HK1119065A - 用於制备包含TNFα和载体蛋白质的抗原杂络物的稳定的免疫原产品的方法 - Google Patents

Description

用于制备包含TNFα和载体蛋白质的抗原杂络物的稳定的免疫原产品的方法

技术领域

本发明涉及包含TNFα和载体蛋白质的抗原杂络物的稳定的免疫原产品，及其制备方法，所述免疫原产品用于在哺乳动物中获得体液免疫应答，产生中和TNFα的生物活性的抗体。

所述稳定的免疫原产品也可以称之为抗-TNFα免疫原产品或者也可称之为用于诱导抗-TNFα抗体的免疫原产品。

本发明还涉及包含所述稳定的免疫原产品的疫苗组合物及其制备方法，所述疫苗组合物包含TNFα和载体蛋白质的抗原杂络物。

背景技术

用于制备包含抗原杂络物的稳定的免疫原产品的通用方法，该抗原杂络物包含一种或更多的目的抗原蛋白质以及至少一种在以NEOVACS名义发表于申请号WO 2004/024189的PCT申请书中已有描述的载体蛋白质。值得注意的是，该PCT申请书公开了用TNFα作为目的抗原和KLH作为载体蛋白质制备这样的杂络物的方法。当实施制备包含TNFα和KLH的杂络物时，该现有技术的通用方法包含以下步骤：

a)获得KLH与TNFα的混合物；

b)向上述混合物中加入戊二醛，至终浓度0.026M；

c)通过实施透析除去过量的戊二醛；

d)向已透析的溶液中加入甲醛并在48小时内维持甲醛的存在；

e)向步骤d结束时获得的溶液中加入甘氨酸；以及

f)用在步骤e结束时获得的溶液进行透析。

PCT申请号WO 2004/024189中的实施例显示合成的TNFα/KLH免疫原产物是稳定的并能够提高对天然TNFα拥有良好中和活性的抗体的产量。

然而，随着时间的推移，考虑到为了满足多个卫生当局的高水平要求，包括在美国和欧洲，为了制备包含所述杂络物作为主要活性成份的合适的疫苗组合物，似乎需要更有效的杂络物。

发明详述

申请者已经发现，在PCT申请号WO 2004/024189中公开的通用方法，当应用于包含TNFα和载体蛋白质的杂络物时，导致最终的免疫原产品，为了制备的抗TNFα疫苗组合物能被全世界的多个卫生当局批准，必须改进所述产品中TNFα的减活化作用和免疫原性。申请者还发现整个免疫原产品的稳定性应该改善，特别是提高贮存期间的稳定性。

申请者现在已经发现了用于制备稳定的包含TNFα和载体蛋白质的抗原杂络物的免疫原产品的新方法，使所述产品能达至上述多种目标。

本发明的目标包括用于制备包含TNFα和载体蛋白质的抗原杂络物的稳定免疫原产品的方法。其包含步骤：

a)提供包含TNFα的溶液；

b)向包含上述步骤a)的TNFα的溶液中加入EDTA；

c)为了获得TNFα和所述载体蛋白质的混合液，向步骤b最终获得的溶液中加入载体蛋白质；

d)向步骤c结束时获得的混合液中加入戊二醛，以便TNFα分子部分共价缀合至上述载体蛋白质并获得TNFα与该载体蛋白质之间的杂络物；

e)从步骤d结束时获得的混合液中除去戊二醛，以及TNFα和该载体蛋白质的游离分子，以便获得含有TNFα与该载体蛋白质之间的纯化的杂络物的溶液；

f)向步骤e结束时获得的溶液中加入甲醛，并在长达96小时至192小时的时间内维持甲醛的存在；

g)向步骤f结束时获得的含有TNFα与该载体蛋白质之间的杂络物的溶液中加入阻断与甲醛反应的试剂；以及

h)为了得到包含上述稳定的免疫原产品的溶液，该免疫原产品包含TNFα与该载体蛋白质之间的杂络物，从步骤h)结束时获得的溶液中除去甲醛和阻断试剂。

通过实施上述方法，当与一种或多种免疫佐剂化合物联合施用于哺乳动物时，产生的稳定免疫原产品被赋予增强的诱导产生中和天然TNFα抗体的能力。

“包含TNFα和载体蛋白质的抗原杂络物的稳定的免疫原产品”，如此处所用，由诱导中和TNFα生物学活性的抗体的免疫原产品组成，该免疫原产品包含在(i)TNFα分子和(ii)载体分子之间的蛋白质相互作用，其中少于40％的TNFα分子与载体分子通过共价化学键结合。

应用上述方法制备的稳定的免疫原产品，因其在受试者中诱导抗天然TNFα的抗体，是“具有免疫原性的”，在将其注射至该受试者后，诱导产生更特异的中和TNFα生物学活性的抗体。

应用上述方法制备的免疫原产品是“稳定的”，因为该免疫原产品有自己的等电点，能与至少(i)TNFα或者(ii)载体分子的等电点相区分，并且由于所述免疫原产品在等电聚焦分析中作为蛋白质带迁移时，该蛋白质带与分别相应于(i)TNFα和(ii)载体分子的两条蛋白质带中至少一条不同。这意味着根据本发明的免疫原产品既不包含游离的未结合的TNFα分子，也不包含游离的未结合的载体蛋白质分子。

因为所述免疫原产品包含(i)抗原的TNFα和(ii)抗原的载体蛋白质分子，它们结合到一起(a)部分通过共价键(少于40％的共价键)和(b)部分通过弱的非共价键(超过60％的非共价键)，包括离子相互作用、氢键、范德华相互作用等等，应用上述方法制备的免疫原产品包含TNFα和载体蛋白质的“抗原的杂络物”或者“杂络物”。

该稳定的免疫原产品，其包含TNFα和如上所定义的载体蛋白质的抗原杂络物，可根据本发明的方法进行制备，在此也可以更简单的定义为在人或动物中用于诱导，或者其诱导产生TNFα抗体的免疫原产品；或者也可称为抗-TNFα的免疫原产品。

根据本发明由于本方法的结合步骤，最终获得的稳定的免疫原产品，比根据以上引用的公开于PCT申请号WO 2004/024189中的现有技术方法获得的包含TNFα和载体蛋白质的杂络物，具有更高的可重复性。

特别是，已发现根据本发明通过实施本方法制备的稳定的免疫原产品的免疫原活性，从一批制品到另一批，具有很高的可重复性。

正如此处的实施例所示，根据本发明通过实施本方法制备的稳定的免疫原产品，由于其ED₅₀剂量大于50ng/ml，甚至大于400ng/ml(当表示为TNFα的终浓度时)，没有在体内和体外可检测到的TNFα生物学活性。

并且，此处显示，除了诱导高滴度的抗TNFα抗体外，根据本发明通过实施本方法制备的稳定的免疫原产品，诱导产生高中和能力的抗TNFα抗体，其具有NC₅₀超过1/1000的中和能力。

此外，根据本发明通过实施本方法制备的稳定的免疫原产品也已显示能够安全地给哺乳动物施用，由于这些产品不诱导任何不良副作用，并且具体而言，即使当投药量比单人治疗量(SHTD)高4000倍时亦无炎症或任何器官例如心脏、肺、肝和脾的改变。

此外，根据本发明通过实施本方法制备的稳定的免疫原产品诱导产生大量的抗TNFα的中和抗体，特别是IgG同种型，在恒河猴(Rhesusmacaque)中，其显示这些稳定的免疫原产品能够打破对内源所产生的蛋白质的免疫耐受性，并且诱导有效的疫苗接种，导致TNFα的中和，在涉及TNFα的所有病理情形中其疫苗能够预防TNFα过量所产生的毒性效应。

根据本发明通过实施本方法制备的稳定的免疫原产品还显示能够有效接种哺乳动物防止TNFα诱导的关节炎。更进一步，其显示出当单独使用时这些稳定的免疫原产品能够预防和/或治疗TNFα诱导的关节炎炎性滑膜炎和关节损伤，而无需用任何另外的抗关节炎活性成份如氨甲喋呤辅助预防或根治。

按照本发明的方法制备的稳定的免疫原产品还显示出能够预防和/或治疗TNFα过量生成所导致的致命性休克。

因此，按照本发明制备的稳定的免疫原产品诱导抗TNFα的自身免疫保护作用，防止TNFα依赖的急性和慢性的病理症状，没有可检测到的副作用。

不希望被任何具体的理论所束缚，申请者相信步骤a)至h)的特殊组合让TNFα初始产物的空间构像得以保留，同时促进TNFα的主要抗原表位暴露于溶剂中，当将稳定的免疫原产品给哺乳动物施用时，使得TNFα抗原有效地递呈至免疫活性细胞。

不希望被任何具体的理论所束缚，申请者也相信，与在PCT申请号WO 2004/024189中公开的方法比较，当应用TNFα和KLH时，步骤a)至h)的特定组合让最终免疫原产物具有更好的结构的和化学的稳定性。通过该方法获得的最终的稳定免疫原产品的这些特定性质，应能使制备长期贮存也十分稳定的疫苗组合物成为可能。

而且，已经发现本发明的方法使得制备的稳定的免疫原终产品无残留的TNFα初始产物的生物学活性。值得注意的是，已经发现在本发明中TNFα初始产物的ED₅₀是大约10pg/ml。通过本发明的方法获得的稳定的免疫原终产品具有的ED₅₀值高于50ng/ml，并且甚至在大多数情况下高于400ng/ml。同时，稳定的免疫原终产品具有高免疫原性。

此外，已经显示出按照本发明的方法获得的免疫原产品保留了天然TNFα的主要构像，因为尽管该免疫原产品的生物学活性丧失，但仍然与TNFα的受体R1和R2结合。

在步骤a)中，构成TNFα的天然TNFα选自小鼠TNFα、大鼠TNFα、兔TNFα和人TNFα组成的组。优选TNFα由人TNFα组成。

根据本发明的方法，在某些实施方案中步骤b)包含以下步骤：

b1)向包含步骤a)的TNFα的所述溶液中加入EDTA；以及

b2)向步骤b1)结束时获得的溶液中加入DMSO。

已经发现根据本发明在步骤b2)中加入DMSO增强该稳定的免疫原终产品的免疫原性。

在本方法的某些实施方案中，步骤d)包含以下步骤：

d1)向在步骤c)结束时获得的混合液中加入戊二醛，使TNFα分子与所述载体蛋白质共价缀合并获得TNFα与该载体蛋白质之间的杂络物；以及

d2)向在步骤d1)结束时获得的TNFα与该载体蛋白质之间的杂络物中加入EDTA。

因此，在步骤d1)结束时获得的溶液，其包含的产品含有(i)部分通过共价键和(ii)部分通过非共价键与载体分子结合的TNFα分子。

根据本发明的方法包含步骤h)为了从在步骤g)结束时获得的溶液中除去甲醛和阻断试剂，以获得纯化的稳定的免疫原产品，该产品包含TNFα和所述载体蛋白质之间的杂络物。

在步骤h)结束时，获得的稳定的免疫原溶液，呈无色半透明状态，实际上没有明显的颗粒物质。

在某些实施方案中，该方法可能还包含另外的步骤i)冷冻在步骤h)结束时获得的溶液。

在某些实施方案中，该方法可能还包含另外的步骤i)冻干在步骤h)结束时获得的溶液，以便获得能在使用前长期保存的白色粉末。

在步骤a)的优选实施方案中，TNFα浓度范围从0.1mg/ml至50mg/ml，以及甚至更优选从0.5mg/ml至10mg/ml的范围。

在步骤b)的优选实施方案中，EDTA的终浓度范围从1mM至500mM，以及最优选从1mM至10mM。

最好将EDTA作为pH范围从7至8.5，更优选从7.5至8.1的缓冲溶液加入。

在步骤b2)的优选实施方案中，DMSO终浓度范围从0.5％v/v(体积比)至20％v/v，最优选从5％v/v至20％v/v。

最好步骤b2)进行的时间长度为从10分钟至50分钟，更优选从20分钟至40分钟。

在步骤c)的优选的实施方案中，TNFα与所述载体蛋白质的摩尔比范围是从5∶1至100∶1，并且更优选的范围是20∶1至80∶1。在步骤c)最优选的实施方案中，TNFα与所述载体蛋白质的摩尔比的范围是从30∶1至70∶1，或者从40∶1至60∶1。

在步骤d)优选的实施方案中，戊二醛的终浓度范围从0.05％w/w(重量比)至0.5％w/w。戊二醛的终浓度范围从0.02M至0.03M是适当的，最优选的戊二醛终浓度为0.026M。

最好步骤d2)进行的时间长度为从30分钟至60分钟，更优选从40分钟至50分钟。

在步骤d2)的优选的实施方案中，EDTA的终浓度范围从1mM至10mM。

在步骤e)的优选的实施方案中，通过实施透析、应用渗滤的超滤或者实施正切流动过滤(TFF)除去戊二醛。

当进行透析时，优选使用截留值为6-8kDa的透析膜。

透析步骤优选包括三步，包括(i)使用工作缓冲液(100mM磷酸盐，150mM NaCl pH7.8，EDTA 5mM)进行的前两步以及(ii)使用PBS进行的最后一步。

通常，透析步骤用常规的缓冲溶液，例如磷酸盐缓冲液(PBS)实施，使用相对于包含TNFα与该载体蛋白质之间的杂络物(其中TNFα部分与所用载体蛋白质共价结合)的溶液200至400倍的体积的缓冲液。

当实施应用渗滤的超滤时，优选使用截留值为10000kDa的滤膜。发现TNFα与该载体蛋白质之间的杂络物留在超滤截留物中是可以理解的。通常，用于渗滤的液体由缓冲液，例如磷酸盐缓冲液(PBS)组成。一般用等体积的缓冲液进行三次渗滤。

在步骤f)优选的实施方案中，甲醛的终浓度范围从1％w/w至10％w/w，并且甚至更优选的范围是从2％w/w至5％w/w。

在步骤f)中，在96小时至192小时的时间范围内维持甲醛的存在。

已经发现，当与根据本发明方法的优选实施方案获得的稳定的免疫原化合物比较，根据本发明维持甲醛与杂络物共存的时间少于96小时将导致随着时间推移最终的免疫原化合物的稳定性显著降低。

