HK1119179B - Methods for the selection of aptamers - Google Patents
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Claims (27)
- Procédé pour sélectionner simultanément au moins deux aptamères comprenant une première séquence d'aptamères et une deuxième séquence d'aptamères, où la première séquence d'aptamères se lie à un premier épitope sur une molécule cible et la deuxième séquence d'aptamères se lie à un deuxième épitope sur la molécule cible ; le procédé comprenant le fait :(a) de mettre en contact une pluralité de paires de segments d'acides nucléiques comprenant un premier segment d'acide nucléique et un deuxième segment d'acide nucléique avec la molécule cible pour former un mélange de segments d'acides nucléiques et de molécules cibles, le premier segment d'acide nucléique comprenant :i. A-B-C-D ; le deuxième segment d'acide nucléique comprenant :ii. E-F-G-H ;où :A, C, E et G sont chacune des séquences différentes d'ADN d'une longueur allant d'environ 10 à environ 30 nucléotides, A et C comprenant ensemble une séquence pour amorcer une amplification en chaîne par polymérase afin d'amplifier une première séquence d'aptamères, et E et G comprenant ensemble une séquence pour amorcer une amplification en chaîne par polymérase afin d'amplifier une deuxième séquence d'aptamères ;B est une séquence nucléotidique aléatoire simple brin ayant une longueur allant d'environ 20 à environ 110 nucléotides qui contient des séquences spécifiques se liant à un premier épitope de la molécule cible ;D et H sont une paire de séquences nucléotidiques complémentaires ayant une longueur allant d'environ 2 à environ 20 nucléotides, où D et H ont une énergie libre d'association entre environ 5,5 kcal/mole et environ 8,0 kcal/mol à une température allant d'environ 21°C à environ 40°C et à une concentration en sel allant d'environ 1 mM à environ 100 mM ; etF est une séquence nucléotidique aléatoire simple brin ayant une longueur allant d'environ 20 à environ 110 nucléotides qui contient des séquences spécifiques se liant à un deuxième épitope de la molécule cible ;(b) d'isoler du mélange un complexe comprenant la molécule cible où le premier segment d'acide nucléique est lié à un premier épitope et le deuxième segment d'acide nucléique est lié au deuxième épitope ; et(c) de purifier le premier segment d'acide nucléique et le deuxième segment d'acide nucléique du complexe.
- Procédé de la revendication 1, dans lequel la molécule cible est choisie dans le groupe constitué d'un analyte, d'un prion, d'une protéine, d'un acide nucléique, d'un lipide, d'un glucide, d'une biomolécule, d'un complexe macromoléculaire, d'un champignon, d'un virus, et d'un organisme microbien.
- Procédé de la revendication 2, dans lequel la molécule cible est une protéine.
- Procédé de la revendication 1, dans lequel la pluralité de segments d'acide nucléique sont placés au contact de la molécule cible par incubation dans un tampon de sel, dont la plage de pH se trouve entre environ 6,5 et environ 8,5 à une température dans la plage d'environ 21°C à environ 40°C.
- Procédé de la revendication 1, dans lequel le complexe est isolé du mélange en utilisant un procédé choisi dans le groupe de filtres de nitrocellulose, de billes magnétiques, et de billes de sépharose.
- Procédé de la revendication 1, comprenant en outre la séparation des premier et deuxième segments d'acides nucléiques du complexe pour former un mélange comprenant la molécule cible, le premier segment d'acide nucléique et le deuxième segment d'acide nucléique.
- Procédé de la revendication 6, dans lequel le premier segment d'acide nucléique et le deuxième segment d'acide nucléique sont séparés de la molécule cible par dénaturation de la molécule cible ou par incubation du complexe avec un excès de compétiteur.
- Procédé de la revendication 7, dans lequel le premier segment d'acide nucléique et le deuxième segment d'acide nucléique sont purifiés du mélange par précipitation de l'acide nucléique.
- Procédé de la revendication 8, comprenant en outre l'amplification du premier segment d'acide nucléique et du deuxième segment d'acide nucléique par l'amplification en chaîne par polymérase pour former un produit d'amplification en chaîne par polymérase.
- Procédé de la revendication 9, dans lequel le premier segment d'acide nucléique et le deuxième segment d'acide nucléique sont purifiés du produit d'amplification en chaîne par polymérase moyennant la séparation sur gel d'agarose et la purification de l'acide nucléique à partir du gel.
- Procédé de la revendication 9, comprenant en outre la répétition des étapes de sélection, de séparation, d'amplification et de purification du procédé entre environ 4 et environ 20 fois, où à la fin de chaque cycle le premier segment d'acide nucléique et le deuxième segment d'acide nucléique comprenant une séquence nucléotidique double brin voient la séquence nucléotidique double brin séparée pour former une séquence nucléotidique simple brin avant le début de chaque cycle.
- Procédé de la revendication 11, dans lequel la séquence nucléotidique double brin est séparée pour former une séquence nucléotidique simple brin en liant l'acide nucléique à des billes couplées à de la streptavidine et en dénaturant l'acide nucléique.
