HK1119179B - Methods for the selection of aptamers - Google Patents

Claims (27)

1. Verfahren zur gleichzeitigen Auswahl von mindestens zwei Aptameren, die eine erste Aptamersequenz und eine zweite Aptamersequenz umfassen, wobei die erste Aptamersequenz an ein erstes Epitop an einem Zielmolekül bindet und die zweite Aptamersequenz an ein zweites Epitop am Zielmolekül bindet; wobei das Verfahren Folgendes umfasst:

   a) das Kontaktieren einer Mehrzahl von Paaren von Nucleinsäurekonstrukten, die ein erstes Nucleinsäurekonstrukt und ein zweites Nucleinsäurekonstrukt umfassen, mit dem Zielmolekül unter Bildung eines Gemisches von Nucleinsäurekonstrukten und Zielmolekülen, wobei das erste Nucleinsäurekonstrukt Folgendes umfasst:

   i. A-B-C-D; und das zweite Nucleinsäurekonstrukt Folgendes umfasst:

   ii. E-F-G-H;

   wobei:

   A, C, E und G jeweils verschiedene DNA-Sequenzen mit einer Länge von etwa 10 bis etwa 30 Nucleotiden bedeuten, A und C zusammen eine Sequenz zur Auslösung einer Polymerase-Kettenreaktion zur Amplifikation einer ersten Aptamersequenz umfassen und E und G zusammen eine Sequenz zur Auslösung einer Polymerase-Kettenreaktion zur Amplifikation einer zweiten Aptamersequenz umfassen;

   B eine einzelsträngige Nucleotid-Zufallssequenz mit einer Länge von etwa 20 bis etwa 110 Nucleotiden bedeutet, die spezifische Sequenzen enthält, die an ein erstes Epitop des Zielmoleküls binden;

   D und H ein Paar von komplementären Nucleotidsequenzen mit einer Länge von etwa 2 bis etwa 20 Nucleotiden bedeuten, wobei D und H eine freie Assoziationsenergie von etwa 5,5 kcal/mol bis etwa 8,0 kcal/mol bei einer Temperatur von etwa 21 °C bis etwa 40 °C und einer Salzkonzentration von etwa 1 mM bis etwa 100 mM aufweisen; und

   F eine einzelsträngige Nucleotid-Zufallssequenz mit einer Länge von etwa 20 bis etwa 110 Nucleotiden bedeutet, die spezifische Sequenzen enthält, die an ein zweites Epitop des Zielmoleküls binden;

   b) das Isolieren eines Komplexes aus dem Gemisch, wobei der Komplex das Zielmolekül mit dem an ein erstes Epitop gebundenen ersten Nucleinsäurekonstrukt und dem an das zweite Epitop gebundenen zweiten Nucleinsäurekonstrukt umfasst; und

