HK1114405B - 生产胶原的植物及其生成和使用方法 - Google Patents
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Description
发明领域和背景
本发明涉及生产胶原的植物及其生成和使用方法。更具体而言，本发明涉及用于生成能够生产高水平羟基化胶原链的植物的新方法，所述胶原链能够形成天然的三股螺旋I型胶原纤维。
胶原是负责脊椎动物和许多其他多细胞生物的结构完整性的主要结构蛋白。I型胶原代表原型的纤维胶原，并且是大多数组织中的主要胶原类型。
I型胶原是骨和腱中占优势的胶原组分，并且大量发现于皮肤、主动脉和肺中。I型胶原纤维提供极大的抗张强度和有限的伸长性。I型胶原的最丰富的分子形式是由2种不同的α链[α1(I)]2和α2(I)组成的异源三聚体(Inkinen，2003)。所有纤维胶原分子都包含由重复的Gly-X-Y三联体构建的3种多肽链，其中X和Y可以是任何氨基酸，但通常是亚氨基酸脯氨酸和羟脯氨酸。
形成原纤维的胶原作为包含球状N-和C-末端延伸前肽的前体前胶原而合成。前胶原的生物合成是牵涉多种不同的翻译后修饰的复杂过程，所述翻译后修饰包括脯氨酸和赖氨酸羟基化、N-连接的和O-连接的糖基化以及链内和链间二硫键的形成。执行这些修饰的酶以协同的方式起作用以确保正确排列和热稳定的三股螺旋分子的折叠和装配。
每种前胶原分子由3种多肽链组成成分在粗面内质网内装配。因为多肽链共翻译地穿过内质网膜移位(translocate)，所以脯氨酸和赖氨酸残基的羟基化发生在Gly-X-Y重复区域内。一旦多肽链完全移位到内质网腔内，C-前肽就折叠。3种前-α链随后经由其C-前肽结合以形成三聚体分子，从而允许Gly-X-Y重复区域在其C-末端形成成核点，确保链的正确排列。Gly-X-Y区域随后在C-至-N方向折叠以形成三股螺旋。
多肽链修饰和三股螺旋形成之间的时间关系是关键的，因为脯氨酸残基的羟基化是确保三股螺旋在体温下的稳定性必需的，一旦形成，三股螺旋就不再充当羟基化酶的底物。C-前肽(以及较少程度上的N-前肽)在前胶原通过细胞的过程中保持前胶原可溶(Bulleid等人，2000)。在前胶原分子分泌进入细胞外基质后或在这个过程中，通过前胶原N-和C-蛋白酶去除前肽，从而触发胶原分子自发地自身装配为原纤维(Hulmes，2002)。通过前胶原N-和C-蛋白酶去除前肽使前胶原的溶解性降低了＞10000倍，并且是发动胶原自身装配成纤维所必需和充分的。对这个装配过程关键的是在三股螺旋结构域末端被称为端肽的短的非三股螺旋肽，它确保原纤维结构内的胶原分子的正确记录，并降低自身装配的临界浓度(Bulleid等人，2000)。在自然中，胶原的三股螺旋结构的稳定性需要由脯氨酰-4-羟化酶(P4H)对脯氨酸的羟基化，以在胶原链内形成羟脯氨酸残基。
表达胶原链的植物是本领域已知的，参见例如，美国专利号6,617,431和(Merle等人，2002，Ruggiero等人，2000)。尽管植物能够合成包含羟脯氨酸的蛋白质，但与哺乳动物P4H相比，负责在植物细胞中合成羟脯氨酸的脯氨酰羟化酶显示出相对宽松的底物序列特异性，并因此只在Gly-X-Y三联体的Y位置包含羟脯氨酸的胶原生产需要植物共表达胶原和P4H基因(Olsen等人，2003)。
生产依赖于植物中天然存在的羟基化机制的人胶原的尝试得到了在脯氨酸羟基化方面弱的胶原(Merle等人，2002)。这种胶原在低于30℃的温度下熔解或失去其三股螺旋结构。胶原和脯氨酰-羟化酶的共表达产生稳定羟基化的胶原，它在生物学上与体温时的应用相关(Merle等人，2002)。
赖氨酰羟化酶(LH，EC 1.14.11.4)、半乳糖基转移酶(EC2.4.1.50)和葡糖基转移酶(EC 2.4.1.66)是在胶原翻译后修饰中牵涉的酶。它们序贯地将特定位置中的赖氨酰残基修饰为羟赖氨酰、半乳糖基羟赖氨酰和葡糖基半乳糖基羟赖氨酰残基。这些结构是胶原特有的并且是其功能活性必需的(Wang等人，2002)。单独的人的酶，赖氨酰羟化酶3(LH3)可以催化羟赖氨酸连接的碳水化合物形成中的所有3个连续步骤(Wang等人，2002)。
烟草中表达的人胶原的羟赖氨酸形成少于2％的在牛胶原中发现的羟赖氨酸(0.04％残基/1.88％残基)。这提示植物内源性的赖氨酰羟化酶不能充分地使胶原中的赖氨酸羟基化。
在将本发明变为实践的同时，本发明人揭示了胶原链的有效羟基化依赖于胶原链连同能够正确修饰这种多肽的酶的隔离。
发明概述
根据本发明的一个方面，提供了在植物或被分离的植物细胞中生产胶原的方法，其包括在植物或被分离的植物细胞中，以能够使至少一种类型的胶原α链和外源性P4H积聚在缺乏内源性P4H活性的亚细胞区室中的方式，表达至少一种类型的胶原α链和外源性P4H，从而在植物中生产胶原。
根据本发明的一个另外的方面，提供了
根据下文描述的本发明的优选实施方案中进一步的特征，该方法进一步包括在缺乏内源性P4H活性的亚细胞区室中表达外源性LH3。
根据所述优选实施方案中再进一步的特征，至少一种类型的胶原α链包括用于靶向质外体或液泡的信号肽。
根据所述优选实施方案中再进一步的特征，至少一种类型的胶原α链缺乏ER靶向序列或保留序列。
根据所述优选实施方案中再进一步的特征，至少一种类型的胶原α链表达于包含DNA的植物细胞器中。
根据所述优选实施方案中再进一步的特征，外源性P4H包括用于靶向质外体或液泡的信号肽。
根据所述优选实施方案中再进一步的特征，外源性P4H缺乏ER靶向序列或保留序列。
根据所述优选实施方案中再进一步的特征，外源性P4H表达于包含DNA的植物细胞器中。
根据所述优选实施方案中再进一步的特征，至少一种类型的胶原α链是α1链。
根据所述优选实施方案中再进一步的特征，至少一种类型的胶原α链是α2链。
根据所述优选实施方案中再进一步的特征，至少一种类型的胶原α链包括C-末端和/或N-末端前肽。
根据所述优选实施方案中再进一步的特征，植物选自烟草、玉米、苜蓿、稻、马铃薯、大豆、番茄、小麦、大麦、低芥酸菜子(Canola)和棉花。
根据所述优选实施方案中再进一步的特征，至少一种类型的胶原α链或外源性P4H只在植物的部分中表达。
根据所述优选实施方案中再进一步的特征，植物的部分是叶、种子、根、块茎或茎。
根据所述优选实施方案中再进一步的特征，外源性P4H能够使至少一种类型的胶原α链的Gly-X-Y三联体的Y位置特异性羟基化。
根据所述优选实施方案中再进一步的特征，外源性P4H是人P4H。
根据所述优选实施方案中再进一步的特征，对植物实施应激条件。
根据所述优选实施方案中再进一步的特征，应激条件选自干旱、盐度、损伤、寒冷和喷射应激诱导化合物。
根据本发明的另一方面，提供了基因修饰植物或被分离的植物细胞，其能够积聚具有羟基化模式的胶原α链，所述羟基化模式与当胶原α链表达于人细胞中时产生的模式相同。
根据本发明的再一方面，提供了基因修饰植物或被分离的植物细胞，其能够在缺乏内源性P4H活性的亚细胞区室中积聚胶原α链。
根据所述优选实施方案中再进一步的特征，基因修饰植物进一步包括外源性P4H。
根据所述优选实施方案中再进一步的特征，至少一种类型的胶原α链包括用于靶向质外体或液泡的信号肽。
根据所述优选实施方案中再进一步的特征，至少一种类型的胶原α链缺乏ER靶向序列或保留序列。
根据所述优选实施方案中再进一步的特征，至少一种类型的胶原α链表达于包含DNA的植物细胞器中。
根据所述优选实施方案中再进一步的特征，外源性P4H包括用于靶向质外体或液泡的信号肽。
根据所述优选实施方案中再进一步的特征，外源性P4H缺乏ER靶向序列或保留序列。
根据所述优选实施方案中再进一步的特征，外源性P4H表达于包含DNA的植物细胞器中。
根据所述优选实施方案中再进一步的特征，胶原α链是α1链。
根据所述优选实施方案中再进一步的特征，胶原α链是α2链。
根据所述优选实施方案中再进一步的特征，胶原α链包括C-末端和/或N-末端前肽。
根据本发明的再一方面，提供了植物系统，其包括能够积聚胶原α1链的第一种基因修饰植物，和能够积聚胶原α2链的第二种基因修饰植物。
根据本发明的再一方面，提供了植物系统，其包括能够积聚胶原α1链和胶原α2链的第一种基因修饰植物，以及能够积聚P4H的第二种基因修饰植物。
根据所述优选实施方案中再进一步的特征，第一种基因修饰植物和第二种基因修饰植物中的至少一种进一步包括外源性P4H。
根据本发明的再一方面，提供了生产纤维胶原的方法，其包括：(a)在第一种植物中表达胶原α1链；(b)在第二种植物中表达胶原α2链；其中在第一种植物和第二种植物中的表达被这样设置，从而使得胶原α1链和胶原α2链各自能够在缺乏内源性P4H活性的亚细胞区室中积聚；和(c)使第一种植物与第二种植物杂交，并选择表达胶原α1链和胶原α2链的后代，从而生产纤维胶原。
根据所述优选实施方案中再进一步的特征，该方法进一步包括在第一种植物和第二种植物的每一种中表达外源性P4H。
根据所述优选实施方案中再进一步的特征，胶原α1链和胶原α2链中的每一种包括用于靶向质外体或液泡的信号肽。
根据所述优选实施方案中再进一步的特征，胶原α1链和胶原α2链中的每一种缺乏ER靶向序列或保留序列。
根据所述优选实施方案中再进一步的特征，步骤(a)和(b)经由在包含DNA的植物细胞器中的表达来实现。
根据所述优选实施方案中再进一步的特征，外源性P4H包括用于靶向质外体或液泡的信号肽。
根据所述优选实施方案中再进一步的特征，外源性P4H缺乏ER靶向序列或保留序列。
根据所述优选实施方案中再进一步的特征，外源性P4H表达于包含DNA的植物细胞器中。
根据所述优选实施方案中再进一步的特征，胶原α1链和胶原α2链中的每一种包括C-末端和/或N-末端前肽。
根据所述优选实施方案中再进一步的特征，外源性P4H能够使至少一种类型的胶原α链的Gly-X-Y三联体的Y位置特异性羟基化。
根据所述优选实施方案中再进一步的特征，外源性P4H是人P4H。
根据所述优选实施方案中再进一步的特征，对第一种植物和第二种植物实施应激条件。
根据所述优选实施方案中再进一步的特征，应激条件选自干旱、盐度、损伤、重金属毒性和寒冷应激。
根据本发明的再一方面，提供了生产纤维胶原的方法，其包括：(a)在第一种植物中表达胶原α1链和胶原α2链，其中在第一种植物中的表达被这样设置，从而使得胶原α1链和胶原α2链各自能够在缺乏内源性P4H活性的亚细胞区室中积聚；(b)在第二种植物中表达外源性P4H，其能够在缺乏内源性P4H活性的亚细胞区室中积聚；和(c)使第一种植物与第二种植物杂交，并选择表达胶原α1链、胶原α2链和P4H的后代，从而生产纤维胶原。
根据本发明的再一方面，提供了核酸构建体，其包括置于在植物细胞中起作用的启动子的转录控制下、编码人P4H的多核苷酸。
根据所述优选实施方案中再进一步的特征，启动子选自CaMV 35S启动子、遍在蛋白启动子、rbcS启动子和SVBV启动子。
根据本发明的再一方面，提供了基因修饰植物或被分离的植物细胞，其能够表达胶原α1链、胶原α2链、P4H、LH3和蛋白酶C和/或蛋白酶N。
根据所述优选实施方案中再进一步的特征，胶原α1链和胶原α2链各自能够在缺乏内源性植物P4H活性的亚细胞区室中积聚。
根据本发明的再一方面，提供了基因修饰植物或被分离的植物细胞，其能够积聚具有温度稳定性特征的胶原，所述温度稳定性特征与哺乳动物胶原的特征相同。
根据所述优选实施方案中再进一步的特征，胶原是I型胶原。
根据所述优选实施方案中再进一步的特征，哺乳动物胶原是人胶原。
根据本发明的再一方面，提供了对于在植物中的表达进行最优化的胶原编码序列。
根据所述优选实施方案中再进一步的特征，胶原编码序列为由SEQ ID NO：1所阐明的。
本发明通过提供能够表达正确羟基化的胶原链成功地解决了目前已知构造的缺点，所述胶原链能够装配为具有与人胶原类似特性的胶原。
除非另外定义，本文所使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域普通技术人员通常理解相同的含义。尽管与本文所述那些相似或等同的方法和材料可以用于本发明的实践或测试中，但下文还是描述了适当的方法和材料。在冲突的情况下，以本专利说明书包括定义为准。此外，材料、方法和实施例仅是举例说明的，并不预期是限制性的。
附图简述
本发明在此处仅通过例子参考附图进行描述。现在特别详细地参考附图，要强调的是所显示的细节通过例子来进行并且仅用于本发明优选实施方案的举例说明性讨论的目的，并且为了提供被认为是本发明的原理和概念方面最有用和易于理解的描述而呈现。在这点上，不试图显示比基本理解本发明所需细节更多的本发明的结构细节，附图采用的描述使得本发明的几种形式如何能够在实践中体现对于本领域技术人员是显而易见的。
在附图中：
图1a-d举例说明了用于转化测试植物的各种表达盒和载体的构建。作为本研究的部分合成的所有编码序列对于烟草中的表达是最优化的。
图2举例说明了各种共转化方法。每种表达盒由编码序列的短名表示。编码序列在表1中详细说明。每个共转化通过2个pBINPLUS二元载体来进行。每个长方形表示携带1、2或3个表达盒的单个pBINPLUS载体。启动子和终止子在实施例1中详细说明。
图3是转化体的多重PCR筛选，显示出对于胶原α1链(324bp片段)或胶原α2链(537bp片段)或二者阳性的植物。
图4是由共转化2、3和4产生的转基因植物的蛋白质印迹分析。
从烟草共转化体#2、#3和#4中提取总可溶性蛋白，并用抗-胶原I抗体(来自Chemicon Inc.的#AB745)进行检测。大小标记是来自Fermentas Inc.的#SM0671。W.T.是野生型烟草。阳性胶原条带在对于I型胶原α1或α2或二者为PCR阳性的植物中可见。来自人胎盘的500ng I型胶原(来自Chemicon Inc.的#CC050，通过胃蛋白酶消化从人胎盘中提取)的阳性对照条带代表来自转基因植物的样品中的约0.3％总可溶性蛋白(约150μg)。如通过I型胶原抗体的抗羧基末端前肽(来自Chemicon Inc.的#MAB1913)所检测的，在人胶原样品中约140kDa的较大条带是含有其C-前肽的前胶原。在人胶原样品中约120kDa的较小条带是不含前肽的胶原。由于其罕见的组成，富含脯氨酸的蛋白质(包括胶原)作为具有高于预期的分子量的条带在聚丙烯酰胺凝胶上一致迁移。因此，分子量约95kDa、不含前肽的胶原链作为约120kDa的条带迁移。
图5是由共转化#8(携带与胶原链翻译地融合的质外体(appoplast)信号)产生的转基因植物的蛋白质印迹分析。从转基因烟草叶中提取总可溶性蛋白，并用抗-胶原I抗体(来自Chemicon Inc.的#AB745)进行检测。阳性胶原α2条带在植物8-141中可见。来自人胎盘的I型胶原(来自Chemicon Inc.的#CC050)充当对照。
图6a-b举例说明根据热处理和胰蛋白酶或胃蛋白酶消化证实的胶原三股螺旋装配和热稳定性，在图6a中-对来自烟草2-9(只表达胶原α1且不表达P4H)和3-5(表达胶原α1+2以及人P4H α和β亚基)的总可溶性蛋白实施热处理(38℃或43℃15分钟)，随后为胰蛋白酶消化(室温20分钟)，并用抗-胶原I抗体在蛋白质印迹方法中进行检测。阳性对照是500ng人胶原I样品+野生型烟草的总可溶性蛋白。在图6b中-从转基因烟草13-6(表达胶原Iα1和α2链-由箭标指出，人P4Hα和β亚基以及人LH3)提取总可溶性蛋白，并实施热处理(33℃、38℃或42℃20分钟)，立即在冰上冷却以防止三股螺旋重新装配，并于室温(约22℃)与胃蛋白酶一起温育30分钟，随后在标准蛋白质印迹方法中用抗-胶原I抗体(来自Chemicon Inc.的#AB745)进行检测。阳性对照是～50ng人胶原I样品(来自Chemicon Inc.的#CC050，通过胃蛋白酶消化从人胎盘中提取)，将其加到从野生型烟草中提取的总可溶性蛋白中。
图7举例说明了对野生型烟草进行的RNA印迹分析。印迹用烟草P4HcDNA进行探测。
图8是由共转化2、3和13产生的转基因植物的蛋白质印迹分析。从烟草共转化体提取总可溶性蛋白，并用抗人P4Hα和β以及抗胶原I抗体进行检测。
优选实施方案的描述
本发明是关于表达并积聚胶原的植物，所述植物可用于生产显示哺乳动物胶原特征的胶原和胶原纤维。
参考附图和附加的描述可以更好地理解本发明的原理和操作。
在详细解释本发明的至少一个实施方案之前，应当理解本发明在其应用方面不局限于下文描述中阐明或由实施例示例的细节。本发明能够是其他实施方案、或以各种方式加以实践或执行。同样，应当理解本文所采用的措辞和术语是用于描述的目的且不应被视为限制。
生产胶原的植物是本领域已知的。尽管此类植物可以用于生产胶原链以及胶原，但此类链是不正确地羟基化的，并因此无论是在植物中还是不在植物中，其自身的装配导致内在不稳定的胶原。
在将本发明变为实践的同时，本发明人设计了植物表达方法，它确保胶原链的正确羟基化并因此使得能够在植物中生产胶原，所述胶原紧密地模仿人I型胶原的特征(例如，温度稳定性)。
因此，根据本发明的一个方面，提供了基因修饰植物，它能够表达至少一种类型的胶原α链，并将其积聚在缺乏内源性P4H活性的亚细胞区室中。
如本文所使用的，短语“基因修饰植物”指任何低等(例如藓类)或高等(维管)植物或组织或其被分离的细胞(例如细胞悬浮液)，它用外源性多核苷酸序列稳定或瞬时转化。植物的例子包括烟草、玉米、苜蓿、稻、马铃薯、大豆、番茄、小麦、大麦、低芥酸菜子、棉花、胡萝卜以及低等植物例如藓类。
如本文所使用的，短语“胶原链”指胶原亚基，例如胶原纤维的α1或2链，优选I型纤维。如本文所使用的，短语“胶原”指被装配的胶原三聚体，在I型胶原的情况下它包括2个α1链和1个α2链。胶原纤维是缺乏末端前肽C和N的胶原。
如本文所使用的，短语“缺乏内源性P4H活性的亚细胞区室”指细胞的任何被区室化的区域，它不包括植物P4H或具有植物样P4H活性的酶。此类亚细胞区室的例子包括液泡、质外体和细胞质，以及细胞器例如叶绿体、线粒体等。
任何类型的胶原链都可以由本发明的基因修饰植物表达。例子包括形成原纤维的胶原(I、II、III、V和XI型)、形成网络的胶原(IV、VIII和X型)、与原纤维表面结合的胶原(IX、XII和XIV型)、作为跨膜蛋白存在的胶原(XIII和XVII型)、或形成11nm周期性珠状丝的胶原(VI型)。关于进一步的描述请参见Hulmes，2002。
优选地，表达的胶原链是I型胶原α1和/2链。表达的胶原α链可以由来源于任何哺乳动物的任何多核苷酸序列编码。优选地，编码胶原α链的序列是人的并且由SEQ ID NO：1和4阐明。
一般地，在植物中表达的α胶原链可以包括或不包括其末端前肽(即前肽C和前肽N)。
Ruggiero等人(2000)指出前胶原经由植物蛋白水解活性的处理不同于在人中的正常处理，并且前肽C通过植物蛋白水解活性去除，尽管切割位点不明。前肽C的切割可以在三聚体装配之前(3种C-前肽的结合是发动三聚体装配所必需的)发生在前胶原肽上。
经由植物蛋白水解活性的N-前肽切割发生在成熟植物中而不发生在小植物中。此类切割去除来自N端肽的2个氨基酸(17个中的2个)。
C-前肽(以及较少程度上的N-前肽)在前胶原通过动物细胞的过程中保持前胶原可溶(Bulleid等人，2000)，并且预期在植物细胞中有类似作用。在前胶原分子分泌进入细胞外基质后或在这个过程中，通过前胶原N-和C-蛋白酶去除前肽，从而触发胶原分子自发地自身装配为原纤维(Hulmes，2002)。通过前胶原N-和C-蛋白酶去除前肽使前胶原的溶解性降低了＞10000倍，并且是发动胶原自身装配成纤维所必需和充分的。对这个装配过程关键的是在三股螺旋结构域末端被称为端肽的短的非三股螺旋肽，它确保原纤维结构内的胶原分子的正确记录，并降低自身装配的临界浓度(Bulleid等人，2000)。现有技术描述了在胶原生产过程中利用胃蛋白酶切割前肽(Bulleid等人2000)。然而胃蛋白酶破坏端肽，并且因此，胃蛋白酶提取的胶原不能形成有序的原纤维结构(Bulleid等人2000)。
形成人P4Hβ亚基的蛋白质二硫键异构酶(PDI)显示在三聚体装配之前与C-前肽结合，因此在链的装配过程中还充当分子侣伴(Ruggiero等人，2000)。在不同植物中表达的人前胶原I N-蛋白酶和前胶原C-蛋白酶的使用可以产生更类似于天然的人胶原的胶原，并且可以形成有序的原纤维结构。
在其中N或C前肽或二者包括在表达的胶原链中的情况下，本发明的基因修饰植物还可表达分别的蛋白酶(即，C或N或二者)。编码此类蛋白酶的多核苷酸序列由SEQ ID NO：18(蛋白酶C)和20(蛋白酶N)示例。此类蛋白酶可以被这样表达，从而使得它们在与胶原链相同的亚细胞区室中积聚。
表达的胶原链在缺乏内源性P4H活性的亚细胞区室中的积聚可以经由几种方法中的任何一种来实现。
例如，表达的胶原链可以包括用于将表达的蛋白靶向亚细胞区室例如质外体或细胞器(例如叶绿体)的信号序列。适当的信号序列的例子包括叶绿体转运肽(包括在Swiss-Prot的登录号P07689中，氨基酸1-57)和线粒体转运肽(包括在Swiss-Prot的登录号P46643中，氨基酸1-28)。下文实施例部分提供了适当的信号序列的另外例子以及关于在植物细胞的胶原链表达中采用此类信号序列的指导方针。
可替代地，当在植物中表达时，胶原链的序列可以以改变胶原细胞定位的方式进行修饰。
如上文所提及的，植物的ER包括不能使胶原链正确羟基化的P4H。胶原α链天然地包括ER靶向序列，它指导表达的胶原进入ER，在其中它被翻译后修饰(包括不正确的羟基化)。因此，ER靶向序列的去除将导致缺乏翻译后修饰(包括任何羟基化)的胶原链的细胞质积聚。
下文实施例部分的实施例1描述了缺乏ER序列的胶原序列的生产。
再可替代地，胶原链可以被表达并积聚在包含DNA的细胞器例如叶绿体或线粒体中。叶绿体表达的进一步描述在下文中提供。
如上文所提及的，α链的羟基化是稳定的I型胶原装配所必需的。因为通过本发明基因修饰植物表达的α链积聚在缺乏内源性P4H活性的区室内，所以必须从植物、植物组织或细胞中分离此类链并在体外进行羟基化。此类羟基化可以通过Turpeenniemi-Hujanen和Myllyla(Concomitant hydroxylation 0f proline and lysine residues in collagenusing purified enzymes in vitro.Biochim Biophys Acta.1984Jul 16；800(l)：59-65)所述方法实现。
尽管此类体外羟基化可以产生正确羟基化的胶原链，但它的实现是困难且代价高的。
为了克服体外羟基化的局限，本发明的基因修饰植物优选还共表达P4H，它能使胶原α链正确羟基化[即只在Gly-X-Y三联体的脯氨酸(Y)位置上羟基化]。P4H是由2个亚基α和β组成的酶。二者都是形成活性酶所必需的，而β亚基还具有侣伴功能。
通过本发明的基因修饰植物表达的P4H优选是人P4H，它由例如SEQ ID NO：12和14编码。此外，还可使用显示增强的底物特异性的P4H突变体或P4H同源物。
适当的P4H同源物由NCBI编号NP_179363鉴定的鼠耳芥属(Arabidopsis)氧化还原酶示例。由本发明人进行的这种蛋白质序列和人P4Hα亚基的逐对比对揭示了任何已知的植物P4H同源物的功能结构域之间的最高同源性。
因为P4H需要与表达的胶原链共积聚，所以其编码序列优选相应地进行修饰(加入信号序列、可能阻止ER靶向的缺失，等等)。
在哺乳动物细胞中，胶原还通过赖氨酰羟化酶、半乳糖基转移酶和葡糖基转移酶进行修饰。这些酶序贯地将特定位置的赖氨酰残基修饰为羟赖氨酰、半乳糖基羟赖氨酰和葡糖基半乳糖基羟赖氨酰残基。单独的人的酶，赖氨酰羟化酶3(LH3)可以催化羟赖氨酸连接的碳水化合物形成中的所有3个连续步骤。
因此，本发明的基因修饰植物还优选表达哺乳动物LH3。编码LH3的序列例如SEQ ID NO：22所阐明的那些可以用于此类用途。
上文描述的胶原链和修饰酶可以由稳定整合或瞬时表达的核酸构建体进行表达，所述核酸构建体包括编码α链和/或修饰酶(例如P4H和LH3)、置于植物功能启动子的转录控制下的多核苷酸序列。此类核酸构建体(它在本文中也被称为表达构建体)可以被设置为在遍及完整植物、限定的植物组织或限定的植物细胞、或在植物的限定发育阶段进行表达。此类构建体还可包括选择标记(例如抗生素抗性)、增强子元件和用于细菌复制的复制起点。
应当理解包括2种可表达的插入片段(例如2个α链类型、或α链和P4H)的构建体优选包括适合于每种插入片段的单独启动子，或可替代地，此类构建体可以表达包括来自单个启动子的2个插入序列的单个转录物嵌合体。在这种情况下，嵌合转录物包括在2个插入序列之间的IRES序列，从而使得下游插入片段可以从那里被翻译。
本发明的构建体可以采用众多植物功能表达启动子和增强子，它们可以是组织特异性、发育特异性、组成型或诱导型的，下文提供了一些例子。
如本说明书此处和随后的权利要求部分所使用的，短语“植物启动子”或“启动子”包括可以指导植物细胞(包括包含DNA的细胞器)中的基因表达的启动子。此类启动子可以来源于植物、细菌、病毒、真菌或动物来源。此类启动子可以是组成型的，即能够指导在多个植物组织中的高水平基因表达，组织特异性的，即能够指导在一种或多种特定植物组织中的基因表达，诱导型的，即能够在刺激下指导基因表达，或嵌合的，即由至少2个不同的启动子部分形成。
因此，所使用的植物启动子可以是组成型启动子、组织特异性启动子、诱导型启动子或嵌合启动子。
组成型植物启动子的例子包括，但不限于，CaMV35S和CaMV19S启动子、FMV34S启动子、甘蔗杆状病毒(sugarcane bacilliformbadnavirus)启动子、CsVMV启动子、鼠耳芥ACT2/ACT8肌动蛋白启动子、鼠耳芥遍在蛋白UBQ1启动子、大麦叶硫素BTH6启动子和稻肌动蛋白启动子。
组织特异性启动子的例子包括，但不限于，豆菜豆蛋白贮存蛋白启动子、DLEC启动子、PHS启动子、玉米醇溶蛋白贮存蛋白启动子、来自大豆的羽扇豆球蛋白γ启动子、AT2S1基因启动子、来自鼠耳芥的ACT11肌动蛋白启动子、来自欧洲油菜(Brassica napus)的napA启动子和马铃薯patatin基因启动子。
诱导型启动子是由特异性的刺激例如应激条件(包括例如光、温度、化学制剂、干旱、高盐度、渗透压休克)、氧化剂条件或在致病性的情况下诱导的启动子，并且包括，但不限于，来源于豌豆rbcS基因的光诱导型启动子，来自苜蓿rbcS基因的启动子，在干旱时活化的启动子DRE、MYC和MYB；在高盐度和渗透压应激下活化的启动子INT、INPS、prxEa、Ha hsp17.7G4和RD21，以及在致病性应激下活化的启动子hsr203J和str246C。
优选地，本发明使用的启动子是强组成型启动子，从而使得构建体插入片段的超表达在植物转化后实现。
应当理解，本发明所使用的任何构建体类型都可以利用每种构建体类型中相同或不同的选择标记共转化到相同的植物中。可替代地，第一种构建体类型可以导入第一种植物中，而第二种构建体类型可以导入第二种等基因植物中，之后由此产生的转基因植物可以进行杂交并选择双重转化体的后代。此类后代的进一步自交可以用于产生2种构建体的纯合系。
存在将核酸构建体导入单子叶植物和双子叶植物的各种方法(Potrykus，I.，Annu.Rev.Plant.Physiol.，Plant.Mol.Biol.(1991)42：205-225；Shimamoto等人，Nature(1989)338：274-276)。此类方法依赖于核酸构建体或其部分稳定整合到植物基因组中，或在其中这些序列不由植物后代遗传的情况下依赖于核酸构建体的瞬时表达。
此外，存在可以将核酸构建体直接导入包含DNA的细胞器例如叶绿体的DNA中的几种方法。
存在实现外源序列例如包括在本发明的核酸构建体内的那些稳定地基因组整合到植物基因组中的2种基本方法：
(i)土壤杆菌属(Agrobaclerium)-介导的基因转移：Klee等人(1987)Annu.Rev.Plant Physiol.38：467-486；Klee和Rogers，CellCulture and Somatic Cell Genetics of Plants，第6卷，MolecularBiology of Plant Nuclear Genes，eds.Schell，J.，和Vasil，L.K.，Academic Publishers，San Diego，Calif.(1989)第2-25页；Gatenby，Plant Biotechnology，eds.Kung，S.和Arntzen，C.J.，ButterworthPublishers，Boston，Mass.(1989)第93-112页。
(ii)DNA直接摄取：Paszkowski等人，Cell Culture and SomaticCell Genetics of Plants，第6卷，Molecular Biology of Plant NuclearGenes eds.Schell，J.，和Vasil，L.K.，Academic Publishers，San Diego，Calif.(1989)第52-68页；包括用于将DNA直接摄入原生质体中的方法，Toriyama，K.等人(1988)Bio/Technology 6：1072-1074。通过植物细胞短暂电休克诱导的DNA摄取：Zhang等人Plant Cell Rep.(1988)7：379-384.Fromm等人Nature(1986)319：791-793。通过粒子轰击，Klein等人Bio/Technology(1988)6：559-563；McCabe等人Bio/Technology(1988)6：923-926；Sanford，Physiol.Plant.(1990)79：206-209；通过使用微量移液管系统，Neuhaus等人，Theor.Appl.Genet.(1987)75：30-36；Neuhaus和Spangenberg，Physiol.Plant.(1990)79：213-217；或通过将DNA与发芽的花粉直接温育，DeWet等人Experimental Manipulation of Ovule Tissue，eds.Chapman，G.P.和Mantell，S.H.和Daniels，W.Longman，London，(1985)第197-209页；和Ohta，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1986)83：715-719，将DNA注射到植物细胞或组织中。
土壤杆菌属系统包括质粒载体的使用，所述质粒载体包含整合到植物基因组DNA中的限定的DNA片段。植物组织的接种方法依赖于植物物种和土壤杆菌属送递系统而变。广泛使用的方法是叶盘法，它可以由任何组织外植体来进行，所述外植体提供用于发动整个植物分化的良好来源。Horsch等人Plant Molecular Biology Manual A5，Kluwer Academic Publishers，Dordrecht(1988)第1-9页。补充方法采用与真空渗透组合的土壤杆菌属送递系统。土壤杆菌属系统在转基因双子叶植物的制备中尤其可行。
存在直接将DNA转移到植物细胞中的各种方法。在电穿孔中，使原生质体短暂地暴露在强电场中。在显微注射中，利用极小的微量移液管将DNA机械地直接注射到细胞中。在微粒轰击中，DNA吸附在微粒例如硫酸镁晶体、钨颗粒或金颗粒上，并且微粒物理加速进入细胞或植物组织中。
转化后进行植物繁殖。最常见的植物繁殖法是通过种子。然而通过种子繁殖的再生具有由于杂合性而在农作物中缺少一致性的缺陷，因为根据孟德尔定律决定的遗传变异，种子通过植物产生。基本上，每个种子在遗传上不同并且每个将伴随其自身的特殊性状生长。因此，优选被转化的植物被这样生产，从而使得再生的植物具有与亲本转基因植物相同的性状和特征。因此，优选被转化的植物通过微繁殖(micropropagation)进行再生，所述微繁殖提供被转化植物的快速、一致的生殖。
可以用于瞬时表达包括在本发明的核酸构建体内的被分离核酸的瞬时表达法包括，但不限于，如上所述的显微注射和轰击，但在有利于瞬时表达的条件下，和病毒介导的表达，其中包括核酸构建体的被包装或未包装的重组病毒载体用于感染植物组织或细胞，从而使得其中确立的繁殖的重组病毒表达非病毒的核酸序列。
已显示对于植物宿主转化有用的病毒包括CaMV、TMV和BV。利用植物病毒的植物转化描述于美国专利号4,855,237(BGV)、EP-A67,553(TMV)、日本公开申请号63-14693(TMV)、EPA 194,809(BV)、EPA 278,667(BV)；和Gluzman，Y.等人，Communications in MolecularBiology：Viral Vectors，Cold Spring Harbor Laboratory，New York，pp.172-189(1988)中。用于在多种宿主包括植物中表达外来DNA的假病毒颗粒描述于WO 87/06261中。
用于在植物中导入和表达非病毒性外源核酸序列的植物RNA病毒的构建由上述参考文献以及Dawson，W.O.等人，Virology(1989)172：285-292；Takamatsu等人EMBOJ.(1987)6：307-311；French等人Science(1986)231：1294-1297；和Takamatsu等人FEBS Letters(1990)269：73-76证实。
当病毒是DNA病毒时，可以对病毒自身进行构建。可替代地，病毒可以首先克隆到细菌质粒中以用于容易地构建含有外来DNA的所需病毒载体。病毒随后可以从质粒中切除。如果病毒是DNA病毒，则可以将细菌的复制起点附着在病毒DNA上，所述病毒DNA随后通过细菌进行复制。这种DNA的转录和翻译将产生外壳蛋白，它将使病毒DNA壳体化。如果病毒是RNA病毒，则该病毒通常作为cDNA被克隆并插入质粒中。质粒随后用于制备所有构建体。RNA病毒随后通过转录质粒的病毒序列并翻译病毒基因以产生使病毒RNA壳体化的外壳蛋白来产生。
用于在植物中导入和表达非病毒性外源核酸序列的植物RNA病毒的构建由上述参考文献以及美国专利号5,316,931证实，所述外源核酸序列例如本发明构建体中包括的那些。
在一个实施方案中，提供了植物病毒性核酸，其中天然的外壳蛋白编码序列已从病毒核酸中缺失，已插入非天然的植物病毒外壳蛋白的编码序列和非天然的启动子，优选非天然的外壳蛋白编码序列的亚基因组启动子，其能够在植物宿主中表达，包装重组的植物病毒核酸，并确保通过重组的植物病毒核酸全身地感染宿主。可替代地，外壳蛋白基因可以通过在其中插入非天然的核酸序列来灭活，从而产生蛋白质。重组的植物病毒核酸可以包含一个或多个另外的非天然的亚基因组启动子。每个非天然的亚基因组启动子都能够在植物宿主中转录或表达邻近基因或核酸序列，并且不能互相重组以及与天然的亚基因组启动子重组。如果包括超过一个的核酸序列，则插入的非天然(外来)核酸序列可以邻近天然的植物病毒亚基因组启动子、或邻近天然的和非天然的植物病毒亚基因组启动子。非天然的核酸序列在亚基因组启动子控制下在宿主植物中被转录或表达，以生产所需产品。