另一方面，已经发现根据本发明维持甲醛与杂络物共存的时间超过192小时将导致最终免疫原产物拥有高稳定性，但诱导对天然TNFα具有高中和活性的抗体的能力显著降低。

更优选的是，在步骤f)中维持甲醛存在的时间从120小时至168小时。

最优选的是，在步骤f)中维持甲醛存在的时间从130小时至150小时。

步骤f)在30℃至42℃的温度范围内进行较为有利，更优选的温度范围是从35℃至39℃。

在步骤g)中阻断蛋白质分子与甲醛反应的试剂可以由包含至少一个氨基的任何适当的化合物组成，其将终止该蛋白质分子与甲醛的化学反应。

在某些优选的实施方案中，所述阻断试剂由甘氨酸组成。

在步骤g)优选的实施方案中，甘氨酸终浓度范围是从0.01M至10M，以及甚至更优选的范围是从0.05M至2M。

在步骤g)的某些其它的优选实施方案中，所述阻断试剂由赖氨酸组成。

在步骤g)优选的实施方案中，赖氨酸终浓度范围是从0.01M至10M，优选从0.05M至2M，以及最优选从0.05M至0.5M。

在优选的实施方案中，使该蛋白质分子与赖氨酸在从1小时至10天的孵育时间内发生接触，并且最优选从5天至10天。

与赖氨酸孵育的时间超过3天，并且最优选至少5天导致终产物化学结构的最佳不可逆性并促成其良好的免疫原性和稳定性。

当实施步骤h)时，溶液的pH值调节到6.8至7.8的范围内较为有利，更优选的范围是从7.0至7.6，例如通过使用碱，如NaOH。

在步骤h)的优选实施方案中，通过透析、应用渗滤的超滤或者正切流动过滤(TFF)除去甲醛和阻断试剂。

在步骤h)中使用的透析、应用渗滤的超滤或者正切流动过滤(TFF)的条件通常与上述那些先前为步骤e)所确定的条件一样，或者与此处实施例中公开的条件相一致。

术语“载体蛋白质”或“载体蛋白质分子”是根据其对本领域技术人员而言的常规含义在此使用的，即一种蛋白质，当其与抗原分子，包括半抗原分子偶联时能够诱导宿主生物，特别是在哺乳动物包括人中产生抗该抗原分子的免疫应答。正如此处所用，所述免疫应答包括产生直接抗该抗原分子的抗体。

根据本发明的方法，对本领域技术人员而言已知的广泛而多样的载体蛋白质可以在步骤c)中使用。该载体蛋白质应该承载足够的辅助T-细胞表位以便活化T-辅助细胞和B细胞，并诱导这些细胞释放足够的IL-1和IL-2来诱导B细胞克隆扩增，该克隆将产生中和抗-TNFα抗体。

在本发明稳定的免疫原产品中包括的“载体蛋白质分子”，意指至少15个氨基酸长度的任何蛋白质或肽(无论其氨基酸序列)，并且当其与TNFα分子部分共价结合以形成蛋白质杂络物时组成了本发明的免疫原产品，使得大量的TNFα分子被递呈至B淋巴细胞。

载体蛋白质分子首选由一种蛋白质或一种至少15个氨基酸长度的肽组成，或者也可是此种肽的寡聚物，包括能够活化宿主生物的辅助T淋巴细胞(“T辅助细胞”)从而产生细胞因子的一种或多种辅助T表位(“辅助细胞”)，所述细胞因子包括白细胞介素2，这样的细胞因子，反过来，活化并诱导B淋巴细胞增殖，其成熟后将产生抗TNFα的抗体。

载体蛋白质分子可能还在天然蛋白质的同型寡聚物或同型多聚物中存在，从其中衍生，同样也可以从天然蛋白质的肽段的同型寡聚物或同聚多聚物中衍生。目的抗原蛋白质可能也存在于异型寡聚物或异型多聚物中，其包含几种不同肽段的组合，这些肽段最初包含在天然蛋白质中，其由此衍生而来。

当实施根据本发明的方法时，可用到的载体蛋白质的实例包括白喉破伤风类毒素(分别包括DT，DT CRM197，其它DT突变体，例如位置Glu-148等等[参见，如美国专利申请号4,709,017、WO93/25210、WO95/33481等等]以及TT(和TT片断C))、匙孔槭血蓝素(KLH)、源于脑膜炎奈瑟氏球菌(N.meningitidis)的OMPC和纯化的结核菌素蛋白质衍生物(PDD)。

载体的功能是提供细胞因子帮助以增强对TNFα的免疫应答。可用于本发明的不完全的载体名单包括：匙孔槭血蓝素(KLH)、血清白蛋白质例如牛血清白蛋白(BSA)、灭活的细菌毒素例如破伤风或白喉毒素(TT和DT)，或者它的重组片断(例如，TT的片断C的结构域1，或者DT的易位结构域)，或者纯化的结核菌素蛋白质衍生物(PDD)。

在本方法的实施方案中，载体是来源于流感嗜血杆菌的蛋白D(EP 0594 610 B1)。蛋白D是来源于流感嗜血杆菌的IgD结合蛋白并且已经被Forsgren申请专利(WO 91/18926，已授予的专利EP 0 594 610 B1)。在某些情况下，例如在重组的免疫原表达系统中可能希望使用蛋白质D的片断，例如蛋白质D 1/3.sup.rd(包含蛋白D的N末端100-110个氨基酸(WO99/10375；WO 00/50077))。

因此，在本方法的优选实施方案中，所述载体蛋白选自由白喉毒素(DT)及其突变体、破伤风毒素(TT)、匙孔槭血蓝素(KLH)，以及纯化的结核菌素蛋白质衍生物(PDD)、牛血清白蛋白(BSA)和来源于流感嗜血杆菌的蛋白质D所组成的组。

最优选的是，该载体蛋白由匙孔槭血蓝素(KLH)组成。

本发明还涉及制备疫苗组合物的方法，其包含如下步骤：

a)通过上述方法制备稳定的免疫原产品，其包含TNFα的抗原杂络物；以及

b)用一种或更多的免疫佐剂与所述稳定的免疫原产品混合，所述免疫原产品包含在步骤a)制备的TNFα的抗原杂络物。

如此处的例子所示，该稳定的免疫原产品，在此也可以被称为抗-TNFα免疫原产品，其由根据本发明的方法获得的终产物组成，拥有特异的物理化学和生物学的特性。

大体上，根据本发明抗-TNFα免疫原产品具有从50kDa到8000kDa(8MDa)的分子量范围，其中占总蛋白质量约30％的蛋白质的分子量低于1000kDa(1MDa)。

而且，根据本发明的抗-TNFα免疫原产品显示的TNFα与所述载体蛋白的摩尔比范围是从40∶1至60∶1。

此外，根据本发明的抗-TNFα免疫原产品，当在变性条件下孵育时，其中的非共价键被除去，如在含SDS的缓冲液中，产生超过一种蛋白质的产物，表明那里所包含的TNFα分子和载体蛋白分子至少部分通过非共价结合，例如弱键(包括离子相互作用、氢键和范德华键)结合到一起。

而且，已经发现，根据本发明在抗-TNFα免疫原产品中，TNFα分子和载体蛋白分子之间的共价键总是表现出少于这些分子之间总键数的40％，因为在所述抗-TNFα免疫原产品中总有超过其含量60％的TNFα分子作为在变性条件下未与载体蛋白结合的分子而被释放。

正如此处的例子所示，包括实施例8，根据本发明的抗-TNFα免疫原产品包括至少如下的蛋白质种类：

-共价结合载体蛋白分子的TNFα分子；以及

-通过非共价键结合的分子，包括：

-TNFα分子的单体；

-TNFα分子的二聚体；

-TNFα分子的三聚体；

-TNFα分子的二聚体和/或三聚体的聚合物；

-载体蛋白分子的单体；以及

-载体蛋白分子的聚合物。

重要的是，根据本发明的抗-TNFα免疫原产品诱导产生抗-TNFα抗体，其具有的TNFα中和能力(NC₅₀)超过1/1000。

TNFα中和能力由中和TNFα细胞毒活性的50％的血清稀释度构成。本领域的专业技术人员采用在实施例中公开的和在本说明书中进一步细化的常规技术，对根据本发明的抗-TNFα免疫原产品的生物学特性，很容易进行直接和可靠地评估。

本发明的抗-TNFα免疫原产品的NC₅₀值明显不同于已发现的根据先前PCT申请号WO 2004/024189中公开的方法制备的稳定的免疫原产品的NC₅₀值。

特定的抗-TNFα免疫原产品(其中载体蛋白由KLH构成)的NC₅₀值之间的比较详见于此处的实施例中，特别是在表3中。

根据本发明的TNFα-KLH免疫原产品由一批被称为“K7”的产品组成，然而按照在先前的PCT申请号WO 2004/024189中公开的方法制备的相应的稳定的免疫原产品由一批被称为“K10”的产品组成，如在表3中所见。

如表3所示，按照先前在PCT申请号WO 2004/024189中公开的方法制备稳定的免疫原产品，发现其NC₅₀值为1/700。根据本发明的抗-TNFα的免疫原产品的NC₅₀值为1/1200，因此大约为先前的现有产品NC₅₀值的一半。

通过根据本发明的方法的具体特性的组合，其包括在步骤b)中使用EDTA，以及在步骤f)中从96小时至192小时维持甲醛的存在，为根据本发明的抗-TNFα免疫原产品的终产物提供了更高的TNFα中和能力。

具体而言，如此处表3所示，在步骤f)中从96小时至192小时维持甲醛的存在是获得具有最佳低NC₅₀值的抗-TNFα免疫原终产品的决定性因素。

另外，如此处表3所示，在步骤f)从96小时至192小时维持甲醛的存在同样可获得TNFα的细胞毒活性几乎一直被完全阻断的抗-TNFα免疫原终产品，其ED₅₀(有效剂量₅₀)值大于50ng/ml，优选大于400ng/ml，以及有时至少达10pg/ml。

对根据本发明的抗-TNFα免疫原产品的TNFα中和能力NC₅₀值的评估被详细公布于实施例3中并摘要详述如下。

本领域的技术人员可以直接和可靠地测定抗-TNFα免疫原产品的TNFα中和能力(NC₅₀)值的一般方法包括以下步骤：

a)用待检验的抗-TNFα免疫原产品与完全弗氏佐剂(CFA)的混合物通过肌肉内途径施用于小鼠；

b)在步骤a)后第21天，用待检验的抗-TNFα免疫原产品与不完全弗氏佐剂(IFA)的混合物通过肌肉内途径施用于同样的小鼠；

c)在步骤a)后第28天，从在上述步骤a)和b)处理过的每只小鼠采集血液样品。

d)测定在步骤c)收集的血液样品的血清的哪个稀释度抑制标准量的TNFα50％的细胞毒活性。

为了实施上述NC₅₀值评估方法，应用L929细胞系根据常规细胞毒性试验测定TNFα的细胞毒活性。在L929细胞培养液中优选TNFα的标准量是终浓度20ng/ml。

如在此处实施例中，特别是在此处的表3中所公开的，该ED₅₀值由根据本发明的抗-TNFα免疫原产品的终浓度构成，其在常规的L929细胞细胞毒性试验中诱导50％的细胞毒性。

已经发现根据本发明的抗-TNFα免疫原产品区别于在PCT申请号WO 2004/024189中公开的稳定的免疫原产品的另一个特性由ED₅₀构成，其大于50ng/ml，甚至大于400ng/ml，并且有时达10pg/ml，而发现现有技术产品的ED₅₀大约为15ng/ml。

不希望被任何特定的理论所束缚，申请者相信根据本发明的方法获得的抗TNF免疫原产品具有更好的生物学特性，其包括TNFα活性的缺乏以及高免疫原性，表明根据本发明的抗TNF免疫原产品结构上不同于在PCT申请号WO2004/024189中公开的稳定的免疫原产品，虽然可能不容易检测到特异的结构改变。

本发明还涉及稳定的免疫原产品，其包含TNFα的抗原和载体蛋白的杂络物，所述产品具有一种或多种下列技术特点：

(i)其包含(1)TNFα分子和(2)载体蛋白分子，(a)通过少于40％的共价键和(b)通过超过60％的非共价键结合在一起；

(ii)其展示的TNFα与所述载体蛋白的摩尔比范围从40∶1至60∶1；

(iii)其诱导产生具有TNFα中和能力(NC₅₀)小于1/1000的抗-TNFα抗体；以及

(iV)其具有在L929细胞毒性试验中大于50ng/ml，和甚至大于400ng/ml的ED₅₀值。

(V)其拥有从50kDa至8000kDa(8M Da)的分子量范围，占总蛋白质量约30％的载体蛋白的分子量低于1000kDa(1MDa)。

明显的，本发明涉及的抗-TNFα免疫原产品具有上述(i)至(iv)的特点。

在某些实施例中，载体蛋白由KLH组成。

本领域人员容易检测在本发明的免疫原产品中彼此之间通过共价键连接的目的TNFα蛋白质的百分比和载体蛋白分子的百分比。

例如，测定在本发明的免疫原产品中通过共价键连接至载体蛋白分子的TNFα分子的百分比，可以通过下列步骤完成：

(i)将溶液中的该免疫原产品提交至变性和还原的条件；

(ii)用在步骤(ii)结束时获得的产物进行大小排阻色谱，其间分子量逐渐降低的多种蛋白质组分从大小排阻色谱载体连续洗脱下来；

(iii)在包含最高分子量蛋白质组分的洗脱液部分中，测定通过共价键连接至载体分子的TNFα分子的数量；

(iv)将在步骤(iii)中测定的TNFα数量与在起始的免疫原产品中最初所包含的TNFα总量进行比较。

在用于测定上述共价键百分比的方法的步骤(i)中，在变性和还原条件下孵育一定量(按摩尔或重量数)的本发明的免疫原产品，导致彼此之间不是通过共价键连接的多种蛋白质组分之间的弱键解离。

在优选的变性条件中有尿素存在，例如，其终浓度为8M；或者有SDS存在，例如，在包含该免疫原产品的溶液的总重量中，其终浓度为1％。在优选的还原条件中有β-巯基乙醇存在，例如包含该免疫原产品的溶液的总体积的5％的终浓度。

在用于测定彼此之间通过共价键连接的TNFα分子和载体蛋白质分子的百分比的方法的步骤(ii)中，本领域的技术人员根据其技术常识选择大小排阻色谱载体。例如，本领域技术人员可以利用如Pharmacia公司以Superdex 75^TM、Superdex 200^TM和Superdex 400^TM商标上市的色谱载体。

在步骤(ii)中，相应于共价连接到TNFα分子的载体分子的该分子级分，在包含游离形式的目的抗原的洗脱液部分之前首先被洗脱。以游离的形式被洗脱的TNFα的量相当于在起始免疫原产品中非共价连接至载体分子的目的抗原级分。在高分子量蛋白质级分对共价连接到载体蛋白质分子的TNFα的量进行测定，例如，在免疫酶试验中、在放射免疫学试验或者免疫荧光试验中，直接或者间接地(“夹心法”)，用对TNFα特异的并且与载体蛋白质分子无任何免疫交叉反应的抗体进行测定。

