HK1100089B - Method for modulating gene expression by modifying the cpg content - Google Patents

Claims (42)

1. Procédé pour la modulation ciblée de l'expression génique comprenant :

   (i) la fourniture d'une séquence d'acide nucléique cible destinée à être exprimée,

   (ii) la modification de la séquence d'acide nucléique cible, où le nombre de dinucléotides CpG présents dans la séquence nucléotidique cible est augmenté au moyen de la dégénérescence du code génétique pour augmenter l'expression génique, où le nombre des dinucléotides CpG est augmenté par rapport à une séquence dérivée de la séquence de type sauvage, optimisée quant aux codons, au moyen de la dégénérescence du code génétique, ou est diminué pour diminuer l'expression génique,

   (iii) le clonage de la séquence d'acide nucléique cible à nombre de dinucléotides CpG modifié ainsi modifiée dans un vecteur d'expression approprié en liaison fonctionnelle avec une séquence de contrôle de la transcription appropriée,

   (iv) l'expression de la séquence d'acide nucléique cible modifiée dans un système d'expression de mammifère approprié.
2. Procédé selon la revendication 1 où, dans l'étape (ii), la modification de la séquence d'acide nucléique cible est réalisée de telle manière qu'outre l'augmentation ou la diminution du nombre des dinucléotides CpG, une ou plusieurs modifications supplémentaires sont réalisées au niveau de l'acide nucléique.
3. Procédé selon la revendication 2 où les modifications supplémentaires au niveau de l'acide nucléique sont choisies dans le groupe consistant en : modification du choix des codons, insertion ou élimination de suites de séquence stabilisant la structure secondaire de l'ARN, de régions à autohomologie augmentée, de régions à homologie avec le gène naturel augmentée, de motifs d'instabilité de l'ARN,de motifs activant l'épissage, de motifs de polyadénylation, de motifs riches en adénine, de sites de reconnaissance pour des endonucléases.
4. Procédé selon l'une des revendications précédentes où la modification de la séquence d'acide nucléique cible est réalisée par augmentation ou diminution du nombre des dinucléotides CpG compte tenu d'un choix des codons optimisé pour le système d'expression.
5. Procédé selon l'une des revendications précédentes où la modification du nombre des dinucléotides CpG est réalisée compte tenu d'un choix des codons optimisé pour les mammifères.
6. Procédé selon l'une des revendications 1 à 5 où l'expression génique est augmentée.
7. Procédé selon l'une des revendications 1 à 5 où l'expression génique est diminuée.
8. Procédé selon l'une des revendications précédentes où la séquence d'acide nucléique cible destinée à être exprimée est hétérologue pour le système d'expression de mammifère.
9. Procédé selon l'une des revendications précédentes où une cellule choisie dans le groupe consistant en les cellules de mammifère, les cellules humaines et les cellules somatiques, ou un environnement d'expression sans cellules, est utilisé(e) comme système d'expression de mammifère.
10. Procédé selon l'une des revendications précédentes où la séquence d'acide nucléique cible destinée à être exprimée est d'origine eucaryote, procaryote, virale ou synthétique.
11. Procédé selon l'une des revendications précédentes où un système pauvre en méthylation est utilisé comme système d'expression.
12. Procédé selon l'une des revendications précédentes où la séquence d'acide nucléique cible modifiée et la séquence de contrôle de la transcription ne sont pas associées à des îlots de CpG.
13. Procédé selon l'une des revendications précédentes où le nombre des dinucléotides CpG est augmenté ou diminué d'au moins deux.
14. Procédé selon l'une des revendications précédentes où le nombre des dinucléotides CpG est augmenté ou diminué d'au moins 10 %, de préférence d'au moins 50 %, de préférence d'au moins 100 %.
15. Procédé selon l'une des revendications précédentes où tous les dinucléotides CpG sont retirés au moyen de la dégénérescence du code génétique.
16. Procédé selon l'une des revendications précédentes où la séquence d'acide nucléique cible code un ARN, des dérivés ou mimétiques de celui-ci, un peptide ou un polypeptide, un peptide ou un polypeptide modifié, une protéine ou une protéine modifiée.
17. Procédé selon la revendication 16 où la séquence d'acide nucléique cible code une protéine thérapeutique et/ou diagnostique.
18. Procédé selon la revendication 17 où la séquence d'acide nucléique cible code une protéine choisie parmi les protéines humaines, parasitaires, virales ou bactériennes, les enzymes, les hormones, les vaccins, les messagers et les protéines régulatrices.
19. Procédé selon la revendication 17 ou 18 où la séquence d'acide nucléique cible code une protéine choisie parmi l'asparaginase, l'adénosine désaminase, l'insuline, le tPA, les facteurs de coagulation, la vitamine K-époxyde réductase, l'érythropoïétine, la folliculostimuline, les estrogènes, les protéines morphogénétiques osseuses, l'antithrombine, les protéines dérivées de VIH, VHB, VHC, influenza, Borrelia, Haemophilus, Meningococcus, Anthrax, l'anatoxine botulique, l'anatoxine diphtérique, l'anatoxine tétanique, les protéines de Plasmodium, les antigènes de groupes sanguins, les protéines de HLA, les cytokines, les chimiokines, G-CSF, GM-CSF, les interleukines, les interférons, PDGF, TNF, RANTES, MIP1α et les facteurs de transcription.
20. Procédé selon la revendication 16 où la séquence d'acide nucléique cible code un ARN fonctionnel.
21. Procédé selon la revendication 20 où la séquence d'acide nucléique cible est un ARNsi, un ribozyme, un ARN antisens ou un decoy.
22. Acide nucléique modifié avec une région capable de transcription, qui peut être exprimé dans un système d'expression de mammifère et qui est dérivé d'une séquence de type sauvage, où la région capable de transcription est modifiée de telle manière qu'elle est optimisée quant aux codons à l'égard du système d'expression de mammifère utilisé, où un choix des codons tel qu'il est le plus fréquemment utilisé ou le second plus fréquemment utilisé dans des cellules de mammifère est utilisé, et que le nombre de dinucléotides CpG est augmenté par rapport à la séquence dérivée de la séquence de type sauvage, optimisée quant aux codons au moyen de la dégénérescence du code génétique.
23. Acide nucléique selon la revendication 22 où le nombre des dinucléotides CpG est augmenté par rapport à la séquence de type sauvage d'au moins 10 %, de préférence d'au moins 25 %, de préférence d'au moins 50 %, de préférence d'au moins 100 %, de préférence d'au moins 200 %, de préférence de cinq fois, de préférence de dix fois ou plus.
24. Acide nucléique selon l'une des revendications 22 à 23 précédentes où l'acide nucléique n'est pas associé à un îlot de CpG.
25. Acide nucléique selon l'une des revendications 22 à 24 comprenant une séquence choisie parmi : SEQ ID NO. 13, 17, 19, 52 et 54.
26. Vecteur comprenant un acide nucléique selon l'une des revendications 22 à 25 en liaison fonctionnelle avec une séquence de contrôle de la transcription appropriée.
27. Vecteur selon la revendication 26 où la séquence de contrôle de la transcription comprend un promoteur.
28. Vecteur selon la revendication 27 où le promoteur est un promoteur actif de manière constitutive.
29. Vecteur selon la revendication 28 où le promoteur actif de manière constitutive est choisi parmi le promoteur de CMV (cytomégalovirus) et le promoteur du virus simien 40 (SV40).
30. Vecteur selon la revendication 27 où le promoteur est un promoteur inductible.
31. Vecteur selon la revendication 30 où le promoteur inductible est un promoteur dépendant de tétracycline.
32. Vecteur selon l'une des revendications 26 à 31 où le promoteur n'est pas associé à un îlot de CpG.
33. Vecteur selon l'une des revendications 26 à 32 où les séquences, ou des parties de celles-ci, différentes de l'acide nucléique selon l'une des revendications 22 à 25, présentes sur le vecteur comportent un nombre de dinucléotides CpG diminué.
34. Vecteur selon l'une des revendications 26 à 33 où les séquences, ou des parties de celles-ci, différentes de l'acide nucléique selon l'une des revendications 22 à 25 comportent un nombre de dinucléotides CpG diminué d'environ 25 %, de préférence de 50 %, de préférence encore de 75 %, de préférence encore de 100 %.
35. Vecteur selon l'une des revendications 26 à 34 ayant la séquence d'acide nucléique représentée dans SEQ ID NO. 25.
36. Cellule contenant un acide nucléique ou un vecteur selon l'une des revendications 22 à 35.
37. Système d'expression de mammifère comprenant :

