HK1119061A - 核酸構建體 - Google Patents
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Description
技术领域
本发明涉及分子生物学和免疫学领域，主要还涉及用于核酸免疫接种技术的试剂。更具体地，本发明涉及表达多肽，尤其是抗原多肽，特别是流感抗原的核酸构建体以及表达佐剂多肽的核酸构建体，还涉及使用这类试剂的核酸免疫接种方法。
背景技术
基因治疗和核酸免疫接种在治疗和预防获得性和遗传性疾病上是颇有发展前景的方法。这类技术能将所需核酸转移到受试者内，并随后在体内表达。转移可通过在体外转染来自受试者的细胞或组织，并将转化的材料再导入宿主中而完成。或者，可将核酸直接给药到受试者体内。
这其中的每种技术均要求核酸在转染细胞中高效表达，以提供足量的治疗性基因产物或抗原性基因产物。已知有几个因素影响到获得的表达水平，包括转染率，以及所研究基因或序列转录和mRNA翻译的效率。
本领域已描述了多种表达系统，每种表达系统一般都由含所研究基因或核苷酸序列的载体组成，该基因或核苷酸序列与表达调控序列有效连接。这类调控序列包括转录启动子序列和转录起始和终止序列。一般用于哺乳动物细胞表达系统的启动子包括SV40早期启动子、巨细胞病毒(CMV)启动子，如CMV立即早期启动子(Chapman et al(1991)Nucl.Acids Res.19：3979-3986)、小鼠乳腺癌病毒长末端重复(LTR)启动子、腺病毒主要晚期启动子(Ad MLP)以及单纯疱疹病毒(HSV)启动子等。通常也使用非病毒启动子，如来源于鼠金属硫蛋白基因的启动子。
表达系统通常包括转录调节元件，称为“增强子”。增强子被广义地定义为顺式作用序列(cis-acting agent)，它在同启动子/基因序列有效连接时，将会提高该基因序列的转录。增强子离所研究序列的有效作用距离比其他表达调控元件(如启动子)要远很多，并且可位于所研究序列的任何方向(Banerji et al.(1981)Cell 27：299-308，deVilleirs et al.(1981)Nucl.Acids Res.9：6251-6264)。增强子已从多种病毒源中被识别出来，包括多瘤病毒(polyoma virus)、BK病毒、巨细胞病毒(CMV)、腺病毒、猿猴病毒40(simian virus 40，SV40)、莫洛尼肉瘤病毒(Moloney sarcoma virus)、牛乳头状瘤病毒(bovine papilloma virus)和劳氏肉瘤病毒(Rous sarcomavirus)(deVilleirs et al同上，Rosenthal et al.(1983)Science222：749-755，Hearing et al.(1983)Cell 33：695-703，Weeks et al.(1983)Mol.Cell.Biol.3：1222-1234，Levinson et al.(1982)Nature295：568-572，和Luciw et al.(1983)Cell 33：705-716)。
许多用于核酸免疫接种和基因治疗的表达系统均使用hCMV立即早期启动子。见如授权予Stinski的美国专利No.5168062和5385839，和欧洲专利说明书0323997B1。使用hCMV立即早期启动子的表达载体包括例如pWRG7128(Roy et al，Vaccine ，764-778，2001)和pBC12/CMV和pJW4303(在WO95/20660中提及)。上述的Chapman et al(1991)已报道：不含hCMV内含子A时，hCMV立即早期启动子表达水平降低。
发明内容
使用可操纵的病毒启动子/表达序列已开发出一种核酸构建体，所述核酸构建体使宿主细胞中的异源编码序列表达得以提高。该构建体适合高效表达基因，尤其是抗原编码基因，因此可用于核酸免疫接种。该构建体还可用于表达佐剂多肽。可将该构建体提供到载体颗粒，用于颗粒介导的核酸免疫接种。在本发明的一个特别优选的实施方案中，该构建体编码流感抗原、其免疫原性片段或两者的免疫原性变体。在又一特别优选的实施方案中，该构建体编码佐剂多肽。
因此，本发明提供一种核酸构建体，所述核酸构建体适合送递给受试者以诱导针对流感病毒血凝素(HA)抗原的免疫应答，所述构建体包含：
(i)嵌合启动子序列，包含：
(a)hCMV立即早期启动子序列；
(b)hCMV主要立即早期基因的外显子1和至少一部分外显子2；和
(c)异源内含子，来置换hCMV主要立即早期基因的内含子A区域；
(ii)与嵌合启动子有效连接的编码序列，其中所述编码序列编码流感病毒血凝素(HA)抗原、其免疫原性片段或者所述抗原或片段的免疫原性变体，所述变体与所述抗原或片段具有至少80％的氨基酸同源性；
(iii)非翻译前导序列，所述非翻译前导序列来源于HBV preS2抗原序列、HBV e-抗原序列或HSV型2gD抗原序列，并与所述嵌合启动子有效连接；以及
(iv)增强子序列，所述增强子序列来源于HBsAg序列的3′非翻译区(UTR)或猿CMV立即早期基因序列的3′UTR，与所述嵌合启动子有效连接，并位于编码序列下游。
本发明还提供了一种核酸构建体，所述核酸构建体适合送递给受试者以诱导针对流感病毒血凝素(HA)抗原的免疫应答，所述构建体包含：
(i)嵌合启动子序列，包含：
(a)hCMV立即早期启动子序列；
(b)所述hCMV主要立即早期基因的外显子1和至少一部分外显子2；和
(c)异源内含子，来置换hCMV主要立即早期基因的内含子A区域；和
(ii)与所述嵌合启动子有效连接的编码序列，其中，所述编码序列编码流感病毒血凝素(HA)抗原、其免疫原性片段或所述抗原或片段的免疫原性变体，所述变体与所述抗原或片段具有至少80％的氨基酸同源性。
另外，本发明提供了一种核酸构建体，所述核酸构建体含有嵌合启动子序列和用于插入有效连接嵌合启动子的编码序列的克隆位点，其中所述嵌合启动子序列包含：
(a)hCMV立即早期启动子序列；
(b)hCMV主要立即早期基因的外显子1和至少一部分外显子2；和
(c)异源内含子，来置换hCMV主要立即早期基因的内含子A区域。
在优选的实例下，所述构建体包含插入克隆位点的编码序列。因此，编码序列可提供于克隆位点。
在又一优选的实施方案中，本发明的构建体还可包含：
(a)非翻译前导序列，来源于HBV preS2抗原序列、HBV e-抗原序列或HSV型2gD抗原序列，并与嵌合启动子有效连接；和/或
(b)增强子序列，来源于HBsAg序列的3′非翻译区(UTR)，或猿CMV立即早期基因序列的3′UTR，并与嵌合启动子有效连接，并且所述增强子序列位于克隆位点的下游。
本发明还提供了一种核酸构建体，所述核酸构建体包含启动子序列和有效连接所述启动子的编码序列，其中所述构建体还包含：
(a)非翻译前导序列，来源于HBV preS2抗原序列、HBV e-抗原序列或HSV型2gD抗原序列，并与编码序列和启动子有效连接，所述启动子对所述编码序列是异源的；和/或
(b)增强子序列，位于所述编码序列的3’端并与之有效连接，其中所述增强子序列来源于HBsAg序列的3′UTR或猿CMV立即早期基因序列的3′UTR，并且所述编码序列对3’端增强子序列是异源的。
本发明还提供了一种核酸构建体，包含：
(i)嵌合启动子序列，包含：
(a)hCMV立即早期启动子序列；
(b)hCMV主要立即早期基因的外显子1和至少一部分外显子2；和
(c)异源内含子，来置换hCMV主要立即早期基因的内含子A区域；和
(ii)用于插入与所述嵌合启动子有效连接的编码序列的克隆位点；和
(iii)(a)非翻译前导序列，来源于HBV preS2抗原序列、HBV e-抗原序列或HSV型2gD抗原序列，并与嵌合启动子有效连接；和/或
(b)增强子序列，来源于HBsAg序列的3’非翻译区(UTR)，或猿CMV立即早期基因序列的3′UTR，并与嵌合启动子有效连接，其中所述增强子序列位于克隆位点的下游。
本发明还提供了一种核酸构建体，包含：
(i)启动子序列；
(ii)非翻译前导序列，来源于HBV preS2抗原序列、HBV e-抗原序列或HSV型2 gD抗原序列；和
(iii)编码序列，有效连接至(i)和(ii)
其中所述编码序列对所述非翻译前导序列是异源的。
本发明还提供了一种核酸构建体，包含：
(i)启动子序列；
(ii)编码序列，有效连接至所述启动子序列(i)；和
(iii)增强子序列，位于所述编码序列(ii)的3’端并与之有效连接；
其中所述增强子序列(iii)来源于HBsAg序列的3’UTR或猿CMV立即早期基因序列的3’UTR，并且所述编码序列(ii)对所述3’增强子序列是异源的。
本发明还提供了一种核酸构建体，包含启动子序列和与所述启动子有效连接的编码序列，其中所述构建体还含有：
(a)非翻译前导序列，来源于HBV preS2抗原序列、HBV e-抗原序列或HSV型2gD抗原序列，与所述编码序列和启动子有效连接，所述启动子对所述编码序列是异源的；和/或
(b)增强子序列，位于所述编码序列的3’端并与之有效连接，其中所述增强子序列来源于HBsAg序列的3’UTR或猿CMV立即早期基因序列的3’UTR，并且所述编码序列对所述3’增强子序列是异源的。
本发明另外提供了一群核酸构建体，其中该群包含本发明的至少两种不同的构建体。
在另一实例中，本发明提供了一种经纯化分离的嵌合启动子序列，包含：
(a)hCMV立即早期启动子序列；
(b)hCMV主要立即早期基因的外显子1和至少一部分外显子2；和
(c)异源内含子，来置换hCMV主要立即早期基因的内含子A区域。
本发明还提供了
—一种在哺乳动物细胞中表达所研究多肽的方法，该方法包括将本发明的一种核酸构建体、一群核酸构建体或包被颗粒转移到所述细胞中；
—适合于由颗粒介导的送递装置送递的包被颗粒，该包被颗粒包括由本发明的核酸构建体包被的载体颗粒，该构建体包括编码所述多肽的编码序列；
—用于颗粒介导的送递装置的剂量容器，包含所述包被颗粒；
—一种负载有所述包被颗粒的颗粒介导的送递装置；
—一种核酸免疫接种的方法，包括给予受试者有效量本发明的包被颗粒；
—一种药物组合物，包含本发明的一种核酸构建体或本发明的一群核酸构建体以及可药用载体或赋形剂；
—一种疫苗组合物，包含本发明的一种核酸构建体或本发明的一群核酸构建体或本发明的包被颗粒。
还提供了本发明的一种核酸构建体或本发明的一群核酸构建体或本发明的包被颗粒用于制备用于核酸免疫接种的药物中的用途。
在考虑本文公开内容的情况下，本发明的这些和其他主题、方面、实施方案和优点对于本领域的普通技术人员而言是显而易见的。
附图说明
图1示出使用多种质粒表达载体获得的乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)的表达水平。
图2示出加入内含子对SCC15细胞中HBsAg和B16细胞中β-gal表达的影响(三次实验的平均值)。
图3示出大鼠胰岛素内含子A和HBV3′UTR对SCC15细胞中β-gal表达的影响(三次实验的平均值)。
图4示出大鼠胰岛素内含子A和HBV3′UTR对SCC15细胞中HSVgD表达的影响(三次实验的平均值)。
图5示出大鼠胰岛素内含子A和HBV3′UTR对SCC15和B16细胞中SEAP表达的影响(每个细胞系重复三次)。
图6示出异源信号肽指导B16细胞中SEAP或hFc片段分泌的能力。
图7示出使用包含于多种质粒表达载体的抗原编码核酸免疫接种的小鼠血清中检测到的抗体水平。
图8是pPJV表达载体的示意图。
图9是pPJV7 389的示意图。
图10是pPJV7400的示意图。
图11是pPJV7468的示意图。
图12是pPJV7563的示意图。
图13列出pPJV7563的碱基组成。
图14提供了质粒pPJV7563和pPJV1671的衍化流程图。
图15提供了在构建pPJV1671中关键质粒的图谱。
图16提供了pPJV1671的特征图谱，并提供了天然H3 Panama HA抗原和pPJV 1671编码的H3 Panama HA抗原的N端序列的序列比较。
图17示出用pPJV1671接种的猪中血凝抑制抗体滴度。
图18示出将pPJV1671以颗粒介导的表皮送递形式送递给人后的局部皮肤反应。
图19示出用基于PMED的三价疫苗进行免的猪中的血凝抑制抗体滴度。示出两种PMED装置的特异性针对H3、H1和B病毒的HI滴度。
图20为pPML7789的示意图。
图21示出pPML7789的标注序列。
图22为pPJV2012的示意图。
图23为构建pPJV2012的流程图。
图24提供了pPJV2012的标注序列。
图25为载体pPJV7788的示意图。
图26为示出限制性酶切位点的载体pPJV7788的示意图。
图27为pICP27的示意图。
图28为以pICP27的核苷酸序列为基础、来自HSV-2 MS毒株的ICP27的氨基酸序列(SEQ ID NO：65)。HSV-2毒株MS(天冬酰胺＝N)和毒株HG52(赖氨酸)的已公开ICP27序列之间的单个氨基酸差异表示为粗体。被鉴定为HSV-2毒株MS中的推定CD8表位的序列带有下划线。
图29示出在Balb/c小鼠中鉴定显性ICP27表位。A：使用实施例22所述的各个肽池(C1-C12，R1-R6)，对来自HSV-2感染的Balb/c小鼠的脾脏(S)和淋巴结(N)细胞(分别为BS和BN)以及来自HSV-2感染的C57BL/6小鼠的脾脏和淋巴结细胞(CS和CN)的IFN-γ ELISPOT活性进行分析。将5×105个细胞接种于每个孔中，结果表示为阴性(空白方块)、弱应答(＜25 ELISPOT/孔，灰色方块)或强应答(＞25 ELISPOT/孔，黑色方块)。B：由Balb/c小鼠的细胞识别的两个肽序列(SEQ ID NOS：66和67)，突出显示的是可能的HSV-2 Dd表位(粗体)，并且有一个区域(带有下划线)对应之前鉴定的HSV-1表位(Banks et al，J.Virol.67，613-616，1993)。
图30表示使用IFN-γ ELISPOT分析表征针对ICP27的Balb/c应答。使用由ICP27的全部肽制备的肽池(肽池)或者个别肽HGPSLYRTF(P1，SEQID NO：68)和LYRTFAANPRA(P2，SEQ ID NO：69)对被感染的Balb/c小鼠的脾细胞的IFN-γ ELISPOT活性进行分析。将5×105个细胞接种于每个孔中，结果表示为ELISPOT数目/孔。另外，如实施例22所述，将等份试样的脾细胞样本用磁珠处理以除去CD8+细胞样本。使用由ICP27的全部肽制备的肽池(肽池)对原始样本(+CD8)和处理样本(-CD8)的IFN-γ ELISPOT活性进行分析。
图31示出HSV-2攻击保护性和ICP-27特异性细胞因子产生之间的相关性。各组的16只小鼠均进行了初次和加强PMED DNA免疫接种，所述免疫接种由具有和不具有CT DEI载体pPJV2013(双A+B亚基)或亚基LT DEI载体pPJV2012(双A+B)的pICP27 DNA疫苗组成。pICP27与DEI载体的比例为9∶1。图A：攻击后的存活数据。每组中有一半的动物在第二次免疫接种后两周用50 LD50的HSV-2进行攻击。图B和C：分别为各组中ICP-27特异性IFN-γ和TNF-α的产生情况。同时处死剩下的动物并收集脾细胞用于使用微量样本多指标流式蛋白定量技术(cytometric bead array)试剂盒对ICP-27特异性细胞因子的产生 情况进行测量。
图32示出IFN-γ和TNF-α在HSV-2致命攻击—发病率评估中的保护作用。将各组的4只小鼠用伴有(4个组)或不伴有(1个组)pPJV2 012双A+B LT DEI载体的pICP27 PMED DNA疫苗进行初次和加强免疫接种。pICP27与DEI载体的比率为9∶1。两周后通过鼻内途径用50 LD50HSV-2对动物进行攻击。为了除去T细胞，如实施例22所述，从病毒攻击起算的第-2、0、2、4、6和8天腹膜内注射给小鼠含200μg特异性针对IFN-γ和/或TNF-α的单克隆抗体的注射液。就死亡率(存活百分率)和发病率对动物进行监控，并根据如下列表按0至4的标准进行评分：4，健康；3，毛皮发抖，打喷嚏；2，眼部或臀部酸痛，活动减少；1，弓起背部，几乎不活动；0，死亡。
图33示出T细胞群在HSV-2致命攻击中的保护作用。对五组每组4只的小鼠用伴有(+LT，4个组)或不伴有(-LT，1个组)pPJV2012双A+BLT DEI载体的pICP27 PMED DNA疫苗进行初次和加强免疫接种。pICP27与DEI载体的比率为9∶1。两周后，通过鼻内途径用50 LD50HSV-2对动物进行攻击。ICP27+LT DEI免疫接种的动物中有三组从病毒攻击起算的第-2和0天通过腹膜内注射90μg αCD4和/或αCD8-特异性单克隆抗体进行处理。为使得仅有pICP27组(表示为-LT)与pICP27+LT组的总DNA相等，在仅有pICP27组中加入空载体。
序列说明
SEQ ID NO：1是hCMV立即早期启动子序列(GenBank#M60321，X17403)
SEQ ID NO：2是hCMV主要立即早期基因的外显子1和2的序列(GenBank#M60321，X17403)
SEQ ID NO：3是大鼠胰岛素内含子A的序列(GenBank#J00748)
SEQ ID NO：4是本发明的嵌合启动子的序列
SEQ ID NO：5是HBV preS2抗原5′UTR序列的前导序列(GenBank#M54923)
SEQ ID NO：6是HSV型2gD 5′UTR序列的前导序列(GenBank#Z86099)
SEQ ID NO：7是HBV e抗原5′UTR序列的前导序列(GenBank#M54923)
SEQ ID NO：8是HBVenh 3′UTR的序列(GenBank#AF143308)
SEQ ID NO：9是猿立即早期基因3′UTR的序列(GenBank#M16019)
SEQ ID NO：10是兔珠蛋白的聚腺苷酸序列(GenBank#K03256)
SEQ ID NO：11是猿sCMV立即早期基因的聚腺苷酸序列(GenBank#M16019)
SEQ ID NO：12是HSV2 gB基因的聚腺苷酸序列(GenBank#Z86099)
SEQ ID NO：13是HPV16早期基因的聚腺苷酸序列(GenBank#K02718)。
SEQ ID NO：14是pPJV表达载体的序列
SEQ ID NO：15是PCR引物JF93
SEQ ID NO：16是PCR引物F110
SEQ ID NO：17是PCR引物GW1
SEQ ID NO：18是PCR引物JF254
SEQ ID NO：19是PCR引物GW150
SEQ ID NO：20是PCR引物JF255
SEQ ID NO：21是PCR引物DS1
SEQ ID NO：22是PCR引物DA1
SEQ ID NO：23是PCR引物JF301
SEQ ID NO：24是PCR引物JF302
SEQ ID NO：25是PCR引物JF84
SEQ ID NO：26是PCR引物JF225
SEQ ID NO：27是PCR引物JF335
SEQ ID NO：28是PCR引物JF336
SEQ ID NO：29是PCR引物JF357
SEQ ID NO：30是PCR引物JF365
SEQ ID NO：31是PCR引物JF393
SEQ ID NO：32是PCR引物JF406
SEQ ID NO：33是PCR引物JF256
SEQ ID NO：34是PCR引物JF257
SEQ ID NO：35是PCR引物JF320
SEQ ID NO：36是PCR引物JF321
SEQ ID NO：37是PCR引物JF386
SEQ ID NO：38是PCR引物FcAS
SEQ ID NO：39是寡核苷酸JF354
SEQ ID NO：40是PCR引物JF355
SEQ ID NO：41是PCR引物JF356
SEQ ID NO：42是寡核苷酸JF348
SEQ ID NO：43是PCR引物JF349
SEQ ID NO：44是PCR引物JF350
SEQ ID NO：45是寡核苷酸JF351
SEQ ID NO：46是PCR引物JF352
SEQ ID NO：47是PCR引物JF353
SEQ ID NO：48是PCR引物JF430
SEQ ID NO：49是PCR引物JF442
SEQ ID NO：50是PCR引物JF421
SEQ ID NO：51是PCR引物JF444
SEQ ID NO：52是伪狂犬病病毒(PRV)启动子序列。
SEQ ID NO：53是劳氏肉瘤病毒(RSV)启动子序列。
SEQ ID NO：54提供了pPJV1671载体的核苷酸序列和所编码的H3N2 HA抗原的氨基酸序列。
SEQ ID NO：55公提供了由pPJV1671编码的H3N2 HA抗原的氨基酸序列。
SEQ ID NO：56提供了H3 panama HA抗原的天然N端氨基酸序列。
SEQ ID NO：57提供了由pPJV1671编码的H3 Pananama HA抗原的N端氨基酸序列。
SEQ ID NO：58提供了序列SEQ ID No.56和57的共有序列。
SEQ ID NO：59提供了pPML7789载体的核苷酸序列和VN1194H5抗原的氨基酸序列。
SEQ ID NO：60仅提供了VN1194H5抗原的氨基酸序列。
SEQ ID NO：61提供了pPJV2012载体的核苷酸序列。
SEQ ID NO：62提供了PJV7788载体的核苷酸序列。
SEQ ID NO：63和64为在实施例22中用来扩增HSV-2 MS毒株中DNA的5’和3’引物。
SEQ ID NO：65为实施例22中以pICP27的核苷酸序列为基础的HSV-2 MS毒株的ICP27的氨基酸序列。
SEQ ID NO：66和67为实施例22中被Balb/c小鼠的细胞识别的肽45和46。
SEQ ID NO：68为肽45和46中含有的9个氨基酸的同源序列。
SEQ ID NO：69和70为HSV-2 ICP27和HSV-1 ICP27有一个氨基酸不同的氨基酸区域。
具体实施方式
在详细描述本发明前，应该理解的是：本发明并不限定于特别示例的分子或者方法参数，因其毫无疑问地可有多种变化形式。同样应该理解的是：本文所用术语只是出于描述本发明具体实施方案的目的，而非意在限制。另外，若无另外指出，本发明的实施将采用病毒学、微生物学、分子生物学、重组DNA技术和免疫学中的常规方法，所有这些方法为本领域普通技术人员所熟知。这些技术在文献中有完整的描述，见如Sambrook等人编著的《分子克隆：实验室手册》(第二版，1989)(Sambrook，et al.，Molecular Cloning：A Labora tory Manual(2nd Edit ion，1989))，《DNA克隆：一种实验方法》第I卷和II卷(DNA Cloning：A Practical Approach，vol.I&II(D.Glover，ed.))，《寡核苷酸合成》(Oligonucleotide Synthesis(N.Gait，ed.，1984))，《分子克隆实验指南》(A Practical Guide to Molecular Cloning(1984))和《基础病毒学》第二版第I卷和II卷(Fundamental Virology，2nd Edition，vol.I&II(B.N.Fields and D.M.Knipe，eds.))。
本文所引用的全部出版物、专利和专利申请，不管是上文还是下文，均在此通过引用全文纳入本说明书中。
必须注意的是：如在说明书和所附权利要求书中使用的，单数形式的“一”、“一种”和“该”包括复数指代对象，除非上下文中另外明确指出。
在其中具体试剂被明确指明包含具体单位的情况下，在优选的情况下，该药剂可基本由这些单位组成。
A.定义
若无另外定义，本文所使用的所有技术和科学术语具有本发明所属技术领域普通技术人员通常理解的相同含义。尽管许多与本文所描述的相似或等同的方法和材料可用来实施本发明，但本文只描述了优选的材料和方法。
在描述本发明中将使用如下术语，并被定义为具有如下含义。
本文所使用的术语“核酸免疫接种”用来指将编码一个或多个所选抗原或多肽的核酸分子导入宿主细胞中，以实现一种或多种抗原在体内表达。核酸分子可直接导入接受受试者，如通过标准的肌内注射或皮内注射、透皮颗粒送递、吸入、局部给药、或通过口服、鼻内或粘膜方式给药。具体而言，核酸可通过经皮颗粒送递给药。或者，分子也可在体外导入从受试者取出的细胞中。在后一种情况下，含有所研究核酸分子的细胞被重新导入受试者，这样针对该核酸分子所编码的抗原的免疫应答得以启动。在该免疫接种中所使用的核酸分子在本文中一般称为“核酸疫苗”。本文所提及的任何核酸可存在于这类疫苗中，具体而言，可存在本文提及的核酸构建体。
术语“佐剂”是指能特异性或非特异性改变、提高、引导、再引导、增强或启动抗原特异的免疫应答的物质或组合物。因此，佐剂和抗原的共同给药能使给予抗原的受试者获得所需免疫应答必需的抗原剂量降低或减少，或者，共同给药能在受试者内产生在定性和/或定量上不同的免疫应答。具体而言，佐剂的给予能增强免疫应答，如增大强度和/或延长持续时间之一。通过以下方法测定佐剂的效果：将佐剂和疫苗组合物，以及疫苗组合物本身给予动物，并且通过使用标准检测方法如放射免疫法、ELISA和CTL分析，比较两组中的抗体和/或细胞介导的免疫性。本发明的构建体可表达一种或多种佐剂多肽。
“核心载体”是指被客体核酸(guest nucleic acid)(如DNA、RNA)包被的载体，目的是为了给予规定的颗粒大小和足够高的密度，以获得穿入细胞膜所需的动量，以使客体分子可使用颗粒介导的技术送递(参见如美国专利No.5,100,792)。核心载体一般包括诸如钨、金、铂、铁氧体、聚苯乙烯和乳胶等的物质。见如《基因转移的粒子轰击技术》(Particle BombardmentTechnology for Gene Transfer，(1994)Yang，N.ed.，Oxford UniversityPress，New York，NY pages 10-11)。
“无针注射器”是指一种仪器，它不借助于常规的注射针来穿刺皮肤就能透皮送递微粒组合物。本发明所使用的无针注射器会在本文中详细说明。
术语“透皮”送递是指皮内(如进入真皮或表皮)、透皮(如“经皮”)和跨粘膜给药，如，通过将试剂注入或穿过皮肤或粘膜组织送递。参见例如Transdermal Drug Delivery：Developmental Issues and ResearchInitiatives，Hadgraft and Guy(eds.)，Marcel Dekker，Inc.，(1989)；Controlled Drug Delivery：Fundamentals and Applications，Robinson andLee(eds.)，Marcel Dekker Inc.，(1987)；和Transdermal Delivery of Drugs，Vols.1-3，Kydonieus and Berner(eds.)，CRC Press，(1987)。因此，本术语包括由无针注射器送递(在美国专利No.5,630,796中描述)和颗粒介导的送递(在美国专利No.5,865,796中描述)。
“多肽”在最广义上被用来指两个或多个亚基氨基酸、氨基酸类似物，或其它假肽(peptidomimetics)的化合物。该亚基可通过肽键或其它键，如脂键、醚键等连接。在本文中使用的术语“氨基酸”指天然的和/或非天然的或合成的氨基酸，包括甘氨酸和D型或L型两种旋光异构体，和氨基酸类似物和假肽。如果肽链较短，三个或多个氨基酸的肽通常被称为寡肽。如果肽链较长，该肽通常被称为多肽或蛋白质。
“抗原”指任何物质，一般指大分子，它能在个体中引发免疫应答。该术语可用来指单个大分子或指一群同质或异质的抗原大分子。本文中使用的“抗原”一般用来指包含一个或多个表位的蛋白分子或其一部分。例如，“抗原”可包含天然存在的多肽、其具有免疫原性的片段或者两者保留免疫原性的变体。在一个优选的实例中，指的是片段或变体，所形成的免疫应答优选能识别衍生出该片段或变体的原始多肽。
基于本发明的目的，抗原可从任何合适的来源中获得或得到。基于本发明的目的，“抗原”包括经修饰的蛋白，所述修饰如天然序列的缺失、插入和置换(一般在本质上是保守的)，只要蛋白保持足够的免疫原性。这些修饰可是刻意的，如通过定向诱变，或者也可是偶然的，如通过产生抗原的宿主的突变。在本发明的一个特别优选的实施方案中，所采用或编码的抗原可为流感抗原、流感抗原的免疫原性片段或两者的免疫原性变体。
针对所研究抗原的“免疫应答”是在个体中产生针对该抗原的体液和/或细胞免疫应答。基于本发明的目的，“体液免疫应答”是指由抗体分子介导的免疫应答，而“细胞免疫应答”是指由T-淋巴细胞和/或其它白细胞介导的免疫应答。
术语“核酸分子”和“多核苷酸”在本文中互换使用，指任何长度的核苷酸(脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸，或其类似物)的聚合形式。多核苷酸可具有任何三维结构，并可发挥任何已知或未知的功能。多核苷酸的非限制性实例包括基因、基因片段、外显子、内含子、信使RNA(mRNA)、转移RNA，核糖体RNA、核酶、cDNA、重组多核苷酸、分枝多核苷酸、质粒、载体、任何序列的分离DNA、任何序列的分离RNA、核酸探针和引物。
多核苷酸一般由四种核苷酸碱基(腺嘌呤(A)，胞嘧啶(C)，鸟嘌呤(G)，和胸腺嘧啶(T)(当多核苷酸是RNA时以尿嘧啶(U)代替胸腺嘧啶(T)))的特定序列组成。因此，术语核酸序列是多核苷酸分子的字母表示。这种字母表示可输入具有中央处理单元的计算机的数据库中，用于生物信息学应用，如功能基因组学和同源性查询。
“载体”能将核酸序列转移到靶细胞，如病毒载体、非病毒载体、微粒载体和脂质体。靶细胞可为原核细胞或真核细胞。一般地，“载体构建体”、“表达载体”和“基因转移载体”指任何能指导所研究基因的表达的核酸构建体，它可将基因序列转移至靶细胞。因此，该术语包括克隆载体和表达载体以及病毒载体。“质粒”是染色体外的遗传因子形式的载体。
“编码”所选抗原的核酸序列是指在合适的调节序列的调控下，在体内或体外转录(在DNA的情况下)和翻译(在mRNA的情况下)成为多肽的核酸分子。编码序列的边界由5’端(氨基端)的起始密码子和3’端(羧基端)的翻译终止密码子决定。基于本发明的目的，这些核酸序列包括，但不限于病毒cDNA、原核或真核mRNA、病毒基因组序列或原核DNA或RNA，甚至还包括合成DNA序列。转录终止序列可位于编码序列的3’端。
在某些情况下，转录序列可产生多个多肽，例如转录物可包含多个可译框架(ORF)，还包含一个或多个内部核糖体进入位点(IRES)，使得第一个ORF后的ORF可被翻译。可翻译转录物以产生一个多肽，该多肽随后会被剪切以形成多个多肽。在某些情况下，核酸构建体可产生多个转录物，由此产生多个多肽。
“启动子”是启动和调节编码多肽的多核苷酸的转录的核苷酸序列。启动子包括诱导型启动子(与启动子有效连接的多核苷酸序列的表达被分析物、辅助因子、调节蛋白等诱导)、阻抑型启动子(与启动子有效连接的多核苷酸序列的表达被分析物、辅助因子、调节蛋白等阻抑)、和组成型启动子。术语“启动子”或“调控元件”包括全长启动子区和这些区域的功能(如调控转录或翻译)区段。
“有效连接”指元件的排列，其中以该术语描述的组分被装配以执行其一般功能。因此，与核酸序列有效连接的指定启动子在恰当的酶存在时能影响该序列的表达。启动子无需与该序列毗邻，只要其能指导该序列表达即可。因此例如，间隔的非翻译但被转录的序列可出现在启动子序列和核酸序列间，并且启动子序列仍然被认为与编码序列“有效连接”。
本文中“重组”是用来描述基因组、cDNA、半合成或合成来源的核酸分子(多核苷酸)，根据其来源或操作方法，该核酸分子不与自然状态下与其连接的全部或部分多核苷酸连接，和/或与自然状态下不与其连接的多核苷酸连接。单个重组核酸分子中的两个核酸序列自然状态下一般彼此没有关联时，它们相对于彼此而言是“异源的”。
本文提到了多核苷酸的同源物。一般地，与另一多核苷酸同源的多核苷酸至少与该多核苷酸70％同源，优选至少75％、80％或90％，并更优选至少与其95％、97％或99％同源。检测同源性的方法为本领域所熟知，并且本领域普通技术人员应该理解的是：在本文上下文中，同源性是以核酸的同一性为基础来计算的。该同源性可存在于至少15个，优选至少30个，比如至少40个、60个或100个或更多个连续核苷酸的区域。同源区域可包含至少150个，优选至少200个，更优选至少300个核苷酸。同源区域可涉及与本发明核酸构建体相关的本文所提及的任何元件。在某些情况下，同源区域可包括待研究的全部区域，例如，可包括本文特别指出的任何元件的全部区域。
氨基酸同源性的水平与上述核苷酸同源性相关水平相当。因此，任何上述同源性水平可用于氨基酸水平。例如，氨基酸水平的同源性可跨越至少15个，优选至少25个，更优选至少50个，再更优选至少75个，甚至更优选跨越至少1 00个氨基酸。同源区可跨越待研究元件的全长。
检测多核苷酸的同源性或同一性的方法已为本领域所熟知。如，UWGCG程序包提供了BESTFIT程序，它可用于计算同源性(如以默认设置使用)(Devereux et al(1984)Nucleic Acids Research 12，p387-395)。
PILEUP和BLAST算法也可用于计算同源性或比对序列(一般以默认设置)，如在Altschul S.F.(1993)J Mol Evol 36：290-300；Altschul，S，F et al(1990)J Mol Biol 215：403-10中描述。
执行BLAST分析的软件通过美国国家生物技术信息中心(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)可公开获得。该算法首先要识别高比值序列对(high scoring sequence pair，HSP)，这通过识别待查询的序列中长度为W的短字段实现，该字段在与数据库序列中相同长度的字段比对时，匹配或满足某些正值的阈得分T。T指相邻字段得分阈(Altschul et al，同上)。这些最初的相邻字段命中结果作为开始检索的种子，以查找含有它们的HSP。字段命中结果沿每个序列的两个方向延伸，使累积比对得分尽量增加。出现以下情形即停止字段命中结果沿两个方向的延伸：当累积比对得分为零或小于零时，这是由于一个或多个负分残基比对的累积；或到达了任一序列的末端。BLAST算法参数W、T和X决定了比对的灵敏度和速度。BLAST程序使用默认值：字段长度(W)为11，BLOSUM62得分矩阵(见Henikoff and Henikoff(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：10915-10919)比对值(B)为50，期望值(E)为10，M＝5，N＝4，两条链比较。
BLAST算法进行两个序列间相似性的统计分析，见如Karlin和Altschul(1993)Proc.Natl，Acad.Sci.USA 90：5873-5787。由BLAST算法提供的相似性的一个量度是最小和概率(smallest sum probability(P(N)))，它提供了两个核苷酸或氨基酸序列之间随机出现匹配的概率的指标。例如，若一个序列和另一个序列相比较时，最小和概率小于大约1，优选小于大约0.1，更优选小于大约0.01，最优选小于大约0.001，则第一个序列被认为同第二个序列是相似的。
同源物一般与相关的多核苷酸以显著高于本底的水平杂交。由同源物和多核苷酸间的相互作用所形成的信号水平一般为“本底杂交”的至少10倍，优选至少100倍。相互作用的强度可使用诸如放射性标记如32P的探针来检测。选择性杂交一般通过使用中度到高度严格条件(例如大约50℃到大约60℃、0.03M氯化钠和0.003M柠檬酸钠)来实现。
严格杂交条件可包括50％甲酰胺、5×Denhardt溶液、5×SSC、0.1％SDS和100μg/ml变性鲑精DNA，洗涤条件可包括在37℃下2×SSC，0.1％SDS洗涤，随后在68℃下1×SSC，0.1％SDS洗涤。确定的合适的杂交条件已为本领域普通技术人员所熟知，见如Sambrook，et al.，同上。
同源物与一个序列的不同可在于在相关多核苷酸中少于3、5、10、15、20或更多个突变(每一种均可为置换、重复、缺失或插入)。这些突变可在同源物的至少30，比如至少40、60或100或更多个连续核苷酸的区域测定。在某些情况下，突变可在同源物的全部区域进行测量。在多核苷酸编码多肽时，优选地，置换在所编码的氨基酸中形成“保守”变化。保守变化根据下表定义。在保守变化中，第二列的同一方格中的氨基酸，优选第三列的同一行的氨基酸彼此置换。
表1
| 脂肪族 | 非极性 | GAP |
| ILV | ||
| 极性-不带电 | CSTM | |
| NQ | ||
| 极性-带电 | DE | |
| KR | ||
| 芳香族 | HFWY |
术语“片段”指的是较大实体的一个较小部分。本文提及的具体元件的片段可用于本发明。具体而言，这些片段保留原始元件的某些或全部功能，特别是本文提及的任一功能。在优选的实例中，抗原的片段可保留免疫原性，佐剂的片段保留作为佐剂的能力。在某些情况下，片段的长度为原始元件的至少50％，优选至少60％，更优选至少70％，又更优选至少80％，甚至更优选至少90％，再更优选至少95％。片段可以与原始元件长度的这些百分比相等或较小。
在本文中互换使用的术语“个体”和“受试者”是指脊椎动物亚门中的任一成员，包括但不限于人和其它灵长类，包括除人外的灵长类如黑猩猩以及其它猿和猴种；家畜如牛、绵羊、猪、山羊和马；驯养哺乳动物如狗和猫；实验动物包括啮齿类如小鼠、大鼠和豚鼠以及猪；鸟类，包括驯养鸟类，野生鸟类和诸如鸡、火鸡等的猎鸟和其它鹑鸡类，鸭，鹅等等。本术语并不指特定年龄。因此，成年和新生个体均包括在内。由于所有这些脊椎动物的免疫系统作用方式相似，因此本文中所描述的方法用于上述的脊椎动物种中的任一动物。
在某些情况下，本发明可用来免疫任何合适的受试者，特别是给定种的任何合适受试者。在一个优选的实例中，可对任何合适的受试人进行免疫。因此，例如，可对尽可能多的受试者进行免疫，而无需强调任何特定组次的受试者。例如，可对作为一个整体的或尽可能多的一群受试者进行免疫。具体而言，本发明用于治疗流感时，特别是用来对针对流行性流感病毒毒株进行免疫时，本发明的构建体可用来对任何受试者并优选尽可能多的受试者进行免疫。
在其他情况下，受试者或个体可为具有感染风险或对其而言感染特别有害的受试者或个体。在一个优选的实例中，感染可为呼吸系统感染。具体而言，本发明用来预防或治疗呼吸系统感染特别是流感时，受试者可为人。在某些情况下，本发明的核酸构建体可优先或首先给予风险组的具体对象。例如，这可为这样一种情况：给予核酸构建体来针对非流行性流感病毒毒株进行免疫。例如，在某些情况下，受试者可分为以下类别的一类或多类：
——具有呼吸系统病症和/或心脏有问题的受试者，特别是患有哮喘、肺气肿、支气管炎和/或慢性阻塞性肺病(COPD)的受试者；
——患有慢性医学病症例如糖尿病、免疫抑制、免疫缺陷、镰状红细胞病和/或肾病的受试者；
——至少50岁，优选至少60岁，更优选至少65岁，甚至更优选至少75岁，又更优选至少80岁的受试者；
——2岁或不到2岁的儿童，特别是6至23个月例如18个月或不到18个月的儿童；
——长期进行阿司匹林治疗的受试者，特别是年龄为6个月至18岁的受试者；
——孕妇，特别是流感季节期间将处于妊娠中三月或妊娠末三月的孕妇；
——养老院的居民或长期照料机构中的居民；和/或
——上述任一人群的护工或可能经常与他们接触的人。
B.概述
本发明涉及核酸构建体，它为宿主细胞中的异源编码序列特别是抗原编码基因的高效表达提供了可能。在某些情况下，构建体可表达一种或多种佐剂多肽。更具体地，本发明提供了核酸构建体，它包含嵌合启动子序列和克隆位点，或在某些具体实施方案中基本由嵌合启动子序列和克隆位点组成，因此在编码序列插入克隆位点时，编码序列会与嵌合启动子有效连接。本发明还提供了具有插入一个或多个克隆位点的编码序列的构建体。该编码序列可编码本文提及的任一多肽，尤其是抗原，特别是本文所述的任何抗原和佐剂多肽。
在一个特别优选的实施方案中，构建体包含编码序列，特别是编码抗原、其免疫原性片段或两者的免疫原性变体的编码序列。在一个特别优选的实施方案中，编码序列编码流感抗原、其免疫原性片段或两者的免疫原性变体。在一个更优选的实施方案中，编码序列编码佐剂多肽，特别是ADP核糖基化细菌毒素亚基、其具有佐剂活性的片段或两者具有佐剂活性的变体。
嵌合启动子包括下列元件，或在某些具体实施方案中基本由下列元件组成：
(a)hCMV立即早期启动子序列；
(b)hCMV主要立即早期基因的外显子1和至少一部分外显子2；和
(c)异源内含子，来置换hCMV主要立即早期基因的内含子A区域。
hCMV立即早期启动子序列(a)可包括：
(i)天然hCMV立即早期启动子序列；
(ii)其功能同源变体；或
(iii)(i)或(ii)的功能片段。
一般地，序列(a)包括大约100到600，优选200到600，例如400到600个核苷酸。序列(a)一般包括出现在(i)中的可与转录因子或RNA聚合酶结合的序列，或能与相同转录因子和RNA聚合酶结合的这些序列的同源物，而非这些序列。一般地，这些序列或其同源物以与(i)相同的顺序和/或基本相同的相对间隔出现在启动子序列(a)中。
一般地，(i)包括hCMV主要立即早期基因的至少-100至-1位，一般-150至-1位，如-500至-1位或-600至-1位的核苷酸。序列(i)一般包括hCMV核心启动子序列，并且还可包括hCMV立即早期启动子中存在的一个或多个增强子元件。例如，(i)可包括US 6218140所述的-118至-1位或-524至-1位的核苷酸或US 538 5839所述的-62至-1位或-465至-1位的核苷酸。
一般地，(i)包括一般出现于启动子序列的TATA框或CAAT框。优选地，该序列包括hCMV立即早期启动子中的一个或多个重复序列。
在一个优选的实施方案中，(i)包括SEQ ID NO：1。在一个更优选的实施方案中，(i)包括SEQ ID NO：54的903至1587位核苷酸。在另一个实施方案中，(i)可包括SEQ ID NO：14的903至1587位核苷酸。在一个更优选的实施方案中，(i)可包括SEQ ID No.57的1002至1686位或者2624至3308位核苷酸。在一个更优选的实施方案中，(i)可包括SEQ ID No.61的1815至1935位和/或1948至2632位核苷酸，特别是SEQ ID No.61的1948至2632位核苷酸。在另一个优选的实施方案中，可使用1815至1935位核苷酸。
在本发明的一个特别优选的实施方案中，hCMV立即早期启动子序列(a)包括：
(i)核苷酸序列SEQ ID No.1、SEQ ID No.54的903至1587位核苷酸、SEQ ID No：61的1815至1935位核苷酸、SEQ ID No：61的1948至2632位核苷酸、SEQ ID No：62的1002至1686位核苷酸和/或SEQ ID No：62的2624至3308位核苷酸；
(ii)(i)的功能变体，它与(i)的一个或多个序列具有至少80％的核苷酸序列同源性；和/或
(iii)(i)或(ii)的功能片段。
在某些情况下，片段可包含该序列的至少300个核苷酸，优选至少400个核苷酸，更优选至少500个核苷酸，甚至更优选至少600个核苷酸。片段可包含最高达800、最高达600或最高达400个核苷酸。
使用已知方法可获得hCMV立即早期启动子序列。使用标准技术，可直接从病毒样本中分离出天然的hCMV立即早期启动子。例如US 5385839描述了hCMV启动子区的克隆。hCMV立即早期启动子序列可从Genbank#M60321(hCMVTowne株)和X17403(hCMV Ad169株)获得。因此，天然序列可通过使用基于已知序列的PCR引物，采用PCR分离得到。见如Sambrook et al(同上)中用于获得和分离DNA的技术的描述。合适的hCMV启动子序列也可从已有的质粒载体分离得到。启动子序列也可通过合成产生。
功能变体(ii)或片段(iii)一般可维持和/或补充天然启动子(i)的活性。一般地，这种活性是指引起(包括启动和调控)有效连接的多核苷酸，特别是hCMV主要立即早期基因的转录的能力。在一个实施方案中，片段或变体能补充hCMV病毒中的天然启动子的活性，比如允许病毒维持在细胞内感染和/或复制的能力。
可检测同源变体(ii)或片段(iii)维持和/或补充(i)的活性的能力。例如，可检测变体或片段恢复突变体hCMV功能(如感染和/或复制能力)的能力，在突变体中，天然hCMV立即早期启动子是缺损的。
同源变体(ii)或片段(iii)可使用下面的差异表达分析(ComparativeExpression Assay)检测其可用性。待测启动子序列被导入基本载体(basevector)中，置换天然hCMV立即早期启动子。一般地，功能变体或片段可达到使用基本载体所提供的表达的至少50％，如60％、70％、80％、90％或更高。功能性变体或片段可提供本文述及的任何水平的表达。在某些情况下，变体或片段可提供更高水平的表达，例如活性提高了至少50％、100％、150％、200％、300％或更多。一般地，表达发生在至少一种，但优选两种参照细胞类型中。一般地，参照细胞为哺乳动物HEK293T、CHO、HeLa、BHK、3T3或COS细胞。某些情况下，参照细胞可为SSC-15或B16宿主细胞。
附加地或者替代地，启动子序列可由下面的差异免疫原性分析(Comparative Immunogenicity Assay)检测。待测启动子序列被导入基本载体中，置换天然hCMV立即早期启动子。一般而言，功能启动子序列所提供的抗体滴度至少与具有至少一个抗原，优选具有两个抗原的基本载体所获得的抗体滴度相同或者较之更高。优选地，抗体滴度较基本载体的至少高5％、1 0％、20％、30％或40％。在某些情况下，抗原滴度的水平可为本文述及的任何水平。合适的抗原是HBsAg、HSV 2gD和flu-M2抗原。特别优选的抗原是流感抗原。流感抗原包括HA、NA、M2、NP、M1、PB1、PB2、PA、NS1和NS2抗原，特别是HA、NA和M2抗原。在一个特别优选的实施方案中，抗原为HA或其片段，或者两者的变体。根据本检测，天然启动子序列(i)的功能同源变体(ii)或功能片段(iii)通常可获得天然序列获得的最高抗体滴度。在某些情况下，抗体滴度可略微较低，包括本文述及的任一水平。
在本发明的构建体编码佐剂多肽的情况下，可采用使用标准抗原的差异免疫原性测试，并将编码佐剂活性未知的多肽的测试载体与标准佐剂载体进行比较。例如，测试佐剂载体可编码已知佐剂多肽的片段或变体，并在与抗原同时给予时就其促进免疫应答的能力与表达已知佐剂多肽的标准载体进行比较。片段或变体可具有本文述及的任何水平的活性，特别可提供至少50％，优选至少75％，更优选至少85％，甚至更优选至少100％标准佐剂的佐剂活性。优选地，除了编码待测佐剂/多肽的序列外，待测载体和标准载体是相同的，或者至少基本相同。
如上所述，构建体可包括外显子序列(b)，它包括来源于hCMV主要立即早期基因的外显子1和外显子2的序列。外显子是编码序列，它们天然状态下一般被内含子分隔。在天然hCMV主要立即早期基因中，外显子1和2一般被天然内含子A分隔。在本发明的嵌合构建体中，外显子2序列一般位于外显子1序列的3’端，没有内含子序列间隔，因此外显子1和外显子2序列是连续的。
外显子序列(b)可包括：
(i)天然外显子序列，一般为外显子1和(全部或部分)外显子2；
(ii)(i)的功能同源变体；或
(iii)(i)或(ii)的功能片段。
序列(i)可包括大约50％到100％的天然hCMV主要立即早期基因外显子1序列，如，60％到90％，或70％到80％。一般至少有50％的天然外显子1序列，如60％、70％、80％、90％或更多。外显子序列(b)也包括至少部分外显子2序列。在序列(i)中，一般有天然外显子2的两个或多个碱基，如2到9、2到7、或3到5个碱基。有最高达并且包括100％的天然外显子2序列，如5％到95％、20％到80％或40％到60％的天然外显子2序列。一般地，同源变体具有天然序列的任何上述长度。
优选地，(i)包含SEQ ID No.2。在一个更优选的实施方案中，(i)包括SEQ ID NO：54的1588至1718位核苷酸。在一个更优选的实施方案中，(i)包括SEQ ID NO：14的1588至1718位核苷酸。在另一个优选的实例中，(i)包括SEQ ID NO：51的1684至1814位核苷酸和/或2633至2763位核苷酸。在一个更优选的实施方案中，(i)可包括SEQ ID No：SEQ ID No.62的1687至1817位和/或3309至3439位核苷酸。
因此，在一个特别优选的实施方案中，嵌合启动子的外显子序列(b)包括：
(i)核苷酸序列SEQ ID No.2、SEQ ID No.54的1588至1718位核苷酸、SEQ ID No.61的1684至1814位核苷酸、SEQ ID No.61的2633至276 3位核苷酸、SEQ ID No.62的1687至1817位核苷酸和/或SEQ ID No.62的3309至34 39位核苷酸的核苷酸序列；
(ii)(i)的功能变体，它与(i)的一个或多个序列具有至少80％的核苷酸序列同源性；和/或
(iii)(i)或(ii)的功能片段。
