HK1112007B - Peptide acceptor ligation methods - Google Patents

Claims (36)

1. Verfahren zum Anbringen eines Peptidakzeptors an ein RNA-Molekül, umfassend:

   (a) Bereitstellen eines RNA-Moleküls; und

   (b) chemisches Ligieren des Peptidakzeptors mit dem RNA-Molekül, um eine kovalente Bindung zu bilden.
2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Peptidakzeptor mit einer Psoralen-Einheit verbunden ist und der Schritt der chemischen Ligation Vernetzen des Peptidakzeptors, durch die Psoralen-Einheit, mit dem RNA-Molekül umfasst.
3. Verfahren nach Anspruch 2, wobei die Psoralen-Einheit durch einen Linker an den Peptidakzeptor angefügt ist.
4. Verfahren nach Anspruch 3, wobei die Psoralen-Einheit an dem 5'-Terminus des Linkers positioniert ist.
5. Verfahren nach Anspruch 3, wobei die Psoralen-Einheit an dem 3'-Terminus des Linkers positioniert ist.
6. Verfahren nach Anspruch 3, wobei die Psoralen-Einheit innerhalb des Linkers positioniert ist.
7. Verfahren nach Anspruch 3, wobei der Linker eine C₆-Alkylkette umfasst.
8. Verfahren nach Anspruch 3, wobei das RNA-Molekül ein Stopcodon, positioniert proximal zu seinem 3'-Ende, enthält.
9. Verfahren nach Anspruch 3, wobei der Linker eine Länge zwischen 25 und 40 Nucleotideinheiten hat.
10. Verfahren nach Anspruch 2, wobei das Vernetzen durch UV-Licht-Bestrahlung erreicht wird.
11. Verfahren nach Anspruch 3, wobei vor dem Vernetzen die RNA mit dem Linker hybridisiert wird, welcher weiterhin eine photochemisch abspaltbare Einheit umfasst, und die hybridisierte RNA durch die photochemisch abspaltbare Einheit auf einem festen Träger immobilisiert wird.
12. Verfahren nach Anspruch 11, wobei die photochemisch abspaltbare Einheit Biotin ist.
13. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das RNA-Molekül funktionalisiert wird und wobei eine funktionelle Gruppe an den Peptidakzeptor angefügt wird.
14. Verfahren nach Anspruch 13, wobei das RNA-Molekül durch IO₄-Oxidation funktionalisiert wird.
15. Verfahren nach Anspruch 13, wobei die chemische Ligation in Abwesenheit eines äußeren Templats ausgeführt wird.
16. Verfahren nach Anspruch 13, wobei der Peptidakzeptor kovalent an ein Linkermolekül gebunden ist und, vor dem Schritt der chemischen Ligation, das RNA-Molekül und der Peptidakzeptor unter Verwendung eines äußeren Templats ausgerichtet werden, wobei das äußere Templat mit dem 3'-Ende des RNA-Moleküls und mit dem 5'-Ende des Linkermoleküls hybridisiert.
17. Verfahren nach Anspruch 13, wobei der Peptidakzeptor kovalent an ein Linkermolekül gebunden ist und, vor dem Schritt der chemischen Ligation, das RNA-Molekül und der Peptidakzeptor durch Hybridisierung des Linkermoleküls mit dem 3'-Ende der RNA ausgerichtet werden.
18. Verfahren nach Anspruch 17, wobei sich die funktionelle Gruppe des Peptidakzeptors an dem 5'-Ende des Linkermoleküls befindet.
19. Verfahren nach Anspruch 17, wobei die funktionelle Gruppe des Peptidakzeptors von einer Region, welche mit dem RNA-Molekül hybridisiert, auf einer Seite und von dem Peptidakzeptor auf der anderen Seite flankiert ist.
20. Verfahren nach Anspruch 13, wobei die funktionelle Gruppe des Peptidakzeptors aus der Gruppe, bestehend aus einem Amin, Hydrazin, (Thio)hydrazid und (Thio)semicarbazon, ausgewählt ist.
21. Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Schritt der chemischen Ligation umfasst:

    (a) Anfügen einer funktionellen Gruppe an das RNA-Molekül durch reduktive Aminierung;

    (b) Modifizieren eines Peptidakzeptors, um mit der funktionellen Gruppe des RNA-Moleküls zu reagieren; und

    (c) Inkontaktbringen des Peptidakzeptors mit dem RNA-Molekül unter Bedingungen, welche kovalente Bindungsbildung erlauben.
22. Verfahren nach Anspruch 21, wobei die funktionelle Gruppe ein Thiol, Maleimid oder Amin ist.
23. Verfahren nach Anspruch 1 oder 22, wobei das RNA-Molekül eine Translationsinitiationssequenz und ein Startcodon, operabel verknüpft mit einer Proteincodierungssequenz, umfasst.
24. Verfahren nach Anspruch 1 oder 22, wobei der Peptidakzeptor Puromycin ist.
25. Verfahren nach Anspruch 1 oder 22, wobei der Peptidakzeptor kovalent an ein nicht-Nucleotid-Linker-Molekül gebunden ist.
26. Verfahren nach Anspruch 3, wobei der Linker Triethylenglycol-Spacer umfasst.
27. Verfahren nach Anspruch 3, wobei der Linker 2'-OMe-RNA-Phosphoramidite umfasst.
28. Verfahren nach Anspruch 1, 3 oder 22, wobei die RNA oder der Linker eine Affinitätsreinigungssequenz enthält und das Verfahren weiterhin Reinigen der RNA umfasst.
29. Verfahren nach Anspruch 28, wobei die Affinitätsreinigungssequenz eine Poly-(A)-Sequenz umfasst.
30. RNA-Molekül, vernetzt mit einem Peptidakzeptor durch eine Psoralen-Einheit.
31. RNA-Molekül nach Anspruch 30, wobei die RNA ein Stopcodon, positioniert an ihrer Photovernetzungs-Zielstelle, enthält.
32. RNA-Molekül nach Anspruch 30, wobei der Peptidakzeptor an dem 3'-Ende des RNA-Moleküls ligiert ist.
33. RNA-Molekül nach Anspruch 30, wobei das RNA-Molekül eine Translationsinitiationssequenz und ein Startcodon, operabel verknüpft mit einer Proteincodierungssequenz, umfasst.
34. RNA-Molekül nach Anspruch 30, wobei der Peptidakzeptor Puromycin ist.
35. RNA-Molekül nach Anspruch 30, wobei die Psoralen-Einheit durch einen Linker an den Peptidakzeptor angefügt ist.
36. Verfahren zum Generieren einer RNA-Proteinfusion, wobei das Verfahren umfasst:

    (a) Bereitstellen eines RNA-Moleküls, hybridisiert mit einem Linker, wobei der Linker eine photochemisch abspaltbare Einheit, eine Psoralen-Einheit und einen Peptidakzeptor umfasst;

    (b) Immobilisieren der RNA auf einem festen Träger unter Bedingungen, unter welchen nicht-immobilisierte RNA im Wesentlichen von dem Träger entfernt wird;

    (c) Vernetzen des Peptidakzeptors mit der RNA, durch die Psoralen-Einheit, womit das Vernetzen gleichzeitig die vernetzte RNA von dem festen Träger freisetzt; und

    (d) Translatieren der vernetzten RNA, gebildet in Schritt (c), um ein RNA-Fusionsprotein zu bilden.