在步骤(iii)中，如上所述测定的与载体蛋白质分子共价连接的TNFα的量，与给定量(按摩尔或重量数)的起始免疫产品中所包含的TNFα的初始量进行比较，并以此计算TNFα(其在本发明的免疫原产品中共价连接到载体蛋白质分子上)的百分比。

本领域的技术人员可以容易地利用包括以下步骤的次选方法，对在本发明的免疫原产品中彼此之间通过共价键连接的载体蛋白质分子的百分含量和TNFα的百分含量进行检测。

a)固定于抗该载体蛋白质的特异抗体的支持物上；

b)让被固定化于步骤a)中的支持物上的抗载体蛋白质的抗体，与包含该载体蛋白质和TNFα的、已知分子数量的待测免疫原产品作用；

c)借助包含一种或多种蛋白质变性剂的缓冲溶液，除去在步骤a)中未连接至固定化的抗-载体蛋白质抗体的免疫原产品的分子。

d)d1)使在步骤c)中在固定化的抗-载体蛋白质抗体和免疫原产品的分子之间形成的(i)免疫原复合物与(ii)特异的抗载体蛋白质的抗体接触；

d2)与步骤d1)分开进行，使在步骤c)中在固定化的抗-载体蛋白质抗体和免疫原产品的分子之间形成的免疫原复合物与(ii)特异的抗TNFα的抗体接触；

e)e1)对在步骤d1)中所加入的已经连接至载体蛋白质的抗体进行定量；

e2)对在步骤d2)中所加入的已经连接至TNFα的抗体进行定量；

f)计算以下两项之间比率：

(i)在步骤e1)中测定的已结合的抗-载体蛋白质抗体的数量；以及

(ii)在步骤e2)中测定的已结合的抗-TNFα抗体的数量。

该比例存在于在起始的免疫原产品中，彼此之间通过共价键结合的载体蛋白质分子和TNFα分子的比例。

在上述方法的步骤c)中，使用包含一种或多种蛋白质变性剂的洗脱水溶液导致与抗-载体蛋白质抗体结合的免疫原产品变性，使得与载体蛋白质分子没有共价结合的TNFα分子释放到洗脱溶液中。因此，在本方法的步骤d2)中，只有与载体蛋白质共价结合的TNFα分子被定量。

在用于步骤c)的变性缓冲液中优选包含表面活性剂，例如Tween20，终浓度为0.1％v/v。

在步骤d1)和d2)中，结合的抗体量优选分别通过将在上述每一步骤的结束所形成的抗原-抗体复合物与可检测的分子标记的新抗体孵育进行测定。

(i)在步骤d1)中，新抗体直接抗抗-载体蛋白质抗体并且用可检测的分子标记；

(ii)在步骤d2)中，新抗体直接抗抗-TNFα抗体并且用可检测的分子标记。

放射性分子、荧光分子或者酶，这些可检测的分子是无差别的。作为酶，过氧化物酶可能更常用到，在用邻苯二胺(POD)底物孵育之后通过比色法，显示其存在。

以上提及的方法的详细方案在实施例中进行描述。

通过图解说明，根据本发明，应用上述第一或者第二种定量方法已显示：在包含KLH载体分子和人TNFα分子之间的杂络物的免疫原产物中，少于40％的TNFα分子是与KLH载体蛋白质分子共价结合的。

为了制备本发明的免疫原的或疫苗的组合物，将根据本发明的方法获得的稳定的免疫原产品调节至适当的浓度，任选与合适的疫苗佐剂混合并包装备用。

本发明还涉及免疫原组合物，其包含(i)稳定的免疫原产品，该产品包含TNFα和用此处公开的方法制备的载体蛋白质的抗原杂络物，或者(ii)包含TNFα和上述载体蛋白质的抗原杂络物与一种或多种药物可接受的赋形剂组合的稳定的免疫原产品。

本发明还涉及疫苗组合物，其包含(i)稳定的免疫原产品，该产品包含TNFα和用此处公开的方法制备的载体蛋白质的抗原杂络物，或者(ii)包含TNFα和上述载体蛋白质的抗原杂络物与一种或多种免疫佐剂结合的稳定的免疫原产品。

正如此处所用，术语“佐剂”是指其通常含义，即任何与之混合增强对抗原的免疫应答的物质。在本发明中有用的佐剂包括，但非意在限制，弗氏、矿物胶例如氢氧化铝和表面活性物质例如溶血卵磷脂、聚醚多元醇、多聚阴离子、肽、油乳胶、匙孔槭血蓝素和二硝基苯酚。BCG(卡介苗)和短小棒状杆菌是潜在的有用佐剂。

任何在本领域中已知的佐剂可以用于上述疫苗组合物，包括油性佐剂例如弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂、基于霉菌酸酯的佐剂(例如，海藻糖二霉菌酸酯)、细菌的脂多糖(LPS)、肽聚糖(例如，胞壁质、粘肽或者糖蛋白质例如N-Opaca、胞壁酰二肽[MDP]，或者MDP类似物)、蛋白聚糖(例如提取自肺炎克雷伯杆菌)、链球菌制剂(例如OK432)、必思添(例如01K2)，EP 109 942、EP180564和EP231039的免疫刺激复合物、氢氧化铝、皂角甙、DEAE-葡聚糖、中性油(例如miglyol)、植物油(例如arachid油)、脂质体、Pluronic.RTM.多元醇、Ribi佐剂系统(参见，例如GB-A-2 189 141)，或者白介素，特别是那些刺激细胞介导免疫的物质。可替代的佐剂由细菌属放线菌目的Amycolata的抽提物组成，已经在美国专利第4,877,612号述及。此外，所有的佐剂混合物皆可商购。所用佐剂一定程度上视受体生物而定。所施用佐剂的量将视动物的类型和大小而定。最佳剂量可以用常规方法容易的测定。

合适的佐剂包括但不限制于表面活性剂，例如十六烷基胺(hexadecylamine)、十八胺、溶血卵磷脂、溴化二甲基双十八烷基铵、N，N-双十八烷基-N’-N-甲叉(2-羟乙基-丙烷二胺)、甲氧基十六烷基-甘油和普卢兰尼克多元醇；polanions，例如吡喃、硫酸葡聚糖、多聚免疫复合物、聚丙烯酸、聚羧乙烯、肽，例如胞壁酰二肽、MPL、aimethylglycine、吞噬刺激肽、油乳胶、明矾及其混合物。其它的潜在佐剂包括大肠杆菌(E.coli)的B肽亚基、霍乱毒素的不耐热毒素。McGhee，J.R.，等人.″On vaccinedevelopment，″Sem.Hematol.，30：3-15(1993)。

由于其能够提高对免疫原的抗体滴度，皂角甙的佐剂特性已经久为人知。如此处所用，术语“皂角甙”是指一组植物来源的表面活性苷类，由与甾类或者三萜类结构的疏水区相连接的亲水区(通常几个糖链)组成。虽然皂角甙可从不同来源获得，具有有用的佐剂活性的皂角甙已经从南美皂树(Quillaja)肥皂草属(Molina)得到。从这些来源得到的皂角甙被用于分离得到“均一的”用“Quil A”表示的级分(Dalsgaard，K.，(1974)，Arch.GesamteVirusforsch.44：243)。

对疫苗制剂中Quil A的兽医的和人类的用途主要关心的是剂量-位点反应性。一种避免Quil A的这种毒性的方法是使用免疫刺激复合物(以ISCOM.TM.为人熟知，免疫刺激复合物的缩写)。这主要是因为当掺入免疫刺激复合物时Quil A的反应性较小，由于它与复合物中胆固醇的缔合作用降低其与细胞膜中胆固醇的结合，因而降低它的细胞裂解效应。此外，产生类似水平的佐剂效应需要较少量的Quil A。

当其被掺入免疫刺激复合物时，Quil A皂角甙的免疫调节特性和从这些皂角甙得到的另外的益处，在多种出版物中已有描述，例如Cox和Cox，J.C.和Coulter，A.R.Advances in Adjuvant Technology and Applicationin Animal Parasite Control Utilising Biotechnology，第4章，Yong，W.K.编辑，CRC Press(1992)；Cox，J.C.和Coulter，A.R.(1997)Vaccine，15(3)：248-256；Cox，J.C.和Coulter，A.R.(1999)BioDrugs 12(6)：439-453)；Dalsgaard，(1974)(supra)；Morein等人，(1989)″Immunostimulatingcomplex(ISCOM)″，In″Vaccines：Recent Trends and Progress″.G.Gregoriadis，A.C.Allison和G.Poster(编辑).Plenium Press，New York，p.153；Australian Patent Specifications Nos.558258，589915，590904 and632067。

经典的免疫刺激复合物ISCOM是通过结合胆固醇、皂角甙、磷脂和免疫原，例如病毒包装蛋白质而形成的。免疫刺激复合物基质组合物(称为ISCOMATRIX.TM.)是同样形成的，但没有病毒蛋白质。免疫刺激复合物似乎既刺激体液的又刺激细胞的免疫应答。已经用多种病毒来源的蛋白质制成了免疫刺激复合物，包括HSV-1、CMV、EBV、乙型肝炎病毒(HBV)，狂犬病毒和流感病毒。参见例如I.G.Barr等Adv.Drug Delivery Reviews，32：247-271(1998)。已经观察到来源于传染物质的裸露DNA或者多肽当通过它们自己给药时免疫原差，包含于免疫刺激复合物内部已增强了它们的免疫原性。用免疫刺激复合物按配方制备的多种蛋白质主要在啮鼠动物模型中已经显示出诱导CTL。Ber-zofsky，(1991)，Biotechnol.Ther.2：123-135；Hsu等，(1996)，Vaccine 14：1159-1166；Lipford等，(1994)，Vaccine 12：73-80；Mowat等.，(1991)，Immunology 72：317-322；Osterhaus等，(1998)，Dev.Biol.Stand.92：49-58；Rimmelzwaan等.，(1997)，J.Gen.Virol.78(pt.4)：757-765；Sambhara等，(1998)，J.Infect.Dis.177：1266-1274；Sambhara等，(1997)，Mech.Aging Dev.96：157-169；Sjolander等，(1997)，Vaccine 15：1030-1038；Sjolander等，(1998)，J.Leukoc.Biol.64：713-723；Takahashi等，(1990)，Nature 344：873-875；Tarpey等，(1996)，Vaccine14：230-236；Trudel等，(1987)，Vaccine 10：107-112；Verschoor等，(1999)，J.Virol.73：3292-3300；Villacres-Eriksson，(1995)，Clin.Exp.Immunol.102：46-52；Zugel等，(1995)，Eur.J.Immunoll.25：451-458。

一般认为通过本发明的方法获得的稳定的免疫原产品和佐剂的结合对诱导最佳免疫应答十分重要。许多研究证实了该假设，包括用病毒小体和ISCOMs.TM.进行的研究已经完成。(Ennis，F.A.，Crux，J.，Jameson，J.，Klein，M.，Burt，D.和Thipphawong，J.1999.Virology 259：256-261.，Zurbriggen，R.，Novak-Hofer，I.，Seelig，A.和Gluck，R.(2000)，Progress inlipid Research 39：3-18.，Voeten，J.T.M.，Nieuwkoop，N.J.，Lovgren-Bengtsson，K.，Osterhaus，D.M.E.和Rimmelzwaan，G.F.2000.Euro J Imm(Submitt-ed))。通常在ISCOM.TM.和抗原之间的结合，通过在其形成过程中掺入两性抗原至ISCOM.TM.结构中已经获得成功。(Morein，B.，B.Sundquist，S.Hoglund，K.Dalsgaard，和A.Osterhaus.1984.Nature 308：457)。该掺入通过疏水相互作用完成。已经与此不同的是，最近的方法是利用螯合的和静电相互作用将抗原与预先形成的无蛋白质免疫刺激复合物(ISCOMATRIX.TM.)结合(国际专利申请号PCT/AU98/00080-WO 98/36772和PCT/AU00/00110)。

根据本发明在某些疫苗组合物的实施方案中，所述疫苗组合物包括，如药物赋形剂，一种或多种带电无机载体。带电有机载体的实例(其为适用于本发明的佐剂)包括，但不限制于，皂角甙、皂角甙复合物、称为ISCOMATRIX.TM.的皂角甙、胆固醇和脂类的免疫刺激复合物的任何一种或者多种成份(例如皂角甙组分和/或磷脂组分)、脂质体或水包油型乳剂。(ISCOMATRIX.TM.的组分和制备详细描述于国际专利申请号PCT/SE86/00480，澳大利亚专利号558258和632067，以及欧洲专利出版第0 180 564号，其公开内容在这里引入作为参考)。另外的佐剂实例包括，但不限于，那些在Cox和Coulter，1992，1997和1999的出版物中详述的例子。应当理解受试的有机载体可能是天然产生的或者可能是合成的或者是重组衍生的。

疫苗组合物可能还包括另外的佐剂以增强组合物的有效性。合适的佐剂包括，但不限于：(1)铝盐(铝)，例如氢氧化铝、磷酸铝、硫酸铝等等；(2)水包油型乳剂制剂(有或者无其它的特定的免疫刺激剂例如，胞壁酰(基)肽(见下)或者细菌细胞壁成分)，例如(a)MF59(PCT公开号WO 90/14837)，包含5％的角鲨烯、0.5％的吐温80和0.5％司盘85(任选包含不同量的胞壁酰三肽磷酯酰乙醇胺(见下)，虽为非必须)按配方制造成亚微粒，(b)SAF，包含10％的角鲨烯、0.4％吐温80、5％普卢兰尼克阻断的多聚物和thr-MDP(见下)，或者微观流体化成为亚微细粒乳剂或者涡旋震荡产生大颗粒乳剂，以及(c)Ribi.TM.佐剂系统(RAS)，(Ribi Immunochem，Hamilton，Mont.)包含2％的角鲨烯、0.2％吐温80以及一种或多种细菌细胞壁的组分，其来源于由单磷酸类脂A(MPL)、海藻糖二霉菌酸酯(TDM)和细胞壁骨架(CWS)组成的组，优选MPL+CWS(Detox.TM.)；(3)皂角甙佐剂，例如Stimulon.TM.(Cambridge Bioscience，Worcester，Mass.)；(4)完全弗氏佐剂(CFA)和不完全弗氏佐剂(IFA)；(5)细胞因子，例如白介素(例如IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-12等)、干扰素(例如γ-干扰素)、巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)等等；(6)细菌ADP-核糖基化毒素的去毒的突变体例如霍乱毒素(CT)、百日咳毒素(PT)或者大肠杆菌(E.coli)不耐热毒素(LT)，特别是LT-K63、LT-R72、CT-S109、PT-K9/G129；参见，如WO93/13302和WO92/19265；(7)其它作为免疫刺激剂的物质以增强组合物的功效；以及(8)如国际专利申请号PCT/US99/17308所描述的吸附了大分子的微粒。优选铝和MF59。