通过已知方法能获得合适的外显子序列(b)。见如Sambrook et al.，同上，关于用于获得和分离DNA的技术的描述。通过使用标准技术(见，例如，Maclean，A(1998)“Preparation of HSV-DNA and Production of InfectiousVirus”in Herpes Simplex Virus Protocols(在单纯疱疹病毒试验方案中的“感染病毒的HSV-DNA和产物的制备”)S.Brown，A Maclean，editors，Humana Press，Totowa，NJ，pp.19-26)，天然hCMV主要立即早期基因序列能直接从病毒样本中分离得到。hCMV主要立即早期基因的序列，包括外显子1和外显子2的位置，可在Genbank#M60321，X17403获得。因此，天然外显子1和2序列能通过在合适的限制酶切位点切割天然主要基因序列，或通过使用基于已知序列的PCR引物采用PCR分离得到。或者，合适的外显子序列可从现有的质粒载体如pWRG7128中分离得到。外显子序列也可通过合成而非克隆制备。变体序列易于通过常规方法，如定向诱变构建得到。
一般地，当外显子存在于本发明的构建体中时，它能增强表达，一般能引起与上述天然外显子1和外显子2序列(i)相当的提高。
外显子序列的功能可使用下述的差异表达分析法进行分析。待测外显子序列被导入基本载体中，置换已有外显子序列。一般地，与基本载体相比，若外显子序列在至少一种、优选两种参照细胞类型中其表达不停止，优选进一步提高，则该序列是功能性的。一般地，参照细胞是哺乳动物HEK293T、CHO、HeLa、BHK、3T3或COS细胞。可使用SSC15或B16细胞。优选地，表达提高了至少5％、10％、20％、30％或40％。表达可提高本文所述的任何水平。根据本检测，天然外显子序列(i)的功能同源变体(ii)或功能片段(iii)通常能实现与天然序列相比至少50％的表达提高。在某些情况下，若表达水平较基本水平低，则降低程度可为本文述及的任何水平。
附加地或者替代地，可使用下面的差异免疫原性分析检测外显子序列。待测外显子序列被导入基本载体，置换已有外显子序列。一般而言，功能外显子序列所提供的抗体滴度至少与具有至少一个抗原，优选具有两个抗原的基本载体所获得的抗体滴度相同或者较之更高。优选地，抗体滴度较基本载体的至少高5％、10％、20％、30％或40％。升高程度可为本文述及的任何水平。优选的抗原是HBsAg、HSV 2gD和flu-M2抗原。特别优选的抗原是流感抗原，包括上文述及的任何一种，尤其是HA、NA和M2抗原。特别优选使用HA抗原、其免疫原性片段或两者的免疫原性变体。根据本检测，天然外显子序列(i)的功能同源变体(ii)或功能片段(iii)通常可获得天然序列获得的最高抗体滴度。在抗体滴度的水平略微降低的情况下，该降低程度可为本文述及的任何水平。可以上述等价形式对佐剂载体进行评估。
嵌合启动子构建体包括置换hCMV主要立即早期基因的天然内含子A区域的异源内含子(c)。内含子是从由基因转录得到的hnRNA剪接得到的非编码序列。异源内含子为天然状态下不存在于编码序列中的内含子。
异源内含子(c)全部或部分置换hCMV主要立即早期基因的天然内含子(A)。一般地，不存在天然内含子A。
一般地，异源内含子(c)位于外显子序列(b)的3’端。
一般地，异源内含子(c)包括：
(i)天然内含子；
(ii)(i)的功能同源变体；或
(iii)(i)或(ii)的功能片段。
异源内含子(c)一般为病毒或真核生物的内含子。优选地，内含子是哺乳动物的内含子，尤其是除人外的内含子，例如，可使用大鼠的内含子。在某些情况下，也可使用鸡的内含子。优选地，内含子为内含子A，如，大鼠胰岛素内含子A，鸡角蛋白内含子A或鸡心脏的肌动蛋白内含子A。在一个特别优选的实施方案中，内含子为大鼠胰岛素内含子A。
在一个优选的实施方案中，异源内含子(c)包括选自下列的序列：大鼠胰岛素基因内含子A序列、鸡角蛋白基因内含子A序列、鸡心脏的肌动蛋白基因内含子A序列、它们的功能片段、或者任何上述序列的功能片段。
一般地，内含子(c)长度为大约50个核苷酸到大约1000个核苷酸，如大约100到大约500个核苷酸。例如，内含子(c)可包括50到500个核苷酸，如最高达100、200、300或400个核苷酸。优选地，内含子包括天然大鼠胰岛素内含子A的第50到133位的核苷酸，或该序列的同源物。
优选地，异源内含子(c)能从真核宿主细胞的RNA转录产物中剪接。一般地，内含子包括供体序列(如GT)、受体序列(如AG)、3’嘧啶富集区和分枝点序列中的一个或多个。若含嘧啶富集区，该区可包括，如至少5、8、10或更多嘧啶。优选地，内含子包括至少一个供体序列、一个受体序列和一个分枝点序列。一般地，在嵌合构建体中，内含子(c)包括来源于外显子序列的非内含子侧翼序列，该外显子序列发现于天然内含子(i)的内含子/外显子边界。侧翼外显子序列可为天然外显子序列或该序列的同源物，该同源物基本保持与天然序列相同的活性，如保持剪接功能。一般在内含子的两端均包括外显子序列的5到10、优选7到10个碱基。
内含子(c)可是人工内含子，前提是该内含子是功能性的。例如，可使用重组内含子或嵌合内含子。这种内含子可包括来自一个以上天然内含子的序列。
一般地，内含子(c)包括存在于hCMV内含子A的、可与转录因子或调控蛋白结合的序列，或能与相同转录因子或蛋白结合的这些序列的同源物，而非这些序列。一般地，这些序列或其同源物以与hCMV内含子A中相同的顺序和/或基本相同的相对间隔出现在内含子(c)中。
内含子(c)包括同源变体(ii)，其中天然内含子(i)的序列经修饰以除去内部的限制酶切位点。例如，可使用大鼠胰岛素内含子A的同源变体，其内部的Nhel位点已被破坏。
优选地，内含子(c)包括：
(i)SEQ ID No.3；
(ii)(i)的功能同源变体；或
(iii)(i)或(ii)的功能片段。
在一个更优选的实例中，(i)可包括SEQ ID NO：54的1725至1857位核苷酸或SEQ ID NO：14的相同核苷酸。在一个更优选的实施方案中，(i)可包括SEQ ID NO：61的1545至1677位和/或2770至2902位核苷酸。在另一个优选的实例中，(i)可包括SEQ ID NO：62的1824至1956位和/或3446至3578位核苷酸。
在一个优选的实例中，大鼠胰岛素基因内含子A序列包括：
(i)核苷酸序列SEQ ID NO：3、核苷酸序列SEQ ID No.54的1725至1857位核苷酸、SEQ ID No：61的1545至1677位核苷酸、SEQ ID No：61的2770至2902位核苷酸、SEQ ID No：62的1824至1956位核苷酸和/或SEQ IDNo：62的3446至3578位核苷酸；
(ii)(i)的功能变体，它与(i)的一个或多个序列具有至少80％的核苷酸序列同源性；和/或
(iii)(i)或(ii)的功能片段。
内含子序列(c)可使用标准克隆技术获得。例如，大鼠胰岛素内含子A序列在GenBank J00748，鸡角蛋白内含子A序列在GenBank J00847以及鸡心内含子A序列在GenBank X02212中可得。内含子序列可使用基于已知序列的引物从天然来源中分离得到。序列也可合成制备。变体序列可通过突变获得。
一般地，诸如功能变体(ii)或功能片段(iii)的功能内含子序列基本具有与天然内含子(i)相同的活性，和/或补充其活性。在一个实施方案中，该活性是指剪接活性。
可使用常规剪接分析检测内含子(c)序列的剪接活性。一般地，在该检测中，功能同源物(ii)或功能片段(iii)显示出至少50％，如60％、70％、80％、90％和最高达100％或更高天然内含子(i)的剪接效率。
一般地，异源内含子序列出现在本发明的构建体中时，它能提高表达。一般地，变体(ii)或片段(iii)内含子较天然内含子(i)能产生相当的提高。在某些情况下，可观察到表达的减少程度包括本文述及的任何水平。
潜在的内含子序列(c)的功能可使用下面的差异表达分析检测。异源内含子被导入基本载体中。一般地，在与基本载体进行比较时，若异源内含子序列的引入在至少一种、优选两种参照细胞类型中其表达提高25％或更高，则该序列是功能性的。一般地，参照细胞是哺乳动物HEK293T、CHO、HeLa、BHK、3T3或COS细胞。也可使用SSC15或B16细胞。表达提高至少35％、45％、55％或更高。升高程度可为本文述及的任何水平。根据本检测，天然内含子序列(i)的功能变体(i)或功能片段(ii)通常比该天然序列的表达提高50％以上。例如，在观察到表达降低的情况下，该降低程度可为本文述及的任何水平。
附加地或者替代地，可使用下面的差异免疫原性分析检测异源内含子(c)序列的功能性。内含子(c)序列被导入基本载体中。功能内含子(c)序列所提供的抗体滴度与具有至少一个、优选两个抗原的基本载体所获得的抗体滴度相同或较之更高。优选地，抗体滴度较基本载体的至少提高5％或10％，如20％、30％或40％。优选的抗原是HBsAg、HSV2gD和flu-M2抗原。特别优选的抗原为流感抗原，包括本文述及的任何一种流感抗原，特别是HA、NA和M2抗原。具体而言，可使用HA抗原、其免疫原性片段或两者的免疫原性变体。根据本检测，天然内含子序列(i)的功能变体(ii)或功能片段(iii)通常获得该天然序列获得的最高抗体滴度。例如，在观察到减少的情况下，该水平可为本文述及的任何水平。可以与本文其他部分述及方式相同的方式对佐剂载体进行评估。
可使用标准克隆技术获得合适的异源内含子序列。例如，大鼠胰岛素内含子A序列在GenBank J00748，鸡角蛋白内含子A在GenBank J00847以及鸡心脏的肌动蛋白内含子A序列在X02212中可得。内含子序列可使用基于已知序列数据的引物从天然来源中分离得到。合适的序列还可通过合成制备。
可使用标准克隆或分子生物学技术，将组成序列(a)、(b)和(c)适当地连接在一起以形成嵌合启动子。优选地，内含子序列(c)位于外显子序列(b)的3’端。嵌合启动子构建体与克隆位点相连接，在有合适的酶参与下，通过这种方式启动子会影响插入到该位点的编码序列的表达。合适的克隆位点，包括多克隆位点，已为本领域所熟知，如pUC19、pBC SK、pBluescript IIKS、cDNA3.1、pSP72、pGEM 7Z多克隆位点。例如，可将任何合适的限制性酶切位点用作克隆位点来插入编码序列。
在一个优选的实施方案中，所使用的嵌合启动子包括：
(i)核苷酸序列SEQ ID No.4或者核苷酸序列SEQ ID No.54的903至1857位核苷酸；
(ii)(i)的功能变体，它与(i)具有至少80％的核苷酸序列同源性；和/或
(iii)(i)或(ii)的功能片段。
在一个更优选的实例中，所使用的嵌合启动子可为含有序列SEQ ID No：14的嵌合启动子。
一般地，用于插入(或已经插入)克隆位点的核酸编码与治疗相关的多肽。优选编码序列适用于核酸免疫接种或基因治疗中。因此，核酸插入物可包括能提供免疫性的序列，例如免疫原性序列，它在送递给受试者时能引起体液和/或细胞免疫应答。或者，核酸可包括一个或多个编码治疗性多肽(如靶细胞基因组缺损或缺少的蛋白，或具有所需生物或治疗效应(如抗病毒功能)的非天然蛋白)的基因。构建体可编码佐剂多肽。对于遗传病的治疗，可将对应于已知在具体病症中缺失的基因的功能性基因给予受试者。优选地，核酸是DNA。在某些情况下，核酸可为RNA或PNA。
在某些情况下，非编码RNA可由本发明的构建体表达。因此，可将载体插入克隆位点，一个可产生这种RNA(例如反义RNA或SiRNA)的区域。例如，反义RNA或SiRNA可抑制本文述及的任何一种基因或本文述及的任何病原体的基因的表达。但是，在最优选的实施方案中，它们编码多肽。
合适的插入核酸包括那些用于治疗炎性疾病、自身免疫疾病、慢性病和传染病的核酸，所包括的病症如艾滋病、癌症、神经系统疾病、心血管系统疾病、高胆固醇血症(hypercholestemia)；各种血液病包括各种贫血(anemias)、地中海贫血(thalassemia)和血友病(hemophilia)；遗传缺陷如囊肿性纤维化(cystic fibrosis)、Gaucher疾病、腺苷脱氨酶(ADA)缺乏症(adenosine deaminase deficiency)、肺气肿(emphysema)等。
本发明中的构建体可用来治疗或预防病症。该构建体可用来改善病症和/或消除或减轻某种疾病的具体或全部的症状。在一个特别优选的实例中，构建体可用来针对病原体对受试者进行免疫接种。
例如，在治疗实体瘤(solid tumor)的方法中，如下基因可在肿瘤位点或其附近插入表达：编码毒性肽的基因(即诸如篦麻毒素(ricin)、白喉毒素(diphtheria toxin)和眼镜蛇毒因子(cobra venom factor)的化学治疗剂)、诸如p53的肿瘤抑制基因，编码转化癌基因的反义链的mRNA序列的基因，编码抗肿瘤肽如肿瘤坏死因子(TNF)和其它细胞因子的基因，或转化癌基因的反式显性阴性突变体(transdominant negative mutant)。
在一个优选的实施方案中，本发明的构建体可编码治疗或预防癌症的多肽。在一个特别优选的实施方案中，本发明的构建体可编码肿瘤抗原。肿瘤相关抗原的实例包括但不限于肿瘤-睾丸抗原例如MAGE家族(MAGE 1、2、3等)的成员、NY-ESO-1和SSX-2；分化抗原例如酪氨酸酶、gp100、PSA、Her-2和CEA；突变的自身抗原和病毒肿瘤抗原例如来自致癌HPV型的E6和/或E7。特定肿瘤抗原的其它实例包括MART-1、Melan-A、p97、β-HCG、GaINAc、MAGE-1、MAGE-2、MAGE-4、MAGE-12、MUC1、MUC2、MUC3、MUC4、MUC18、CEA、DDC、P1A、EpCam、黑素瘤抗原gp75、Hker 8、高分子量黑素瘤抗原、K19、Tyr1、Tyr2、pMel 17基因家族的成员、c-Met、PSM(前列腺粘蛋白抗原)、PSMA(前列腺特异性膜抗原)、前列腺分泌蛋白、甲胎蛋白、CA125、CA19.9、TAG-72、BRCA-1和BRCA-2抗原。
抗原来源的具体癌症的实例包括肺癌、前列腺癌、乳腺癌、结肠癌、卵巢癌、睾丸癌、大肠癌、黑素瘤、淋巴瘤和白血病。本发明的构建体还可用来治疗或预防这类癌症。
同样，也包括编码多肽的核酸，已知该多肽表现出抗病毒和/或抗细菌活性、或刺激宿主免疫系统。核酸可编码多种细胞因子(或其功能片段)中的一种，如白细胞介素、干扰素和集落刺激因子(colony stimulatingfactor)。
在一个优选的实例中，编码序列可编码抗原、其免疫原性片段或两者的免疫原性变体。具体而言，抗原可为病毒、细菌、寄生物或真菌病原体抗原或肿瘤抗原。在一个优选的实例中，抗原可为病毒抗原、其免疫原性片段或两者的免疫原性变体。
核酸可编码治疗或预防许多疾病的抗原，所述疾病包括但不限于癌症、变态、中毒和病原体感染，该病原体例如但不限于真菌；病毒，包括人乳头状瘤病毒(Human Papilloma virus，HPV)、HIV、HSV2/HSV1，流感病毒(甲型、乙型和丙型)、脊髓灰质炎病毒(Poliovirus)、RSV病毒(RSVvirus)、鼻病毒(Rhinovirus)、轮状病毒(Rotavirus)、甲型肝炎病毒(Heptatitis Avirus)、诺瓦克病毒组(Norwalk Virus Group)、肠道病毒(Enterovirus)、星状病毒(Astrovirus)、麻疹病毒(Measles virus)、副流感病毒(Para Influenza Virus)，腮腺炎病毒(Mumps Virus)、水痘-带状疱疹病毒(Varicella-zoster virus)、巨细胞病毒(cytomegalovirus)、非洲淋巴细胞瘤病毒(Epstein-Barr Virus)、腺病毒(Adenovirus)、德国麻疹病毒(Rubella virus)、人T细胞淋巴瘤I型病毒(Human T-cell Lymphoma type I virus，HTLV-I)、乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus，HBV)、丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus，HCV)、丁型肝炎病毒(Hepatitis D virus)、痘病毒(Pox virus)、马尔病毒和埃博拉病毒(Marburg and Ebola)；细菌，包括：结核杆菌(M.tuberculosis)、衣原体(Chlamydia)、淋病菌(N.gonorrhoeae)、志贺氏杆菌(Shigella)、沙门氏菌(Salmonella)、霍乱弧菌(Vibrio Cholera)、苍白密螺旋体(Treponema Pallidua)、假单胞菌(Pseudomonas)、百日咳杆菌(Bordetella Pertussis)、布鲁氏菌(Brucella)、土拉热弗朗西施氏菌(Franciscella tularensis)、幽门螺旋杆菌(Helicobacter pylori)、问号钩端螺旋体(Leptospria interrogaus)、嗜肺军团菌(Legionellapneumophila)、鼠疫耶尔森氏菌(Yersinia pestis)、链球菌(Streptococcus)(A和B型)、肺炎球菌(Pneumococcus)、脑膜炎球菌(Meningococcus)、流感嗜血杆菌(Hemophilus influenza)(b型)、刚地弓形虫(Toxoplama gondic)、Complybacteriosis、粘膜炎莫拉菌(Moraxella catarrhalis)、腹股沟肉芽肿(Donovanosis)和放线菌(Actinomycosis)；真菌病原体，包括念珠菌(Candidiasis)和曲霉(Aspergillosis)；寄生虫病原体包括绦虫(Taenia)、吸虫(Flukes)、蛔虫(Roundmorms)、变形虫(Amebiasis)、贾第虫(Giardiasis)、隐孢子虫属(Cryptosporidium)、血吸虫(Schitosoma)、卡氏肺囊虫(Pneumocystis carinii)，匐滴虫(Trichomoniasis)和旋毛虫(Trichinosis)。该核酸也可用来针对多种畜禽疾病提供合适的免疫应答，所述畜禽疾病为例如口蹄疫(Foot and Mouth Disease)、冠状病毒(Coronavirus)、出血败血性巴斯德氏菌(Pasteurella multocida)、缠绕杆菌属(Helicobacter)、寻常圆线虫(Strongylus vulgaris)、胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumonia)、牛病毒性腹泻病毒(Boyine viral diarrhea virus，BVDV)、肺炎杆菌(Klebsiellapneumoniae)、大肠杆菌(E.Coli)、百日咳杆菌(Bordetella pertussis)、副百日咳杆菌(Bordetella parapertussis)和支气管败血性博德特氏菌(Bordetella brochiseptica)。因此，一方面，本发明的核酸构建体可在疫苗中使用。本发明的疫苗可用来针对本文所述任一病原体和疾病进行免疫接种。因此，本发明提供了一种疫苗组合物，所述疫苗组合物包括本发明的一种核酸构建体或本发明的一群核酸构建体或本发明的包被颗粒。
在一个优选的实例中，本发明的核酸构建体可编码来自如下病毒科的成员的抗原：腺病毒科(adenoviridae)(包括例如人腺病毒)、疱疹病毒科(herpesviridae)(包括例如HSV-1、HSV-2、EBV、CMV和VZV)、乳多空病毒科(papovaviridae)(包括例如HPV)、痘病毒科(poxviridae)(包括例如天花和牛痘)、细小病毒科(parvoviridae)(包括例如细小病毒B19)、呼肠孤病毒科(reoviridae)(包括例如轮状病毒)、日冕形病毒科(coronaviridae)(包括例如SARS)、黄病毒科(flaviviridae)(包括例如黄热病病毒、西尼罗河病毒、登革热病毒、丙型肝炎病毒和蜱传脑炎病毒)、小核糖核酸病毒科(picornaviridae)(包括脊髓灰质炎病毒、鼻病毒和甲型肝炎病毒)、批盖病毒科(togaviridae)(包括例如风疹病毒)、线状病毒科(filoviridae)(包括例如马尔堡和埃波拉病毒)、副粘病毒科(paramyxoviridae)(包括例如副流感病毒、呼吸道合胞病毒、腮腺炎病毒和麻疹病毒)、弹状病毒科(rhabdoviridae)(包括例如狂犬病病毒)、本扬病毒科(bunyaviridae)(包括例如汉坦病毒)、正粘病毒科(orthomyxoviridae)(包括例如甲型、乙型和丙型流感病毒)、逆转录病毒科(retroviridae)(包括例如HIV和HTLV)以及嗜肝DNA病毒科(hepadnaviridae)(包括例如乙型肝炎病毒)。在一个更优选的实例中，抗原来自引起畜禽疾病的病原体，尤其是来自病毒病原体，包括例如呼肠病毒(例如非洲马瘟病毒或蓝舌病毒)和疱疹病毒(包括马疱疹病毒)。抗原可为来自口蹄疫病毒的抗原。在一个更优选的实例中，抗原来自蜱传脑炎病毒、登革热病毒、SARS、西尼罗河病毒和汉坦病毒。
在另一个优选的实例中，抗原来自逆转录病毒科(retroviradae)(如HTLV-I、HTLV-11或HIV-1(也被称为HTLV-111、LAV、ARV、hTLR等))。尤其是来自HIV，特别是分离HIVI11b、HIVSF2、HTVLAV、HIVLAI、HIVMN；HIV-1CM235、HIV-1；或HIV-2。在一个特别优选的实施方案中，抗原为人类免疫缺陷病毒(HIV)抗原。优选的HIV抗原的实例包括例如gp120、gp 160 gp41、gag抗原例如p24gag和p55gag，以及来源于pol、env、tat、vif、rev、nef、vpr、vpu或HIV的LTR区域的蛋白质。在一个特别优选的实例中，抗原为HIV gp120或HIV gp120的一部分。抗原可来自免疫缺陷病毒，例如来自SIV或猫免疫缺陷病毒。
因此，所编码的多肽可为抗原、其免疫原性片段或其免疫原性变体。例如，该片段或变体可具有任何水平的同源性，原始抗原的任何比例的长度以及本文所述的功能，尤其是产生免疫应答的能力。在某些情况下，可对核酸构建体的编码序列进行修饰使得表达最优化。例如，可将密码子选择修改为受试者的典型的密码子选择。受试者的Kozak共有序列还可被起始密码子周围天然存在的序列置换。
在一个特别优选的实施方案中，本发明的核酸构建体包括编码流感抗原、其免疫原性片段或两者的免疫原性变体的编码序列。片段和/或变体可具有本文所述的任何水平的序列同源性、片段长度和/或功能水平。具体而言，优选构建体的编码序列编码流感病毒抗原、流感病毒抗原的免疫原性片段或与两者具有80％氨基酸同源性的免疫原性变体。
例如，流感抗原可为流感NP(核蛋白/核壳蛋白)、HA(血凝素)、NA(神经氨酸酶)、M1、M2、PB1、PB2、PA、NS1和/或NS2抗原，或可为这些抗原的片段或变体。在一个优选的实施方案中，所编码的抗原可为HA、NA和/或M2流感抗原或这类抗原的片段或变体。在一个特别优选的实例中，所编码的抗原可为HA或NA抗原或这些抗原的片段或变体，特别是HA抗原或该抗原的片段或变体。
因此，在本发明的一个特别优选的构建体中，所编码的抗原可为流感血凝素(HA)、其免疫原性片段或与两者具有80％氨基酸序列同源性的免疫原性片段。在一个更优选的实例中，所编码的抗原为流感神经氨酸酶、M2、两者的免疫原性片段或与它们具有80％氨基酸序列同源性的免疫原性片段。
在一个优选的实例中，本发明的构建体可编码一种以上的多肽，尤其是一种以上的流感抗原、其免疫原性片段或两者的免疫原性变体。在将一个以上的抗原应用至优选的实例的情况下，HA和NA抗原或这些抗原的片段或变体可一起使用。
在本发明的构建体表达一种以上的流感抗原、其免疫原性片段或两者的免疫原性变体的情况下，至少有两种不同的所编码的抗原、片段或变体来自不同流感病毒毒株的相同流感多肽。
在一个优选的实施方案中，抗原可来自流感病毒的H5N1毒株，并且也可使用其免疫原性片段或两者的保留免疫原性的变体。具体而言，抗原可为来自H5N1毒株的抗原或该抗原的片段。
在某些情况下，抗原可为天然存在的流感病毒多肽的片段或变体。例如，抗原可对应天然存在的流感病毒多肽的亚区，包括本文述及的任一不同的片段长度。抗原可为天然存在的流感病毒抗原的变体或该抗原的片段。优选地，该变体和/或片段能产生能识别抗原尤其是该片段或变体所来源的流感病毒抗原的免疫应答。
流感抗原可来自任何流感病毒。抗原可来自甲型、乙型或丙型流感病毒，尤其是来自甲型和/或乙型流感病毒。抗原可来自变异流感病毒毒株，尤其是与流感病毒毒株的感染性或致病性增加相关的变异毒株。例如，抗原可来自由世界卫生组织每年鉴定的用于流感病毒疫苗的毒株之一，尤其是，抗原可为由WHO鉴定用于这种用途的抗原。在一个优选的实例中，本发明的一种核酸构建体、一群核酸构建体、药物组合物或疫苗可编码三种流感病毒毒株尤其是由WHO或其他相当的权威机构在某一具体年限中鉴定的三种流感毒株的每一种毒株的抗原。
在一个优选的实例中，一种或多种所编码的流感抗原可来自流行性流感病毒毒株。因此，流感抗原、其免疫原性片段或两者的免疫原性变体可来自流行性流感病毒毒株。例如，编码来自流行性毒株的抗原的构建体可独自给予或存在。在其他情况下，该构建体还可编码其它抗原或与编码其他抗原的其他构建体一起给予。在一个优选的实例中，可在相同或不同的构建体中编码来自流行性流感病毒毒株的抗原和来自非流行性流感病毒毒株的抗原。具体而言，可给予流行性流感抗原和来自1个、2个、3个、4个、5个、6个或更多个非流行性流感病毒毒株的抗原，优选给予来自3个、4个或5个非流行性流感病毒毒株的每个毒株的抗原，更优选给予来自3个或4个非流行性流感病毒毒株的每个毒株的抗原。
在某些情况下，构建体可编码一种以上的多肽。具体而言，构建体可编码一种以上的抗原，尤其是一种以上的流感抗原。例如，构建体可表达两种、三种、四种、五种、六种或更多种多肽，尤其是抗原。在一个优选的实例中，构建体可编码三种、四种、五种或更多种不同的多肽，尤其是抗原。在一个更优选的实例中，构建体可编码三种、四种或五种不同的多肽，尤其是抗原。在一个更优选的实例中，构建体可编码三种或四种不同的多肽，尤其是抗原，特别是流感抗原。使用本发明的嵌合启动子可表达至少一种抗原，并且优选所有抗原也如此表达。一般，每种抗原由本发明的不同嵌合启动子表达。在某些情况下，一种启动子可用来形成产生多种多肽的转录物。在某些情况下，几种抗原可表达为一种融合蛋白。
在一个优选的实例中，本发明的构建体编码流行性流感抗原、其免疫原性片段或两者的免疫原性变体以及一种或多种非流行性流感抗原、其免疫原性片段或两者的免疫原性变体。
本发明的核酸构建体可用于疫苗中。因此，本发明提供了一种疫苗组合物，所述疫苗组合物包括本发明的一种核酸构建体、一群核酸构建体或包被载体颗粒。疫苗可包含合适的药物载体或赋形剂。疫苗可包括佐剂尤其是本发明的佐剂构建体。或者，疫苗可与这一佐剂分别、序贯或同时给药。
在一个优选的实例中，本发明提供了一种多价疫苗，所述多价疫苗包括本发明的至少两种不同的构建体，所述构建体编码不同的抗原、其免疫原性片段或两者的免疫原性变体。抗原可为本文所述的任何抗原。在一个优选的实例中，本发明提供了一种多价疫苗，所述多价疫苗包括本发明的至少两种不同的构建体，所述构建体编码不同的流感抗原、其免疫原性片段或两者的免疫原性变体。在其它情况下，多种抗原可由相同构建体表达来提供多价疫苗，或者可使用编码一种或多种抗原的构建体的组合。
在一个更优选的实例中，本发明的多价疫苗可为三价、四价或五价疫苗的多价疫苗，所述三价、四价或五价疫苗编码三种、四种或五种不同的抗原、免疫原性片段或免疫原性变体，尤其是流感抗原、其片段或两者的变体。
在另一个优选的实例中，本发明的疫苗包括多价疫苗在内可包括编码流行性流感抗原、其免疫原性片段或两者的免疫原性变体的构建体。多价疫苗可编码流行性流感抗原、免疫原性片段或两者的免疫原性变体，并且还可编码例如来自三种、四种或五种不同流感病毒毒株中的每种毒株的抗原、其免疫原性片段或两者的免疫原性变体。
佐剂可存在于本发明的疫苗中或者与本发明的疫苗同时、分别或序贯给药。具体而言，本发明提供了一种疫苗，所述疫苗包括本发明的至少一种构建体，所述构建体编码ADP核糖基化的细菌毒素亚基、其具有佐剂活性的片段或其具有佐剂活性的变体。
表达一种以上抗原的核酸构建体可用来形成多价疫苗，即旨在针对多种不同抗原尤其是针对流感抗原进行免疫的疫苗。在某些情况下，可提供一种或多种流感抗原以及来自不同病原体的一种或多种抗原。因此，本文所述的构建体、核酸构建体群、疫苗、药物组合物和包被载体颗粒的任何一种可包括编码流感抗原的构建体，并且相同的构建体或不同的构建体可编码来自不同病原体的抗原。本文所述的多种多价流感构建体、群体和疫苗还可编码来自不同病原体的一种或多种抗原。
在某些情况下，所编码的抗原来自相同的病原体。在某些情况下，不同的抗原全部来自相同的病毒。因此，在一个优选的实例中，全部的抗原均为流感抗原。多种抗原可来自相同毒株的流感病毒，因此可来自流感病毒的几种不同的多肽。或者，多种抗原可来自不同毒株的病毒尤其是流感病毒。就多价构建体和/或疫苗而言，可选用来自至少两种，优选至少三种、四种或五种不同的流感病毒毒株的抗原。例如，抗原可来自2种、3种、4种、5种、6种或多种不同毒株，尤其是可使用来自三种、四种或五种毒株的抗原，更优选来自三种或四种不同毒株。
替代地或者附加地，多价疫苗可包括多种本发明的不同构建体，不同的构建体编码不同的抗原。例如，可使用至少两种、三种、四种、五种或六种不同的构建体。在一个特别优选的实例中，可使用两种、三种、四种或五种不同的构建体尤其是三种或四种构建体。在一个实例中，若存在一种以上的构建体，则每种构建体只编码一种抗原。在另一个实例中，构建体可编码两种、三种、四种、五种或多种不同的抗原，尤其是三种或四种不同的抗原。
本发明还提供了一群核酸构建体，其中所述群体包括本发明的多种构建体，尤其是上述的任一组合。因此，本发明提供了一群核酸构建体，其中所述群体包括本发明的至少两种不同的构建体。核酸构建体以相对于彼此的任何合适的量存在。通常，每一种核酸构建体以相对于彼此约1∶10的重量比存在。
核酸构建体群可用来形成多价疫苗，并可用于本发明的多种方法中。多价疫苗之所以为多价，还可因为它们包括本发明的任何一种编码一种以上抗原的构建体。
在一个优选的实例中，提供了一群核酸，所述群体包括编码不同抗原的至少两种不同的构建体。具体而言，本发明提供了一个包括至少两种不同的构建体的群体，所述构建体编码流感病毒抗原、其免疫原性片段或两者免疫原性变体。在这群核酸构建体中，优选至少两种不同的抗原来自不同流感病毒毒株的相同的流感多肽，例如HA。在具有至少两种不同的编码流感抗原的构建体存在的群体中，优选至少两种不同的抗原、片段或变体来自来源于相同或不同的流感病毒毒株的不同流感多肽。另一个优选的群体包括一群核酸构建体，其中所述群体包括至少三种不同的构建体，所述的每一种构建体编码不同流感病毒毒株的抗原或免疫原性片段或免疫原性变体。
在另一个优选的实例中，本发明提供了一群核酸构建体，所述核算构建体包括至少一种编码抗原、其免疫原性片段或两者的免疫原性变体的构建体；以及至少一种编码ADP核糖基化细菌毒素亚基、其具有佐剂活性的片段或其具有佐剂活性的变体的构建体。编码抗原、免疫原性片段或免疫原性变体的所述构建体或每一种这样的构建体相对于编码ADP核糖基化细菌毒素亚基、其具有佐剂活性的片段或其具有佐剂活性的变体的所述构建体或每一种这样的构建体通常以约10∶1至1∶10的重量比存在。重量比可为约10∶1至约1∶1，例如约9∶1。
在其中多种多肽被编码的情况下，可使用编码一种或多种多肽的构建体的任一组合和多种构建体。例如，在三种抗原被编码的情况下，一种构建体可编码全部三种抗原，一种构建体编码两种抗原而另一种构建体编码一种抗原，或者使用例如三种构建体，每一种构建体编码一种抗原。在四种抗原被编码的情况下，它们可通过四种、三种、两种或一种构建体编码，每一种构建体编码一种、两种、三种或四种不同的抗原。在一个实例中，使用尽量少的构建体，例如仅使用一种或两种构建体。本发明还提供了包括核酸构建体的这些组合的疫苗和核酸构建体群。
在一个优选的实例中，本发明提供了包括某种构建体的一种多价疫苗或一群核酸，所述构建体编码流行性流感病毒的一种抗原，还编码3种、4种或5种尤其是3种或4种非流行性流感抗原。非流行性流感抗原可由与编码流行性流感抗原相同或不同的构建体编码。在一个优选的实例中，这3种、4种或5种其它非流行性流感抗原可由一个或多个不同的构建体编码，特别是只由一个不同的构建体编码。在另一个实例中，编码流行性抗原的构建体也可编码一种或多种其他的抗原。
在一些实施方案中，该核酸构建体可编码佐剂，或者由不同的构建体来编码。本发明的任何群体、组合物和疫苗可包括这种佐剂构建体或与之同时给药、序贯给药或分别给药。因此，已插入到用于插入编码序列的克隆位点的序列可编码作为佐剂的多肽。
因此，在一个实例中，本发明包括一种核酸构建体，其中编码序列编码ADP核糖基化细菌毒素亚基、其具有佐剂活性的片段或两者具有佐剂活性、并且还与之具有80％氨基酸同源性的变体。在一个优选的实例中，所述核酸构建体包括两个编码序列，所述编码序列包括ADP核糖基化细菌毒素亚基、其具有佐剂活性的片段或两者具有佐剂活性的变体，其中每个编码序列连接这样一种嵌合启动子。
在一个实例中，编码ADP核糖基化细菌毒素亚基、其具有佐剂活性的片段或两者具有佐剂活性的变体的两个编码序列可在相反方向。在另一个实例中，编码ADP核糖基化细菌毒素亚基、其具有佐剂活性的片段或两者具有佐剂活性的变体的两个编码序列可在相同方向。在包含一个以上与嵌合启动子连接的编码序列的本发明的任一构建体中，启动子可在相同方向或不同方向，或者，当存在三个或更多个这样的启动子时，可以有些在相同方向，有些在不同方向。
在一个优选的实例中，任一佐剂构建体中所编码的佐剂可为ADP核糖基化细菌毒素。这些毒素包括白喉毒素(DT)、百日咳毒素(PT)、霍乱毒素(CT)、大肠杆菌不耐热毒素(E.coli heat labile toxins，LT1和LT2)、假单胞杆菌内毒素A(Pseudomona endotoxin A)、假单胞菌外毒素S(Pseudomonasextoxin S)、仙人掌杆菌胞外酶(B cereus exoenzyme)、球形芽孢杆菌毒素(B.sphaericus toxin)、肉毒梭菌C2和C3毒素(C botulinum C2 and C3toxin)，泥渣梭菌胞外酶(C.limosum exoenzyme)，以及来自产气荚膜梭菌(C.perfringens)、螺状梭菌(C spiroforma)和艰难梭菌(C difficile)的毒素和金黄色葡萄球菌EDIN(Staphylococcus aureus EDIN)的毒素。大部分ADP-核糖基化的细菌毒素包含A亚基和B亚基。构建体可表达A亚基、B亚基和/或两个亚基一起表达。
在一个优选的实例中，核酸构建体可编码大肠杆菌不耐热毒素和/或霍乱毒素，尤其表达大肠杆菌不耐热毒素。CT的A亚基和B亚基基因的完整序列的GenBank条目见于基因座VIBCTXABB(编号No.D30053)，而LT的A亚基和B亚基基因的完整序列的GenBank条目见于基因座AB0116677(编号No.AB011677)。在一个特别优选的实例中，本发明的构建体可编码由载体pPJV2012和/或pPJV7788编码的LT的A亚基和/或B亚基，或该亚基的保持佐剂活性的片段，或者两者的保持佐剂活性的变体。本发明的构建体可包括载体pPJV2012和/或pPJV7788的LTA亚基和/或LTB亚基的编码序列、其编码具有佐剂活性的多肽的片段或者两者具有佐剂活性的变体。在一个优选的实例中，本发明的构建体可具有LT A编码序列和LTB编码序列。
在另一个优选的实例中，该构建体可包括由SEQ ID No：61提供的载体pJV2012的序列或与之具有60％序列同一性的序列。在另一个实例中，该构建体可包括由SEQ ID No：62提供的载体pJV7788的序列或与之具有60％序列同一性的序列。
构建体可表达特定佐剂的活性变体或片段。若变体或片段保持所来源多肽的至少部分佐剂活性，则说其具有活性。因此，与没有佐剂同抗原一起给药时观察到的免疫应答相比，变体和/或片段仍然能增强针对特定抗原的免疫应答。所编码的序列可以是CT的A亚基和/或B亚基的活性片段或变体，尤其是LT的A亚基和/或B亚基的活性片段。例如，可使用的变体和片段可具有变体和片段的任何长度、任何水平的序列同源性或本文所述的其他特征。例如，它们可通过使用特定抗原的差异免疫原性分析，然后将所观察到的结果与编码佐剂的佐剂基本载体和变化载体相比较来进行评估。在一个特别优选的实施方案中，构建体可编码LTA和/或LTB亚基，尤其是对两者进行编码。在一个特别优选的实例中，构建体可为在本文提供序列的pPJV2012或pPJV7788。
本发明的任一佐剂构建体可与抗原或编码抗原的核酸同时给药、序贯给药或分别给药。在一个优选的实例中，本发明的佐剂构建体可与编码抗原的本发明的构建体同时给药、序贯给药或分别给药。可以由提供于其表面的两类构建体包被的核心载体形式或者以包被有佐剂构建体的核心载体和包被有编码抗原的构建体的其他核心载体的混合物形式，提供含有佐剂构建体和编码抗原的构建体的组合物和疫苗。
毒素亚基可缺失天然存在的信号序列。外毒素的天然信号序列可由真核生物的信号序列尤其是鸡的溶菌酶信号肽置换。天然存在的外毒素亚基可被修饰以将毒素解毒。A亚基可被修饰以干扰ADP-核糖基转移酶的活性或使该酶失活。在某些情况下，外毒素亚基依然具有毒性。因此，在某些情况下，外毒素亚基可能并未被去毒。
因此，本发明的佐剂构建体可用于提高针对特定抗原的免疫应答。增强的免疫应答包括强度更大或时间更长的免疫应答。这意味着当再次遇到抗原时，免疫应答比未给予佐剂时更强。增强的免疫应答可产生更高的抗体滴度。就某些构建体尤其是在那些表达外毒素亚基的构建体而言，佐剂可产生针对所研究抗原的放大的细胞应答以及T辅助细胞1样免疫应答。
佐剂构建体可与本文所述的任何其他构建体一起给药、存在于具有所述其他构建体的疫苗中或者存在于具有所述其他构建体的一群核酸中。佐剂构建体还可编码包括本文述及的任何一种抗原尤其是编码流感病毒抗原在内的一种或多种抗原，或与编码这类抗原的构建体一起给药。
在一个实施方案中，本发明的构建体可编码免疫刺激剂和/或免疫抑制剂。在一个优选的实例中，构建体可编码以下物质的一种或多种：α-干扰素、β-干扰素和/或γ-干扰素、白细胞介素-1、白细胞介素-2、白细胞介素-4、白细胞介素-5、白细胞介素-7、白细胞介素-10、白细胞介素-12、白细胞介素-13、白细胞介素-18、白细胞介素-23和白细胞介素24、GM-CSF、G-CSF、TGF-β、B7.1、B7.2、CTLA-4、CD40配体、CD40、OX40、OX40配体、Flt-3配体、TRAIL、TRANCE、Fas配体、TNF-α、MCP-1α、PF-4、SLC、MIP-3α、IP-10。在某些情况下，这样的构建体可与其他构建体尤其是本发明的构建体之一特别是编码抗原的构建体同时给药、分别给药或序贯给药。
本发明的构建体可包含聚腺苷酸化信号。插入克隆位点的核酸可包括聚腺苷酸化(polyA)序列。这种PolyA序列一般来源于编码序列。或者，可在本发明的核酸构建体中提供异源polyA序列。一般地，polyA序列可位于克隆位点下游，这样可有效连接插入克隆位点的编码序列。使用标准克隆技术可将任何合适的polyA序列导入构建体中。该polyA序列为本领域所熟知。
poly A序列可为：
(i)天然polyA序列；
(ii)(i)的功能同源变体；或
(iii)(i)或(ii)的功能片段。
天然polyA序列(i)可为，例如兔β-珠蛋白基因polyA、人乳头状瘤病毒(HPV)早期或晚期基因polyA、HSV-2gB基因polyA、猿CMV立即早期基因polyA或HSVgD晚期基因polyA。聚腺苷酸化序列可来源于选自下列的基因的聚腺苷酸化序列：兔β-珠蛋白基因、人乳头状瘤病毒(HPV)早期或晚期基因、HSV-2gB基因、猿CMV立即早期基因和HSVgD晚期基因。
优选地，天然polyA序列(i)选自SEQ ID No.10(GenBank K03256)、SEQ ID No.11(GenBank M16019)、SEQ ID No.12(GenBank Z80699)和SEQID No.13(GenBank K02718)。特别优选的polyA序列包括SEQ ID NO：54的4243至4373位核苷酸或其功能同源变体或片段。优选的poly A序列还可由SEQ ID No.14的2556至2686位核苷酸提供，或者还可使用其功能片段或两者的功能变体。
在一个更优选的实例中，本发明的构建体中所使用的聚腺苷酸化信号可包括：
(i)核苷酸序列SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID No：54的4243至4373位核苷酸、SEQ ID No：61的906至1038位核苷酸、SEQ ID No：61的4375至4050位核苷酸和/或SEQ ID No：62的2463至2593位核苷酸；
(ii)与(i)的一个或多个序列具有至少80％核苷酸序列同源性的(i)功能变体；和/或
(iii)(i)或(ii)的功能片段。
一般地，功能polyA序列是保留聚腺苷酸化活性的序列。
可使用常规表达分析检测polyA序列将RNA转录产物聚腺苷化的能力。在检测中发现：功能同源变体(ii)或功能片段(iii)一般具有天然polyA序列的至少50％，例如60％、70％、80％或更高polyA活性。
一般地，在polyA序列出现在本发明的构建体中时，会增强表达，一般会引起与上述天然polyA序列(i)相当的增强。
可使用下述差异表达分析检测polyA序列的功能性。待测polyA区被导入基本载体，以置换RBGpA。和基本载体相比，若polyA在至少一种(优选两种)参照细胞类型中不停止表达(优选提高表达)，则认为待测polyA是功能性的。优选地，表达提高至少5％、10％、20％、30％、40％或50％或更高。提高程度可为本文述及的任一水平。在某些情况下可出现减少，包括本文述及的任一水平。优选的细胞类型为哺乳动物HEK293T、CHO、HeLa、BHK、3T3或COS细胞。还可使用SSC15或B16细胞。根据本检测，若同源变体(ii)或片段(iii)能获得高于天然polyA序列(i)所获得的表达增量的50％，则通常认为它是功能性的。
替代地或者附加地，可使用如下差异免疫原性分析检测polyA序列的活性。polyA序列被导入基本载体中，以置换RBCpA。功能性polyA序列所提供的抗体滴度与具有至少一个、优选两个抗原的基本载体所获得的抗体滴度一样高或较之更高。优选地，该抗体滴度较基本载体所获得的抗体滴度高至少5％、10％，如20％、30％或40％。在某些情况下，可观察到本文述及的任一升高或降低。优选的抗原是HBsAg、HSV2gD和Flu-M2抗原。特别优选的抗原为流感病毒抗原，包括本文述及的任一流感病毒抗原，尤其是HA、NA和M2抗原。特别地，可使用HA抗原，或其免疫原性片段或两者的免疫原性变体。若同源变体(ii)或片段(iii)能获得天然polyA序列(i)所获得的最高抗体滴度，则它通常是功能性的。
核酸构建体可包含其它的调控序列，它影响插入克隆位点的编码序列的表达。该构建体可包括非翻译前导序列。该序列在构建体中与嵌合启动子有效连接，因此它同样与插入克隆位点的编码序列有效连接。前导序列提供表达所插入的编码序列的翻译起始位点，通常含有Kozak序列。
一般地，非翻译前导序列包括：
(i)天然非翻译前导序列；
(ii)(i)的功能同源变体；或
(iii)(i)或(ii)的功能片段。
通常前导序列含有存在于(i)中、可结合转录组分或调节蛋白质的序列，或者含有能结合相同组分或蛋白质的这些序列的同源物。通常该序列或其同源物以与(i)中相同的顺序和/或基本相同的相对间隔出现在前导序列中。通常前导序列含有表达所插入编码序列的翻译起始位点。通常前导序列含有Kozak序列。
一般而言，非翻译前导序列长约10至约200个核苷酸，例如约15至150个核苷酸，优选15至约130个核苷酸。例如，可使用含有15、50、75或100个核苷酸的前导序列。
通常，功能性非翻译前导序列是能提供表达与该前导序列有效连接的编码序列的翻译起始位点的前导序列。通常，功能变体(ii)或片段(iii)具有基本与天然序列(i)相同的活性和/或补充其活性，该活性通常有助于或增强与该序列有效连接的编码序列的表达。
可使用标准方法对作为非翻译前导序列的变体(ii)或片段(iii)相对于天然前导序列的活性进行测试。例如，可制备含有与其天然编码序列有效连接的天然前导序列(i)的表达载体，并在合适的宿主细胞例如哺乳动物HEK293T、CHO、HeLa、BHK、3T3或COS细胞等中监测表达情况。可制备其中天然前导序列由同源变体或片段置换的测试构建体，并在相同的宿主细胞中再监测表达情况。通常，变体(ii)或片段(iii)可提供由天然序列提供的表达的至少50％，例如60％、70％、80％、90％或100％或更高。在某些情况下，可观察到本文述及的任一表达的升高或降低。
还可在下面的差异表达分析中对可能的前导序列的实用性进行测试。将测试前导序列导入基本载体中替换HBV pre S2 5’UTR。与基本载体相比，功能前导序列在至少一种(优选两种)参照细胞类型中不停止表达，而优选提高表达。表达通常提高了至少5％、10％、20％、30％、40％或50％。优选的细胞类型为哺乳动物HEK293T、CHO、HeLa、BHK、3T3或COS细胞。根据本分析，若同源变体(ii)或片段(iii)可获得天然前导序列所获得的表达增量的50％以上，则通常认为它是功能性的。
替代地或者附加地，可在下述差异免疫原性分析中对前导序列的活性进行测试。将前导序列引入基本载体中替换HBV pre S2 5’UTR。功能性前导序列所提供的抗体滴度与具有至少一个(优选两个)抗原的基本载体所获得的抗体滴度至少一样高或较之更高。优选地，所述抗体滴度至少较基本载体所具有的抗体滴度高5％、10％、20％、30％或40％。优选的抗原为HbsAg、HSV 2gD和Flu-M2抗原。特别优选的抗原是流感病毒抗原，包括本文述及的任一流感病毒抗原在内，尤其是HA、NA和M2抗原。具体而言，可使用HA抗原或者其片段或变体。若同源变体(ii)或片段(iii)可获得天然前导序列(i)所获得的最高抗体滴度，则它通常是功能性的。但是，在某些情况下，可观察到本文述及的任一降低水平的表达。
使用标准方法可获得合适的前导序列。例如，HBV preS2抗原序列、HBV e-抗原序列和HSV型2 gD抗原序列可分别在GenBank M54923、M54923和Z86099获得。可基于该已知的序列来设计引物并将其用来分离同源序列。前导序列可基于已知序列合成。
一般地，天然序列(i)是真核生物的序列或病毒序列，特别是感染真核生物的病毒。优选地，天然序列(i)是HBV或HSV序列，如HBV preS2抗原序列、HBV e-抗原序列或HSV型2gD抗原序列。特别优选地，(i)选自SEQ IDNo.5、SEQ ID No.6和SEQ ID No.7。在一个优选的实例中，非翻译前导序列包括SEQ ID NO：54或SEQ ID No.14的1864-1984位核苷酸。还可使用这其中的任一序列的功能片段或变体。
在一个实例中，非翻译前导序列包括：
(i)核苷酸序列SEQ ID No 5、Seq ID No：6、Seq ID No：7，或SEQID No.54的1864至1984位核苷酸；
(ii)(i)的功能变体，它具有与(i)至少80％的核苷酸序列同源性；和/或
(iii)(i)或(ii)的功能片段。
该非翻译前导序列可用于本发明的任一构建体中。
核酸构建体可包括增强子序列。通常将增强子序列提供于克隆位点的3’端，与嵌合启动子和所插入的编码序列有效连接，并起着提高所插入序列的转录的作用。
通常，增强子包括：
(i)天然增强子；
(ii)(i)的功能同源变体；或
(iii)(i)或(ii)的功能片段。
增强子序列通常含有约50个至约850个核苷酸，例如约75个至约500个核苷酸。可使用约100、200、300或400个核苷酸的增强子。
一般而言，(i)是真核生物的或病毒尤其是感染真核生物的病毒的增强子。通常这些增强子出现在基因的3’非翻译区域(3′UTR)。优选(i)为HBV或CMV增强子，例如HBs Ag3’UTR或猿猴CMV立即早期基因3’UTR。优选(i)包括SEQ ID No.8或SEQ ID No.9。优选(i)包含SEQ ID NO：54的3699-42 31位核苷酸。在另一个优选的实例中，(i)可包括SEQ ID NO：14的2012至2544位核苷酸。可使用这其中的任一序列的功能片段或变体。
通常，构建体中的增强子包括存在于(i)中、可结合转录组分或调节蛋白例如转录因子的序列，或者包括能结合相同组分或蛋白质的这些序列的同源物。优选地，这些序列以与(i)中相同的顺序和/或基本相同的相对间隔存在于增强子中。
通常，功能性增强子为增强或提高多核苷酸例如编码序列等的表达的增强子，所述多核苷酸与该增强子序列有效连接。通常，功能性同源变体(ii)或片段(iii)具有与天然增强子(i)基本相同的活性(例如增强表达)和/或补充其活性。
使用增强子捕捉分析(enhancer trap assay)可对增强子的活性进行分析。实验方案为本领域已知。在该分析中，功能性同源变体(ii)或片段(iii)优选提供天然增强子所示出的增强子活性的至少50％。通常所述活性为天然增强子的活性的至少60％、70％、80％、90、100％或更高。一般而言，在该分析中，功能变体(ii)或片段(iii)能补充天然增强子(i)的活性。例如，可观察到本文述及的任一升高或降低。
在一个优选的实例中，增强子序列包括：
