详细描述。此实施例1的详细条件是确定目的芽孢杆菌孢子细胞是否符合第一方面的特征(i)的标准的优选测定法。

术语“胆盐”是指胆汁酸的盐。胆汁酸是主要在哺乳动物的胆汁中发现的类固醇酸。它们通过胆固醇的氧化在肝内产生，并储存在胆囊中并以盐的形式分泌至肠内。它们用作表面活性剂、乳化脂质并协助其吸收和消化。模拟猪胆盐的生理浓度和组合物制备用于实施例1中的胆盐。如专业技术人员所公知的，与鸟类胆盐组合物相比，猪胆盐组合物在本文中可被认为是相对“苛刻”的条件。

术语“胆盐培养基”是指包括相关的芽孢杆菌生长成分诸如相关的营养素和胆盐的培养基。

营养细胞生长点-在胆盐测定中-第一方面的特征(i)

如上所述，关于第一方面的特征(i)，如本文所述，芽孢杆菌孢子细胞从孢子出芽并增生成为营养细胞的速度很快使得它们在4和6mM胆盐中分别在少于18和19小时内达到0.4 OD的营养细胞生长点。

如上所述，新的DSM 19467株在4和6mM胆盐中分别在孵育14和15小时后达到营养细胞生长点。

因此，在优选的实施方式中，在第一方面的特征(i)的条件下，芽孢杆菌孢子在4和6mM胆盐中分别在孵育17和18小时后达到营养细胞生长点，更优选在第一方面的特征(i)的条件下，芽孢杆菌孢子在4和6mM胆盐中在孵育15和16小时后达到营养细胞生长点。

如上所解释以及在图1中示意性的显示，本文所述的新的DSM 19467株通过使用市售的作为起始菌株如本文所述用于突变和选择在胆盐的存在下的迅速生长而选择。是一种包括枯草芽孢杆菌细胞的组合物，并且该枯草芽孢杆菌被保藏为DSM 17231。因此，在本文中可被看作是参考菌株。

如上所述，的营养细胞生长起始点为在第一方面的特征(i)的条件下在4和6mM胆盐中孵育20小时后。因此，在一个实施方式中，在第一方面的特征(i)的条件下，芽孢杆菌孢子比保藏为DSM 17231 的参考枯草芽孢杆菌孢子细胞早至少3小时达到营养细胞生长点，更优选在第一方面的特征(i)的条件下，芽孢杆菌孢子比保藏为DSM17231 的参考枯草芽孢杆菌孢子细胞早至少4小时达到营养细胞生长点，且最优选在第一方面的特征(i)的条件下，芽孢杆菌孢子比保藏为DSM 17231 的参考枯草芽孢杆菌孢子细胞早至少5小时达到营养细胞生长起始点。

植酸酶测定

如上所述，第一方面的特征(ii)的植酸酶测定基于标准已知的市售要素(诸如，例如，标准培养基，标准检测)。

因此，基于本文详细的测定说明(见，例如，本文的实施例2)，专业技术人员能够常规地重复该测定以客观地确定特定的目的芽孢杆菌营养细胞是否符合如特征(ii)中所述的植酸酶产生量。

本文的工作实施例2提供了植酸酶测定的详细描述。

此实施例2的详细条件在本文中是优选的植酸酶测定以确定目的芽孢杆菌营养细胞是否符合第一方面的特征(ii)的标准。

植酸酶的产生量-第一方面的特征(ii)

如上所述，关于第一方面的特征(ii)，在第一方面的特征(ii)的条件下，芽孢杆菌营养细胞产生植酸酶的量比参考芽孢杆菌细胞DSM 19467多至少1.25倍。

在优选的实施方式中，在第一方面的特征(ii)的条件下，芽孢杆菌营养细胞产生植酸酶的量为参考芽孢杆菌细胞DSM 19467的至少1.5倍，更优选在第一方面的特征(ii)的条件下，芽孢杆菌营养细胞产生植酸酶的量为参考芽孢杆菌细胞DSM 19467的至少1.75倍。