如上所述，适合的胞壁酰肽包括，但不限于，N-乙酰-胞壁酰-L-苏氨酰-D-异谷氨酰胺(thr-MDP)、N-乙酰-normauramyl-L-丙氨酰-D-异谷氨酰胺(nor-MDP)、N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酰-D-异谷氨酰胺酰基-L-丙氨酸-2-(1’-2’-二软脂酰-s-正-甘油-3-羟基磷酰氧基)-氨基乙烷(MTP-PE)等。

根据本发明用于诱导粘膜或者抗免疫原化合物的全身应答的另外的佐剂可以是那些在Vogel等人的书中所描述的化合物(Vogel F.R.，Powell M.F.和Alving C.R.，《A compendium of vaccine adjuvants and excipients》；第2版；Vogel F.R.和Powell MF，1995，《A summary compendium of vaccineadjuvants and excipients.In：Powell MF，Newman MJ编辑，《Vaccinedesign：the subunit and adjuvant approach》.New York：Plenumpublishing，1995：141-228)))。

一般地，根据本发明可能包含于疫苗组合物中的佐剂包括，但不限于：

(i)凝胶型佐剂，例如氢氧化铝或磷酸铝(Glenny AT等人，1926；JPathol Bacteriol；第29卷：38-45；Gupta RK和Siber GR，1994；Biologicals；第22卷：53-63)；

(ii)微生物的佐剂，例如：

-DNA CpG基序(Chu RS等人，199；J Exp Med；第186卷：1623-1631)；单磷酰脂质A(Schneerson R等人，1991；J Immunol；第147卷：2136-2140)；霍乱毒素(Holmgren J等人，1993；Vaccine；第11卷：1179-1184；Okahashi N等人，1996；Infect Immun；第64卷：1516-1525)；

-大肠杆菌不耐热毒素(Lycke N等人，1992；Eur J Immunol；第22卷：2277-2281；de Haan L等人，1996；Vaccine；第14卷：260-266；Chong C等人，1998.Vaccine；第16卷：732-740)；

-百日咳毒素(Roberts M等人，1995；Infect Immun；第63卷：2100-2108；Mu HH和Sewell WA，1994；Immunology；第83卷：639-645)；

-胞壁酰二肽(Ellouz F等人；1974；Biochem Biophys Res Commun；第59卷：1317-1325)；Cohen LY等人，1996；Cell Immunol；第169卷：75-84)；

(iii)油乳剂和基于乳化剂的佐剂，例如：

-弗氏不完全佐剂(Dhiman N等人，1997；Med Microbiol Immunol(Berlin)；第186卷：45-51；Putkonen P等人，1994；J Med Primatol；第23卷：89-94)；

-MF59(Dupuis M等人，1998；Cell Immunol；Vol.186：18-27；KahnJO等人，1994；J infect Dis；Vol.170：1288-1291；Ott G等人，1995；Vaccine.Vol.13：1557-1562)；

-SAF(Allison AC；1998；Dev Biol Stand；Vol.92：3-11；Gupta RK等人，1993；Vaccine；Vol.11：293-306；Byars NE等人，1994；Vacine；Vol.12：200-209)；

(iv)微粒佐剂，例如：

-免疫刺激复合物(ISCOM)(Putkonen P等人，1994；J Med Primatol；Vol.23：89-94；；Gupta RK等人，1993；Vaccine；Vol.11：293-306；Sjolander A等人，1997；Cell Immunol；Vol.177：69-76)；

-脂质体(Richards RL等人，1998；Infect Immun；Vol.66：2859-2865；Fernandes I等人，1997；Mol Immunol；Vol.34：569-576)；

-生物可降解的微球体(Men Y等人，1996；Vaccine；Vol.14：1442-1450；Shahin R等人，1995；Infect Immun；Vol.63：1195-1200；

-皂角甙(QS-21)(Newman MJ等人，1992；J Immunol；Vol.148：2357-2362；Neuzil KM等人，1997；Vaccine.Vol.15：525-532)；

(v)合成佐剂，例如：

-非离子的阻断共聚物(Hunter RL等人，1994；AIDS Res HumRetroviruses；Vol.10(Supl 2)；S95-S98；Newman MJ等人，1997；MechAgeing dev；Vol.93：189-203)；

-胞壁酰肽类似物(Cohen LY等人，1996；Cell Immunol；Vol.169：75-84；Fast DJ和Vosika GJ，1997；Vaccine；Vol.15：1748-1752；BahrGM等人，1995；Int J Immunopharmacol；Vol.17：117-131)；

-聚膦腈(Payne LG等人，1998；Vaccine；Vol.16：92-98)；

-合成的多核苷酸(Johnson AG，1994；Clin Microbiol Rev；Vol.7：277-289；Harrington DG等人，1979；Infect Immun；Vol.24：160-166)；以及

(vi)细胞因子，例如：

-免疫应答性纤维结合素-γ(IFN-γ)(Odean MJ等人，1990；InfectImmun；Vol.58：427-432)；

-白细胞介素-2(Nunberg J等人，1989；Proc Natl Acad Sci USA；Vol.86：4240-4243)；

-白细胞介素-12(Luis C等人，1994；Science；Vol.263：235-237；Bliss J等人，1996；J Immunol；Vol.156：887-894；Jankovic D等人，1997，J Immunol；Vol.159：2409-2417).

本发明的另一方面因此涉及利用以上定义的疫苗组合物的稳定的免疫原产品在哺乳动物中诱导免疫应答，包括体液免疫应答，其中的抗体能中和天然细胞因子的免疫抑制剂、凋亡或促血管生成的特性。

本发明的另一目标由用于诱导抗体产生的方法组成，该抗体中和哺乳动物中天然TNFα的活性，包括的步骤为向该哺乳动物施用(i)如上所公开的疫苗组合物或(ii)将如上所述包含TNFα和载体蛋白质的抗原杂络物的稳定的免疫原产品连同一种或多种免疫佐剂一起施用。

该疫苗组合物可任意包括疫苗适用的、药物可接受的(即无菌的和无毒的)液体、半固体或者固体稀释剂，其用作制药的运载工具、赋形剂或介质。可以应用在本领域已知的任何稀释剂。可作为范例的稀释剂包括，但并非限定于，聚氧乙烯脱水山梨醇单月桂酸酯、硬脂酸镁、羟基苯甲酸甲酯和羟基苯甲酸丙酯、滑石粉、藻酸盐、淀粉、乳糖、蔗糖、右旋糖、山梨醇、甘露醇、阿拉伯胶、磷酸钙、矿物油、可可豆脂和可可油。

根据本发明疫苗组合物可能还包括一种或多种可药用的载体和/或稀释剂，这样的载体包括其本身对接受组合物的个体不诱导产生有害反应的任何载体。适合的载体一般是大的、代谢慢的大分子例如蛋白质、多糖、聚乳酸、聚乙醇酸、多聚氨基酸、氨基酸共聚物、脂类聚集物(例如油滴或脂质体)和灭活的病毒颗粒。这样的载体为本领域的那些普通专业技术人员所熟知。

根据本发明的疫苗组合物一般可能还包括稀释剂，例如水、盐、甘油、乙醇等等。此外，辅助物，例如湿润剂或乳化剂、pH缓冲物质等可能出现在组合物中。

本发明的疫苗的合适制剂包括可注射的液体溶液或者可注射的悬浮液。也可以制备固体形式，其适合于在注射前的液态可药用载体中溶解或者悬浮。疫苗制剂可以被乳化。可以包含于可用于本方法的产品中的另外的物质包括，但不限于一种或多种防腐剂，例如乙二胺四乙酸(EDTA)的二钠或四钠盐、硫柳汞等。

该疫苗组合物可任选的包括疫苗适用的可药用的(即无菌的和无毒的)液体、半固体或者固体稀释剂，其用作制药的运载工具、赋形剂或介质。可以应用任何在本领域已知的稀释剂。可作为范例的稀释剂包括，但不限于，聚氧乙烯脱水山梨醇单月桂酸酯、硬脂酸镁、羟基苯甲酸甲酯和羟基苯甲酸丙酯、滑石粉、藻酸盐、淀粉、乳糖、蔗糖、右旋糖、山梨醇、甘露醇、阿拉伯胶、磷酸钙、矿物油、可可豆脂和可可油。

疫苗组合物可以以便于输送的形式包装。组合物可包装于胶囊、小胶囊、囊剂、扁囊剂、明胶、纸或其它容器中。当与免疫原组合物进入受体生物相适应时，并且，特别是，当免疫原组合物以单位剂量进行输送时优选这些递送形式。该剂量单位可以被包装于，例如片剂、胶囊、栓剂或扁胶囊中。

适于注射使用的形式包括无菌水溶液(在此可溶于水)或分散体和用于临时制备无菌可注射溶液或分散体的无菌粉剂。它们在制造和储存条件下必须是稳定的，并且必须防腐保存防止微生物例如细菌和真菌的污染作用。可以通过多种抗细菌和抗真菌试剂达到预防微生物的活动，例如对羟苯甲酸酯、三氯叔丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞等。在许多例子中，优选包含等渗剂，例如蔗糖或氯化钠。通过应用延迟吸收的试剂组合物，例如单硬脂酸铝和明胶，可以使得可注射的组合物延时吸收。

无菌可注射溶液可以通过将以上例举的多种其它组份按照需要在适当的溶剂中以所需量掺入活性化合物，随后过滤灭菌来制备。一般地，通过将多种已灭菌的活性成分掺入无菌载体制备分散体，所述载体含有基本的分散介质和以上例举的那些必需的其它组份。至于用于制备无菌可注射溶剂的无菌粉剂，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥技术，其产生活性成分以及从先前的过滤灭菌溶液而来的任何另外想要的成分的粉剂。

当根据本发明的活性免疫原化合物应该受到保护时，它可能被口服施用，例如，用惰性稀释剂或用可同化的可食用载体，或它可以被包于硬壳或软壳的明胶胶囊中，压缩进片剂中，或直接掺入饮食的食物中。对口服的治疗用药，根据本发明的活性的免疫原化合物可以与赋形剂混合，并以可吸收的片剂、含片、糖锭、胶囊、酏剂、悬浮液、糖浆剂、薄脆饼等形式使用。按照活性免疫原化合物重量计，这样的疫苗组合物和制剂应该含有至少1％。该组合物和制剂的百分比当然可以是不同的，并且可以方便地在单位重量的大约5％至约80％之间。在这样的治疗上有用的疫苗组合物中，活性的免疫原化合物的数量是获得的合适剂量。根据本发明制备优选的疫苗组合物或制剂以便计量单位形式含有介于大约0.1g和2000mg之间的活性免疫原化合物。

根据本发明适合于口服用药的疫苗组合物也可以以液体溶液，包括液态气溶制剂的形式制备。

液态气溶制剂含有在生理学上可接受的稀释剂中的免疫原产品和分散剂。本发明的干粉气溶制剂由分得很细的固体形式的免疫原产品和分散剂组成。使用液态或干粉气溶制剂，该制剂必须被气雾化。就是说，它必须被分解成液体或固体颗粒，从而确保该气雾化的剂量实际到达鼻道或肺的粘膜。术语“气溶胶粒子”此处用于描述适合鼻或肺用药，即能到达粘膜的液体或固体的颗粒。其它的考虑，例如建造输送装置、该制剂中的另外的成分和颗粒特性是重要的。药物经肺给药的这些方面是在本领域众所周知的，并且制剂操作、气雾化方法和建造输送装置至多要求本领域普通技术人员进行的常规实验。在具体的实施方案中，质量中位动力学(the massmedian dynamic)参数将是5微米或更小以便确保药物颗粒到达肺泡[Wearley，L.L.，Crit.Rev.in Ther.Drug Carrier Systems 8：333(1991)]。

气溶胶传输系统，例如压力定量吸入装置和干粉吸入装置公开于Newman，S.P.，(Aerosols and the Lung，Clarke，S.W.和Davia，D.编辑，第197-22页)并可与本发明结合使用。

根据本发明该疫苗组合物可以通过任何常规方法向待免疫的受试者施用，所述方法包括，例如，通过口、静脉注射、皮内、肌内、乳房内、腹膜内或者皮下的注射；通过口服、经皮肤、舌下、鼻内、肛门或阴道输送。该处理可以由施用一段时间的单一剂量或复合剂量组成。

本发明还通过以下的图和实施例予以图解说明。

附图说明

图1由图解说明根据本发明制造稳定的免疫原产品的一般程序的方案组成。

图2说明在用(A)KLH单独或(B)如在实施例1中所公开的制造稳定的免疫原产品免疫的小鼠中的体液应答。横坐标：个体；纵坐标：IgG抗TNFα抗体滴度。

图3说明通过(A)KLH单独或(B)如在实施例1中所公开的制造的稳定的免疫原产品免疫小鼠，产生的血清抗体的抗-TNFα中和活性。每条曲线对应于来自一只小鼠的血清。横坐标：TNFα活性的中和百分比；纵坐标：血清稀释度。

图4说明用(A)KLH单独或(B)如实施例1公开的所制造的20μg稳定的免疫原产物，以及(C)如实施例1公开的所制造的80μg稳定的免疫原产物免疫恒河猴的体液反应。横坐标：在第一次注射后的天数；纵坐标：IgG抗-TNFα抗体滴度。

图5说明用(A)KLH单独或(B)如实施例1公开的所制造的20μg稳定的免疫原产物，以及(C)如实施例1公开的所制造的80μg稳定的免疫原产物免疫恒河猴产生的血清抗体的抗-TNFα中和活性。横坐标：TNFα活性的中和百分比；纵坐标：血清稀释度。

图6说明用(A)对照PBS缓冲液，(B)KLH单独，(C)如实施例1公开的所制造的稳定的免疫原产物和(D)如实施例1公开的所制造的稳定的免疫原产物与氨甲喋呤组合来免疫转基因huTNFαB6.SJL-Tg(TNF)N2小鼠的体液应答。横坐标：个体；纵坐标：IgG抗-TNF抗体滴度。

图7说明在转基因huTNFαB6.SJL-Tg(TNF)N2小鼠中测定的关节炎临床评估值，对其注射使用

-氯化钠[◆]；

-KLH单独[■]；

-如实施例1中所公开同样制造的稳定的免疫原产品[▲]；以及

-如实施例1中所公开同样制造的稳定的免疫原产品与氨甲蝶呤组合[■]

横坐标：第一次注射之后的天数；纵坐标：关节炎临床评估值。

图8说明hTNFα-Kinoid的特性。

图8-a)1：RPN800分子量标准参照物，2：KLH(0.8μg)，3：hTNFα(0.8μg)，4：3μg Kinoid，上样在12％SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳。通过银染或蛋白质印迹法显影。