在第二个实施方案中，提供的重组的植物病毒核酸与第一个实施方案中的一样，只是除了将天然的外壳蛋白编码序列置于邻近一个非天然的外壳蛋白亚基因组启动子而不是非天然的外壳蛋白编码序列。
在第三个实施方案中，提供重组的植物病毒核酸，其中天然外壳蛋白的基因邻近其亚基因组启动子，且一个或多个非天然亚基因组启动子已插入到病毒核酸中。插入的非天然的亚基因组启动子能够在植物宿主中转录或表达邻近基因，并且不能互相重组及与天然的亚基因组启动子重组。插入的非天然的核酸序列可以邻近非天然的亚基因组植物病毒启动子，从而使得所述序列在亚基因组启动子控制下在宿主植物中被转录或表达，以生产所需产品。
在第四个实施方案中，提供的重组的植物病毒核酸与第三个实施方案中的一样，只是除了天然的外壳蛋白编码序列由非天然的外壳蛋白编码序列替代。
病毒载体通过由重组的植物病毒核酸编码的外壳蛋白进行壳体化，以生产重组的植物病毒。重组的植物病毒核酸或重组的植物病毒用于感染适当的宿主植物。重组的植物病毒核酸能够在宿主中复制、在宿主中全身地扩散、并且在宿主中转录或表达外来基因(被分离的核酸)，以生产所需蛋白。
用于将外源核酸序列导入叶绿体基因组的技术是已知的。这种技术包括下列过程。首先，植物细胞被化学处理以便将每个细胞的叶绿体数目减少至约一个。随后，外源核酸经由粒子轰击导入细胞中以用于将至少一种外源核酸分子导入叶绿体中。选择外源核酸从而使得它能够经由同源重组整合到叶绿体基因组中，所述同源重组易于通过叶绿体固有的酶来实现。为此，外源核酸除了目的基因之外还包括至少一个核酸段，它来源于叶绿体基因组。此外，外源核酸包括选择标记，它通过序贯选择过程以用于确定所有或基本上所有的叶绿体基因组拷贝在此类选择后将包括外源核酸。关于这种技术的进一步的细节在美国专利号4,945,050和5,693,507中找到，所述专利引入本文作为参考。因此多肽可以通过叶绿体的蛋白质表达系统来生产并且变得整合到叶绿体内膜中。
上述转化方法可以用于在任何物种的植物、或植物组织或来源于那里的被分离的植物细胞中生产胶原链和/或修饰酶以及被装配的胶原(含或不含前肽)。
优选的植物是能够积聚大量本文描述的胶原链、胶原和/或加工酶的那些。还可根据其对应激条件的抗性和其中表达的组分或被装配的胶原可以被提取的容易性来选择此类植物。优选的植物的例子包括烟草、玉米、苜蓿、稻、马铃薯、大豆、番茄、小麦、大麦、低芥酸菜子和棉花。
胶原纤维广泛地用于食物和化妆品工业中。因此，尽管由植物表达的胶原纤维组分(α链)和修饰酶在胶原的工业合成中找到功用，但由于其简单性和成本效率，优选在植物中生产完整的胶原。
几种方法可以用于在植物中生成I型胶原。例如可以从表达胶原α1和P4H(和任选的LH3)的植物中分离胶原α1链并且将其与胶原α2链混合，所述胶原α2链从表达胶原α2和P4H(和任选的LH3以及蛋白酶C和/或N)的植物中分离。因为胶原α1链自动地自身装配为三股螺旋，所以在混合之前可能必须使此类同源三聚体变性，且与胶原α2链一起复性。
优选地，表达胶原α1和P4H(和任选的LH3以及蛋白酶C和/或N)的第一种植物可以与表达胶原α2的第二种(且优选等基因的)植物杂交，或可替代地，表达2种α链的第一种植物可以与表达P4H和任选的LH3以及蛋白酶C和/或N的第二种植物杂交。
应当指出尽管上述植物育种方法使用2种单独转化的植物，但使用3种或更多种单独转化的植物的方法也可采用，所述植物各自表达1种或2种组分。
本领域的普通技术人员知道各种植物育种技术并且因此本文不提供此类技术的进一步描述。
尽管植物育种方法是优选的，但应当指出表达胶原α1和2、P4H和LH3(和任选的蛋白酶C和/或N)的单个植物可以经由数个转化事件产生，每个所述转化事件被设计用于将再一个可表达的组分导入细胞中。在这种情况下，每个转化事件的稳定性可以利用特异性的选择标记进行验证。
在任何情况下，转化和植物育种方法都可以用于生成表达任何数目的组分的任何植物。目前优选的是表达胶原α1和2链、P4H、LH3和至少一种蛋白酶(例如蛋白酶C和/或N)的植物。如下文实施例部分将进一步描述的，此类植物积聚在最高达42℃的温度下显示出稳定性的胶原。
由育种产生的后代，或可替代地，多重转化的植物可以通过使用核酸或蛋白质探针(例如抗体)证实外源mRNA和/或多肽的存在来选择。后面的方法是优选的，因为它能够定位所表达的多肽组分(通过例如，探测分级分离的植物提取物)，并因此同样证实了用于正确加工和装配的潜力。适当的探针的例子在下文实施例部分提供。
一旦表达胶原的后代被鉴别，此类植物就进一步在使胶原链以及修饰酶最大化表达的条件下进一步培育。
因为游离的脯氨酸积聚可以促进不同的富含脯氨酸的蛋白质的过度生产，所述蛋白质包括由本发明的基因修饰植物表达的胶原链，所以优选的培育条件是增加被培育植物中游离脯氨酸积聚的那些。
游离脯氨酸响应于广泛的环境应激而在多种植物中积聚，所述环境应激包括剥夺、盐化、低温、高温、病原体感染、重金属毒性、无氧生活、养分缺乏、大气污染和紫外线照射(Hare和Cress，1997)。
游离脯氨酸还可响应于经由化合物例如ABA，或应激诱导化合物例如铜盐、百草枯(paraquate)、水杨酸等处理植物或土壤而积聚。
因此，表达胶原的后代可以在不同的应激条件(例如50mM-最高达250mM的不同的NaCl浓度)下生长。为了进一步增强胶原的生产，将检查各种应激条件对胶原表达的作用，并关于植物生活力、生物量和胶原积聚进行最优化。
植物组织/细胞优选在成熟期进行收获，并且利用众所周知的现有技术的提取方法分离胶原纤维，下文描述了一种此类方法。
转基因植物的叶子在液氮下被磨成粉末，并且于4℃在包含0.2MNaCl的0.5M乙酸中提取匀浆物60小时。通过离心去除不溶的材料。包含重组胶原的上清液在0.4M和0.7M NaCl下进行盐分级分离。包含重组的异源三聚体胶原的0.7M NaCl沉淀物溶解于0.1M乙酸中并针对其进行透析，并储存于-20℃(根据Ruggiero等人，2000)。
在检查下列实施例后本发明的其他目的、优点和新型特征对于本领域的普通技术人员而言将是显而易见的，所述实施例不预期是限制性的。另外，如上文所描绘的和下文权利要求部分所请求保护的本发明的各种实施方案和方面中的每一个在下列实施例中都能找到实验支持。
实施例
现在参考下列实施例，所述实施例与上述说明书一起以非限制性的方式举例说明本发明。
一般地，本文所使用的术语和本发明中使用的实验程序包括分子、生物化学、微生物学和重组DNA技术。此类技术在文献中得到充分说明。参见，例如“Molecular Cloning：A laboratory Manual”Sambrook等人(1989)；“Current Protocols in Molecular Biology”第I-III卷Ausubel，R.M.，ed.(1994)；Ausubel等人，“CurrentProtocols in Molecular Biology”，John Wiley和Sons，Baltimore，Maryland(1989)；Perbal，“A Practical Guide to MolecularCloning”，John Wiley&Sons，New York(1988)；Watson等人，“Recombinant DNA”，Scientific American Books，New York；Birren等人(eds)，“Genome Analysis：A Laboratory Manual Series”，第1-4卷，Cold Spring Harbor Laboratory Press，New York(1998)；美国专利号4,666,828；4,683,202；4,801,531；5,192,659和5,272,057中所阐明的方法；“Cell Biology：A Laboratory Handbook”，第I-III卷Cellis，J.E.，ed.(1994)；“Current Protocols in Immunology”第I-III卷Coligan J.E.，ed.(1994)；Stites等人(eds)，“Basic and ClinicalImmunology”(第8版)，Appleton&Lange，Norwalk，CT(1994)；Mishell和Shiigi(eds)，“Selected Methods in Cellular Immunology”，W.H.Freeman and Co.，New York(1980)；可用的免疫测定广泛描述于专利和科学文献中，参见，例如，美国专利号3,791,932；3,839,153；3,850,752；3,850,578；3,853,987；3,867,517；3,879,262；3,901,654；3,935,074；3,984,533；3,996,345；4,034,074；4,098,876；4,879,219；5,011,771和5,281,521；“Oligonucleotide Synthesis”Gait，M.J.，ed.(1984)；“Nucleic Acid Hybridization”Hames，B.D.，和Higgins S.J.，eds.(1985)；“Transcription and Translation”Hames，B.D.，和Higgins S.J.，Eds.(1984)；“Animal Cell Culture”Freshney，R.I，ed.(1986)；“Immobilized Cells and Enzymes”IRL Press，(1986)；“A Practical Guide to Molecular Cloning”Perbal，B.，(1984)和“Methods in Enzymology”第1-317卷，Academic Press；“PCRProtocols：A Guide To Methods And Applications”，Academic Press，San Diego，CA(1990)；Marshak等人，“Strategies for ProteinPurification and Characterization-A Laboratory Course Manual”CSHL Press(1996)；所有这些都如本文完全阐明的那样引入本文作为参考。这个文件自始至终提供了其他的一般参考文献。其中的程序被认为是本领域众所周知的并且为了读者的方便而提供。其中包含的所有信息都引入本文作为参考。
实施例1
构建体和转化方案
图1a-d中举例说明了在这项工作中使用的表达盒和载体的构建。这项工作中的所有编码序列都对于在烟草中的表达进行最优化，并与所需侧翼区(SEQ ID NO：1、4、7、12、14、16、18、20、22)一起进行化学合成。图1a-编码与液泡信号或质外体信号(由SEQ IDNO：7编码)融合的、或不含信号的Col1和Col2的合成基因(SEQ ID1、4)在由菊花rbcS1启动子和5′UTR(SEQ ID NO：10)以及菊花rbcS13′UTR和终止子(SEQ ID NO：11)组成的表达盒中进行克隆。将完整的表达盒克隆到pBINPLUS植物转化载体的多克隆位点中(van Engelen等人，1995，Transgenic Res 4：288-290)。图1b-编码与液泡信号或质外体信号(由SEQ ID NO：7编码)融合的、或不含信号的P4H β-人、P4H α-人和P4H-植物(SEQ ID NO：12、14和16)的合成基因在由载体pJD330携带的CaMV 35S启动子和TMVω序列和土壤杆菌属胭脂碱合成酶(NOS)终止子组成的表达盒中进行克隆(Galili等人，1987，Nucleic Acids Res 15：3257-3273)。将完整的表达盒克隆到携带Col1或Col2表达盒的pBINPLUS载体的多克隆位点中。图1c-编码与液泡信号或质外体信号(由SEQ ID NO：7编码)融合的蛋白酶C和蛋白酶N(SEQ ID NO：18、20)的合成基因在由菊花rbcS1启动子和5′UTR(SEQ ID NO：10)以及菊花rbcS13′UTR和终止子(SEQ ID NO：11)组成的表达盒中进行克隆。将完整的表达盒克隆到pBINPLUS植物转化载体的多克隆位点中。图1d-编码与液泡信号或质外体信号(由SEQ ID NO：7编码)融合的、或不含信号的、具有侧翼的草莓镶脉病毒(SVBV)启动子(NCBI编号AF331666REGION：623..950版本AF331666.1GI：13345788)并由土壤杆菌属章鱼碱(octopin)合酶(OCS)终止子(NCBI编号Z37515REGION：1344..1538版本Z37515.1GI：886843)终止的LH3的合成基因(SEQ ID NO：22)在携带Col1和P4Hβ表达盒的pBINPLUS载体的多克隆位点中进行克隆。
在图2中举例说明了利用图1中描述的表达盒进入宿主植物的共转化方案。每个表达盒插入片段由编码序列的短名表示。编码序列和相关的SEQ ID NO描述于表1中。每次共转化由2个pBINPLUS二元载体来进行。每个长方形表示携带1、2或3个表达盒的单个pBINPLUS载体。启动子和终止子在图1中详细说明。
实施例2
植物胶原表达
下表1中列出的编码蛋白质的合成的多核苷酸序列对于在烟草植物中的表达进行设计和最优化。
表1-表达的蛋白质的列表
| 名称： | SwissProt编号 | 氨基酸 | 剪接同工型 | 缺失 | 名称 | 包括在SEQ IDNO中 | 由SEQID NO编码 |
| 胶原α1(I)链[前体] | p02452 | 1442 | 一种形式 | ER信号 | Col1 | 3 | 1 |
| 胶原α2(I)链[前体] | p08123在p08123中进行2种改变：D549A和N249I | 1342 | 一种形式 | ER信号 | Col2 | 6 | 4 |
| 脯氨酰4-羟化酶β亚基 | p07237 | 487 | 一种形式 | ER信号，KDEL | P4H β人 | 13 | 12 |
| 脯氨酰4-羟化酶α1亚基 | p13674 | 517 | P13674-1 | ER信号 | P4H α人 | 15 | 14 |
| 脯氨酰4-羟化酶植物 | 没有记入SwissProt。NCBI编号：gi：15227885 | 252 | 一种形式 | 线粒体信号预期为：氨基酸1-39 | P4H植物 | 17 | 16 |
| 前胶原C-蛋白酶 | p13497 | 866 | P13497-1BMP1-3 | ER信号，前肽 | 蛋白酶C | 19 | 18 |
| 前胶原I N-蛋白酶 | o95450 | 958 | O95450-1LpNPI | ER信号，前肽 | 蛋白酶N | 21 | 20 |
| 赖氨酰羟化酶3 | o60568 | 714 | 一种形式 | ER信号 | LH3 | 23 | 22 |
信号肽
(i)用于巯基蛋白酶aleurain前体(NCBI编号P05167GI：113603)的大麦基因的液泡信号序列
MAHARVLLLALAVLATAAVAVASSSSFADSNPIRPVTDRAASTLA(SEQ IDNO：24)。
(ii)鼠耳芥(Arabidopsis thaliana)内切-1，4-β-葡聚糖酶的质外体信号(Cell，NCBI编号CAA67156.1GI：2440033)；SEQ ID NO.9，由SEQ ID NO.7编码。
质粒的构建
如实施例1所教导的构建植物表达载体，每种被构建的表达载体的组成经由限制酶切分析和测序进行确认。
构建包括下列表达盒的表达载体：
1.胶原α1
2.胶原α1+人P4Hβ亚基
3.胶原α1+人P4Hβ亚基+人LH3
4.胶原α2
5.胶原α2+人P4Hα亚基
6.胶原α2+鼠耳芥P4H
7.人P4Hβ亚基+人LH3
8.人P4Hα亚基
上述编码序列中的每一种都与液泡转运肽或质外体转运肽翻译地融合，或在其中预期细胞质积聚的情况下，缺乏任何转运肽序列。
植物转化和PCR筛选
烟草植物(烟草(Nicotiana tabacum)，Samsun NN)根据图2中教导的转化方案由上述表达载体进行转化。
所得的转基因植物经由多重PCR利用4种引物进行筛选，所述引物被设计为能够扩增胶原α1的324bp片段和胶原α2的537bp片段(表2)。图3举例说明了多重PCR筛选的结果。
表2-用于扩增胶原α1的324bp片段和胶原α2的537bp片段的多重PCR的引物列表
| Coll正向引物(24-聚体)： | 5′ATCACCAGGAGAACAGGGACCATC 3′ | SEQ ID 25 |
| Coll反向引物(29-聚体)： | 5′TCCACTTCCAAATCTCTATCCCTAACAAC 3′ | SEQ ID 26 |
| Col2正向引物(23-聚体)： | 5′AGGCATTAGAGGCGATAAGGGAG 3′ | SEQ ID 27 |
| Col2反向引物(27-聚体)： | 5′TCAATCCAATAATAGCCACTTGACCAC 3′ | SEQ ID 28 |
实施例3
在转基因烟草植物中的人胶原的检测
通过在0.5ml 50mM Tris-HCl pH＝7.5中与“完整的”蛋白酶抑制剂混合物(来自Roche Diagnostics GmbH的产品#1836145，1片剂/50ml缓冲液)一起磨碎500mg叶子，从烟草转化体2、3和4中提取总可溶性蛋白。粗提取物与250μl包含10％β-巯基乙醇和8％SDS的4×样品应用缓冲液混合，将样品煮沸7分钟并在13000rpm下离心8分钟。将20μl上清液加载到10％聚丙烯酰胺凝胶中并在标准蛋白质印迹程序中用抗-胶原I(变性的)抗体(来自Chemicon Inc.的#AB745)进行测试(图4)。W.T.是野生型烟草。在对于I型胶原α1或α2或二者PCR阳性的植物中可见阳性胶原条带。来自人胎盘的500ng I型胶原(来自Chemicon Inc.的#CC050)的阳性对照条带代表来自转基因植物的样品中的约0.3％总可溶性蛋白(约150μg)。
当胶原靶向液泡时，检测到表达预期分子量的、最高达～1％总可溶性蛋白的胶原的植物(图4)。成功地实现了全长胶原亚细胞靶向质外体(图5)。在细胞质中表达胶原(即没有靶向肽)的植物没有将胶原积聚至可检测的水平，从而显示在植物中的胶原亚细胞靶向作用对于成功是关键的。
此外，与显示对缺少N-前肽的胶原实施重要的蛋白质水解作用的Ruggiero等人2000和Merle等人2002研究相反，使用本方法，含有C-前肽和N-前肽的全长胶原蛋白质以高水平积聚在亚细胞区室中。
现在的数据还清晰地显示各自表达不同胶原链类型的2种植物杂交是有利的，因为它使得能够选择表达最佳水平的每种链类型的植物和后续的植物杂交，以获得所需生产胶原的植物。
由本发明的植物生产的胶原包括天然的前肽，并因此预期形成比通过蛋白质水解纯化的人对照大的蛋白质。计算出的不含羟基化或糖基化的胶原α1和α2链分子量如下：含有前肽的Col1-136kDa，不含前肽的Col1-95kDa、含有前肽的Col2-127kDa、不含前肽的Col2-92kDa。
如图4中可见的，转化体3-5和3-49中的Col1条带看起来比其他植物中的Col1条带大。这提示胶原链中通过由α和β亚基组成的人脯氨酸4-羟化酶全酶进行脯氨酸羟基化，所述α和β亚基在这些植物中共表达并靶向与人胶原链相同的亚细胞区室(例如液泡)。
实施例4
在转基因植物中的胶原三股螺旋装配和热稳定性
通过转基因植物的总粗蛋白提取物的热变性、随后为胰蛋白酶或胃蛋白酶消化，来测试在转基因植物中的胶原三股螺旋的装配和螺旋的热稳定性(图6a-b)。
在第一个实验中，来自烟草2-9(只表达胶原α1，且不表达P4H)和3-5(表达胶原α1+2和P4H)的总可溶性蛋白通过下列操作提取：在0.5ml 50 mM Tris-HCl pH＝7.5中磨碎500mg叶子，在13000rpm下离心10分钟，并收集上清液。对50μl上清液实施热处理(于33℃或43℃15分钟)，并随后立即置于冰上。通过向每种样品加入6μl溶于50mM Tris-HCl pH＝7.5的1mg/ml胰蛋白酶开始胰蛋白酶消化。样品在室温(约22℃)下温育20分钟。通过加入20μl包含10％β巯基乙醇和8％SDS的4×样品应用缓冲液来终止消化，将样品煮沸7分钟并在13000rpm下离心7分钟。将50μl上清液加载到10％聚丙烯酰胺凝胶上并利用标准蛋白质印迹程序经由抗-胶原I抗体(来自Chemicon Inc.的#AB745)进行测试。阳性对照是～500ng人胶原I样品(来自Chemicon Inc.的#CC050，通过胃蛋白酶消化从人胎盘中提取)，将其加入从野生型烟草中提取的50μl总可溶性蛋白中。
如图6a中所示，在植物#3-5中形成的胶原三股螺旋以及对照人胶原在33℃对变性有抗性。相反，由植物#2-9形成的胶原在33℃变性。这种热稳定性方面的差异提示在转化体#3-5中的成功的三股螺旋装配和翻译后的脯氨酸羟基化，所述转化体#3-5表达胶原α1和胶原α2以及P4Hβ和α亚基。
转化体#2-9中的2个条带可以表示二聚体或三聚体，它们在与SDS和巯基乙醇一起煮沸7分钟后是稳定的。类似的条带在人胶原(上面的图)和转化体#3-5中可见。可能的解释是不同三股螺旋中的2种肽之间的共价键(交联)，所述共价键在2个赖氨酸通过赖氨酸氧化酶氧化脱氨后形成。
在第二个实验中，来自转基因烟草13-6(表达胶原Iα1和α2链-由箭标指出，人P4Hα和β亚基以及人LH3)的总可溶性蛋白通过下列操作提取：在0.5ml 100 mM Tris-HCl pH＝7.5和300mM NaCl中磨碎500mg叶子，在10000rpm下离心7分钟，并收集上清液。对50μl上清液实施热处理(于33℃、38℃或42℃20分钟)，并随后立即置于冰上。通过向每种样品加入溶于10mM乙酸的4.5μl 0.1M HCl和4μl 2.5mg/ml胃蛋白酶开始胃蛋白酶消化。样品在室温(约22℃)下温育30分钟。通过加入5μl无缓冲的1M Tris来终止消化。每种样品与22μl包含10％β巯基乙醇和8％SDS的4×样品应用缓冲液混合，煮沸7分钟并在13000rpm下离心7分钟。将40μl上清液加载到10％聚丙烯酰胺凝胶上并在标准蛋白质印迹程序中用抗-胶原I抗体(来自Chemicon Inc.的#AB745)进行测试。阳性对照是加入从野生型烟草中提取的总可溶性蛋白中的～50ng人胶原I(来自Chemicon Inc.的#CC050，通过胃蛋白酶消化从人胎盘中提取)。
如图6b中举例说明的，在植物#13-6中形成的胶原三股螺旋在42℃对变性有抗性。前肽的切割首先在33℃可见，并且当温度升至38℃并再升至42℃时效力逐渐增加。被切割的胶原三股螺旋结构域在凝胶上显示出的迁移与胃蛋白酶处理的人胶原的迁移相似。在这个实验中使用的人胶原通过胃蛋白酶的蛋白水解作用从人胎盘中提取出来，并且因此缺少前肽和某些端肽。
实施例5
植物P4H表达
天然的植物P4H的诱导
烟草P4H cDNA被克隆并用作探针以测定将诱导内源性P4H表达的条件和处理。RNA印迹分析(图7)清晰地显示，P4H以相对高的水平表达于苗端并以低水平表达于叶中。P4H水平在磨损处理(在下面的图中的“创伤”)后4小时在叶中被显著诱导。利用其他应激条件达到类似结果(未显示)。
转基因烟草植物中入P4Hα和β亚基以及胶原α1和α2链的检测
使用抗人P4H α亚基抗体(来自ICN Biomedicals Inc.的#63-163)、抗人P4Hβ亚基抗体(来自Chemicon Inc.的#MAB2701)和抗胶原I抗体(来自Chemicon Inc.的#AB745)实现转基因烟草植物中人P4Hα和β亚基以及I型胶原α1和α2链的检测。用这些抗体探测的蛋白质印迹结果显示于图8中。
在植物13-6(还转化有人LH3)中确认P4Hα、P4Hβ和胶原Iα1和α2条带的表达。计算出的包括液泡信号肽的P4Hα和β的分子量分别为65.5kDa和53.4kDa。计算出的含有前肽、不含羟基化或糖基化的胶原α1和α2链的分子量分别为136kDa和127kDa。
应当理解本发明的某些特征还可与单个实施方案组合提供，所述特征为了清晰起见在分开的实施方案的背景中进行描述。相反地，本发明的各种特征还可分开或以任何适当的亚组合提供，所述特征为了简短起见在单个实施方案的背景中进行描述。
尽管本发明已结合其具体实施方案进行了描述，但明显的是，多种替代方案、修饰和改变对于本领域技术人员将是显而易见的。因此，它预期包含落在附加权利要求的精神和广泛范围内的所有此类替代方案、修饰和改变。本说明书中提到的所有公开出版物、专利和专利申请以及GenBank编号都整体引入本说明书作为参考，其程度相当于每个单独的公开出版物、专利或专利申请或GenBank编号被具体地和单独地说明引入本文作为参考。此外，本申请中的任何参考文献的引用或鉴定不应被解释为承认此类参考文献可作为本发明的现有技术。
参考文献
(其他参考文献在文件中引用)
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序列表
<110>CollPlant Ltd.
<120>生产胶原的植物及其生成和使用方法
<130>CPCH0761218P
<160>28
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>4662
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>含有与人胶原α1(I)链融合的大麦巯基蛋白酶aleurain前体基因的维管信号序列
编码区和侧翼区的合成序列
<400>1
gcgatgcatg taatgtcatg agccacatga tccaatggcc acaggaacgt aagaatgtag 60
atagatttga ttttgtccgt tagatagcaa acaacattat aaaaggtgtg tatcaatacg 120
aactaattca ctcattggat tcatagaagt ccattcctcc taagtatcta aaccatggct 180
cacgctcgtg ttctcctcct cgctctcgct gttttggcaa cagctgctgt ggctgtggct 240
tctagttctt cttttgctga ttcaaaccct attagacctg ttactgatag agcagcttcc 300
actttggctc aattgcaaga ggagggccag gttgagggcc aagatgagga tatccctcca 360
attacatgcg tgcaaaatgg cttgcgttac cacgataggg atgtgtggaa acctgaacct 420
tgtcgtatct gtgtgtgtga taacggcaag gtgctctgcg atgatgttat ctgcgatgag 480
acaaaaaatt gccctggcgc tgaagttcct gagggcgagt gttgccctgt gtgccctgat 540
ggttccgagt ccccaactga tcaggaaact actggcgtgg agggcccaaa aggagatact 600
ggtccacgtg gtcctagggg tccagcaggt cctccaggta gagatggtat tccaggccag 660
cctggattgc caggaccacc aggcccacct ggcccaccag gacctcctgg tcttggtgga 720
aatttcgctc cacaactctc ttatggctat gatgagaagt caacaggtgg tatttccgtt 780
ccaggtccta tgggaccatc cggaccaaga ggtctcccag gtcctccagg tgctcctgga 840
cctcaaggct ttcaaggacc tccaggcgaa ccaggagaac caggcgcttc tggaccaatg 900
ggcccaaggg gaccacctgg cccaccagga aaaaatggcg atgatggcga agctggaaag 960
cctggtcgtc ctggagagag aggtcctcct ggcccacagg gtgcaagagg cttgccagga 1020
actgctggct tgcctggaat gaagggacat aggggcttct ccggcctcga tggcgctaag 1080
ggtgatgctg gccctgctgg accaaagggc gagccaggtt cccctggaga aaacggtgct 1140
cctggacaaa tgggtcctcg tggacttcca ggagaaaggg gtcgtccagg cgctccagga 1200
ccagcaggtg ctaggggaaa cgatggtgca acaggcgctg ctggccctcc tggcccaact 1260
ggtcctgctg gccctccagg attcccaggc gcagttggag ctaaaggaga agcaggacca 1320
cagggcccta ggggttctga aggacctcag ggtgttagag gtgaaccagg tcctccaggc 1380
ccagctggag cagctggtcc agcaggaaat ccaggtgctg atggtcaacc tggagctaag 1440
ggcgctaatg gcgcaccagg tatcgcaggc gcaccaggtt ttcctggcgc tagaggccca 1500
agtggtcctc aaggaccagg tggaccacca ggtccaaaag gcaattctgg cgaacctggc 1560
gctccaggtt ctaaaggaga tactggtgct aaaggcgaac caggacctgt tggtgttcag 1620
ggtcctcctg gtcctgctgg agaagaagga aaaagaggtg ctcgtggaga accaggacca 1680
actggacttc ctggacctcc tggtgaacgt ggcggacctg gctcaagggg tttccctgga 1740
gctgatggag tggcaggtcc aaaaggccct gctggagaga gaggttcacc aggtccagct 1800
ggtcctaagg gctcccctgg tgaagcaggt agaccaggcg aagcaggatt gccaggcgca 1860
aagggattga caggctctcc tggtagtcct ggcccagatg gaaaaacagg cccaccaggt 1920
ccagcaggac aagatggacg tccaggccca ccaggtcctc ctggagcaag gggacaagct 1980
ggcgttatgg gttttccagg acctaaaggt gctgctggag agccaggaaa ggcaggtgaa 2040
agaggagttc ctggtccacc aggagcagtg ggtcctgctg gcaaagatgg tgaagctgga 2100
gcacagggcc ctccaggccc tgctggccca gctggcgaac gtggagaaca aggcccagct 2160
ggtagtccag gatttcaagg attgcctggc cctgctggcc ctccaggaga agcaggaaaa 2220
cctggagaac aaggagttcc tggtgatttg ggagcacctg gaccttcagg agcacgtggt 2280
gaaagaggct tccctggcga gaggggtgtt caaggtccac caggtccagc aggacctaga 2340
ggtgctaatg gcgctcctgg caacgatgga gcaaaaggtg atgctggtgc tcctggcgca 2400
cctggaagtc agggtgctcc tggattgcaa ggaatgcctg gagagagggg tgctgctggc 2460
ttgccaggcc caaagggcga taggggtgat gctggaccaa aaggtgctga tggatcccca 2520
ggaaaagatg gagttcgtgg tcttactggc ccaatcggac ctccaggccc tgctggcgct 2580
ccaggtgata agggcgaaag tggcccaagt ggacctgctg gacctactgg tgctagaggt 2640
gcacctggtg ataggggtga acctggacca cctggtccag ctggttttgc tggtcctcct 2700
ggagctgatg gacaacctgg cgcaaagggt gaaccaggtg atgctggcgc aaagggagat 2760
gctggtccac ctggacctgc tggtccagca ggcccccctg ggccaatcgg taatgttgga 2820
gcaccaggtg ctaagggagc taggggttcc gctggtccac ctggagcaac aggatttcca 2880
ggcgctgctg gtagagttgg cccaccaggc ccatccggaa acgcaggccc tcctggtcct 2940
ccaggtcctg ctggcaagga gggtggcaaa ggaccaaggg gcgaaactgg ccctgctggt 3000
agacctggcg aagttggccc tcctggacca ccaggtccag caggagaaaa aggttcccca 3060
ggagctgatg gcccagctgg tgctccagga actccaggcc ctcaaggtat tgctggacag 3120
agaggcgttg tgggactccc tggtcaaagg ggagagagag gatttccagg cttgccagga 3180
cctagtggag aacctggaaa acaaggccca tcaggcgcta gtggagagcg tggacctcct 3240
ggccctatgg gacctcctgg attggctggc ccacctggcg aatcaggtcg tgaaggcgca 3300
ccaggcgcag aaggatcacc tggaagagat ggatcccctg gtgctaaagg cgatcgtgga 3360