将芽孢杆菌孢子饲养/给予动物的方法

如上所述，本发明的第二方面涉及一种饲养动物的方法，包括将第一方面和本文所述的相关实施方式的芽孢杆菌组合物结合其他动物饲料成分给予动物。

动物可以是任意的目的动物。优选地，动物是选自家禽、反刍动物、牛、猪、兔、马、鱼和宠物的动物。

当给予根据本领域的时，正常以一餐约10⁴-10⁸CFU/g，通常以一餐10⁵-10⁶CFU/g的剂量或以与正常摄食量/kg动物活重相当的剂量的剂量完成。

可选地，芽孢杆菌孢子可以下列方式之一给予动物：

(1)：将其放入动物饮用水中；

(2)：喷雾至动物体表；或

(3)：经糊剂、凝胶或大丸剂应用。

筛选和分离新的芽孢杆菌细胞的方法

如上所述，第三方面涉及筛选和分离新的芽孢杆菌细胞的方法。

在第三方面的方法中，选择能够满足第一方面的特征(i)和特征(ii)的条件的芽孢杆菌细胞。

如专业技术人员所理解的，本文详述的具体的耐胆汁性和植酸酶量测定(见，例如，本文的用于耐胆汁性测定的实施例1和本文的用于植酸酶测定的实施例2)参数可被改变成替代的筛选方法，该方法仍然能获得如本文所述的主要目标，即，能够满足第一方面的特征(i)和特征(ii)的条件的芽孢杆菌细胞。

在优选的实施方式中，实施例1的耐胆汁性测定用于第三方面的筛选方法的步骤(a)中，且实施例2的植酸酶测定用于第三方面的筛选方法的步骤(c)中。

在第三方面的步骤(d)中，分离营养芽孢杆菌细胞。此营养芽孢杆菌细胞可用来制备芽孢杆菌孢子形式。

因此，在一个实施方式中，紧接着第三方面的筛选方法之后是额外步骤(e)，其中步骤(d)的分离的芽孢杆菌营养细胞被发酵以制成10⁵-10¹²芽孢杆菌营养细胞，且这些10⁵-10¹²芽孢杆菌营养细胞用来制成10⁵-10¹²芽孢杆菌孢子细胞，其被分离以得到芽孢杆菌组合物，该组合物包括10⁵-10¹²CFU/g芽孢杆菌孢子细胞。

步骤(e)的最终结果是新的芽孢杆菌组合物，该组合物包括10⁵-10¹²CFU/g芽孢杆菌孢子细胞，并且其中芽孢杆菌细胞能够满足第一方面的特征(i)和特征(ii)的条件。

因此，本发明的一个独立的方面涉及一种芽孢杆菌组合物，该组合物包括10⁵-10¹²CFU/g芽孢杆菌孢子细胞，并且其中芽孢杆菌细胞能够满足第一方面的特征(i)和特征(ii)的条件，该细胞可通过第三方面的筛选方法紧接着上述的额外步骤(f)而获得。

在第三方面的筛选方法的步骤(b)中，对以前选择的耐胆汁芽孢杆菌细胞进行突变以在步骤(c)中选择高植酸酶产量细胞。如专业技术人员所理解的，例如，此步骤可通过基因特异性交换的典型突变(例如通过化学处理或UV)以制成所谓的基因修饰生物(GMO)。

例如，本文所述的新的GMO株DSM 19466来自并且如本文的工作实施例中所述被首先制成具有耐胆汁性以获得DSM 19467。此后，DSM 19467株中植酸酶的启动子用另一芽孢杆菌启动子交换以使其成为植酸酶高产者，并由此获得DSM 19466。

类似地，通过使用从DSM 19467开始的典型突变获得新的高植酸酶产量的DSM 19489株。见，例如，图1。

保藏的菌株

如上所述，本发明的第四方面涉及选自下列的芽孢杆菌细胞：

(a)保藏号为DSM 19467的枯草芽孢杆菌细胞；

(b)保藏号为DSM 19489的枯草芽孢杆菌细胞；和

(c)保藏号为DSM 19466的枯草芽孢杆菌细胞；

或其突变株，其中所述突变株通过使用上述保藏菌株之一作为起始原料而获得，并且所述突变株保留了上述保藏菌株的基本特性。

本发明的第四方面涉及本文所述的新菌株或“其突变体”。

对于专业技术人员来说显而易见的是，通过使用保藏的菌株作为起始原料，专业读者可常规地通过常规诱变或再分离技术，进一步获得保留了本文所述的相关特征和优点的其突变体或其衍生物。因此，第一方面的术语“其突变体”涉及通过使用保藏菌株作为起始原料获得的突变株。

这可以可选地被表示为获得菌株的方法，该方法包括使用本文保藏的菌株之一作为起始菌株，制备保藏菌株的突变体并分离新菌株，其中突变体保留了保藏菌株的基本特性。

一株新枯草芽孢杆菌菌株的样品已经被保藏在DSMZ(DeutscheSammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH，Maschroder Weg1b，D-38124 Braunschweig)，保藏号为DSM 19467，保藏日为2007年6月27日。已经在国际承认用于专利程序的微生物保存布达佩斯条约的条件下进行了保藏。