图8-b)放射自显影图：1：分子量标准参照物；2：125I-hTNFα；3：标记在hTNFα上的Kinoid；4：标记在KLH上的Kinoid；5：125I-KLH。

图8-c)Kinoid(50μg)在superose 6柱上(10×300)滤过。用0.2ml DBPS洗脱。柱子先用一系列的分子量标准参照物校准。

图8-d)在L929细胞中TNFα(◆)和kinoid(◇)生物学活性的对比评价。e)比较TNFα对受体I(◆)和II(■)的结合，以及kinoid对受体I(◇)和II(□)的结合。

图9说明在TTg和Balb/c小鼠中的抗体应答。

图9-a)与Balb/c小鼠比较，在kinoid、失活的TNFα(iTNFα)或KLH免疫的TTg中的血清抗-TNFα抗体滴度。

图9-b)至9-e)：在kinoid(◇)和KLH(◆)免疫小鼠中评估的

图9-b)按照血清稀释的中和能力，

图9-c)作为时间函数的血清中和能力，

图9-d)血清hTNFα对受体I结合的抑制，

图9-e)IgG中和能力，

图9-f)IgG对TNFα受体I结合的抑制。

1-免疫方案：2次肌肉注射，间隔3周注射20μg并加强免疫(6周时5μg)；2：2次肌肉注射，注射10μg并加强免疫5μg。

图10表明小鼠脾细胞对hTNFα的细胞介导的免疫。

从KLH(n＝3)(◆)和kinoid(n＝2)(◇)免疫的小鼠纯化的脾细胞。在第1、8、29天对Balb/c和TTg小鼠免疫。在第90天进行加强免疫并在(第120天)处死取脾脏。脾细胞在体外用a)hTNFα，b)鼠TNFα(muTNFα)和c)KLH抗原刺激96小时。通过3H-胸腺嘧啶脱氧核苷掺入并且表示为刺激指数(图10-A)或者分别在44小时和72小时之后在培养上清液中测量IL2(图10-B)和IFN-γ(图10-C)产物来测定特定的细胞增殖(参见材料和方法部分)。

图11显示用hTNFαkinoid接种改善在huTNFα转基因小鼠中的临床关节炎。

七周龄的小鼠在第1、7和28天用KLH-TNFα(开环)(n＝8)或KLH(闭环)(对照组，n＝7)免疫。对任一参数组间差异具有统计学上的显著性：

图11-a)：从试验开始起体重增加的进展。P＜0.05(方差分析)；

图11-b)：患肢数。P＜0.0001(方差分析)；

图11-c)：关节炎临床评分。P＜0.0001(方差分析)；

图11-d)：关节炎每日患病率(百分比)显示在已接种组中该疾病的逆转(P＜0.01，方差分析)。

这个试验重复两次得到类似结果。

实施例

实施例1至7

实施例1：根据本发明制造稳定的免疫原产品的方法。

A.材料

表1：化合物和试剂

试剂	等级	供应商	详细资料	应用
					戊二醛25％	等级1	Sigma	G5882 10×1mL	PD&GMP
甲醛37％	-	Sigma	F-1635 25mL	PD
					甲醛37％	EP	Sigma	15513	GMP
磷酸氢二钠(无水)	Analar	BDH	10249	PD
					磷酸氢二钠(无水)	USP	Merck	1.06585 5kg	GMP
乙二胺四乙酸(EDTA)	Analar	BDH	10093	PD
					乙二胺四乙酸(EDTA)	USP	Merck	108421 1kg	GMP
甘氨酸	Analar	BDH	10119	PD
					甘氨酸	USP	Merck	500190 1kg	GMP
氯化钠	Analar	BDH	10241	PD
					氯化钠	BP	Merck	116224	GMP
二甲基亚砜(DMSO)	99.5％	Sigma	D5879	PD
					二甲基亚砜(DMSO)	USP	Sigma	D2438 10mL	GMP
杜尔贝科磷酸盐缓冲液(DPBS)	-	Sigma	D8537	PD
					杜尔贝科磷酸盐缓冲液(DPBS)	tbc	tbc	tbc	GMP

表2：消耗品

描述	供应商	应用
			Slide-a-Lyzer表达盒7kDa MWCO(0.5-3mL)	Perbio；66370	透析
Pellicon XL PES膜(5或10kDa MWCO)	微孔；PXB010A50	正切流动过滤
			50mL试管	Nunc；362696	样品容器
聚丙烯广口瓶(150mL)	VWR；215-0520	样品容器
			聚丙烯广口瓶(250mL)	VWR；215-5683	样品容器
冷冻管(3.5mL & 2mL)	Sigma；V1138；V9637	样品容器
			附带500mL丙烯酸树脂容器的实验室规格的TFF单元	微孔；XX42LSS13	正切流动过滤

B.方法详述

在这个实施例中公开的操作说明本发明方法的实施方案，其用于制备包含TNF和KLH的抗原杂络物的稳定的免疫原产品。

此外，在下文详述的方法是为制备一批120mg的稳定的免疫原产品而设计的。

步骤a)

-取30.05ml的TNFα(浓度为4.2mg/ml)并让其在4℃过夜解冻(注意：需要126.21mg TNFα)。

步骤b)(或步骤b1)在该方法的某些实施方案中)

-加90.15ml的“稀释缓冲液”以获得“工作缓冲液”溶液且TNFα为1mg/ml(±10％)。

-稀释缓冲液＝130mM磷酸氢二钠，133mM NaCl，6.6mM EDTA，pH7.8

-工作缓冲液＝100mM磷酸氢二钠，150mM NaCl，5mM EDTA，pH7.8

步骤b2)

-向保留的120ml的1mg/ml TNFα(±10％)中加入1.2ml DMSO。该混合物于室温放置30分钟。每10分钟搅拌混匀并尽量避免产生泡沫。

-加61.34ml的“工作缓冲液”至混合物中。通过颠倒容器轻轻混合并尽量避免产生泡沫。

步骤c)

-加入51.6mg的KLH。注意：对于9.81mg/ml的KLH溶液加入5.26ml。通过颠倒容器轻轻混合。此时总体积为187.8ml。

步骤d)

-用“工作缓冲液”将25％的戊二醛贮存液稀释至2.5％。用前即刻完成。

-加入20.86ml稀释的2.5％的戊二醛溶液。注意此时总体积为208.56ml。通过颠倒容器轻轻混合。

-封闭瓶子并于室温孵育45分钟。每15分钟轻轻颠倒瓶子。

步骤e)将该溶液用正切流动过滤(TFF)对工作缓冲液渗滤。

-对20倍体积的pH7.6，含150mM NaCl的10mM磷酸盐缓冲液透析3次。

体积1＝透析2小时

体积2＝透析2小时

体积3＝透析过夜

步骤f)

-用“工作缓冲液”将甲醛贮存液(37％)稀释10倍以获得3.7％的溶液。用前即刻完成。

-向TNFα-KLH溶液中加入稀释的3.7％的甲醛以获得0.2％的终浓度。

例如，如果回收的体积为200ml，那么所加入的3.7％甲醛的量将是11.43ml。

-封闭瓶子并于37℃孵育6天。每天颠倒瓶子一次。

步骤g)

-6天后，加入2M甘氨酸(配制于WFI中)至0.1M的终浓度。于室温孵育1小时，其间轻轻颠倒瓶子。

步骤h)

-检查用于渗滤的DPBS(Sigma)的pH，如果需要，用0.1M NaOH调节至最终pH7.3±0.2。通常应该无需调节pH。

-用正切流动过滤(TFF)对DPBS渗滤该溶液。

使用2×5kDa MWCO TFF膜。

使用Labscale TFF系统上的500ml(丙烯酸树脂)容器。

通过将浓缩物(超滤保留)引流至预称重的聚丙烯瓶从膜上回收原料。

实施例2：通过根据本发明的方法获得稳定的免疫原产品的试验操作

在实施例2中公开的试验操作可以被本领域技术人员参考。然而，本领域技术人员也可以根据公布于此的多个实施例中的任何一个试验操作进行试验。

2.1.通过比色计的总蛋白质含量测定：Bradford试验的实例

应用Bradford技术测定蛋白质含量(Bradford，M.Anal.Biochem.1976.72，248-254)。

简言之，通过吸取0、10、20、30、40μl溶于PBS中的0.2mg/mlBSA溶液至一系列的试管中，用牛血清白蛋白(BSA)建立校准曲线。随后，通过加入相应体积的DI水使每管体积最终达500μl。然后每管加入500μlBradford试剂。用200μl PBS配制两个空白。于室温反应5分钟之后，每管内容物涡旋振荡并于595nm读数。

200μl适当稀释的待测蛋白质溶液与如上所述Bradford试剂进行反应。

KLH-TNFα中TNFα蛋白质含量：ELISA

将从4个小瓶中所取的4个KLH-TNFα样品在pH7.2的磷酸盐缓冲液(PBS)中稀释至5μg/ml。这些稀释物被用于包被微量滴定板(Costar 3590)，每孔100μl。在让其4℃包被过夜后，用含0.1％吐温20的PBS冲洗该平板，并将该孔用2％胎牛血清(FCS)溶液(溶于100μl PBS-吐温中)于37℃饱和2小时。在用PBS-吐温冲洗该平板之后，吸取系列稀释的抗-TNFα血清100μl至每个孔中并将该平板于37℃孵育2小时，此后将其彻底冲洗干净，并在每孔加入100μl辣根过氧化物酶标记的抗-IgG抗血清之后再次于37℃孵育2小时。

孵育后，冲洗该平板并向每孔中加入100μl邻苯二胺(OPD)溶液。3分钟后，每孔加入100μl的2N硫酸，该平板用多扫描光度计于490nm读数。

2.2.KLH-TNFα免疫原的纯度级别：等电聚焦(IEF)+蛋白质印迹

在1％的琼脂糖平板上，在3至10的pH梯度内，通过等电聚焦(IEF)通过使KLH-TNFα免疫原在单独的KLH和单独的TNFα旁边迁移，评估免疫原的纯度级别。在将每个样品适当稀释至250μg/ml后，用快速凝胶电泳系统装置(Amersham Pharmacia)在下列条件下进行电泳。

第一步(预迁移)：500V，2.5mA，2.5W，15℃，5aVh

第二步(应用)：200V，2.5mA，2.5W，15℃，5aVh

第三步(迁移)：1500V，2.5mA，2.5W，15℃，450aVh

迁移后，通过微-毛细管作用将该蛋白质转移至PVDF膜并通过蛋白质印迹将该蛋白质显影。

蛋白质印迹检测

通过将硝酸纤维素膜浸泡于5％的牛奶-TBS吐温20中，在室温下过夜，使其被饱和，此后用稀释于10％牛奶-TBS吐温20中的多克隆抗-TNFα(人)第一抗体或者抗-KLH第一抗体室温下孵育1小时。随后，在5分钟内用TBS-吐温20洗膜4次，之后用10％牛奶-TBS吐温20稀释的辣根过氧化物酶标记的第二抗体室温孵育1小时。再次，用TBS-吐温20洗膜4次，并用ECL增强试剂盒(Amersham Pharmacia)通过化学发光显示该斑点。

3.在稳定的免疫原产品中TNFα-KLH共价键的百分比

·3.1.方法1：在变性和还原条件下的大小排阻色谱

将待测的kinoid溶液置于导致非共价键解离的变性(8M终浓度的尿素)和还原(5％终浓度的β-巯基乙醇)条件下。所得溶液通过装填了Superdex200^TM(Pharmacia)的大小排阻柱洗脱，Superdex 200是因其600kDa的级分限制远低于KLH和共价的KLH-TNFα构建体的分子量而被选择的。只有那些与KLH共价结合的细胞因子分子留在排阻体积中。用夹心酶联免疫分析技术用与KLH没有交叉免疫应答的抗-TNFα抗体测定后者的TNFα(特异的TNFα抗原)。该结果以在起始溶液中TNFα滴度的百分比表达，其通过同样的酶联免疫吸附测定法测定。这个百分比等于在TNFαkinoid中的％TNFα-KLH共价键。

·3.2.方法2：应用吐温洗涤的双-夹心酶联免疫分析

A使用溶于PBS(10mM pH7.3，NaCl 150mM)中的1mg/ml的抗-KLH多克隆抗体包被微量滴定板(Costar，高结合量)，每孔100μl，37℃2小时。在用PBST(含0.1％v/v吐温20的PBS)洗3次之后，每孔用含2％胎牛血清的PBS饱和1.5小时。该孔用PBST再洗3次。

然后将两个相同的系列稀释的待测kinoid(10、5、0.156μg/ml)加至孔中并孵育2小时。将该孔用PBST洗3次，其解离作用(通过吐温20)清除与KLH非共价结合的所有分子，后者KLH被固定于包被支持物的捕获抗体。第一系列的测试稀释液与抗-KLH抗体孵育，且第二系列与抗-TNFα抗体孵育。在37℃孵育1.5小时之后，如上冲洗各孔，然后与特异的过氧化物酶偶联的第二抗体孵育。

加入OPD(过氧化物酶底物)，使能够对第一系列进行固定的抗-TNFα抗体的定量比色检测，以及对第二系列进行固定的抗-KLH抗体的定量比色检测。两个系列之间固定的抗体比率给出在kinoid中TNFα共价结合KLH的百分比。

4.KLH-TNFαKINOID的免疫学活性

抗原性测试：酶联免疫吸附测定(ELISA)

这个测试的目的在于测定免疫原(或者抗原衍生物，或者与载体蛋白质结合的抗原)与天然抗原相关的特异抗体的结合能力。该测试基本上以反向ELISA为主。

将试验中一系列稀释度增高的免疫原分配到聚苯乙烯微量滴定板孔中。让针对该待测蛋白质的特异多克隆抗体与固定于孔内的免疫原反应。在通过洗板清除未反应的过量抗体之后，通过让被孔内抗原所固定的抗体与辣根过氧化物酶标记的针对第一抗体的抗体反应进行定量显示。通过加入适当底物所显的黄色与所固定的蛋白质的量直接成正比。用微板光度计测定每孔的光密度(OD)。从校准曲线测得待测样品的蛋白质含量。