gaaactggtc cagcaggccc accaggcgca ccaggtgcac ctggcgctcc aggacctgtg 3420
ggaccagctg gaaaatccgg agataggggc gagacaggcc cagcaggacc agctggacct 3480
gttggccctg ctggcgctcg tggaccagca ggacctcaag gaccaagggg agataaggga 3540
gaaacaggcg aacaaggcga taggggcatt aagggtcata ggggttttag tggcctccag 3600
ggtcctcctg gcccacctgg atcaccagga gaacagggac catctggtgc ttccggccca 3660
gctggtccaa gaggacctcc aggatcagct ggtgcacctg gaaaagatgg tcttaacggt 3720
ctcccaggac caatcggccc tccaggacct agaggaagaa caggagatgc tggccctgtt 3780
ggccctccag gacctcctgg tccaccaggt ccacctggtc ctccatcagc tggattcgat 3840
ttttcatttc ttccacagcc accacaagag aaagctcacg atggcggcag atattaccgt 3900
gctgatgatg ctaacgttgt tagggataga gatttggaag tggatacaac tttgaaatcc 3960
ctctcccagc aaattgaaaa cattagatct ccagaaggtt cacgtaaaaa cccagctaga 4020
acatgtcgtg atttgaaaat gtgtcactcc gattggaaaa gtggtgaata ctggattgat 4080
ccaaatcagg gctgtaatct cgatgctatc aaagttttct gtaacatgga aacaggcgaa 4140
acatgcgttt atcctactca accttccgtg gctcagaaaa attggtacat ctcaaaaaat 4200
cctaaagata agaggcacgt ttggttcggt gaaagtatga ctgatggatt tcaatttgag 4260
tacggcggtc aaggtagtga tccagctgat gtggctattc aactcacatt tttgcgtctt 4320
atgtccacag aggcatcaca aaacatcact taccactgca aaaacagtgt ggcttatatg 4380
gatcaacaaa caggaaacct taagaaggct cttcttttga agggctcaaa cgagattgag 4440
attagagcag agggcaactc aaggtttact tattcagtta ctgttgatgg ctgcacttca 4500
catactggcg cttggggtaa aacagttatc gagtataaga ctacaaaaac atcaagactc 4560
ccaatcattg atgttgctcc tctcgatgtt ggcgctcctg atcaagagtt cggttttgat 4620
gtgggcccag tttgtttcct ctaatgagct cgcggccgca tc 4662
<210>2
<211>4662
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>与人胶原α1(I)链融合的大麦巯基蛋白酶aleurain前体基因的维管信号序列和侧
翼区的合成序列
<220>
<221>CDS
<222>(175)..(4644)
<400>2
gcgatgcatg taatgtcatg agccacatga tccaatggcc acaggaacgt aagaatgtag 60
atagatttga ttttgtccgt tagatagcaa acaacattat aaaaggtgtg tatcaatacg 120
aactaattca ctcattggat tcatagaagt ccattcctcc taagtatcta aacc atg 177
Met
1
gct cac gct cgt gtt ctc ctc ctc gct ctc gct gtt ttg gca aca gct 225
Ala His Ala Arg Val Leu Leu Leu Ala Leu Ala Val Leu Ala Thr Ala
5 10 15
gct gtg gct gtg gct tct agt tct tct ttt gct gat tca aac cct att 273
Ala Val Ala Val Ala Ser Ser Ser Ser Phe Ala Asp Ser Asn Pro Ile
20 25 30
aga cct gtt act gat aga gca gct tcc act ttg gct caa ttg caa gag 321
Arg Pro Val Thr Asp Arg Ala Ala Ser Thr Leu Ala Gln Leu Gln Glu
35 40 45
gag ggc cag gtt gag ggc caa gat gag gat atc cct cca att aca tgc 369
Glu Gly Gln Val Glu Gly Gln Asp Glu Asp Ile Pro Pro Ile Thr Cys
50 55 60 65
gtg caa aat ggc ttg cgt tac cac gat agg gat gtg tgg aaa cct gaa 417
Val Gln Asn Gly Leu Arg Tyr His Asp Arg Asp Val Trp Lys Pro Glu
70 75 80
cct tgt cgt atc tgt gtg tgt gat aac ggc aag gtg ctc tgc gat gat 465
Pro Cys Arg Ile Cys Val Cys Asp Asn Gly Lys Val Leu Cys Asp Asp
85 90 95
gtt atc tgc gat gag aca aaa aat tgc cct ggc gct gaa gtt cct gag 513
Val Ile Cys Asp Glu Thr Lys Asn Cys Pro Gly Ala Glu Val Pro Glu
100 105 110
ggc gag tgt tgc cct gtg tgc cct gat ggt tcc gag tcc cca act gat 561
Gly Glu Cys Cys Pro Val Cys Pro Asp Gly Ser Glu Ser Pro Thr Asp
115 120 125
cag gaa act act ggc gtg gag ggc cca aaa gga gat act ggt cca cgt 609
Gln Glu Thr Thr Gly Val Glu Gly Pro Lys Gly Asp Thr Gly Pro Arg
130 135 140 145
ggt cct agg ggt cca gca ggt cct cca ggt aga gat ggt att cca ggc 657
Gly Pro Arg Gly Pro Ala Gly Pro Pro Gly Arg Asp Gly Ile Pro Gly
150 155 160
cag cct gga ttg cca gga cca cca ggc cca cct ggc cca cca gga cct 705
Gln Pro Gly Leu Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro
165 170 175
cct ggt ctt ggt gga aat ttc gct cca caa ctc tct tat ggc tat gat 753
Pro Gly Leu Gly Gly Asn Phe Ala Pro Gln Leu Ser Tyr Gly Tyr Asp
180 185 190
gag aag tca aca ggt ggt att tcc gtt cca ggt cct atg gga cca tcc 801
Glu Lys Ser Thr Gly Gly Ile Ser Val Pro Gly Pro Met Gly Pro Ser
195 200 205
gga cca aga ggt ctc cca ggt cct cca ggt gct cct gga cct caa ggc 849
Gly Pro Arg Gly Leu Pro Gly Pro Pro Gly Ala Pro Gly Pro Gln Gly
210 215 220 225
ttt caa gga cct cca ggc gaa cca gga gaa cca ggc gct tct gga cca 897
Phe Gln Gly Pro Pro Gly Glu Pro Gly Glu Pro Gly Ala Ser Gly Pro
230 235 240
atg ggc cca agg gga cca cct ggc cca cca gga aaa aat ggc gat gat 945
Met Gly Pro Arg Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Lys Asn Gly Asp Asp
245 250 255
ggc gaa gct gga aag cct ggt cgt cct gga gag aga ggt cct cct ggc 993
Gly Glu Ala Gly Lys Pro Gly Arg Pro Gly Glu Arg Gly Pro Pro Gly
260 265 270
cca cag ggt gca aga ggc ttg cca gga act gct ggc ttg cct gga atg 1041
Pro Gln Gly Ala Arg Gly Leu Pro Gly Thr Ala Gly Leu Pro Gly Met
275 280 285
aag gga cat agg ggc ttc tcc ggc ctc gat ggc gct aag ggt gat gct 1089
Lys Gly His Arg Gly Phe Ser Gly Leu Asp Gly Ala Lys Gly Asp Ala
290 295 300 305
ggc cct gct gga cca aag ggc gag cca ggt tcc cct gga gaa aac ggt 1137
Gly Pro Ala Gly Pro Lys Gly Glu Pro Gly Ser Pro Gly Glu Asn Gly
310 315 320
gct cct gga caa atg ggt cct cgt gga ctt cca gga gaa agg ggt cgt 1185
Ala Pro Gly Gln Met Gly Pro Arg Gly Leu Pro Gly Glu Arg Gly Arg
325 330 335
cca ggc gct cca gga cca gca ggt gct agg gga aac gat ggt gca aca 1233
Pro Gly Ala Pro Gly Pro Ala Gly Ala Arg Gly Asn Asp Gly Ala Thr
340 345 350
ggc gct gct ggc cct cct ggc cca act ggt cct gct ggc cct cca gga 1281
Gly Ala Ala Gly Pro Pro Gly Pro Thr Gly Pro Ala Gly Pro Pro Gly
355 360 365
ttc cca ggc gca gtt gga gct aaa gga gaa gca gga cca cag ggc cct 1329
Phe Pro Gly Ala Val Gly Ala Lys Gly Glu Ala Gly Pro Gln Gly Pro
370 375 380 385
agg ggt tct gaa gga cct cag ggt gtt aga ggt gaa cca ggt cct cca 1377
Arg Gly Ser Glu Gly Pro Gln Gly Val Arg Gly Glu Pro Gly Pro Pro
390 395 400
ggc cca gct gga gca gct ggt cca gca gga aat cca ggt gct gat ggt 1425
Gly Pro Ala Gly Ala Ala Gly Pro Ala Gly Asn Pro Gly Ala Asp Gly
405 410 415
caa cct gga gct aag ggc gct aat ggc gca cca ggt atc gca ggc gca 1473
Gln Pro Gly Ala Lys Gly Ala Asn Gly Ala Pro Gly Ile Ala Gly Ala
420 425 430
cca ggt ttt cct ggc gct aga ggc cca agt ggt cct caa gga cca ggt 1521
Pro Gly Phe Pro Gly Ala Arg Gly Pro Ser Gly Pro Gln Gly Pro Gly
435 440 445
gga cca cca ggt cca aaa ggc aat tct ggc gaa cct ggc gct cca ggt 1569
Gly Pro Pro Gly Pro Lys Gly Asn Ser Gly Glu Pro Gly Ala Pro Gly
450 455 460 465
tct aaa gga gat act ggt gct aaa ggc gaa cca gga cct gtt ggt gtt 1617
Ser Lys Gly Asp Thr Gly Ala Lys Gly Glu Pro Gly Pro Val Gly Val
470 475 480
cag ggt cct cct ggt cct gct gga gaa gaa gga aaa aga ggt gct cgt 1665
Gln Gly Pro Pro Gly Pro Ala Gly Glu Glu Gly Lys Arg Gly Ala Arg
485 490 495
gga gaa cca gga cca act gga ctt cct gga cct cct ggt gaa cgt ggc 1713
Gly Glu Pro Gly Pro Thr Gly Leu Pro Gly Pro Pro Gly Glu Arg Gly
500 505 510
gga cct ggc tca agg ggt ttc cct gga gct gat gga gtg gca ggt cca 1761
Gly Pro Gly Ser Arg Gly Phe Pro Gly Ala Asp Gly Val Ala Gly Pro
515 520 525
aaa ggc cct gct gga gag aga ggt tca cca ggt cca gct ggt cct aag 1809
Lys Gly Pro Ala Gly Glu Arg Gly Ser Pro Gly Pro Ala Gly Pro Lys
530 535 540 545
ggc tcc cct ggt gaa gca ggt aga cca ggc gaa gca gga ttg cca ggc 1857
Gly Ser Pro Gly Glu Ala Gly Arg Pro Gly Glu Ala Gly Leu Pro Gly
550 555 560
gca aag gga ttg aca ggc tct cct ggt agt cct ggc cca gat gga aaa 1905
Ala Lys Gly Leu Thr Gly Ser Pro Gly Ser Pro Gly Pro Asp Gly Lys
565 570 575
aca ggc cca cca ggt cca gca gga caa gat gga cgt cca ggc cca cca 1953
Thr Gly Pro Pro Gly Pro Ala Gly Gln Asp Gly Arg Pro Gly Pro Pro
580 585 590
ggt cct cct gga gca agg gga caa gct ggc gtt atg ggt ttt cca gga 2001
Gly Pro Pro Gly Ala Arg Gly Gln Ala Gly Val Met Gly Phe Pro Gly
595 600 605
cct aaa ggt gct gct gga gag cca gga aag gca ggt gaa aga gga gtt 2049
Pro Lys Gly Ala Ala Gly Glu Pro Gly Lys Ala Gly Glu Arg Gly Val
610 615 620 625
cct ggt cca cca gga gca gtg ggt cct gct ggc aaa gat ggt gaa gct 2097
Pro Gly Pro Pro Gly Ala Val Gly Pro Ala Gly Lys Asp Gly Glu Ala
630 635 640
gga gca cag ggc cct cca ggc cct gct ggc cca gct ggc gaa cgt gga 2145
Gly Ala Gln Gly Pro Pro Gly Pro Ala Gly Pro Ala Gly Glu Arg Gly
645 650 655
gaa caa ggc cca gct ggt agt cca gga ttt caa gga ttg cct ggc cct 2193
Glu Gln Gly Pro Ala Gly Ser Pro Gly Phe Gln Gly Leu Pro Gly Pro
660 665 670
gct ggc cct cca gga gaa gca gga aaa cct gga gaa caa gga gtt cct 2241
Ala Gly Pro Pro Gly Glu Ala Gly Lys Pro Gly Glu Gln Gly Val Pro
675 680 685
ggt gat ttg gga gca cct gga cct tca gga gca cgt ggt gaa aga ggc 2289
Gly Asp Leu Gly Ala Pro Gly Pro Ser Gly Ala Arg Gly Glu Arg Gly
690 695 700 705
ttc cct ggc gag agg ggt gtt caa ggt cca cca ggt cca gca gga cct 2337
Phe Pro Gly Glu Arg Gly Val Gln Gly Pro Pro Gly Pro Ala Gly Pro
710 715 720
aga ggt gct aat ggc gct cct ggc aac gat gga gca aaa ggt gat gct 2385
Arg Gly Ala Asn Gly Ala Pro Gly Asn Asp Gly Ala Lys Gly Asp Ala
725 730 735
ggt gct cct ggc gca cct gga agt cag ggt gct cct gga ttg caa gga 2433
Gly Ala Pro Gly Ala Pro Gly Ser Gln Gly Ala Pro Gly Leu Gln Gly
740 745 750
atg cct gga gag agg ggt gct gct ggc ttg cca ggc cca aag ggc gat 2481
Met Pro Gly Glu Arg Gly Ala Ala Gly Leu Pro Gly Pro Lys Gly Asp
755 760 765
agg ggt gat gct gga cca aaa ggt gct gat gga tcc cca gga aaa gat 2529
Arg Gly Asp Ala Gly Pro Lys Gly Ala Asp Gly Ser Pro Gly Lys Asp
770 775 780 785
gga gtt cgt ggt ctt act ggc cca atc gga cct cca ggc cct gct ggc 2577
Gly Val Arg Gly Leu Thr Gly Pro Ile Gly Pro Pro Gly Pro Ala Gly
790 795 800
gct cca ggt gat aag ggc gaa agt ggc cca agt gga cct gct gga cct 2625
Ala Pro Gly Asp Lys Gly Glu Ser Gly Pro Ser Gly Pro Ala Gly Pro
805 810 815
act ggt gct aga ggt gca cct ggt gat agg ggt gaa cct gga cca cct 2673
Thr Gly Ala Arg Gly Ala Pro Gly Asp Arg Gly Glu Pro Gly Pro Pro
820 825 830
ggt cca gct ggt ttt gct ggt cct cct gga gct gat gga caa cct ggc 2721
Gly Pro Ala Gly Phe Ala Gly Pro Pro Gly Ala Asp Gly Gln Pro Gly
835 840 845
gca aag ggt gaa cca ggt gat gct ggc gca aag gga gat gct ggt cca 2769
Ala Lys Gly Glu Pro Gly Asp Ala Gly Ala Lys Gly Asp Ala Gly Pro
850 855 860 865
cct gga cct gct ggt cca gca ggc ccc cct ggg cca atc ggt aat gtt 2817
Pro Gly Pro Ala Gly Pro Ala Gly Pro Pro Gly Pro Ile Gly Asn Val
870 875 880
gga gca cca ggt gct aag gga gct agg ggt tcc gct ggt cca cct gga 2865
Gly Ala Pro Gly Ala Lys Gly Ala Arg Gly Ser Ala Gly Pro Pro Gly
885 890 895
gca aca gga ttt cca ggc gct gct ggt aga gtt ggc cca cca ggc cca 2913
Ala Thr Gly Phe Pro Gly Ala Ala Gly Arg Val Gly Pro Pro Gly Pro
900 905 910
tcc gga aac gca ggc cct cct ggt cct cca ggt cct gct ggc aag gag 2961
Ser Gly Asn Ala Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro Ala Gly Lys Glu
915 920 925
ggt ggc aaa gga cca agg ggc gaa act ggc cct gct ggt aga cct ggc 3009
Gly Gly Lys Gly Pro Arg Gly Glu Thr Gly Pro Ala Gly Arg Pro Gly
930 935 940 945
gaa gtt ggc cct cct gga cca cca ggt cca gca gga gaa aaa ggt tcc 3057
Glu Val Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro Ala Gly Glu Lys Gly Ser
950 955 960
cca gga gct gat ggc cca gct ggt gct cca gga act cca ggc cct caa 3105
Pro Gly Ala Asp Gly Pro Ala Gly Ala Pro Gly Thr Pro Gly Pro Gln
965 970 975
ggt att gct gga cag aga ggc gtt gtg gga ctc cct ggt caa agg gga 3153
Gly Ile Ala Gly Gln Arg Gly Val Val Gly Leu Pro Gly Gln Arg Gly
980 985 990
gag aga gga ttt cca ggc ttg cca gga cct agt gga gaa cct gga aaa 3201
Glu Arg Gly Phe Pro Gly Leu Pro Gly Pro Ser Gly Glu Pro Gly Lys
995 1000 1005
caa ggc cca tca ggc gct agt gga gag cgt gga cct cct ggc cct 3246
Gln Gly Pro Ser Gly Ala Ser Gly Glu Arg Gly Pro Pro Gly Pro
1010 1015 1020
atg gga cct cct gga ttg gct ggc cca cct ggc gaa tca ggt cgt 3291
Met Gly Pro Pro Gly Leu Ala Gly Pro Pro Gly Glu Ser Gly Arg
1025 1030 1035
gaa ggc gca cca ggc gca gaa gga tca cct gga aga gat gga tcc 3336
Glu Gly Ala Pro Gly Ala Glu Gly Ser Pro Gly Arg Asp Gly Ser
1040 1045 1050
cct ggt gct aaa ggc gat cgt gga gaa act ggt cca gca ggc cca 3381
Pro Gly Ala Lys Gly Asp Arg Gly Glu Thr Gly Pro Ala Gly Pro
1055 1060 1065
cca ggc gca cca ggt gca cct ggc gct cca gga cct gtg gga cca 3426
Pro Gly Ala Pro Gly Ala Pro Gly Ala Pro Gly Pro Val Gly Pro
1070 1075 1080
gct gga aaa tcc gga gat agg ggc gag aca ggc cca gca gga cca 3471
Ala Gly Lys Ser Gly Asp Arg Gly Glu Thr Gly Pro Ala Gly Pro
1085 1090 1095
gct gga cct gtt ggc cct gct ggc gct cgt gga cca gca gga cct 3516
Ala Gly Pro Val Gly Pro Ala Gly Ala Arg Gly Pro Ala Gly Pro
1100 1105 1110
caa gga cca agg gga gat aag gga gaa aca ggc gaa caa ggc gat 3561
Gln Gly Pro Arg Gly Asp Lys Gly Glu Thr Gly Glu Gln Gly Asp
1115 1120 1125
agg ggc att aag ggt cat agg ggt ttt agt ggc ctc cag ggt cct 3606
Arg Gly Ile Lys Gly His Arg Gly Phe Ser Gly Leu Gln Gly Pro
1130 1135 1140
cct ggc cca cct gga tca cca gga gaa cag gga cca tct ggt gct 3651
Pro Gly Pro Pro Gly Ser Pro Gly Glu Gln Gly Pro Ser Gly Ala
1145 1150 1155
tcc ggc cca gct ggt cca aga gga cct cca gga tca gct ggt gca 3696
Ser Gly Pro Ala Gly Pro Arg Gly Pro Pro Gly Ser Ala Gly Ala
1160 1165 1170
cct gga aaa gat ggt ctt aac ggt ctc cca gga cca atc ggc cct 3741
Pro Gly Lys Asp Gly Leu Asn Gly Leu Pro Gly Pro Ile Gly Pro
1175 1180 1185
cca gga cct aga gga aga aca gga gat gct ggc cct gtt ggc cct 3786
Pro Gly Pro Arg Gly Arg Thr Gly Asp Ala Gly Pro Val Gly Pro
1190 1195 1200
cca gga cct cct ggt cca cca ggt cca cct ggt cct cca tca gct 3831
Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Ser Ala
1205 1210 1215
gga ttc gat ttt tca ttt ctt cca cag cca cca caa gag aaa gct 3876
Gly Phe Asp Phe Ser Phe Leu Pro Gln Pro Pro Gln Glu Lys Ala
1220 1225 1230
cac gat ggc ggc aga tat tac cgt gct gat gat gct aac gtt gtt 3921
His Asp Gly Gly Arg Tyr Tyr Arg Ala Asp Asp Ala Asn Val Val
1235 1240 1245
agg gat aga gat ttg gaa gtg gat aca act ttg aaa tcc ctc tcc 3966
Arg Asp Arg Asp Leu Glu Val Asp Thr Thr Leu Lys Ser Leu Ser
1250 1255 1260
cag caa att gaa aac att aga tct cca gaa ggt tca cgt aaa aac 4011
Gln Gln Ile Glu Asn Ile Arg Ser Pro Glu Gly Ser Arg Lys Asn
1265 1270 1275
cca gct aga aca tgt cgt gat ttg aaa atg tgt cac tcc gat tgg 4056
Pro Ala Arg Thr Cys Arg Asp Leu Lys Met Cys His Ser Asp Trp
1280 1285 1290
aaa agt ggt gaa tac tgg att gat cca aat cag ggc tgt aat ctc 4101
Lys Ser Gly Glu Tyr Trp Ile Asp Pro Asn Gln Gly Cys Asn Leu
1295 1300 1305
gat gct atc aaa gtt ttc tgt aac atg gaa aca ggc gaa aca tgc 4146
Asp Ala Ile Lys Val Phe Cys Asn Met Glu Thr Gly Glu Thr Cys
1310 1315 1320
gtt tat cct act caa cct tcc gtg gct cag aaa aat tgg tac atc 4191
Val Tyr Pro Thr Gln Pro Ser Val Ala Gln Lys Asn Trp Tyr Ile
1325 1330 1335
tca aaa aat cct aaa gat aag agg cac gtt tgg ttc ggt gaa agt 4236
Ser Lys Asn Pro Lys Asp Lys Arg His Val Trp Phe Gly Glu Ser
1340 1345 1350
atg act gat gga ttt caa ttt gag tac ggc ggt caa ggt agt gat 4281
Met Thr Asp Gly Phe Gln Phe Glu Tyr Gly Gly Gln Gly Ser Asp
1355 1360 1365
cca gct gat gtg gct att caa ctc aca ttt ttg cgt ctt atg tcc 4326
Pro Ala Asp Val Ala Ile Gln Leu Thr Phe Leu Arg Leu Met Ser
1370 1375 1380
aca gag gca tca caa aac atc act tac cac tgc aaa aac agt gtg 4371
Thr Glu Ala Ser Gln Asn Ile Thr Tyr His Cys Lys Asn Ser Val
1385 1390 1395
gct tat atg gat caa caa aca gga aac ctt aag aag gct ctt ctt 4416
Ala Tyr Met Asp Gln Gln Thr Gly Asn Leu Lys Lys Ala Leu Leu
1400 1405 1410