一株新枯草芽孢杆菌菌株的样品已经被保藏在DSMZ(DeutscheSammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH，Maschroder Weg1b，D-38124 Braunschweig)，保藏号为DSM 19489，保藏日为2007年6月27日。已经在国际承认用于专利程序的微生物保存布达佩斯条约的条件下进行了保藏。

一株新枯草芽孢杆菌菌株DSM 19466的样品已经被保藏在DSMZ(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH，Maschroder Weg 1b，D-38124 Braunschweig)，保藏号为DSM 19466，保藏日为2007年6月27日。已经在国际承认用于专利程序的微生物保存布达佩斯条约的条件下进行了保藏。

实施例

实施例1：耐胆汁性测定

培养基：

培养基为标准非选择性市售培养基小牛肉浸出液肉汤(VIB)(Difco，234420)。

在本申请的申请日时，来自供应商BD Diagnostic Systems(www.bd.com)的产品目录(“Difco^TM/BBL^TM手册)关于小牛肉浸出液肉汤是如此叙述的：

“来自瘦小牛肉和蛋白胨的浸出液提供小牛肉浸出液中的氮、微生物、碳和氨基酸。氯化钠维持制剂的渗透压平衡”；以及

根据生产厂商的说明书通过下列步骤制备培养基：将25g小牛肉浸出液肉汤粉悬浮在1L纯水中(2.5％溶液)，加热并频繁搅动，煮沸1分钟以完全地溶解粉末。

2.5％小牛肉浸出液肉汤溶液包括每升：

瘦小牛肉，浸出液：10g

月示蛋白胨：10g

氯化钠：5g

培养基被分配至无菌瓶中并在121℃下高压灭菌15min。

胆盐溶液/培养基：

模拟猪胆汁中胆盐的生理组成和浓度制备胆盐混合物，且胆盐溶解在如上制备的小牛肉浸出液肉汤培养基中以得到胆盐的终浓度为8mM。

结合型胆盐为牛磺脱氧胆酸盐(Sigma T-0875，美国)和甘氨脱氧胆酸盐(Sigma G-9910，美国)以及去结合型胆盐脱氧胆酸盐(Sigma D-5670美国)，且最终的8mM混合胆盐溶液含有60％牛磺脱氧胆酸盐，30％甘氨脱氧胆酸盐和10％脱氧胆酸盐。使用氢氧化钠将溶液调节至pH7.4，然后在121℃下高压灭菌15分钟。将此制备的8mM胆盐培养基稀释以得到0、1、2、4、6和8mM的胆盐浓度。

胆盐以浓缩形式加至小牛肉浸出液肉汤培养基中。因此，在加入胆盐之前瘦小牛肉浸出液、月示蛋白胨和氯化钠的最终量与2.5％小牛肉浸出液肉汤培养基基本相同。

孢子混悬液

为了区分营养细胞和孢子，并确保纯孢子产品用于接种，使用在80℃下+/-热处理10min测定芽孢杆菌产品的孢子计数。在热处理并随后冷却至室温后，在蛋白胨盐水溶液中进行连续10倍稀释。从适当的十倍稀释液中取0.1ml接种至双份的胰蛋白月示血琼脂板(Difco 0232-01)中。这些板在37℃下孵育至第二天。基于先前产品的孢子计数测定，在无菌蒸馏水中制备孢子混悬液以达到最终计算的孢子浓度10⁸CFU/ml。使用上述的方法测定最终接种物中营养细胞和孢子的计数。10⁸CFU/ml的终浓度对应于起始OD₆₃₀ 0.2-0.3。

生长测定：光密度测定

使用无菌平底96孔微量滴定板(Greiner Bio-one GmbH，德国)。每个孔填充以0.150ml接种了孢子(～1×10⁸孢子/ml相当/对应于起始OD₆₃₀～0.2-0.3)的VIB，滴定板在37℃下孵育20小时，每次读数前用强度4(高)的周期振摇1分钟。

为了避免在滴定板盖的内侧上发生凝聚，盖子与Triton X-100的稀释溶液接触。

芽孢杆菌菌株的出芽和增生动力学使用分光光度计(Bio-tekInstruments，Inc.VE)在波长630nm(OD₆₃₀)下测定。以10分钟的间隔进行读数，并使用KC4^TM软件(Bio-tek Instruments，Inc.，USA)分析。20h后，数据输出至电子表格程序以进一步分析，输入至SAS 9.0版并进行统计学分析。