5.KINOID的免疫原性

免疫原制剂的免疫原性是：

-1-其诱导特异的抗-TNFα多克隆抗体形成的能力水平(体内测定)；以及

-2-它的中和能力。后者是在体外通过定量从免疫小鼠取样的抗血清抑制TNFα的特异生物学活性的能力而测量的。

-1-为此，20组7周龄的Balb/c小鼠，体重18-20g，每5只动物关在一个单独的笼舍中，用标准的丸状食物以及不限制饮水进行饲养，在第0、7、14和21天通过肌内注射0.1ml(10μg)在ISA 51中的待测免疫原(1∶1v/v乳剂于ISA51中)进行免疫。第60天，注射5μg免疫原(0.1ml，1∶1乳剂于ISA51中)给予加强免疫。在开始免疫2天之前通过眼眶后穿刺取血样，并在最后一次注射后12天再次取血样，用于通过酶联免疫吸附测定法检测抗体水平。三只对照小鼠接受1∶1v/v PBS于IFA中的乳剂。

血清抗体滴度表示为产生OD＞0.3的稀释度的倒数。

6.免疫毒性-体外

使用多种kinoid剂量处理并且通过PPD/TT抗原刺激的T细胞的增殖(通过3H-胸腺嘧啶脱氧核苷)的测试。

通过聚蔗糖梯度离心分离血液，从健康供体得到新近分离的外周血单核细胞。将细胞接种至含10％胎牛血清的RPMIc培养基的圆底96孔板中，每孔15,000个细胞。将kinoid加至浓度1μg/ml至100ng/ml，然后加PPD或TT至0.16％。将平板放在37℃5％CO₂中孵育6天。孵育结束前18小时加入氚标记的胸腺嘧啶脱氧核苷，0.5μCi/孔。用β闪烁计数器分析细胞增殖。

7.KLH-TNFαKINOID的生物学特性

TNF-α生物测定：

放线菌素D存在下鼠L929细胞的细胞溶解

材料

-L929小鼠成纤维细胞系(ATCC商品号CCL-1)；KLH-TNFα(小鼠或人)kinoid溶于PBS(标准)中，NEOVACS

-重组鼠TNF-αPeprotech(315-01A)或人TNF-αPeprotech(300-01A)；培养基(补充10％胎牛血清、2mM谷氨酰胺、100U/ml青霉素-链霉素的RPMI)

-测定用培养基(补充2％胎牛血清、2mM谷氨酰胺、100U/ml青霉素-链霉素的RPMI)

-预孵育培养基：补充2mM谷氨酰胺、100U/ml青霉素-链霉素的HL1

-96孔平底培养板(Costar，3595)

-放线菌素D，1000μg/ml，保存于4℃(避光)

-MTT溶液(Sigma，M5655)，溶于PBS的5mg/ml等分试样贮存液于-20℃保存(避光)

-DMSO(SIGMA，471267)

试验持续时间

24小时孵育

1小时测定准备

方法

1.将KLH-TNFα鼠或人kinoid和标准品在96孔板每孔50μl的分析培养基中稀释，留下第1排作为空白，从适当的稀释度开始，从第2排至第11排进行一系列的二倍稀释。

2.在补充1μg/ml的放线菌素D(避光保存)的分析培养基中，制备密度为7.5105/ml的L929细胞悬液。

3.将平板在增湿保温箱中于37℃5％CO₂孵育24小时。

4.用不含Ca²⁺、Mg²⁺的PBS漂洗两次。

5.每孔加入50μl MTT溶液到分析培养基中至40％，在增湿保温箱中于37℃5％CO₂孵育4小时。

6.倒空平板并且每孔加入50μl DMSO。

7.于550-630nm读板

8.分析数据。

实施例3：

多种KLH-TNFα(人)kinoid制剂的比较研究

由人TNFα与特异的载体蛋白质KLH复合组成的人TNFαkinoid的多种制剂已经完成。

更精确地说，通过同样的一般程序已经生产了KLH-TNFα(人)的多种制剂，该程序公布于实施例1中但在(i)DMSO的百分比，(ii)戊二醛浓度(2.5或22.5mM)以及(iii)中间产物与甲醛孵育的时间期限(从0.2至6天的孵育时间期限)有变化。

然后，已经测定了人TNFα生物学活性的丧失。并且，已经通过(i)人TNFα在L929细胞系中的细胞毒性测定，以及(ii)通过公布于此的本实施例中的免疫原性测定检测了在最终的kinoid产物中构象上B-表位的保存。

A.材料和方法

A.1在KLH-TNFα(人)kinoid中对TNFα生物学活性缺失的测定

人TNFα，在放线菌素D存在下，对L929细胞系的鼠成纤维细胞具有细胞毒性，通过细胞存活试验用MTT(3-[4，5-二甲基噻唑-2-基]-2，5-联二苯-四唑盐溴化物)评估其细胞毒性。该测定方法是基于MTT被活细胞的线粒体NAPDH还原酶还原为还愿态产物甲，其具有兰紫色。

在该测定方法中，细胞的代谢活性使得能够评估其生存能力。

该KLH TNF-α生物学活性的评估包括在逐渐减少(从50ng/ml至0ng/ml)量的所述产品与D放线菌素(1μg/ml)混合存在下于微培养板平底孔中孵育L929细胞。

在含5％CO₂的湿润空气中于37℃在24小时时间期限内进行细胞培养。

在培养24小时后，弃去该细胞培养上清液并替换为MTT测试液。

在37℃与MTT孵育4小时之后，弃去MTT溶液并加入DMSO。

在混合均匀之后，用分光光度计在波长570nm处测定细胞培养上清液的光密度。

用570nm处的光密度(O.D.)表示该结果。平行地，将细胞培养物与从0至10ng/ml范围的TNFα进行孵育，作为对照。

最终结果以半数致死剂量表示，也称为LD₅₀，其为诱导50％的L929培养细胞溶胞的剂量。

A.2在用戊二醛和甲醛进行化学处理后，在最终的KLH-TNFα(人) kinoid中人TNFα构像B-表位保存的测定：免疫原性测定

在重量为18-20g的C57Bl/6中进行免疫原活性的测试，在化学处理后对最终的KLH-TNFα(人)kinoid中人TNFα的B表位构像的保存进行研究。

在第0天，通过肌内途径给同组的三只小鼠注射完全弗氏佐剂(CFA)中的乳剂0.2ml(50μg)。

在第21天，用不完全弗氏佐剂中的kinoid产品25μg给予第二次注射。

在第一次注射之前和在第28天时进行每只小鼠的眶后血样采集。收集每组小鼠的血清。

通过检测免疫小鼠的血清中直接抗人-TNFα的IgG同种型抗体对体液应答进行测定。体液应答是通过酶联免疫吸附法进行测定的并用抗体滴度表示(稀释度^-1，给出大于0.3的光密度)。

如后所述，通过在L929细胞上对TNFα细胞毒的检测已经从用KLH-TNFα(人)免疫的小鼠中测定了血清的中和能力。

用从在第-2天和第28天采样的血清库(稀释度从1/100至1/12800)得到的多种稀释度处理L929细胞，然后于室温下一直孵育40分钟，接着与20ng/ml的人TNFα于4℃孵育20分钟。

在含5％CO₂的湿润空气中于37℃继续培养细胞24小时。

在细胞培养24小时后，弃去细胞培养上清液并替换为MTT溶液。

在于37℃孵育4小时后，弃去MTT并加入DMSO。

在混合均匀之后，用分光光度计在波长570nm处测定细胞培养上清液的光密度。

用细胞培养上清液的光密度(O.D.)表示该结果。将细胞培养物与从0至10ng/ml范围的TNFα进行平行孵育，以作为对照。

中和TNFα细胞毒性的血清避免了其对L929细胞的细胞毒性。

该结果表示为50％中和能力或NC₅₀，其相当于中和50％的人TNFα细胞毒性的血清稀释度。

B：结果

表3用根据多种化学处理制备的最终KLH TNFα(人)获得的结果如下所示。

表3

代码	戊二醛(mM)	甲醛(天)	EDTA	DMSO(％)		抗体滴度
								K1	2.5	2	5mM	0	12.5	＞64000	1/650
K2	2.5	2	5mM	2	20	＞64000	1/600
								K3	22.5	0	5mM	1	0.15	＞64000	1/600
K4	22.5	2	5mM	1	200	＞64000	1/750
								K5	22.5	2	5mM	2	225	＞64000	1/400
K6	22.5	2	5mM	5	250	＞64000	1/700
								K7	22.5	6	5mM	1	＞400	＞64000	1/1200
K8	22.5	6	5mM	2	＞400	＞64000	1/300
								K9	22.5	6	5mM	5	＞400	＞64000	1/350
K10	22.5	2	0mM	0	15	＞64000	1/700

用包括化学处理(i)用浓度为1％的DMSO和(ii)用浓度为22.5mM的戊二醛，然后(iii)用甲醛化学处理6天的制造KLH TNFα(人)的方法获得的最好的结果，如上表3所示。产生的最终KLH-TNFα(人)产品去除了人TNFα的细胞毒性并诱导产生中和天然人TNFα的生物学活性的多克隆抗体。

因此，根据公布于上述表3中K7条件的制造程序使包含于其中的保留构象上B-表位的人TNFα细胞因子失活。

根据上述表3中称为“K7”的条件制备的KLH-TNFα(人)终产品与根据上述实施例1制备的相同。

这种最好的TNFα产品已经在以下实施例中进行了研究，特别是在转基因小鼠模型中，考虑到研究其诱导多克隆抗体的能力，该抗体中和自体系统中天然的TNFα。

实施例4：小鼠中KLH-TNFα(人)kinoid的急性毒性的研究

本研究的目的是将根据本发明的包含KLH-TNFα(人)kinoid的疫苗组合物的特性，定义为用作广谱治疗疫苗以用于治疗癌性恶病质和/或多种自身免疫疾病(例如关节炎、克隆病和银屑病)。

特别是，对疫苗组合物关于耐受性和无危险的特性已经进行了研究。

因此，已经在SWISS小鼠中进行了初次的毒性研究。

A.材料和方法

将四十六(46)只雌性SWISS小鼠分配于(i)一组4只未处理的动物和(ii)三组十四只动物，其分别接受：

a)对照组(佐剂载体)：n＝14

在大腿部经肌内途径注射(IM)磷酸盐缓冲液(PBS)；

对照组被用于评估配方中所用佐剂的局部的和系统的反应性。

b)治疗组(第一次剂量：人单次治疗剂量的2.000倍，STHD°/N+14)

按照50μg/小鼠在大腿部经肌内途径注射(IM)溶于磷酸盐缓冲液(PBS)中的KLH-TNFα(人)kinoid。

c)治疗组(第二次剂量：人单次治疗剂量的4000倍，STHD)：n＝14

按照100μg/鼠在大腿部经肌内途径注射(IM)溶于磷酸盐缓冲液(PBS)中的KLH-TNFα(人)kinoid。

d)包括在本研究中的未处理的首次用于试验的小鼠组(n＝4)

对涉及人使用的单次剂量进行剂量计算，其为80μg/注射/个体：1SHTD(人单次治疗剂量)，即，1.15μg/kg。

在实验的第五天(D5)已经完成KLH-TNFα(人)kinoid的注射。

根据下列参数已经测试了动物对上述治疗的应答：

a-立即的、短期的和长期的最终死亡数目(注射后10天的观察期)

b-对于该治疗的局部或系统的反应性。

c-曲线显示注射KLH-TNFα(人)kinoid(D 15)后一直到第10天该动物的总体状态和体重。

在观察期之后五(5)天(D 20)，将存活的动物处死并且进行对下列对照的处理。

d-显微镜下病理解剖检查注射位点处的肌肉，用以评估局部耐受性。

e-测定肺、心、肝和脾的重量，作为对施用免疫刺激物质的器官应答的指数值。

B.结果

当以大大提高的剂量(每只小鼠中人单次治疗剂量的大约4000倍)施用于小鼠，在整个10天的观察期内，并且对每个试验组而言，该KLH-TNFα(人)kinoid并未导致任何不良反应，其通过以下得以说明：

1)无立即或中间发生的死亡；

2)在注射位点无局部反应，也没有任何系统反应；

3)在任何试验组中，对小鼠的生长曲线没有影响。

此外，在试验结束时(D20)对被处死的动物的器官进行宏观检查，没有显示出器官的改变或者任何脾和肝体积的增大。

而且，对整组测试动物而言，其心、肺、肝和脾的重量以类似的方式变化。

实施例5-在适于人TNF的转基因小鼠模型中研究该KLH-TNFα(人) kinoid的免疫源性。

与KLH的免疫原性比较，KLH-TNFα(人)kinoid制剂的免疫原性(体液)，已经在5周龄(一组10只小鼠)的小鼠B6.SJL-Tg(TNF)N2中进行了研究。这些小鼠由Taconic公司(美国)提供并包括人TNFα基因的转基因(半合子)小鼠。

A.材料和方法

在第0天和第7天，小鼠(一组10只小鼠)已经通过肌内根部接受0.2ml(30μg)ISA51中乳剂的注射。在第28天给予25μg ISA51中乳剂的第二次注射。然后，在第35天对每只小鼠进行眼窝后血样采集。

B.结果

1.体液应答

体液应答是通过已免疫小鼠的血清中直接抗人TNFα的IgG型抗体的存在来测定的；体液应答通过ELISA测定法进行测定并以抗体滴度(稀释度^-1给出大于0.3的光密度)表示。图2说明所获得的抗体滴度。

用根据实施例1获得的KLH-TNFα(人)终产品免疫小鼠，来源于该小鼠的血清具有高水平的IgG型抗体滴度，而来源于用KLH免疫的小鼠的血清缺乏这些抗体。

用TNFα细胞毒性测定法在L929细胞中测量这些抗体的中和活性。其结果呈现于图3中。

KLH-TNFα(人)kinoid制品诱导的抗体具有高水平的中和活性。

实施例6-在恒河猴中对KLH-TNFα(人)kinoid的免疫原性的研究

与单独的KLH的免疫原活性比较，KLH-TNFα(人)kinoid的体液免疫原活性，已经在由MDS pharma(里昂-法国)提供的恒河猴中进行了研究。值得注意的是恒河猴天然生成的TNFα与人TNFα有98.1％的氨基酸同源性。

A.材料和方法

在第0天、第21天和第49天，恒河猴已经接受了0.5ml溶于ISA51中的kinoid的乳剂通过肌内途径的注射，包括(i)80或者20μg的KLH-TNFα(人)kinoid制剂，或者(ii)单独的KLH。在第28天、第56天和第68天已经完成每只动物的血样采集。

B.结果

1-体液应答：

通过检测已免疫的恒河猴的血清中直接抗人TNFα的IgG同种型抗体的存在对体液应答进行测量。已经使用ELISA测定法对体液应答进行了测定并表示为抗体滴度(稀释度^-1给出大于0.3的光密度)。所获得的抗体滴度的结果报告于图4中。