ttg aag ggc tca aac gag att gag att aga gca gag ggc aac tca 4461
Leu Lys Gly Ser Asn Glu Ile Glu Ile Arg Ala Glu Gly Asn Ser
1415 1420 1425
agg ttt act tat tca gtt act gtt gat ggc tgc act tca cat act 4506
Arg Phe Thr Tyr Ser Val Thr Val Asp Gly Cys Thr Ser His Thr
1430 1435 1440
ggc gct tgg ggt aaa aca gtt atc gag tat aag act aca aaa aca 4551
Gly Ala Trp Gly Lys Thr Val Ile Glu Tyr Lys Thr Thr Lys Thr
1445 1450 1455
tca aga ctc cca atc att gat gtt gct cct ctc gat gtt ggc gct 4596
Ser Arg Leu Pro Ile Ile Asp Val Ala Pro Leu Asp Val Gly Ala
1460 1465 1470
cct gat caa gag ttc ggt ttt gat gtg ggc cca gtt tgt ttc ctc 4641
Pro Asp Gln Glu Phe Gly Phe Asp Val Gly Pro Val Cys Phe Leu
1475 1480 1485
taa tgagctcgcg gccgcatc 4662
<210>3
<211>1489
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>与人胶原α1(I)链融合的大麦巯基蛋白酶aleurain前体基因的维管信号序列和侧
翼区的合成序列
<400>3
Met Ala His Ala Arg Val Leu Leu Leu Ala Leu Ala Val Leu Ala Thr
1 5 10 15
Ala Ala Val Ala Val Ala Ser Ser Ser Ser Phe Ala Asp Ser Asn Pro
20 25 30
Ile Arg Pro Val Thr Asp Arg Ala Ala Ser Thr Leu Ala Gln Leu Gln
35 40 45
Glu Glu Gly Gln Val Glu Gly Gln Asp Glu Asp Ile Pro Pro Ile Thr
50 55 60
Cys Val Gln Asn Gly Leu Arg Tyr His Asp Arg Asp Val Trp Lys Pro
65 70 75 80
Glu Pro Cys Arg Ile Cys Val Cys Asp Asn Gly Lys Val Leu Cys Asp
85 90 95
Asp Val Ile Cys Asp Glu Thr Lys Asn Cys Pro Gly Ala Glu Val Pro
100 105 110
Glu Gly Glu Cys Cys Pro Val Cys Pro Asp Gly Ser Glu Ser Pro Thr
115 120 125
Asp Gln Glu Thr Thr Gly Val Glu Gly Pro Lys Gly Asp Thr Gly Pro
130 135 140
Arg Gly Pro Arg Gly Pro Ala Gly Pro Pro Gly Arg Asp Gly Ile Pro
145 150 155 160
Gly Gln Pro Gly Leu Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly
165 170 175
Pro Pro Gly Leu Gly Gly Asn Phe Ala Pro Gln Leu Ser Tyr Gly Tyr
180 185 190
Asp Glu Lys Ser Thr Gly Gly Ile Ser Val Pro Gly Pro Met Gly Pro
195 200 205
Ser Gly Pro Arg Gly Leu Pro Gly Pro Pro Gly Ala Pro Gly Pro Gln
210 215 220
Gly Phe Gln Gly Pro Pro Gly Glu Pro Gly Glu Pro Gly Ala Ser Gly
225 230 235 240
Pro Met Gly Pro Arg Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Lys Asn Gly Asp
245 250 255
Asp Gly Glu Ala Gly Lys Pro Gly Arg Pro Gly Glu Arg Gly Pro Pro
260 265 270
Gly Pro Gln Gly Ala Arg Gly Leu Pro Gly Thr Ala Gly Leu Pro Gly
275 280 285
Met Lys Gly His Arg Gly Phe Ser Gly Leu Asp Gly Ala Lys Gly Asp
290 295 300
Ala Gly Pro Ala Gly Pro Lys Gly Glu Pro Gly Ser Pro Gly Glu Asn
305 310 315 320
Gly Ala Pro Gly Gln Met Gly Pro Arg Gly Leu Pro Gly Glu Arg Gly
325 330 335
Arg Pro Gly Ala Pro Gly Pro Ala Gly Ala Arg Gly Asn Asp Gly Ala
340 345 350
Thr Gly Ala Ala Gly Pro Pro Gly Pro Thr Gly Pro Ala Gly Pro Pro
355 360 365
Gly Phe Pro Gly Ala Val Gly Ala Lys Gly Glu Ala Gly Pro Gln Gly
370 375 380
Pro Arg Gly Ser Glu Gly Pro Gln Gly Val Arg Gly Glu Pro Gly Pro
385 390 395 400
Pro Gly Pro Ala Gly Ala Ala Gly Pro Ala Gly Asn Pro Gly Ala Asp
405 410 415
Gly Gln Pro Gly Ala Lys Gly Ala Asn Gly Ala Pro Gly Ile Ala Gly
420 425 430
Ala Pro Gly Phe Pro Gly Ala Arg Gly Pro Ser Gly Pro Gln Gly Pro
435 440 445
Gly Gly Pro Pro Gly Pro Lys Gly Asn Ser Gly Glu Pro Gly Ala Pro
450 455 460
Gly Ser Lys Gly Asp Thr Gly Ala Lys Gly Glu Pro Gly Pro Val Gly
465 470 475 480
Val Gln Gly Pro Pro Gly Pro Ala Gly Glu Glu Gly Lys Arg Gly Ala
485 490 495
Arg Gly Glu Pro Gly Pro Thr Gly Leu Pro Gly Pro Pro Gly Glu Arg
500 505 510
Gly Gly Pro Gly Ser Arg Gly Phe Pro Gly Ala Asp Gly Val Ala Gly
515 520 525
Pro Lys Gly Pro Ala Gly Glu Arg Gly Ser Pro Gly Pro Ala Gly Pro
530 535 540
Lys Gly Ser Pro Gly Glu Ala Gly Arg Pro Gly Glu Ala Gly Leu Pro
545 550 555 560
Gly Ala Lys Gly Leu Thr Gly Ser Pro Gly Ser Pro Gly Pro Asp Gly
565 570 575
Lys Thr Gly Pro Pro Gly Pro Ala Gly Gln Asp Gly Arg Pro Gly Pro
580 585 590
Pro Gly Pro Pro Gly Ala Arg Gly Gln Ala Gly Val Met Gly Phe Pro
595 600 605
Gly Pro Lys Gly Ala Ala Gly Glu Pro Gly Lys Ala Gly Glu Arg Gly
610 615 620
Val Pro Gly Pro Pro Gly Ala Val Gly Pro Ala Gly Lys Asp Gly Glu
625 630 635 640
Ala Gly Ala Gln Gly Pro Pro Gly Pro Ala Gly Pro Ala Gly Glu Arg
645 650 655
Gly Glu Gln Gly Pro Ala Gly Ser Pro Gly Phe Gln Gly Leu Pro Gly
660 665 670
Pro Ala Gly Pro Pro Gly Glu Ala Gly Lys Pro Gly Glu Gln Gly Val
675 680 685
Pro Gly Asp Leu Gly Ala Pro Gly Pro Ser Gly Ala Arg Gly Glu Arg
690 695 700
Gly Phe Pro Gly Glu Arg Gly Val Gln Gly Pro Pro Gly Pro Ala Gly
705 710 715 720
Pro Arg Gly Ala Asn Gly Ala Pro Gly Asn Asp Gly Ala Lys Gly Asp
725 730 735
Ala Gly Ala Pro Gly Ala Pro Gly Ser Gln Gly Ala Pro Gly Leu Gln
740 745 750
Gly Met Pro Gly Glu Arg Gly Ala Ala Gly Leu Pro Gly Pro Lys Gly
755 760 765
Asp Arg Gly Asp Ala Gly Pro Lys Gly Ala Asp Gly Ser Pro Gly Lys
770 775 780
Asp Gly Val Arg Gly Leu Thr Gly Pro Ile Gly Pro Pro Gly Pro Ala
785 790 795 800
Gly Ala Pro Gly Asp Lys Gly Glu Ser Gly Pro Ser Gly Pro Ala Gly
805 810 815
Pro Thr Gly Ala Arg Gly Ala Pro Gly Asp Arg Gly Glu Pro Gly Pro
820 825 830
Pro Gly Pro Ala Gly Phe Ala Gly Pro Pro Gly Ala Asp Gly Gln Pro
835 840 845
Gly Ala Lys Gly Glu Pro Gly Asp Ala Gly Ala Lys Gly Asp Ala Gly
850 855 860
Pro Pro Gly Pro Ala Gly Pro Ala Gly Pro Pro Gly Pro Ile Gly Asn
865 870 875 880
Val Gly Ala Pro Gly Ala Lys Gly Ala Arg Gly Ser Ala Gly Pro Pro
885 890 895
Gly Ala Thr Gly Phe Pro Gly Ala Ala Gly Arg Val Gly Pro Pro Gly
900 905 910
Pro Ser Gly Asn Ala Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro Ala Gly Lys
915 920 925
Glu Gly Gly Lys Gly Pro Arg Gly Glu Thr Gly Pro Ala Gly Arg Pro
930 935 940
Gly Glu Val Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro Ala Gly Glu Lys Gly
945 950 955 960
Ser Pro Gly Ala Asp Gly Pro Ala Gly Ala Pro Gly Thr Pro Gly Pro
965 970 975
Gln Gly Ile Ala Gly Gln Arg Gly Val Val Gly Leu Pro Gly Gln Arg
980 985 990
Gly Glu Arg Gly Phe Pro Gly Leu Pro Gly Pro Ser Gly Glu Pro Gly
995 1000 1005
Lys Gln Gly Pro Ser Gly Ala Ser Gly Glu Arg Gly Pro Pro Gly
1010 1015 1020
Pro Met Gly Pro Pro Gly Leu Ala Gly Pro Pro Gly Glu Ser Gly
1025 1030 1035
Arg Glu Gly Ala Pro Gly Ala Glu Gly Ser Pro Gly Arg Asp Gly
1040 1045 1050
Ser Pro Gly Ala Lys Gly Asp Arg Gly Glu Thr Gly Pro Ala Gly
1055 1060 1065
Pro Pro Gly Ala Pro Gly Ala Pro Gly Ala Pro Gly Pro Val Gly
1070 1075 1080
Pro Ala Gly Lys Ser Gly Asp Arg Gly Glu Thr Gly Pro Ala Gly
1085 1090 1095
Pro Ala Gly Pro Val Gly Pro Ala Gly Ala Arg Gly Pro Ala Gly
1100 1105 1110
Pro Gln Gly Pro Arg Gly Asp Lys Gly Glu Thr Gly Glu Gln Gly
1115 1120 1125
Asp Arg Gly Ile Lys Gly His Arg Gly Phe Ser Gly Leu Gln Gly
1130 1135 1140
Pro Pro Gly Pro Pro Gly Ser Pro Gly Glu Gln Gly Pro Ser Gly
1145 1150 1155
Ala Ser Gly Pro Ala Gly Pro Arg Gly Pro Pro Gly Ser Ala Gly
1160 1165 1170
Ala Pro Gly Lys Asp Gly Leu Asn Gly Leu Pro Gly Pro Ile Gly
1175 1180 1185
Pro Pro Gly Pro Arg Gly Arg Thr Gly Asp Ala Gly Pro Val Gly
1190 1195 1200
Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Ser
1205 1210 1215
Ala Gly Phe Asp Phe Ser Phe Leu Pro Gln Pro Pro Gln Glu Lys
1220 1225 1230
Ala His Asp Gly Gly Arg Tyr Tyr Arg Ala Asp Asp Ala Asn Val
1235 1240 1245
Val Arg Asp Arg Asp Leu Glu Val Asp Thr Thr Leu Lys Ser Leu
1250 1255 1260
Ser Gln Gln Ile Glu Asn Ile Arg Ser Pro Glu Gly Ser Arg Lys
1265 1270 1275
Asn Pro Ala Arg Thr Cys Arg Asp Leu Lys Met Cys His Ser Asp
1280 1285 1290
Trp Lys Ser Gly Glu Tyr Trp Ile Asp Pro Asn Gln Gly Cys Asn
1295 1300 1305
Leu Asp Ala Ile Lys Val Phe Cys Asn Met Glu Thr Gly Glu Thr
1310 1315 1320
Cys Val Tyr Pro Thr Gln Pro Ser Val Ala Gln Lys Asn Trp Tyr
1325 1330 1335
Ile Ser Lys Asn Pro Lys Asp Lys Arg His Val Trp Phe Gly Glu
1340 1345 1350
Ser Met Thr Asp Gly Phe Gln Phe Glu Tyr Gly Gly Gln Gly Ser
1355 1360 1365
Asp Pro Ala Asp Val Ala Ile Gln Leu Thr Phe Leu Arg Leu Met
1370 1375 1380
Ser Thr Glu Ala Ser Gln Asn Ile Thr Tyr His Cys Lys Asn Ser
1385 1390 1395
Val Ala Tyr Met Asp Gln Gln Thr Gly Asn Leu Lys Lys Ala Leu
1400 1405 1410
Leu Leu Lys Gly Ser Asn Glu Ile Glu Ile Arg Ala Glu Gly Asn
1415 1420 1425
Ser Arg Phe Thr Tyr Ser Val Thr Val Asp Gly Cys Thr Ser His
1430 1435 1440
Thr Gly Ala Trp Gly Lys Thr Val Ile Glu Tyr Lys Thr Thr Lys
1445 1450 1455
Thr Ser Arg Leu Pro Ile Ile Asp Val Ala Pro Leu Asp Val Gly
1460 1465 1470
Ala Pro Asp Gln Glu Phe Gly Phe Asp Val Gly Pro Val Cys Phe
1475 1480 1485
Leu
<210>4
<211>4362
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>含有与人胶原α2(I)链融合的大麦巯基蛋白酶aleurain前体基因的维管信号序列
编码区和侧翼区的合成序列
<400>4
gcgatgcatg taatgtcatg agccacatga tccaatggcc acaggaacgt aagaatgtag 60
atagatttga ttttgtccgt tagatagcaa acaacattat aaaaggtgtg tatcaatacg 120
aactaattca ctcattggat tcatagaagt ccattcctcc taagtatcta aaccatggct 180
cacgctcgtg ttctcctcct cgctctcgct gttttggcaa cagctgctgt ggctgtggct 240
tcaagttcta gttttgctga ttccaaccca attcgtccag ttactgatag agcagcttcc 300
actttggctc aattgcttca agaagaaact gtgaggaagg gccctgctgg cgataggggc 360
cctaggggcg aaaggggtcc accaggacct ccaggcaggg atggcgaaga tggtccaact 420
ggccctcctg gacctcctgg ccctccaggg ccacccggct tgggcggaaa cttcgcagct 480
caatacgatg gcaagggtgt tggtcttggt cctggtccta tgggcttgat gggacctaga 540
ggcccacctg gtgctgctgg tgctcctgga ccacagggtt ttcagggacc agctggcgag 600
ccaggagagc caggccaaac aggaccagct ggtgcaaggg gacctgctgg acctcctgga 660
aaagctggtg aagatggtca cccaggcaaa ccaggacgtc ctggcgaaag aggtgttgtt 720
ggaccacaag gcgctagggg atttccaggt acacctggat tgccaggttt taagggcatt 780
cgtggtcata acggcctcga tggattgaag ggacagcctg gcgcacctgg cgttaagggt 840
gaacctggag caccaggtga aaacggtact cctggccaga ctggtgcaag aggactccca 900
ggtgaaaggg gtagagttgg tgctcctgga cctgctggag ctaggggtag tgatggtagt 960
gttggtcctg tgggccctgc tggtccaatc ggttccgctg gcccacctgg attcccaggc 1020
gctccaggac ctaaaggaga aatcggtgct gtgggtaacg caggtcctac tggtccagca 1080
ggtcctcgtg gagaagtggg attgccagga ctttctggtc cagtgggccc tccaggcaac 1140
cctggagcta acggcttgac aggagctaaa ggcgcagcag gactccctgg agtggctggc 1200
gcaccaggat tgcctggtcc aaggggtatc ccaggccctg ttggcgcagc tggagctact 1260
ggtgcacgtg gacttgttgg cgaaccaggc cctgctggat caaaaggcga gtctggaaat 1320
aagggagaac ctggttctgc tggacctcaa ggtcctcctg gaccttctgg agaagaagga 1380
aaaaggggac caaatggcga ggctggatca gcaggtccac caggaccacc tggacttcgt 1440
ggatcccctg gtagtagagg acttccaggc gctgatggta gagcaggcgt tatgggacca 1500
ccaggaagta gaggagcatc cggtccagca ggagttaggg gtcctaacgg agatgctggt 1560
agaccaggtg aaccaggtct tatgggccca aggggcctcc caggtagtcc aggaaatatc 1620
ggccctgctg gaaaagaagg ccctgttgga cttccaggta ttgatggacg tcctggccct 1680
attggcccag caggtgcaag aggagaacct ggcaatattg gatttccagg accaaagggt 1740
ccaacaggcg atcctggaaa aaatggagat aagggtcatg ctggattggc aggcgcaagg 1800
ggcgctcctg gtccagatgg aaacaacggc gcacagggtc cacctggccc tcagggtgtt 1860
caaggcggaa aaggcgaaca aggcccagct ggaccaccag gctttcaagg cttgccagga 1920
ccaagtggtc cagcaggtga agttggcaag ccaggcgagc gtggacttca tggcgagttt 1980
ggactccctg gaccagcagg accaaggggt gaaagaggcc ctcctggaga gagtggcgct 2040
gctggaccaa caggcccaat cggtagtaga ggtcctagtg gacctccagg cccagatgga 2100
aataagggtg aaccaggagt tgtgggcgct gttggaacag ctggtccttc aggaccatca 2160
ggactcccag gcgagagagg cgctgctggc attcctggag gaaaaggtga aaaaggcgaa 2220
cctggcctcc gtggcgaaat cggaaatcct ggacgtgatg gtgctcgtgg tgcacacggc 2280
gctgtgggcg ctccaggccc tgctggtgct actggtgata gaggagaggc tggcgcagct 2340
ggcccagcag gtcctgctgg cccaaggggt agtcctggtg aaagaggcga agttggacct 2400
gctggcccta acggctttgc tggccctgct ggagcagcag gtcaacctgg cgctaaaggt 2460
gaaaggggcg gaaagggccc aaaaggtgaa aatggcgttg tgggaccaac tggtccagtg 2520
ggcgcagctg gacctgctgg tccaaatgga ccaccaggac cagcaggtag tagaggagat 2580
ggtggacctc caggaatgac aggttttcca ggtgctgctg gtagaacagg acctcctggt 2640
cctagtggta tttctggtcc accaggacca ccaggtcctg ctggaaaaga aggattgagg 2700
ggtccacgtg gtgatcaagg accagtgggc agaactggtg aagttggcgc agtgggacca 2760
cctggttttg ctggagaaaa gggcccttct ggagaggcag gaacagctgg tcctcctggt 2820
acacctggac ctcaaggact tttgggtgca cctggtattc tcggattgcc aggaagtagg 2880
ggcgaacgtg gacttcctgg cgtggcagga gcagttggag aacctggccc tctcggaatc 2940
gcaggcccac caggcgcaag aggaccacca ggagctgttg gatcaccagg cgtgaatggt 3000
gcacctggcg aggctggtcg tgatggaaac ccaggaaatg atggcccacc aggaagagat 3060
ggtcaacctg gacacaaagg cgagaggggc tacccaggaa atattggccc agttggtgct 3120
gctggcgcac caggcccaca cggtccagtt ggaccagcag gaaaacacgg taatcgtggc 3180
gaaacaggcc cttcaggccc agtgggacct gctggtgctg ttggcccaag aggaccatct 3240
ggacctcaag gcattagagg cgataaggga gagcctggcg aaaaaggacc tagaggcttg 3300
cctggtttta aaggacacaa cggtctccaa ggacttccag gtatcgctgg tcatcatgga 3360
gatcagggtg ctcctggatc agtgggtcca gcaggtccta gaggcccagc aggcccttcc 3420
ggtccagcag gaaaggatgg acgtactggc caccctggaa ctgtgggccc tgctggaatt 3480
agaggtcctc aaggtcatca gggccctgct ggccctccag gtccaccagg tcctccaggc 3540
ccaccaggag tttcaggtgg tggttacgat tttggttacg atggtgattt ttaccgtgct 3600
gatcaaccta gaagtgctcc ttctctccgt cctaaagatt atgaagttga tgctactttg 3660
aaatcactta acaaccagat tgagactctt ctcacacctg agggatcaag aaagaatcca 3720
gcacgtacat gccgtgatct cagacttagt cacccagagt ggtcaagtgg ctattattgg 3780
attgatccta atcagggttg tacaatggag gctatcaaag tttactgtga ttttccaact 3840
ggagagacat gtattagggc acaacctgag aacattccag ctaaaaattg gtatcgttcc 3900
tctaaagata agaaacatgt ttggctcgga gagactatta acgctggttc tcagttcgag 3960
tataatgttg agggcgttac ttctaaagag atggcaactc agctcgcttt tatgagattg 4020
ctcgctaact acgcatccca aaacatcact tatcactgca aaaattccat tgcatatatg 4080
gatgaggaga caggaaattt gaagaaagca gttattctcc aaggtagtaa cgatgttgag 4140
cttgtggctg agggaaatag tagattcact tacacagttt tggtggatgg atgctcaaag 4200
aaaactaatg agtggggcaa gacaatcatt gagtacaaga caaataagcc ttctaggctc 4260
ccatttctcg atattgcacc tcttgatatc ggaggagctg atcacgagtt ttttgttgat 4320
atcggacctg tttgttttaa gtaatgagct cgcggccgca tc 4362
<210>5
<211>4362
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>与人胶原α2(I)链融合的大麦巯基蛋白酶aleurain前体基因的维管信号序列和侧
翼区的合成序列
<220>
<221>CDS
<222>(175)..(4344)
<400>5
gcgatgcatg taatgtcatg agccacatga tccaatggcc acaggaacgt aagaatgtag 60
atagatttga ttttgtccgt tagatagcaa acaacattat aaaaggtgtg tatcaatacg 120
aactaattca ctcattggat tcatagaagt ccattcctcc taagtatcta aacc atg 177
Met
1
gct cac gct cgt gtt ctc ctc ctc gct ctc gct gtt ttg gca aca gct 225
Ala His Ala Arg Val Leu Leu Leu Ala Leu Ala Val Leu Ala Thr Ala
5 10 15
gct gtg gct gtg gct tca agt tct agt ttt gct gat tcc aac cca att 273
Ala Val Ala Val Ala Ser Ser Ser Ser Phe Ala Asp Ser Asn Pro Ile
20 25 30
cgt cca gtt act gat aga gca gct tcc act ttg gct caa ttg ctt caa 321
Arg Pro Val Thr Asp Arg Ala Ala Ser Thr Leu Ala Gln Leu Leu Gln
35 40 45
gaa gaa act gtg agg aag ggc cct gct ggc gat agg ggc cct agg ggc 369
Glu Glu Thr Val Arg Lys Gly Pro Ala Gly Asp Arg Gly Pro Arg Gly
50 55 60 65
gaa agg ggt cca cca gga cct cca ggc agg gat ggc gaa gat ggt cca 417
Glu Arg Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Arg Asp Gly Glu Asp Gly Pro
70 75 80
act ggc cct cct gga cct cct ggc cct cca ggg cca ccc ggc ttg ggc 465
Thr Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Leu Gly
85 90 95
gga aac ttc gca gct caa tac gat ggc aag ggt gtt ggt ctt ggt cct 513
Gly Asn Phe Ala Ala Gln Tyr Asp Gly Lys Gly Val Gly Leu Gly Pro
100 105 110
ggt cct atg ggc ttg atg gga cct aga ggc cca cct ggt gct gct ggt 561
Gly Pro Met Gly Leu Met Gly Pro Arg Gly Pro Pro Gly Ala Ala Gly