实施例2：植酸酶活性测定

在本研究中使用的测定和定量由芽孢杆菌细胞产生的植酸酶单位的方法改良自Walsh等人，2004，Biochemistry & Molecular Biology Educationvol.32 no 5(336-340)。基本上，作出的仅有的明显改良是为了生长动力学的目的而对该方法进行标准化，该改良为使用分光光度计测定相对于活芽孢杆菌细胞的植酸酶活性并在波长600下测定光密度(OD)，如果需要用稀释水1∶4稀释细胞。通过使用该方法，得到相对有限的标准差。

芽孢杆菌细胞的生长

芽孢杆菌细胞接种并在37℃下生长在增菌芽孢杆菌生长培养基中，芽孢杆菌的生长和植酸酶活性以至多24小时的间隔进行。

芽孢杆菌孢子在具有下列组成的心浸液肉汤(HIB)基础培养基中繁殖：

HIB(Bacto 238400) 25g/l

0.5％Bacto酵母提取物(Difco 212750) 5g/l

2mM CaCl₂(Merck 1.02382) 0.294g/l

在121℃下高压灭菌15min，并加入无菌过滤的1％甘露糖和1％葡萄糖。

HIB是公知的市售非选择型培养基。在本申请的申请日时，来自供应商BD Diagnostic Systems(www.bd.com)的产品目录说明了每升Bacto^TM心浸液肉汤的组成/配方为：

来自500g牛心浸液： 10.0g

胰蛋白月示： 10.0g

氯化钠： 5.0g

补充的HIB是一种低磷酸盐含量的培养基，并且因此适合用于植酸酶测定。过夜培养后，使用1％接种物用于新鲜HIB培养基中并在37℃下孵育直至活性测定(例如4、6、8和24小时后)。

在蓝帽孔培养板(blue cap Nunc)50ml或以较小量(0.150ml)在通风良好的96孔ELISA板中完成培养基的孵育。

植酸酶测定

对细胞上清液进行植酸酶测定，因为酶分泌至培养基中。微量滴定板以3600 RPM离心15min。较大体积在Eppendorf离心机中以2400-3600rpm离心15min。小心地去除上清液，在植酸酶测定前去除细胞。

溶液：

0、1M TRIS/苹果酸盐ph7.0

溶液A：0、1M TRIS/苹果酸盐(1-苹果酸，Sigma M1000)pH7.0+0.1w/v来自玉米(sigma P8810)的植酸钠盐+2mM CaCl₂(在测定前新鲜制备的)＝底物

溶液B：8g钼酸铵(Sigma A7302)+50ml H₂O+27ml 10M H₂SO₄+H₂O补足至100ml。

溶液C：5g FeSO₄(sigma F 7002)+90ml H₂O(搅拌直至溶解)+10ml溶液B(新鲜配制)

0.5M TCA(Merck 1.00807.1000)8％w/v

1mM KH₂PO₄

在含有0.020ml的芽孢杆菌上清液的96孔微量滴定板中进行测定，其中加入0.080ml含有0.1％植酸和2mM CaCl₂的0.1M Tris/苹果酸pH7.0缓冲液(溶液A)。测定板在50℃下孵育30min(遮盖板以避免蒸发)。

显色反应：

加入0.100ml 0.5M三氯乙酸TCA

加入0.100ml Fe++溶液(溶液C)

置于在室温下5分钟。将出现蓝色。

在600nm下读取吸光度。

此测定是测定上清液中的总游离磷酸盐。为了测定游离磷酸盐的本底量，还在没有植酸酶的底物(植酸)的存在下进行植酸酶测定。这意味着测定中的溶液A(见上)被单一的TRIS/苹果酸盐缓冲液pH 7.0代替。

植酸酶活性的计算

测定中测定的吸光度代表培养基中的游离磷酸盐和由植酸酶活性释放的磷酸盐两者，因此培养基中的游离磷酸盐需要被减去。为此，在具有植酸和没有植酸的缓冲液中测定样品，将两者相减以得到纯植酸酶活性。对于细胞密度(OD600)的校正，芽孢杆菌培养物的植酸酶活性表示为如此式计算的活性(单位吸光度)：