(i)核苷酸序列SEQ ID No：8、SEQ ID No：9，SEQ ID No.54的3699至4231位核苷酸，SEQ ID No：61的3831至4363位核苷酸和/或SEQ ID No：62的4507至5038位核苷酸；
(ii)(i)的功能同源变体，它与(i)的一个或多个序列具有至少80％的核苷酸序列同源性；和/或
(iii)(i)或(ii)的功能片段。
使用下述差异表达分析还可对增强子的实用性进行了测试。将测试3’UTR序列引入基本载体中。在本分析中，与基本载体相比，若3’UTR在至少一种、优选两种参照细胞类型中其表达不停止，优选提高，则它具有实用性。优选表达提高了至少5％、10％、20％、30％、40％或50％。优选的细胞类型为哺乳动物HEK293T、CHO、HeLa、BHK、3T3或COS细胞。根据本分析，若同源变体(ii)或片段(iii)可获得天然增强子序列(i)所获得的表达增量的50％以上，则它是功能性的。
附加地或者替代地，可在下述差异免疫原性分析中检测增强子序列的活性。3’UTR被导入基本载体中。功能性增强子序列所提供的抗体滴度与具有至少一个(优选两个)抗原的基本载体所提供的抗体滴度一样高或较之更高。优选地，该抗体滴度较基本载体所提供的抗体滴度提高至少5％、10％、20％、30％或40％。优选的抗原是HBs Ag、HSV2gD和Flu-M2抗原。特别优选的抗体是流感病毒抗原，包括本文述及的任一流感病毒抗原在内，尤其是HA、NA和M2抗原。具体而言，可使用HA或其片段或变体。若同源变体(ii)或片段(iii)具有天然增强子序列(i)的最高抗体滴度，则它是功能性的。
使用标准克隆方法可获得合适的增强子序列。例如，可在GenBankAF143308和M16019可获得HBs Ag 3’UTR序列或猿CMV立即早期基因3’UTR序列。可基于已知序列设计引物并将其用于分离同源序列。
在某些情况下，若多个多肽由一个构建体编码，则最好缺失特定序列来减小该构建体的大小。具体而言，构建体可缺失与一个或多个待表达多肽的编码序列有效连接的非翻译前导序列编码区域和/或增强子。例如，这可为这么一种情况，即三个、四个、五个或多个肽由同一构建体表达，尤其是三个、四个或五个多肽由同一构建体表达。
在一个优选的实施方案中，核酸构建体包括异源polyA序列，异源前导序列和异源增强子，均与嵌合启动子有效连接，以高效表达插入的编码序列。
在另外一方面，本发明还提供一种核酸构建体，包括如下组分或基本由如下组分组成：
(i)启动子序列；
(ii)非翻译前导序列，来源于HBV preS2抗原序列、HBV e-抗原序列或HSV型2gD抗原序列；和
(iii)与(i)和(ii)有效连接的编码序列
其中，该编码序列对非翻译前导序列是异源的。
一般地，启动子序列(i)来源于病毒或真核生物的启动子序列。该启动子序列可为天然的启动子序列、天然序列的功能性同源物或两者的功能片段。合适的天然启动子包括例如hCMV立即早期启动子、伪狂犬病病毒(PRV)启动子或劳氏肉瘤病毒(RSV)启动子。优选地，该天然启动子包括SEQ ID NO：52或SEQ ID NO：53。
可使用诸如上述嵌合启动子等的人工启动子构建体，只要该启动子是功能性的。
功能性启动子序列通常为能引起(包括启动和调控)有效连接的编码序列在适当的宿主细胞中转录的启动子序列。
可使用常规表达分析检测启动子序列的启动子活性。在此分析中，天然启动子序列的功能性同源物或片段提供的表达通常为天然序列所提供的表达的至少50％，例如至少60％、70％、80％或90％。
非翻译前导序列(ii)如上所述。合适的编码序列(iii)包括涉及已在嵌合启动子构建体的部分描述的编码序列。但是，在本发明的这一方面，编码序列对非翻译前导序列是异源的。本发明的构建体通常包括polyA序列，如上所述，该polyA序列可来自编码序列，或在构建体中作为异源polyA序列提供。已描述了合适的polyA序列。该构建体还包括位于编码序列3’端的增强子序列。合适的增强子序列已在上文涉及嵌合启动子构建体的部分进行了描述。
在另一方面，本发明提供了一种核酸构建体，包括下述组分或在某些实施方案中基本由下述组分组成：
(i)启动子序列；
(ii)编码序列，其与启动子序列(i)有效连接；和
(iii)增强子序列，位于编码序列(ii)的3’端，并与之有效连接；
其中，增强子序列(iii)来源于HBsAg序列的3’UTR或猿CMV立即早期基因序列的3’UTR，并且编码序列(ii)对增强子序列是异源的。
构建体可包括非翻译前导序列，如在嵌合启动子构建体中已经描述的那些前导序列。
一般地，启动子序列(i)来源于病毒或真核生物的启动子序列。启动子序列可为天然启动子序列、天然序列的功能性同源物或两者的功能片段。例如，合适的天然启动子包括hCMV立即早期启动子、伪狂犬病病毒(PRV)启动子或劳氏肉瘤病毒(RSV)启动子。优选地，天然启动子包括SEQ ID NO：52或SEQID NO：53。
可使用诸如上述嵌合启动子等的人工启动子构建体，只要该启动子是功能性的。
功能性启动子序列一般为能引起(包括启动和调节)有效连接的编码序列在合适的宿主细胞中转录的启动子序列。
使用常规表达分析可检测启动子序列的启动子活性。在该分析中，天然启动子序列的功能性同源物或片段提供的表达通常为天然序列所提供的表达的至少50％，例如至少60％、70％、80％或90％。
合适的编码序列(ii)包括已在涉及嵌合启动子构建体的部分所提及的那些编码序列。但是，在这一方面，编码序列对3′增强子序列是异源的。该构建体的增强子序列(iii)如上所述。本发明的构建体通常还包括polyA序列。如在嵌合启动子构建体中一样，该polyA区可来自编码序列(ii)或可作为该构建体中的异源polyA组分。
根据本发明的任何一方面的构建体可包括信号肽序列。因此，核酸构建体可包括与所述编码序列有效连接的、编码信号肽的核苷酸序列。插入信号肽序列使之与启动子有效连接，由此可表达信号肽，并且有助于分泌由同样与该启动子有效连接的编码序列所编码的多肽。
一般地，信号肽序列编码10到30个氨基酸如15到20个氨基酸的肽。通常氨基酸主要为疏水的。通常情况下，信号肽将带有该信号肽的正在合成的多肽链引导至表达细胞的内质网中。该信号肽在内质网中被切除，并通过高尔基体分泌多肽。
用于本发明的信号肽可包括：
(i)天然信号肽序列；
(ii)(i)的同源变体，它保留信号肽活性；或
(iii)(i)或(ii)的片段，它保留信号肽活性。
例如，序列(i)可为人组织纤溶酶原激活剂信号肽(hTPAsp)(GenBankL00141)、抑肽酶信号肽(GenBank AAD13685)、烟草伸展蛋白信号肽(GenBankJU0465)、或鸡溶菌酶信号肽(GenBank AF410481)。
适用于本发明的信号肽是能分泌异源蛋白的信号肽。功能性信号肽可在下述分析中鉴定，所述分析对待测信号肽的效果和已知信号肽-如人组织纤溶酶原激活剂信号肽(hTPAsp)-的效果和没有信号肽的效果进行比较。可使用下述差异表达分析，但需要有如下修改。在基本载体中构建具有待测信号肽、hTPAsp或没有信号肽的分泌表达载体。缺少其天然存在的信号肽的多肽编码序列被插入至载体，并将该载体转化至参照宿主细胞中。优选的细胞是哺乳动物HEK293T、CHO、HeLa、BHK、3T3或COS细胞。分析细胞培养基，获得多肽表达水平。与缺少信号肽、具有至少一种、优选两种多肽的载体相比，功能性信号肽能使多肽在较高水平上分泌。一般地，分泌提高5％，或更优选提高10％或更高，如提高20％或50％或更高。一般地，分泌水平与使用hTPAsp获得的分泌水平相当。在某些情况下，可观察到本文述及的任一升高或降低。
在一个优选的实例中，信号肽选自人组织纤溶酶原激活剂信号肽(hTPAsp)、抑肽酶信号肽、烟草伸展蛋白信号肽和鸡溶菌酶信号肽。
编码的蛋白能在表达细胞外分泌具有诸多优点，特别是在该蛋白为抗原时。例如，抗原分泌提高为由免疫细胞(巨噬细胞、Langehan细胞、B细胞、T细胞等)引起的更多抗原摄入和应答提供了可能，使抗原具有到达血流和信号细胞(细胞因子)的能力、使抗原能找到细胞配体并发挥作用(抗体，毒素如霍乱毒素、大肠杆菌LT)，并参与正常的细胞生物化学过程(细胞受体)。
本发明的核酸构建体可为质粒形式。本发明的核酸构建体可为质粒表达载体形式。在一个优选的实例中，本发明的构建体可为DNA构建体。在其它情况下，该构建体可为RNA或PNA构建体。
然后，该载体可包括其它元件，如复制起点或选择子基因。这些元件为本领域所熟知，并可通过使用标准技术被纳入其中。在一个实施方案中，质粒载体具有SEQ ID NO：14的序列。或者，该构建体可包括在病毒载体构建体中。
在某些实施方案中，本发明的核酸构建体可包括本文定义的两个或多个嵌合启动子。因此，构建体可包括多个嵌合启动子，具体而言，该构建体可具有两个、三个、四个、五个或多个嵌合启动子。优选地，嵌合启动子分别与用于插入编码序列的克隆位点有效连接。因此，该构建体可表达两个、三个、四个、五个或多个编码序列。所表达的编码序列可为本文所述的任一序列。在一个优选的实例中，构建体具有两个嵌合启动子，它们每个都与一个编码序列有效连接。具体而言，这两种启动子可彼此独立地转录。在一个实施方案中，启动子可朝向彼此转录。因此，所述启动子可在相反方向，或者在某些情况下在相同方向。
具体而言，具有两个启动子的构建体可表达ADP-核糖基化细菌毒素的A亚基和B亚基，包括本文所述的任何一种，并优选LTA亚基和B亚基。但是，具有多个启动子的构建体可表达任一组合的本文所述编码序列。在一个更优选的方面，具有多个启动子的构建体可表达多个流感病毒抗原，包括本文述及任一流感病毒抗原的组合在内。在另一个优选的方面，构建体可表达流行性流感病毒抗原、其免疫原性片段或两者的免疫原性变体以及一个或多个本文所述的任一编码序列。
在构建体具有多个嵌合启动子的情况下，每个启动子均包括本文提及的任一序列或与之有效连接。在一个特别优选的实例中，一个或多个启动子的异源内含子可为大鼠胰岛素基因内含子A序列。一个或多个嵌合启动子还可优选包括HBV pre-S2的5’UTR。一个或多个启动子可包括兔β珠蛋白基因的聚腺苷酸化序列。
在一优选的实例中，本发明的核酸构建体可包括两个嵌合启动子序列，且每个启动子序列有效连接到插入编码序列的克隆位点，其中，每个嵌合启动子包含：
(a)hCMV立即早期启动子序列；
(b)hCMV主要立即早期基因的外显子1和至少一部分外显子2；和
(c)置换hCMV主要立即早期基因的内含子A区的异源内含子。
与一个嵌合启动子有效连接的编码序列编码LTA亚基，与另一启动子连接的编码序列编码LTB亚基。因此，构建体能表达两种亚基。优选地：
—每个启动子的异源内含子是大鼠胰岛素基因内含子A序列；
—编码每个LT亚基的序列有效连接到HBV pre-S2的5’UTR；和/或
—LT编码序列与兔β珠蛋白基因聚腺苷酸化序列有效连接。
在一个特别优选的实例中，载体pPJV7563和/或pPJV1671的一个或多个元件可用于本发明的核酸构建体中。可使用这些元件的功能片段或变体。具体而言，pPJV1671的任一元件列举于表3，可使用这些元件的功能变体或两者的功能片段。同样，pPJV7563的任一元件列举于实施例5，可使用这些元件的功能变体或两者的功能片段。优选地，可使用pPJV7563和/或pPJV1671自身的这些元件中的一个或多个元件的序列。在另一个优选的实施方案中，可使用构建体pPML7789的相应元件，并且这些元件的位置具体示于本文提供的图21和序列表中。在更优选的实例中，可使用载体pPJV2012和pPJV7788的相应元件，具体而言，可使用示于表6和8的那些元件。载体pPML7789、pPJV2012和pPJV7788的元件的功能片段和变体也可用于本发明的构建体中。
在一个优选的实例中，本发明的构建体包括：
(i)载体pPJV7563的序列，作为SEQ ID No：14提供；
(ii)与(i)的序列具有60％序列同一性的序列，
此外，将编码流感病毒抗原、免疫原性片段或免疫原性变体的序列插入(i)或(ii)的序列，这样使其与嵌合启动子有效连接。在一个优选的实例中，该构建体的编码序列编码HA抗原、其免疫原性变体或两者的免疫原性片段。
在本发明的更优选的实例中，可提供这样一种构建体，其中载体包含作为SEQ ID No：54提供的载体pPJV1671的序列，或者与其具有60％序列同一性的序列。在另一个优选的实例中，载体包含作为SEQ ID No：59提供的载体pPML7789的序列，或者与其具有60％序列同一性的序列。
在一个优选的实例中，可使用pPJV7563和/或pPJV1671的CMV启动子、非翻译前导序列、大鼠胰岛素内含子A、非翻译前导序列、HBV增强子和/或兔polyA序列或这些序列的功能变体或片段。在一个特别优选的实例中，可使用pPJV7563和/或pPJV1671的大鼠胰岛素内含子A和/或HBV增强子或这些序列的功能片段或变体。具体而言，大鼠胰岛素内含子A和HBV增强子两者均使用或使用这些序列的功能片段或变体。在另一个优选的实例中，可使用pPML7789、pPJV2012、pPJV7788的相应序列、这些序列的功能片段或这些序列的变体。
在构建体编码几个多肽尤其是抗原的情况下，可缺失特定序列来减少构建体的大小。例如，构建体可缺少增强子和/或非翻译前导序列，尤其是在编码三个、四个、五个或多个抗原时。在编码相同数目抗原的其它构建体中，这些序列依然存在。
在一个特别优选的实例中，载体pPJV7563可用来克隆所需编码序列，尤其是抗原例如本文所述的任一抗原的编码序列。在一个优选的实例中，所需流感病毒抗原、其片段或变体被克隆至载体。在某些情况下可对pPJV7563进行修饰。例如，可将卡那霉素抗性基因替换为另一备选基因，尤其是另一种备选的可选择或可筛选标记。本发明的任一核苷酸构建体可包括可选择标记。可对pPJV7563的pUC19质粒骨架进行修饰或用不同的质粒骨架置换。例如，可用实现相同功能的任何元件尤其是pPJV7563中的序列的功能变体或片段替换pPJV7563的特定元件。在某些情况下，通过用本文述及的任一元件置换具体的元件可对pPJV7563进行修饰，所述任一元件具有与待置换元件相同的功能。使用pPJV1671时可对其作相似的修饰。还可对本文述及的任一载体尤其是pPML7789、pPJV2012和pPJV7788进行相似的修饰。pPML7789、pPJV2012和pPJV7788的编码序列可替换为本文述及的任一编码序列。就pPJV2012和pPJV7788而言，可替换载体的一个或两个编码序列。
在一个优选的实施方案中，本发明的核酸构建体可包括：
(i)载体pPJV7563的序列，作为SEQ ID No：14提供；
(ii)与(i)的序列具有60％序列同一性的序列，
此外，插入所需编码序列，这样使其与嵌合启动子有效连接。在一个优选的实例中，编码序列编码抗原。具体而言，将编码流感病毒抗原、免疫原性片段或免疫原性变体的编码序列插入(i)或(ii)的序列中，由此使其与嵌合启动子有效连接。
不管是否考虑所插入的编码序列，该构建体与(i)的序列具有60％序列同一性。该构建体可具有本文述及的任一数值的序列同一性，尤其是至少70％，优选至少80％，更优选至少90％，甚至更优选至少95％。在一个优选的实施方案中，该构建体是插入了编码序列的pPJV7563。
可将其它序列加至pPJV7563的序列来形成本发明的其它构建体。例如，可加入本发明的一个或多个嵌合启动子以及与这一启动子有效连接的本文提及的任一序列。可对pPJV7563的克隆位点进行修饰以克隆不同的限制性酶切片段，尤其是克隆作为不同片段的编码序列。可对本文所述任一载体进行同样的修饰，尤其是对pPML7789、pPJV2012和pPJV7788进行同样的修饰。
在另一个优选的实例中，通过用编码不同抗原的序列置换一些或者全部编码抗原的pPJV1671的编码序列，可制备本发明的构建体。此外，还可进行上文涉及pPJV7563的部分所述的任一修饰来修饰pPJV1671。还可对pPML7789进行这类修饰。pPJV2012和pPJV7788的编码序列还可由其它所需编码序列尤其是那些编码抗原的编码序列置换。
在其他优选的实例中，本发明的构建体包括：
—提供为SEQ ID No：54的载体pPJV1671的序列或者与之具有60％序列同一性的序列；
—提供为SEQ ID No：59的载体pPML7789的序列或者与之具有60％序列同一性的序列；
—由SEQ ID No：61提供的载体pPJV2012的序列或者与之具有60％序列同一性的序列；
—由SEQ ID No：62提供的载体pPJV7788的序列或者与之具有60％序列同一性的序列。
在这些实例中，构建体可具有本文所述的任一百分比的序列同一性，尤其是那些在上文涉及pPJV7563的部分所述的序列同一性。
本发明的构建体可包括本文的表格中列举的任一元件，尤其是那些在表3、6和8列举的元件。还可使用这些序列的功能片段以及这些序列的变体及其片段。在一个优选的实例中，若载体为佐剂载体，则可存在表6和/或8所列举的一个或多个元件或者这些序列的片段或变体。
本发明还提供了一种形成本发明的构建体的方法，所述方法包括将多肽尤其是抗原的编码序列插入缺乏这些序列的本发明的载体中。该编码序列可编码本文所述任一抗原。在一个优选的实例中，本发明提供了这样一种方法，所述方法将所选择的编码序列插入pPJV7563、pPJV1671或本文所述修饰形式的载体之一中。可将它们插入pPML7789、pPJV2012和/或pPJV7788，尤其是pPML7789。在某些情况下，可插入其他编码序列并且/或者用不同的编码序列置换现有的编码序列。
本发明还提供了启动子序列和与该启动子有效连接的编码序列，其中所述构建体还包括：
(a)非翻译前导序列，来源于HBV preS2抗原序列、HBV e-抗原序列或HSV型2gD抗原序列，并且与该编码序列和对该编码序列异源的启动子有效连接；和/或
(b)增强子序列，位于该编码序列的3’端并与之有效连接，其中所述增强子序列来源于HBsAg序列的3’UTR或猿CMV立即早期基因序列的3′UTR，并且该编码序列对该3’增强子序列是异源的。
载体的多个元件可为本文所述的任一元件。在一个实例中，启动子序列(i)选自hCMV立即早期启动子序列、伪狂犬病病毒启动子序列和劳氏肉瘤病毒启动子序列。在另一个实例中，启动子为本文所述的嵌合启动子之一。
在另一个实例中，本发明提供了一种经纯化、分离的嵌合启动子，其中所述嵌合启动子为本文所定义的任一嵌合启动子。
本发明的多核苷酸构建体基本不含细胞或细胞物质或与之相关联。它可以是基本分离的形式，或基本纯化的形式，在每种情况下，它在制剂中一般包括至少90％，如至少95％、98％或99％的多核苷酸或干物质。
本发明的核酸分子可被送递到适合的宿主细胞中，以表达与启动子有效连接的多核苷酸。优选地，宿主细胞是哺乳动物细胞，特别是人的细胞。送递核酸到这些细胞中的适合的方法为本领域所熟知，包括例如葡聚糖介导的转染、磷酸钙沉淀、电穿孔和直接显微注射到细胞核。因此，本发明提供了具有本发明的载体的细胞转化株。
如上所述，构建体中的核酸编码序列可编码治疗相关的多肽。因此，使用标准基因送递方案，本构建体可用于核酸免疫接种或基因治疗。合适的基因送递方法已为本领域所熟知，如下所详细说明。核酸分子可直接送递给受试者，或者在体外送递给来自受试者的细胞，然后将细胞重新植入受试者中。在一个优选的实例中，可将构建体直接送递给受试者，其中所编码的多肽为抗原，尤其是流感病毒抗原。可使用本文所述任一送递途径，尤其是经皮送递。可给予本发明的佐剂构建体，以增强针对抗原尤其是针对由本发明的构建体所表达的抗原的免疫应答。
本发明还提供了本发明的一种核酸构建体或本发明的一群核酸构建体或本发明的包被颗粒在制备用于核酸免疫接种的药物中的用途。该药物为通过注射送递、经皮颗粒送递、吸入送递、局部送递、口服送递、鼻内送递或穿粘膜送递的药物。在一个优选的实例中，药物可通过无针注射送递。
就在核酸免疫接种或基因治疗中的用途而言，核酸构建体能制成常规药物制剂。可使用本领域普通技术人员可得的标准药理配方化学和方法制备。例如，含有一个或多个核酸序列(如以合适的载体形式如DNA质粒形式存在)的组合物能与一种或多种可药用赋形剂或载体联合，以提供一种液体制剂。因而还提供了一种药物组合物，所述药物组合物包括本发明的核酸构建体和可药用载体或赋形剂。在一个优选的实例中，药物组合物可包括本发明的多个构建体或本发明的一群构建体，包括本文述及的任一构建体。
辅助物质，如湿润剂或乳化剂，pH缓冲物质等等，可存在于赋形剂或载体中。这些赋形剂、载体和辅助物质一般是药剂，它可给药，没有异常毒性，并且在作为疫苗组合物时不会在接受该组合物的个体内引起免疫应答。可药用赋形剂包括但不限于液体，如水、盐水、聚乙二醇、透明质酸、丙三醇和乙醇。其中还可包括药理学上可接受的盐，例如，无机酸盐，如氢氯化物、氢溴化物、磷酸盐、硫酸盐等，有机酸盐，如乙酸盐、丙酸盐、丙二酸盐、安息香酸盐等。尽管不做要求，但优选制剂含有特别针对肽、蛋白或其它分子(若它们包含在该组合物中)起稳定剂作用的可药用赋形剂。同样起着肽的稳定剂作用的合适的载体的实例包括但不限于药品级的葡萄糖、蔗糖、乳糖、海藻糖、甘露醇、山梨醇、纤维醇、葡聚糖等。其它合适的载体还包括但不限于淀粉、纤维素、磷酸钠或磷酸钙、柠檬酸、酒石酸、甘氨酸、高分子量聚乙二醇(PEG)及其组合。在REMINGTON’S PHARMACEUTICAL SCIENCES(Mark Pub.Co.，N.J.1991)中非常详细地描述了可药用赋形剂、载体和辅助物质，在此通过引用被纳入本申请中。
在组合物中还包括核酸摄入和/或表达的某些促进剂(facilitator)(“转染促进剂”，transfection facilitating agent)，例如诸如布比卡因(bupivacaine)、心脏毒素(cardiotoxin)和蔗糖等的促进剂，以及诸如通常用于送递核酸分子的脂质体制剂或脂质制剂等的转染易化载体。阴离子脂质体和中性脂质体来源广泛，并且将其用于送递核酸分子广为人知(见如Liposomes：A practical Approach，(1990)RPC New Ed.，IRL Press)。阳离子脂质制剂也是公知的用于送递核酸分子的载体。合适的脂质制剂包括商品名为LipofectinTM的DOTMA(N-[1-(2，3-二油酰氧)丙基]-N，N，N-三甲基氯化胺，N-[1-(2，3-dioleyloxy)propyl]-N，N，N-trimethylammonium chloride)和DOTAP(1，2-二(油酰氧)-3-(三甲铵基)丙烷，1，2-bis(dioleoyloxy)-3-(trimethylammonio)propane)，见如Felgner et al.(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84：7413-7416；Malone et al.(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA86：6077-6081；美国专利No 5,283,185和5,527,928，和国际公布No WO90/11092、WO91/15501和WO95/26356。这些阳离子脂质可优选与中性脂质如DOPE(二油酰磷脂酰乙醇胺，dioleoylphosphatidylethanolamine)联合使用。可加入上述脂质制剂或脂质体制剂中的其他转染促进组合物包括精胺衍生物(见如国际公布No.WO 93/18759)和透膜化合物如GALA、短杆菌肽(Gramicidine S)和阳离子胆盐(见如国际公布No.WO 93/19768)。
或者，本发明的核酸分子可被包入、被吸入或结合至微粒载体。合适的微粒载体包括来源于聚甲基丙烯酸甲酯聚合物(polymethyl methacrylatepolymer)的微粒载体，和来源于聚(丙交酯)(poly(lactide))和聚(丙交酯-共-乙交酯)(poly(lactide-co-glycolide))的PLG微粒。见如Jeffery etal.(1993)Pharm.Res10：362-368。也可使用其它微粒系统和聚合物，如聚合物如聚赖氨酸、聚精氨酸、聚鸟氨酸、精胺、亚精胺，和这些分子的缀合物。在一个优选的实施方案中，在核酸凝聚剂(nucleic acid condensing agent)和金属离子螯合剂的存在下，将本发明的构建体沉积于载体上。优选的凝聚剂包括阳离子聚合物，尤其是多胺，特别是聚精氨酸或聚赖氨酸。在一个优选的实例中，该多胺为(Arg)4或(Arg)6。可参考WO2004/208560中所描述的技术，这些技术可用来形成本发明的包被载体颗粒。
组合物一旦形成，则能通过诸多已知途径和技术送递至受试者体内。例如，液体制剂可以注射溶液、悬浮液或乳液形式提供，并使用普通针头和注射器或液体喷射注射系统，通过肠胃外注射、皮下注射、皮内注射、肌内注射、静脉内注射给药。液体制剂还可局部给药至皮肤或粘膜组织，或以适合呼吸或肺部给药的微细喷雾剂形式提供。其它给药模式包括口服给药、栓剂和主动或被动透皮送递技术。
或者，组合物可体外给药，如已知将转化细胞送递和重新植入受试者内(如葡聚糖介导的转染、磷酸钙沉淀、电穿孔和直接显微注射至细胞核)。
组合物以与药剂相容的量给予受试者，该量在预防和/或治疗上是有效的。合适的有效量将会落入相对较宽的范围内，但容易由本领域普通技术人员通过常规试验确定。就确定所需量而言，《医师药学参考书》(Physicians DeskReference)和Goodman和Gilman的《治疗的药理学基础》(ThePharmacological Basis of Therapeutic)是有用的。例如，通常预计多核苷酸的有效剂量范围为约0.001到1000μg，优选在0.001到100μg，更优选0.01到10.0μg。在某些实例中，剂量可为0.1至100μg，优选0.5μg至25μg。当药剂是通过无针注射给药时，在某些实例中，剂量可为0.1至25μg，优选0.5μg至10μg，更优选1至5μg。具体而言，剂量可为4μg。在某些情况下，该剂量可通过多次无针注射例如一次、两次、三次、四次或五次无针注射给予。
在某些情况下，可在首次给药后再次给予该构建体。具体而言，在首次免疫后，再对受试者进行加强免疫。例如，加强免疫可为选自本文所述任一剂量的剂量。例如，受试者给药可在首次免疫后至少一周、两周、一个月、两个月或六个月。
在一个实例中，本发明的核酸构建体可与另一种核酸构建体联合使用。在一个实例中，该核酸构建体可为本文所述的一种表达佐剂的构建体，另一种构建体可为编码一种或多种抗原的构建体。在一个优选的实例中，两种构建体均采用本发明的嵌合启动子。若要给予本文的两种或多种物质，则它们具体可分别给药、同时给药或序贯给药。
在一种构建体表达佐剂，另一种构建体表达一种抗原或多种抗原的情况下，抗原可特别来自HSV、HPV或肝炎病毒(特别是乙型肝炎病毒)。抗原可具体为HSV ICP0、ICP4、ICP22和/ICP27抗原，并优选所有这四种。在一个特别优选的实例中，抗原为流感病毒抗原，包括本文所述任一流感病毒抗原，尤其是HA、NA和/或M2，尤其是HA和NA，特别是HA。在这些抗原被表达的情况下，佐剂构建体将特别表达LTA和/或LTB，尤其是同时表达两者。本文所述任一佐剂构建体可与编码抗原的任一构建体同时使用、分别使用或序贯使用。
本发明的任何两种实体可分别给药、同时给药或序贯给药。这两种构建体可分别给药、同时给药或序贯给药。这两种构建体可在同一组合物或不同组合物中给药。具体而言，在一种构建体具有佐剂效应时，两种构建体将被送递，由此可观察到佐剂效应，即：与佐剂不与抗原一起给药相比，佐剂和抗原一起给药所形成的免疫应答增强和/或时间延长。在一个优选的实例中，这两种构建体在同一组合物中送递，优选在相同的载体颗粒上送递。在其它情况下，携带某一种构建体的载体颗粒可与携带另一种构建体的载体颗粒混合。对于本文所述多种构建体的任一组合而言，可使用任一这类给药方案。
在一个优选的实施方案中，使用颗粒介导的送递技术将本发明的核酸构建体送递至靶细胞。送递核酸制剂的颗粒介导方法为本领域所熟知。
因此，在一个优选的实例中，本发明提供了包被颗粒，所述包被颗粒包括包被有本发明的一种核酸构建体或本发明的一群核酸构建体的载体颗粒。具体而言，包被颗粒适合从颗粒介导的送递装置送递。
采用各种本领域已熟知的技术，通过将本发明的核酸分子包被到载体颗粒(如核心载体)上可形成用于颗粒介导的送递系统的颗粒。载体颗粒选自在颗粒大小范围内具有合适密度的物质，该颗粒大小通常可用于从颗粒介导的送递装置进行细胞内送递。一般地，载体颗粒的直径为0.1到5μm，如0.5到3μm，优选1到2μm。在某些情况下，该颗粒的直径为1至3μm。最佳载体颗粒大小当然取决于靶细胞的直径。
通常，载体颗粒选自惰性金属。该金属是惰性的是因为它们没有生理学活性。就本发明的目的而言，可使用例如铁、钴、镍、铜、银、镉、铪、钽、钨、铂、金和不锈钢，尤其是可使用钨、金、铂和铱载体颗粒。优选钨和金颗粒。因此，在一个优选的实例中，本发明提供了金或钨的包被载体颗粒。平均直径为0.5到2.0μm的钨颗粒易于得到。尽管这种颗粒在用于颗粒加速送递方法中有着最佳密度，并为使用DNA进行高效包被提供可能，但是，钨对某些细胞类型而言可能具有毒性。还发现金颗粒或微晶金(microcrystalline gold)(如金粉A1570，可从Engelhard Corp.获得，East Newark，NJ)可用于本方法。金颗粒大小均一(从Alpha Chemicals获得，颗粒大小为1-3μm，或从Degussa，South Plainfield，NJ获得，颗粒大小在一定范围内，包括0.95μm)，并且毒性降低。微晶金具有不同的颗粒大小分布，一般在范围0.1-5μm间。但是，微晶金的不规则表面积为使用核酸高效包被提供了可能。
将DNA或RNA包被或沉积在金或钨颗粒上的多种方法为公知，并且已经进行了描述。其中大部分方法通常将预定量的金或钨与质粒DNA、CaCl2和亚精胺相结合。在包被过程中将产生的溶液一直搅拌以确保反应混合物的均一性。在核酸沉积后，包被颗粒可转移到合适的膜上并在使用前干燥，然后包被到样本模块(sample module)或样本盒(cassette)的表面，或负载到特别用于颗粒介导的送递装置的送递盒(delivery cassette)中。
或者，本发明的多核苷酸可制备成微粒组合物。使用上述标准药理配方化学进行制备。例如，多核苷酸可与一种或多种可药用赋形剂或载体相结合来以提供合适的组合物。然后，使用标准技术，如通过简单蒸发(风干)、真空干燥、喷雾干燥、冷冻干燥(冻干)、喷雾-冷冻干燥、喷雾包被、沉淀、超临界流体颗粒制备等，将制备得到的组合物制备成颗粒。如果需要，可使用在国际公布No.WO97/48485(通过引用纳入本发明)中描述的技术将得到的颗粒致密。
这些方法可用来获得核酸颗粒，该核酸颗粒大小范围在大约0.01到大约250μm，优选大约10到大约150μm，并最优选大约20到大约60μm；并且颗粒密度范围在大约0.1到大约25g/cm3，堆密度在大约0.5到大约3.0g/cm3，或更大。
含核酸分子的颗粒一旦形成，则可将其包装到一单位剂量或多单位剂量的容器中。因此，本发明还提供了颗粒介导的送递装置的剂量容器，包含本发明的包被颗粒。该容器可包含装有合适量颗粒的密封紧密的容器。该颗粒可包装成无菌制剂，因此，该密封紧密的容器可经专门设计，以使制剂在送递给受试者之前保持其无菌性。该容器优选适合直接用于颗粒介导的送递装置。一般地，该容器为胶囊、铝箔包装(foil pouches)、囊剂、药盒等形式。含合适剂量颗粒的颗粒送递装置可以预负载的形式提供。然后，预负载装置还可在紧密封闭的容器中预先包装。
包装颗粒的容器可进一步标记，以识别组合物，并提供相关剂量信息。另外，容器可用标签标记，该标签的形式由政府机关，如食品药品管理局规定，其中该标签表明其中所含有的人用核酸制剂的制造、使用或销售得到联邦法律下属机构的许可。
本发明还提供了负载有本发明的包被颗粒的颗粒介导的送递装置。优选地，该送递装置为无针注射器。适用于颗粒介导的送递装置的颗粒加速装置已为本领域所熟知。例如，现有的基因枪装置使用爆发性的、电的或气体的释放方法推进包被载体颗粒到靶细胞。包被载体颗粒可以可释放方式附着在可移动载体片层上，或以可除去的方式附着在气流通过的表面上，将该颗粒抬离表面并加速到靶标。气体释放装置的实例在美国专利No.5,204,253中描述。爆发型装置在美国专利No.4,945,050中描述。适用于本文的电释放装置的一个实例在美国专利No.5,120,657中描述。另外一种电释放装置在美国专利No.5,149,655种描述。所有这些专利的公开以引用的方式全文纳入本文。
颗粒也可使用无针注射装置给药，如在授权给Bellhouse等人的美国专利No.5,630,796(“the powderJectneedleless syringe device”)和国际公布No.WO 94/24263、WO 96/04947、WO 96/12513和WO 96/20022中描述的那些无针注射装置，并全部以引用的方式纳入本文。
诸如在美国专利No.5,630,796中描述的装置可为笔状装置，以从上到下的线性顺序依次包括贮气筒、颗粒盒或颗粒包，和与消声器相连的超声喷嘴。颗粒可提供于合适的容器如由两张可破聚合膜形成的盒等中，该聚合膜被热封闭成一垫圈状隔圈以形成独立的封闭单位。可选择膜材料以获得特定的开口模式和破裂压力，这指明了超音流启动的条件。
运行时，促使装置将压缩气体从贮气筒释放到装置内的膨胀室。被释放的气体与颗粒盒接触，并在达到足够压力时，突然突破盒膜将颗粒导入超声喷嘴用以随后的送递。喷嘴被设计以获得特定的气体速度和流动方式以将一定量颗粒送递至预定区域的靶表面。消声器用来减弱由超声气流所产生的噪音。
国际公布No.WO 96/20022中所描述的送递系统还使用压缩气体源的能量来加速和送递粉状组合物。但是，它与美国专利No.5,630,796中的系统的不同之处在于它采用冲击波而非气体流来使颗粒加速。更具体地说，由冲击波在弹性圆顶(flexible dome)后面所形成的瞬时压力的升高撞击圆顶的背部，在沿靶表面方向引起弹性圆顶的突然外翻。这种突然外翻作用以充足的速度由此以充足的动量发射出粉状组合物(其位于圆顶的外侧)，以穿透靶组织如口腔粘膜组织。粉状组合物在圆顶完全外翻瞬间释放。该圆顶还完全包含高压气流，因此它并不与组织相接触。由于气体在该送递操作中并不释放，因此该系统在本质上是安静的。这种设计可用于其它密闭或其它非常敏感的应用中，例如以将颗粒送递到受损最小的手术部位。
颗粒可在体内直接送递给受试者，或体外送递给来自受试者的细胞，然后将转化细胞重新植入受试者。就在体内送递而言，颗粒注射一般是皮下注射、表皮注射、皮内注射、粘膜内注射(如鼻腔注射、直肠注射和/或阴道注射)、腹膜内注射、静脉注射、口腔注射或肌内注射。优选地，送递到最终分化的细胞；但是，颗粒也可送递到未分化，或部分分化的细胞如血液和皮肤成纤维细胞的干细胞。最优选地，送递到皮肤表皮细胞。
颗粒以与剂量制剂相容的方式、并以在预防和/或治疗上有效的量给予受试者。该微粒组合物的“治疗有效剂量”足以治疗或预防疾病或病症症状，并将落入采用常规方法可测定的相对宽的范围内。一般地，颗粒以0.001到1000μg、更优选0.01到10.0μg的核酸/剂量的量送递。但是，所需精确剂量随接受治疗的个体的年龄和整体状况以及所选择的具体核酸序列和其它因素的不同而不同。通过临床检测可非常容易确定合适的有效量。就确定所需量而言，《医师药学参考书》和Goodman和Gilman的《治疗的药理学基础》是有用的。
分析
差异表达分析
适当的元件实用性试验可确定元件对多肽表达的影响。在一个优选的实例中，多肽可为流感病毒抗原、其变体或两者的片段。检测元件实用性的比较基础是“基本载体”，一般(除非另外提及)是指质粒，它含hCMV启动子、hCMV外显子1、hCMV外显子2的9个碱基、HBV preS2的5’UTR和兔β-珠蛋白聚腺苷酸化区，它位于驱动编码序列表达处。一般地，基本载体是pJV7384、pJV7401、pJV7450或pJV7533。在某些实例中，可将本文所述具有上述元件的任一载体用作基本载体。在一个实例中，pPJV1671用作基本载体。pPJV2012、pPJV7788和pPML7789也可用作基本载体。
将异源内含子和3’UTR加入基本载体，或将启动子序列、外显子、5’UTR和polyA位点导入基本载体中形成待测表达载体。本文所述任一载体的元件可与待测序列一起导入并与基本序列相比较。因此，可检测功能变体或片段。
基本载体和待测载体被转化至合适的宿主细胞，并就多肽表达水平对该细胞进行了分析。优选地，使用哺乳动物宿主细胞。合适的细胞包括哺乳动物HEK 293T、CHO、HeLa、BHK、3T3或COS细胞。在某些实例中，可使用SSC15或B16细胞。
一般地，功能元件会产生与基本载体相当的表达，例如至少与之相同或更高。优选地，表达在一种以上细胞类型并使用一个以上编码序列检测。在某些实例中，功能元件可引起较基本载体略低的表达，例如至少为基本载体的表达的25％，尤其是至少50％，优选至少60％，更优选至少70％，更优选至少80％，甚至更优选至少90％，还更优选至少90％。通常，若具体元件的变体或片段表现出这些水平的表达，则它仍然被认为代表具体元件的功能变体或片段。但是，优选功能变体和片段会引起较本文所述基本载体更高的表达。例如，升高百分比可为上述任一百分比。
合适的实验方法提供于例如下面的实施例1至18中。
差异免疫原性分析
若待表达多肽为抗原，进行另一检测以鉴定功能性构建体元件或特别优选的构建体元件。具体而言，可进行这一测试，其中抗原为例如流感病毒抗原、其片段或两者的变体。在此分析中，元件对免疫应答的影响在将表达载体送递到待测机体后测定。针对抗原的抗体水平是判断免疫应答的最为简单的方式。将不同组次的小鼠用如上构建的基本载体或待测载体接种。在恰当的时间后收集血清并分析抗体水平。
该实验进行了两次，并用两次实验所有组次中获得的抗体水平作图。和基本载体相比，在两次实验中，功能元件针对一特定抗原将产生至少相同或更高的抗体滴度。优选地，可使用一种以上抗原观察到该结果，表明了在该表达系列中元件的实用范围。在某些实例中，功能元件可引起较基本载体略低的抗体滴度，例如至少为在基本载体中所观察到的抗体滴度的25％，尤其是至少50％，优选至少60％，更优选至少70％，更优选至少80％，甚至更优选至少90％，还更优选至少90％。通常，若具体元件的变体或片段表现出这一抗体滴度，则它仍然被认为代表具体元件的功能变体或片段。但是，优选功能变体和片段会引起较本文所述基本载体更高的滴度。例如，升高百分比可为上述任一百分比。
在均给予了相同抗原的情况下，通过将测试佐剂载体和标准佐剂进行比较，还可对佐剂载体进行评估。使用仅给予抗原作为对照，对两种载体的佐剂作用进行比较。本文所述任一佐剂载体均可用作标准品。佐剂作用的升高或降低的百分比可为本文所述这些水平的任一百分比。
合适的实验方法提供于例如下面的实施例14中。合适的实验方案还描述于下面的实施例15至18中。
C.实验
下面是实施本发明的具体实施方案的实施例。这些实施例仅供说明，无意于以任何方式限制本发明的范围。
已努力确保所使用的数字(如含量、温度等)的准确性，但是毫无疑问也应允许某些实验误差和偏差。
方法
标准PCR条件
下面是用于构建载体的标准PCR条件：含1.5mM MgCl2的1×PCR核心缓冲液(Promega Corporation，Madison，WI)，每种引物各0.400μM，每种dNTP(USB，Inc，Cleveland，OH)各200μM，2.5μTaq聚合酶(PromegaCorporation，Madison，WI)，1.0ng模板DNA，加水到100μl，并用矿物油(Aldrich Chemical，Inc，Milwaukee，WI)覆盖。PTC-200热循环器(thermocycler)(MJ Research，Inc.Waltham，MA)被编程执行如下程序：95℃×4’，30个循环(95℃×1’/55℃×1’15”/72℃×1’)，72℃×10’，4℃保持)。在限制性内切酶(New England Biolabs，Beverly，MA)剪切前，使用QIAquickPCR纯化试剂盒(Qiagen Inc，Valencia，CA)从PCR反应中取出扩增产物。
所有PCR产物在克隆后被测序以确定扩增的保真度。
实施例1.乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)载体系列的构建
构建了许多表达HBsAg的质粒表达载体。
原材料
(i)pWRG7128(Roy，M，et.al.Vaccine(2001)19：764-778)，它含有hCMV立即早期启动子序列、hCMV主要立即早期基因的第一外显子、第一内含子和部分第二外显子，具有侧翼区域(来源于HBV preS2 5’UTR的序列和3′转录后应答元件)的HBsAg编码序列和牛生长激素聚腺苷酸化区域(BGHpA)。
(ii)pJV7284，pWRG7128的衍生物，它用兔珠蛋白聚腺苷酸化区(RBGpA)替换BGHpA。
(a)pPJV7384(CMV(无内含子)、HBV preS2 5’UTR和RBGpA)
采用标准条件，用JF93(SEQ ID NO：15)和F110(SEQ ID NO：16)扩增pWRG7128，Sal 1和BamH 1剪切，以分离含CMV启动子、外显子1和部分外显子2序列的插入片段。BamH 1和BstX1剪切pAM6(ATCC，Mannassas，VA)，以分离含HBsAg 5’UTR和大概70％HBsAg编码区的插入片段。Sal 1和BstX 1剪切pJV7284，以形成其中连接有这两个插入片段的载体片段，得到pJV7293。
用引物GW1(SEQ ID NO：17)和JF254(SEQ ID NO：18)PCR扩增pWRG7128，并用BstX 1和Bgl2剪切以分离含HBsAg编码区3’端的插入片段。BstX 1和Bgl2剪切pPJV7293，以形成其中连接有该插入片段的载体片段，得到载体pPJV7384。
(b)pPJV7382(CMV(无内含子)、HBsAg 3’UTR、HBV preS2 5’UTR和RBGpA)
Xho 1和Xba 1剪切pPJV7293，以形成含CMV启动子/外显子和5’-UTR、具有HBsAg编码序列5’端的的插入片段。Xba 1和Bcl 1剪切pWRG7128，以形成含大部分HBsAg编码序列和其3’-UTR的插入片段。Xho 1和Bgl 2剪切pPJV7284，以形成其中连接有这两个插入片段的载体片段，得到载体pPJV7382。
(c)pPPJV7389(CMV(RIA))、HBsAg 3’UTR、HBV preS2 5’UTR和RBGpA)
使用引物GW150(SEQ ID NO：19)和JF255(SEQ ID NO：20)将大鼠胰岛素内含子A(RIA)从质粒p5’rlns(来源未知)PCR扩增。BamH 1剪切PCR产物，并插入经BamH 1线性化的pPJV7382，得到pPJV7389。
(d)pPJV7387(CMV(RIA))、HBV preS2 5’UTR和RBGpA)
BstX 1和EcoR 1剪切pPJV7384，以形成含HBsAg编码区的3’端和RBGpA的插入片段。BstX 1和EcoR 1剪切pPJV7389，以形成其中连接有这一插入片段的载体片段，得到载体pPJV7387。
实施例2.单纯疱疹病毒糖蛋白D抗原(HSVgD)载体系列的构建
构建了许多表达HSVgD的质粒表达载体。
原材料
(a)pPJV7334，pWRG7284(pPJV 7284)的衍生物，HBsAg编码序列由紧邻ATG起始密码子下游的框内Nhe 1置换，后继带有BamH1的填充片段，紧接HBC Enh(增强子)的5’端。
(b)pWRG7202，含填充片段的pGem3Z(Promega)的衍生物，该填充片段为编码序列融合到Nhe 1位点下游的人组织纤溶酶原激活剂(TPA)信号肽提供了可能。
(a)pPJV7392(CMV(天然内含子)、HBsAg 3’UTR、HBsAg 5’UTR和RBGpA)
用引物DS1(SEQ ID NO：21)和DA1(SEQ ID NO：22)从病毒DNA原种(AdcancedBiotech，Inc，Columbia，MD)PCR扩增HSV2gD的编码区，并用Nhe 1和EcoR1剪切，以形成一插入片段。Nhe 1和EcoR 1剪切pWRG7202，以形成其中连接由该插入片段的载体片段，产生载体pPJV7391。
Nhe 1和Bgl 2剪切pPJV7391，以形成含HSV2 gD编码序列的插入片段。Nhe 1和BamH 1剪切pPJV7334，以形成其中连接有该插入片段的载体片段，产生载体pPJV7392。该载体由下列表达元件组成：hCMV立即早期启动子序列，hCMV主要立即早期基因的第一外显子、第一内含子和部分第二外显子，HBsAg的5’-UTR，HSV2 gD基因的编码序列，HBsAg的3’-UTR和RBGpA。
(b)pPJV7399(CMV(无内含子)、HBsAg 3’UTR、HBsAg 5’UTR和RBGpA)
按如下方法构建无内含子的pPJV7392。HindIII和Nde 1剪切pPJV7384，以分离含卡那霉素抗性基因5’端和CMV启动子的插入片段。Nde 1和Ssp 1剪切pPJV7384，以分离含CMV启动子3’端、CMV外显子1/2和HBsAg 5’-UTR的5’端的插入片段。该插入片段插入pPJV7392中，并且除去Hind3-Ssp 1片段，得到pPJV7399。
(c)pPJV7400(CMV(RIA)、HBsAg 3’UTR、HBsAg 5’UTR和RBGpA)
按如下方法构建RIA形式的pPJV7392。HindIII和Nde 1剪切pPJV7384，以分离含卡那霉素抗性基因5’端和CMV启动子的插入片段。Nde 1和Ssp 1剪切pPJV7387，以分离含CMV启动子3’端、CMV外显子1/2(部分)、RIA和HBsAg5’-UTR 5’端的插入片段。该插入片段插入pPJV7392中，并且除去Hind 3-Ssp1片段，得到pPJV7400。
(d)pPJV7401(CMV(无内含子)、HBsAg 5’UTR和RBGpA)
按如下方法构建无3’-UTR的pJV7399。Bsp 120I和Bgl 2剪切pPJV7391，以分离含HSV2 gD基因的3’端的插入片段。Bgl 2和EcoR 1剪切pJV7284，以分离RBGpA信号。将这些插入片段插入pPJV7399中，并且除去Bsp 120I-EcoR1片段，得到pPJV7401。
(e)pPJV7402(CMV(RIA)、HBsAg 5’UTR和RBGpA)
按如下方法构建无3’-UTR的pPJV7400。Bsp 1201和 Bgl 2剪切pPJV7391，以分离含HSV2 gD基因3’端的插入片段。Bgl 2和EcoR 1剪切pPJV7284，以分离RBGpA信号。将这些插入片段连接到pPJV7400中，并且除去Bsp 120I-EcoR1片段，得到pPJV7402。
实施例3.Flu M2抗原载体系列的构建
(a)pPJV7450(CMV(无内含子)、HBsAg 5’UTR和RBGpA)
使用引物JF301(SEQ ID NO：23)和JF302(SEQ ID NO：24)从质粒pFL-M2(Joel Haynes，pPJV)PCR扩增Flu M2编码区，并用Nhe 1和Bgl2剪切，以形成一插入片段。Nhe 1和Bgl 2剪切pPJV7401，以形成其中连接有该插入片段的载体片段，得到pPJV7450。
(b)pPJV7452(CMV(无内含子)、HBsAg 3’UTR、HBsAg 5’UTR和RBGpA)
使用引物JF84(SEQ ID NO：25)和JF225(SEQ ID NO：26)从pPJV7389 PCR扩增3’UTR片段，Bsp120I剪切、T4 DNA聚合酶填充，Bgl 2接头(cat#1036，New England Biolabs)连接。然后用Bgl2和EcoR1剪切该片段，以分离含HBsAg 3’UTR和RBGpA区的插入片段。Bgl2和EcoR1剪切pPJV7450，以形成其中连接由该插入片段的载体片段，得到pPJV7452。
(c)pPJV7458(CMV(RIA)、HBsAg 5’UTR和RBGpA)
按如下方法构建含RIA形式的pPJV7450：BamH 1剪切pPJV7389，以分离含RIA的插入片段。BamH 1剪切pPJV7450，以形成其中连接有该插入片段的载体片段，得到pPJV7458。
(d)pPJV7468(CMV(RIA)、HBsAg 3’UTR、HBsAg 5’UTR和RBGpA)
按如下方法构建含HBsAg 3’UTR形式的pPJV7458。Bgl2和EcoR1剪切pPJV7452，以制备含HBsAg 3’UTR和RBGpA的插入片段。Bgl 2和EcoR 1剪切pPJV7458，以形成其中连接有该插入片段的载体片段，得到pPJV7468。
实施例4.β-gal载体系列的构建
(a)pPJV7488(CMV(无内含子)、HBsAg 3’UTR、HBsAg 5’UTR和RBGpA)
使用引物JF335(SEQ ID NO：27)和JF336(SEQ ID NO：28)PCR扩增CMV-β(Clontech)，并用Nhe 1和Bgl 2剪切，以分离编码β-半乳糖苷酶的插入片段。Nhe 1和Bgl 2剪切pPJV7452，以形成其中连接有该插入片段的载体片段，得到pPJV7488。
(b)pPJV7533(CMV(无内含子)、HBsAg 5’UTR和RBGpA)
Bgl 2和EcoR 1剪切pPJV7450，以分离含RBGpA的插入片段。Bgl 2和EcoR1剪切pPJV7488，以形成其中连接有该插入片段的载体片段，得到pPJV7533。