115 120 125
gct cct gga cca cag ggt ttt cag gga cca gct ggc gag cca gga gag 609
Ala Pro Gly Pro Gln Gly Phe Gln Gly Pro Ala Gly Glu Pro Gly Glu
130 135 140 145
cca ggc caa aca gga cca gct ggt gca agg gga cct gct gga cct cct 657
Pro Gly Gln Thr Gly Pro Ala Gly Ala Arg Gly Pro Ala Gly Pro Pro
150 155 160
gga aaa gct ggt gaa gat ggt cac cca ggc aaa cca gga cgt cct ggc 705
Gly Lys Ala Gly Glu Asp Gly His Pro Gly Lys Pro Gly Arg Pro Gly
165 170 175
gaa aga ggt gtt gtt gga cca caa ggc gct agg gga ttt cca ggt aca 753
Glu Arg Gly Val Val Gly Pro Gln Gly Ala Arg Gly Phe Pro Gly Thr
180 185 190
cct gga ttg cca ggt ttt aag ggc att cgt ggt cat aac ggc ctc gat 801
Pro Gly Leu Pro Gly Phe Lys Gly Ile Arg Gly His Asn Gly Leu Asp
195 200 205
gga ttg aag gga cag cct ggc gca cct ggc gtt aag ggt gaa cct gga 849
Gly Leu Lys Gly Gln Pro Gly Ala Pro Gly Val Lys Gly Glu Pro Gly
210 215 220 225
gca cca ggt gaa aac ggt act cct ggc cag act ggt gca aga gga ctc 897
Ala Pro Gly Glu Asn Gly Thr Pro Gly Gln Thr Gly Ala Arg Gly Leu
230 235 240
cca ggt gaa agg ggt aga gtt ggt gct cct gga cct gct gga gct agg 945
Pro Gly Glu Arg Gly Arg Val Gly Ala Pro Gly Pro Ala Gly Ala Arg
245 250 255
ggt agt gat ggt agt gtt ggt cct gtg ggc cct gct ggt cca atc ggt 993
Gly Ser Asp Gly Ser Val Gly Pro Val Gly Pro Ala Gly Pro Ile Gly
260 265 270
tcc gct ggc cca cct gga ttc cca ggc gct cca gga cct aaa gga gaa 1041
Ser Ala Gly Pro Pro Gly Phe Pro Gly Ala Pro Gly Pro Lys Gly Glu
275 280 285
atc ggt gct gtg ggt aac gca ggt cct act ggt cca gca ggt cct cgt 1089
Ile Gly Ala Val Gly Asn Ala Gly Pro Thr Gly Pro Ala Gly Pro Arg
290 295 300 305
gga gaa gtg gga ttg cca gga ctt tct ggt cca gtg ggc cct cca ggc 1137
Gly Glu Val Gly Leu Pro Gly Leu Ser Gly Pro Val Gly Pro Pro Gly
310 315 320
aac cct gga gct aac ggc ttg aca gga gct aaa ggc gca gca gga ctc 1185
Asn Pro Gly Ala Asn Gly Leu Thr Gly Ala Lys Gly Ala Ala Gly Leu
325 330 335
cct gga gtg gct ggc gca cca gga ttg cct ggt cca agg ggt atc cca 1233
Pro Gly Val Ala Gly Ala Pro Gly Leu Pro Gly Pro Arg Gly Ile Pro
340 345 350
ggc cct gtt ggc gca gct gga gct act ggt gca cgt gga ctt gtt ggc 1281
Gly Pro Val Gly Ala Ala Gly Ala Thr Gly Ala Arg Gly Leu Val Gly
355 360 365
gaa cca ggc cct gct gga tca aaa ggc gag tct gga aat aag gga gaa 1329
Glu Pro Gly Pro Ala Gly Ser Lys Gly Glu Ser Gly Asn Lys Gly Glu
370 375 380 385
cct ggt tct gct gga cct caa ggt cct cct gga cct tct gga gaa gaa 1377
Pro Gly Ser Ala Gly Pro Gln Gly Pro Pro Gly Pro Ser Gly Glu Glu
390 395 400
gga aaa agg gga cca aat ggc gag gct gga tca gca ggt cca cca gga 1425
Gly Lys Arg Gly Pro Asn Gly Glu Ala Gly Ser Ala Gly Pro Pro Gly
405 410 415
cca cct gga ctt cgt gga tcc cct ggt agt aga gga ctt cca ggc gct 1473
Pro Pro Gly Leu Arg Gly Ser Pro Gly Ser Arg Gly Leu Pro Gly Ala
420 425 430
gat ggt aga gca ggc gtt atg gga cca cca gga agt aga gga gca tcc 1521
Asp Gly Arg Ala Gly Val Met Gly Pro Pro Gly Ser Arg Gly Ala Ser
435 440 445
ggt cca gca gga gtt agg ggt cct aac gga gat gct ggt aga cca ggt 1569
Gly Pro Ala Gly Val Arg Gly Pro Asn Gly Asp Ala Gly Arg Pro Gly
450 455 460 465
gaa cca ggt ctt atg ggc cca agg ggc ctc cca ggt agt cca gga aat 1617
Glu Pro Gly Leu Met Gly Pro Arg Gly Leu Pro Gly Ser Pro Gly Asn
470 475 480
atc ggc cct gct gga aaa gaa ggc cct gtt gga ctt cca ggt att gat 1665
Ile Gly Pro Ala Gly Lys Glu Gly Pro Val Gly Leu Pro Gly Ile Asp
485 490 495
gga cgt cct ggc cct att ggc cca gca ggt gca aga gga gaa cct ggc 1713
Gly Arg Pro Gly Pro Ile Gly Pro Ala Gly Ala Arg Gly Glu Pro Gly
500 505 510
aat att gga ttt cca gga cca aag ggt cca aca ggc gat cct gga aaa 1761
Asn Ile Gly Phe Pro Gly Pro Lys Gly Pro Thr Gly Asp Pro Gly Lys
515 520 525
aat gga gat aag ggt cat gct gga ttg gca ggc gca agg ggc gct cct 1809
Asn Gly Asp Lys Gly His Ala Gly Leu Ala Gly Ala Arg Gly Ala Pro
530 535 540 545
ggt cca gat gga aac aac ggc gca cag ggt cca cct ggc cct cag ggt 1857
Gly Pro Asp Gly Asn Asn Gly Ala Gln Gly Pro Pro Gly Pro Gln Gly
550 555 560
gtt caa ggc gga aaa ggc gaa caa ggc cca gct gga cca cca ggc ttt 1905
Val Gln Gly Gly Lys Gly Glu Gln Gly Pro Ala Gly Pro Pro Gly Phe
565 570 575
caa ggc ttg cca gga cca agt ggt cca gca ggt gaa gtt ggc aag cca 1953
Gln Gly Leu Pro Gly Pro Ser Gly Pro Ala Gly Glu Val Gly Lys Pro
580 585 590
ggc gag cgt gga ctt cat ggc gag ttt gga ctc cct gga cca gca gga 2001
Gly Glu Arg Gly Leu His Gly Glu Phe Gly Leu Pro Gly Pro Ala Gly
595 600 605
cca agg ggt gaa aga ggc cct cct gga gag agt ggc gct gct gga cca 2049
Pro Arg Gly Glu Arg Gly Pro Pro Gly Glu Ser Gly Ala Ala Gly Pro
610 615 620 625
aca ggc cca atc ggt agt aga ggt cct agt gga cct cca ggc cca gat 2097
Thr Gly Pro Ile Gly Ser Arg Gly Pro Ser Gly Pro Pro Gly Pro Asp
630 635 640
gga aat aag ggt gaa cca gga gtt gtg ggc gct gtt gga aca gct ggt 2145
Gly Asn Lys Gly Glu Pro Gly Val Val Gly Ala Val Gly Thr Ala Gly
645 650 655
cct tca gga cca tca gga ctc cca ggc gag aga ggc gct gct ggc att 2193
Pro Ser Gly Pro Ser Gly Leu Pro Gly Glu Arg Gly Ala Ala Gly Ile
660 665 670
cct gga gga aaa ggt gaa aaa ggc gaa cct ggc ctc cgt ggc gaa atc 2241
Pro Gly Gly Lys Gly Glu Lys Gly Glu Pro Gly Leu Arg Gly Glu Ile
675 680 685
gga aat cct gga cgt gat ggt gct cgt ggt gca cac ggc gct gtg ggc 2289
Gly Asn Pro Gly Arg Asp Gly Ala Arg Gly Ala His Gly Ala Val Gly
690 695 700 705
gct cca ggc cct gct ggt gct act ggt gat aga gga gag gct ggc gca 2337
Ala Pro Gly Pro Ala Gly Ala Thr Gly Asp Arg Gly Glu Ala Gly Ala
710 715 720
gct ggc cca gca ggt cct gct ggc cca agg ggt agt cct ggt gaa aga 2385
Ala Gly Pro Ala Gly Pro Ala Gly Pro Arg Gly Ser Pro Gly Glu Arg
725 730 735
ggc gaa gtt gga cct gct ggc cct aac ggc ttt gct ggc cct gct gga 2433
Gly Glu Val Gly Pro Ala Gly Pro Asn Gly Phe Ala Gly Pro Ala Gly
740 745 750
gca gca ggt caa cct ggc gct aaa ggt gaa agg ggc gga aag ggc cca 2481
Ala Ala Gly Gln Pro Gly Ala Lys Gly Glu Arg Gly Gly Lys Gly Pro
755 760 765
aaa ggt gaa aat ggc gtt gtg gga cca act ggt cca gtg ggc gca gct 2529
Lys Gly Glu Asn Gly Val Val Gly Pro Thr Gly Pro Val Gly Ala Ala
770 775 780 785
gga cct gct ggt cca aat gga cca cca gga cca gca ggt agt aga gga 2577
Gly Pro Ala Gly Pro Asn Gly Pro Pro Gly Pro Ala Gly Ser Arg Gly
790 795 800
gat ggt gga cct cca gga atg aca ggt ttt cca ggt gct gct ggt aga 2625
Asp Gly Gly Pro Pro Gly Met Thr Gly Phe Pro Gly Ala Ala Gly Arg
805 810 815
aca gga cct cct ggt cct agt ggt att tct ggt cca cca gga cca cca 2673
Thr Gly Pro Pro Gly Pro Ser Gly Ile Ser Gly Pro Pro Gly Pro Pro
820 825 830
ggt cct gct gga aaa gaa gga ttg agg ggt cca cgt ggt gat caa gga 2721
Gly Pro Ala Gly Lys Glu Gly Leu Arg Gly Pro Arg Gly Asp Gln Gly
835 840 845
cca gtg ggc aga act ggt gaa gtt ggc gca gtg gga cca cct ggt ttt 2769
Pro Val Gly Arg Thr Gly Glu Val Gly Ala Val Gly Pro Pro Gly Phe
850 855 860 865
gct gga gaa aag ggc cct tct gga gag gca gga aca gct ggt cct cct 2817
Ala Gly Glu Lys Gly Pro Ser Gly Glu Ala Gly Thr Ala Gly Pro Pro
870 875 880
ggt aca cct gga cct caa gga ctt ttg ggt gca cct ggt att ctc gga 2865
Gly Thr Pro Gly Pro Gln Gly Leu Leu Gly Ala Pro Gly Ile Leu Gly
885 890 895
ttg cca gga agt agg ggc gaa cgt gga ctt cct ggc gtg gca gga gca 2913
Leu Pro Gly Ser Arg Gly Glu Arg Gly Leu Pro Gly Val Ala Gly Ala
900 905 910
gtt gga gaa cct ggc cct ctc gga atc gca ggc cca cca ggc gca aga 2961
Val Gly Glu Pro Gly Pro Leu Gly Ile Ala Gly Pro Pro Gly Ala Arg
915 920 925
gga cca cca gga gct gtt gga tca cca ggc gtg aat ggt gca cct ggc 3009
Gly Pro Pro Gly Ala Val Gly Ser Pro Gly Val Asn Gly Ala Pro Gly
930 935 940 945
gag gct ggt cgt gat gga aac cca gga aat gat ggc cca cca gga aga 3057
Glu Ala Gly Arg Asp Gly Asn Pro Gly Asn Asp Gly Pro Pro Gly Arg
950 955 960
gat ggt caa cct gga cac aaa ggc gag agg ggc tac cca gga aat att 3105
Asp Gly Gln Pro Gly His Lys Gly Glu Arg Gly Tyr Pro Gly Asn Ile
965 970 975
ggc cca gtt ggt gct gct ggc gca cca ggc cca cac ggt cca gtt gga 3153
Gly Pro Val Gly Ala Ala Gly Ala Pro Gly Pro His Gly Pro Val Gly
980 985 990
cca gca gga aaa cac ggt aat cgt ggc gaa aca ggc cct tca ggc cca 3201
Pro Ala Gly Lys His Gly Asn Arg Gly Glu Thr Gly Pro Ser Gly Pro
995 1000 1005
gtg gga cct gct ggt gct gtt ggc cca aga gga cca tct gga cct 3246
Val Gly Pro Ala Gly Ala Val Gly Pro Arg Gly Pro Ser Gly Pro
1010 1015 1020
caa ggc att aga ggc gat aag gga gag cct ggc gaa aaa gga cct 3291
Gln Gly Ile Arg Gly Asp Lys Gly Glu Pro Gly Glu Lys Gly Pro
1025 1030 1035
aga ggc ttg cct ggt ttt aaa gga cac aac ggt ctc caa gga ctt 3336
Arg Gly Leu Pro Gly Phe Lys Gly His Asn Gly Leu Gln Gly Leu
1040 1045 1050
cca ggt atc gct ggt cat cat gga gat cag ggt gct cct gga tca 3381
Pro Gly Ile Ala Gly His His Gly Asp Gln Gly Ala Pro Gly Ser
1055 1060 1065
gtg ggt cca gca ggt cct aga ggc cca gca ggc cct tcc ggt cca 3426
Val Gly Pro Ala Gly Pro Arg Gly Pro Ala Gly Pro Ser Gly Pro
1070 1075 1080
gca gga aag gat gga cgt act ggc cac cct gga act gtg ggc cct 3471
Ala Gly Lys Asp Gly Arg Thr Gly His Pro Gly Thr Val Gly Pro
1085 1090 1095
gct gga att aga ggt cct caa ggt cat cag ggc cct gct ggc cct 3516
Ala Gly Ile Arg Gly Pro Gln Gly His Gln Gly Pro Ala Gly Pro
1100 1105 1110
cca ggt cca cca ggt cct cca ggc cca cca gga gtt tca ggt ggt 3561
Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Val Ser Gly Gly
1115 1120 1125
ggt tac gat ttt ggt tac gat ggt gat ttt tac cgt gct gat caa 3606
Gly Tyr Asp Phe Gly Tyr Asp Gly Asp Phe Tyr Arg Ala Asp Gln
1130 1135 1140
cct aga agt gct cct tct ctc cgt cct aaa gat tat gaa gtt gat 3651
Pro Arg Ser Ala Pro Ser Leu Arg Pro Lys Asp Tyr Glu Val Asp
1145 1150 1155
gct act ttg aaa tca ctt aac aac cag att gag act ctt ctc aca 3696
Ala Thr Leu Lys Ser Leu Asn Asn Gln Ile Glu Thr Leu Leu Thr
1160 1165 1170
cct gag gga tca aga aag aat cca gca cgt aca tgc cgt gat ctc 3741
Pro Glu Gly Ser Arg Lys Asn Pro Ala Arg Thr Cys Arg Asp Leu
1175 1180 1185
aga ctt agt cac cca gag tgg tca agt ggc tat tat tgg att gat 3786
Arg Leu Ser His Pro Glu Trp Ser Ser Gly Tyr Tyr Trp Ile Asp
1190 1195 1200
cct aat cag ggt tgt aca atg gag gct atc aaa gtt tac tgt gat 3831
Pro Asn Gln Gly Cys Thr Met Glu Ala Ile Lys Val Tyr Cys Asp
1205 1210 1215
ttt cca act gga gag aca tgt att agg gca caa cct gag aac att 3876
Phe Pro Thr Gly Glu Thr Cys Ile Arg Ala Gln Pro Glu Asn Ile
1220 1225 1230
cca gct aaa aat tgg tat cgt tcc tct aaa gat aag aaa cat gtt 3921
Pro Ala Lys Asn Trp Tyr Arg Ser Ser Lys Asp Lys Lys His Val
1235 1240 1245
tgg ctc gga gag act att aac gct ggt tct cag ttc gag tat aat 3966
Trp Leu Gly Glu Thr Ile Asn Ala Gly Ser Gln Phe Glu Tyr Asn
1250 1255 1260
gtt gag ggc gtt act tct aaa gag atg gca act cag ctc gct ttt 4011
Val Glu Gly Val Thr Ser Lys Glu Met Ala Thr Gln Leu Ala Phe
1265 1270 1275
atg aga ttg ctc gct aac tac gca tcc caa aac atc act tat cac 4056
Met Arg Leu Leu Ala Asn Tyr Ala Ser Gln Asn Ile Thr Tyr His
1280 1285 1290
tgc aaa aat tcc att gca tat atg gat gag gag aca gga aat ttg 4101
Cys Lys Asn Ser Ile Ala Tyr Met Asp Glu Glu Thr Gly Asn Leu
1295 1300 1305
aag aaa gca gtt att ctc caa ggt agt aac gat gtt gag ctt gtg 4146
Lys Lys Ala Val Ile Leu Gln Gly Ser Asn Asp Val Glu Leu Val
1310 1315 1320
gct gag gga aat agt aga ttc act tac aca gtt ttg gtg gat gga 4191
Ala Glu Gly Asn Ser Arg Phe Thr Tyr Thr Val Leu Val Asp Gly
1325 1330 1335
tgc tca aag aaa act aat gag tgg ggc aag aca atc att gag tac 4236
Cys Ser Lys Lys Thr Asn Glu Trp Gly Lys Thr Ile Ile Glu Tyr
1340 1345 1350
aag aca aat aag cct tct agg ctc cca ttt ctc gat att gca cct 4281
Lys Thr Asn Lys Pro Ser Arg Leu Pro Phe Leu Asp Ile Ala Pro
1355 1360 1365
ctt gat atc gga gga gct gat cac gag ttt ttt gtt gat atc gga 4326
Leu Asp Ile Gly Gly Ala Asp His Glu Phe Phe Val Asp Ile Gly
1370 1375 1380
cct gtt tgt ttt aag taa tgagctcgcg gccgcatc 4362
Pro Val Cys Phe Lys
1385
<210>6
<211>1389
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>含有与人胶原α2(I)链融合的大麦巯基蛋白酶aleurain前体基因的维管信号序列
编码区和侧翼区的合成序列
<400>6
Met Ala His Ala Arg Val Leu Leu Leu Ala Leu Ala Val Leu Ala Thr
1 5 10 15
Ala Ala Val Ala Val Ala Ser Ser Ser Ser Phe Ala Asp Ser Asn Pro
20 25 30
Ile Arg Pro Val Thr Asp Arg Ala Ala Ser Thr Leu Ala Gln Leu Leu
35 40 45
Gln Glu Glu Thr Val Arg Lys Gly Pro Ala Gly Asp Arg Gly Pro Arg
50 55 60
Gly Glu Arg Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Arg Asp Gly Glu Asp Gly
65 70 75 80
Pro Thr Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Leu
85 90 95
Gly Gly Asn Phe Ala Ala Gln Tyr Asp Gly Lys Gly Val Gly Leu Gly
100 105 110
Pro Gly Pro Met Gly Leu Met Gly Pro Arg Gly Pro Pro Gly Ala Ala
115 120 125
Gly Ala Pro Gly Pro Gln Gly Phe Gln Gly Pro Ala Gly Glu Pro Gly
130 135 140
Glu Pro Gly Gln Thr Gly Pro Ala Gly Ala Arg Gly Pro Ala Gly Pro
145 150 155 160
Pro Gly Lys Ala Gly Glu Asp Gly His Pro Gly Lys Pro Gly Arg Pro
165 170 175
Gly Glu Arg Gly Val Val Gly Pro Gln Gly Ala Arg Gly Phe Pro Gly
180 185 190
Thr Pro Gly Leu Pro Gly Phe Lys Gly Ile Arg Gly His Asn Gly Leu
195 200 205
Asp Gly Leu Lys Gly Gln Pro Gly Ala Pro Gly Val Lys Gly Glu Pro
210 215 220
Gly Ala Pro Gly Glu Asn Gly Thr Pro Gly Gln Thr Gly Ala Arg Gly
225 230 235 240
Leu Pro Gly Glu Arg Gly Arg Val Gly Ala Pro Gly Pro Ala Gly Ala
245 250 255
Arg Gly Ser Asp Gly Ser Val Gly Pro Val Gly Pro Ala Gly Pro Ile
260 265 270
Gly Ser Ala Gly Pro Pro Gly Phe Pro Gly Ala Pro Gly Pro Lys Gly
275 280 285
Glu Ile Gly Ala Val Gly Asn Ala Gly Pro Thr Gly Pro Ala Gly Pro
290 295 300
Arg Gly Glu Val Gly Leu Pro Gly Leu Ser Gly Pro Val Gly Pro Pro
305 310 315 320
Gly Asn Pro Gly Ala Asn Gly Leu Thr Gly Ala Lys Gly Ala Ala Gly
325 330 335
Leu Pro Gly Val Ala Gly Ala Pro Gly Leu Pro Gly Pro Arg Gly Ile
340 345 350
Pro Gly Pro Val Gly Ala Ala Gly Ala Thr Gly Ala Arg Gly Leu Val
355 360 365
Gly Glu Pro Gly Pro Ala Gly Ser Lys Gly Glu Ser Gly Asn Lys Gly
370 375 380
Glu Pro Gly Ser Ala Gly Pro Gln Gly Pro Pro Gly Pro Ser Gly Glu
385 390 395 400
Glu Gly Lys Arg Gly Pro Asn Gly Glu Ala Gly Ser Ala Gly Pro Pro
405 410 415
Gly Pro Pro Gly Leu Arg Gly Ser Pro Gly Ser Arg Gly Leu Pro Gly
420 425 430
Ala Asp Gly Arg Ala Gly Val Met Gly Pro Pro Gly Ser Arg Gly Ala
435 440 445
Ser Gly Pro Ala Gly Val Arg Gly Pro Asn Gly Asp Ala Gly Arg Pro
450 455 460
Gly Glu Pro Gly Leu Met Gly Pro Arg Gly Leu Pro Gly Ser Pro Gly
465 470 475 480
Asn Ile Gly Pro Ala Gly Lys Glu Gly Pro Val Gly Leu Pro Gly Ile
485 490 495
Asp Gly Arg Pro Gly Pro Ile Gly Pro Ala Gly Ala Arg Gly Glu Pro
500 505 510
Gly Asn Ile Gly Phe Pro Gly Pro Lys Gly Pro Thr Gly Asp Pro Gly
515 520 525
Lys Asn Gly Asp Lys Gly His Ala Gly Leu Ala Gly Ala Arg Gly Ala
530 535 540
Pro Gly Pro Asp Gly Asn Asn Gly Ala Gln Gly Pro Pro Gly Pro Gln
545 550 555 560
Gly Val Gln Gly Gly Lys Gly Glu Gln Gly Pro Ala Gly Pro Pro Gly
565 570 575
Phe Gln Gly Leu Pro Gly Pro Ser Gly Pro Ala Gly Glu Val Gly Lys
580 585 590
Pro Gly Glu Arg Gly Leu His Gly Glu Phe Gly Leu Pro Gly Pro Ala
595 600 605
Gly Pro Arg Gly Glu Arg Gly Pro Pro Gly Glu Ser Gly Ala Ala Gly
610 615 620
Pro Thr Gly Pro Ile Gly Ser Arg Gly Pro Ser Gly Pro Pro Gly Pro
625 630 635 640
Asp Gly Asn Lys Gly Glu Pro Gly Val Val Gly Ala Val Gly Thr Ala
645 650 655
Gly Pro Ser Gly Pro Ser Gly Leu Pro Gly Glu Arg Gly Ala Ala Gly