   c) das Reinigen des ersten Nucleinsäurekonstrukts und des zweiten Nucleinsäurekonstrukts aus dem Komplex.
2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Zielmolekül aus einer Gruppe ausgewählt wird, die aus einem Analyten, einem Prion, einem Protein, einer Nucleinsäure, einem Lipid, einem Kohlenhydrat, einem Biomolekül, einem makromolekularen Komplex, einem Pilz, einem Virus und einem mikrobiellen Organismus besteht.
3. Verfahren nach Anspruch 2, wobei es sich beim Zielmolekül um ein Protein handelt.
4. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Mehrzahl von Nucleinsäurekonstrukten mit dem Zielmolekül durch Inkubation in einem Salzpuffer mit einem pH-Bereich von etwa 6,5 bis etwa 8,5 in einem Temperaturbereich von etwa 21 °C bis etwa 40 °C kontaktiert werden.
5. Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Komplex aus dem Gemisch isoliert wird, indem man ein Verfahren anwendet, das aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Nitrocellulosefiltern, magnetischen Kügelchen und Sepharosekügelchen besteht.
6. Verfahren nach Anspruch 1, ferner umfassend das Abtrennen des ersten und zweiten Nucleinsäurekonstrukts aus dem Komplex unter Bildung eines Gemisches, das das Zielmolekül, das erste Nucleinsäurekonstrukt und das zweite Nucleinsäurekonstrukt umfasst.
7. Verfahren nach Anspruch 6, wobei das erste Nucleinsäurekonstrukt und das zweite Nucleinsäurekonstrukt vom Zielmolekül getrennt werden, indem man das Zielmolekül denaturiert oder indem man den Komplex mit einem Überschuss eines Kompetitors inkubiert.
8. Verfahren nach Anspruch 7, wobei das erste Nucleinsäurekonstrukt und das zweite Nucleinsäurekonstrukt aus dem Gemisch gereinigt werden, indem man die Nucleinsäure ausfällt.
9. Verfahren nach Anspruch 8, ferner umfassend das Amplifizieren des ersten Nucleinsäurekonstrukts und des zweiten Nucleinsäurekonstrukts durch die Polymerase-Kettenreaktion unter Bildung eines Produkts der Polymerase-Kettenreaktion.
10. Verfahren nach Anspruch 9, wobei das erste Nucleinsäurekonstrukt und das zweite Nucleinsäurekonstrukt aus dem Produkt der Polymerase-Kettenreaktion durch Agarosegel-Trennung und Reinigung der Nucleinsäure aus dem Gel gereinigt werden.
11. Verfahren nach Anspruch 9, ferner umfassend das etwa 4- bis etwa 20-malige Wiederholen der Auswahl-, Trenn-, Amplifikations- und Reinigungsstufen des Verfahrens, wobei am Ende eines jeden Zyklus beim ersten Nucleinsäurekonstrukt und zweiten Nucleinsäurekonstrukt, die die doppelsträngige Nucleotidsequenz umfassen, die doppelsträngige Nucleotidsequenz unter Bildung der einzelsträngigen Nucleotidsequenz vor Beginn eines jeden Zyklus getrennt worden ist.
12. Verfahren nach Anspruch 11, wobei die doppelsträngige Nucleotidsequenz zu einer einzelsträngigen Nucleotidsequenz aufgetrennt wird, indem man die Nucleinsäure an mit Streptavidin verknüpften Kügelchen bindet und die Nucleinsäure denaturiert.
13. Verfahren nach Anspruch 1, wobei A, C, E und G eine Länge von etwa 15 bis etwa 25 Nucleotiden oder eine Länge von etwa 15 bis etwa 20 Nucleotiden oder eine Länge von etwa 16 bis etwa 18 Nucleotiden oder eine Länge von 18 Nucleotiden aufweisen.
14. Verfahren nach Anspruch 1, wobei A, C, E und G einen durchschnittlichen GC-Gehalt von etwa 55 % bis etwa 60 % und beispielsweise von etwa 60 % aufweisen.
15. Verfahren nach Anspruch 1, wobei B und F Nucleotidbasen umfassen, die aus der Gruppe ausgewählt sind, die aus DNA-Basen, RNA-Basen, modifizierten DNA-Basen und modifizierten RNA-Basen besteht.
16. Verfahren nach Anspruch 1, wobei B und F eine Länge von etwa 25 bis etwa 75 Nucleotiden oder von etwa 30 bis etwa 60 Nucleotiden aufweisen.
17. Verfahren nach Anspruch 1, wobei D und H eine Länge von etwa 4 bis etwa 15 Nucleotiden oder eine Länge von etwa 5 bis etwa 7 Nucleotiden aufweisen.
18. Verfahren nach Anspruch 1, wobei D und H eine freie Assoziationsenergie von etwa 6,0 kcal/mol bis etwa 8,0 kcal/mol und beispielsweise von etwa 7,5 kcal/mol aufweisen.
19. Verfahren nach Anspruch 1, wobei A, C, E und G eine Länge von etwa 18 Nucleotiden aufweisen, B und F eine Länge von etwa 30 bis etwa 60 Nucleotiden aufweisen und D und H eine Länge von etwa 5 bis etwa 7 Nucleotiden aufweisen.
20. Verfahren nach Anspruch 19, wobei D und H eine freie Assoziationsenergie von etwa 7,5 kcal/mol aufweisen.
21. Verfahren nach Anspruch 20, wobei A, C, E und G einen durchschnittlichen GC-Gehalt von etwa 60 % aufweisen.
22. Verfahren zur Auswahl mindestens eines Aptameren in Gegenwart eines Epitop-Bindungsmittel-Konstrukts, wobei die Aptamersequenz an ein erstes Epitop an einem Zielmolekül bindet und das Epitop-Bindungsmittel-Konstrukt an ein zweites Epitop am Zielmolekül bindet; wobei das Verfahren Folgendes umfasst:

    a) das Kontaktieren einer Mehrzahl von Nucleinsäurekonstrukten, und des Epitop-Bindungsmittel-Konstrukts mit dem Zielmolekül unter Bildung eines Gemisches von Nucleinsäurekonstrukten, Epitop-Bindungsmittel-Konstrukten und Zielmolekülen, wobei das Nucleinsäurekonstrukt Folgendes umfasst:

    iii. A-B-C-D; und das Epitop-Bindungsmittel-Konstrukt Folgendes umfasst:

    iv. P-Q-R;

    wobei: A und C jeweils verschiedene DNA-Sequenzen mit einer Länge von etwa 10 bis etwa 30 Nucleotiden bedeuten, wobei A und C zusammen eine Sequenz zur Auslösung einer Polymerase-Kettenreaktion zur Amplifikation der Aptamersequenz umfassen; B eine einzelsträngige Nucleotid-Zufallssequenz mit einer Länge von etwa 20 bis etwa 110 Nucleotiden bedeutet, die spezifische Sequenzen enthält, die an ein erstes Epitop des Zielmoleküls binden; D und R ein Paar von komplementären Nucleotidsequenzen mit einer Länge von etwa 2 bis etwa 20 Nucleotiden bedeutet, wobei D und R eine freie Assoziationsenergie von etwa 5,5 kcal/mol bis etwa 8,0 kcal/mol bei einer Temperatur von etwa 21 °C bis etwa 40 °C und einer Salzkonzentration von etwa 1 mM bis etwa 100 mM aufweisen; P ein Epitop-Bindungsmittel bedeutet, das aus der Gruppe ausgewählt ist, die ein Aptameres, einen Antikörper, ein Antikörperfragment, eine doppelsträngige DNA-Sequenz, einen Liganden, ein Ligandenfragment, einen Rezeptor, ein Rezeptorfragment, ein Polypeptid, ein Peptid, ein Coenzym, einen Coregulator, ein allosterisches Molekül und ein Ion umfasst; Q einen flexiblen Linker bedeutet; und

    b) das Isolieren eines Komplexes aus dem Gemisch, wobei der Komplex das Zielmolekül mit dem an das erste Epitop gebundenen Nucleinsäurekonstrukt und das an das zweite Epitop gebundene Epitop-Bindungsmittel-Konstrukt umfasst; und

    c) das Reinigen des Nucleinsäurekonstrukts aus dem Komplex.
23. Verfahren nach Anspruch 22, wobei es sich beim Epitop-Bindungsmittel um einen Antikörper handelt, der aus der Gruppe ausgewählt ist, die polyklonale Antikörper, Aszites, Fab-Fragmente, Fab'-Fragmente, monoklonale Antikörper und humanisierte Antikörper umfasst.
24. Verfahren nach Anspruch 23, wobei das Epitop-Bindungsmittel einen monoklonalen Antikörper umfasst.
25. Verfahren nach Anspruch 22, wobei Q eine Länge von 0 bis etwa 500 Å oder eine Länge von etwa 50 bis etwa 250 Å aufweist.
26. Verfahren nach Anspruch 22, wobei Q aus einem Polymeren von bifunktionellen chemischen Linkern besteht.
27. Verfahren nach Anspruch 22, wobei Q aus Polyethylenglykol-Spacer 18 besteht.