来源于用KLH-TNFα(人)制剂免疫的恒河猴的血清具有抗-TNFα的IgG同种型抗体滴度，而来源于用单独的KLH免疫的恒河猴的血清缺乏这些抗体。

在接受了80μg的KLH-TNFα(人)kinoid的恒河猴血清中，其抗-TNFα抗体滴度更高。

用TNFα细胞毒性测定法在L929细胞中已经测定了该抗体的中和活性。这些测定的结果报告于图5中。

该KLH-TNFα(人)kinoid诱导的抗体具有很高的中和活性。

实施例7-在huTNFα转基因小鼠中抗TNFα自动免疫接种的治疗效果 的评估

在Taconic公司(美国)提供的5周龄的转基因小鼠huTNFαB6.SJL-Tg(TNF)N2中，对使用KLH-TNFα(人)kinoid制剂作为活性成份的抗TNFα的自动免疫接种策略的治疗功效进行评估。这些TNFα转基因小鼠在4至5周龄发生自发的多关节炎。

A-材料和方法

1-免疫接种

小鼠在第0天、第7天和第28天通过肌内途径接受0.2ml ISA中的乳剂注射。对四组的10只小鼠已经进行的处理详述如下：

-A组：PBS：200μl PBS

-B组：KLH：200μl KLH

-C组：KLH-TNF：200μl KLH-TNF

-D组：KLH-TNF+MTX：200μl KLH：TNF和氨甲喋呤(1mg/kg)，从免疫接种N°1开始和直到处死，一周三次(腹腔注射，每次注射200μl)。

小鼠已经接受(i)在第0天和第7天：30μg的KLH-TNFα(人)kinoid制剂以及(ii)在第28天：15μg的同样制剂的处理。

在第35天，进行每只小鼠的眼眶后血样采集。在第57天，将小鼠处死的时候，也进行血样采集。

2-关节炎的临床检查和定量评估

在试验开始时已经进行了临床检查，并且随后一周两次进行临床检查。

由对所施处理一无所知的观察者进行评估。通过从0至4变化的分值属性，对各个关节(手指、跗骨、踝关节、carpe)处关节炎的临床严重程度进行定量，其中：0＝正常；1＝红斑；2＝肿胀；3＝变形；和4＝大部分变形或坏死。为了获得每只动物的关节炎分值，每天对这些分值已进行总计。计算治疗每天的每组平均值。

3-关节炎的组织学检查和定量评估

在试验开始后第57天处死所有的动物。将后爪取下，固定于甲醛溶液中，脱钙，然后脱水以及随后包埋于石蜡块中。然后，用切片机制备5μm厚的组织切片。为了确保对该关节病变进行正确的立体评估至少对每只爪进行连续切片。然后用苏木精和伊红对载玻片标本进行染色并随后在光学显微镜下观察。根据3个数据点的尺度(0＝正常；3＝严重)对每块切片进行损伤的定量评估。这种组织学上的得分可以划分为两个参数：一方面，软骨的破坏和骨的破坏(软骨的厚度以及骨的厚度、不规则性以及侵蚀的存在)；另一方面，炎症(滑液增多、细胞炎症性浸润)。

4-统计：

该结果数值以平均数和标准离均差(SDM)给出。student’s检验以及方差分析(ANOVA)已经完成。

B.结果

1-体液应答：

通过检测已免疫的恒河猴的血清中直接抗人TNFα的IgG同种型抗体的存在对体液应答进行测量。通过ELISA测定法对体液应答进行测定并表示为抗体滴度(稀释度^-1给出大于0.3的光密度)。

所获得的抗体滴度的结果报告于图6中。

2-关节炎的临床检查和定量评估

临床评分随时间的变化

临床评分随时间的变化报告于图7中。

恒河猴的治疗(i)用KLH-TNFα(人)kinoid或(ii)组合应用KLH-TNFα(人)kinoid和甲氨蝶呤(MTX)诱导通过临床检查评定的关节炎分值大部分在统计上显著降低。通过比较，用KLH或PBS缓冲液处理的对照动物所测定的关节炎分值低得多。

疾病发生和病情恶化参数的评估

疾病发生和病情恶化的评估报告于以下表4中。

-通过临床检查已经确定每只动物疾病发生的天数。未患该病的动物不予考虑。

-分值“A MAX”相应于试验期间每只动物所得最高分。分值“A MAX”代表疾病严重性的参数。

-发病率是指考虑每组动物的总数目，试验结束之前发生关节炎的动物数目。

表4

治疗	疾病发生的天数(仅患病动物)	Amax得分值±标准离差	发病率
				PBS	24.4±2.5	11.5±4.2	10/10
KLH	25.9±2.5	9.0±1.4	10/10
				KLH/TNF			3/10
KLH/TNF			6/10

^*p＜0.01相对于KLH    ^**p＜0.001相对于KLH    #p＜0.02相对于PBS##p＜0.001相对于PBS(Student t检验)

该结果显示通过KLH-TNFα和KLH-TNFα+甲氨蝶呤(MTX)的处理以统计上显著的方式诱导：

-与用单独的KLH或PBS处理的对照动物比较，推迟关节炎的发生。

-关节炎的严重程度下降；以及

-患病动物数量减少。

3-关节炎的组织学检查和定量评估

结果报告于以下表5中。

表5

治疗	炎症分值±sem	破坏分值±sem
			PBS	1.30±0.09	0.71±0.11
KLH	1.53±0.21	1.10±0.23
			KLH/TNF
KLH/TNF

^*p＜0.01相对于KLH和相对于PBS  ^**：p＜0.001相对于KLH和相对于PBS(Student t检验)

通过KLH-TNFα和KLH-TNFα+甲氨蝶呤(MTX)的治疗，以统计上显著的方式，诱导组织学改变(破坏和关节炎症参数)的减少。

C-结论

根据实施例1用KLH-TNFα(人)kinoid制剂对huTNFα转基因小鼠进行免疫接种，明显保护动物以避免炎症和关节损坏，如临床和组织学分析结果所示。

用KLH-TNFα(人)kinoid制剂处理的动物组，在关节保护方面，无法与组合应用KLH-TNFα(人)kinoid制剂和甲氨蝶呤(MTX)治疗的动物组区分；这些结果可以用这样的事实来解释，即在这些试验条件下，单独的KLH-TNFα(人)kinoid制剂的主要功效掩盖了甲氨蝶呤最终的有益作用。

用KLH处理的动物组不能与用PBS缓冲液处理的动物组区分。

另外的结果，其涉及根据本发明的稳定的免疫原产品的生物学特性，公布于以下实施例8至12。

实施例8至12

A.实施例8至12的材料和方法

A.1.试剂

KLH购自Intracel(圣地亚哥，加拿大)，hTNFα购自BoehringerIngelheim(曼海姆，德国)，鼠TNFα购自Cytolab(Rehovot，以色列)，hTNFα受体RI和RII、hTNFα、鼠IL2和鼠IFNγ酶联免疫吸附测定试剂盒购自R&D系统(里尔，法国)，ISA51佐剂购自Seppic(巴黎，法国)。

A.2.动物

4-5周龄的雌性和雄性的杂合hTNF转基因小鼠(1006-T)购自Taconic，6-8周龄的雌性C57Bl/6和Balb/c小鼠购自Charles River(L′Arbresles，法国)。小鼠在无病菌的条件下饲养。兔子在Charles River breeding饲养(L′Arbresles，法国)以及恒河猴在MDSPharma公司饲养(St-Germain-sur-L′Arbresles，法国)。

A.3.免疫原的制备

通过公布于实施例1中的方法制备hTNFα-KLH免疫原。

A.4.SDS/聚丙烯酰胺凝胶电泳、银染和免疫印迹

根据Laemmli的方法(Laemmli，U.K.(1970)，Nature 227：680-85)，在非还原条件下进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析。在12％的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳中，蛋白质通过银染和放射自显影显示(Le Roy F.，Bisbal C.，Silhol M.，Martinand C.，Lebleu B.& Salehzada T.(2001)。The Journal ofBiological Chemistry，276：48473-482.)或者用适当的抗体进行免疫印迹分析。

A.5.凝胶过滤色谱法

将该杂络物上样至Superose 6 10/300 GL凝胶过滤柱(Amershambioscience，Orsay，法国)，该柱用DPBS预平衡，并用与平衡时所用的相同缓冲液以0.2ml/min进行洗脱。

A.6.细胞培养

小鼠L929细胞系(ATCC，CCL 1)培养于含有10％胎牛血清的RPMI-1640中。纯化的鼠脾细胞重悬于含有5％胎牛血清和50μM 2-β-巯基乙醇的RPMI培养基中，并在培养基中单独或与KLH(30μg/ml)、hTNFα(3μg/ml)以及鼠TNFα(1μg/ml)抗原一起孵育。

A.7.T细胞增殖测定法

将抗原活化的脾细胞培养4天，然后用3H-胸腺嘧啶脱氧核苷放射脉冲18小时。18小时后将细胞收集于过滤器中，用β-射线计数器对掺入DNA的胸腺嘧啶脱氧核苷定量。刺激指数表示为：[(来自被刺激细胞的cpm的平均值)-(来自未刺激细胞的cpm的平均值)]/(来自未刺激细胞的cpm的平均值)。SI值大于2被认为是阳性。

A.8.TNFα和受体测定法

A.8.1.直接的受体结合测定：

用50ng/孔的hTNFαRI或RII预包被板测定与其靶受体结合的该杂络物和hTNFα。系列稀释的样品与其受体孵育并且用生物素化的山羊多克隆抗-hTNFα抗体(R&D Systems)检测。为了评估血清或IgG抑制hTNFα与其受体结合的能力，在将hTNFα转移至固定hTNFαRI的平板之前，首先将其与系列稀释的待测血清或IgG进行预处理。封闭滴度用中和50％hTNFα结合的血清稀释度的倒数表示。

A.8.2.抗-hTNFα抗体滴度测定：

通过直接酶联免疫吸附测定法(Elisa)测定免疫的和对照小鼠血清中的特异的抗-hTNFα抗体滴度。用50ng/孔hTNFα预包被的Elisa板与系列稀释的免疫的和对照小鼠的血清孵育。用过氧化物酶兔抗-小鼠IgG(Zymed，加拿大)检测特异的IgG。最终滴度以给出0.3的光密度值的最高样品稀释度的倒数表示。

A.8.3.细胞因子定量：

通过酶联免疫吸附测定法对血清和培养液上清中的hTNFα、鼠IL-2和鼠IFNγ进行测定。

A.9.hTNFα的生物测定

用L929细胞毒性测定法(Bloquel 2004)评估hTNFα的活性。系列稀释的hTNFα和杂络物与L929细胞在放线菌素D(1μg/ml)存在条件下孵育18小时，并通过MTT测定法确定存活细胞的数量。在血清和IgG与hTNFα孵育之后类似地测定高度免疫血清或IgG中和hTNFα活性的能力。中和滴度用中和50％的hTNFα活性的血清稀释度的倒数表示。

A.10.免疫接种

通过3或4次肌肉注射以ISA51为佐剂的kinoid(Seppic)或对照制剂(5-30μg)免疫动物。在第3次或第4次免疫之后8至12天以及处死时收集血清。

A.11.抗体纯化

免疫球蛋白(IgG)和特异的抗-hTNFα或抗-KLH抗体是从免疫小鼠或对照小鼠的血清用蛋白质G IgG纯化试剂盒(Pierce)或基于hTNF或KLH偶联的琼脂糖4B柱的亲和层析法(Sigma化学试剂公司，圣路易斯，Mo)。用BIAcore 3000技术确定亲合力(Lofas，S.，Johnsson B.(1990)J.Chem.Soc.Chem.Commun.21：1526；Karlsson，R.，Falt A.，(1997)J.Immunol.Methods 200：121)。

A.12.致死休克

在最后的免疫注射之后10天，用存在于溶于PBS的20mg D-半乳糖胺中的hTNFα腹膜注射刺激对照和hTNFα-kinoid免疫的小鼠(C57Bl/6或TTg)的反应。注射80-90％的hTNFα致死剂量记录注射后24小时存活的动物(Lehmann V J Exp Med 1997657)。在这些试验中，对注射TNFα后8小时处死的小鼠分组，进行肝脏的肉眼检查。

A.13.关节炎追踪

人TNFα转基因小鼠1006-T从第8周龄起罹患自发性关节炎，如Tg197品系(Keffer，J.，Probert，L.，Cazlaris，H.，Georgopoulos，S.，Kaslaris，E.，Kioussis，D.&Kollias，G.(1991)Embo J 10，4025-31)。用盲法监测小鼠四个爪子的关节炎迹象。对每侧肢体，将临床严重程度评分为0(正常)至3(严重的炎症伴随变形)(Williams，R.O.，Feld-mann.M和Maini，R.N.(1992)Proc Natl Acad Sci USA89，9784-8；Thwin，M.M.，Douni，E.，Aidinis，V.，Kollias，G.，Kodama，K.，Sato，K.，Satish，R.L.，Mahendran，R.&Gopalakri-shnakone，P.(2004)Arthritis ResTher6，R282-94)。计算每个治疗组中临床观察每天的平均关节炎分值。腿被分离切片并如他处所述进行加工以用于组织学分析。(Bessis，N.，Guery，L.，Mantovani，A.，Vecchi，A.，Sims，J.E.，Fradelizi，D.&Boissier，M.C.(2000)Eur J Immunol 30，867-75)。每只爪切出大量的切片并且至少检查四个切片。用盲法评估在膝关节、踝关节和足部每个关节的损伤，如先前所述用4点划分法(0-3，其中0是正常以及3是严重)或者对滑膜炎(滑液增多，炎症细胞浸润)或者关节损伤(骨和软骨厚度、不规则性以及出现侵蚀)进行评估(Saidenberg-Kermanac′h，N.，Corrado，A.，Lemeiter，D.，deVernejoul，M.C.，Boissier，M.C.& Cohen-Solal，M.E.(2004)Bone 35，1200-7，Miellot，A.，Zhu，R.，Diem，S.，Boissier，M.C.，Herbelin，A.& Bessis，N.(2005)Eur J Immunol 35，3704-13)。

A.14.统计学分析。用StatView版本5.0软件完成所有的统计分析。方差分析被用于分析重复的测量，例如临床评分、患肢数量、增加体重、患病率。为了定量资料的比较，采用非参数Mann Whitney检验。使用Yates修正的卡方检验来比较定性数据。

B.实施例8至12的结果

实施例8：稳定的免疫原产品(hTNFαkinoid)的生物学特性

A.免疫生化特性

人TNFαkinoid是KLH-hTNFα杂络物，其在SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳中迁移为3条带，呈现的分子量(MW)为大约250、105和40kDa(图8-a)。相当大比例的kinoid不迁移并可见于积层胶水平。hTNFα和KLH都用特异抗体进行鉴定(图8-a)。