660 665 670
Ile Pro Gly Gly Lys Gly Glu Lys Gly Glu Pro Gly Leu Arg Gly Glu
675 680 685
Ile Gly Asn Pro Gly Arg Asp Gly Ala Arg Gly Ala His Gly Ala Val
690 695 700
Gly Ala Pro Gly Pro Ala Gly Ala Thr Gly Asp Arg Gly Glu Ala Gly
705 710 715 720
Ala Ala Gly Pro Ala Gly Pro Ala Gly Pro Arg Gly Ser Pro Gly Glu
725 730 735
Arg Gly Glu Val Gly Pro Ala Gly Pro Asn Gly Phe Ala Gly Pro Ala
740 745 750
Gly Ala Ala Gly Gln Pro Gly Ala Lys Gly Glu Arg Gly Gly Lys Gly
755 760 765
Pro Lys Gly Glu Asn Gly Val Val Gly Pro Thr Gly Pro Val Gly Ala
770 775 780
Ala Gly Pro Ala Gly Pro Asn Gly Pro Pro Gly Pro Ala Gly Ser Arg
785 790 795 800
Gly Asp Gly Gly Pro Pro Gly Met Thr Gly Phe Pro Gly Ala Ala Gly
805 810 815
Arg Thr Gly Pro Pro Gly Pro Ser Gly Ile Ser Gly Pro Pro Gly Pro
820 825 830
Pro Gly Pro Ala Gly Lys Glu Gly Leu Arg Gly Pro Arg Gly Asp Gln
835 840 845
Gly Pro Val Gly Arg Thr Gly Glu Val Gly Ala Val Gly Pro Pro Gly
850 855 860
Phe Ala Gly Glu Lys Gly Pro Ser Gly Glu Ala Gly Thr Ala Gly Pro
865 870 875 880
Pro Gly Thr Pro Gly Pro Gln Gly Leu Leu Gly Ala Pro Gly Ile Leu
885 890 895
Gly Leu Pro Gly Ser Arg Gly Glu Arg Gly Leu Pro Gly Val Ala Gly
900 905 910
Ala Val Gly Glu Pro Gly Pro Leu Gly Ile Ala Gly Pro Pro Gly Ala
915 920 925
Arg Gly Pro Pro Gly Ala Val Gly Ser Pro Gly Val Asn Gly Ala Pro
930 935 940
Gly Glu Ala Gly Arg Asp Gly Asn Pro Gly Asn Asp Gly Pro Pro Gly
945 950 955 960
Arg Asp Gly Gln Pro Gly His Lys Gly Glu Arg Gly Tyr Pro Gly Asn
965 970 975
Ile Gly Pro Val Gly Ala Ala Gly Ala Pro Gly Pro His Gly Pro Val
980 985 990
Gly Pro Ala Gly Lys His Gly Asn Arg Gly Glu Thr Gly Pro Ser Gly
995 1000 1005
Pro Val Gly Pro Ala Gly Ala Val Gly Pro Arg Gly Pro Ser Gly
1010 1015 1020
Pro Gln Gly Ile Arg Gly Asp Lys Gly Glu Pro Gly Glu Lys Gly
1025 1030 1035
Pro Arg Gly Leu Pro Gly Phe Lys Gly His Asn Gly Leu Gln Gly
1040 1045 1050
Leu Pro Gly Ile Ala Gly His His Gly Asp Gln Gly Ala Pro Gly
1055 1060 1065
Ser Val Gly Pro Ala Gly Pro Arg Gly Pro Ala Gly Pro Ser Gly
1070 1075 1080
Pro Ala Gly Lys Asp Gly Arg Thr Gly His Pro Gly Thr Val Gly
1085 1090 1095
Pro Ala Gly Ile Arg Gly Pro Gln Gly His Gln Gly Pro Ala Gly
1100 1105 1110
Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Val Ser Gly
1115 1120 1125
Gly Gly Tyr Asp Phe Gly Tyr Asp Gly Asp Phe Tyr Arg Ala Asp
1130 1135 1140
Gln Pro Arg Ser Ala Pro Ser Leu Arg Pro Lys Asp Tyr Glu Val
1145 1150 1155
Asp Ala Thr Leu Lys Ser Leu Asn Asn Gln Ile Glu Thr Leu Leu
1160 1165 1170
Thr Pro Glu Gly Ser Arg Lys Asn Pro Ala Arg Thr Cys Arg Asp
1175 1180 1185
Leu Arg Leu Ser His Pro Glu Trp Ser Ser Gly Tyr Tyr Trp Ile
1190 1195 1200
Asp Pro Asn Gln Gly Cys Thr Met Glu Ala Ile Lys Val Tyr Cys
1205 1210 1215
Asp Phe Pro Thr Gly Glu Thr Cys Ile Arg Ala Gln Pro Glu Asn
1220 1225 1230
Ile Pro Ala Lys Asn Trp Tyr Arg Ser Ser Lys Asp Lys Lys His
1235 1240 1245
Val Trp Leu Gly Glu Thr Ile Asn Ala Gly Ser Gln Phe Glu Tyr
1250 1255 1260
Asn Val Glu Gly Val Thr Ser Lys Glu Met Ala Thr Gln Leu Ala
1265 1270 1275
Phe Met Arg Leu Leu Ala Asn Tyr Ala Ser Gln Asn Ile Thr Tyr
1280 1285 1290
His Cys Lys Asn Ser Ile Ala Tyr Met Asp Glu Glu Thr Gly Asn
1295 1300 1305
Leu Lys Lys Ala Val Ile Leu Gln Gly Ser Asn Asp Val Glu Leu
1310 1315 1320
Val Ala Glu Gly Asn Ser Arg Phe Thr Tyr Thr Val Leu Val Asp
1325 1330 1335
Gly Cys Ser Lys Lys Thr Asn Glu Trp Gly Lys Thr Ile Ile Glu
1340 1345 1350
Tyr Lys Thr Asn Lys Pro Ser Arg Leu Pro Phe Leu Asp Ile Ala
1355 1360 1365
Pro Leu Asp Ile Gly Gly Ala Asp His Glu Phe Phe Val Asp Ile
1370 1375 1380
Gly Pro Val Cys Phe Lys
1385
<210>7
<211>127
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>含有拟南芥内切-1，4-β-葡聚糖酶的质外体信号编码区和侧翼区的合成序列
<400>7
gccatggcta ggaagtcttt gattttccca gtgattcttc ttgctgtgct tcttttctct 60
ccacctattt actctgctgg acacgattat agggatgctc ttaggaagtc atctatggct 120
caattgc 127
<210>8
<211>127
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>拟南芥内切-1，4-β-葡聚糖酶的质外体信号和侧翼区的合成序列
<220>
<221>CDS
<222>(10)..(120)
<400>8
gccatggct agg aag tct ttg att ttc cca gtg att ctt ctt gct gtg ctt 51
Arg Lys Ser Leu Ile Phe Pro Val Ile Leu Leu Ala Val Leu
1 5 10
ctt ttc tct cca cct att tac tct gct gga cac gat tat agg gat gct 99
Leu Phe Ser Pro Pro Ile Tyr Ser Ala Gly His Asp Tyr Arg Asp Ala
15 20 25 30
ctt agg aag tca tct atg gct caattgc 127
Leu Arg Lys Ser Ser Met Ala
35
<210>9
<211>37
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>拟南芥内切-1，4-β-葡聚糖酶的质外体信号和侧翼区的合成序列
<400>9
Arg Lys Ser Leu Ile Phe Pro Val Ile Leu Leu Ala Val Leu Leu Phe
1 5 10 15
Ser Pro Pro Ile Tyr Ser Ala Gly His Asp Tyr Arg Asp Ala Leu Arg
20 25 30
Lys Ser Ser Met Ala
35
<210>10
<211>1037
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>菊花rbcS1启动子和5’UTR
<400>10
aaatggcgcg ccaagcttag acaaacaccc cttgttatac aaagaatttc gctttacaaa 60
atcaaattcg agaaaataat atatgcacta aataagatca ttcggatcca atctaaccaa 120
ttacgatacg ctttgggtac acttgatttt tgtttcagta gttacatata tcttgtttta 180
tatgctatct ttaaggatct tcactcaaag actatttgtt gatgttcttg atggggctcg 240
gaagatttga tatgatacac tctaatcttt aggagatacc agccaggatt atattcagta 300
agacaatcaa attttacgtg ttcaaactcg ttatcttttc atttaatgga tgagccagaa 360
tctctataga atgattgcaa tcgagaatat gttcggccga tatccctttg ttggcttcaa 420
tattctacat atcacacaag aatcgaccgt attgtaccct ctttccataa aggaacacac 480
agtatgcaga tgcttttttc ccacatgcag taacataggt attcaaaaat ggctaaaaga 540
agttggataa caaattgaca actatttcca tttctgttat ataaatttca caacacacaa 600
aagcccgtaa tcaagagtct gcccatgtac gaaataactt ctattatttg gtattgggcc 660
taagcccagc tcagagtacg tgggggtacc acatatagga aggtaacaaa atactgcaag 720
atagccccat aacgtaccag cctctcctta ccacgaagag ataagatata agacccaccc 780
tgccacgtgt cacatcgtca tggtggttaa tgataaggga ttacatcctt ctatgtttgt 840
ggacatgatg catgtaatgt catgagccac atgatccaat ggccacagga acgtaagaat 900
gtagatagat ttgattttgt ccgttagata gcaaacaaca ttataaaagg tgtgtatcaa 960
tacgaactaa ttcactcatt ggattcatag aagtccattc ctcctaagta tctaaacata 1020
tgcaattgtc gactaaa 1037
<210>11
<211>975
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>菊花rbcS13’UTR和终止子
<400>11
aaaaggatcc gcggccgcat aagttttact atttaccaag acttttgaat attaaccttc 60
ttgtaacgag tcggttaaat ttgattgttt agggttttgt attatttttt tttggtcttt 120
taattcatca ctttaattcc ctaattgtct gttcatttcg ttgtttgttt ccggatcgat 180
aatgaaatgt aagagatatc atatataaat aataaattgt cgtttcatat ttgcaatctt 240
tttttacaaa cctttaatta attgtatgta tgacattttc ttcttgttat attaggggga 300
aataatgtta aataaaagta caaaataaac tacagtacat cgtactgaat aaattaccta 360
gccaaaaagt acacctttcc atatacttcc tacatgaagg cattttcaac attttcaaat 420
aaggaatgct acaaccgcat aataacatcc acaaattttt ttataaaata acatgtcaga 480
cagtgattga aagattttat tatagtttcg ttatcttctt ttctcattaa gcgaatcact 540
acctaacacg tcattttgtg aaatattttt tgaatgtttt tatatagttg tagcattcct 600
cttttcaaat tagggtttgt ttgagatagc atttcagccg gttcatacaa cttaaaagca 660
tactctaatg ctggaaaaaa gactaaaaaa tcttgtaagt tagcgcagaa tattgaccca 720
aattatatac acacatgacc ccatatagag actaattaca cttttaacca ctaataatta 780
ttactgtatt ataacatcta ctaattaaac ttgtgagttt ttgctagaat tattatcata 840
tatactaaaa ggcaggaacg caaacattgc cccggtactg tagcaactac ggtagacgca 900
ttaattgtct atagtggacg cattaattaa ccaaaaccgc ctctttcccc ttcttcttga 960
agcttgagct ctttt 975
<210>12
<211>1633
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>含有与人脯氨酰4-羟化酶β亚基融合的大麦巯基蛋白酶aleurain前体基因的维管
信号序列编码区和侧翼区的合成序列
<400>12
ctcgagtaaa ccatggctca tgctagggtt ttgcttttgg ctcttgctgt tcttgctact 60
gctgctgttg ctgtggcttc ttcttcatct ttcgctgatt ctaacccaat taggccagtg 120
actgatagag ctgcttctac tcttgctcaa ttggtcgaca tggatgctcc agaagaggag 180
gatcacgttc ttgtgcttag gaagtctaac ttcgctgaag ctcttgctgc tcacaagtac 240
cttcttgtgg agttttatgc tccttggtgc ggacattgca aagctcttgc tccagagtat 300
gctaaggctg ctggaaagtt gaaggctgag ggatctgaaa ttaggcttgc taaagtggat 360
gctactgagg agtctgatct tgctcaacag tacggagtta ggggataccc aactattaag 420
ttcttcagga acggagatac tgcttctcca aaggagtata ctgctggaag ggaggctgat 480
gatattgtga actggcttaa gaagagaact ggaccagctg ctactactct tccagatgga 540
gctgctgctg aatctcttgt ggagtcatct gaggtggcag tgattggatt cttcaaggat 600
gtggagtctg attctgctaa gcagttcctt caagctgctg aggctattga tgatattcca 660
ttcggaatta cttctaactc tgatgtgttc tctaagtacc agcttgataa ggatggagtg 720
gtgcttttca agaaattcga tgagggaagg aacaatttcg agggagaggt gacaaaggag 780
aaccttcttg atttcattaa gcacaaccag cttccacttg tgattgagtt cactgagcag 840
actgctccaa agattttcgg aggagagatt aagactcaca ttcttctttt ccttccaaag 900
tctgtgtctg attacgatgg aaagttgtct aacttcaaga ctgctgctga gtctttcaag 960
ggaaagattc ttttcatttt cattgattct gatcacactg ataaccagag gattcttgag 1020
ttcttcggac ttaagaagga agagtgccca gctgttaggc ttattactct tgaggaggag 1080
atgactaagt acaagccaga gtctgaagaa cttactgctg agaggattac tgagttctgc 1140
cacagattcc ttgagggaaa gattaagcca caccttatgt ctcaagagct tccagaggat 1200
tgggataagc agccagttaa ggtgttggtg ggtaaaaact tcgaggatgt ggctttcgat 1260
gagaagaaga acgtgttcgt ggagttctac gcaccttggt gtggtcactg taagcagctt 1320
gctccaattt gggataagtt gggagagact tacaaggatc acgagaacat tgtgattgct 1380
aagatggatt ctactgctaa cgaggtggag gctgttaagg ttcactcttt cccaactttg 1440
aagttcttcc cagcttctgc tgataggact gtgattgatt acaacggaga aaggactctt 1500
gatggattca agaagttcct tgagtctgga ggacaagatg gagctggaga tgatgatgat 1560
cttgaggatt tggaagaagc tgaggagcca gatatggagg aggatgatga tcagaaggct 1620
gtgtgatgag ctc 1633
<210>13
<211>537
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>含有与人脯氨酰4-羟化酶β亚基融合的大麦巯基蛋白酶aleurain前体基因的维管
信号序列和侧翼区的合成序列
<400>13
Met Ala His Ala Arg Val Leu Leu Leu Ala Leu Ala Val Leu Ala Thr
1 5 10 15
Ala Ala Val Ala Val Ala Ser Ser Ser Ser Phe Ala Asp Ser Asn Pro
20 25 30
Ile Arg Pro Val Thr Asp Arg Ala Ala Ser Thr Leu Ala Gln Leu Val
35 40 45
Asp Met Asp Ala Pro Glu Glu Glu Asp His Val Leu Val Leu Arg Lys
50 55 60
Ser Asn Phe Ala Glu Ala Leu Ala Ala His Lys Tyr Leu Leu Val Glu
65 70 75 80
Phe Tyr Ala Pro Trp Cys Gly His Cys Lys Ala Leu Ala Pro Glu Tyr
85 90 95
Ala Lys Ala Ala Gly Lys Leu Lys Ala Glu Gly Ser Glu Ile Arg Leu
100 105 110
Ala Lys Val Asp Ala Thr Glu Glu Ser Asp Leu Ala Gln Gln Tyr Gly
115 120 125
Val Arg Gly Tyr Pro Thr Ile Lys Phe Phe Arg Asn Gly Asp Thr Ala
130 135 140
Ser Pro Lys Glu Tyr Thr Ala Gly Arg Glu Ala Asp Asp Ile Val Asn
145 150 155 160
Trp Leu Lys Lys Arg Thr Gly Pro Ala Ala Thr Thr Leu Pro Asp Gly
165 170 175
Ala Ala Ala Glu Ser Leu Val Glu Ser Ser Glu Val Ala Val Ile Gly
180 185 190
Phe Phe Lys Asp Val Glu Ser Asp Ser Ala Lys Gln Phe Leu Gln Ala
195 200 205
Ala Glu Ala Ile Asp Asp Ile Pro Phe Gly Ile Thr Ser Asn Ser Asp
210 215 220
Val Phe Ser Lys Tyr Gln Leu Asp Lys Asp Gly Val Val Leu Phe Lys
225 230 235 240
Lys Phe Asp Glu Gly Arg Asn Asn Phe Glu Gly Glu Val Thr Lys Glu
245 250 255
Asn Leu Leu Asp Phe Ile Lys His Asn Gln Leu Pro Leu Val Ile Glu
260 265 270
Phe Thr Glu Gln Thr Ala Pro Lys Ile Phe Gly Gly Glu Ile Lys Thr
275 280 285
His Ile Leu Leu Phe Leu Pro Lys Ser Val Ser Asp Tyr Asp Gly Lys
290 295 300
Leu Ser Asn Phe Lys Thr Ala Ala Glu Ser Phe Lys Gly Lys Ile Leu
305 310 315 320
Phe Ile Phe Ile Asp Ser Asp His Thr Asp Asn Gln Arg Ile Leu Glu
325 330 335
Phe Phe Gly Leu Lys Lys Glu Glu Cys Pro Ala Val Arg Leu Ile Thr
340 345 350
Leu Glu Glu Glu Met Thr Lys Tyr Lys Pro Glu Ser Glu Glu Leu Thr
355 360 365
Ala Glu Arg Ile Thr Glu Phe Cys His Arg Phe Leu Glu Gly Lys Ile
370 375 380
Lys Pro His Leu Met Ser Gln Glu Leu Pro Glu Asp Trp Asp Lys Gln
385 390 395 400
Pro Val Lys Val Leu Val Gly Lys Asn Phe Glu Asp Val Ala Phe Asp
405 410 415
Glu Lys Lys Asn Val Phe Val Glu Phe Tyr Ala Pro Trp Cys Gly His
420 425 430
Cys Lys Gln Leu Ala Pro Ile Trp Asp Lys Leu Gly Glu Thr Tyr Lys
435 440 445
Asp His Glu Asn Ile Val Ile Ala Lys Met Asp Ser Thr Ala Asn Glu
450 455 460
Val Glu Ala Val Lys Val His Ser Phe Pro Thr Leu Lys Phe Phe Pro
465 470 475 480
Ala Ser Ala Asp Arg Thr Val Ile Asp Tyr Asn Gly Glu Arg Thr Leu
485 490 495
Asp Gly Phe Lys Lys Phe Leu Glu Ser Gly Gly Gln Asp Gly Ala Gly
500 505 510
Asp Asp Asp Asp Leu Glu Asp Leu Glu Glu Ala Glu Glu Pro Asp Met
515 520 525
Glu Glu Asp Asp Asp Gln Lys Ala Val
530 535
<210>14
<211>1723
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>含有与人脯氨酰4-羟化酶α-1亚基融合的大麦巯基蛋白酶aleurain前体基因的维
管信号序列编码区和侧翼区的合成序列
<400>14
ctcgagtaaa ccatggctca tgctagggtt ttgcttttgg ctcttgctgt tcttgctact 60
gctgctgttg ctgtggcttc ttcttcatct ttcgctgatt ctaacccaat taggccagtg 120
actgatagag ctgcttctac tcttgctcaa ttggtcgaca tgcacccagg attcttcact 180
tctattggac agatgactga tcttattcac actgagaagg atcttgtgac ttctcttaag 240
gattacatta aggctgagga ggataagttg gagcagatta agaagtgggc tgagaagttg 300
gataggctta cttctactgc tacaaaagat ccagagggat tcgttggtca tccagtgaac 360
gctttcaagt tgatgaagag gcttaacact gagtggagtg agcttgagaa ccttgtgctt 420
aaggatatgt ctgatggatt catttctaac cttactattc agaggcagta cttcccaaat 480
gatgaggatc aagtgggagc tgctaaggct cttcttaggc ttcaggatac ttacaacctt 540
gatactgata caatttctaa gggaaacctt ccaggagtta agcacaagtc tttccttact 600
gctgaggatt gcttcgagct tggaaaggtt gcatacactg aggctgatta ctaccacact 660
gagctttgga tggaacaagc tcttaggcaa cttgatgagg gagagatttc tactattgat 720
aaggtgtcag tgcttgatta cctttcttac gctgtgtacc agcagggtga tcttgataag 780
gctcttttgc ttactaagaa gttgcttgag cttgatccag aacatcagag ggctaacgga 840
aaccttaagt acttcgagta cattatggct aaggaaaagg atgtgaacaa gtctgcttct 900
gatgatcagt ctgatcaaaa gactactcca aagaagaagg gagtggctgt tgattatctt 960
cctgagaggc agaagtatga gatgttgtgt aggggagagg gtattaagat gactccaagg 1020
aggcagaaga agttgttctg caggtatcac gatggaaaca ggaacccaaa gttcattctt 1080
gctccagcta agcaagaaga tgagtgggat aagccaagga ttattaggtt ccacgatatt 1140
atttctgatg ctgagattga gattgtgaag gatcttgcta agccaagact taggagggct 1200
actatttcta accctattac tggtgatctt gagactgtgc actacaggat ttctaagtct 1260
gcttggcttt ctggatacga gaacccagtg gtgtctagga ttaacatgag gattcaggat 1320
cttactggac ttgatgtgtc tactgctgag gagcttcaag ttgctaacta cggagttgga 1380
ggacaatatg agccacactt cgatttcgct aggaaggatg agccagatgc ttttaaggag 1440
cttggaactg gaaacaggat tgctacttgg cttttctaca tgtctgatgt ttctgctgga 1500
ggagctactg ttttcccaga agtgggagct tctgtttggc caaagaaggg aactgctgtg 1560
ttctggtaca accttttcgc ttctggagag ggagattact ctactaggca tgctgcttgc 1620
ccagttcttg ttggaaacaa gtgggtgtca aacaagtggc ttcatgagag gggacaagag 1680
tttagaaggc catgcactct ttctgagctt gagtgatgag ctc 1723
<210>15
<211>567
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>含有与人脯氨酰4-羟化酶α-1亚基融合的大麦巯基蛋白酶aleurain前体基因的维
管信号序列和侧翼区的合成序列
<400>15
Met Ala His Ala Arg Val Leu Leu Leu Ala Leu Ala Val Leu Ala Thr
1 5 10 15
Ala Ala Val Ala Val Ala Ser Ser Ser Ser Phe Ala Asp Ser Asn Pro
20 25 30
Ile Arg Pro Val Thr Asp Arg Ala Ala Ser Thr Leu Ala Gln Leu Val
35 40 45
Asp Met His Pro Gly Phe Phe Thr Ser Ile Gly Gln Met Thr Asp Leu
50 55 60
Ile His Thr Glu Lys Asp Leu Val Thr Ser Leu Lys Asp Tyr Ile Lys
65 70 75 80
Ala Glu Glu Asp Lys Leu Glu Gln Ile Lys Lys Trp Ala Glu Lys Leu
85 90 95
Asp Arg Leu Thr Ser Thr Ala Thr Lys Asp Pro Glu Gly Phe Val Gly
100 105 110
His Pro Val Asn Ala Phe Lys Leu Met Lys Arg Leu Asn Thr Glu Trp
115 120 125
Ser Glu Leu Glu Asn Leu Val Leu Lys Asp Met Ser Asp Gly Phe Ile
130 135 140
Ser Asn Leu Thr Ile Gln Arg Gln Tyr Phe Pro Asn Asp Glu Asp Gln
145 150 155 160
Val Gly Ala Ala Lys Ala Leu Leu Arg Leu Gln Asp Thr Tyr Asn Leu