(c)pPJV7551(CMV(RIA/Nhel)、HBsAg 3’UTR、HBsAg 5’UTR和RBGpA)
Xho 1和BamH 1剪切pPJV7530(见实施例5)，以分离含穿过RIA的CMV启动子的插入片段。Xho 1和BamH 1剪切pPJV7488，以形成其中连接有该插入片段的载体片段，得到pPJV7551。
(d)pPJV7552(CMV(RIA/Nhel)、HBsAg 5’UTR和RBGpA)
Xho 1和BamH 1剪切pPJV75 30，以分离含穿越至RIA的CMV启动子的插入片段。Xho 1和BamH 1剪切pPJV7533，以形成其中连接有该插入片段的载体片段，得到pPJV7552。
实施例5.pPJV表达载体(pPJV7563)的构建
(a)pPJV7496
使用引物JF357(SEQ ID NO：29)和JF365(SEQ ID NO：30)pCR扩增pPJV7389，T4 DNA聚合酶处理钝化末端，Sal 1剪切，以分离编码卡那霉素抗性基因的插入片段。Ava 1剪切pPJV7389，T4 DNA聚合酶处理钝化末端，Sal 1剪切，以分离其中连接有该插入片段的载体片段，得到pPJV7496。
(b)pPJV7530
使用引物JF393(SEQ ID NO：31)和JF406(SEQ ID NO：32)PCR扩增pPJV7389，Bgl2和BamH 1剪切，以分离含RIA(缺失内部Nhe1位点)的插入片段。BamH1剪切pPJV7496，以制备其中连接有该插入片段的载体片段，得到pPJV7530。
(c)pPJV7549
BamH 1和EcoR 5剪切pPJV7468，以分离含M2和部分HBV 3’ENH的插入片段。BamH 1和EcoR5剪切pPJV7530，以制备其中连接有该插入片段的载体片段，得到pPJV7549。
(d)pPJV7563
将引物JF256(SEQ ID NO：33)和JF257(SEQ ID NO：34)退火以制备由多克隆位点组成的插入片段。Nhe 1和Bgl2剪切pPJV7549，以制备其中连接有该插入片段的载体片段，得到pPJV7563。图12示出pPJV7563质粒图谱。图13给出质粒pPJV7563的碱基组成。质粒pPJV7563中的组分及其位置如下所示：
1-44转座子903序列
45-860来自转座子903的卡那霉素抗性编码序列
861-896转座子903序列
897-902 Sal1位点
903-1587 CMV启动子
1588-1718来自CMV立即早期基因的非翻译前导序列
1719-1724 BamH1和Bgl11限制性酶的融合
1725-1857大鼠胰岛素内含子A
1858-1863BamH1位点
1864-1984 HBV表面抗原5’非翻译前导序列
1985-1993合成起始密码子/Nhe1克隆位点
1994-2011合成克隆位点
2012-2544 HBV增强子
2545-2555原载体序列。NCBI数据库中没有命中结果
2556-2686兔β-珠蛋白聚腺苷酸化区
2687-3759 pUC19载体序列
实施例6.使用人分泌型碱性磷酸酶(SEAP)和人IgG Fc片段(hFc)作
为模型抗原，构建信号肽表达载体系列
(i)pPJV7507(hTPAsp和SEAP)
使用引物JF320(SEQ ID NO：35)和JF321(SEQ ID NO：36)PCR扩增pSEAP-Basic(Clontech)，Nhe 1和Bgl 2剪切，以分离由人SEAP片段组成的插入片段。Nhe 1和Bgl 2剪切pPJV7079(Macklin，et.al.)，以制备其中连接有该插入片段的载体片段，得到pPJV7507。
(ii)pPJV7508(hTPAsp和hFc)
使用引物JF386(SEQ ID NO：37)和FcAS(SEQ ID NO：38)PCR扩增人DNA，然后用Nhe 1和Bgl 2剪切，以分离由人IgG Fc片段组成的插入片段。Nhe 1和Bgl 2剪切pPJV7079，以制备其中连接有该插入片段的载体片段，得到pPJV7508。
(iii)抑肽酶信号肽编码序列的制备
使用引物JF355(SEQ ID NO：40)和JF356(SEQ ID NO：41)PCR扩增合成的寡核苷酸JF354(SEQ ID NO：39)，以形成抑肽酶信号肽的编码序列。
(iv)烟草伸展蛋白信号肽编码序列的制备
使用引物JF349(SEQ ID NO：43)和JF350(SEQ ID NO：44)PCR扩增合成的寡核苷酸JF348(SEQ ID NO：42)，以形成烟草伸展蛋白信号肽的编码序列。
(v)鸡溶菌酶信号肽编码序列的制备
使用引物JF352(SEQ ID NO：46)和JF353(SEQ ID NO：47)PCR扩增合成的寡核苷酸JF351(SEQ ID NO：45)，以形成鸡溶菌酶信号肽的编码序列。
(a)Flu M2抗原信号肽系列
pPJV7499(CMV(无内含子)、HbsAg5’UTR、RBGpA、抑肽酶信号肽)
pPJV7497(CMV(无内含子)、HbsAg5’UTR、RBGpA、烟草伸展蛋白信号肽)
pPJV7500(CMV(无内含子)、HbsAg5’UTR、RBGpA、鸡溶菌酶信号肽)
SPe 1和Nhe 1剪切信号肽编码序列，以分离插入片段。Nhe 1剪切pPJV7450，以制备其中连接有该插入片段的载体片段，得到pPJV7499(抑肽酶)、pPJV7497(烟草伸展蛋白)和pPJV7500(鸡溶菌酶)。
(b)SEAP信号肽系列
pPJV7513(CMV(无内含子)、HbsAg5’UTR、RBGpA、抑肽酶信号肽)
pPJV7512(CMV(无内含子)、HbsAg5’UTR、RBGpA、烟草伸展蛋白信号肽)
pPJV7510(CMV(无内含子)、HbsAg5’UTR、RBGpA、鸡溶菌酶信号肽)
Xho 1和Nhe 1剪切pPJV7499、7497和7500，以分离由穿过质粒的信号肽编码序列的CMV启动子组成的插入片段。Xho 1和Nhe 1剪切pPJV7507，以制备其中连接有该插入片段的载体片段，得到pPJV7513(抑肽酶)、pPJV7512(烟草伸展蛋白)和pPJV7510(鸡溶菌酶)。
(c)hFc信号肽系列
pPJV7524(CMV(无内含子)、HbsAg5’UTR、RBGpA、抑肽酶信号肽)
pPJV7525(CMV(无内含子)、HbsAg5’UTR、RBGpA、烟草伸展蛋白信号肽)
pPJV7526(CMV(无内含子)、HbsAg5’UTR、RBGpA、鸡溶菌酶信号肽)
Xho 1和Nhe 1剪切pPJV7499、7497和7500，以分离由穿过质粒的信号肽编码序列的CMV启动子组成的插入片段。Xho 1和Nhe 1剪切pPJV7508，以制备其中连接有该插入片段的载体片段，得到pPJV7524(抑肽酶)、pPJV7525(烟草伸展蛋白)和pPJV7526(鸡溶菌酶)。
实施例7.人分泌型碱性磷酸酶(SEAP)系列的构建
(a)pPJV7531(CMV(无内含子)、HbsAg5’UTR、RBGpA、鸡溶菌酶信号肽)
Sal 1和Bgl 2剪切pPJV7510，以分离含穿过溶菌酶信号肽的CMV启动子的插入片段。Sal 1和Bgl 2剪切pPJV7450，以形成其中连接有该插入片段的载体片段，得到pPJV7531。
(b)pPJV7554(CMV(RIA/Nhe1)、HBsAg5’UTR、RBGpA、鸡溶菌酶信号肽)
Xho 1和BamH 1剪切pPJV7530，以分离含穿过RIA的CMV启动子的插入片段。Xho 1和BamH 1剪切pPJV7531，以形成其中连接有该插入片段的载体片段，得到pPJV7554。
(c)pPJV7568(CMV(无内含子)、HBsAg 3’UTR、HBsAg5’UTR、RBGpA、
鸡溶菌酶信号肽)
Bgl 2和EcoR 1剪切pPJV7563，以分离含HBV 3’UTR和RBGpA的插入片段。Bgl 2和EcoR 1剪切pPJV7531，以形成其中连接有该插入片段的载体片段，得到pPJV7568。
(d)pPJV7572(CMV(RIA/Nhel)、HBsAg 3’UTR、HBsAg5’UTR、RBGpA、
鸡溶菌酶信号肽)
Bgl 2和EcoR 1剪切pPJV7563，以分离含HBV 3’UTR和RBGpA的插入片段。Bgl 2和EcoR 1剪切pPJV7554，以形成其中连接有该插入片段的载体片段，得到pPJV7572。
实施例8.使用鸡角蛋白和鸡心脏的肌动蛋白内含子构建β-gal和HBsAg
载体
(a)pPJV7557(β-gal、CMV(cA内含子)、HbsAg3’UTR、HbsAg5’UTR和
RBGpA)
使用引物JF430(SEQ ID NO：48)和JF442(SEQ ID NO：49)PCR扩增鸡DNA，Bgl 2和BamH 1剪切，以分离由鸡心脏的肌动蛋白的内含子和侧翼外显子序列组成的插入片段。BamH 1剪切pPJV7488，以制备其中连接有该插入片段的载体片段，得到pPJV7557。
(b)pPJV7558(β-gal、CMV(cK内含子)、HbsAg3’UTR、HbsAg5’UTR和
RBGpA)
使用引物JF421(SEQ ID NO：50)和JF444(SEQ ID NO：51)PCR扩增鸡DNA，Bgl 2和BamH 1剪切，以分离由鸡角蛋白基因的内含子和侧翼外显子序列组成的插入片段。BamH 1剪切pPJV7488，以制备其中连接有该插入片段的载体片段，得到pPJV7558。
(c)pPJV7578(HBsAg、CMV(cA内含子)、HbsAg3’UTR、HbsAg5’UTR和
RBGpA)
Sal 1和BamH 1剪切pPJV7557，以分离由穿过内含子区的CMV启动子组成的插入片段。Sal 1和BamH 1剪切pPJV7496，以制备其中连接有该插入片段的载体片段，得到pPJV7558。
(d)pPJV7579(HBsAg、CMV(cA内含子)、HbsAg3’UTR、HbsAg5’UTR和
RBGpA)
Sal 1和BamH 1剪切pPJV7558，以分离由穿过内含子区的CMV启动子组成的插入片段。Sal 1和BamH 1剪切pPJV7496，以制备其中连接有该插入片段的载体片段，得到pPJV7579。
实施例9.HBsAg载体系列抗原表达的体外分析
在第一天，SCC15(ATCC)或B16(来源未知，从ATCC获得)细胞以20％-40％汇合(confluency)接种到6孔组织培养板，并在培养箱中过夜生长。宿主细胞在ATCC推荐的培养基中增殖。
在第二天，实施转染反应。对每种待测载体而言，将20μl Lipofectin试剂(Life Technologies Inc，Grand Island，NY)加至180μl Optimem培养基(Life Technologies Inc，Grand Island，NY)，并在室温下孵育45min。对每种待测载体，在40min时，2μg载体与200μl Optimem混合。在45min时，将载体和Lipofection溶液混合在一起，并在室温下再静置10分钟。在最后孵育期间，将接种的宿主细胞从培养箱中取出并用Optimem培养基洗涤两次。在10min时，将1.6ml Optimem加至Lipofectin/载体混合物，并将1ml所得混合物加到两个细胞孔中。将宿主细胞再次放入培养箱并静置5小时，在5小时时，去除Lipofectin/载体混合物，并换上标准细胞生长培养基。
在更换培养基后18到24小时，从组织培养板中取出从50到100μl的细胞生长培养基，将该样本放入AUSZYMEMonoc Ional诊断试剂盒(AbbottLaboratories，Abbott Park，IL)中的反应池，分析抗原表达情况。待测样本的体积用PBS调至200μl，然后每个样本中加入50μl缀合物和反应微球。反应池在40℃孵育80min，此后，洗去孔中所有液体反应组分。将反应微球转移到新的试管中，此后加入300μl显色反应缓冲液。30分钟后加入1M硫酸终止显色反应，并在490nm测定反应的吸光度。图1中示出的数据是两次实验中两个孔的平均吸光度。
如图1所示，将RIA、HBV 3’UTR或两者共同导入基本载体(CMV启动子、外显子和聚腺苷酸化区)提高了SCC15细胞中HBsAg的表达。如图2所示，将鸡角蛋白或鸡心脏的肌动蛋白内含子导入基本载体(CMV启动子、外显子、HBV3’UTR和聚腺苷酸化区)提高了SCC15细胞中HBsAg的表达。
实施例10.β-gal载体系列抗原表达的体外分析
如实施例9所述，转染SSC-15或B16宿主细胞。
在更换培养基后的18到40小时，去除培养基上清，并用PBS洗涤细胞。去除洗涤液后，用500μl裂解缓冲液(50mM NaPO4、0.1％Triton X-100，pH7)孵育细胞5min，以裂解细胞，然后采用物理方法将细胞刮离塑料皿。将裂解液离心两分钟以除去细胞碎片，并将10到25μl澄清裂解液加入到500μl反应缓冲液(80ug/ml邻硝基苯-吡喃半乳糖苷(o-nitrophenylgalactopyranoside)、50mM NaPO4，pH7)并在37℃孵育10到20分钟。加入500μl 1M Na2CO3中止反应并在405nm读取吸光度。数据用增强载体(含有内含子、HBVenh或两者均含有)的表达与基本载体的表达的比率表示。
RIA、HBV 3’UTR或两者共同加入基本载体(CMV启动子、外显子和聚腺苷酸化区)提高了β-gal在两种细胞系中的表达。图3示出了SCC15细胞得到的结果。将鸡角蛋白或鸡心脏的肌动蛋白内含子加到基本载体(CMV启动子、外显子、HBV 3’UTR和聚腺苷酸化区)提高了β-gal在两种细胞系中的表达。图2示出了B16细胞得到的结果。
实施例11.HSV gD载体系列抗原表达的体外分析
如实施例9所述，转染SSC15或B16宿主细胞。转染18小时后，将板冰浴15min。然后用2ml PBS(Biowhittaker，Walkwille，MD)洗涤各孔。0.05％PBS稀释的戊二醛(Polysciences Inc，Warrington，PA)固定细胞，并在室温下孵育30min。随后所有的孵育在室温下持续1小时并在每次孵育之间，进行如上所述的洗涤。用2ml 5％奶粉(溶于PBS)(Bio Rad Laboratories，Melville，NY)封闭板中的细胞。随后用2％奶粉/PBS/0.05％Tween-20(Sigma，St.Louis，MO)1∶1000稀释的抗gD单克隆抗体(ABI，Columbia，MD)1ml和用PBS/0.1％Tween-20 1∶2500稀释的山羊抗小鼠HRP(KPL，Gaithersburg，MD)1ml孵育。用1ml TMB微孔底物(BioFX，Owings Mills，MD)进行显色反应。1M H2SO4终止反应，将液体转移到塑料比色皿中并在450nm读取光密度值。数据用增强载体(含有内含子、HBVenh或两者均含有)的表达与基本载体的表达的比率表示。
将含或不含HBV 3’UTR的RIA导入到基本载体(CMV启动子、外显子和聚腺苷酸化区)，提高了HSV gD在两种细胞中的表达。图4示出了SC15得到的结果。
实施例12.SEAP载体系列抗原表达的体外分析
如实施例9所述，转染SSC15或B16宿主细胞。在更换培养基后18到40小时，去除培养基上清，并将上清在70℃加热30min。将10-25μl热灭活的上清与1/10体积的100mM I-高精氨酸一起孵育5min。将500μl碱性磷酸酶反应缓冲液(cat#172-1063，Bio-Rad，根据说明书制备)加入该裂解液并在37℃孵育10到20min。加入500μl 1M NaOH终止反应并在405nm读取吸光度。数据用增强载体(含有内含子、HBVenh或两者均含有)的表达与基本载体的表达的比率，或实验组信号肽的表达与人TPA信号肽载体的表达的比率表示。
如图5所示，RIA、HBV 3’UTR或两者一起导入基本载体(CMV启动子、外显子和聚腺苷酸化区)提高了SEAP在B16细胞中的表达。出乎意料的是，仅仅将HBV 3’UTR导入基本载体(CMV启动子、外显子和聚腺苷酸化区)提高了SEAP在SCC15细胞中的表达。
将牛抑肽酶、鸡溶菌酶或烟草伸展蛋白的信号肽加入到成熟的SEAP的N端，为SEAP有效分泌至两种细胞系的细胞培养基上清提供了可能。图6示出B16细胞的结果。
实施例13.人IgG Fc片段信号肽系列抗原表达的体外分析
如实施例9所述，转染SSC15或B16宿主细胞。在更换培养基后的18到40小时，去除培养基上清。
ELISA板(Costar)每孔加入100μl山羊抗人IgG(Sigma#I 3382，用碳酸盐包被缓冲液1/1000稀释)，并在4℃过夜孵育。随后所有的孵育均在室温下持续1小时，并在每次孵育之间用洗涤液(10mM Tris、150mM NaCl、0.1％Brij-35，pH8.0)洗涤。然后用100μl 5％奶粉(溶于PBS)封闭，随后与用稀释缓冲液(2％奶粉、PBS、0.05％Tween-20)系列稀释的培养基上清一起孵育。然后与100μl每孔的山羊抗人IgG/HRP(Sigma#A6029，稀释缓冲液1/5000稀释)一起孵育，然后用100μl TMB微孔底物进行显色反应。用100μl 1M H2SO4终止反应，并在405nm读取吸光度。数据用实验组信号肽的表达与人TPA信号肽载体的表达的比率表示。
将牛抑肽酶、鸡溶菌酶或烟草伸展蛋白的信号肽加入到人Fc片段的N端，为hFc有效分泌进入两种细胞系的细胞培养基上清提供了可能。图6示出B16细胞的结果。
实施例14.HBsAg、HSVgD和Flu-M2质粒表达载体在小鼠的免疫接种中的
用途
(a)免疫接种药筒的制备
对每个待测质粒而言，称取25mg 2微米金粉到离心管中。在加入250μl等份50mM亚精胺(Aldrich Chemical，Inc，Milwaukee，WI)后，振荡试管并经短时间的超声破碎。离心去除金粉，换上100μl新鲜的亚精胺。振荡使金粉重新悬浮，然后将25μg DNA加入试管中混合。边轻轻振荡试管，边加入100μl 10％CaCl2(Fujisawa USA，Inc，Deerfield，IL)，以在金珠上沉淀DNA。沉淀反应可在工作台上进行10min，随后通过短时间离心收集金珠并用无水乙醇(Spectrum Quality Products，Inc，Gardena，CA)洗涤三次，以除去过量的沉淀试剂。然后用溶于无水乙醇的3.6ml 0.05mg/ml聚乙烯吡咯烷酮(360KD，Spectrum Quality Products，Inc，Gardena，CA)重悬洗涤后的金珠/DNA复合物。然后将此浆液注入位于旋管器(tube turner，PowderJectVaccines)中的Tefzel管(McMaster-Carr，Chicago，IL)中，用金珠/DNA复合物包被Tefzel管内侧。在旋管过程完成后，试管被切成0.5”的疫苗“针剂”，该针剂被负载于XR1装置(PowderJect Vaccines)中，以送递给小鼠。
(b)接种程序
用Ketaset(Fort Dodge)和Rompun(Bayer)的混合物麻醉4到6周龄的小鼠。用电动剪毛机剃腹部以除去体毛，通过XR1装置(450psi)将两个疫苗无交叠“针剂”送递到剃毛区。将动物放回笼中并在接种后6周采血。Balb/c小鼠用于评估HBsAg表达载体，Swiss Webster小鼠用于评估HSV-gD和Flu M2表达载体。
血清中抗-HBsAg抗体的分析
在第六周从接种动物获取血样。将从这些血样中分离的血清放入AUSABEIA诊断试剂盒(Abbott Laboratories，Abbott Park，IL)的反应池的孔中。所加血清的体积取决于样本的抗体滴度，将样本用样本稀释缓冲液稀释以落入用定量分析图可获得的值内。从AUSAB定量分析板(AbbottLaboratories，Abbott Park，IL)每个小瓶中取出200μl加入到反应池的孔中。每孔中加入一个微球，随后密封反应池并在40℃孵育二小时，然后洗去孔中所有的液体反应组分。在每个洗涤后的孔内加入200μl缀合物混合物，随后密封反应池并在40℃孵育二小时，然后洗去孔中所有的液体反应组分。珠被转移到新的试管，随后加入300μl显色反应缓冲液。30分钟时加入1M硫酸终止显色反应，并用Quantum II分光光度计(Abbott Laboratories，Abbott Park，IL)490nm检测反应物的吸光度。通过将样本的吸光度与由定量图产生的标准曲线相比较，分光光度计可以计算样本的抗体水平。然后用稀释因子矫正抗体水平。图7所示数据是用某一特定载体接种的所有动物的几何平均滴度。
血清中抗Flu M2抗原抗体的分析
用浓度为1μg/ml的合成Flu M2肽(QCB/Biosource，Hopkinton，MA)(溶于PBS(Biowhittaker，Walkerville，MD))包被96孔Costar培养基结合ELISA板(Fisher Scientific，Pittsburgh，PA)，并在4℃过夜孵育。10mMTris(Sigma，St.Louis，MO)/150mM NaCl(Fisher Scientific)/0.1％Brij-35(Sigma)将板洗涤三次，然后用5％奶粉(Bio Rad Laboratories，Melville，NY)(溶于PBS)室温封闭1小时。随后所有的孵育均在室温下进行1小时，并如上所述在每次孵育之间洗涤。2％奶粉/PBS/0.05％Tween-20(Sigma)稀释样本小鼠血清、标准品(高滴度，抗M2小鼠血清)和阴性对照(抗HBsAg小鼠血清)，并在ELISA板中孵育。用2％奶粉/PBS/0.05％Tween-201∶8000稀释山羊抗小鼠IgG(H+L)生物素缀合的抗体(Southern BiotechnologyAssociate，Birmingham，AL)，随后用PBS/0.1％Tween-20 1∶8000稀释链霉亲和素-辣根过氧化物酶缀合物(Southern Biotechnology)。用底物TMB(BioFX，Owings Mills，MD)进行显色反应。用1M H2SO4终止反应并用超精酶标仪(Molecular Devices，Sunnyvale，CA)在450nm读取吸光度。使用SoftMaxPro 4.1软件(Molecular Devices)，四参数分析计算端点滴度，并将滴度根据具有已知滴度的标准血清进行标准化，以将组间和组内的变异最小化。结果如图7所示。
血清中抗HSV gD抗原抗体的分析
用浓度为1μg/ml的HSV gD(Viral Therapeutics，Ithaca，NY)蛋白(溶于PBS(Biowhittaker，Walkerville，MD))包被96孔Costar培养基结合ELISA板(Fisher Scientific，Pittsburgh，PA)，并在4℃过夜孵育。10mMTris(Sigma，St.Louis，MO)/150mM NaCl(Fisher Scientific)/0.1％Brij-35(Sigma)将板洗涤三次，然后用5％奶粉(Bio Rad Laboratories，Melville，NY)(溶于PBS)室温封闭1小时。随后所有的孵育均在室温下进行1小时，并如上所述在每次孵育之间洗涤。2％奶粉/PBS/0.05％Tween-20(Sigma)稀释样本小鼠血清、标准品(高滴度，抗gD小鼠血清)和阴性对照(抗HBsAg小鼠血清)，并在ELISA板中孵育。用2％奶粉/PBS/0.05％Tween-201∶8000稀释山羊抗小鼠IgG(H+L)生物素缀合的抗体(Southern BiotechnologyAssociate，Birmingham，AL)，随后用PBS/0.1％Tween-201∶8000稀释链霉亲和素-辣根过氧化物酶缀合物(Southern Biotechnology)。用底物TMB(BioFX，Owings Mills，MD)进行显色反应。用1M H2SO4终止反应并用超精酶标仪(Molecular Devices，Sunnyvale，CA)在450nm读取吸光度。使用SoftMaxPro 4.1软件(Molecular Devices)，四参数分析计算端点滴度，并将滴度根据具有已知滴度的标准血清进行标准化，以将组间和组内的变异最小化。结果如图7所示。
实施例15.质粒pPJV1671、流感病毒NDA疫苗载体的构建
构建质粒pPJV1671，该质粒编码并可表达流感病毒A/panama/2007/99(H3N2)的血凝素(HA)抗原。
pPJV1671的构建在如下三个主要步骤中得到了最好的描述：
(i)克隆表达基因；
(ii)改造出载体骨架；并
(iii)改造出最终的质粒。
克隆表达基因
使用获自疾病控制和预防中心(Atlanta，GA)的A/panama/2007/99病毒作为模板核糖核酸(RNA)的来源，通过标准的反转录酶聚合酶链式反应(RT-PCR)克隆技术获得流感病毒HA的编码序列。
将如下步骤应用于克隆表达基因HA：
●通过RT-PCR从A/Panama/2007/99(H3N2)的RNA区段4产生dsDNA片段；
●在大肠杆菌中，在以标准pUC19为基础的载体中扩增RNA区段4 DNA克隆；
●在RNA区段4克隆中对H3 Panama HA编码序列进行测序分析；并
●进行第二次PCR反应，以形成含有H3 Panama HA编码序列(没有ATG密码子)的DNA片段，其末端与pPJV7563 DNA疫苗“空”载体(NheI和Bsp 120I)相容。
改造出载体骨架pPJV7563
pPJV1671的质粒骨架是pPJV7563。pPJV7563中的大部分质粒骨架序列还存在于pWRG7128，后者是一种已在几个人类临床实验中评估的DNA疫苗载体。本部分对构建pPJV7563进行了简要说明。详细的流程图提供于构建pPJV7563和pPJV1671的图14，并对质粒pWRG7128和pPJV1671中的关键元件进行了如下列表比较(表2)。pPJV1671的图谱示于图16。
表2
载体骨架中关键元件的比较：
质粒WRG7128(HBsAg)和pPJV1671(流感病毒HA)
| 对改变的描述 | 改变的原因或目的 | 改变的生物学效应或意义或可能的作用 |
| pPJV1671中的卡那霉素抗性基因片段较pWRG7128中使用的短354个碱基。 | 为了从载体中除去外源序列 | 对可预见的疫苗效力或安全性没有负面变化 |
| 除去pWRG7128中CMV启动子上游的Sph1-Pst1接头。 | 为了从载体中除去外源序列。使这些限制性酶切位点可更有效地用于构建可能的疫苗。 | 对可预见的疫苗效力或安全性没有负面变化 |
| 将CMV的内含子A除去，并且在pPJV1671中，CMV外显子1已与CMV外显子2剩下的9个碱基相融合。 | 融合CMV外显子，以重新形成剪接的pWRG7128转录物的5’UTR。 | CMV外显子的融合不会改变疫苗效力或安全情况。 |
| 将大鼠胰岛素基因的内含子A插入融合的CMV外显子和HbsAg的5’-UTR。 | 为了用功能性序列替换CMV内含子A序列。 | 已表明将大鼠胰岛素内含子A加入疫苗载体提高了抗原表达以及随后的抗体应答。 |
| 将聚腺苷酸化区域从牛生长激素改变为兔β-珠蛋白。 | 为了使用另一种聚腺苷酸化信号。 | 对可预见的疫苗效力或安全性没有负面变化 |
改造出最终的质粒pPJV1671
有两个主要步骤涉及从骨架pPJV7563改造出最终质粒pPJV1671(如图14所示)，它们是：
●使Nhe1-Bgl II位点从pPJV7563缺失；并
●将H3Panama HA编码序列插入pPJV7563，从而产生最终的pPJV1671，H3Panama HA DNA疫苗载体。
对pPJV1671的完全序列分析确认了下面表3所列出的全部载体骨架和HA编码序列。
对pWRG7128和pPJV1671的比较
经临床检测的编码HBsAg的pWRG7128和编码H3 Panama HA的流感病毒疫苗pPJV1671载体之间的载体骨架的主要差异示于上表2。这些差异包括使用大鼠胰岛素内含子A替换人巨细胞病毒(hCMV)内含子A元件，以及使用兔β-珠蛋白聚腺苷酸化序列替换牛生长激素聚腺苷酸化序列。用所述pPJV1671进行的大量动物研究表明其在小动物和大动物中具有良好的流感病毒DNA疫苗性能。如下文实施例16所述对该DNA疫苗进行PMED后，质粒pPJV1671对人也具有良好性能。
pPJV1671的特征和功能性图谱
pPJV1671的功能性图谱示于图16。该图谱的特征示于表3。质粒pPJV1671使用hCMV立即早期启动子和外显子1和2的5’非编码序列。该启动子与大鼠胰岛素内含子A和HBV pre-S2基因的5’UTR连接。H3 Panama HA编码序列的翻译起始于ATG密码子，该密码子在共有的Kozak翻译起始序列的背景下固定于载体中。HA编码序列之后是HBV的转录增强子(HBV enh)。最后，兔β-珠蛋白聚腺苷酸化位点有助于转录终止。
由于A/Panama/2007/99(H3N2)的HA基因的天然ATG翻译起始密码子与Kozak翻译起始共有序列并不一致，因此选择使用由pPJV7563 DNA疫苗载体提供的ATG元件来启动翻译。使用与Kozak共有序列一致的ATG密码子，DNA疫苗载体的抗原表达得到增强。载体提供的ATG密码子(通过在Nhe I位点插入)的使用导致在HA基因的编码序列的氨基末端出现很小的两个氨基酸的插入(如图16所示)。
pPJV1671中核苷酸序列的来源
pPJV1671的详细构建历史和测序报道使得可对该质粒内的全部核苷酸位置的来源进行定位。在载体组分序列和GenBank数据库之间进行BLAST比对，以确定确实已进行了正确的组分定位。
表3
对质粒pPJV1671所包含的组分的鉴定
| 碱基编号 | 组分鉴定 |
| 1-896 | 卡那霉素抗性基因，两侧为tn903序列(Tn903、pUC4K残余1-44和861-896) |
| 897-902 | Sal 1克隆位点/pUC 19MCS |
| 903-1587 | CMV启动子 |
| 1588-1718 | CMV外显子1/2融合体 |
| 1719-1724 | BamH1/Bgl 2融合体 |
| 1725-1857 | 大鼠胰岛素内含子A |
| 1858-1863 | BamH1克隆位点 |
| 1864-1984 | HbsAg的非编码preS2区域 |
| 1985-1987 | ATG起始密码子 |
| 1988-1993 | Nhe1克隆位点 |
| 1994-3688 | H3N2HA编码序列 |
| 3689-3691 | 终止密码子 |
| 3692 | H3Panama 3’UTR的G核苷酸 |
| 3693-3698 | Bsp 120I克隆位点 |
| 3699-4231 | HBV增强子 |
| 4232-4242 | 克隆人工序列。来源未知 |
| 4243-4373 | 兔β-珠蛋白聚腺苷酸化区域 |
| 4374-4379 | EcoR1克隆位点 |
| 4380-5446 | PUC19载体 |
pPJV1671的序列(主细胞库)
使用从新构建的pPJV1671质粒制备得到的Qiagen Megaprep DNA，通过PowderJect Research Department进行测序。pPJV1671的实测序列数据与其理论序列100％吻合。制备过程期间的测序还表明该质粒序列也与理论序列和研究序列100％吻合。各个质粒元件及其在序列中的位置示于上表3。
实施例16.pPJV1671的非临床评估：大动物模型中单价流感病毒DNA
疫苗pPJV1671的免疫原性
使用家猪模型来研究pPJV1671的免疫原性，其形成描述于上文实施例15之中。在该研究中使用八周龄家养白猪(生长育肥猪)。对候选研究动物的血凝抑制(HI)抗体滴度进行了测量，所有被研究动物的血凝抑制抗体滴度均＜1∶10。
通过pPJV1671 DNA疫苗的PMED，对两组动物(每组8只)进行免疫接种。对两组进行初次免疫和加强免疫，其间间隔4周。每次免疫由两次先后(side-by-side)给药至皮肤组成。每次给药的DNA疫苗剂量为浓缩至0.5mg金颗粒表面上的1μg DNA。用在500psi氦压操作的XR-1临床和研究装置送递DNA疫苗。
在第0天对猪进行免疫接种，在第28天进行加强免疫接种，并在第42天即加强免疫接种后两周采血。使用标准HI分析就HI抗体应答对血清进行测试。本研究的结果示于图17，该结果表明pPJV1671DNA疫苗在100％的测试动物中均引起了显著的HI抗体滴度，平均HI抗体滴度大大超过用于对抗人流感病毒的替代HI抗体滴度，所述替代HI抗体滴度为1∶40。
实施例17.在人体内对流感病毒DNA疫苗构建体进行评估的临床实验
引言
进行I期剂量逐渐增加的临床研究以评估pPJV1671 DNA疫苗的安全性和免疫原性，该疫苗为含有来自A/Panama/2007/99(H3N2)的HA(血凝素)基因的单价PMED流感病毒DNA疫苗。通过从免疫接种至研究完成期间监测局部和全身的不良后果对安全性进行评估。通过测量血清血凝抑制(HI)抗体水平对免疫原性进行评估。
在第0天给予三组健康成年受试者(每组12名)单剂DNA疫苗(1、2或4μg)，所述DNA疫苗以1、2或4PMED给药方式送递。在所有3个剂量水平，PMED流感病毒DNA疫苗均可引发血清血凝抑制(HI)抗体应答，且在用最高剂量水平接种的受试者中引发了水平最高且最为一致的应答。在测试最后一个时间点第56天，抗体应答最为显著。处理相关的反应发生局限于在接种部位有轻度至中度皮肤反应，这些皮肤反应多数有自限性。这些结果提供了所形成的流感病毒DNA疫苗的安全性和免疫原性的指标。
材料和方法
疫苗和送递系统
对于临床用质粒，使用A/Panama/2007/99病毒样本作为模板RNA的来源(该病毒为疾病控制和预防中心的J.Katz的馈赠之物)，通过标准的反转录酶-聚合酶链式反应(RT-PCR)克隆技术获得HA编码序列。如上文实施例15所述，将该H3 Panama HA编码序列插入至pPJV7563载体，由此获得最终的pPJV1671H3 Panama HA DNA疫苗载体。对pPJV1671的完全序列分析确认了全部的载体骨架和HA编码序列。
在Strathman GmbH(Hannover，Germany)以良好的制备实践制备质粒pPJV1671。使用前人所描述的方法(Roy et al.，(2001)Vaccine 19：764-78)将质粒DNA包被于1-3μm金颗粒上，并制备用于使用PowderJect XR-1装置的PMED。每个剂量含有包被于0.5mg金上的1μg DNA的标称值。所分析的疫苗质量参数包括金和DNA的量、体外表达情况、小鼠体内的免疫能力以及是否没有生物负载和内毒素。
患者群体和环境
该研究的临床阶段在MDS药学服务处(MDS Pharma Services，Lincoln，NE)进行，并得到当地机构审查委员会的同意。有三十六(36)名成年志愿者参与(表4)。
表4：研究群体的人口统计情况
| 第1组 | 第2组 | 第3组 | |
| 每组人数平均年龄(岁)年龄范围(岁)男性∶女性免疫接种前HAI GMT(范围) | 123120-487∶516(5-40) | 123120-504∶817(5-40) | 123221-495∶712(5-40) |
若受试者满足如下条件，则认为他们是合适的：健康，年龄在19-50之间，未怀孕或哺乳，能提供书面的试服志愿书，并且对流感病毒A/Panama具有≥10和≤40的免疫接种前血凝抑制(HI)滴度。
排除理由包括在最近6个月里接受过免疫抑制治疗，具有皮肤病史，在免疫接种位点有瘢痕形成、痣、切口或纹身，对金发生变态反应，具有默耳加德氏治疗史，在过去12个月里接受过流感病毒疫苗、在当前季节出现流感样症状或确诊出现流感，或者出现其中不推荐进行流感病毒免疫接种的任何医学病症。
除了两名受试者，所有受试者均完成了该研究并就安全性和免疫原性对其进行了评估。一名受试者无法进行随访，另一名受试者不合作。但是，由于所有36名受试者均提供了免疫接种前的样本，接受了免疫接种，并且在免疫接种后就安全性和免疫原性对其进行了至少一次评估，因此可获得所有受试者的安全性和免疫原性的评估数据。所有研究规程遵循起草于1975年、最后于苏格兰的爱丁堡修订(2000)的赫尔辛基宣言以及良好临床实践的协调指南的国际会议(第4步，1996年五月)。
临床研究设计
按顺序将受试者分为三个治疗组，每组12人。每次PMED DNA疫苗给药送递了0.5mg金上的1μg DNA，质粒pPJV1671(H3 Panama)。在第0天对第一组的上臂内侧进行了单次免疫给药。在第0天对第2组的受试者进行了两次总共2μg DNA的疫苗免疫接种，所述疫苗给予至上臂内侧的邻近位点。在第4天对第3组的受试者进行4次给药，总共4μg DNA。使用氦压为500psi的PowderJect XR-1装置给予疫苗，已表明该氦压在之前的研究中较好地耐受(Roy et al.(2001)Supra，Rottinghaus et al.(2003)Vaccine21(31)：4604-8和Tacket et al.(1999)Vaccines 17(22)：2826-9)。
临床安全性和免疫原性评估
安全性可通过在研究期间监测接种部位反应并记录局部和全身不良后果的发生率进行评估。在免疫接种时、免疫接种后1小时和2小时就疫苗安全性和局部耐受性对所有受试者进行评估。在第3、7、14、21、28、56和180天就局部耐受性再对受试者进行评估。通过体检、生命体征、实验室安全测试以及抗双链DNA抗体测试对全身不良后果进行监测。这些测试在免疫接种之前和之后进行。
使用先前描述方法(Kendal，et al(1982)Concepts and procedures forlaboratory-based influenza surveillance.US Department of Health andHuman Services，Public Health Service，Centers for Disease Control：B17-35)的改进方法，在第0天(免疫接种前)以及免疫接种后第14、21和56天收集血样，测定针对A/Panama/2007/99的HAI滴度，可确定每种疫苗的免疫原性。
临床数据分析
安全性数据列于表中。每个HI滴度表示为两次独立测试的几何平均数(GMT)，所述测试通常会得到相同或相似的结果。若样本的滴度小于分析的检测限度10，则被分配给滴度5。对于每个组次，可使用对数转化的滴度计算在每个时间点的GMT以及95％的置信区间(CI)。对于每个时间点，通过使用SAS中的程序CATMOD的卡方检验对各个剂量组相对于基准值的GMT比率进行比较。还对三组中的GMT之间的差异进行了比较。
计算血清转化率(HAI滴度相对于免疫接种前的滴度升高≥4倍的受试者的百分率)和血清保护率(免疫接种后获得的滴度≥40的受试者的百分率)，并通过使用SAS中的程序CATMOD的卡方检验来对各组次进行比较，所述程序CATMOD可通过使用对数单元作为应变量的联系函数对应答细胞百分率进行比较。
结果
安全性和反应发生
对全部84个疫苗给药位点的局部反应进行了评估(图18)。将全部三组(总共84个接种位点)的局部皮肤反应得分进行平均。根据如下标准对皮肤反应进行评分：
—红斑：0＝没有；1＝泛红；2＝浅黑红；3＝甜菜红。
—水肿：0＝没有；1＝略微增厚；2＝显著增厚；3＝大而硬的蜂巢状物(large firm hive)。
—颜色变化：0＝没有；1＝略微可见；2＝颜色发生显著变化；3＝褐色鞋油样。
—剥落：0＝没有；1＝如细小白色头皮屑；2＝晒伤样剥皮；3＝较厚黄色痂。
—瘙痒/不适：0＝没有；1＝略微瘙痒或轻微触痛；2＝中度瘙痒或触痛。
正如基于先前的研究(Roy et al.(2001)，Rottinghaus et al.(2003)and Tacket et al.(1999)，全部同上)所预期的那样，受试者经历了局部皮肤反应，但是严重(分值＝3)范围内的局部反应并未发生。并未记录到有出血或皮肤损害。典型的局部反应的特征在于出现轻度至中度的红斑、水肿和皮肤颜色变化，偶尔会出现瘙痒/不适，随后出现轻度浅层皮肤剥落。
少见的局部反应包括瘀点(2/84位点)、小挫伤(2/84位点)和小痂(15/84位点)。尽管水肿在接种后14天消退，但是红斑和皮肤颜色变化会持续28天。在总共84个接种位点中，有30个在接种后第56天、有21个在第180天依然存在轻微的皮肤颜色变化。一个受试者还在第180天有2个位点具有可检测的挫伤。
在研究期间观察到的全身性不良后果很轻微，被认为与治疗无关。从免疫接种后第7至56天所报道的后果包括头痛(10名受试者中出现11次)、疲劳(3名受试者中出现4次)、肌痛(1名受试者中出现3次)、发烧(2名受试者中出现2次)、手感觉冷(2名受试者中出现2次)、背痛(1名受试者中出现2次)和呕吐、关节痛、肌肉紧张、战栗、间歇性高血压和间歇性低血压(对于每种情况，1名受试者中出现1次)。没有检测到抗双链DNA的抗体。全部研究组次的整个局部和全身不良后果情况为由PMED送递的流感病毒DNA疫苗的安全性提供了一个指标。
抗体应答
对受试者进行了预筛选，选出了对流感病毒A/Panama的HI滴度≥10且≤40的受试者，而一些受试者在接种当天的滴度≤10。基准HI滴度全部＜40，并且各组之间的基准滴度没有显著差异(p＝0.439，参见上表4)。
免疫接种使得全部三组中所有时间点的几何平均滴度(GMT)显著升高(如下表5所示)。
表5：
血清抗体应答、血清转化率和血清保护率
| 组次 | 天 | 平均GMT升高(倍数) | ||
| 1 | 0142156 | -8(1/12)17(2/12)33(4/12) | 17(2/12)42(5/12)33(4/12)58(7/12) | |
| 2 | 0142156 | -17(2/12)8(1/12)67(8/12) | 33(4/12)50(6/12)58(7/12)92(11/12) | -1.72.13.9 |
| 3- | 0142156 | -17(2/12)33(4/12)64(7/11) | 8(1/12)25(3/12)67(8/12)100(11/11) | -1.83.48.1 |
a血清转化被定义为接种前的阴性滴度(≤10)变为接种后≥40的滴度，或者抗体滴度的显著升高，即当接种前滴度≥10时，接种前的滴度和接种后的滴度之间至少有四倍升高
b血清保护率被定义为免疫接种后获得≥40滴度的受试者的比例
c满足CPMP标准的数值为粗体
尽管HI滴度和血清转化率有以剂量-应答方式升高的趋势，但是这三组之间GMT、血清保护率或血清转化率没有统计学差异。对于全部三个疫苗剂量水平，GMT、血清转化率和血清保护率随接种后时间的增加而增加，最高滴度出现在第56天(参见表5)。在第一组，33％的受试者到第56天出现血清转化，58％的获得血清保护性HAI滴度，GMP升高2.8倍。在第二组，第56天的血清转化率为67％，92％的受试者得到血清保护，GMT升高3.9倍。在第56天于第三组观察到最高且最一致的滴度，此时观察到100％的血清保护，GMT相对于基准值升高8.1倍。在该组，血清转化小于100％，原因在于由于相对较高的基准HAI滴度，一些得到血清保护的受试者并未表现出≥4倍的滴度升高。
讨论
在本实施例中描述的研究工作提供了首次成功形成的抗流感病毒抗体应答，所述应答有望有效预防流感。
免疫学分析表明所有剂量水平均产生了抗流感病毒抗体应答。针对批准年度流感疫苗的CPMP(专卖医药品委员会)指南作出的比较表明，1μg剂量组在第56天达到几何平均滴度(GMT)的标准，2μg剂量组在第56天达到全部三个标准(血清转化、血清保护和GMT)的要求，而4μg剂量组在第21天达到GMT的标准，在第56天达到全部三个标准的要求。
给药的36名受试者中有34名(94％)报告总共有320个治疗引发的不良后果(AE)，包括疫苗位点反应在内。研究期间报道有1例SAE——脚骨伤——被认为不太可能与研究疫苗有关。七(7)名受试者经历了应向FDA报道的AE，所述AE均被认为不太可能与研究疫苗有关。大部分(71％)AE程度较轻。所报道的最常见AE是头痛(53％全部受试者)。没有受试者由于AE而中断该研究。所给药的36名受试者中有27名报告总共有89个接种位点相关AE，有12名受试者(33％)报告轻微给药位点疼痛是最常见的局部AE。没有局部反应发生的量度被评估为三级(严重)并因此被认为是不良后果。典型的接种位点反应包括泛红/红斑、水肿、剥落、颜色变化和痂/疤形成。
总之，pPJV1671的给药在所有受试者中被很好地接受并引发了有效的抗流感病毒抗体应答。最高剂量4μg在第21天满足了由批准年度流感疫苗的CPMP制定的标准。
实施例18.三价DNA疫苗在猪中的非临床评估
构建编码三种2001-2002流感疫苗毒株的HA分子的三种DNA疫苗载体，以在相关动物模型中评估候选人三价流感DNA疫苗的免疫原性。由于人和猪的皮肤在结构上非常相似，因此，在过去，家猪被用作人的PMED DNA疫苗的模型。猪模型作为人的PMED DNA疫苗性能的预测模型的相关性已在乙型肝炎表面抗原DNA疫苗的I期人临床实验中得到证实，其中在猪中的良好疫苗性能反映到人上。
三种2001-2002人流感疫苗毒株(A/Panama/2007/99(H3N2)、A/NewCaledonia/20/99(H1N1)和B/Victoria/5/00)的样本获自疾病控制中心(CDC)，并用于反转录酶/聚合酶链式反应(RT-PCR)实验，以形成编码相应HA抗原的DNA片段。下列步骤用于开发最终的三种HA DNA疫苗载体：
●通过RT-PCR从A/Panama/2007/99(H3N2)、A/New Caledonia/20/99(H1N1)和B/Victoria/5/00的RNA区段#4产生dsDNA片段。
●在大肠杆菌中，在以标准pUC19为基础的载体中扩增RNA区段#4DNA克隆。
●在RNA区段#4克隆中对HA编码序列进行测序分析。
●进行第二系列的PCR反应(以真实的HA基因序列数据为基础)，以形成含有HA编码序列(不含ATG密码子)、来自各个病毒的DNA片段，其末端与pPJV7563DNA疫苗表达载体(Nhe I和Bsp 120I)相容。
●将三个HA编码序列片段插入临床DNA疫苗载体pPJV7563，由此产生最终的三种DNA疫苗载体。
●对全部三个载体中的HA编码序列进行序列分析，确认没有出现突变。
所得到的载体使用本发明的嵌合启动子。因此，该载体使用人巨细胞病毒(hCMV)立即早期启动子和来自立即早期外显子1和2的5’非编码序列。该启动子与大鼠胰岛素内含子A和乙型肝炎病毒(HBV)pre-S2基因的5’非翻译区(UTR)相连。HA编码序列的翻译起始于ATG密码子，该密码子在共有的Kozak翻译起始序列的背景下固定于载体中。HA编码序列之后是HBV的转录增强子(HBV enh)。最后，兔β-珠蛋白聚腺苷酸化位点有助于转录终止。
由于HA基因的天然ATG翻译起始密码子与Kozak翻译起始共有序列并不一致，因此将pPJV7563DNA疫苗载体所提供的ATG元件用于启动翻译。使用与Kozak共有序列一致的ATG密码子，DNA疫苗载体的抗原表达通常得以提高。使用由载体提供的ATG密码子(通过在Nhe I位点插入)导致在HA抗原的编码序列的氨基端出现很小的两个氨基酸的插入。
在家猪模型中对三价制剂中的这些载体的免疫原性进行评价。所述三种载体以1∶1∶1混合，并以2μg总DNA/mg金的比率将其制备于金颗粒表面，每次给药使用0.5mg金。每次免疫接种由两次先后PMED给药组成，总共2μg DNA和1mg金。接种方案包括间隔四周的两次这样的免疫接种。以实际使用的送递装置为基础，将未患过流感的猪分为两个免疫接种组。使用可重复使用的“研究用”PMED装置对一组动物进行三价流感DNA免疫接种，所述PMED装置已成功用于在多种动物中针对多种抗原引发免疫应答。使用临床装置对第二组动物进行免疫接种，所述临床装置用来使用HBV DNA疫苗成功对人接种。后一种装置与研究用装置的不同之处在于，它使用一次性“单针剂”塑料喷嘴来替代与研究用装置连接的可重复使用的12-针剂喷嘴。
第二次免疫接种后两周，收集血清样本并测量特异性针对同源H3、H1和B病毒的凝血抑制(HI)抗体滴度。这些数据示于图19。使用两种装置均观察到对H3和B抗原的100％血清转化，几何平均HI滴度大大超过滴度为1∶40的替代水平，所述替代水平通常被认为是对流感病毒产生免疫所必需的。所获得的数据表面该技术平台将能在人中引发显著的应答。
H1特异性免疫应答较低。这在后来被确定是由于在质粒制备期间出现在H1DNA疫苗载体中的H1HA基因的重排所致。该重排并未在制备和接种前对DNA的首次分析中检测到，但是会在更为严格的分析中被检测到。基于使用H3和B载体的结果，若利用功能性质粒，则H1-特异性应答将显著增强。
实施例19.质粒pPJV2012的构建
构建质粒pPJV2012。pPJV2012表达肠产毒性大肠杆菌的不耐热毒素(LT)的A和B亚基。pPJV2012在体内表达功能性LT毒素可用来增强针对其它蛋白质的免疫应答，所述其它蛋白质由与pPJV2012共同给药的质粒表达。
LT是一种84kD的多亚基蛋白，包含一个A亚基和相同B亚基的五聚体。LT由大肠杆菌表达和分泌，并通过B亚基的五聚体与肠细胞上的GM1神经节苷脂结合。毒素被吸收后，A亚基激活产生过量cAMP并破坏肠腔内外的电解质平衡(Tauschek，et al(2002)Proc Natl Acad Sci，USA 99：7066-7071)。因此，对于在体内表达的LT的生物学活性，需要产生A和B亚基以及介导从表达细胞分泌的信号序列。已表明编码LT的A和B亚基的质粒载体在使用具体的被介导表皮送递一起送递时，可增强针对几种病毒抗原所引发的免疫应答(Arrington et al(2002)J Virol 76(9)：4536-46)。