    (a) une séquence d'acide nucléique modifiée avec une région capable de transcription, qui est dérivée d'une séquence de type sauvage, où la séquence d'acide nucléique modifiée est modifiée de telle manière qu'elle est optimisée quant aux codons à l'égard du système d'expression de mammifère utilisé, et présente un nombre de dinucléotides CpG augmenté ou diminué par rapport à la séquence optimisée quant aux codons, en liaison fonctionnelle avec une séquence de contrôle de la transcription,

    (b) un environnement d'expression choisi parmi une cellule de mammifère et un environnement d'expression sans cellules où (a) peut être exprimée, où le système d'expression de mammifère présente lors de l'expression d'une séquence d'acide nucléique modifiée à nombre de dinucléotides CpG augmenté une expression augmentée et lors de l'expression d'une séquence d'acide nucléique modifiée à nombre de dinucléotides CpG diminué une expression diminuée.
38. Médicament comprenant comme principe actif un acide nucléique et/ou un vecteur et/ou une cellule et/ou un système d'expression de mammifère selon l'une des revendications 23 à 37.
39. Utilisation d'un acide nucléique et/ou d'un vecteur et/ou d'une cellule et/ou d'un système d'expression de mammifère selon l'une des revendications 23 à 37 pour la production d'un médicament pour un traitement diagnostique et/ou thérapeutique.
40. Utilisation selon la revendication 39 pour un traitement de thérapie génique.
41. Utilisation d'un acide nucléique et/ou d'un vecteur et/ou d'une cellule et/ou d'un système d'expression de mammifère selon l'une des revendications 23 à 37 pour la production de vaccins.
42. Acide nucléique ayant une séquence choisie parmi SEQ ID NO. 1, 5, 7, 9 et 26.