165 170 175
Asp Thr Asp Thr Ile Ser Lys Gly Asn Leu Pro Gly Val Lys His Lys
180 185 190
Ser Phe Leu Thr Ala Glu Asp Cys Phe Glu Leu Gly Lys Val Ala Tyr
195 200 205
Thr Glu Ala Asp Tyr Tyr His Thr Glu Leu Trp Met Glu Gln Ala Leu
210 215 220
Arg Gln Leu Asp Glu Gly Glu Ile Ser Thr Ile Asp Lys Val Ser Val
225 230 235 240
Leu Asp Tyr Leu Ser Tyr Ala Val Tyr Gln Gln Gly Asp Leu Asp Lys
245 250 255
Ala Leu Leu Leu Thr Lys Lys Leu Leu Glu Leu Asp Pro Glu His Gln
260 265 270
Arg Ala Asn Gly Asn Leu Lys Tyr Phe Glu Tyr Ile Met Ala Lys Glu
275 280 285
Lys Asp Val Asn Lys Ser Ala Ser Asp Asp Gln Ser Asp Gln Lys Thr
290 295 300
Thr Pro Lys Lys Lys Gly Val Ala Val Asp Tyr Leu Pro Glu Arg Gln
305 310 315 320
Lys Tyr Glu Met Leu Cys Arg Gly Glu Gly Ile Lys Met Thr Pro Arg
325 330 335
Arg Gln Lys Lys Leu Phe Cys Arg Tyr His Asp Gly Asn Arg Asn Pro
340 345 350
Lys Phe Ile Leu Ala Pro Ala Lys Gln Glu Asp Glu Trp Asp Lys Pro
355 360 365
Arg Ile Ile Arg Phe His Asp Ile Ile Ser Asp Ala Glu Ile Glu Ile
370 375 380
Val Lys Asp Leu Ala Lys Pro Arg Leu Arg Arg Ala Thr Ile Ser Asn
385 390 395 400
Pro Ile Thr Gly Asp Leu Glu Thr Val His Tyr Arg Ile Ser Lys Ser
405 410 415
Ala Trp Leu Ser Gly Tyr Glu Asn Pro Val Val Ser Arg Ile Asn Met
420 425 430
Arg Ile Gln Asp Leu Thr Gly Leu Asp Val Ser Thr Ala Glu Glu Leu
435 440 445
Gln Val Ala Asn Tyr Gly Val Gly Gly Gln Tyr Glu Pro His Phe Asp
450 455 460
Phe Ala Arg Lys Asp Glu Pro Asp Ala Phe Lys Glu Leu Gly Thr Gly
465 470 475 480
Asn Arg Ile Ala Thr Trp Leu Phe Tyr Met Ser Asp Val Ser Ala Gly
485 490 495
Gly Ala Thr Val Phe Pro Glu Val Gly Ala Ser Val Trp Pro Lys Lys
500 505 510
Gly Thr Ala Val Phe Trp Tyr Asn Leu Phe Ala Ser Gly Glu Gly Asp
515 520 525
Tyr Ser Thr Arg His Ala Ala Cys Pro Val Leu Val Gly Asn Lys Trp
530 535 540
Val Ser Asn Lys Trp Leu His Glu Arg Gly Gln Glu Phe Arg Arg Pro
545 550 555 560
Cys Thr Leu Ser Glu Leu Glu
565
<210>16
<211>928
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>含有与植物脯氨酰4-羟化酶植物融合的大麦巯基蛋白酶aleurain前体基因的维管
信号序列编码区和侧翼区的合成序列
<400>16
ctcgagtaaa ccatggctca tgctagggtt ttgcttttgg ctcttgctgt tcttgctact 60
gctgctgttg ctgtggcttc ttcttcatct ttcgctgatt ctaacccaat taggccagtg 120
actgatagag ctgcttctac tcttgctcaa ttggtcgaca tgcttggtat tctttctctt 180
ccaaacgcta acaggaactc ttctaagact aacgatctta ctaacattgt gaggaagtct 240
gagacttctt ctggagatga ggagggaaat ggagaaagat gggtggaagt gatttcttgg 300
gagccaaggg ctgttgttta ccacaacttc cttactaatg aggagtgcga gcaccttatt 360
tctcttgcta agccatctat ggtgaagtct actgtggtgg atgagaaaac tggaggatct 420
aaggattcaa gagtgaggac ttcatctggt actttcctta ggaggggaca tgatgaagtt 480
gtggaagtta ttgagaagag gatttctgat ttcactttca ttccagtgga gaacggagaa 540
ggacttcaag ttcttcacta ccaagtggga caaaagtacg agccacacta cgattacttc 600
cttgatgagt tcaacactaa gaacggagga cagaggattg ctactgtgct tatgtacctt 660
tctgatgtgg atgatggagg agagactgtt tttccagctg ctaggggaaa catttctgct 720
gttccttggt ggaacgagct ttctaagtgt ggaaaggagg gactttctgt gcttccaaag 780
aaaagggatg ctcttctttt ctggaacatg aggccagatg cttctcttga tccatcttct 840
cttcatggag gatgcccagt tgttaaggga aacaagtggt catctactaa gtggttccac 900
gtgcacgagt tcaaggtgta atgagctc 928
<210>17
<211>302
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>含有与植物脯氨酰4-羟化酶植物融合的大麦巯基蛋白酶aleurain前体基因的维管
信号序列和侧翼区的合成序列
<400>17
Met Ala His Ala Arg Val Leu Leu Leu Ala Leu Ala Val Leu Ala Thr
1 5 10 15
Ala Ala Val Ala Val Ala Ser Ser Ser Ser Phe Ala Asp Ser Asn Pro
20 25 30
Ile Arg Pro Val Thr Asp Arg Ala Ala Ser Thr Leu Ala Gln Leu Val
35 40 45
Asp Met Leu Gly Ile Leu Ser Leu Pro Asn Ala Asn Arg Asn Ser Ser
50 55 60
Lys Thr Asn Asp Leu Thr Asn Ile Val Arg Lys Ser Glu Thr Ser Ser
65 70 75 80
Gly Asp Glu Glu Gly Asn Gly Glu Arg Trp Val Glu Val Ile Ser Trp
85 90 95
Glu Pro Arg Ala Val Val Tyr His Asn Phe Leu Thr Asn Glu Glu Cys
100 105 110
Glu His Leu Ile Ser Leu Ala Lys Pro Ser Met Val Lys Ser Thr Val
115 120 125
Val Asp Glu Lys Thr Gly Gly Ser Lys Asp Ser Arg Val Arg Thr Ser
130 135 140
Ser Gly Thr Phe Leu Arg Arg Gly His Asp Glu Val Val Glu Val Ile
145 150 155 160
Glu Lys Arg Ile Ser Asp Phe Thr Phe Ile Pro Val Glu Asn Gly Glu
165 170 175
Gly Leu Gln Val Leu His Tyr Gln Val Gly Gln Lys Tyr Glu Pro His
180 185 190
Tyr Asp Tyr Phe Leu Asp Glu Phe Asn Thr Lys Asn Gly Gly Gln Arg
195 200 205
Ile Ala Thr Val Leu Met Tyr Leu Ser Asp Val Asp Asp Gly Gly Glu
210 215 220
Thr Val Phe Pro Ala Ala Arg Gly Asn Ile Ser Ala Val Pro Trp Trp
225 230 235 240
Asn Glu Leu Ser Lys Cys Gly Lys Glu Gly Leu Ser Val Leu Pro Lys
245 250 255
Lys Arg Asp Ala Leu Leu Phe Trp Asn Met Arg Pro Asp Ala Ser Leu
260 265 270
Asp Pro Ser Ser Leu His Gly Gly Cys Pro Val Val Lys Gly Asn Lys
275 280 285
Trp Ser Ser Thr Lys Trp Phe His Val His Glu Phe Lys Val
290 295 300
<210>18
<211>2689
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>含有人前胶原C-蛋白酶编码区和侧翼区的合成序列
<400>18
agatctatcg atgcatgcca tggtaccgcg ccatggctca attggctgca acatcaaggc 60
ctgaaagagt ttggccagat ggtgttattc ctttcgttat tggtggaaac tttactggat 120
ctcagagagc agtttttaga caagctatga gacattggga aaagcacact tgtgtgacat 180
tccttgaaag gactgatgaa gattcttata ttgtgttcac ataccgtcca tgtggatgct 240
gctcatatgt tggtagaagg ggaggaggtc cacaagcaat ttctattgga aaaaactgcg 300
ataagttcgg aattgtggtg catgaattgg gacatgttgt tggtttctgg cacgaacaca 360
caaggccaga tagggatagg cacgtgtcta ttgtgaggga aaacattcag ccaggtcaag 420
agtacaattt tcttaagatg gaacctcaag aggtggaatc tctcggagag acttacgact 480
tcgactccat catgcactac gcaaggaata ctttcagcag gggcatcttc ttggatacca 540
ttgtgcctaa gtacgaggtg aacggcgtta agccacctat tggtcaaagg actaggctct 600
ctaagggtga tattgcacag gctaggaagc tctacaaatg tccagcatgc ggagaaactc 660
ttcaggattc cactggcaac ttctcatctc cagagtaccc aaacggatac tctgctcata 720
tgcactgtgt ttggaggatc tcagtgactc ctggagagaa gatcatcctc aacttcactt 780
ccctcgatct ctatcgttct aggctctgtt ggtacgacta tgtggaagtg agagatggct 840
tctggagaaa ggctccactt agaggaaggt tctgcggatc taaacttcct gagccaatcg 900
tgtctactga ttccagattg tgggtggagt tcaggtcctc ttctaattgg gttggcaagg 960
gcttttttgc tgtgtacgag gctatttgtg gcggcgacgt gaaaaaggac tacggacata 1020
ttcaaagtcc aaattaccca gatgattacc gtccttcaaa agtgtgtatt tggaggattc 1080
aagtgagtga gggtttccat gttggattga cattccaatc tttcgaaatt gagagacacg 1140
attcatgcgc atacgattat ttggaagtga gagatggaca ctctgaatct tctacactta 1200
ttggaaggta ctgcggttat gagaaacctg atgatattaa gtctacttct agtaggttgt 1260
ggcttaaatt tgtgtcagat ggttctatta acaaggctgg tttcgcagtg aacttcttca 1320
aggaagtgga tgaatgctca agacctaaca gaggaggatg tgagcaaaga tgccttaaca 1380
ctttgggaag ttacaagtgt tcttgcgatc ctggatacga gttggctcct gataagagaa 1440
gatgcgaagc tgcttgcggt ggttttttga caaaattgaa cggatctatt acttctcctg 1500
gatggccaaa agagtaccca cctaataaga attgcatttg gcagcttgtt gcacctactc 1560
agtaccgtat ttcattgcaa ttcgattttt tcgagactga gggtaatgat gtgtgcaagt 1620
acgatttcgt ggaagtgaga tcaggtctta ctgctgatag taaattgcac ggaaagttct 1680
gcggatctga aaaaccagaa gtgattacat cacagtacaa caatatgagg gtggagttca 1740
aatctgataa tactgtttct aaaaaaggtt ttaaggcaca tttcttttct gataaggacg 1800
agtgctctaa agataatggt ggttgccagc aggattgcgt gaacacattc ggttcatatg 1860
agtgccaatg ccgtagtgga tttgttcttc acgataacaa acatgattgc aaagaggcag 1920
gttgcgatca caaggtgaca tctacttcag gtactatcac atctccaaac tggcctgata 1980
agtatccttc aaaaaaagaa tgtacatggg caatttcttc tacaccaggt catagggtta 2040
agttgacatt catggagatg gatattgaga gtcaaccaga gtgcgcttat gatcatcttg 2100
aggtgttcga tggaagggat gctaaggctc ctgttcttgg tagattctgt ggtagtaaaa 2160
agccagaacc agtgcttgca acaggatcta ggatgttcct tagattctac tctgataact 2220
cagttcagag gaaaggattc caagctagtc acgcaactga atgcggtgga caagttagag 2280
cagatgttaa gactaaggat ctttactcac acgcacagtt cggagataac aactaccctg 2340
gaggagttga ttgcgagtgg gttattgtgg ctgaagaggg atacggagtt gagcttgttt 2400
tccagacatt cgaggtggag gaggaaactg attgcggtta cgattatatg gaactttttg 2460
atggatacga tagtactgct ccaagacttg gaaggtattg tggtagtggt ccaccagaag 2520
aggtgtactc agctggagat agtgttcttg ttaagttcca cagtgatgat acaattacta 2580
agaagggatt ccatcttaga tatacttcaa ctaagtttca ggatactctt cattctagga 2640
agtaatgagc tcgcggccgc atccaagctt ctgcagacgc gtcgacgtc 2689
<210>19
<211>870
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>含有人前胶原C-蛋白酶和侧翼区的合成序列
<400>19
Met Ala Gln Leu Ala Ala Thr Ser Arg Pro Glu Arg Val Trp Pro Asp
1 5 10 15
Gly Val Ile Pro Phe Val Ile Gly Gly Asn Phe Thr Gly Ser Gln Arg
20 25 30
Ala Val Phe Arg Gln Ala Met Arg His Trp Glu Lys His Thr Cys Val
35 40 45
Thr Phe Leu Glu Arg Thr Asp Glu Asp Ser Tyr Ile Val Phe Thr Tyr
50 55 60
Arg Pro Cys Gly Cys Cys Ser Tyr Val Gly Arg Arg Gly Gly Gly Pro
65 70 75 80
Gln Ala Ile Ser Ile Gly Lys Asn Cys Asp Lys Phe Gly Ile Val Val
85 90 95
His Glu Leu Gly His Val Val Gly Phe Trp His Glu His Thr Arg Pro
100 105 110
Asp Arg Asp Arg His Val Ser Ile Val Arg Glu Asn Ile Gln Pro Gly
115 120 125
Gln Glu Tyr Asn Phe Leu Lys Met Glu Pro Gln Glu Val Glu Ser Leu
130 135 140
Gly Glu Thr Tyr Asp Phe Asp Ser Ile Met His Tyr Ala Arg Asn Thr
145 150 155 160
Phe Ser Arg Gly Ile Phe Leu Asp Thr Ile Val Pro Lys Tyr Glu Val
165 170 175
Asn Gly Val Lys Pro Pro Ile Gly Gln Arg Thr Arg Leu Ser Lys Gly
180 185 190
Asp Ile Ala Gln Ala Arg Lys Leu Tyr Lys Cys Pro Ala Cys Gly Glu
195 200 205
Thr Leu Gln Asp Ser Thr Gly Asn Phe Ser Ser Pro Glu Tyr Pro Asn
210 215 220
Gly Tyr Ser Ala His Met His Cys Val Trp Arg Ile Ser Val Thr Pro
225 230 235 240
Gly Glu Lys Ile Ile Leu Asn Phe Thr Ser Leu Asp Leu Tyr Arg Ser
245 250 255
Arg Leu Cys Trp Tyr Asp Tyr Val Glu Val Arg Asp Gly Phe Trp Arg
260 265 270
Lys Ala Pro Leu Arg Gly Arg Phe Cys Gly Ser Lys Leu Pro Glu Pro
275 280 285
Ile Val Ser Thr Asp Ser Arg Leu Trp Val Glu Phe Arg Ser Ser Ser
290 295 300
Asn Trp Val Gly Lys Gly Phe Phe Ala Val Tyr Glu Ala Ile Cys Gly
305 310 315 320
Gly Asp Val Lys Lys Asp Tyr Gly His Ile Gln Ser Pro Asn Tyr Pro
325 330 335
Asp Asp Tyr Arg Pro Ser Lys Val Cys Ile Trp Arg Ile Gln Val Ser
340 345 350
Glu Gly Phe His Val Gly Leu Thr Phe Gln Ser Phe Glu Ile Glu Arg
355 360 365
His Asp Ser Cys Ala Tyr Asp Tyr Leu Glu Val Arg Asp Gly His Ser
370 375 380
Glu Ser Ser Thr Leu Ile Gly Arg Tyr Cys Gly Tyr Glu Lys Pro Asp
385 390 395 400
Asp Ile Lys Ser Thr Ser Ser Arg Leu Trp Leu Lys Phe Val Ser Asp
405 410 415
Gly Ser Ile Asn Lys Ala Gly Phe Ala Val Asn Phe Phe Lys Glu Val
420 425 430
Asp Glu Cys Ser Arg Pro Asn Arg Gly Gly Cys Glu Gln Arg Cys Leu
435 440 445
Asn Thr Leu Gly Ser Tyr Lys Cys Ser Cys Asp Pro Gly Tyr Glu Leu
450 455 460
Ala Pro Asp Lys Arg Arg Cys Glu Ala Ala Cys Gly Gly Phe Leu Thr
465 470 475 480
Lys Leu Asn Gly Ser Ile Thr Ser Pro Gly Trp Pro Lys Glu Tyr Pro
485 490 495
Pro Asn Lys Asn Cys Ile Trp Gln Leu Val Ala Pro Thr Gln Tyr Arg
500 505 510
Ile Ser Leu Gln Phe Asp Phe Phe Glu Thr Glu Gly Asn Asp Val Cys
515 520 525
Lys Tyr Asp Phe Val Glu Val Arg Ser Gly Leu Thr Ala Asp Ser Lys
530 535 540
Leu His Gly Lys Phe Cys Gly Ser Glu Lys Pro Glu Val Ile Thr Ser
545 550 555 560
Gln Tyr Asn Asn Met Arg Val Glu Phe Lys Ser Asp Asn Thr Val Ser
565 570 575
Lys Lys Gly Phe Lys Ala His Phe Phe Ser Asp Lys Asp Glu Cys Ser
580 585 590
Lys Asp Asn Gly Gly Cys Gln Gln Asp Cys Val Asn Thr Phe Gly Ser
595 600 605
Tyr Glu Cys Gln Cys Arg Ser Gly Phe Val Leu His Asp Asn Lys His
610 615 620
Asp Cys Lys Glu Ala Gly Cys Asp His Lys Val Thr Ser Thr Ser Gly
625 630 635 640
Thr Ile Thr Ser Pro Asn Trp Pro Asp Lys Tyr Pro Ser Lys Lys Glu
645 650 655
Cys Thr Trp Ala Ile Ser Ser Thr Pro Gly His Arg Val Lys Leu Thr
660 665 670
Phe Met Glu Met Asp Ile Glu Ser Gln Pro Glu Cys Ala Tyr Asp His
675 680 685
Leu Glu Val Phe Asp Gly Arg Asp Ala Lys Ala Pro Val Leu Gly Arg
690 695 700
Phe Cys Gly Ser Lys Lys Pro Glu Pro Val Leu Ala Thr Gly Ser Arg
705 710 715 720
Met Phe Leu Arg Phe Tyr Ser Asp Asn Ser Val Gln Arg Lys Gly Phe
725 730 735
Gln Ala Ser His Ala Thr Glu Cys Gly Gly Gln Val Arg Ala Asp Val
740 745 750
Lys Thr Lys Asp Leu Tyr Ser His Ala Gln Phe Gly Asp Asn Asn Tyr
755 760 765
Pro Gly Gly Val Asp Cys Glu Trp Val Ile Val Ala Glu Glu Gly Tyr
770 775 780
Gly Val Glu Leu Val Phe Gln Thr Phe Glu Val Glu Glu Glu Thr Asp
785 790 795 800
Cys Gly Tyr Asp Tyr Met Glu Leu Phe Asp Gly Tyr Asp Ser Thr Ala
805 810 815
Pro Arg Leu Gly Arg Tyr Cys Gly Ser Gly Pro Pro Glu Glu Val Tyr
820 825 830
Ser Ala Gly Asp Ser Val Leu Val Lys Phe His Ser Asp Asp Thr Ile
835 840 845
Thr Lys Lys Gly Phe His Leu Arg Tyr Thr Ser Thr Lys Phe Gln Asp
850 855 860
Thr Leu His Ser Arg Lys
865 870
<210>20
<211>2912
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>含有人前胶原I N-蛋白酶编码区和侧翼区的合成序列
<400>20
gcgccatggc tcaattgagg agaagggcta ggagacacgc agctgatgat gattacaaca 60
ttgaagtttt gcttggtgtt gatgatagtg tggtgcaatt ccacggaaaa gagcatgttc 120
agaaatatct tttgacactt atgaatattg tgaacgaaat ctaccatgat gagtctttgg 180
gagcacacat taacgtggtt cttgtgagga ttattcttct ttcatacggt aaatctatgt 240
cacttattga gattggaaac ccttctcagt ctcttgagaa tgtgtgcaga tgggcatacc 300
ttcaacagaa gcctgatact ggacacgatg agtatcacga tcacgctatt ttccttacaa 360
ggcaggattt cggtccaagt ggaatgcaag gatatgctcc tgttactggt atgtgccacc 420
ctgttaggtc ttgtacactt aaccacgagg atggtttttc atctgctttc gtggtggctc 480
atgagacagg tcatgttttg ggaatggaac atgatggaca gggtaataga tgtggagatg 540
aagtgagact tggttcaatt atggctcctc ttgttcaagc tgcttttcat aggttccact 600
ggagtaggtg ttcacagcaa gagttgagta gataccttca ttcttacgat tgcttgcttg 660
atgatccatt tgctcatgat tggccagctt tgcctcaact tcctggattg cactactcta 720
tgaacgagca gtgcagattt gatttcggtc ttggttacat gatgtgcaca gctttcagga 780
ctttcgatcc atgcaaacag ttgtggtgtt cacacccaga taacccatat ttctgtaaaa 840
caaaaaaagg tccaccactt gatggtacta tgtgcgcacc tggaaagcac tgcttcaagg 900
gacactgcat ttggcttact cctgatattc ttaaaaggga tggatcatgg ggagcttggt 960
ctccattcgg aagttgctca agaacttgcg gaacaggtgt taagtttaga actaggcagt 1020
gcgataatcc acaccctgct aatggtggta gaacttgctc tggacttgct tacgattttc 1080
agttgtgttc taggcaagat tgccctgata gtcttgctga ttttagagaa gagcaatgta 1140
gacagtggga tctttacttt gagcacggcg acgctcagca ccactggctt ccacacgagc 1200
atagagatgc aaaagaaagg tgtcaccttt attgcgagag tagagagact ggagaggtgg 1260
tgtcaatgaa gagaatggtg cacgatggta caaggtgttc ttataaggat gcattctctt 1320
tgtgtgtgag gggagattgc aggaaagtgg gttgtgatgg agtgattgga tctagtaagc 1380
aagaagataa gtgcggagtg tgcggaggag ataactctca ttgcaaggtt gtgaaaggaa 1440
cttttacaag atcaccaaaa aaacacggtt acattaagat gttcgaaatt cctgctggag 1500
caaggcattt gcttattcag gaagtggatg caacatctca ccacttggca gtgaaaaacc 1560
ttgagactgg aaaattcatt ttgaacgagg agaacgatgt tgatgcatct agtaagactt 1620
tcattgcaat gggtgttgaa tgggagtata gggatgagga tggaagggaa acacttcaaa 1680
caatgggtcc tcttcatgga acaattactg tgttggtgat tccagtggga gatacaaggg 1740
tgtcattgac atacaagtat atgattcacg aggatagtct taacgttgat gataacaacg 1800
ttttggaaga agattctgtg gtttacgagt gggctcttaa gaaatggtca ccttgctcta 1860
agccatgtgg tggaggaagt cagttcacta agtatggttg taggaggagg cttgatcata 1920
agatggttca taggggattt tgcgcagcac ttagtaagcc aaaggcaatt aggagggctt 1980
gtaaccctca agaatgctca caaccagttt gggtgacagg agagtgggag ccatgttcac 2040
aaacatgcgg aagaactgga atgcaagtta gatcagttag atgcattcaa cctcttcatg 2100
ataacactac aagaagtgtg cacgcaaaac actgtaacga tgctaggcca gagagtagaa 2160
gagcttgctc tagggaactt tgccctggta gatggagggc aggaccttgg agtcagtgct 2220