除了LT毒素的A和B亚基的编码序列外，pPJV2012还包含确保有效进行基因表达的本发明的嵌合启动子序列、兔β珠蛋白poly A序列、介导从表达细胞分泌的信号序列、卡那霉素抗性基因和细菌的复制起点。该质粒示于图22。
质粒pPJV2012通过如下步骤构建：
●通过PCR从大肠杆菌基因组DNA扩增LTA编码序列，并将其插入中间质粒；
●切除该LT A编码序列并插入受控于CMV启动子的“Acceptor”质粒中。
●通过PCR从大肠杆菌基因组DNA扩增LT B编码序列，并将其插入受控于截短型CMV启动子的中间质粒中。
●切除该LT A表达盒。
所得到的质粒pPJV2012在哺乳动物细胞中表达LT的两个亚基。
pPJV2012中的启动子和增强子序列
LT A亚基由CMV立即早期(IE)启动子表达。LT B亚基由截短型CMV IE启动子表达。对于这两个基因而言，还包括其它序列以提高表达，尤其是HBVpre-S25’UTR(Moriarty et al(1981)Proc Natl Acad Sci USA 78：2606-2610)、CMV外显子1/2(由通过使天然内含子缺失而剪接在一起的前两个CMV IE外显子组成)、大鼠胰岛素内含子A(Lomedico et al(1979)Cell2：545-558)和兔β珠蛋白poly A(rGpA)。为确保从表达细胞分泌，已将鸡溶菌酶信号肽(CLSP，Genbank编号CR390743)插入两个LT亚基。另外，HBVenv增强子(Vannice and Levinson(1988)J Virol.62：1305-1313)被插入A亚基之后来提高表达。
LT A和B亚基的克隆
大肠杆菌菌株E078：H11获自ATCC(分类号35401)，使用与5’和3’端同源的引物通过分别的PCR反应扩增A和B亚基，所述引物参照GenBank编号为AB011677的文件设计。所形成的两个亚基的编码序列并不包括编码存在于氨基端的细菌信号肽的序列。将A和B亚基片段分别连接至质粒WRG7054。
pPJV2012的构建
将LT A编码序列切除并与pPJV7592的载体骨架和来源于pPJV7572、包含CMV启动子、5’非翻译区和CLSP的片段连接。所得到的质粒被称为A1。切割A1并与来自pPJV7592的片段连接，以重新形成一个多克隆位点，所得到的质粒被称为Acceptor；这提供了pPJV2012的LT A组分。
将LT B编码序列切除并与pPJV7591的载体骨架和来源于pPJV7572、包含非翻译区的3’端和CLSP的片段连接。所得到的质粒被称为Donor，由此提供了pPJV2012的LT B组分。
为形成pPJV2012，来自Donor、含LT B表达盒的片段与来自Acceptor的载体片段连接。所得到的质粒在哺乳动物细胞中表达LT A和B。
pPJV2012中的核苷酸序列的来源
pPJV2012已被完全测序并与数据库进行了比对以指定每个序列的来源。所得序列与预期相同(示于下表6中)。
表6：
对质粒pPJV2012所包含的组分的鉴定
| 碱基编号 | 组分鉴定 |
| 1-905 | 来源于pUC4K、包括卡那霉素抗性基因的序列 |
| 906-1038 | 兔β珠蛋白poly A |
| 1039-1351 | LT B亚基编码序列 |
| 1352-1357 | 接头序列 |
| 1358-1417 | 鸡溶菌酶信号序列 |
| 1418-1538 | HBV pre-S2的5’UTR |
| 1539-1544 | 接头序列 |
| 1545-1677 | 大鼠内含子A |
| 1678-1683 | 接头序列 |
| 1684-1814 | CMV外显子1/2 |
| 1815-1935 | 截短型CMV IE启动子 |
| 1936-1947 | 接头序列 |
| 1948-2632 | CMV启动子 |
| 2633-2763 | CMV外显子1/2 |
| 2764-2769 | 接头序列 |
| 2770-2902 | 大鼠胰岛素内含子A |
| 2903-2908 | 接头序列 |
| 2909-3029 | HBV pre-S2的5’UTR |
| 3030-3089 | 鸡溶菌酶信号肽 |
| 3090-3095 | 接头序列 |
| 3096-3818 | LT A编码序列 |
| 3819-3830 | 接头序列 |
| 3831-4363 | HBV env增强子序列 |
| 4364-4374 | 未知序列 |
| 4375-4050 | 兔β珠蛋白poly A |
| 4051-5578 | 来源于pUC19的序列 |
此外，还就与整个人类基因组的序列同源性进行了BLAST检索，寻找短至19个碱基的序列段之间的序列相似性。“没发现显著的相似性”；与68个碱基的rGpA序列同源程度最高，但是最长一段相同序列仅18个碱基。
pPV2012与pPJV1671序列的比较
比较pPJV2012的序列与pPJV1671的序列。结果示于下表7。
表7：比较pPJV2012与pPJV1671的序列
| pPJV2012中的序列的碱基编号 | 序列也存在于pPJV1671流感病毒DNA疫苗？ |
| 1-896 | 是 |
| 897-905 | 否 |
| 906-1038 | 是 |
| 1039-1351 | 否 |
| 1352-1357 | 是 |
| 1358-1417 | 否 |
| 1418-1538 | 是 |
| 1539-1544 | 是 |
| 1545-1677 | 是 |
| 1678-1683 | 是 |
| 1684-1814 | 是 |
| 1815-1935 | 是 |
| 1936-1947 | 是 |
| 1948-2632 | 是 |
| 2633-2763 | 是 |
| 2764-2769 | 是 |
| 2770-2902 | 是 |
| 2903-2908 | 是 |
| 2909-3029 | 是 |
| 3030-3089 | 否 |
| 3090-3095 | 是 |
| 3096-3818 | 否 |
| 3819-3824 | 是 |
| 3825-3830 | 是 |
| 3831-4363 | 是 |
| 4364-4374 | 是 |
| 4375-4505 | 是 |
| 4512-5578 | 是 |
分析表明pPJV2012中的5578个碱基对中有4418个碱基对(79％)也存在于pPJV1671流感病毒DNA疫苗中。除了LT A和B亚基的编码序列外，pPJV2012中的4544个碱基对中有4418个碱基对(97％)也存在于pPJV1671中。
注意，还对pPJV1671进行了生物分布/整合研究，每种情况中均未发现整合的证据。
实施例20-质粒pPJV7788—在哺乳动物细胞中表达大肠杆菌LT亚基的一种质
粒—的构建
使用如下质粒形成质粒pPJV7788：
pPJV7563和pPJV7592，来源于pPJV7275、pPJV7284、pPJV7389、pPJV7586和pPJV7293。
pPJV7590，为pPJV7389的衍生物，含有紧邻CMV启动子上游的多克隆位点(MCS)。
pPJV7572，为pPJV7389的衍生物，含有紧邻所编码抗原上游的鸡溶菌酶信号肽(CLSP)的编码序列。这使得可将c-端融合的抗原分泌到细胞外。
(i)构建pPJV7785(LTA Acceptor质粒)
Sal 1剪切pPJV7563，钝化末端，并用Nde 1剪切，以形成载体片段。Sph1剪切pPJV7590，钝化末端，并用Nde1剪切，以形成含有MCS和CMV启动子的5’末端的插入片段。连接这些片段形成pPJV7592。
用Nco1和Bgl2剪切pPJV7592，以形成载体片段。用Nco1和Nhe1剪切pPJV7572，以形成含有CMV启动子3’末端、5’非翻译区和CLSP的插入片段。用Nhe1和BamH1剪切pPJV2004，以形成含有LTA亚基的插入片段。连接这些片段形成质粒pPJV7785。
(ii)构建pPJV7787(LTB Donor质粒)
用Nco1和EcoR1剪切pPJV7389，以形成载体片段。用Nco11和Nhe1剪切pPJV7572，以形成含有CMV启动子的3’端、5’非翻译区和CLSP的插入片段。用Nhe1和BamH1剪切pPJV2005，以形成含有LTB亚基的插入片段。用Bgl2和EcoR1剪切pPJV7586，以形成含有兔β珠蛋白多聚腺苷酸化区域的插入片段。连接这些片段形成pPJV7787。
(iii)构建pPJV7788
用Xho1和Mfe1剪切pPJV7785，以形成含LTA表达盒的载体片段。用Xho1和EcoR1剪切pPJV7787，以形成含有LTB表达盒的插入片段。连接这些片段来形成pPJV7788，将pPJV7788导入哺乳动物细胞时它会表达LTA和LTB亚基。
下表8提供了构建体pPJV7788中各个元件的位置。
表8：pPJV7788的组分ID
| 碱基编号 | 组分 |
| 1-4445-860861-98398410011002-16861687-18171818-18231824-19561857-19621963-20832084-21432144-21492150-24622463-25932594-26232624-33083309-34393440-34453446-35783579-3584 | Tn903、pUC4K残余KanR(Tn903)Tn903、pUC4K残余pUC19MCSCMV ProCMV外显子1/2Bam/Bgl融合物大鼠胰岛素内含子ABamH1位点HBV pre-S2的5′-UTR溶菌酶SPNhe1位点LTBRBGpA多克隆位点CMV ProCMV外显子1/2Bam/Bgl融合物大鼠胰岛素内含子ABamH1 |
| 3585-37053706-37653766-36713772-44944495-45064507-50395040-50505051-51815182-51875188-6254 | HBV pre-S2的5′-UTR溶菌酶SPNhe1位点LTA聚合接头HBVenh来源未知rGlob pAEcoR1位点pUC19 |
实施例21—pPML7789—在哺乳动物细胞中表达H5/VN1194血凝素蛋白质的一
种质粒—的构建
形成了另一种构建体pPML7789，它能利用本发明的嵌合启动子表达H5/VN1194血凝素蛋白质。实施例5所述的构建体pPJV7563用作构建体pPML7789的骨架。
含有H5/VN1194 HA基因编码序列的质粒可用作PCR的模板。在5’和3’端位点设计PCR引物，以使之插入pPJV7563。用Nhe1和Bsp120I剪切pPJV7563，以形成载体片段。从H5/VN1194模板扩增得到的PCR片段用相同的酶剪切，以形成插入片段。连接这两个片段以产生pPML7789。通过测序验证编码序列和侧翼序列。
pPML7789中的各个元件的核苷酸位置示于下表9中。
表9：构建体pPML7789的组分
| 核苷酸位置 | 元件 | |
| 起点：1 | 终点：44 | Tn903、pUC4K残余 |
| 起点：45 | 终点：860 | KanR(Tn903) |
| 起点：861 | 终点：896 | Tn903、pUC4K残余 |
| 起点：897 | 终点：902 | pUC19MCS |
| 起点：903 | 终点：1587 | CMV Pro |
| 起点：1588 | 终点：1718 | CMV外显子1/2 |
| 起点：1719 | 终点：1724 | Bam/Bgl融合物 |
| 起点：1725 | 终点：1857 | 大鼠胰岛素内含子A |
| 起点：1858 | 终点：1863 | BamH1位点 |
| 起点：1864 | 终点：1984 | HBV pre-S2的5′-UTR |
| 起点：1985 | 终点：1993 | ATG-Nhe |
| 起点：1994 | 终点：3699 | VN1194H5 |
| 起点：3700 | 终点：3705 | Bsp120I位点 |
| 起点：3706 | 终点：4238 | HBVenh |
| 起点：4239 | 终点：4249 | 未知的接头序列 |
| 起点：4250 | 终点：4380 | rGlob pA |
| 起点：4341 | 终点：4341 | PolyA位点 |
| 起点：4381 | 终点：4386 | EcoR1位点 |
| 起点：4387 | 终点：5453 | pUC19 |
实施例22.通过采用HSV-2ICP27和大肠杆菌不耐热毒素的DNA免疫接种所
形成的有效的保护性细胞免疫应答
材料和方法
病毒
HSV-2病毒(MS毒株，ATCC VR-540和HG52毒株G，辛辛那提大学的NancySawtell的馈赠)在VERO细胞(ATCC CCL-81)上培养，并在使用前在蔗糖梯度中纯化。
DNA疫苗和DEI载体
通过将包含整个ICP27基因(UL54)的PCR片段插入pTarget(Promega，Madison，WI)，形成编码HSV-2ICP27(图27)的质粒。使用5’(GCCACTCTCTTCCGACAC，SEQ ID NO：63)和3’(CAAGAACATCACACGGAAC，SEQ IDNO：64)引物，由HSV-2MS毒株的纯化基因组DNA扩增PCR片段。扩增得到的序列对应HSV-2的HG52克隆(GenBank编号NC_007198)的已公开基因组序列的114,523至116,179位核苷酸。在麦迪逊的威斯康星州大学由DNA测序核心设备就整个pICP27进行测序。
质粒PJV2012编码单个载体的LT的A和B亚基，且示于图22。pPJV2012的构建在实施例19有述。在pPJV2012中，LT A亚基基因由转录单位表达，所述转录单位由下述组分构成：人巨细胞病毒(hCMV)立即早期启动子、hCMV(非编码的)融合的外显子1和2，大鼠胰岛素内含子A、乙肝病毒(HBV)pre-S2基因的5’非编码区、ATG密码子、溶菌酶信号肽编码序列、LT A亚基编码序列、3’非编码HBV转录增强子区域和兔β珠蛋白聚腺苷酸化序列。
pPJV2012还编码沿相反方向延伸的另一转录单位的LT B亚基产物(图22)。LT B转录单位与编码LT A产物的转录单位相似，但不含额外拷贝的hCMV和HBV转录增强子元件。位于LT A转录单位中的hCMV和HBV增强子元件对LT B转录单位也有用。
质粒PJV2013(未示出)与pPJV2012相似，但编码来自单个载体的霍乱毒素的A和B亚基产物。pPJV2013的功能图谱与图22中pPJV2012所示功能图谱相同。
通过颗粒介导的表皮送递(PMED)的DNA接种
对6至8周龄Balb/c小鼠进行PMED DNA接种如前人所述(Arrington etal，J.Virol.76，4536-4546，2002)，不同之处在于每次免疫接种由一次PMED送递至腹下皮肤组成，其中每次送递含有包被有总共0.5μgDNA疫苗/DEI载体制剂的0.5mg金。两次这样的“单针剂”免疫接种间隔4周进行，并在第二次或“加强”免疫接种后2周处死动物或攻击。
肽池和肽
将自MS毒株病毒衍生得到的ICP27氨基酸序列用作文库模板。HG52和MS序列(参见图28和SEQ ID NO：65)之间的ICP27蛋白高度保守，因此，该文库能检测对这两个毒株的反应。使用长18个氨基酸的肽合成涵盖ICP27整个序列的肽库(Mimotopes，Fisher Scientific)，所述肽的11个氨基酸与相邻肽重叠。制备了总共72个肽。
为帮助鉴定阳性肽，使用Tobery etalJ.Immunol.Methods 254，59-66，2001所述方法将该文库分为肽池。使用表10所示方式形成肽池。有12个肽池(称为C1-C12，每个肽池6个肽)和6个肽池(R1-R6，每个肽池12个肽)。含肽#45和#46的肽池显示为粗体。
表10：肽池组成
| C1 | C2 | C3 | C4 | C5 | C6 | C7 | C8 | C9 | C10 | |
| R1 | 1 | 3 | 5 | 7 | 9 | 11 | 13 | 15 | 17 | 19 |
| R2 | 25 | 27 | 29 | 31 | 33 | 35 | 37 | 39 | 41 | 43 |
| R3 | 49 | 51 | 53 | 55 | 57 | 59 | 61 | 63 | 65 | 67 |
| R4 | 4 | 6 | 8 | 10 | 12 | 14 | 16 | 18 | 20 | 22 |
| R5 | 28 | 30 | 32 | 34 | 36 | 38 | 40 | 42 | 44 | 46 |
| R6 | 52 | 54 | 56 | 58 | 60 | 62 | 64 | 66 | 68 | 70 |
| C11 | C12 | |
| R1 | 21 | 23 |
| R2 | 45 | 47 |
| R3 | 69 | 71 |
| R4 | 24 | 26 |
| R5 | 48 | 50 |
| R6 | 72 | 2 |
ELISPOT分析
如前所述，在新鲜的脾细胞和淋巴结细胞上进行IFN-γELISPOT分析，不同之处在于用于刺激的抗原是每个实验结果部分所定义的单一肽或肽池。在某些情况下，在ELISPOT分析之前，根据制造商的说明书通过磁珠(Dynal)除去T细胞群。
微量样本多指标流式蛋白定量技术(CBA)分析
在第二次免疫接种后两周收集新鲜的脾细胞，并在SM(RPMI培养基+10％胎牛血清，添加有MEM丙酮酸钠、非必需氨基酸和2-巯基乙醇(Invitrogen，Carlsbad，CA))中以1×107细胞/ml重悬。将细胞样本以1×106细胞(100μl)/孔接种于96孔平底培养板中。用100μl溶于SM或溶于培养基自身中的ICP27肽的等分试样处理脾细胞。最终的肽浓度为10-8M。在具有和不具有肽以及具有和不具有Con-A(终浓度为2.5mg/ml)的条件下接种来自未处理动物的对照脾细胞，并分别用作阴性和阳性对照。
将板在37℃孵育48小时，然后收集160μl的每个样本，并于-20℃保存，直至使用BD Cytometric Bead Array(CBA)小鼠Th1/Th2试剂盒(BDBiosciences，San Jose，CA(cat.#551287))进行分析。简言之，该试剂盒使用具有不同荧光强度的5种微球群，所述微球群包被有特异性针对小鼠IL-2、IL-4、IL-5、INF-γ和TNF-α的捕捉抗体。将这五种微球群混合在一起，以形成在BD FACSCalibur流式细胞仪的FL3通道上辨析的阵列。将细胞因子捕捉微球与缀合PE的检测抗体混合，然后与标准品或测试样本孵育，以形成夹心复合物。样本采集后使用BD CBA分析软件来获得结果。将每种细胞因子的样本强度与标准曲线进行比较，用以对细胞因子浓度进行定量。根据制造商的说明书，将纯样本或稀释度为1∶10的样本进行分析。
HSV-2病毒攻击
用30μl含约50LD50(2×106PFU)HSV毒株MS的PBS对麻醉的Balb/c小鼠进行鼻内攻击。感染后观察小鼠20天，并就发病率和死亡率进行评分。根据如下列表按0至4的标准对发病率进行评分：4，健康；3，毛皮发抖，打喷嚏；2，眼部或臀部酸痛，活动减少；1，弓起背部，几乎不活动；0，死亡。攻击前后用IFN-γ-(eBioscience，San Diego，CA(cat.#16-7311))和/或TNF-α-(cat.#16-7332)特异性单克隆抗体处理的小鼠从病毒攻击起算的第-2、0、2、4、6和8天腹膜内注射含90μg抗体的注射液。在T细胞消除实验中，从病毒攻击起算的第-2和0天腹膜内注射含200μg特异性针对CD4或CD8细胞群的抗体的注射液(Functional Grade纯化的抗小鼠CD4，eBioscience Cat#：16-0041；Functional Grade纯化的抗小鼠CD8，eBioscience；Cat#：16-0081)。
结果
Balb/c小鼠中强CD8表位的鉴定
为鉴定针对ICP27蛋白质的T细胞应答，对自HSV-2的弱毒毒株(HG52毒株G)感染的Balb/c和C57B1/6小鼠获得的细胞进行IFN-γELISPOT分析。含有涵盖整个ICP27编码序列的肽的肽库被用来刺激T细胞。该肽长18个氨基酸，并与相邻肽重叠11个氨基酸。如材料和方法部分以及表10所述，肽池含有6个肽(肽池C1-C12)或12个肽(肽池R1-R6)，该设置有助于鉴定肽库中的阳性肽。感染后7天自Balb/c小鼠获得的脾细胞和淋巴结细胞对肽池C10、C11、R2和R5中的肽表现出非常强的应答(图29A)，而对其它几个肽池中的肽表现出较弱的应答。在获自C57B1/6小鼠的细胞中仅检测到较弱的应答。已发现在所分析的脾细胞群和淋巴结细胞群中，阳性应答的模式相似。
基于IFN-γELISPOT结果，推测两个相邻的肽(#45，#46)含有显性T细胞表位。这通过分别对每个肽进行测试得到确认(未给出数据)。肽45和46激发强的IFN-γ分泌，并含有推测会与Dd等位基因结合的同源九氨基酸序列HGPSLYRTF(图29B，SEQ ID NO：68)。值得注意的是，肽46还含有对应之前描述的Balb/c小鼠中的来自HSV-1的ICP27的表位的区域(Banks et al，J.Virol.67，613-616，1993)。对HSV-1和HSV-2的ICP27序列的比较表明，该区域有一个氨基酸不同：HSV-2ICP27(LYRTFAANPRA，SEQ ID NO：69)中的丙氨酸(A)残基由HSV-1(LYRTFAGNPRA，SEQ ID NO：70)中的甘氨酸(G)置换。但是，即便该肽激发极强的应答，肽45中也不存在该区域。
为确定在IFN-γELISPOT分析中肽46的两个可能的表位的相对重要性，合成了肽LYRTFAANPRA和HGPSLYRTF并对其进行了测试。从感染小鼠分离得到的脾细胞对HGPSLYRTF肽有强烈应答，但未检测到对LYRTFAANPRA序列高于本底的应答。使用磁珠除去T细胞群，然后进行IFN-γELISPOT分析，获得了较强的CD8+ICP27应答。这些数据表明强的CD8应答是在Balb/c小鼠中特异性针对HSV-2ICP27蛋白的序列HGPSLYRTF形成的。
针对ICP27疫苗的体外免疫应答
使用HSV-2的MS毒株的ICP27序列形成DNA疫苗“pICP27”(图27)。经测序发现该构建体仅有两个核苷酸与所公开的HG52ICP27基因序列不同(图28)。第57位核苷酸G改变为A(沉默型改变)，第484位A改变为C将使得HG52毒株中的赖氨酸改变为MS形式中的天冬酰胺。因此，DNA疫苗表达的MS毒株ICP27蛋白与该蛋白的HG52毒株形式几乎相同，并且推定的CD8表位区域没有差异。
pICP27DNA疫苗用于通过PMED对Balb/c和C57B1/6小鼠进行免疫接种。在IFN-γELISPOT分析中，针对图29所述的肽池图对脾细胞和淋巴结细胞进行测试。在DNA免疫接种的小鼠中观察到的针对ICP27肽的阳性应答模式与在感染小鼠中观察到的相同(未给出数据)。
针对ICP27疫苗的体内应答
在Balb/c小鼠预防性鼻内感染模型中，对由pICP27DNA接种所形成的免疫应答的体内活性进行了研究。在12周龄Balb/c小鼠中用不同剂量HSV-2MS毒株感染确定了LD50大约为3×104PFU(未给出数据)。在DNA保护实验中，使用50LD50的病毒攻击剂量，原因在于该剂量一直会在未免疫动物中引起100％的死亡率。
一系列实验表明，单独用pICP27 DNA进行免疫接种(初次免疫和加强免疫)对保护小鼠的能力有一定的局限性。因此，为了提高保护性，编码霍乱毒素(CT)或大肠杆菌不耐热毒素(LT)的DEI载体与ICP27DNA疫苗一起给予。对于这两种毒素的每一种毒素，A和B毒素亚基均由同一质粒表达。
单独用ICP27疫苗对小鼠进行免疫接种，或者辅以比率为9∶1(0.45μg抗原DNA+0.05μg DEI载体DNA)的CT或LT DEI载体。使用的免疫接种组每组总共16只动物，其中有一半用病毒攻击，而另一半在用ICP27特异性细胞因子产物进行攻击时处死。
本研究的结果示于图31。该结果表明用ICP27+CT和仅用ICP27制剂进行免疫接种可分别提供部分保护和不提供保护，而在使用ICP27+LT制剂时观察到100％的保护性(图31A)。这些结果证实DEI载体与ICP27载体的共同送递可增强保护性，并可在DNA免疫接种中加强LT相对于CT作为免疫刺激物的优越性。使用CBA试剂盒，对CD8表位肽在体外刺激后产生的细胞因子进行定量，表明攻击存活与INF-γ(图31B)和TNF-α的产生(图31C)的水平之间具有良好的相关性。
细胞因子和T细胞群的作用
对ICP27特异性IFN-γ或TNF-α的产生在保护被攻击动物中的作用进行评估。在攻击前后用INF-γ和/或TNF-α特异性单克隆抗体将pICP27+pPJV2012(LT)接种的动物处理几天，以在体内中和这些细胞因子。发病率数据示于图32。与先前一样，进行ICP27+LT DEI免疫接种的动物完全免受攻击，并且仅展现出轻度短时发病率(4只动物中有1只动物毛皮发抖)，而100％的未免疫小鼠或仅用pICP27载体进行免疫接种的小鼠死于攻击。在用ICP27+LT DEI制剂进行免疫接种并随后用抗-TNF-α处理的组次中，在鼻内攻击注射后立即观察到一例由于麻醉并发症所引发的死亡。重要的是，剩下的三只小鼠仅表现出短时皮毛发抖，并且完全康复，这表明TNF-α的产生可能对保护性没有显著帮助。相反，攻击时接受抗-IFN-γ或抗-IFN-γ+抗-TNF-α的ICP27+LT DEI免疫接种小鼠的两个组次变得极为不健康，8只动物中有7只死亡，这清楚表明IFN-γ作为保护的必需调节物的重要性。
为检测CD4群和CD8群的保护作用，使用CD4或CD8抗体除去这些细胞群，然后进行感染攻击(图33)。在对小鼠的死亡率进行跟踪观察20天时，出现了一个有意义的模式。正如所期望的那样，用空载体给予pICP27的小鼠并未显著免受感染。pICP27+LT DEI接种提供了100％的存活，但是从进行相似免疫接种的小鼠除去CD4细胞和CD8细胞消除了接种的保护作用，并使得该小鼠的敏感水平与未免疫小鼠的敏感水平相同。在用pICP27+LT DEI疫苗进行免疫接种的小鼠中，除去CD8细胞群后进行感染使得小鼠死于感染，表明这些细胞在保护免受感染或脑炎中起着重要作用。在pICP27+LT DEI接种的小鼠中，除去CD4细胞群在这些小鼠发病和死亡前引起九天的延迟(相对于未免疫小鼠)，这表明CD4T细胞对长期存活有作用。
实施例23：流感病毒H5N1 DNA疫苗在小鼠中的免疫原性
材料和方法
将编码流感A/Vietnam/1194/2004[H5N1]病毒的HA的DNA质粒pPML7789(实施例21，图20)沉积于金颗粒表面并使用PowderMed的专有送递技术通过颗粒介导的表皮送递(PMED)送递给小鼠。送递的实施可与作为佐剂、编码大肠杆菌不耐热毒素亚基A和B的另一质粒pPJV2012(实施例19，图22)一起进行或不与之一起进行。在存在pPJV2012时，将该另一质粒和pPML7789质粒一起沉积于相同金颗粒表面。这可通过如下步骤实现：首先将液体形式的pPJV2012和pPML7789以重量比1∶9预先混合，然后将这些质粒共同沉积于一群金颗粒表面。作为阴性对照，将没有沉积有质粒的金颗粒通过PMED送递。小鼠情况如下：
品系：Balb/C小鼠
数目：36
性别：雌性
体重范围：15.0-19.6g(在首次操作当天)
年龄：43-49天(到达当天)
饮食：RM1颗粒
供应商：Charles River UK Ltd
将小鼠分为下表11所示的六组。对小鼠进行的操作以及操作进行的天数示于下表12。根据标准方法对血清进行HAI分析。
表11：动物处理组分配
| 组次# | 给药方式 | 每组动物数目 | 处理情况 |
| 1 | 表皮 | 6 | 阴性对照1个剂量第-1天采血，第14天采血并处死 |
| 2 | 表皮 | 6 | 阴性对照2个剂量第-1和21天采血，第36天采血并处死 |
| 3 | 表皮 | 6 | pPML77891个剂量第-1天采血，第14天采血并处死 |
| 4 | 表皮 | 6 | pPML77892个剂量第-1和21天采血，第36天采血并处死 |
| 5 | 表皮 | 6 | pPML7789+pPJV20121个剂量第-1天采血，第14天采血并处死 |
| 6 | 表皮 | 6 | pPML7789+pPJV20122个剂量第-1和21天采血，第36天采血并处死 |
表12：如下操作在标记为X的天数进行
| 研究天数 | 0 | 14 | 21 | 35 |
| 应答器移植 | X | |||
| 体重 | X | X | ||
| 接种 | X | |||
| 健康评分 | X | X | ||
| 抗体血清 | X | |||
| 收集脾脏 | ||||
| 处死 |
a仅第1、3&5组
b仅第2、4&6组
结果
测定针对NIBRG-14[H5N1]病毒的HAI滴度
已观察到所有对照均在可接受的限度内。阴性对照物(NIBRG-14[H5N1]病毒)在所有板上均为阴性。阳性对照物(火鸡红细胞)在所有板上均为阳性。第二阳性对照物(含有抗流感A/Chicken/Scotland/59[H5N1]病毒抗体的血清)在所有板上均获得28、40、56或80HAIU(在可接受限度40HAIU+/-2倍的范围内)的几何平均数。
除了第21天的ID：1074(第6组，该样本不能采血)以及第21天的ID：1059(第4组，该样本未获得足以进行分析的血清)，第0、14和21天的所有样本均＜10HAIU(低于检测限度)。
对于第35日采血，除了ID：1074(第6组)不能采血外，对每个样本的几何平均滴度进行计算，同时还计算了各组的组算术平均数、中值和标准差。这些结果示于下表13。
表13：第2、4&6组在第35天获得的血清的HAI滴度
| 组次 | 样本编号 | 几何平均滴度 | 算术平均数 | 中值 | SD |
| 2 | 104710481049105010511052 | ＜10＜10＜10＜10＜10＜10 | ＜10 | ＜10 | 0 |
| 4 | 105910601061106210631064 | 284040202020 | 28 | 24 | 10 |
| 6 | 107110721073107410751076 | 164 | 160 | 40 |
*由于一只动物的提前死亡，不能获得数据
这些结果表明，pPML7789质粒在小鼠中具有免疫原性，并且该免疫原性通过pPJV2012的加入而得到增强。
因此，描述了新的核酸构建体、含有各种构建体的组合物以及使用这些构建体的核酸免疫接种技术。尽管本发明的优选实施方案已经详细描述，应该理解的是：在不背离本发明的宗旨和范围的情况下，可进行改动。
序列表
<110>宝德杰克特疫苗有限公司(POWDERJECT VACCINES，INC)
<120>核酸构建体
<130>N93730C GCW
<150>UK 0507997.5
<151>2005-04-20
<150>US 60/672,479
<151>2005-04-19
<150>US 60/648,382
<151>2005-02-01
<160>70
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>685
<212>DNA
<213>人巨细胞病毒
<400>1
aatattggct attggccatt gcatacgttg tatctatatc ataatatgta catttatatt 60
ggctcatgtc caatatgacc gccatgttga cattgattat tgactagtta ttaatagtaa 120
tcaattacgg ggtcattagt tcatagccca tatatggagt tccgcgttac ataacttacg 180
gtaaatggcc cgcctggctg accgcccaac gacccccgcc cattgacgtc aataatgacg 240
tatgttccca tagtaacgcc aatagggact ttccattgac gtcaatgggt ggagtattta 300
cggtaaactg cccacttggc agtacatcaa gtgtatcata tgccaagtcc gccccctatt 360
gacgtcaatg acggtaaatg gcccgcctgg cattatgccc agtacatgac cttacgggac 420
tttcctactt ggcagtacat ctacgtatta gtcatcgcta ttaccatggt gatgcggttt 480
tggcagtaca ccaatgggcg tggatagcgg tttgactcac ggggatttcc aagtctccac 540
cccattgacg tcaatgggag tttgttttgg caccaaaatc aacgggactt tccaaaatgt 600
cgtaataacc ccgccccgtt gacgcaaatg ggcggtaggc gtgtacggtg ggaggtctat 660
ataagcagag ctcgtttagt gaacc 685
<210>2
<211>131
<212>DNA
<213>人巨细胞病毒
<400>2
gtcagatcgc ctggagacgc catccacgct gttttgacct ccatagaaga caccgggacc 60
gatccagcct ccgcggccgg gaacggtgca ttggaacgcg gattccccgt gccaagagtg 120
actcaccgtc c 131
<210>3
<211>135
<212>DNA
<213>大鼠(Rattus rattus)
<400>3
atcagcaagc aggtatgtac tctccagggt gggcctggct tccccagtca agactccagg 60
gatttgaggg acgctgtggg ctcttctctt acatgtacct tttgctagcc tcaaccctga 120
ctatcttcca ggtca 135
<210>4
<211>955
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>嵌合启动子序列
<400>4
aatattggct attggccatt gcatacgttg tatctatatc ataatatgta catttatatt 60
ggctcatgtc caatatgacc gccatgttga cattgattat tgactagtta ttaatagtaa 120
tcaattacgg ggtcattagt tcatagccca tatatggagt tccgcgttac ataacttacg 180
gtaaatggcc cgcctggctg accgcccaac gacccccgcc cattgacgtc aataatgacg 240
tatgttccca tagtaacgcc aatagggact ttccattgac gtcaatgggt ggagtattta 300
cggtaaactg cccacttggc agtacatcaa gtgtatcata tgccaagtcc gccccctatt 360
gacgtcaatg acggtaaatg gcccgcctgg cattatgccc agtacatgac cttacgggac 420
tttcctactt ggcagtacat ctacgtatta gtcatcgcta ttaccatggt gatgcggttt 480
tggcagtaca ccaatgggcg tggatagcgg tttgactcac ggggatttcc aagtctccac 540
cccattgacg tcaatgggag tttgttttgg caccaaaatc aacgggactt tccaaaatgt 600
cgtaataacc ccgccccgtt gacgcaaatg ggcggtaggc gtgtacggtg ggaggtctat 660
ataagcagag ctcgtttagt gaaccgtcag atcgcctgga gacgccatcc acgctgtttt 720
gacctccata gaagacaccg ggaccgatcc agcctccgcg gccgggaacg gtgcattgga 780
acgcggattc cccgtgccaa gagtgactca ccgtccggat ctcagcaagc aggtatgtac 840
tctccagggt gggcctggct tccccagtca agactccagg gatttgaggg acgctgtggg 900
ctcttctctt acatgtacct tttgcttgcc tcaaccctga ctatcttcca ggtca 955
<210>5
<211>121
<212>DNA
<213>乙肝病毒
<400>5
cagagtcagg ggtctgtatt ttcctgctgg tggctccagt tcaggaacag taaaccctgc 60
tccgaatatt gcctctcaca tctcgtcaat ctccgcgagg actggggacc ctgtgacgaa 120
c 121
<210>6
<211>57
<212>DNA
<213>单纯疱疹病毒
<400>6
ataagctgca ttgcgaacca ctagtcgccg tttttcgtgt gcatcgcgta tcacggc 57
<210>7
<211>48
<212>DNA
<213>乙肝病毒
<400>7
ctttgtacta ggaggctgta ggcataaatt ggtctgttca ccagcacc 48
<210>8
<211>533
<212>DNA
<213>乙肝病毒
<400>8
taacaaaaca aaaagatggg gttattccct aaacttcatg ggttacgtaa ttggaagttg 60
ggggacattg ccacaagatc atattgtaca aaagatcaaa cactgtttta gaaaacttcc 120
tgtaaacagg cctattgatt ggaaagtatg tcaaaggatt gtgggtcttt tgggctttgc 180
tgctccattt acacaatgtg gatatcctgc cttaatgcct ttgtatgcat gtatacaagc 240
taaacaggct ttcactttct cgccaactta caaggccttt ctaagtaaac agtacatgaa 300
cctttacccc gttgctcggc aacggcctgg tctgtgccaa gtgtttgctg acgcaacccc 360
cactggctgg ggcttggcca taggccatca gcgcatgcgt ggaacctttg tggctcctct 420
gccgatccat actgcggaac tcctagccgc ttgttttgct cgcagccggt ctggagcaaa 480
gctcatagga actgacaatt ctgtcgtcct ctcgcggaaa tatacatcgt ttc 533
<210>9
<211>158
<212>DNA
<213>猿巨细胞病毒
<400>9
gtcagacaga cagacagtta tatgggctgg tccctataac tctgccattg taaccccata 60
tagccagaca gttagcattg catctattga tgatgtacta atgtattgta acccccccta 120
tgccattgtc taactgtact aatgtatgat attatacc 158
<210>10
<211>131
<212>DNA
<213>家兔(Oryctolagus cuniculus)
<400>10
gatctttttc cctctgccaa aaattatggg gacatcatga agccccttga gcatctgact 60
tctggctaat aaaggaaatt tattttcatt gcaatagtgt gttggaattt tttgtgtctc 120
tcactcggaa g 131
<210>11
<211>204
<212>DNA
<213>猿巨细胞病毒
<400>11
atatatactc tatgttatac tctatgatat acaatatata ctcatgaaca ctatgtactt 60
ggtgtatgac tcattattgt ctgggacttg gttgggactt ggttggttgg gaagaatgtt 120
gtgcctgtac ttgtgctgtg ctgtggatct caataaatgt gactatgttc aaaacactaa 180
gtgcccccgt gtcttcttta acta 204
<210>12
<211>163
<212>DNA
<213>单纯疱疹病毒2
<400>12
gaagacgagc tctaagggag gggaggggag ctgggcttgt gtataaataa aaagacaccg 60
atgttcaaaa atacacatga cttctggtat tgttttgcct tggtttttat ttgggggggg 120
gggggcgtgt gactagaaaa acaaatgcag acatgtgcta acg 163
<210>13
<211>191
<212>DNA
<213>人乳头状瘤病毒16型
<400>13
aattgttaca tataattgtt gtataccata acttactatt ttttcttttt tattttcata 60
tataattttt ttttttgttt gtttgtttgt tttttaataa actgttatta cttaacaatg 12
cgacacaaac gttctgcaaa acgcacaaaa cgtgcatcgg ctacccaact ttataaaaca 180
tgcaaacagg c 191
<210>14
<211>3759
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>pJV表达载体
<220>
<221>内含子
<222>(1725)..(1857)
<223>大鼠胰岛素内含子A
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(44)
<223>Tn903，pUC4K残余
<220>
<221>misc_feature
<222>(861)..(896)
<223>Tn903，pUC4K残余
<220>
<221>misc_feature
<222>(897)..(902)
<223>pUC19MCS
<220>
<221>polyA信号
<222>(2556)..(2686)
<223>rGLOB pA
<220>
<221>polyA 位点
<222>(2647)..(2647)
<223>PolyA_位点_1
<220>
<221>启动子
<222>(903)..(1587)
<223>CMV Pro
<220>
<221>3′UTR
<222>(2012)..(2544)
<223>HBVenh
<220>
<221>5′UTR
<222>(1864)..(1984)
<223>HBV pre-S2的5′-UTR
<220>
<221>misc_feature
<222>(1719)..(1724)
<223>Bam/Bgl融合物
<220>
<221>misc_feature
<222>(1985)..(1987)
<223>ATG-Nhe
<220>
<221>misc_feature
<222>(1988)..(2011)
<223>CDS插入位点
<220>
<221>misc_feature
<222>(2545)..(2555)
<223>未知
<220>
<221>外显子
<222>(1588)..(1718)
<223>CMV外显子1/2
<220>
<221>misc_feature
<222>(2693)..(3759)
<223>pUC19
<220>
<221>misc_feature
<222>(45)..(860)
<223>KanR(Tn903)互补序列
<400>14
ggcgtaatgc tctgccagtg ttacaaccaa ttaaccaatt ctgattagaa aaactcatcg 60
agcatcaaat gaaactgcaa tttattcata tcaggattat caataccata tttttgaaaa 120
agccgtttct gtaatgaagg agaaaactca ccgaggcagt tccataggat ggcaagatcc 180
tggtatcggt ctgcgattcc gactcgtcca acatcaatac aacctattaa tttcccctcg 240
tcaaaaataa ggttatcaag tgagaaatca ccatgagtga cgactgaatc cggtgagaat 300
ggcaaaagct tatgcatttc tttccagact tgttcaacag gccagccatt acgctcgtca 360
tcaaaatcac tcgcatcaac caaaccgtta ttcattcgtg attgcgcctg agcgagacga 420
aatacgcgat cgctgttaaa aggacaatta caaacaggaa tcgaatgcaa ccggcgcagg 480
aacactgcca gcgcatcaac aatattttca cctgaatcag gatattcttc taatacctgg 540
aatgctgttt tcccggggat cgcagtggtg agtaaccatg catcatcagg agtacggata 600
aaatgcttga tggtcggaag aggcataaat tccgtcagcc agtttagtct gaccatctca 660
tctgtaacat cattggcaac gctacctttg ccatgtttca gaaacaactc tggcgcatcg 720
ggcttcccat acaatcgata gattgtcgca cctgattgcc cgacattatc gcgagcccat 780
ttatacccat ataaatcagc atccatgttg gaatttaatc gcggcctcga gcaagacgtt 840
tcccgttgaa tatggctcat aacacccctt gtattactgt ttatgtaagc agacaggtcg 900
acaatattgg ctattggcca ttgcatacgt tgtatctata tcataatatg tacatttata 960
ttggctcatg tccaatatga ccgccatgtt gacattgatt attgactagt tattaatagt 1020
aatcaattac ggggtcatta gttcatagcc catatatgga gttccgcgtt acataactta 1080
cggtaaatgg cccgcctggc tgaccgccca acgacccccg cccattgacg tcaataatga 1140
cgtatgttcc catagtaacg ccaataggga ctttccattg acgtcaatgg gtggagtatt 1200
tacggtaaac tgcccacttg gcagtacatc aagtgtatca tatgccaagt ccgcccccta 1260
ttgacgtcaa tgacggtaaa tggcccgcct ggcattatgc ccagtacatg accttacggg 1320
actttcctac ttggcagtac atctacgtat tagtcatcgc tattaccatg gtgatgcggt 1380
tttggcagta caccaatggg cgtggatagc ggtttgactc acggggattt ccaagtctcc 1440
accccattga cgtcaatggg agtttgtttt ggcaccaaaa tcaacgggac tttccaaaat 1500
gtcgtaataa ccccgccccg ttgacgcaaa tgggcggtag gcgtgtacgg tgggaggtct 1560
atataagcag agctcgttta gtgaacc gtc aga tcg cct gga gac gcc atc cac 1614
Val Arg Ser Pro Gly Asp Ala Ile His
15
gct gtt ttg acc tcc ata gaa gac acc ggg acc gat cca gcc tcc gcg 1662
Ala Val Leu Thr Ser Ile Glu Asp Thr Gly Thr Asp Pro Ala Ser Ala
10 15 20 25
gcc ggg aac ggt gca ttg gaa cgc gga ttc ccc gtg cca aga gtg act 1710