- Procédé de la revendication 1, dans lequel A, C, E et G ont une longueur entre environ 15 et environ 25 nucléotides, ou entre environ 15 et environ 20 nucléotides, ou entre environ 16 et environ 18 nucléotides, ou de 18 nucléotides.
- Procédé de la revendication 1, dans lequel A, C, E et G ont une teneur moyenne en GC allant de 55% à environ 60%, par exemple d'environ 60%.
- Procédé de la revendication 1, dans lequel B et F comprennent des bases nucléotidiques choisies dans le groupe constitué de bases ADN, de bases ARN, de bases ADN modifiées, et de bases ARN modifiées.
- Procédé de la revendication 1, dans lequel B et F ont une longueur allant d'environ 25 à environ 75 nucléotides, ou allant d'environ 30 à environ 60 nucléotides.
- Procédé de la revendication 1, dans lequel D et H ont une longueur allant d'environ 4 à environ 15 nucléotides, ou allant d'environ 5 à environ 7 nucléotides.
- Procédé de la revendication 1, dans lequel D et H ont une énergie libre d'association entre environ 6,0 kcal/mole et environ 8,0 kcal/mol, par exemple d'environ 7,5 kcal/mol.
- Procédé de la revendication 1, dans lequel A, C, E et G ont une longueur allant d'environ 18 nucléotides ; B et F ont une longueur allant d'environ 30 à environ 60 nucléotides ; et D et H ont une longueur allant d'environ 5 à environ 7 nucléotides.
- Procédé de la revendication 19, dans lequel D et H ont une énergie libre d'association d'environ 7,5 kcal/mol.
- Procédé de la revendication 20, dans lequel A, C, E et G ont une teneur moyenne en GC d'environ 60%.
- Procédé pour sélectionner au moins un aptamère en présence d'un segment de liant d'épitope, dans lequel la séquence d'aptamères se lie à un premier épitope sur une molécule cible et le segment de liant d'épitope se lie à un deuxième épitope sur la molécule cible ; le procédé comprenant le fait :(a) de mettre en contact une pluralité de segments d'acide nucléique et le segment de liant d'épitope avec la molécule cible pour former un mélange de segments d'acides nucléiques, de segments de liant d'épitope, et de molécules cibles, le segment d'acide nucléique comprenant :iii. A-B-C-D ; le segment de liant d'épitope comprenant :iv. P-Q-R ;où :A et C sont chacune des séquences différentes d'ADN ayant une longueur allant d'environ 10 à environ 30 nucléotides, A et C comprenant ensemble une séquence pour amorcer une amplification en chaîne par polymérase afin d'amplifier la séquence d'aptamères ;B est une séquence nucléotidique aléatoire simple brin ayant une longueur allant d'environ 20 à environ 110 nucléotides qui contient des séquences spécifiques se liant à un premier épitope de la molécule cible ;D et R sont une paire de séquences nucléotidiques complémentaires ayant une longueur allant d'environ 2 à environ 20 nucléotides, où D et R ont une énergie libre d'association entre environ 5,5 kcal/mole et environ 8,0 kcal/mol à une température entre environ 21°C et environ 40°C et à une concentration en sel allant d'environ 1 mM à environ 100 mM ;P est un liant d'épitope choisi dans le groupe constitué d'un aptamère, d'un anticorps, d'un fragment d'anticorps, d'une séquence d'ADN double brin, d'un ligand, d'un fragment de ligand, d'un récepteur, d'un fragment de récepteur, d'un polypeptide, d'un peptide, d'une coenzyme, d'un corégulateur, d'une molécule allostérique, et d'un ion ;Q est un lieur flexible ; et(b) d'isoler du mélange un complexe comprenant la molécule cible ayant le segment d'acide nucléique lié au premier épitope et le segment de liant d'épitope lié au deuxième épitope ; et(c) de purifier le segment d'acide nucléique du complexe.
- Procédé de la revendication 22 dans lequel le liant d'épitope est un anticorps choisi dans le groupe constitué d'anticorps polyclonaux, d'ascites, de fragments Fab, de fragments Fab', d'anticorps monoclonaux et d'anticorps humanisés.
- Procédé de la revendication 23 dans lequel le liant d'épitope comprend un anticorps monoclonal.
- Procédé de la revendication 22 dans lequel Q a une longueur allant de 0 à environ 500 angströms, ou allant d'environ 50 à environ 250 angströms.
- Procédé de la revendication 22 dans lequel Q est constitué d'un polymère de lieurs chimiques bifonctionnels.
- Procédé de la revendication 22 dans lequel Q est constitué d'un Espaceur PEG 18.
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US68947005P | 2005-06-10 | 2005-06-10 | |
| US689470P | 2005-06-10 | ||
| PCT/US2006/018845 WO2006135527A2 (fr) | 2005-06-10 | 2006-05-16 | Procedes de selection d'aptameres |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| HK1119179A1 HK1119179A1 (en) | 2009-02-27 |
| HK1119179B true HK1119179B (en) | 2012-11-23 |
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