用¹²⁵I-标记的kinoid在KLH或者hTNFα上获得类似的迁移图，如图8-b所示。在superose 6凝胶过滤上分辨出4个峰。一个峰在排阻体积中而其它3个是分子量440、158和13.7kDa(图8-c)。

B.TNFα生物活性的缺失

当用标准的L929检验评估，即使在最高浓度(图8-d)下，Kinoid缺乏任何TNFα-诱导的细胞毒性。

尽管其令人如愿的缺乏生物活性，人TNFα-kinoid与hTNFα受体I(p55)和受体II(p75)都结合(图8-e)。

实施例9：在人TNFα转基因小鼠(TTg小鼠)中抗-TNFα抗体的诱导

在TTg小鼠中用TNFαkinoid免疫诱导高滴度的抗-TNFα抗体，然而用失活的TNFα或用对照KLH不能诱导任何可检测的抗-TNFα抗体。与此形成对照的是，在Balb/c小鼠中用kinoid或者失活的TNFα都诱导产生抗-TNFα抗体(图9-a)。在TTg和Balb/c小鼠中，KLH以及kinoid免疫导致产生抗-KLH抗体(未显示)。如用标准的L929细胞毒性试验所评估的，源于kinoid免疫的TTg小鼠的高稀释度的高度免疫血清，甚至在高稀释度也能中和TNFα的生物活性，然而来自于KLH免疫小鼠的血清无此效应(图9-b)。加强免疫后2-4周其活性达峰值，在3个月内显著下降(＞50％)(图9-c)并且阻断TNFαR1和R2受体的结合(图9-d)。抗-hTNFα抗体主要属于IgG1(52％)和IgG2a(48％)。当用同种型Elisa试剂盒检测时，IgG3、IgM和IgE的量可忽略不计。当用Biacore技术进行评估时，最后从高度免疫血清纯化的IgG显示出对KD范围从5×10^-8M至10^-10M的huTNFα的高亲和力，并且阻断hTNFα与其受体I和II的结合(图9-f)。这些结果解释了为什么在免疫的小鼠中不能检测到循环中的hTNFα，相反在未免疫小鼠中其以9pg/ml存在。

实施例10：稳定的免疫原产品(hTNFαkinoid)的安全性

在不同品系的小鼠(Balb/c；C57Bl/6；Swiss)、兔子或恒河猴中注射高剂量的TNFαkinoid(一直到100μg)不产生局部或系统的临床副作用。而且，虽然在D-半乳糖胺处理的C57Bl/6小鼠中施用天然hTNFα导致在24小时内(8只鼠中有8只)死亡，但hTNFαkinoid无此效应。此外，kinoid免疫不引发不良反应，其包括不希望产生的抗-TNFα细胞自身免疫应答以及对免疫的TTg小鼠的长期生长和存活的损害。

正如通过对T-细胞增殖和在细胞培养上清中细胞因子(IL-2和IFNγ)的产生进行的检测，来源于kinoid免疫的TTg小鼠的脾细胞体外培养不引发任何细胞介导的对自身hTNFα的免疫应答(图10(A、B、C)-a)。相反，kinoid免疫的Balb/c小鼠与对照的非免疫动物(未显示)比较，显示出显著的对异源hTNFα的细胞介导免疫。与对照比较在免疫的小鼠中没有检测到对鼠TNFα的细胞应答(图.10(A，B，C)-b)。最后，在免疫的TTg小鼠中，对KLH抗原有可比较的阳性T细胞应答，其等同于接受KLH的对照动物所观察到的，该应答不具有可检测到的临床效应(图10(A、B、C)-c)。

kinoid免疫小鼠(n＝8)的生长，当通过测量体重，与非免疫动物(n＝7)对照一直到免疫后50天是相当的，但在更晚的阶段变得明显更好(图11-a)。在免疫后120天处死的小鼠用于关节组织的组织学比较研究。更长时间的追踪其它组的TTg小鼠以便观察其关节炎的临床进程。在这些动物中，由于其关节炎的严重程度在第150天将对照鼠(n＝3)处死。相反3只hTNFα-kinoid免疫的TTg小鼠一直保持未患严重关节炎(现在已经超过210天)。

实施例11：通过中和稳定的免疫原产品(hTNFαkinoid)诱导的抗体预 防TNFα-半乳糖胺致死性休克。

腹膜内施用TNFα在半乳糖胺存在时可引发小鼠致死性休克。该效应是剂量依赖的。如表1所示，在C57Bl/6小鼠中该致死性休克在剂量为11μg时发生，并且在TTg小鼠中所记录的死亡剂量低至1μg。

所有的非接种的对照死亡，但用11μg hTNFα处理的hTNFα-kinoid免疫的C57Bl/6小鼠没有死亡(表6)。值得注意的是该免疫动物不但抵抗致死性休克，在临床上它们还保持健康。而且，间隔一个月重复注射hTNFα-半乳糖胺对其没有影响(未显示)。

重要的是，kinoid免疫的TTg小鼠，也抵抗hTNFα依赖的致死性休克，而对照TTg小鼠死亡(表6)。施用更高剂量的hTNFα(2μg)对hTNFαkinoid免疫的TTg小鼠没有影响(表6)。这些动物在经历重复的hTNFα冲击2周后存活下来并且至今保持完全健康。

在免疫的小鼠中对休克的防护是由于中和抗-TNFα抗体。然而在施用TNFα(11μg)-D-半乳糖胺1小时之后，接受非特异IgG(1mg)的对照C57Bl/6小鼠在24小时内死亡，给予特异的纯化多克隆IgG(其来源于高度免疫血清)的小鼠存活下来(P＜0.001相对于对照组)。在这些试验中，另外的对照分组和免疫小鼠在施用hTNFα后8小时被处死，肉眼器官检查显示对照中肝萎缩，但免疫的小鼠中无此现象(p＜0.02相对于对照)(表7)。

实施例12：用稳定的免疫原产品(hTNFαkinoid)免疫接种TTg小鼠保 护其不发生关节炎

用KLH/TNF-αkinoid免疫接种7周龄的TTg小鼠并且在120天的期限内进行监测。对照组由用KLH处理和用盐水处理的小鼠组成，都未影响关节炎的发生。所有对照小鼠患多关节炎，伴随炎症和关节变形(图11)，而kinoid免疫接种的小鼠仅患边缘关节疾病(p＜0.0001)(图4-c)，伴随临床征象开始的延迟(P＜0.05)、最高临床指数的低分值(p＜0.01)(表8)和显著减少的弥散性疾病以及少得多的患肢(P＜0.0001)(图11-b)。虽然所有动物发生临床的关节炎，该病仅在TNF-αkinoid免疫的组中逆转(图11-d)；在120天中，与对照组相反，处理组中的所有动物除一只以外均得到保护(表8)(P＜0.001)。

组织学评估显示经过处理的动物中炎症和关节损伤明显减少，其显示低组织学分值(p＜0.01)(表8)；相反，对照小鼠显示明显的关节炎迹象，伴随增殖性滑膜炎和单核及多形核细胞的细胞浸润，同时伴随软骨和骨侵蚀。在TNFα-kinoid处理的小鼠中组织学上的滑膜炎或破坏的发生显著减少(表8)。

表6.TNFα依赖的致死性休克：

给予对照和kinoid免疫的C57Bl/6和TTg小鼠最后的免疫加强之后10天在D-半乳糖胺存在下通过腹腔注射给与溶于0.1mlPBS的hTNFα

通过动物存活评估的致死性休克的预防24小时后仅在免疫小鼠中观察到。^*P＜0.01相对于对照(卡方检验)

	hTNFα(μg/鼠)	在24小时存活的小鼠(活的小鼠/总的小鼠)
						C57Bl/6		TTg
		对照	免疫的	对照	免疫的
						试验1试验2″″	11121	6/60/66/66/6	6/66/66/66/6	0/6未做未做0/6

表7.通过高度免疫IgG对TNFα依赖的休克的中和

在静脉注射蛋白质G纯化的小鼠IgG(来源于对照和kinoid免疫的C57Bl/6小鼠)之前30分钟，小鼠组通过腹腔注射接受溶于0.1ml PBS的D-半乳糖胺和hTNFα。^*P＜0.001相对于对照(卡方检验)P＜0.02(卡方检验)

	hTNFα(μg/小鼠)	在24小时存活的小鼠(活的小鼠/总的小鼠)	肝萎缩
				对照小鼠TNF-kinoid免疫的小鼠	1111		5/50/5

表8.在TNF-αkinoid(KLH-TNF)免疫接种的小鼠和在对照(KLH)小鼠中第120天时关节炎的临床和组织学分值。

通过组织学评估的炎症/损坏的发病率是炎症/损坏的分值≥0.5的小鼠的数目。Amax：关节炎临床最高分值。结果以平均数±SEM给出。^*p＜0.05相对于KLH，p＜0.01相对于KLH(Mann Whitney)；p＜0.001相对于KLH(卡方检验)

免疫	动物	临床评价			组织学
									KLHKLH-TNF	78	关节炎			炎症		损坏
开始(天)	Amax得分	患病率	得分	患病率	得分	患病率
								8.6±0.61.4±0.2			71	1.5±0.10.1±0.1	70	1.2±0.10.1±0.1	71

Claims (27)

1.用于制备抗-TNFα免疫原产品的方法，包括步骤：

a)提供含有TNFα的溶液；

b)向步骤a)的含有TNFα的溶液中加入EDTA；

c)向在步骤b)结束时获得的溶液中加入载体蛋白质；

d)向在步骤c)结束时获得的液体混合物中加入戊二醛；

e)从在步骤d)结束时获得的溶液中除去戊二醛以及TNFα和所述载体蛋白质的游离分子；

f)向在步骤e)结束时获得的溶液中加入甲醛，并在96小时至192小时时间范围内维持甲醛的存在；

g)向在步骤f)结束时获得的溶液中加入阻断与甲醛反应的试剂；以及

h)从在步骤h)结束时获得的溶液中除去甲醛和阻断试剂，从而获得含有上述抗-TNFα免疫原产品的溶液。

2.权利要求1的方法，其中步骤b)包括下列步骤：

b1)向含有步骤a)的TNFα的溶液中加入EDTA；以及

b2)向在步骤b1)结束时获得的溶液中加入DMSO。

3.根据权利要求1或2的任意一项的方法，其中步骤d)包括下列步骤：

d1)向在步骤c)结束时获得的液体混合物中加入戊二醛；以及

d2)向在步骤d1)结束时获得的TNFα和所述载体蛋白质之间的杂络物中加入EDTA。

4.根据权利要求1至3的任意一项的方法，其中在步骤a)TNFα的浓度范围从0.1mg/ml至50mg/ml。

5.根据权利要求1至3的任意一项的方法，其中在步骤a)TNFα的浓度范围从0.5mg/ml至10mg/ml。

6.根据权利要求1至5的任意一项的方法，其中在步骤b)EDTA的终浓度范围从1mM至500mM。

7.根据权利要求2至6的任意一项的方法，其中在步骤b2)DMSO的终浓度范围从0.5％v/v至20％v/v。

8.根据权利要求1至7的任意一项的方法，其中在步骤c)TNFα对所述载体蛋白质的摩尔比率的范围从5∶1至100∶1。

9.根据权利要求1至8的任意一项的方法，其中在步骤d)戊二醛的终浓度范围从0.05％w/w至0.5％w/w。

10.根据权利要求3至9的任意一项的方法，其中在步骤d2)EDTA的终浓度范围从1mM至10mM。

11.根据权利要求1至10的任意一项的方法，其中在步骤e)通过进行透析，通过应用渗滤的超滤或者通过正切流动过滤(TFF)除去戊二醛。

12.根据权利要求1至11的任意一项的方法，其中在步骤f)甲醛的终浓度范围从1％w/w至10％w/w。

13.根据权利要求1至12的任意一项的方法，其中在步骤f)甲醛的终浓度范围从2％w/w至5％w/w。

14.根据权利要求1至13的任意一项的方法，其中在步骤f)在从120小时至168小时的时间范围内维持甲醛的存在。

15.根据权利要求1至14的任意一项的方法，其中在步骤g)阻断试剂由甘氨酸组成。

16.根据权利要求15的方法，其中在步骤g)甘氨酸的终浓度范围从0.01M至10M。

17.根据权利要求15的方法，其中在步骤g)甘氨酸的终浓度范围从0.05M至2M。

18.根据权利要求1至14的任意一项的方法，其中在步骤g)阻断试剂由赖氨酸组成。

19.权利要求18的方法，其中在步骤g)赖氨酸的终浓度范围从0.01M至10M。

20.权利要求18的方法，其中在步骤g)赖氨酸的终浓度范围从0.05M至0.5M。

21.根据权利要求1至20的任意一项的方法，其中在步骤h)通过进行透析，通过应用渗滤的超滤或者通过正切流动过滤(TFF)除去甲醛和阻断试剂。

22.根据权利要求1至21的任意一项的方法，其中所述载体蛋白质选自由白喉类毒素(DT)及其突变体、破伤风毒素(TT)、匙孔槭血蓝素(KLH)、以及结核菌素的纯化蛋白质衍生物(PPD)、源于脑膜炎奈瑟氏球菌的OMPC、结核菌素的纯化蛋白质衍生物(PPD)、牛血清白蛋白(BSA)和流感嗜血杆菌来源的蛋白质D组成的组。

23.根据权利要求1至22的任意一项的方法，其中所述载体蛋白质由匙孔槭血蓝素(KLH)组成。

24.用于制备疫苗组合物的方法，包括步骤：

a)通过实施权利要求1至23的任意一项的方法制备抗-TNFα免疫原产品；以及

b)将在步骤a)制备的所述抗-TNFα免疫原产品与一种或多种免疫佐剂组合。

25.抗-TNFα免疫原产品，其具有一种或多种下列技术特征：

(i)其包括(a)通过少于40％的共价键和(b)通过超过60％的非共价键结合在一起的(1)TNF-α分子和(2)载体蛋白质分子；

(ii)其显示TNF-α对所述载体蛋白质的摩尔比率范围从40∶1至60∶1；

(iii)其诱导产生TNFα中和能力(NC₅₀)小于1/1000的抗-TNFα抗体；以及

(iv)在L929细胞毒性试验中，其具有大于50ng/ml和甚至大于400ng/ml的ED₅₀值。

26.免疫原组合物，包括(i)根据权利要求1至23的任意一项的方法制备的抗-TNFα免疫原产品，或(ii)根据权利要求25的抗-TNFα免疫原产品，与一种或多种可药用赋形剂组合。

27.疫苗组合物，包括(i)根据权利要求1至23的任意一项的方法制备的抗-TNFα免疫原产品，或(ii)根据权利要求25的抗-TNFα免疫原产品，与一种或多种免疫佐剂组合。