Ala Gly Asn Gly Ala Leu Glu Arg Gly Phe Pro Val Pro Arg Val Thr
30 35 40
cac cgt cc ggatctcagc aagcaggtat gtactctcca gggtgggcct ggcttcccca 1768
His Arg
gtcaagactc cagggatttg agggacgctg tgggctcttc tcttacatgt accttttgct 1828
tgcctcaacc ctgactatct tccaggtcag gatcccagag tcaggggtct gtattttcct 1888
gctggtggct ccagttcagg aacagtaaac cctgctccga atattgcctc tcacatctcg 1948
tcaatctccg cgaggactgg ggaccctgtg acgaacatgg ctagcgggcc cagatctggg 2008
ccctaacaaa acaaaaagat ggggttattc cctaaacttc atgggttacg taattggaag 2068
ttgggggaca ttgccacaag atcatattgt acaaaagatc aaacactgtt ttagaaaact 2128
tcctgtaaac aggcctattg attggaaagt atgtcaaagg attgtgggtc ttttgggctt 2188
tgctgctcca tttacacaat gtggatatcc tgccttaatg cctttgtatg catgtataca 2248
agctaaacag gctttcactt tctcgccaac ttacaaggcc tttctaagta aacagtacat 2308
gaacctttac cccgttgctc ggcaacggcc tggtctgtgc caagtgtttg ctgacgcaac 2368
ccccactggc tggggcttgg ccataggcca tcagcgcatg cgtggaacct ttgtggctcc 2428
tctgccgatc catactgcgg aactcctagc cgcttgtttt gctcgcagcc ggtctggagc 2488
aaagctcata ggaactgaca attctgtcgt cctctcgcgg aaatatacat cgtttcgatc 2548
tacgtatgat ctttttccct ctgccaaaaa ttatggggac atcatgaagc cccttgagca 2608
tctgacttct ggctaataaa ggaaatttat tttcattgca atagtgtgtt ggaatttttt 2668
gtgtctctca ctcggaagga attctgcatt aatgaatcgg ccaacgcgcg gggagaggcg 2728
gtttgcgtat tgggcgctct tccgcttcct cgctcactga ctcgctgcgc tcggtcgttc 2788
ggctgcggcg agcggtatca gctcactcaa aggcggtaat acggttatcc acagaatcag 2848
gggataacgc aggaaagaac atgtgagcaa aaggccagca aaaggccagg aaccgtaaaa 2908
aggccgcgtt gctggcgttt ttccataggc tccgcccccc tgacgagcat cacaaaaatc 2968
gacgctcaag tcagaggtgg cgaaacccga caggactata aagataccag gcgtttcccc 3028
ctggaagctc cctcgtgcgc tctcctgttc cgaccctgcc gcttaccgga tacctgtccg 3088
cctttctccc ttcgggaagc gtggcgcttt ctcatagctc acgctgtagg tatctcagtt 3148
cggtgtaggt cgttcgctcc aagctgggct gtgtgcacga accccccgtt cagcccgacc 3208
gctgcgcctt atccggtaac tatcgtcttg agtccaaccc ggtaagacac gacttatcgc 3268
cactggcagc agccactggt aacaggatta gcagagcgag gtatgtaggc ggtgctacag 3328
agttcttgaa gtggtggcct aactacggct acactagaag aacagtattt ggtatctgcg 3388
ctctgctgaa gccagttacc ttcggaaaaa gagttggtag ctcttgatcc ggcaaacaaa 3448
ccaccgctgg tagcggtggt ttttttgttt gcaagcagca gattacgcgc agaaaaaaag 3508
gatctcaaga agatcctttg atcttttcta cggggtctga cgctcagtgg aacgaaaact 3568
cacgttaagg gattttggtc atgagattat caaaaaggat cttcacctag atccttttaa 3628
attaaaaatg aagttttaaa tcaatctaaa gtatatatga gtaaacttgg tctgacagtt 3688
accaatgctt aatcagtgag gcacctatct cagcgatctg tctatttcgt tcatccatag 3748
ttgcctgact c 3759
<210>15
<211>42
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>15
ggaggatccg gacggtgagt cactcttggc acggggaatc cg 42
<210>16
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>16
ggtgaatatg gctcataaca c 21
<210>17
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>17
ccgccgaaca tggagaacat cgc 23
<210>18
<211>33
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>18
cacagatctt ttgttagggt ttaaatgtat acc 33
<210>19
<211>29
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>19
ggaggatcct gacctggaag atagtcacc 29
<210>20
<211>26
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>20
ggaggatcca tcagcaagca ggtatg 26
<210>21
<211>33
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>21
ggagctagcg ggcgtttgac ctccggcgtc ggg 33
<210>22
<211>37
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>22
ggagaattca gatctcctct agtaaaacaa tggctgg 37
<210>23
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>23
ggagctagcc ttctaaccga ggtcg 25
<210>24
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>24
ggaagatctc cttactccag ctctatgctg 30
<210>25
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>25
ggcgaattcc ttccgagtga gagacac 27
<210>26
<211>43
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>26
ggagtataca tttaaagggc cctaacaaaa caaaaagatg ggg 43
<210>27
<211>31
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>27
ggagctagct cgtttacttt gaccaagaac g 31
<210>28
<211>36
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>28
ggaagatctc cttatttttg acaccagacc aactgg 36
<210>29
<211>29
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>29
ggagtcgacc tgtctgctta cataaacag 29
<210>30
<211>26
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>30
cgtaatgctc tgccagtgtt acaacc 26
<210>31
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>31
gaaagatctc agcaagcagg 20
<210>32
<211>47
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>32
ggaggatcct gacctggaag atagtcaggg ttgaggcaag caaaagg 47
<210>33
<211>12
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>33
ctagcgggcc ca 12
<210>34
<211>12
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>34
gatctgggcc cg 12
<210>35
<211>28
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>35
ggagctagca tcatcccagt tgaggagg 28
<210>36
<211>28
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>36
ggtagatctc ctcatgtctg ctcgaagc 28
<210>37
<211>29
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>37
ccaagctagc gacaaaactc acacatgcc 29
<210>38
<211>45
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>38
ggaagatctc gtttacccct gtcatttacc cggagacagg gagag 45
<210>39
<211>57
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸
<400>39
aagatgtcca gactctgtct ctccgtggcc ctcctcgtgc tcctcgggac actcgcc 57
<210>40
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>40
ggaactagta agatgtccag actc 24
<210>41
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>41
ggaagctagc ggcgagtgtc ccgag 25
<210>42
<211>75
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸
<400>42
ggaaagatgg ccagcctctt tgccacattt ctcgtggtgc tcgtgagcct cagcctcgcc 60
agcgaaagca gcgcc 75
<210>43
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>43
ggaactagtg gaaagatggc cagc 24
<210>44
<211>26
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>44
ggaagctagc ggcgctgctt tcgctg 26
<210>45
<211>51
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸
<400>45
aggtctttgc taatcttggt gctttgcttc ctgcccctgg ctgctctggg g 51
<210>46
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>46
ggaactagta ggtctttgct aatc 24
<210>47
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>47
ggaagctagc ccccagagca gccag 25
<210>48
<211>31
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>48
ggagctagct cgtttacttt gaccaagaac g 31
<210>49
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>49
ggaagatctc cggtgagtgg tgctg 25
<210>50
<211>32
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>50
gcaggatcca gtagacctgg agagaggaca ag 32
<210>51
<211>29
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>51
ggaagatcta caaggtgagc tgctgtggc 29
<210>52
<211>490
<212>DNA
<213>伪狂犬病病毒
<400>52
tggccgcaga gcgggccggg catgcaaatc agaggcgcgc gggagacgcc tccgcgcgcc 60
cattggcccg ggcgagccga gatggccgcc gcgggggccg gacatgcaaa gtagacgcga 120
gaggaagtag ggagagaaat cccattggcc gtcgaggggc caagatggcg ccctcggggc 180
cggacatgca aagtagacgc gagaggaagt gggcgagaga aatcccattg gccgtcgatg 240
gggcaagatg gccgccgcgg gggccgggca tgcaaatggt cctcgcgagg aagttcctcg 300
cgaaatccca ttggccggcg gccgccatct tgggccgggc atgcaaagca gacggcagag 360
gaagcgggcg agaaaaatcc cattggccgg ccgtcgggga agtccgcggc gaaaatcggc 420
cattggtccg cttacctggg ggcgggctct cctcggggcg cttataagcg cggtctccat 480
cgtagcactt 490
<210>53
<211>495
<212>DNA
<213>劳氏肉瘤病毒
<400>53
ctgctccctg cttgtgtgtt ggaggtcgct gagtagtgcg cgagcaaaat ttaagctaca 60
acaaggcaag gcttgaccga caattgcatg aagaatctgc ttagggttag gcgttttgcg 120
ctgcttcgcg atgtacgggc cagatatacg cgtatctgag gggactaggg tgtgtttagg 180
cgaaaagcgg ggcttcggtt gtacgcggtt aggagttccc tcaggatata gtagtttcgc 240
ttttgcatag ggagggggaa atgtagtctt atgcaataca cttgtagtct tgcaacatgg 300
taacgatgag ttagcaacat gccttacaag gagagaaaaa gcaccgtgca tgccgattgg 360
tggaagtaag gtggtacgat cgtgccttat taggaaggca acagacaggt ctgacatgga 420
ttggacgaac cactgaattc cgcattgcag agataattgt atttaagtgc ctagctcgat 480
acaataaacg ccatt 495
<210>54
<211>5446
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>两侧为Tn903序列的卡那霉素抗性基因
<222>(1)..(896)
<220>
<221>SalI克隆位点
<222>(897)..(902)
<220>
<221>CMV启动子
<222>(903)..(1587)
<220>
<221>CMV外显子1/2融合物
<222>(1588)..(1718)
<220>
<221>Bam H1/Bgl2融合物
<222>(1719)..(1724)
<220>
<221>大鼠胰岛素内含子A
<222>(1725)..(1857)
<220>
<221>Bam H1克隆位点
<222>(1858)..(1863)
<220>
<221>HbsAg非编码区域的pre S2区域
<222>(1864)..(1984)
<220>
<221>CDS
<222>(1985)..(3691)
<220>
<221>H3Panama 3″UTR的G核苷酸
<222>(3692)..(3692)
<220>
<221>Bsp1201克隆位点
<222>(3693)..(3698)
<220>
<221>HBV增强子
<222>(3699)..(4231)
<220>
<221>兔β珠蛋白多腺苷酸化区域
<222>(4243)..(4373)
<220>
<221>Eco RI克隆位点
<222>(4374)..(4379)
<220>
<221>PUC 19载体骨架序列
<222>(4380)..(5446)
<400>54
ggcgtaatgc tctgccagtg ttacaaccaa ttaaccaatt ctgattagaa aaactcatcg 60
agcatcaaat gaaactgcaa tttattcata tcaggattat caataccata tttttgaaaa 120
agccgtttct gtaatgaagg agaaaactca ccgaggcagt tccataggat ggcaagatcc 180
tggtatcggt ctgcgattcc gactcgtcca acatcaatac aacctattaa tttcccctcg 240
tcaaaaataa ggttatcaag tgagaaatca ccatgagtga cgactgaatc cggtgagaat 300
ggcaaaagct tatgcatttc tttccagact tgttcaacag gccagccatt acgctcgtca 360
tcaaaatcac tcgcatcaac caaaccgtta ttcattcgtg attgcgcctg agcgagacga 420
aatacgcgat cgctgttaaa aggacaatta caaacaggaa tcaaatgcaa ccggcgcagg 480
aacactgcca gcgcatcaac aatattttca cctgaatcag gatattcttc taatacctgg 540
aatgctgttt tcccggggat cgcagtggtg agtaaccatg catcatcagg agtacggata 600
aaatgcttga tggtcggaag aggcataaat tccgtcagcc agtttagtct gaccatctca 660
tctgtaacat cattggcaac gctacctttg ccatgtttca gaaacaactc tggcgcatcg 720
ggcttcccat acaatcgata gattgtcgca cctgattgcc cgacattatc gcgagcccat 780
ttatacccat ataaatcagc atccatgttg gaatttaatc gcggcctcga gcaagacgtt 840
tcccgttgaa tatggctcat aacacccctt gtattactgt ttatgtaagc agacaggtcg 900
acaatattgg ctattggcca ttgcatacgt tgtatctata tcataatatg tacatttata 960
ttggctcatg tccaatatga ccgccatgtt gacattgatt attgactagt tattaatagt 1020
aatcaattac ggggtcatta gttcatagcc catatatgga gttccgcgtt acataactta 1080
cggtaaatgg cccgcctggc tgaccgccca acgacccccg cccattgacg tcaataatga 1140
cgtatgttcc catagtaacg ccaataggga ctttccattg acgtcaatgg gtggagtatt 1200
tacggtaaac tgcccacttg gcagtacatc aagtgtatca tatgccaagt ccgcccccta 1260
ttgacgtcaa tgacggtaaa tggcccgcct ggcattatgc ccagtacatg accttacggg 1320
actttcctac ttggcagtac atctacgtat tagtcatcgc tattaccatg gtgatgcggt 1380
tttggcagta caccaatggg cgtggatagc ggtttgactc acggggattt ccaagtctcc 1440
accccattga cgtcaatggg agtttgtttt ggcaccaaaa tcaacgggac tttccaaaat 1500
gtcgtaataa ccccgccccg ttgacgcaaa tgggcggtag gcgtgtacgg tgggaggtct 1560
atataagcag agctcgttta gtgaaccgtc agatcgcctg gagacgccat ccacgctgtt 1620
ttgacctcca tagaagacac cgggaccgat ccagcctccg cggccgggaa cggtgcattg 1680
gaacgcggat tccccgtgcc aagagtgact caccgtccgg atctcagcaa gcaggtatgt 1740
actctccagg gtgggcctgg cttccccagt caagactcca gggatttgag ggacgctgtg 1800
ggctcttctc ttacatgtac cttttgcttg cctcaaccct gactatcttc caggtcagga 1860
tcccagagtc aggggtctgt attttcctgc tggtggctcc agttcaggaa cagtaaaccc 1920
tgctccgaat attgcctctc acatctcgtc aatctccgcg aggactgggg accctgtgac 1980
gaac atg gct agc aag act atc att gct ttg agc tac att tta tgt ctg 2029
Met Ala Ser Lys Thr Ile Ile Ala Leu Ser Tyr Ile Leu Cys Leu
1 5 10 15
gtt ttc gct caa aaa ctt ccc gga aat gac aac agc acg gca acg ctg 2077
Val Phe Ala Gln Lys Leu Pro Gly Asn Asp Asn Ser Thr Ala Thr Leu
20 25 30
tgc ctg ggg cac cat gca gtg tca aac gga acg cta gtg aaa aca atc 2125
Cys Leu Gly His His Ala Val Ser Asn Gly Thr Leu Val Lys Thr Ile
35 40 45
acg aat gac caa att gaa gtg act aat gct act gag ctg gtt cag agt 2173
Thr Asn Asp Gln Ile Glu Val Thr Asn Ala Thr Glu Leu Val Gln Ser
50 55 60
tcc tca aca ggt aga ata tgc gac agt cct cac caa atc ctt gat gga 2221
Ser Ser Thr Gly Arg Ile Cys Asp Ser Pro His Gln Ile Leu Asp Gly
65 70 75
gaa aac tgc aca cta ata gat gct cta ttg gga gac cct cat tgt gat 2269
Glu Asn Cys Thr Leu Ile Asp Ala Leu Leu Gly Asp Pro His Cys Asp
80 85 90 95
ggc ttc caa aat aag gaa tgg gac ctt ttt gtt gaa cgc agc aaa gcc 2317
Gly Phe Gln Asn Lys Glu Trp Asp Leu Phe Val Glu Arg Ser Lys Ala
100 105 110
tac agc aac tgt tac cct tat gat gtg ccg gat tat gcc tcc ctt agg 2365
Tyr Ser Asn Cys Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala Ser Leu Arg
115 120 125
tca cta gtt gcc tca tcc ggc aca ctg gag ttt aac aat gaa agc ttc 2413
Ser Leu Val Ala Ser Ser Gly Thr Leu Glu Phe Asn Asn Glu Ser Phe
130 135 140
aat tgg act gga gtc gct cag aat gga aca agc tct gct tgc aaa agg 2461
Asn Trp Thr Gly Val Ala Gln Asn Gly Thr Ser Ser Ala Cys Lys Arg
145 150 155
aga tct aat aaa agt ttc ttt agt aga ttg aat tgg ttg cac caa tta 2509
Arg Ser Asn Lys Ser Phe Phe Ser Arg Leu Asn Trp Leu His Gln Leu
160 165 170 175
aaa tac aaa tat cca gca ctg aac gtg act atg cca aac aat gaa aaa 2557
Lys Tyr Lys Tyr Pro Ala Leu Asn Val Thr Met Pro Asn Asn Glu Lys
180 185 190
ttt gac aaa ttg tac att tgg ggg gtt ctc cac ccg agt acg gac agt 2605
Phe Asp Lys Leu Tyr Ile Trp Gly Val Leu His Pro Ser Thr Asp Ser
195 200 205
gac caa atc agc cta tat gct caa gca tca ggg aga gtc aca gtc tct 2653
Asp Gln Ile Ser Leu Tyr Ala Gln Ala Ser Gly Arg Val Thr Val Ser
210 215 220
acc aaa aga agc caa caa act gta atc ccg aat atc gga tct aga ccc 2701
Thr Lys Arg Ser Gln Gln Thr Val Ile Pro Asn Ile Gly Ser ArgPro
225 230 235
tgg gta agg ggt gtc tcc agc aga ata agc atc tat tgg aca ata gta 2749
Trp Val Arg Gly Val Ser Ser Arg Ile Ser Ile Tyr Trp Thr Ile Val
240 245 250 255
aaa ccg gga gac ata ctt ttg att aac agc aca ggg aat cta att gct 2797
Lys Pro Gly Asp Ile Leu Leu Ile Asn Ser Thr Gly Asn Leu Ile Ala
260 265 270
cct cgg ggt tac ttc aaa ata cga agt ggg aaa agc tca ata atg agg 2845
Pro Arg Gly Tyr Phe Lys Ile Arg Ser Gly Lys Ser Ser Ile Met Arg
275 280 285
tca gat gca ccc att ggc aaa tgc aat tct gaa tgc atc act cca aat 2893
Ser Asp Ala pro Ile Gly Lys Cys Asn Ser Glu Cys Ile Thr Pro Asn
290 295 300
gga agc att ccc aat gac aaa cca ttt caa aat gta aac agg atc aca 2941
Gly Ser Ile pro Asn Asp Lys Pro Phe Gln Asn Val Asn Ar gIle Thr
305 310 315
tat ggg gcc tgt ccc aga tat gtt aag caa aac act ctg aaa ttg gca 2989
Tyr Gly Ala Cys Pro Arg Tyr Val Lys Gln Asn Thr Leu Lys Leu Ala
320 325 330 335
aca ggg atg cgg aat gta cca gag aaa caa act aga ggc ata ttc ggc 3037
Thr Gly Met Arg Asn Val Pro Glu Lys Gln Thr Arg Gly Ile Phe Gly
340 345 350
gca atc gcg ggt ttc ata gaa aat ggt tgg gag gga atg gtg gac ggt 3085
Ala Ile Ala Gly Phe Ile Glu Asn Gly Trp Glu Gly Met Val Asp Gly
355 360 365
tgg tac ggt ttc agg cat caa aat tct gag ggc aca gga caa gca gca 3133
Trp Tyr Gly Phe Arg His Gln Asn Ser Glu Gly Thr Gly Gln Ala Ala
370 375 380
gat ctt aaa agc act caa gca gca atc aac caa atc aac ggg aaa ctg 3181
Asp Leu Lys Ser Thr Gln Ala Ala Ile Asn Gln Ile Asn Gly Lys Leu
385 390 395
aat agg tta atc gag aaa acg aac gag aaa ttc cat caa att gaa aaa 3229
Asn Arg Leu Ile Glu Lys Thr Asn Glu Lys Phe His Gln Ile Glu Lys
400 405 410 415
gaa ttc tca gaa gta gaa ggg aga att cag gac ctc gag aaa tat gtt 3277
Glu Phe Ser Glu Val Glu Gly Arg Ile Gln Asp Leu Glu Lys Tyr Val
420 425 430
gag gac act aaa ata gat ctc tgg tcg tac aac gcg gag ctt ctt gtt 3325
Glu Asp Thr Lys Ile Asp Leu Trp Ser Tyr Asn Ala Glu Leu Leu Val
435 440 445
gcc ctg gag aac caa cat aca att gat cta act gac tca gaa atg aac 3373
Ala Leu Glu Asn Gln His Thr Ile Asp Leu Thr Asp Ser Glu Met Asn
450 455 460
aaa ctg ttt gaa aga aca aag aag caa ctg agg gaa aat gct gag gat 3421
Lys Leu Phe Glu Arg Thr Lys Lys Gln Leu Arg Glu Asn Ala Glu Asp
465 470 475
atg ggc aat ggt tgt ttc aaa ata tac cac aaa tgt gac aat gcc tgc 3469
Met Gly Asn Gly Cys Phe Lys Ile Tyr His Lys Cys Asp Asn Ala Cys
480 485 490 495
ata ggg tca atc aga aat gga act tat gac cat gat gta tac aga gac 3517
Ile Gly Ser Ile Arg Asn Gly Thr Tyr Asp His Asp Val Tyr Arg Asp
500 505 510
gaa gca tta aac aac cgg ttc cag atc aaa ggt gtt gag ctg aag tca 3565
Glu Ala Leu Asn Asn Arg Phe Gln Ile Lys Gly Val Glu Leu Lys Ser
515 520 525
gga tac aaa gat tgg atc cta tgg att tcc ttt gcc ata tca tgc ttt 3613
Gly Tyr Lys Asp Trp Ile Leu Trp Ile Ser Phe Ala Ile Ser Cys Phe
530 535 540
ttg ctt tgt gtt gtt ttg ctg ggg ttc atc atg tgg gcc tgc caa aaa 3661
Leu Leu Cys Val Val Leu Leu Gly Phe Ile Met Trp Ala Cys Gln Lys
545 550 555
ggc aac att agg tgc aac att tgc att tga ggggccctaa caaaacaaaa 3711
Gly Asn Ile Arg Cys Asn Ile Cys Ile
560 565
agatggggtt attccctaaa cttcatgggt tacgtaattg gaagttgggg gacattgcca 3771
caagatcata ttgtacaaaa gatcaaacac tgttttagaa aacttcctgt aaacaggcct 3831
attgattgga aagtatgtca aaggattgtg ggtcttttgg gctttgctgc tccatttaca 3891
caatgtggat atcctgcctt aatgcctttg tatgcatgta tacaagctaa acaggctttc 3951
actttctcgc caacttacaa ggcctttcta agtaaacagt acatgaacct ttaccccgtt 4011
gctcggcaac ggcctggtct gtgccaagtg tttgctgacg caacccccac tggctggggc 4071
ttggccatag gccatcagcg catgcgtgga acctttgtgg ctcctctgcc gatccatact 4131
gcggaactcc tagccgcttg ttttgctcgc agccggtctg gagcaaagct cataggaact 4191
gacaattctg tcgtcctctc gcggaaatat acatcgtttc gatctacgta tgatcttttt 4251
ccctctgcca aaaattatgg ggacatcatg aagccccttg agcatctgac ttctggctaa 4311
taaaggaaat ttattttcat tgcaatagtg tgttggaatt ttttgtgtct ctcactcgga 4371
aggaattctg cattaatgaa tcggccaacg cgcggggaga ggcggtttgc gtattgggcg 4431
ctcttccgct tcctcgctca ctgactcgct gcgctcggtc gttcggctgc ggcgagcggt 4491
atcagctcac tcaaaggcgg taatacggtt atccacagaa tcaggggata acgcaggaaa 4551
gaacatgtga gcaaaaggcc agcaaaaggc caggaaccgt aaaaaggccg cgttgctggc 4611
gtttttccat aggctccgcc cccctgacga gcatcacaaa aatcgacgct caagtcagag 4671
gtggcgaaac ccgacaggac tataaagata ccaggcgttt ccccctggaa gctccctcgt 4731
gcgctctcct gttccgaccc tgccgcttac cggatacctg tccgcctttc tcccttcggg 4791
aagcgtggcg ctttctcata gctcacgctg taggtatctc agttcggtgt aggtcgttcg 4851
ctccaagctg ggctgtgtgc acgaaccccc cgttcagccc gaccgctgcg ccttatccgg 4911
taactatcgt cttgagtcca acccggtaag acacgactta tcgccactgg cagcagccac 4971
tggtaacagg attagcagag cgaggtatgt aggcggtgct acagagttct tgaagtggtg 5031
gcctaactac ggctacacta gaagaacagt atttggtatc tgcgctctgc tgaagccagt 5091
taccttcgga aaaagagttg gtagctcttg atccggcaaa caaaccaccg ctggtagcgg 5151
tggttttttt gtttgcaagc agcagattac gcgcagaaaa aaaggatctc aagaagatcc 5211
tttgatcttt tctacggggt ctgacgctca gtggaacgaa aactcacgtt aagggatttt 5271
ggtcatgaga ttatcaaaaa ggatcttcac ctagatcctt ttaaattaaa aatgcaagttt 5331
taaatcaatc taaagtatat atgagtaaac ttggtctgac agttaccaat gcttaatcag 5391
tgaggcacct atctcagcga tctgtctatt tcgttcatcc atagttgcct gactc 5446
<210>55
<211>568
<212>PRT
<213>人工序列
<400>55
Met Ala Ser Lys Thr Ile Ile Ala Leu Ser Tyr Ile Leu Cys Leu Val
1 5 10 15
Phe Ala Gln Lys Leu Pro Gly Asn Asp Asn Ser Thr Ala Thr Leu Cys
20 25 30
Leu Gly His His Ala Val Ser Asn Gly Thr Leu Val Lys Thr Ile Thr
35 40 45
Asn Asp GlnIle Glu Val Thr Asn Ala Thr Glu Leu Val Gln Ser Ser
50 55 60
Ser Thr Gly Arg Ile Cys Asp Ser Pro His Gln Ile Leu Asp Gly Glu
65 70 75 80
Asn Cys Thr Leu Ile Asp Ala Leu Leu Gly Asp Pro His Cys Asp Gly
85 90 95
Phe Gln Asn Lys Glu Trp Asp Leu Phe Val Glu Arg Ser Lys Ala Tyr
100 105 110
Ser Asn Cys Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala Ser Leu Arg Ser
115 120 125
Leu Val Ala Ser Ser Gly Thr Leu Glu Phe Asn Asn Glu Ser Phe Asn
130 135 140
Trp Thr Gly Val Ala Gln Asn Gly Thr Ser Ser Ala Cys Lys Arg Arg
145 150 155 160
Ser Asn Lys Ser Phe Phe Ser Arg Leu Asn Trp Leu His Gln Leu Lys
165 170 175
Tyr Lys Tyr Pro Ala Leu Asn Val Thr Met Pro Asn Asn Glu Lys Phe
180 185 190
Asp Lys Leu Tyr Ile Trp Gly Val Leu His Pro Ser Thr Asp Ser Asp
195 200 205
Gln Ile Ser Leu Tyr Ala Gln Ala Ser Gly Arg Val Thr Val Ser Thr
210 215 220
Lys Arg Ser Gln Gln Thr Val Ile Pro Asn Ile Gly Ser Arg Pro Trp
225 230 235 240
Val Arg Gly Val Ser Ser Arg Ile Ser Ile Tyr Trp Thr Ile Val Lys
245 250 255
Pro Gly Asp Ile Leu Leu Ile Asn Ser Thr Gly Asn Leu Ile Ala Pro
260 265 270
Arg Gly Tyr Phe Lys Ile Arg Ser Gly Lys Ser Ser Ile Met Arg Ser
275 280 285
Asp Ala Pro Ile Gly Lys Cys Asn Ser Glu Cys Ile Thr Pro Asn Gly
290 295 300
Ser Ile pro Asn Asp Lys Pro Phe Gln Asn Val Asn Arg Ile Thr Tyr
305 310 315 320
Gly Ala Cys Pro Arg Tyr Val Lys Gln Asn Thr Leu Lys Leu Ala Thr
325 330 335
Gly Met Arg Asn Val Pro Glu Lys Gln Thr Arg Gly Ile Phe Gly Ala
340 345 350
Ile Ala Gly Phe Ile Glu Asn Gly Trp Glu Gly Met Val Asp Gly Trp
355 360 365
Tyr Gly Phe Arg His Gln Asn Ser Glu Gly Thr Gly Gln Ala Ala Asp
370 375 380
Leu Lys Ser Thr Gln Ala Ala Ile Asn Gln Ile Asn Gly Lys Leu Asn
385 390 395 400
Arg Leu Ile Glu Lys Thr Asn Glu Lys Phe His Gln Ile Glu Lys Glu
405 410 415
Phe Ser Glu Val Glu Gly Arg Ile Gln Asp Leu Glu Lys Tyr Val Glu
420 425 430
Asp Thr Lys Ile Asp Leu Trp Ser Tyr Asn Ala Glu Leu Leu Val Ala
435 440 445
Leu Glu Asn Gln His Thr Ile Asp Leu Thr Asp Ser Glu Met Asn Lys
450 455 460
Leu Phe Glu Arg Thr Lys Lys Gln Leu Arg Glu Asn Ala Glu Asp Met
465 470 475 480
Gly Asn Gly Cys Phe Lys Ile Tyr His Lys Cys Asp Asn Ala Cys Ile
485 490 495
Gly Ser Ile Arg Asn Gly Thr Tyr Asp His Asp Val Tyr Arg Asp Glu
500 505 510
Ala Leu Asn Asn Arg Phe Gln Ile Lys Gly Val Glu Leu Lys Ser Gly
515 520 525
Tyr Lys Asp Trp Ile Leu Trp Ile Ser Phe Ala Ile Ser Cys Phe Leu
530 535 540
Leu Cys Val Val Leu Leu Gly Phe Ile Met Trp Ala Cys Gln Lys Gly
545 550 555 560
Asn Ile Arg Cys Asn Ile Cys Ile
565
<210>56
<211>63
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>H3Panama HA流感病毒抗原的N端肽
<400>56
Met Lys Thr Ile Ile Ala Leu Ser Tyr Ile Leu Cys Leu Val Phe Ala
1 5 10 15
Gln Lys Leu Pro Gly Asn Asp Asn Ser Thr Ala Thr Leu Cys Leu Gly
20 25 30
His His Ala Val Ser Asn Gly Thr Leu Val Lys Thr Ile Thr Asn Asp
35 40 45
Gln Ile Glu Val Thr Asn Ala Thr Glu Leu Val Gln Ser Ser Ser
50 55 60
<210>57
<211>65
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>由pPJV1671编码的H3Panama HA抗原的N端序列
<400>57