样品和具有植酸的缓冲液-样品和没有植酸的缓冲液

离心之前的OD测定值

实施例3：耐胆汁枯草芽孢杆菌细胞DSM 19467的选择

起始芽孢杆菌细胞为枯草芽孢杆菌细胞

被诱变以得到新的单个芽孢杆菌细胞库。制备并选择如上面实施例1中所述在包括4和6mM胆盐的胆盐培养基的存在下从孢子快速出芽和增生为营养细胞的孢子。

选择出枯草芽孢杆菌细胞DSM 19467。

下面的表1显示了出芽和增生数据。

从对应于10⁸CFU/ml的OD 0.2-0.3达到OD 0.4的时间(小时)(3次重复值的均数)。

在下面的实施例4中说明耐胆汁和过度表达植酸酶的DSM 19489的选择。DSM 19467具有与DSM 19489大致一样的出芽和增生。

结论

DSM 19489和DSM 19467是耐胆汁菌株，并且很明显比更快地出芽和增生。

实施例4：选择高植酸酶产量的芽孢杆菌细胞DSM 19489(经典型)和DSM19466(GMO)。

起始芽孢杆菌细胞为实施例3中选择的枯草芽孢杆菌细胞DSM19467。

DSM 19467通过经典突变而被突变以得到新的单个芽孢杆菌营养细胞库。通过使用上述实施例2中所述的植酸酶测定选择产生大量植酸酶的营养细胞。

选择了高植酸酶产量的枯草芽孢杆菌细胞DSM 19489(经典型)。

DSM 19467株中植酸酶的启动子用另一芽孢杆菌启动子交换使其成为植酸酶的高产者，由此获得DSM 19466(GMO)。

植酸酶测定的结果

菌株

DSM 19489 枯草芽孢杆菌，耐胆汁和高植酸酶产量

DSM 19467 枯草芽孢杆菌，耐胆汁，DSM 19489的母株

DSM 19466 枯草芽孢杆菌，耐胆汁和编码植酸酶的遗传修饰基因(植酸酶高产者)

表2.如上面实施例2中所述测定的被选择的菌株产生的植酸酶的结果。

时间(小时)	4	6	8	24
					DSM 19489	2.68	0.83	1.06	0.44
DSM 19467	1.10	0.57	0.68	0.59
					DSM 19466	2.30	1.07	1.37	0.44

DSM 19489株产生2.68单位的植酸酶，相比DSM 19467(其是参考耐胆汁母株)产生1.10单位。基因修饰的耐胆汁DSM 19466株(2.30)达到与DSM 19489相似的水平，并且因此它也是植酸酶高产者。

结论

DSM 19489是耐胆汁的和植酸酶高产的芽孢杆菌细胞，并且在此实施例中在培养基中生长4小时后，与DSM 19467相比产生2倍多的植酸酶。

DSM 19466(GMO)是耐胆汁菌株，其中植酸酶基因被基因修饰为植酸酶高产者，并且类似于DSM 19489，在培养基中生长4小时后，其产生的植酸酶为母株(DSM 19467)的2倍多。

DSM 19467来源于且其未被选择有高植酸酶产量。因此，相信，产生的植酸酶的量与DSM 19467大致相同。

实施例5：植酸酶高产的芽孢杆菌细胞DSM 19489(经典型)和DSM 19466(GMO)的耐胆汁性“检查”。

在实施例4中选择的植酸酶高产的芽孢杆菌细胞DSM 19489(经典型)和DSM 19466(GMO)如实施例1中所述，被重新检查其从孢子迅速出芽和增生为营养细胞的能力。

结果为，DSM 19489和DSM 19466保持了与用来获得它们的起始细胞DSM 19467基本上相同的良好的迅速出芽和增生能力。

参考文献

1.Antonie Van Leeuwenhoek.2006 Aug；90(2)：139-46.Epub 2006年7月4日

2.US2003/0124104A

3.US6255098

Claims

1.一种芽孢杆菌组合物，包括10⁵-10¹²CFU/g芽孢杆菌孢子细胞，其中所述芽孢杆菌孢子细胞是保藏号为DSM 19489的枯草芽孢杆菌细胞。

2.如权利要求1所述的芽孢杆菌组合物，其中所述组合物的芽孢杆菌孢子细胞作为干燥的孢子细胞存在。

3.权利要求2所述的芽孢杆菌组合物，其中所述干燥的孢子细胞为喷雾干燥的孢子细胞。

4.一种饲养动物的方法，包括将权利要求1-3任一项的芽孢杆菌组合物结合其他动物饲料成分给予动物。

5.如权利要求4所述的饲养动物的方法，其中所述的动物是选自家禽、反刍动物和宠物的动物。

6.如权利要求4所述的饲养动物的方法，其中所述的动物是选自牛、猪、兔、马和鱼的动物。

7.保藏号为DSM 19489的枯草芽孢杆菌细胞。