ctgtgacatg tggaaacggt actcaggaaa gacctgttcc atgtagaact gctgatgata 2280
gtttcggaat ttgtcaggag gaaaggccag aaacagctag gacttgtaga cttggacctt 2340
gtcctaggaa tatttctgat cctagtaaaa aatcatacgt ggtgcaatgg ttgagtaggc 2400
cagatccaga ttcaccaatt aggaagattt cttcaaaagg acactgccag ggtgataaga 2460
gtattttctg cagaatggaa gttcttagta ggtactgttc tattccaggt tataacaaac 2520
tttcttgtaa gagttgcaac ttgtataaca atcttactaa cgtggagggt agaattgaac 2580
ctccaccagg aaagcacaac gatattgatg tgtttatgcc tactcttcct gtgccaacag 2640
ttgcaatgga agttagacct tctccatcta ctccacttga ggtgccactt aatgcatcaa 2700
gtactaacgc tactgaggat cacccagaga ctaacgcagt tgatgagcct tataagattc 2760
acggacttga ggatgaggtt cagccaccaa accttattcc taggaggcca agtccttacg 2820
aaaaaactag aaatcagagg attcaggagc ttattgatga gatgaggaaa aaggagatgc 2880
ttggaaagtt ctaatgagct cgcggccgca tc 2912
<210>21
<211>962
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>含有人前胶原I N-蛋白酶和侧翼区的合成序列
<400>21
Met Ala Gln Leu Arg Arg Arg Ala Arg Arg His Ala Ala Asp Asp Asp
1 5 10 15
Tyr Asn Ile Glu Val Leu Leu Gly Val Asp Asp Ser Val Val Gln Phe
20 25 30
His Gly Lys Glu His Val Gln Lys Tyr Leu Leu Thr Leu Met Asn Ile
35 40 45
Val Asn Glu Ile Tyr His Asp Glu Ser Leu Gly Ala His Ile Asn Val
50 55 60
Val Leu Val Arg Ile Ile Leu Leu Ser Tyr Gly Lys Ser Met Ser Leu
65 70 75 80
Ile Glu Ile Gly Asn Pro Ser Gln Ser Leu Glu Asn Val Cys Arg Trp
85 90 95
Ala Tyr Leu Gln Gln Lys Pro Asp Thr Gly His Asp Glu Tyr His Asp
100 105 110
His Ala Ile Phe Leu Thr Arg Gln Asp Phe Gly Pro Ser Gly Met Gln
115 120 125
Gly Tyr Ala Pro Val Thr Gly Met Cys His Pro Val Arg Ser Cys Thr
130 135 140
Leu Asn His Glu Asp Gly Phe Ser Ser Ala Phe Val Val Ala His Glu
145 150 155 160
Thr Gly His Val Leu Gly Met Glu His Asp Gly Gln Gly Asn Arg Cys
165 170 175
Gly Asp Glu Val Arg Leu Gly Ser Ile Met Ala Pro Leu Val Gln Ala
180 185 190
Ala Phe His Arg Phe His Trp Ser Arg Cys Ser Gln Gln Glu Leu Ser
195 200 205
Arg Tyr Leu His Ser Tyr Asp Cys Leu Leu Asp Asp Pro Phe Ala His
210 215 220
Asp Trp Pro Ala Leu Pro Gln Leu Pro Gly Leu His Tyr Ser Met Asn
225 230 235 240
Glu Gln Cys Arg Phe Asp Phe Gly Leu Gly Tyr Met Met Cys Thr Ala
245 250 255
Phe Arg Thr Phe Asp Pro Cys Lys Gln Leu Trp Cys Ser His Pro Asp
260 265 270
Asn Pro Tyr Phe Cys Lys Thr Lys Lys Gly Pro Pro Leu Asp Gly Thr
275 280 285
Met Cys Ala Pro Gly Lys His Cys Phe Lys Gly His Cys Ile Trp Leu
290 295 300
Thr Pro Asp Ile Leu Lys Arg Asp Gly Ser Trp Gly Ala Trp Ser Pro
305 310 315 320
Phe Gly Ser Cys Ser Arg Thr Cys Gly Thr Gly Val Lys Phe Arg Thr
325 330 335
Arg Gln Cys Asp Asn Pro His Pro Ala Asn Gly Gly Arg Thr Cys Ser
340 345 350
Gly Leu Ala Tyr Asp Phe Gln Leu Cys Ser Arg Gln Asp Cys Pro Asp
355 360 365
Ser Leu Ala Asp Phe Arg Glu Glu Gln Cys Arg Gln Trp Asp Leu Tyr
370 375 380
Phe Glu His Gly Asp Ala Gln His His Trp Leu Pro His Glu His Arg
385 390 395 400
Asp Ala Lys Glu Arg Cys His Leu Tyr Cys Glu Ser Arg Glu Thr Gly
405 410 415
Glu Val Val Ser Met Lys Arg Met Val His Asp Gly Thr Arg Cys Ser
420 425 430
Tyr Lys Asp Ala Phe Ser Leu Cys Val Arg Gly Asp Cys Arg Lys Val
435 440 445
Gly Cys Asp Gly Val Ile Gly Ser Ser Lys Gln Glu Asp Lys Cys Gly
450 455 460
Val Cys Gly Gly Asp Asn Ser His Cys Lys Val Val Lys Gly Thr Phe
465 470 475 480
Thr Arg Ser Pro Lys Lys His Gly Tyr Ile Lys Met Phe Glu Ile Pro
485 490 495
Ala Gly Ala Arg His Leu Leu Ile Gln Glu Val Asp Ala Thr Ser His
500 505 510
His Leu Ala Val Lys Asn Leu Glu Thr Gly Lys Phe Ile Leu Asn Glu
515 520 525
Glu Asn Asp Val Asp Ala Ser Ser Lys Thr Phe Ile Ala Met Gly Val
530 535 540
Glu Trp Glu Tyr Arg Asp Glu Asp Gly Arg Glu Thr Leu Gln Thr Met
545 550 555 560
Gly Pro Leu His Gly Thr Ile Thr Val Leu Val Ile Pro Val Gly Asp
565 570 575
Thr Arg Val Ser Leu Thr Tyr Lys Tyr Met Ile His Glu Asp Ser Leu
580 585 590
Asn Val Asp Asp Asn Asn Val Leu Glu Glu Asp Ser Val Val Tyr Glu
595 600 605
Trp Ala Leu Lys Lys Trp Ser Pro Cys Ser Lys Pro Cys Gly Gly Gly
610 615 620
Ser Gln Phe Thr Lys Tyr Gly Cys Arg Arg Arg Leu Asp His Lys Met
625 630 635 640
Val His Arg Gly Phe Cys Ala Ala Leu Ser Lys Pro Lys Ala Ile Arg
645 650 655
Arg Ala Cys Asn Pro Gln Glu Cys Ser Gln Pro Val Trp Val Thr Gly
660 665 670
Glu Trp Glu Pro Cys Ser Gln Thr Cys Gly Arg Thr Gly Met Gln Val
675 680 685
Arg Ser Val Arg Cys Ile Gln Pro Leu His Asp Asn Thr Thr Arg Ser
690 695 700
Val His Ala Lys His Cys Asn Asp Ala Arg Pro Glu Ser Arg Arg Ala
705 710 715 720
Cys Ser Arg Glu Leu Cys Pro Gly Arg Trp Arg Ala Gly Pro Trp Ser
725 730 735
Gln Cys Ser Val Thr Cys Gly Asn Gly Thr Gln Glu Arg Pro Val Pro
740 745 750
Cys Arg Thr Ala Asp Asp Ser Phe Gly Ile Cys Gln Glu Glu Arg Pro
755 760 765
Glu Thr Ala Arg Thr Cys Arg Leu Gly Pro Cys Pro Arg Asn Ile Ser
770 775 780
Asp Pro Ser Lys Lys Ser Tyr Val Val Gln Trp Leu Ser Arg Pro Asp
785 790 795 800
Pro Asp Ser Pro Ile Arg Lys Ile Ser Ser Lys Gly His Cys Gln Gly
805 810 815
Asp Lys Ser Ile Phe Cys Arg Met Glu Val Leu Ser Arg Tyr Cys Ser
820 825 830
Ile Pro Gly Tyr Asn Lys Leu Ser Cys Lys Ser Cys Asn Leu Tyr Asn
835 840 845
Asn Leu Thr Asn Val Glu Gly Arg Ile Glu Pro Pro Pro Gly Lys His
850 855 860
Asn Asp Ile Asp Val Phe Met Pro Thr Leu Pro Val Pro Thr Val Ala
865 870 875 880
Met Glu Val Arg Pro Ser Pro Ser Thr Pro Leu Glu Val Pro Leu Asn
885 890 895
Ala Ser Ser Thr Asn Ala Thr Glu Asp His Pro Glu Thr Asn Ala Val
900 905 910
Asp Glu Pro Tyr Lys Ile His Gly Leu Glu Asp Glu Val Gln Pro Pro
915 920 925
Asn Leu Ile Pro Arg Arg Pro Ser Pro Tyr Glu Lys Thr Arg Asn Gln
930 935 940
Arg Ile Gln Glu Leu Ile Asp Glu Met Arg Lys Lys Glu Met Leu Gly
945 950 955 960
Lys Phe
<210>22
<211>2888
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>含有与人赖氨酰羟化酶3融合的大麦巯基蛋白酶aleurain前体基因的维管信号序列
编码区和侧翼区的合成序列
<400>22
gcgaattcgc tagctatcac tgaaaagaca gcaagacaat ggtgtctcga tgcaccagaa 60
ccacatcttt gcagcagatg tgaagcagcc agagtggtcc acaagacgca ctcagaaaag 120
gcatcttcta ccgacacaga aaaagacaac cacagctcat catccaacat gtagactgtc 180
gttatgcgtc ggctgaagat aagactgacc ccaggccagc actaaagaag aaataatgca 240
agtggtccta gctccacttt agctttaata attatgtttc attattattc tctgcttttg 300
ctctctatat aaagagcttg tattttcatt tgaaggcaga ggcgaacaca cacacagaac 360
ctccctgctt acaaaccaga tcttaaacca tggctcacgc tagggttttg cttcttgctc 420
ttgctgttct tgctactgct gctgttgctg tggcttcttc aagttctttc gctgattcta 480
acccaattag gccagtgact gatagagctg cttctactct tgctcaattg agatctatgt 540
ctgatagacc aaggggaagg gatccagtta atccagagaa gttgcttgtg attactgtgg 600
ctactgctga gactgaagga taccttagat tccttaggag tgctgagttc ttcaactaca 660
ctgtgaggac tcttggactt ggagaagaat ggaggggagg agatgttgct agaactgttg 720
gaggaggaca gaaagtgaga tggcttaaga aagagatgga gaagtacgct gatagggagg 780
atatgattat tatgttcgtg gattcttacg atgtgattct tgctggatct ccaactgagc 840
ttttgaagaa attcgttcag tctggatcta ggcttctttt ctctgctgag tctttttgtt 900
ggccagaatg gggacttgct gagcaatatc cagaagtggg aactggaaag agattcctta 960
actctggagg attcattgga ttcgctacta ctattcacca gattgtgagg cagtggaagt 1020
acaaggatga cgatgatgat cagcttttct acactaggct ttaccttgat ccaggactta 1080
gggagaagtt gtctcttaac cttgatcaca agtctaggat tttccagaac cttaacggtg 1140
ctcttgatga ggttgtgctt aagttcgata ggaacagagt gaggattagg aacgtggctt 1200
acgatactct tcctattgtg gtgcatggaa acggaccaac aaaactccag cttaactacc 1260
ttggaaacta cgttccaaac ggatggactc cagaaggagg atgtggattc tgcaatcagg 1320
ataggagaac tcttccagga ggacaaccac caccaagagt tttccttgct gtgttcgttg 1380
aacagccaac tccattcctt ccaagattcc ttcagaggct tcttcttttg gattacccac 1440
cagatagggt gacacttttc cttcacaaca acgaggtttt ccacgagcca cacattgctg 1500
attcttggcc acagcttcag gatcatttct ctgctgtgaa gttggttggt ccagaagaag 1560
ctctttctcc aggagaagct agggatatgg ctatggattt gtgcaggcag gatccagagt 1620
gcgagttcta cttctctctt gatgctgatg ctgtgcttac taaccttcag actcttagga 1680
ttcttattga ggagaacagg aaagtgattg ctccaatgct ttctaggcac ggaaagttgt 1740
ggtctaattt ctggggtgct ctttctcctg atgagtacta cgctagatca gaggactacg 1800
tggagcttgt tcagagaaag agagtgggag tttggaacgt tccttatatt tctcaggctt 1860
acgtgattag gggagatact cttaggatgg agcttccaca gagggatgtt ttctctggat 1920
ctgatactga tccagatatg gctttctgca agtctttcag ggataaggga attttccttc 1980
acctttctaa ccagcatgag ttcggaagat tgcttgctac ttcaagatac gatactgagc 2040
accttcatcc tgatctttgg cagattttcg ataacccagt ggattggaag gagcagtaca 2100
ttcacgagaa ctactctagg gctcttgaag gagaaggaat tgtggagcaa ccatgcccag 2160
atgtttactg gttcccactt ctttctgagc aaatgtgcga tgagcttgtt gctgagatgg 2220
agcattacgg acaatggagt ggaggtagac atgaggattc taggcttgct ggaggatacg 2280
agaacgttcc aactgtggat attcacatga agcaagtggg atacgaggat caatggcttc 2340
agcttcttag gacttatgtg ggaccaatga ctgagtctct tttcccagga taccacacta 2400
aggctagggc tgttatgaac ttcgttgtga ggtatcgtcc agatgagcaa ccatctctta 2460
ggccacacca cgattcttct actttcactc ttaacgtggc tcttaaccac aagggacttg 2520
attatgaggg aggaggatgc cgtttcctta gatacgattg cgtgatttct tcaccaagaa 2580
agggatgggc tcttcttcat ccaggaaggc ttactcatta ccacgaggga cttccaacta 2640
cttggggaac tagatatatt atggtgtctt tcgtggatcc atgactgctt taatgagata 2700
tgcgagacgc ctatgatcgc atgatatttg ctttcaattc tgttgtgcac gttgtaaaaa 2760
acctgagcat gtgtagctca gatccttacc gccggtttcg gttcattcta atgaatatat 2820
cacccgttac tatcgtattt ttatgaataa tattctccgt tcaatttact gattgtccag 2880
aattcgcg 2888
<210>23
<211>764
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>含有与人赖氨酰羟化酶3融合的大麦巯基蛋白酶aleurain前体基因的维管信号序列
和侧翼区的合成序列
<400>23
Met Ala His Ala Arg Val Leu Leu Leu Ala Leu Ala Val Leu Ala Thr
1 5 10 15
Ala Ala Val Ala Val Ala Ser Ser Ser Ser Phe Ala Asp Ser Asn Pro
20 25 30
Ile Arg Pro Val Thr Asp Arg Ala Ala Ser Thr Leu Ala Gln Leu Arg
35 40 45
Ser Met Ser Asp Arg Pro Arg Gly Arg Asp Pro Val Asn Pro Glu Lys
50 55 60
Leu Leu Val Ile Thr Val Ala Thr Ala Glu Thr Glu Gly Tyr Leu Arg
65 70 75 80
Phe Leu Arg Ser Ala Glu Phe Phe Asn Tyr Thr Val Arg Thr Leu Gly
85 90 95
Leu Gly Glu Glu Trp Arg Gly Gly Asp Val Ala Arg Thr Val Gly Gly
100 105 110
Gly Gln Lys Val Arg Trp Leu Lys Lys Glu Met Glu Lys Tyr Ala Asp
115 120 125
Arg Glu Asp Met Ile Ile Met Phe Val Asp Ser Tyr Asp Val Ile Leu
130 135 140
Ala Gly Ser Pro Thr Glu Leu Leu Lys Lys Phe Val Gln Ser Gly Ser
145 150 155 160
Arg Leu Leu Phe Ser Ala Glu Ser Phe Cys Trp Pro Glu Trp Gly Leu
165 170 175
Ala Glu Gln Tyr Pro Glu Val Gly Thr Gly Lys Arg Phe Leu Asn Ser
180 185 190
Gly Gly Phe Ile Gly Phe Ala Thr Thr Ile His Gln Ile Val Arg Gln
195 200 205
Trp Lys Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Asp Gln Leu Phe Tyr Thr Arg Leu
210 215 220
Tyr Leu Asp Pro Gly Leu Arg Glu Lys Leu Ser Leu Asn Leu Asp His
225 230 235 240
Lys Ser Arg Ile Phe Gln Asn Leu Asn Gly Ala Leu Asp Glu Val Val
245 250 255
Leu Lys Phe Asp Arg Asn Arg Val Arg Ile Arg Asn Val Ala Tyr Asp
260 265 270
Thr Leu Pro Ile Val Val His Gly Asn Gly Pro Thr Lys Leu Gln Leu
275 280 285
Asn Tyr Leu Gly Asn Tyr Val Pro Asn Gly Trp Thr Pro Glu Gly Gly
290 295 300
Cys Gly Phe Cys Asn Gln Asp Arg Arg Thr Leu Pro Gly Gly Gln Pro
305 310 315 320
Pro Pro Arg Val Phe Leu Ala Val Phe Val Glu Gln Pro Thr Pro Phe
325 330 335
Leu Pro Arg Phe Leu Gln Arg Leu Leu Leu Leu Asp Tyr Pro Pro Asp
340 345 350
Arg Val Thr Leu Phe Leu His Asn Asn Glu Val Phe His Glu Pro His
355 360 365
Ile Ala Asp Ser Trp Pro Gln Leu Gln Asp His Phe Ser Ala Val Lys
370 375 380
Leu Val Gly Pro Glu Glu Ala Leu Ser Pro Gly Glu Ala Arg Asp Met
385 390 395 400
Ala Met Asp Leu Cys Arg Gln Asp Pro Glu Cys Glu Phe Tyr Phe Ser
405 410 415
Leu Asp Ala Asp Ala Val Leu Thr Asn Leu Gln Thr Leu Arg Ile Leu
420 425 430
Ile Glu Glu Asn Arg Lys Val Ile Ala Pro Met Leu Ser Arg His Gly
435 440 445
Lys Leu Trp Ser Asn Phe Trp Gly Ala Leu Ser Pro Asp Glu Tyr Tyr
450 455 460
Ala Arg Ser Glu Asp Tyr Val Glu Leu Val Gln Arg Lys Arg Val Gly
465 470 475 480
Val Trp Asn Val Pro Tyr Ile Ser Gln Ala Tyr Val Ile Arg Gly Asp
485 490 495
Thr Leu Arg Met Glu Leu Pro Gln Arg Asp Val Phe Ser Gly Ser Asp
500 505 510
Thr Asp Pro Asp Met Ala Phe Cys Lys Ser Phe Arg Asp Lys Gly Ile
515 520 525
Phe Leu His Leu Ser Asn Gln His Glu Phe Gly Arg Leu Leu Ala Thr
530 535 540
Ser Arg Tyr Asp Thr Glu His Leu His Pro Asp Leu Trp Gln Ile Phe
545 550 555 560
Asp Asn Pro Val Asp Trp Lys Glu Gln Tyr Ile His Glu Asn Tyr Ser
565 570 575
Arg Ala Leu Glu Gly Glu Gly Ile Val Glu Gln Pro Cys Pro Asp Val
580 585 590
Tyr Trp Phe Pro Leu Leu Ser Glu Gln Met Cys Asp Glu Leu Val Ala
595 600 605
Glu Met Glu His Tyr Gly Gln Trp Ser Gly Gly Arg His Glu Asp Ser
610 615 620
Arg Leu Ala Gly Gly Tyr Glu Asn Val Pro Thr Val Asp Ile His Met
625 630 635 640
Lys Gln Val Gly Tyr Glu Asp Gln Trp Leu Gln Leu Leu Arg Thr Tyr
645 650 655
Val Gly Pro Met Thr Glu Ser Leu Phe Pro Gly Tyr His Thr Lys Ala
660 665 670
Arg Ala Val Met Asn Phe Val Val Arg Tyr Arg Pro Asp Glu Gln Pro
675 680 685
Ser Leu Arg Pro His His Asp Ser Ser Thr Phe Thr Leu Asn Val Ala
690 695 700
Leu Asn His Lys Gly Leu Asp Tyr Glu Gly Gly Gly Cys Arg Phe Leu
705 710 715 720
Arg Tyr Asp Cys Val Ile Ser Ser Pro Arg Lys Gly Trp Ala Leu Leu
725 730 735
His Pro Gly Arg Leu Thr His Tyr His Glu Gly Leu Pro Thr Thr Trp
740 745 750
Gly Thr Arg Tyr Ile Met Val Ser Phe Val Asp Pro
755 760
<210>24
<211>45
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>大麦巯基蛋白酶aleurain前体基因的液泡信号序列
<400>24
Met Ala His Ala Arg Val Leu Leu Leu Ala Leu Ala Val Leu Ala Thr
1 5 10 15
Ala Ala Val Ala Val Ala Ser Ser Ser Ser Phe Ala Asp Ser Asn Pro
20 25 30
Ile Arg Pro Val Thr Asp Arg Ala Ala Ser Thr Leu Ala
35 40 45
<210>25
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>单链DNA寡核苷酸
<400>25
atcaccagga gaacagggac catc 24
<210>26
<211>29
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>单链DNA寡核苷酸
<400>26
tccacttcca aatctctatc cctaacaac 29
<210>27
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>单链DNA寡核苷酸
<400>27
aggcattaga ggcgataagg gag 23
<210>28
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>单链DNA寡核苷酸
<400>28
tcaatccaat aatagccact tgaccac 27
Claims (20)
1.在植物或被分离的植物细胞中生产胶原的方法，其包括使至少一种类型的胶原α链和哺乳动物脯氨酰-4-羟化酶(P4H)靶向所述植物或所述被分离的植物细胞的液泡，从而允许所述至少一种类型的所述胶原α链由所述哺乳动物P4H羟基化，且不由内源性P4H羟基化，从而在所述植物或被分离的植物细胞中生产胶原。
2.权利要求1的方法，其进一步包括在所述缺乏内源性P4H活性的亚细胞区室中表达外源性赖氨酰羟化酶(LH3)。
3.权利要求1的方法，其中所述至少一种类型的所述胶原α链包括用于靶向液泡的信号肽。
4.权利要求1的方法，其中所述至少一种类型的所述胶原α链缺乏ER靶向序列或保留序列。
5.权利要求1的方法，其中所述至少一种类型的所述胶原α链表达于包含DNA的植物细胞器中。
6.权利要求1的方法，其中所述外源性哺乳动物P4H包括用于靶向液泡的信号肽。
7.权利要求1的方法，其中所述外源性哺乳动物P4H缺乏ER靶向序列或保留序列。
8.权利要求1的方法，其中所述外源性哺乳动物P4H表达于包含DNA的植物细胞器中。
9.权利要求1的方法，其中所述至少一种类型的所述胶原α链是α1链。
10.权利要求1的方法，其中所述至少一种类型的所述胶原α链是α2链。
11.权利要求1的方法，其中所述至少一种类型的所述胶原α链包括C-末端和/或N-末端前肽。
12.权利要求1的方法，其中所述植物选自烟草、玉米、苜蓿、稻、马铃薯、大豆、番茄、小麦、大麦、低芥酸菜子、胡萝卜和棉花。
13.权利要求1的方法，其中所述至少一种类型的所述胶原α链或所述外源性P4H只表达于所述植物的部分中。
14.权利要求13的方法，其中所述植物的所述部分是叶、种子、根、块茎或茎。
15.权利要求1的方法，其中所述外源性哺乳动物P4H能够使所述至少一种类型的所述胶原α链的Gly-X-Y三联体的Y位置特异性羟基化。
16.权利要求14的方法，其中所述外源性哺乳动物P4H是人P4H。
17.权利要求1的方法，其中对所述植物实施应激条件。
18.权利要求17的方法，其中所述应激条件选自干旱、盐度、损伤、寒冷和喷射应激诱导化合物。
19.核酸构建体，其包括置于在植物细胞中起作用的启动子的转录控制下、编码人P4H的多核苷酸，所述人P4H包括用于靶向液泡的信号肽。
20.权利要求19的核酸构建体，其中所述启动子选自CaMV 35S启动子、遍在蛋白启动子、rbcS启动子和SVBV启动子。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US61371904P | 2004-09-29 | 2004-09-29 | |
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Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| HK1114405A1 HK1114405A1 (zh) | 2008-10-31 |
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