Met Ala Ser Lys Thr Ile Ile Ala Leu Ser Tyr Ile Leu Cys Leu Val
1 5 10 15
Phe Ala Gln Lys Leu Pro Gly Asn Asp Asn Ser Thr Ala Thr Leu Cys
20 25 30
Leu Gly His His Ala Val Ser Asn Gly Thr Leu Val Lys Thr Ile Thr
35 40 45
Asn Asp Gln Ile Glu Val Thr Asn Ala Thr Glu Leu Val Gln Ser Ser
50 55 60
Ser
65
<210>58
<211>62
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>天然的和pPJV1671 N端的H3 Panama HA抗原的共有序列
<400>58
Lys Thr Ile Ile Ala Leu Ser Tyr Ile Leu Cys Leu Val Phe Ala Gln
1 5 10 15
Lys Leu Pro Gly Asn Asp Asn Ser Thr Ala Thr Leu Cys Leu Gly His
20 25 30
His Ala Val Ser Asn Gly Thr Leu Val Lys Thr Ile Thr Asn Asp Gln
35 40 45
Ile Glu Val Thr Asn Ala Thr Glu Leu Val Gln Ser Ser Ser
50 55 60
<210>59
<211>5453
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>两侧为Tn903序列的卡那霉素抗性基因
<222>(1)..(896)
<220>
<221>SalI克隆位点
<222>(897)..(902)
<220>
<221>CMV启动了
<222>(903)..(1587)
<220>
<221>CMV外显子1/2融合物
<222>(1588)..(1718)
<220>
<221>Bam H1/Bg12融合物
<222>(1719)..(1724)
<220>
<221>大鼠胰岛素内含子A
<222>(1725)..(1857)
<220>
<221>Bam H1克隆位点
<222>(1858)..(1863)
<220>
<221>HBsAg非编码区域的pre S2区域
<222>(1864)..(1984)
<220>
<221>CDS
<222>(1985)..(3697)
<220>
<221>Bsp1201克隆位点
<222>(3700)..(3705)
<220>
<221>HBV增强子
<222>(3706)..(4238)
<220>
<221>兔β珠蛋白多腺苷酸化区域
<222>(4250)..(4380)
<220>
<221>Eco RI克隆位点
<222>(4381)..(4386)
<220>
<221>PUC 19载体骨架序列
<222>(4387)..(5453)
<400>59
ggcgtaatgc tctgccagtg ttacaaccaa ttaaccaatt ctgattagaa aaactcatcg 60
agcatcaaat gaaactgcaa tttattcata tcaggattat caataccata tttttgaaaa 120
agccgtttct gtaatgaagg agaaaactca ccgaggcagt tccataggat ggcaagatcc 180
tggtatcggt ctgcgattcc gactcgtcca acatcaatac aacctattaa tttcccctcg 240
tcaaaaataa ggttatcaag tgagaaatca ccatgagtga cgactgaatc cggtgagaat 300
ggcaaaagct tatgcatttc tttccagact tgttcaacag gccagccatt acgctcgtca 360
tcaaaatcac tcgcatcaac caaaccgtta ttcattcgtg attgcgcctg agcgagacga 420
aatacgcgat cgctgttaaa aggacaatta caaacaggaa tcgaatgcaa ccggcgcagg 480
aacactgcca gcgcatcaac aatattttca cctgaatcag gatattcttc taatacctgg 540
aatgctgttt tcccggggat cgcagtggtg agtaaccatg catcatcagg agtacggata 600
aaatgcttga tggtcggaag aggcataaat tccgtcagcc agtttagtct gaccatctca 660
tctgtaacat cattggcaac gctacctttg ccatgtttca gaaacaactc tggcgcatcg 720
ggcttcccat acaatcgata gattgtcgca cctgattgcc cgacattatc gcgagcccat 780
ttatacccat ataaatcagc atccatgttg gaatttaatc gcggcctcga gcaagacgtt 840
tcccgttgaa tatggctcat aacacccctt gtattactgt ttatgtaagc agacaggtcg 900
acaatattgg ctattggcca ttgcatacgt tgtatctata tcataatatg tacatttata 960
ttggctcatg tccaatatga ccgccatgtt gacattgatt attgactagt tattaatagt 1020
aatcaattac ggggtcatta gttcatagcc catatatgga gttccgcgtt acataactta 1080
cggtaaatgg cccgcctggc tgaccgccca acgacccccg cccattgacg tcaataatga 1140
cgtatgttcc catagtaacg ccaataggga ctttccattg acgtcaatgg gtggagtatt 1200
tacggtaaac tgcccacttg gcagtacatc aagtgtatca tatgccaagt ccgcccccta 1260
ttgacgtcaa tgacggtaaa tggcccgcct ggcattatgc ccagtacatg accttacggg 1320
actttcctac ttggcagtac atctacgtat tagtcatcgc tattaccatg gtgatgcggt 1380
tttggcagta caccaatggg cgtggatagc ggtttgactc acggggattt ccaagtctcc 1440
accccattga cgtcaatggg agtttgtttt ggcaccaaaa tcaacgggac tttccaaaat 1500
gtcgtaataa ccccgccccg ttgacgcaaa tgggcggtag gcgtgtacgg tgggaggtct 1560
atataagcag agctcgttta gtgaaccgtc agatcgcctg gagacgccat ccacgctgtt 1620
ttgacctcca tagaagacac cgggaccgat ccagcctccg cggccgggaa cggtgcattg 1680
gaacgcggat tccccgtgcc aagagtgact caccgtccgg atctcagcaa gcaggtatgt 1740
actctccagg gtgggcctgg cttccccagt caagactcca gggatttgag ggacgctgtg 1800
ggctcttctc ttacatgtac cttttgcttg cctcaaccct gactatcttc caggtcagga 1860
tcccagagtc aggggtctgt attttcctgc tggtggctcc agttcaggaa cagtaaaccc 1920
tgctccgaat attgcctctc acatctcgtc aatctccgcg aggactgggg accctgtgac 1980
gaac atg gct agc gag aaa ata gtg ctt ctt ttt gca ata gtc agt ctt 2029
Met Ala Ser Glu Lys Ile Val Leu Leu Phe Ala Ile Val Ser Leu
1 5 10 15
gtt aaa agt gat cag att tgc att ggt tac cat gca aac aac tcg aca 2077
Val Lys Ser Asp Gln Ile Cys Ile Gly Tyr His Ala Asn Asn Ser Thr
20 25 30
gag cag gtt gac aca ata atg gaa aag aac gtt act gtt aca cat gcc 2125
Glu Gln yal Asp Thr Ile Met Glu Lys Asn Val Thr Val Thr His Ala
35 40 45
caa gac ata ctg gaa aag aca cac aat ggg aag ctc tgc gat cta gat 2173
Gln Asp Ile Leu Glu Lys Thr His Asn Gly Lys Leu Cys Asp Leu Asp
50 55 60
gga gtg aag cct cta att ttg aga gat tgt agt gta gct gga tgg ctc 2221
Gly Val Lys Pro Leu Ile Leu Arg Asp Cys Ser Val Ala Gly Trp Leu
65 70 75
ctc gga aac cca atg tgt gac gaa ttc atc aat gtg ccg gaa tgg tct 2269
Leu Gly Asn Pro Met Cys Asp Glu Phe Ile Asn Val Pro Glu Trp Ser
80 85 90 95
tac ata gtg gag aag gcc aat cca gtc aat gac ctc tgt tac cca ggg 2317
Tyr Ile Val Glu Lys Ala Asn Pro Val Asn Asp Leu Cys Tyr Pro Gly
100 105 110
gat ttc aat gac tat gaa gaa ttg aaa cac cta ttg agc aga ata aac 2365
Asp Phe Asn Asp Tyr Glu Glu Leu Lys His Leu Leu Ser Arg Ile Asn
115 120 125
cat ttt gag aaa att cag atc atc ccc aaa agt tct tgg tcc agt cat 2413
His Phe Glu Lys Ile Gln Ile Ile Pro Lys Ser Ser Trp Ser Ser His
130 135 140
gaa gcc tca ttg ggg gtg agc tca gca tgt cca tac cag gga aag tcc 2461
Glu Ala Ser Leu Gly Val Ser Ser Ala Cys Pro Tyr Gln Gly Lys Ser
145 150 155
tcc ttt ttc aga aat gtg gta tgg ctt atc aaa aag aac agt aca tac 2509
Ser Phe Phe Arg Asn Val Val Trp Leu Ile Lys Lys Asn Ser Thr Tyr
160 165 170 175
cca aca ata aag agg agc tac aat aat acc aac caa gaa gat ctt ttg 2557
Pro Thr Ile Lys Arg Ser Tyr Asn Asn Thr Asn Gln Glu Asp Leu Leu
180 185 190
gta ctg tgg ggg att cac cat cct aat gat gcg gca gag cag aca aag 2605
Val Leu Trp Gly Ile His His Pro Asn Asp Ala Ala Glu Gln Thr Lys
195 200 205
ctc tat caa aac cca acc acc tat att tcc gtt ggg aca tca aca cta 2653
Leu Tyr Gln Asn Pro Thr Thr Tyr Ile Ser Val Gly Thr Ser Thr Leu
210 215 220
aac cag aga ttg gta cca aga ata gct act aga tcc aaa gta aac ggg 2701
Asn Gln Arg Leu Val Pro Arg Ile Ala Thr Arg Ser Lys Val Asn Gly
225 230 235
caa agt gga agg atg gag ttc ttc tgg aca att tta aaa ccg aat gat 2749
Gln Ser Gly Arg Met Glu Phe Phe Trp Thr Ile Leu Lys Pro Asn Asp
240 245 250 255
gca atc aac ttc gag agt aat gga aat ttc att gct cca gaa tat gca 2797
Ala Ile Asn Phe Glu Ser Asn Gly Asn Phe Ile Ala Pro Glu Tyr Ala
260 265 270
tac aaa att gtc aag aaa ggg gac tca aca att atg aaa agt gaa ttg 2845
Tyr Lys Ile Val Lys Lys Gly Asp Ser Thr Ile Met Lys Ser Glu Leu
275 280 285
gaa tat ggt aac tgc aac acc aag tgt caa act cca atg ggg gcg ata 2893
Glu Tyr Gly Asn Cys Asn Thr Lys Cys Gln Thr Pro Met Gly Ala Ile
290 295 300
aac tct agc atg cca ttc cac aat ata cac cct ctc acc atc ggg gaa 2941
Asn Ser Ser Met Pro Phe His Asn Ile His Pro Leu Thr Ile Gly Glu
305 310 315
tgc ccc aaa tat gtg aaa tca aac aga tta gtc ctt gcg act ggg ctc 2989
Cys Pro Lys Tyr Val Lys Ser Asn Arg Leu Val Leu Ala Thr Gly Leu
320 325 330 335
aga aat agc cct caa aga gag aga aga aga aaa aag aga gga tta ttt 3037
Arg Asn Ser Pro Gln Arg Glu Arg Arg Arg Lys Lys Arg Gly Leu Phe
340 345 350
gga gct ata gca ggt ttt ata gag gga gga tgg cag gga atg gta gat 3085
Gly Ala Ile Ala Gly Phe Ile Glu Gly Gly Trp Gln Gly Met Val Asp
355 360 365
ggt tgg tat ggg tac cac cat agc aac gag cag ggg agt ggg tac gct 3133
Gly Trp Tyr Gly Tyr His His Ser Asn Glu Gln Gly Ser Gly Tyr Ala
370 375 380
gca gac aaa gaa tcc act caa aag gca ata gat gga gtc acc aat aag 3181
Ala Asp Lys Glu Ser Thr Gln Lys Ala Ile Asp Gly Val Thr Asn Lys
385 390 395
gtc aac tcg att att gac aaa atg aac act cag ttt gag gcc gtt gga 3229
Val Asn Ser Ile Ile Asp Lys Met Asn Thr Gln Phe Glu Ala Val Gly
400 405 410 415
agg gaa ttt aac aac tta gaa agg aga ata gag aat tta aac aag aag 3277
Arg Glu Phe Asn Asn Leu Glu Arg Arg Ile Glu Asn Leu Asn Lys Lys
420 425 430
atg gaa gac ggg ttc cta gat gtc tgg act tat aat gct gaa ctt cta 3325
Met Glu Asp Gly Phe Leu Asp Val Trp Thr Tyr Asn Ala Glu Leu Leu
435 440 445
gtt ctc atg gaa aac gag aga act cta gac ttt cat gac tca aat gtc 3373
Val Leu Met Glu Asn Glu Arg Thr Leu Asp Phe His Asp Ser Asn Val
450 455 460
aag aac ctt tac gac aag gtc cga cta cag ctt agg gat aat gca aag 3421
Lys Asn Leu Tyr Asp Lys Val Arg Leu Gln Leu Arg Asp Asn Ala Lys
465 470 475
gag ctg ggt aac ggt tgt ttc gag ttc tat cat aaa tgt gat aat gaa 3469
Glu Leu Gly Asn Gly Cys Phe Glu Phe Tyr His Lys Cys Asp Asn Glu
480 485 490 495
tgt atg gaa agt gta aga aac gga acg tat gac tac ccg cag tat tca 3517
Cys Met Glu Ser Val Arg Asn Gly Thr Tyr Asp Tyr Pro Gln Tyr Ser
500 505 510
gaa gaa gca aga cta aaa aga gag gaa ata agt gga gta aaa ttg gaa 3565
Glu Glu Ala Arg Leu Lys Arg Glu Glu Ile Ser Gly Val Lys Leu Glu
515 520 525
tca ata gga att tac caa ata ttg tca att tat tct aca gtg gcg agc 3613
Ser Ile Gly Ile Tyr Gln Ile Leu Ser Ile Tyr Ser Thr Val Ala Ser
530 535 540
tcc cta gca ctg gca atc atg gta gct ggt cta tcc tta tgg atg tgc 3661
Ser Leu Ala Leu Ala Ile Met Val Ala Gly Leu Ser Leu Trp Met Cys
545 550 555
tcc aat ggg tcg tta caa tgc aga att tgc att taa atgggcccta 3707
Ser Asn Gly Ser Leu Gln Cys Arg Ile Cys Ile
560 565 570
acaaaacaaa aagatggggt tattccctaa acttcatggg ttacgtaatt ggaagttggg 3767
ggacattgcc acaagatcat attgtacaaa agatcaaaca ctgttttaga aaacttcctg 3827
taaacaggcc tattgattgg aaagtatgtc aaaggattgt gggtcttttg ggctttgctg 3887
ctccatttac acaatgtgga tatcctgcct taatgccttt gtatgcatgt atacaagcta 3947
aacaggcttt cactttctcg ccaacttaca aggcctttct aagtaaacag tacatgaacc 4007
tttaccccgt tgctcggcaa cggcctggtc tgtgccaagt gtttgctgac gcaaccccca 4067
ctggctgggg cttggccata ggccatcagc gcatgcgtgg aacctttgtg gctcctctgc 4127
cgatccatac tgcggaactc ctagccgctt gttttgctcg cagccggtct ggagcaaagc 4187
tcataggaac tgacaattct gtcgtcctct cgcggaaata tacatcgttt cgatctacgt 4247
atgatctttt tccctctgcc aaaaattatg gggacatcat gaagcccctt gagcatctga 4307
cttctggcta ataaaggaaa tttattttca ttgcaatagt gtgttggaat tttttgtgtc 4367
tctcactcgg aaggaattct gcattaatga atcggccaac gcgcggggag aggcggtttg 4427
cgtattgggc gctcttccgc ttcctcgctc actgactcgc tgcgctcggt cgttcggctg 4487
cggcgagcgg tatcagctca ctcaaaggcg gtaatacggt tatccacaga atcaggggat 4547
aacgcaggaa agaacatgtg agcaaaaggc cagcaaaagg ccaggaaccg taaaaaggcc 4607
gcgttgctgg cgtttttcca taggctccgc ccccctgacg agcatcacaa aaatcgacgc 4667
tcaagtcaga ggtggcgaaa cccgacagga ctataaagat accaggcgtt tccccctgga 4727
agctccctcg tgcgctctcc tgttccgacc ctgccgctta ccggatacct gtccgccttt 4787
ctcccttcgg gaagcgtggc gctttctcat agctcacgct gtaggtatct cagttcggtg 4847
taggtcgttc gctccaagct gggctgtgtg cacgaacccc ccgttcagcc cgaccgctgc 4907
gccttatccg gtaactatcg tcttgagtcc aacccggtaa gacacgactt atcgccactg 4967
gcagcagcca ctggtaacag gattagcaga gcgaggtatg taggcggtgc tacagagttc 5027
ttgaagtggt ggcctaacta cggctacact agaagaacag tatttggtat ctgcgctctg 5087
ctgaagccag ttaccttcgg aaaaagagtt ggtagctctt gatccggcaa acaaaccacc 5147
gctggtagcg gtggtttttt tgtttgcaag cagcagatta cgcgcagaaa aaaaggatct 5207
caagaagatc ctttgatctt ttctacgggg tctgacgctc agtggaacga aaactcacgt 5267
taagggattt tggtcatgag attatcaaaa aggatcttca cctagatcct tttaaattaa 5327
aaatgaagtt ttaaatcaat ctaaagtata tatgagtaaa cttggtctga cagttaccaa 5387
tgcttaatca gtgaggcacc tatctcagcg atctgtctat ttcgttcatc catagttgcc 5447
tgactc 5453
<210>60
<211>570
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成构建体
<400>60
Met Ala Ser Glu Lys Ile Val Leu Leu Phe Ala Ile Val Ser Leu Val
1 5 10 15
Lys Ser Asp Gln Ile Cys Ile Gly Tyr His Ala Asn Asn Ser Thr Glu
20 25 30
Gln Val Asp Thr Ile Met Glu Lys Asn Val Thr Val Thr His Ala Gln
35 40 45
Asp Ile Leu Glu Lys Thr His Asn Gly Lys Leu Cys Asp Leu Asp Gly
50 55 60
Val Lys Pro Leu Ile Leu Arg Asp Cys Ser Val Ala Gly Trp Leu Leu
65 70 75 80
Gly Asn Pro Met Cys Asp Glu Phe Ile Asn Val Pro Glu Trp Ser Tyr
85 90 95
Ile Val Glu Lys Ala Asn Pro Val Asn Asp Leu Cys Tyr Pro Gly Asp
100 105 110
Phe Asn Asp Tyr Glu Glu Leu Lys His Leu Leu Ser Arg Ile Asn His
115 120 125
Phe Glu Lys Ile Gln Ile Ile Pro Lys Ser Ser Trp Ser Ser His Glu
130 135 140
Ala Ser Leu Gly Val Ser Ser Ala Cys Pro Tyr Gln Gly Lys Ser Ser
145 150 155 160
Phe Phe Arg Asn Val Val Trp Leu Ile Lys Lys Asn Ser Thr Tyr Pro
165 170 175
Thr Ile Lys Arg Ser Tyr Asn Asn Thr Asn Gln Glu Asp Leu Leu Val
180 185 190
Leu Trp Gly Ile His His Pro Asn Asp Ala Ala Glu Gln Thr Lys Leu
195 200 205
Tyr Gln Asn Pro Thr Thr Tyr Ile Ser Val Gly Thr Ser Thr Leu Asn
2l0 215 220
Gln Arg Leu Val Pro Arg Ile Ala Thr Arg Ser Lys Val Asn Gly Gln
225 230 235 240
Ser Gly Arg Met Glu Phe Phe Trp Thr Ile Leu Lys Pro Asn Asp Ala
245 250 255
Ile Asn Phe Glu Ser Asn Gly Asn Phe Ile Ala Pro Glu Tyr Ala Tyr
260 265 270
Lys Ile Val Lys Lys Gly Asp Ser Thr Ile Met Lys Ser Glu Leu Glu
275 280 285
Tyr Gly Asn Cys Asn Thr Lys Cys Gln Thr Pro Met Gly Ala Ile Asn
290 295 300
Ser Ser Met Pro Phe His Asn Ile His Pro Leu Thr Ile Gly Glu Cys
305 310 315 320
Pro Lys Tyr Val Lys Ser Asn Arg Leu Val Leu Ala Thr Gly Leu Arg
325 330 335
Asn Ser Pro Gln Arg Glu Arg Arg Arg Lys Lys Arg Gly Leu Phe Gly
340 345 350
Ala Ile Ala Gly Phe Ile Glu Gly Gly Trp Gln Gly Met Val Asp Gly
355 360 365
Trp Tyr Gly Tyr His His Ser Asn Glu Gln Gly Ser Gly Tyr Ala Ala
370 375 380
Asp Lys Glu Ser Thr Gln Lys Ala Ile Asp Gly Val Thr Asn Lys Val
385 390 395 400
Asn Sen Ile Ile Asp Lys Met Asn Thr Gln Phe Glu Ala Val Gly Arg
405 410 415
Glu Phe Asn Asn Leu Glu Arg Arg Ile Glu Asn Leu Asn Lys Lys Met
420 425 430
Glu Asp Gly Phe Leu Asp Val Trp Thr Tyr Asn Ala Glu Leu Leu Val
435 440 445
Leu Met Glu Asn Glu Arg Thr Leu Asp Phe His Asp Ser Asn Val Lys
450 455 460
Asn Leu Tyr Asp Lys Val Arg Leu Gln Leu Arg Asp Asn Ala Lys Glu
465 470 475 480
Leu Gly Asn Gly Cys Phe Glu Phe Tyr His Lys Cys Asp Asn Glu Cys
485 490 495
Met Glu Ser Val Arg Asn Gly Thr Tyr Asp Tyr Pro Gln Tyr Ser Glu
500 505 510
Glu Ala Arg Leu Lys Arg Glu Glu Ile Ser Gly Val Lys Leu Glu Ser
515 520 525
Ile GlyIle Tyr Gln Ile Leu Ser Ile Tyr Ser Thr Val Ala Ser Ser
530 535 540
Leu Ala Leu Ala Ile Met Val Ala Gly Leu Ser Leu Trp Met Cys Ser
545 550 555 560
Asn Gly Ser Leu Gln Cys Arg Ile Cys Ile
565 570
<210>61
<211>5578
<212>DNA
<213>人工构建体
<220>
<223>含有LT A和LT B编码序列的PJV2012构建体
<400>61
ggcgtaatgc tctgccagtg ttacaaccaa ttaaccaatt ctgattagaa aaactcatcg 60
agcatcaaat gaaactgcaa tttattcata tcaggattat caataccata tttttgaaaa 120
agccgtttct gtaatgaagg agaaaactca ccgaggcagt tccataggat ggcaagatcc 180
tggtatcggt ctgcgattcc gactcgtcca acatcaatac aacctattaa tttcccctcg 240
tcaaaaataa ggttatcaag tgagaaatca ccatgagtga cgactgaatc cggtgagaat 300
ggcaaaagct tatgcatttc tttccagact tgttcaacag gccagccatt acgctcgtca 360
tcaaaatcac tcgcatcaac caaaccgtta ttcattcgtg attgcgcctg agcgagacga 420
aatacgcgat cgctgttaaa aggacaatta caaacaggaa tcaaatgcaa ccggcgcagg 480
aacactgcca gcgcatcaac aatattttca cctgaatcag gatattcttc taatacctgg 540
aatgctgttt tcccggggat cgcagtggtg agtaaccatg catcatcagg agtacggata 600
aaatgcttga tggtcggaag aggcataaat tccgtcagcc agtttagtct gaccatctca 660
tctgtaacat cattggcaac gctacctttg ccatgtttca gaaacaactc tggcgcatcg 720
ggcttcccat acaatcgata gattgtcgca cctgattgcc cgacattatc gcgagcccat 780
ttatacccat ataaatcagc atccatgttg gaatttaatc gcggcctcga gcaagacgtt 840
tcccgttgaa tatggctcat aacacccctt gtattactgt ttatgtaagc agacaggtcg 900
acaattcctt ccgagtgaga gacacaaaaa attccaacac actattgcaa tgaaaataaa 960
tttcctttat tagccagaag tcagatgctc aaggggcttc atgatgtccc cataattttt 1020
ggcagaggga aaaagatccc tagttttcca tactgattgc cgcaattgaa ttgggggttt 1080
tattattcca tacacataat ttatcaattt tggtctcggt cagatatgtg attcttaatg 1140
tgtccttcat cctttcaatg gctttttttt gggagtctat atgttgactg cccgggactt 1200
cgacctgaaa tgttgcgccg ctcttaaatg taatgataac catttctctt ttgcctgcca 1260
tcgattccgt atatgatagt atcttgtcat ttatcgtata tatttgtgtg ttgcgatatt 1320
ccgaacatag ttctgtaata gactggggag cgctagcccc cagagcagcc aggggcagga 1380
agcaaagcac caagattagc aaagacctac tagccatgtt cgtcacaggg tccccagtcc 1440
tcgcggagat tgacgagatg tgagaggcaa tattcggagc agggtttact gttcctgaac 1500
tggagccacc agcaggaaaa tacagacccc tgactctggg atcctgacct ggaagatagt 1560
cagggttgag gcaagcaaaa ggtacatgta agagaagagc ccacagcgtc cctcaaatcc 1620
ctggagtctt gactggggaa gccaggccca ccctggagag tacatacctg cttgctgaga 1680
tccggacggt gagtcactct tggcacgggg aatccgcgtt ccaatgcacc gttcccggcc 1740
gcggaggctg gatcggtccc ggtgtcttct atggaggtca aaacagcgtg gatggcgtct 1800
ccaggcgatc tgacggttca ctaaacgagc tctgcttata tagacctccc accgtacacg 1860
cctaccgccc atttgcgtca acggggcggg gttattacga cattttggaa agtcccgttg 1920
attttggtgc tcgacctgca ggtcgacaat attggctatt ggccattgca tacgttgtat 1980
ctatatcata atatgtacat ttatattggc tcatgtccaa tatgaccgcc atgttgacat 2040
tgattattga ctagttatta atagtaatca attacggggt cattagttca tagcccatat 2100
atggagttcc gcgttacata acttacggta aatggcccgc ctggctgacc gcccaacgac 2160
ccccgcccat tgacgtcaat aatgacgtat gttcccatag taacgccaat agggactttc 2220
cattgacgtc aatgggtgga gtatttacgg taaactgccc acttggcagt acatcaagtg 2280
tatcatatgc caagtccgcc ccctattgac gtcaatgacg gtaaatggcc cgcctggcat 2340
tatgcccagt acatgacctt acgggacttt cctacttggc agtacatcta cgtattagtc 2400
atcgctatta ccatggtgat gcggttttgg cagtacacca atgggcgtgg atagcggttt 2460
gactcacggg gatttccaag tctccacccc attgacgtca atgggagttt gttttggcac 2520
caaaatcaac gggactttcc aaaatgtcgt aataaccccg ccccgttgac gcaaatgggc 2580
ggtaggcgtg tacggtggga ggtctatata agcagagctc gtttagtgaa ccgtcagatc 2640
gcctggagac gccatccacg ctgttttgac ctccatagaa gacaccggga ccgatccagc 2700
ctccgcggcc gggaacggtg cattggaacg cggattcccc gtgccaagag tgactcaccg 2760
tccggatctc agcaagcagg tatgtactct ccagggtggg cctggcttcc ccagtcaaga 2820
ctccagggat ttgagggacg ctgtgggctc ttctcttaca tgtacctttt gcttgcctca 2880
accctgacta tcttccaggt caggatccca gagtcagggg tctgtatttt cctgctggtg 2940
gctccagttc aggaacagta aaccctgctc cgaatattgc ctctcacatc tcgtcaatct 3000
ccgcgaggac tggggaccct gtgacgaaca tggctagtag gtctttgcta atcttggtgc 3060
tttgcttcct gcccctggct gctctggggg ctagcaatgg cgacaaatta taccgtgctg 3120
actctagacc cccagatgaa ataaaacgtt ccggaggtct tatgcccaga gggcataatg 3180
agtacttcga tagaggaact caaatgaata ttaatcttta tgatcacgcg agaggaacac 3240
aaaccggctt tgtcagatat gatgacggat atgtttccac ttctcttagt ttgagaagtg 3300
ctcacttagc aggacagtct atattatcag gatattccac ttactatata tatgttatag 3360
cgacagcacc aaatatgttt aatgttaatg atgtattagg cgtatacagc cctcacccat 3420
atgaacagga ggtttctgcg ttaggtggaa taccatattc tcagatatat ggatggtatc 3480
gtgttaattt tggtgtgatt gatgaacgat tacatcgtaa cagggaatat agagaccggt 3540
attacagaaa tctgaatata gctccggcag aggatggtta cagattagca ggtttcccac 3600
cggatcacca agcttggaga gaagaaccct ggattcatca tgcaccacaa ggttgtggaa 3660
attcatcaag aacaattaca ggtgatactt gtaatgagga gacccagaat ctgagcacaa 3720
tatatctcag gaaatatcaa tcaaaagtta agaggcagat attttcagac tatcagtcag 3780
aggttgacat atataacaga attcgggatg aattatgagg atctgggccc taacaaaaca 3840
aaaagatggg gttattccct aaacttcatg ggttacgtaa ttggaagttg ggggacattg 3900
ccacaagatc atattgtaca aaagatcaaa cactgtttta gaaaacttcc tgtaaacagg 3960
cctattgatt ggaaagtatg tcaaaggatt gtgggtcttt tgggctttgc tgctccattt 4020
acacaatgtg gatatcctgc cttaatgcct ttgtatgcat gtatacaagc taaacaggct 4080
ttcactttct cgccaactta caaggccttt ctaagtaaac agtacatgaa cctttacccc 4140
gttgctcggc aacggcctgg tctgtgccaa gtgtttgctg acgcaacccc cactggctgg 4200
ggcttggcca taggccatca gcgcatgcgt ggaacctttg tggctcctct gccgatccat 4260
actgcggaac tcctagccgc ttgttttgct cgcagccggt ctggagcaaa gctcatagga 4320
actgacaatt ctgtcgtcct ctcgcggaaa tatacatcgt ttcgatctac gtatgatctt 4380
tttccctctg ccaaaaatta tggggacatc atgaagcccc ttgagcatct gacttctggc 4440
taataaagga aatttatttt cattgcaata gtgtgttgga attttttgtg tctctcactc 4500
ggaaggaatt ctgcattaat gaatcggcca acgcgcgggg agaggcggtt tgcgtattgg 4560
gcgctcttcc gcttcctcgc tcactgactc gctgcgctcg gtcgttcggc tgcggcgagc 4620
ggtatcagct cactcaaagg cggtaatacg gttatccaca gaatcagggg ataacgcagg 4680
aaagaacatg tgagcaaaag gccagcaaaa ggccaggaac cgtaaaaagg ccgcgttgct 4740
ggcgtttttc cataggctcc gcccccctga cgagcatcac aaaaatcgac gctcaagtca 4800
gaggtggcga aacccgacag gactataaag ataccaggcg tttccccctg gaagctccct 4860
cgtgcgctct cctgttccga ccctgccgct taccggatac ctgtccgcct ttctcccttc 4920
gggaagcgtg gcgctttctc atagctcacg ctgtaggtat ctcagttcgg tgtaggtcgt 4980
tcgctccaag ctgggctgtg tgcacgaacc ccccgttcag cccgaccgct gcgccttatc 5040
cggtaactat cgtcttgagt ccaacccggt aagacacgac ttatcgccac tggcagcagc 5100
cactggtaac aggattagca gagcgaggta tgtaggcggt gctacagagt tcttgaagtg 5160
gtggcctaac tacggctaca ctagaagaac agtatttggt atctgcgctc tgctgaagcc 5220
agttaccttc ggaaaaagag ttggtagctc ttgatccggc aaacaaacca ccgctggtag 5280
cggtggtttt tttgtttgca agcagcagat tacgcgcaga aaaaaaggat ctcaagaaga 5340
tcctttgatc ttttctacgg ggtctgacgc tcagtggaac gaaaactcac gttaagggat 5400
tttggtcatg agattatcaa aaaggatctt cacctagatc cttttaaatt aaaaatgaag 5460
ttttaaatca atctaaagta tatatgagta aacttggtct gacagttacc aatgcttaat 5520
cagtgaggca cctatctcag cgatctgtct atttcgttca tccatagttg cctgactc 5578
<210>62
<211>6254
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>PJV7788构建体
<400>62
ggcgtaatgc tctgccagtg ttacaaccaa ttaaccaatt ctgattagaa aaactcatcg 60
agcatcaaat gaaactgcaa tttattcata tcaggattat caataccata tttttgaaaa 120
agccgtttct gtaatgaagg agaaaactca ccgaggcagt tccataggat ggcaagatcc 180
tggtatcggt ctgcgattcc gactcgtcca acatcaatac aacctattaa tttcccctcg 240
tcaaaaataa ggttatcaag tgagaaatca ccatgagtga cgactgaatc cggtgagaat 300
ggcaaaagct tatgcatttc tttccagact tgttcaacag gccagccatt acgctcgtca 360
tcaaaatcac tcgcatcaac caaaccgtta ttcattcgtg attgcgcctg agcgagacga 420
aatacgcgat cgctgttaaa aggacaatta caaacaggaa tcgaatgcaa ccggcgcagg 480
aacactgcca gcgcatcaac aatattttca cctgaatcag gatattcttc taatacctgg 540
aatgctgttt tcccggggat cgcagtggtg agtaaccatg catcatcagg agtacggata 600
aaatgcttga tggtcggaag aggcataaat tccgtcagcc agtttagtct gaccatctca 660
tctgtaacat cattggcaac gctacctttg ccatgtttca gaaacaactc tggcgcatcg 720
ggcttcccat acaatcgata gattgtcgca cctgattgcc cgacattatc gcgagcccat 780
ttatacccat ataaatcagc atccatgttg gaatttaatc gcggcctcga gcaagacgtt 840
tcccgttgaa tatggctcat aacacccctt gtattactgt ttatgtaagc agacagtttt 900
attgttcatg atgatatatt tttatcttgt gcaatgtaac atcagagatt ttgagacaca 960
acgtggcttt cccccccccc ccggcatgcc tgcaggtcga caatattggc tattggccat 1020
tgcatacgtt gtatctatat cataatatgt acatttatat tggctcatgt ccaatatgac 1080
cgccatgttg acattgatta ttgactagtt attaatagta atcaattacg gggtcattag 1140
ttcatagccc atatatggag ttccgcgtta cataacttac ggtaaatggc ccgcctggct 1200
gaccgcccaa cgacccccgc ccattgacgt caataatgac gtatgttccc atagtaacgc 1260
caatagggac tttccattga cgtcaatggg tggagtattt acggtaaact gcccacttgg 1320
cagtacatca agtgtatcat atgccaagtc cgccccctat tgacgtcaat gacggtaaat 1380
ggcccgcctg gcattatgcc cagtacatga ccttacggga ctttcctact tggcagtaca 1440
tctacgtatt agtcatcgct attaccatgg tgatgcggtt ttggcagtac accaatgggc 1500
gtggatagcg gtttgactca cggggatttc caagtctcca ccccattgac gtcaatggga 1560
gtttgttttg gcaccaaaat caacgggact ttccaaaatg tcgtaataac cccgccccgt 1620
tgacgcaaat gggcggtagg cgtgtacggt gggaggtcta tataagcaga gctcgtttag 1680
tgaaccgtca gatcgcctgg agacgccatc cacgctgttt tgacctccat agaagacacc 1740
gggaccgatc cagcctccgc ggccgggaac ggtgcattgg aacgcggatt ccccgtgcca 1800
agagtgactc accgtccgga tctcagcaag caggtatgta ctctccaggg tgggcctggc 1860
ttccccagtc aagactccag ggatttgagg gacgctgtgg gctcttctct tacatgtacc 1920
ttttgcttgc ctcaaccctg actatcttcc aggtcaggat cccagagtca ggggtctgta 1980
ttttcctgct ggtggctcca gttcaggaac agtaaaccct gctccgaata ttgcctctca 2040
catctcgtca atctccgcga ggactgggga ccctgtgacg aacatggcta gtaggtcttt 2100
gctaatcttg gtgctttgct tcctgcccct ggctgctctg ggggctagcg ctccccagtc 2160
tattacagaa ctatgttcgg aatatcgcaa cacacaaata tatacgataa atgacaagat 2220
actatcatat acggaatcga tggcaggcaa aagagaaatg gttatcatta catttaagag 2280
cggcgcaaca tttcaggtcg aagtcccggg cagtcaacat atagactccc aaaaaaaagc 2340
cattgaaagg atgaaggaca cattaagaat cacatatctg accgagacca aaattgataa 2400
attatgtgta tggaataata aaacccccaa ttcaattgcg gcaatcagta tggaaaacta 2460
gggatctttt tccctctgcc aaaaattatg gggacatcat gaagcccctt gagcatctga 2520
cttctggcta ataaaggaaa tttattttca ttgcaatagt gtgttggaat tttttgtgtc 2580
tctcactcgg aaggaattga gggccggccc tctgcaggtc gacaatattg gctattggcc 2640
attgcatacg ttgtatctat atcataatat gtacatttat attggctcat gtccaatatg 2700
accgccatgt tgacattgat tattgactag ttattaatag taatcaatta cggggtcatt 2760
agttcatagc ccatatatgg agttccgcgt tacataactt acggtaaatg gcccgcctgg 2820
ctgaccgccc aacgaccccc gcccattgac gtcaataatg acgtatgttc ccatagtaac 2880
gccaataggg actttccatt gacgtcaatg ggtggagtat ttacggtaaa ctgcccactt 2940
ggcagtacat caagtgtatc atatgccaag tccgccccct attgacgtca atgacggtaa 3000
atggcccgcc tggcattatg cccagtacat gaccttacgg gactttccta cttggcagta 3060
catctacgta ttagtcatcg ctattaccat ggtgatgcgg ttttggcagt acaccaatgg 3120
gcgtggatag cggtttgact cacggggatt tccaagtctc caccccattg acgtcaatgg 3180
gagtttgttt tggcaccaaa atcaacggga ctttccaaaa tgtcgtaata accccgcccc 3240
gttgacgcaa atgggcggta ggcgtgtacg gtgggaggtc tatataagca gagctcgttt 3300
agtgaaccgt cagatcgcct ggagacgcca tccacgctgt tttgacctcc atagaagaca 3360
ccgggaccga tccagcctcc gcggccggga acggtgcatt ggaacgcgga ttccccgtgc 3420
caagagtgac tcaccgtccg gatctcagca agcaggtatg tactctccag ggtgggcctg 3480
gcttccccag tcaagactcc agggatttga gggacgctgt gggctcttct cttacatgta 3540
ccttttgctt gcctcaaccc tgactatctt ccaggtcagg atcccagagt caggggtctg 3600
tattttcctg ctggtggctc cagttcagga acagtaaacc ctgctccgaa tattgcctct 3660
cacatctcgt caatctccgc gaggactggg gaccctgtga cgaacatggc tagtaggtct 3720
ttgctaatct tggtgctttg cttcctgccc ctggctgctc tgggggctag caatggcgac 3780
aaattatacc gtgctgactc tagaccccca gatgaaataa aacgttccgg aggtcttatg 3840
cccagagggc ataatgagta cttcgataga ggaactcaaa tgaatattaa tctttatgat 3900
cacgcgagag gaacacaaac cggctttgtc agatatgatg acggatatgt ttccacttct 3960
cttagtttga gaagtgctca cttagcagga cagtctatat tatcaggata ttccacttac 4020
tatatatatg ttatagcgac agcaccaaat atgtttaatg ttaatgatgt attaggcgta 4080
tacagccctc acccatatga acaggaggtt tctgcgttag gtggaatacc atattctcag 4140
atatatggat ggtatcgtgt taattttggt gtgattgatg aacgattaca tcgtaacagg 4200
gaatatagag accggtatta cagaaatctg aatatagctc cggcagagga tggttacaga 4260
ttagcaggtt tcccaccgga tcaccaagct tggagagaag aaccctggat tcatcatgca 4320
ccacaaggtt gtggaaattc atcaagaaca attacaggtg atacttgtaa tgaggagacc 4380
cagaatctga gcacaatata tctcaggaaa tatcaatcaa aagttaagag gcagatattt 4440
tcagactatc agtcagaggt tgacatatat aacagaattc gggatgaatt atgaggatct 4500
gggccctaac aaaacaaaaa gatggggtta ttccctaaac ttcatgggtt acgtaattgg 4560
aagttggggg acattgccac aagatcatat tgtacaaaag atcaaacact gttttagaaa 4620
acttcctgta aacaggccta ttgattggaa agtatgtcaa aggattgtgg gtcttttggg 4680
ctttgctgct ccatttacac aatgtggata tcctgcctta atgcctttgt atgcatgtat 4740
acaagctaaa caggctttca ctttctcgcc aacttacaag gcctttctaa gtaaacagta 4800
catgaacctt taccccgttg ctcggcaacg gcctggtctg tgccaagtgt ttgctgacgc 4860
aacccccact ggctggggct tggccatagg ccatcagcgc atgcgtggaa cctttgtggc 4920
tcctctgccg atccatactg cggaactcct agccgcttgt tttgctcgca gccggtctgg 4980
agcaaagctc ataggaactg acaattctgt cgtcctctcg cggaaatata catcgtttcg 5040
atctacgtat gatctttttc cctctgccaa aaattatggg gacatcatga agccccttga 5100
gcatctgact tctggctaat aaaggaaatt tattttcatt gcaatagtgt gttggaattt 5160
tttgtgtctc tcactcggaa ggaattctgc attaatgaat cggccaacgc gcggggagag 5220
gcggtttgcg tattgggcgc tcttccgctt cctcgctcac tgactcgctg cgctcggtcg 5280
ttcggctgcg gcgagcggta tcagctcact caaaggcggt aatacggtta tccacagaat 5340
caggggataa cgcaggaaag aacatgtgag caaaaggcca gcaaaaggcc aggaaccgta 5400
aaaaggccgc gttgctggcg tttttccata ggctccgccc ccctgacgag catcacaaaa 5460
atcgacgctc aagtcagagg tggcgaaacc cgacaggact ataaagatac caggcgtttc 5520
cccctggaag ctccctcgtg cgctctcctg ttccgaccct gccgcttacc ggatacctgt 5580
ccgcctttct cccttcggga agcgtggcgc tttctcatag ctcacgctgt aggtatctca 5640
gttcggtgta ggtcgttcgc tccaagctgg gctgtgtgca cgaacccccc gttcagcccg 5700
accgctgcgc cttatccggt aactatcgtc ttgagtccaa cccggtaaga cacgacttat 5760
cgccactggc agcagccact ggtaacagga ttagcagagc gaggtatgta ggcggtgcta 5820
cagagttctt gaagtggtgg cctaactacg gctacactag aagaacagta tttggtatct 5880
gcgctctgct gaagccagtt accttcggaa aaagagttgg tagctcttga tccggcaaac 5940
aaaccaccgc tggtagcggt ggtttttttg tttgcaagca gcagattacg cgcagaaaaa 6000
aaggatctca agaagatcct ttgatctttt ctacggggtc tgacgctcag tggaacgaaa 6060
actcacgtta agggattttg gtcatgagat tatcaaaaag gatcttcacc tagatccttt 6120
taaattaaaa atgaagtttt aaatcaatct aaagtatata tgagtaaact tggtctgaca 6180
gttaccaatg cttaatcagt gaggcaccta tctcagcgat ctgtctattt cgttcatcca 6240
tagttgcctg actc 6254
<210>63
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<400>63
gccactctct tccgacac 18
<210>64
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<400>64
caagaacatc acacggaac 19
<210>65
<211>512
<212>PRT
<213>单纯疱疹病毒2
<400>65
Met Ala Thr Asp Ile Asp Met Leu Ile Asp Leu Gly Leu Asp Leu Ser
1 5 10 15
Asp Ser Glu Leu Glu Glu Asp Ala Leu Glu Arg Asp Glu Glu Gly Arg
20 25 30
Arg Asp Asp Pro Glu Ser Asp Ser Ser Gly Glu Cys Ser Ser Ser Asp
35 40 45
Glu Asp Met Glu Asp Pro Cys Gly Asp Gly Gly Ala Glu Ala Ile Asp
50 55 60
Ala Ala Ile Pro Lys Gly Pro Pro Ala Arg Pro Glu Asp Ala Gly Thr
65 70 75 80
Pro Glu Ala Ser Thr Pro Arg Pro Ala Ala Arg Arg Gly Ala Asp Asp
85 90 95
Pro Pro Pro Ala Thr Thr Gly Val Trp Ser Arg Leu Gly Thr Arg Arg
100 105 110
Ser Ala Ser Pro Arg Glu Pro His Gly Gly Lys Val Ala Arg Ile Gln
115 120 125
Pro Pro Ser Thr Lys Ala Pro His Pro Arg Gly Gly Arg Arg Gly Arg
130 135 140
Arg Arg Gly Arg Gly Arg Tyr Gly Pro Gly Gly Ala Asp Ser Thr Pro
145 150 155 160
Asn Pro Arg Arg Arg Val Ser Arg Asn Ala His Asn Gln Gly Gly Arg
165 170 175
His Pro Ala Ser Ala Arg Thr Asp Gly Pro Gly Ala Thr His Gly Glu
180 185 190
Ala Arg Arg Gly Gly Glu Gln Leu Asp Val Ser Gly Gly Pro Arg Pro
195 200 205
Arg Gly Thr Arg Gln Ala Pro Pro Pro Leu Met Ala Leu Ser Leu Thr
210 215 220
Pro Pro His Ala Asp Gly Arg Ala Pro Val Pro Glu Arg Lys Ala Pro
225 230 235 240
Ser Ala Asp Thr Ile Asp Pro Ala Val Arg Ala Val Leu Arg Ser Ile
245 250 255
Ser Glu Arg Ala Ala Val Glu Arg Ile Ser Glu Ser Phe Gly Arg Ser
260 265 270
Ala Leu Val Met Gln Asp Pro Phe Gly Gly Met Pro Phe Pro Ala Ala
275 280 285
Asn Ser Pro Trp Ala Pro Val Leu Ala Thr Gln Ala Gly Gly Phe Asp
290 295 300
Ala Glu Thr Arg Arg Val Ser Trp Glu Thr Leu Val Ala His Gly Pro
305 310 315 320
Ser Leu Tyr Arg Thr Phe Ala Ala Asn Pro Arg Ala Ala Ser Thr Ala
325 330 335
Lys Ala Met Arg Asp Cys Val Leu Arg Gln Glu Asn Leu Ile Glu Ala
340 345 350
Leu Ala Ser Ala Asp Glu Thr Leu Ala Trp Cys Lys Met Cys Ile His
355 360 365
His Asn Leu Pro Leu Arg Pro Gln Asp Pro Ile Ile Gly Thr Ala Ala
370 375 380
Ala Val Leu Glu Asn Leu Ala Thr Arg Leu Arg Pro Phe Leu Gln Cys
385 390 395 400
Tyr Leu Lys Ala Arg Gly Leu Cys Gly Leu Asp Asp Leu Cys Ser Arg
405 410 415
Arg Arg Leu Ser Asp Ile Lys Asp Ile Ala Ser Phe Val Leu Val Ile
420 425 430
Leu Ala Arg Leu Ala Asn Arg Val Glu Arg Gly Val Ser Glu Ile Asp
435 440 445
Tyr Thr Thr Val Gly Val Gly Ala Gly Glu Thr Met His Phe Tyr Ile
450 455 460
Pro Gly Ala Cys Met Ala Gly Leu Ile Glu Ile Leu Asp Thr His Arg
465 470 475 480
Gln Glu Cys Ser Ser Arg Val Cys Glu Leu Thr Ala Ser His Thr Ile
485 490 495
Ala Pro Leu Tyr Val His Gly Lys Tyr Phe Tyr Cys Asn Ser Leu Phe
500 505 510
<210>66
<211>18
<212>PRT
<213>单纯疱疹病毒2
<400>66
Arg Val Ser Trp Glu Thr Leu Val Ala His Gly Pro Ser Leu Tyr Arg
1 5 10 15
Thr Phe
<210>67
<211>18
<212>PRT
<213>单纯疱疹病毒2
<400>67
Val Ala His Gly Pro Ser Leu Tyr Arg Thr Phe Ala Ala Asn Pro Arg
1 5 10 15
Ala Ala
<210>68
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
<400>68
His Gly Pro Ser Leu Tyr Arg Thr Phe
1 5
<210>69
<211>11
<212>PRT
<213>单纯疱疹病毒2
<400>69
Leu Tyr Arg Thr Phe Ala Ala Asn Pro Arg Ala
1 5 10
<210>70
<211>11
<212>PRT
<213>单纯疱疹病毒1
<400>70
Leu Tyr Arg Thr Phe Ala Gly Asn Pro Arg Ala
1 5 10
Claims (114)
1.一种核酸构建体，适合送递给受试者以诱导针对流感病毒血凝素(HA)抗原的免疫应答，所述构建体包含：
(i)嵌合启动子序列，包含：
(a)hCMV立即早期启动子序列；
(b)hCMV主要立即早期基因的外显子1和至少一部分外显子2；和
(c)异源内含子，来置换hCMV主要立即早期基因的内含子A区域；
(ii)与所述嵌合启动子有效连接的编码序列，其中所述编码序列编码流感病毒血凝素(HA)抗原、其免疫原性片段或者所述抗原或片段的免疫原性变体，所述变体与所述抗原或片段具有至少80％的氨基酸同源性；
(iii)非翻译前导序列，所述非翻译前导序列来源于HBV preS2抗原序列、HBV e-抗原序列或HSV型2gD抗原序列，并与所述嵌合启动子有效连接；以及
(iv)增强子序列，所述增强子序列来源于HBsAg序列的3′非翻译区(UTR)或猿CMV立即早期基因序列的3′UTR，与所述嵌合启动子有效连接，并位于编码序列下游。
2.权利要求1的核酸构建体，其中所述编码序列编码一种以上的所述HA、片段或免疫原性变体。
3.权利要求2的核酸构建体，其中所述编码序列编码三至五种不同流感病毒毒株中的每一种的所述HA、片段或变体。
4.权利要求3的核酸构建体，其中所述编码序列编码三或四种非流行性流感病毒毒株的每一种的所述HA、片段或变体。
5.上述任一项权利要求的核酸构建体，其中所述编码序列编码流行性流感病毒毒株的所述HA、片段或变体。
6.载体颗粒，包被有上述任一项权利要求所述的核酸构建体。
7.载体颗粒，包被有权利要求1所述的至少两种不同的核酸构建体，其中每种所述构建体编码不同流感病毒毒株的所述HA、片段或变体。
8.权利要求7的载体颗粒，所述载体颗粒包被有三至五种不同的所述构建体。
9.权利要求8的载体颗粒，其中所述构建体中的三种或四种编码不同的非流行性流感病毒毒株的所述HA、片段或变体。
10.权利要求7至9任一项的载体颗粒，所述载体颗粒包被有编码流行性流感病毒毒株的所述HA、片段或变体的所述构建体。
11.权利要求6至10任一项的载体颗粒，所述载体颗粒还包被有包含启动子序列和与所述启动子有效连接的编码序列的核酸构建体，其中所述编码序列编码ADP核糖基化细菌毒素亚基、其具有佐剂活性的片段或它们两者具有佐剂活性并与所述亚基或片段具有至少80％氨基酸同源性的变体。
12.权利要求11的载体颗粒，其中所述启动子序列为嵌合启动子序列，包含：
(a)hCMV立即早期启动子序列；
(b)所述hCMV主要立即早期基因的外显子1和至少一部分外显子2；和
(c)异源内含子，来置换所述hCMV主要立即早期基因的内含子A区域。
13.权利要求11或12的载体颗粒，其中所述ADP核糖基化细菌毒素亚基选自霍乱毒素亚基A、霍乱毒素亚基B、大肠杆菌不耐热毒素亚基A和大肠杆菌不耐热毒素亚基B。
14.权利要求11至13任一项的载体颗粒，其中所述核酸构建体包含两个编码序列，所述每个编码序列包含不同的所述亚基、片段或变体。
15.权利要求14的载体颗粒，其中所述两个编码序列分别编码霍乱毒素亚基A和霍乱毒素亚基B，或者分别编码大肠杆菌不耐热毒素亚基A和大肠杆菌不耐热毒素亚基B。
16.权利要求11至15任一项的载体颗粒，其中所述核酸构建体还包含：
(a)非翻译前导序列，所述非翻译前导序列来源于HBVpreS2抗原序列、HBV e-抗原序列或HSV型2gD抗原序列，并且所述非翻译前导序列与所述嵌合启动子有效连接；和
(b)增强子序列，所述增强子序列来源于HBsAg序列的3′非翻译区(UTR)或猿CMV立即早期基因序列的3′UTR，与所述嵌合启动子有效连接，并位于编码序列下游。
17.权利要求6至16任一项的载体颗粒，所述载体颗粒为金颗粒。
18.用于颗粒介导的送递装置的剂量容器，包含权利要求6至17任一项所述的包被颗粒。
19.颗粒介导的送递装置，负载有权利要求6至17任一项所述的包被颗粒。
20.权利要求19的颗粒介导的送递装置，所述颗粒介导的送递装置为无针注射器。
21.一种核酸构建体，适合送递给受试者以诱导针对流感病毒血凝素(HA)抗原的免疫应答，所述构建体包含：
(i)嵌合启动子序列，包含：
(a)hCMV立即早期启动子序列；
(b)所述hCMV主要立即早期基因的外显子1和至少一部分外显子2；和
(c)异源内含子，来置换所述hCMV主要立即早期基因的内含子A区域；和
(ii)与所述嵌合启动子有效连接的编码序列，其中，所述编码序列编码流感病毒血凝素(HA)抗原、其免疫原性片段或所述抗原或片段的免疫原性变体，所述变体与所述抗原或片段具有至少80％的氨基酸同源性。
22.权利要求21的核酸构建体，所述核酸构建体还包含：
(iii)非翻译前导序列，所述非翻译前导序列来源于HBV preS2抗原序列、HBV e-抗原序列或HSV型2gD抗原序列，并与所述嵌合启动子有效连接；或者
(iv)增强子序列，所述增强子序列来源于HBsAg序列的3′非翻译区(UTR)或猿CMV立即早期基因序列的3′UTR，与所述嵌合启动子有效连接，并位于编码序列下游。
23.权利要求21或22的核酸构建体，其中所述编码序列编码一种以上所述HA、片段或免疫原性变体。
24.权利要求23的核酸构建体，其中所述编码序列编码三至五种不同流感病毒毒株中的每一种的所述HA、片段或变体。
25.权利要求24的核酸构建体，其中所述编码序列编码三或四种非流行性流感病毒毒株的每一种的所述HA、片段或变体。
26.权利要求21至25任一项的核酸构建体，其中所述编码序列编码流行性流感病毒毒株的所述HA、片段或变体。
27.载体颗粒，包被有权利要求21至26任一项所述的核酸构建体。
28.载体颗粒，包被有权利要求21所述的至少两种不同的核酸构建体，其中每种所述构建体编码不同流感病毒毒株的所述HA、片段或变体。
29.权利要求28的载体颗粒，所述载体颗粒包被有三至五种不同的所述构建体。
30.权利要求29的载体颗粒，其中所述构建体中的三种或四种编码不同的非流行性流感病毒毒株的所述HA、片段或变体。
31.权利要求28至30任一项的载体颗粒，所述载体颗粒包被有编码流行性流感病毒毒株的所述HA、片段或变体的所述构建体。
32.权利要求27至31任一项的载体颗粒，所述载体颗粒还包被有包含启动子序列和与所述启动子有效连接的编码序列的核酸构建体，其中所述编码序列编码ADP核糖基化细菌毒素亚基、其具有佐剂活性的片段或它们两者具有佐剂活性并与所述亚基或片段具有至少80％氨基酸同源性的变体。
33.权利要求32的载体颗粒，其中所述启动子序列为嵌合启动子序列，包含：
(a)hCMV立即早期启动子序列；
(b)所述hCMV主要立即早期基因的外显子1和至少一部分外显子2；和
(c)异源内含子，来置换所述hCMV主要立即早期基因的内含子A区域。
34.权利要求32或33的载体颗粒，其中所述ADP核糖基化细菌毒素亚基选自霍乱毒素亚基A、霍乱毒素亚基B、大肠杆菌不耐热毒素亚基A和大肠杆菌不耐热毒素亚基B。
35.权利要求32至34任一项的载体颗粒，其中所述核酸构建体包含两个编码序列，所述每个编码序列包含不同的所述亚基、片段或变体。
36.权利要求35的载体颗粒，其中所述两个编码序列分别编码霍乱毒素亚基A和霍乱毒素亚基B，或者分别编码大肠杆菌不耐热毒素亚基A和大肠杆菌不耐热毒素亚基B。
37.权利要求32至36任一项的载体颗粒，其中所述核酸构建体还包含：
(a)非翻译前导序列，所述非翻译前导序列来源于HBVpreS2抗原序列、HBV e-抗原序列或HSV型2gD抗原序列，并且所述非翻译前导序列与所述嵌合启动子有效连接；和/或
(b)增强子序列，所述增强子序列来源于HBsAg序列的3′非翻译区(UTR)或猿CMV立即早期基因序列的3′UTR，与所述嵌合启动子有效连接，并位于编码序列下游。
38.权利要求27至37任一项的载体颗粒，所述载体颗粒为金颗粒。
39.用于颗粒介导的送递装置的剂量容器，包含权利要求27至38任一项所述的包被颗粒。
40.颗粒介导的送递装置，负载有权利要求27至38任一项所述的包被颗粒。
41.权利要求40的颗粒介导的送递装置，所述颗粒介导的送递装置为无针注射器。
42.一种核酸构建体，包含嵌合启动子序列和与所述嵌合启动子有效连接的编码序列，其中所述编码序列编码流感病毒抗原、其免疫原性片段或与所述抗原或片段具有至少80％氨基酸同源性的所述抗原或片段的免疫原性变体，并且所述嵌合启动子序列包含：
(a)hCMV立即早期启动子序列；
(b)所述hCMV主要立即早期基因的外显子1和至少一部分外显子2；和
(c)异源内含子，来置换所述hCMV主要立即早期基因的内含子A区域。
43.权利要求42的核酸构建体，其中所编码的抗原为流感病毒血凝素(HA)、其免疫原性片段或与两者具有至少80％氨基酸序列同源性的免疫原性变体。
44.权利要求42的核酸构建体，其中所编码的抗原为流感病毒神经氨酸酶(NA)、M2、两者的免疫原性片段或与任一所述NA、M2或片段具有至少80％氨基酸序列同源性的免疫原性变体。
45.权利要求42至44任一项的核酸构建体，其中所述流感病毒抗原、免疫原性片段或变体来自流行性流感病毒毒株。
46.权利要求42至45任一项的核酸构建体，其中所述构建体编码一种以上的流感病毒抗原、免疫原性片段或免疫原性变体。
47.权利要求46的核酸构建体，其中所述构建体编码流行性流感病毒抗原、其免疫原性片段或所述抗原或片段的免疫原性变体，并且编码一种或多种非流行性流感病毒抗原、其一个或多个免疫原性片段或所述一个或多个抗原或一个或多个片段的一个或多个免疫原性变体。
48.权利要求46或47的核酸构建体，其中至少两种所编码的不同抗原、片段或变体来自不同流感病毒毒株的相同流感病毒多肽。
49.一种核酸构建体，所述构建体包含嵌合启动子序列和与所述嵌合启动子序列有效连接的编码序列，其中所述编码序列编码ADP核糖基化细菌毒素亚基、其具有佐剂活性的片段或它们两者与所述亚基或片段具有至少80％氨基酸同源性的变体，并且所述嵌合启动子序列包含：
(a)hCMV立即早期启动子序列；
(b)所述hCMV主要立即早期基因的外显子1和至少一部分外显子2；和
(c)异源内含子，来置换所述hCMV主要立即早期基因的内含子A区域。
50.权利要求49的核酸构建体，其中所述ADP核糖基化细菌毒素亚基选自霍乱毒素亚基A、霍乱毒素亚基B、大肠杆菌不耐热毒素亚基A和大肠杆菌不耐热毒素亚基B。
51.权利要求49或50的核酸构建体，其中所述核酸构建体包含两个编码序列，所述每个编码序列包含不同的所述亚基、片段或变体，并且每个所述编码序列与一个所述嵌合启动子有效连接。
52.权利要求51的核酸构建体，其中所述两个编码序列分别编码霍乱毒素亚基A和霍乱毒素亚基B，或者分别编码大肠杆菌不耐热毒素亚基A和大肠杆菌不耐热毒素亚基B。
53.权利要求51或52的核酸构建体，其中所述两个编码序列方向相反。
54.权利要求51或52的核酸构建体，其中所述两个编码序列方向相同。
55.权利要求42至54任一项的核酸构建体，其中所述hCMV立即早期启动子序列(a)包含：
(i)核苷酸序列SEQ ID No.1、SEQ ID No.54的903至1587位核苷酸、SEQ ID No：61的1815至1935位核苷酸、SEQ ID No：61的1948至2632位核苷酸、SEQ ID No：62的1002至1686位核苷酸和/或SEQ IDNo：62的2624至3308位核苷酸；
(ii)(i)的功能变体，它与(i)的一个或多个序列具有至少80％的核苷酸序列同源性；或
(iii)(i)或(ii)的功能片段。
56.权利要求42至55任一项的核酸构建体，其中外显子序列(b)包含：
(i)核苷酸序列SEQ ID No.2、核苷酸序列SEQ ID No.54的1588至1718位核苷酸、SEQ ID No.61的1684至1814位核苷酸、SEQ ID No.61的2633至2763位核苷酸、SEQ ID No.62的1687至1817位核苷酸和/或SEQ ID No.62的3309至3439位核苷酸；
(ii)(i)的功能变体，它与(i)的一个或多个序列具有至少80％的核苷酸序列同源性；或
(iii)(i)或(ii)的功能片段。
57.权利要求42至56任一项的核酸构建体，其中所述异源内含子(c)包含选自下列的序列：大鼠胰岛素基因内含子A序列、鸡角蛋白基因内含子A序列、鸡心脏的肌动蛋白基因内含子A序列、它们的功能片段、或者任何上述序列的功能变体。
58.权利要求57的核酸构建体，其中所述大鼠胰岛素基因内含子A序列包含：
(i)核苷酸序列SEQ ID NO：3、核苷酸序列SEQ ID No.54的1725至1857位核苷酸、SEQ ID No：61的1545至1677位核苷酸、SEQ ID No：61的2770至2902位核苷酸、SEQ ID No：62的1824至1956位核苷酸和/或SEQ ID No：62的3446至3578位核苷酸；
(ii)(i)的功能变体，它与(i)的一个或多个序列具有至少80％的核苷酸序列同源性；或
(iii)(i)或(ii)的功能片段。
59.权利要求42至58任一项的核酸构建体，其中所述嵌合启动子序列包含：
(i)核苷酸序列SEQ ID No.4或者核苷酸序列SEQ ID No.54的903至1857位核苷酸；
(ii)(i)的功能变体，它与(i)具有至少80％的核苷酸序列同源性；或
(iii)(i)或(ii)的功能片段。
60.权利要求42至59任一项的核酸构建体，所述核酸构建体还包含：
(a)非翻译前导序列，所述非翻译前导序列来源于HBV preS2抗原序列、HBV e-抗原序列或HSV型2gD抗原序列，并与所述嵌合启动子有效连接；和/或
(b)增强子序列，所述增强子序列来源于HBsAg序列的3′非翻译区(UTR)或猿CMV立即早期基因序列的3′UTR，与所述嵌合启动子有效连接，其中所述增强子序列位于克隆位点下游。
61.权利要求42的核酸构建体，所述核酸构建体包含：
(i)提供为SEQ ID NO：14的载体pPJV7563的序列，或
(ii)与(i)的序列具有至少60％序列同一性的序列；
并且编码所述抗原、片段或变体的所述序列提供于所述序列(i)或(ii)中，由此使得它与所述嵌合启动子有效连接。
62.权利要求61的核酸构建体，其中所述编码序列编码HA抗原、其免疫原性变体或两者的免疫原性片段。
63.权利要求42的核酸构建体，所述核酸构建体包含提供为SEQ IDNO：54的载体pPJV1671的序列，或者与之具有至少60％序列同一性的序列。
64.权利要求42的核酸构建体，所述核酸构建体包含提供为SEQ IDNo：59的载体pPML7789的序列，或者与之具有至少60％序列同一性的序列。
65.权利要求49的核酸构建体，所述核酸构建体包含由SEQ ID No：61提供的载体pPJV2012的序列，或者与之具有至少60％序列同一性的序列。
66.权利要求49的核酸构建体，所述核酸构建体包含由SEQ ID No：62提供的载体pPJV7788的序列，或者与之具有至少60％序列同一性的序列。
67.一种核酸构建体，包含启动子序列和与所述启动子有效连接的编码序列，其中所述编码序列编码流感病毒抗原、其免疫原性片段或与所述抗原或片段具有至少80％氨基酸同源性的所述抗原或片段的免疫原性变体，并且所述构建体还包含：
(a)非翻译前导序列，所述非翻译前导序列来源于HBV preS2抗原序列、HBV e-抗原序列或HSV型2gD抗原序列，与所述编码序列和对所述编码序列异源的启动子有效连接；和/或
(b)增强子序列，位于所述编码序列的3’端并与之有效连接，其中所述增强子序列来源于HBsAg序列的3′UTR或猿CMV立即早期基因序列的3′UTR，并且所述编码序列对所述3’增强子序列是异源的。
68.权利要求67的核酸构建体，其中所编码的抗原为流感病毒血凝素(HA)、其免疫原性片段或与两者具有至少80％氨基酸序列同源性的免疫原性变体。
69.权利要求67的核酸构建体，其中所编码的抗原为流感病毒神经氨酸酶(NA)或M2，两者的免疫原性片段或与所述NA、M2或片段具有至少80％氨基酸序列同源性的免疫原性变体。
70.权利要求67至69任一项的核酸构建体，其中所编码的流感病毒抗原、其免疫原性片段或两者的免疫原性变体来自流行性流感病毒毒株。
71.权利要求67至70任一项的核酸构建体，其中所述构建体编码一种以上流感病毒抗原、免疫原性片段或免疫原性变体。
72.权利要求71的核酸构建体，其中所述构建体编码流行性流感病毒毒株的抗原、其免疫原性片段或所述抗原或片段的免疫原性变体，并编码非流行性流感病毒毒株的一种或多种抗原、其一个或多个免疫原性片段或一个或多个所述抗原或一个或多个片段的一个或多个免疫原性变体。
73.权利要求71或72的核酸构建体，其中至少两种所述不同抗原、片段或变体来自不同流感病毒毒株的相同流感病毒多肽。
74.一种核酸构建体，包含启动子序列和与所述启动子有效连接的编码序列，其中所述编码序列编码ADP核糖基化细菌毒素亚基、其具有佐剂活性的片段或它们两者具有佐剂活性并与所述亚基或片段具有至少80％氨基酸序列同源性的变体，并且所述构建体还包含：
(a)非翻译前导序列，所述非翻译前导序列来源于HBV preS2抗原序列、HBV e-抗原序列或HSV型2gD抗原序列，与所述编码序列和对所述编码序列异源的启动子有效连接；和/或
(b)增强子序列，位于所述编码序列的3’端并与之有效连接，其中所述增强子序列来源于HBsAg序列的3′UTR或猿CMV立即早期基因序列的3′UTR，并且所述编码序列对所述3’增强子序列是异源的。
75.权利要求74的核酸构建体，其中所述ADP核糖基化细菌毒素亚基选自霍乱毒素亚基A、霍乱毒素亚基B、大肠杆菌不耐热毒素亚基A和大肠杆菌不耐热毒素亚基B。
76.权利要求74或75的核酸构建体，其中所述核酸构建体包含两个编码序列，所述每个编码序列包含不同的所述亚基、片段或变体，并且所述每个编码序列与所述嵌合启动子连接。
77.权利要求76的核酸构建体，其中所述两个编码序列分别编码霍乱毒素亚基A和霍乱毒素亚基B，或者分别编码大肠杆菌不耐热毒素亚基A和大肠杆菌不耐热毒素亚基B。
78.权利要求76或77的核酸构建体，其中所述两个编码序列方向相反。
79.权利要求76或77的核酸构建体，其中所述两个编码序列方向相同。
80.权利要求67至79任一项的核酸构建体，其中所述启动子选自所述hCMV立即早期启动子序列、伪狂犬病病毒启动子序列和劳氏肉瘤病毒启动子序列。
81.权利要求67至80任一项的核酸构建体，其中所述非翻译前导序列包含：
(i)核苷酸序列SEQ ID No 5、SEQ ID No：6、SEQ ID No：7或SEQ ID No.54的1864至1984位核苷酸；
(ii)(i)的功能变体，它具有与(i)至少80％的核苷酸序列同源性；或
(iii)(i)或(ii)的功能片段。
82.权利要求67至81任一项的核酸构建体，其中所述增强子序列包含：
(i)核苷酸序列SEQ ID No：8、SEQ ID No：9、SEQ ID No.54的3699至4231位核苷酸、SEQ ID No：61的3831至4363位核苷酸和/或SEQ ID No：62的4507至5038位核苷酸；
(ii)(i)的功能变体，它与一个所述序列(i)具有至少80％的核苷酸序列同源性；或
(iii)(i)或(ii)的功能片段。
83.权利要求42至82任一项的核酸构建体，所述核酸构建体还包含聚腺苷酸化序列。
84.权利要求83的核酸构建体，其中所述聚腺苷酸化序列为选自下列的基因的聚腺苷酸化序列：兔β-珠蛋白基因、人乳头状瘤病毒(HPV)早期或晚期基因、HSV-2gB基因、猿CMV立即早期基因和HSVgD晚期基因。
85.权利要求83的核酸构建体，其中所述聚腺苷酸化序列选自：
(i)核苷酸序列SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQID NO：13、SEQ ID No：54的4243至4373位核苷酸、SEQ ID No：61的906至1038位核苷酸、SEQ ID No：61的4375至4050位核苷酸或SEQ IDNo：62的2463至2593位核苷酸；
(ii)与一个所述序列(i)具有至少80％核苷酸序列同源性的功能变体；或
(iii)(i)或(ii)的功能片段。
86.权利要求42的核酸构建体，所述核酸构建体包含序列SEQ ID NO：14。
87.权利要求42至86任一项的核酸构建体，所述核酸构建体还包含编码信号肽的核苷酸序列，所述核苷酸序列与编码所述抗原、外毒素亚基、片段或变体的所述序列有效连接。
88.权利要求87的核酸构建体，其中所述信号肽选自人组织纤溶酶原激活剂信号肽(hTPAsp)、抑肽酶信号肽、烟草伸展蛋白信号肽和鸡溶菌酶信号肽。
89.权利要求42至88任一项的核酸构建体，所述核酸构建体为质粒。
90.一群核酸构建体，其中所述群体包含权利要求42至89任一项的至少两种不同的构建体。
91.一群核酸构建体，其中所述群体包含权利要求42至48、61至64和67至73任一项的至少两种不同的构建体，所述构建体编码不同的流感病毒抗原、其免疫原性片段或所述抗原或片段的免疫原性变体。
92.权利要求91的一群核酸构建体，所述群体包含至少三种不同的构建体，所述每种构建体编码不同的流感病毒抗原、免疫原性片段或免疫原性变体。
93.权利要求91或92的一群核酸构建体，其中至少两种所述不同的抗原来自不同流感病毒毒株的相同流感病毒多肽。
94.权利要求91至93任一项的一群核酸构建体，其中至少两种所述不同的抗原、片段或变体来自所述同一或不同的流感病毒毒株的不同流感病毒多肽。
95.权利要求90至94任一项的一群核酸构建体，所述群体包含权利要求49至54、65、66和74至79任一项的、编码所述ADP核糖基化细菌毒素亚基、其片段或其变体的至少一种构建体。
96.一群核酸构建体，其中：
(i)至少一种构建体编码ADP核糖基化细菌毒素亚基、其具有佐剂活性的片段或它们两者具有佐剂活性并与所述亚基或片段具有至少80％氨基酸同源性的变体；和
(ii)至少一种构建体编码单纯疱疹病毒(HSV)抗原；
其中编码所述亚基、片段或变体和/或HSV抗原的所述序列与嵌合启动子有效连接，所述嵌合启动子包含：
(a)hCMV立即早期启动子序列；
(b)所述hCMV主要立即早期基因的外显子1和至少一部分外显子2；和
(c)异源内含子，来置换所述hCMV主要立即早期基因的内含子A区域。
97.一群核酸构建体，其中：
(i)至少一种构建体编码ADP核糖基化细菌毒素亚基、其具有佐剂活性的片段或它们两者具有佐剂活性并与所述亚基或片段具有至少80％氨基酸同源性的变体；和
(ii)至少一种构建体编码HSV抗原，
其中至少一种所述构建体还包含：
(a)非翻译前导序列，所述非翻译前导序列来源于HBV preS2抗原序列、HBV e-抗原序列或HSV型2gD抗原序列，与所述构建体的所述编码序列和对所述编码序列异源的启动子有效连接；和/或
(b)增强子序列，位于所述构建体的所述编码序列的3’端并与之有效连接，其中所述增强子序列来源于HBsAg序列的3′UTR或猿CMV立即早期基因序列的3′UTR，并且所述编码序列对所述3’增强子序列是异源的。
98.一群核酸构建体，包含：
(i)第一种核酸构建体，包含嵌合启动子序列和与所述嵌合启动子有效连接的编码序列，其中所述编码序列编码ADP核糖基化细菌毒素亚基、其具有佐剂活性的片段或它们两者具有佐剂活性并与所述亚基或片段具有至少80％氨基酸同源性的变体，并且所述嵌合启动子序列包含：
(a)hCMV立即早期启动子序列；
(b)所述hCMV主要立即早期基因的外显子1和至少一部分外显子2；和
(c)异源内含子，来置换所述hCMV主要立即早期基因的内含子A区域；和
(ii)第二种核酸构建体，编码至少一种HSV抗原。
99.一群核酸构建体，包含：
(i)第一种核酸构建体，包含启动子序列和与所述启动子有效连接的编码序列，其中所述编码序列编码ADP核糖基化细菌毒素亚基、其具有佐剂活性的片段或它们两者具有佐剂活性并与所述亚基或片段具有至少80％氨基酸同源性的变体，并且所述构建体还包含：
(a)非翻译前导序列，所述非翻译前导序列来源于HBV preS2抗原序列、HBV e-抗原序列或HSV型2gD抗原序列，与所述编码序列和对所述编码序列异源的启动子有效连接；和/或
(b)增强子序列，位于所述编码序列的3’端并与之有效连接，其中所述增强子序列来源于HBsAg序列的3′UTR或猿CMV立即早期基因序列的3′UTR，并且所述编码序列对所述3’增强子序列是异源的；
(ii)第二种核酸构建体，编码至少一种HSV抗原。
100.权利要求99的一群核酸构建体，包含：
(i)第一种核酸构建体，所述核酸构建体包含由SEQ ID NO：61的载体pPJV2012的所述序列或与之具有至少60％序列同一性的序列；和
(ii)第二种核酸构建体，编码HSV抗原。
101.一种经纯化分离的嵌合启动子序列，其中所述嵌合启动子序列为权利要求42和55至57任一项所限定的嵌合启动子序列。
102.包被颗粒，所述包被颗粒包含包被有权利要求42至89任一项的核酸构建体或者权利要求90至100任一项的一群核酸构建体的载体颗粒。
103.权利要求102的包被颗粒，其中所述载体颗粒为金颗粒。
104.一种用于颗粒介导的送递装置的剂量容器，包含权利要求102或103所限定的包被颗粒。
105.一种颗粒介导的送递装置，负载有权利要求102或103所限定的包被颗粒。
106.权利要求105的颗粒介导的送递装置，所述颗粒介导的送递装置为无针注射器。
107.一种药物组合物，包含权利要求42至89任一项的核酸构建体或权利要求90至100任一项的一群核酸构建体以及可药用载体或赋形剂。
108.一种疫苗组合物，包含权利要求42至89任一项的核酸构建体或权利要求90至100任一项的一群核酸构建体。
109.权利要求108的疫苗组合物，所述疫苗组合物为多价疫苗，包含权利要求42至48、61至64以及67至73任一项的至少两种不同构建体，所述构建体编码不同的流感病毒抗原、其免疫原性片段或它们两者的免疫原性变体。
110.权利要求109的疫苗组合物，所述疫苗组合物为三价、四价或五价流感疫苗。
111.权利要求42至89任一项所限定的核酸构建体、权利要求90至95任一项所限定的一群核酸构建体或权利要求102或103所限定的包被颗粒在制备用于预防流感的药剂中的用途。
112.权利要求111的用途，其中所述药剂将通过注射、经皮颗粒送递、吸入、局部给药、口服、鼻内给药或经粘膜给药送递。
113.权利要求111或112的用途，其中所述药剂将通过无针注射送递。
114.一种在体外获得所研究流感病毒多肽在哺乳动物细胞中表达的方法，所述方法包括将权利要求42至89任一项所述的核酸构建体、权利要求90至95任一项所述的一群核酸构建体或权利要求102或103所述的包被颗粒转移至所述细胞中。
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|---|---|---|---|
| US60/648,382 | 2005-02-01 | ||
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