HK1198181B - 用於监测血块形成的nmr方法 - Google Patents

Description

用于监测血块形成的NMR方法

发明背景

本发明的特征在于用于监测含水样品中的流变变化的方法。

血液是生物体的循环组织，它将氧气和营养物质带入组织中，并带走二氧化碳和各种代谢产物用以排泄。全血由浅黄色或灰黄色的流体血浆组成，其中悬浮有红细胞、白细胞和血小板。

以及时有效的方式精确地测量止血，即患者血液凝固和溶解的能力，对某些手术和医学程序至关重要。加速(快速)准确地检测异常止血就以下方面而言也是特别重要的：给予患有止血障碍的患者适当治疗，并且有必要在考虑可能对止血障碍起作用的患者血液的异常组分、细胞或“因子”后，以必须明确确定的量向患者给予抗凝血药、抗纤维蛋白溶解药、溶栓药、抗血小板药或血液组分。

止血是一个动态的极其复杂的过程，涉及许多相互作用因子，包括凝血蛋白和溶纤蛋白、激活剂、抑制剂和细胞部件，例如血小板细胞骨架、血小板胞质粒和血小板细胞表面。因此，在活化期间，无因子保持静态或孤立地运转。因此，为了全面完整，必需以非孤立或静态的方式连续测量患者止血的整个阶段作为全血组分的净产物。以测量止血的孤立部分的结果为例，假定患者出现血纤蛋白溶解，其因纤溶酶原活化成为纤溶酶(一种分解血块的酶)所引起。在这种情况下，血纤蛋白原降解产物的这个过程的副产品起抗凝血药的作用。如果仅针对抗凝对患者进行测试，并进行相应的治疗，这个患者可能仍处于因未用抗纤维蛋白溶解药治疗所导致的危险中。

止血过程的最终结果是聚合血纤蛋白原纤维(即血纤蛋白)的三维网，其与血小板糖蛋白IIb/IIIa (GPIIb/IIIa)受体一起结合形成最终的血块。这种网结构的独特性质是它起刚性弹性体的作用，能够抵抗循环血液的变形剪切应力。最终血块抵抗变形剪切应力的强度部分通过由参与的血小板所施加的力来确定。

已表明血小板以至少两种方式影响血纤蛋白的机械强度。第一，通过作为节分支点起作用，它们显著提高血纤蛋白结构刚性。第二，通过血小板肌动球蛋白(一种作为细胞骨架介导的收缩器(contractibility apparatus)的部分的肌肉蛋白质)的收缩力，对纤维施加“牵引”力。这种收缩力的力量进一步提高血纤蛋白结构的强度。血小板受体GPIIb/IIIa似乎在将聚合性纤维锚定在活化血小板中的基础性细胞骨架收缩器中，由此介导机械力的转移至关重要。

因此，因活化止血所致出现并粘附在受损血管系统上并且抵抗循环血液的变形剪切应力的血块，本质上是一种机械装置，其在血管恢复期间形成以提供抵抗循环血液剪切力的“临时阻塞物”。作为其抵抗循环血液的变形剪切力的物理性质的血块的动力学、强度和稳定性决定了其进行止血工作的能力，即在不允许不当血栓形成的情况下停止出血。

血小板在介导促血栓形成(易形成血栓)患者的缺血并发症中起关键作用。在易形成血栓患者中使用GPIIb/IIIa抑制剂或作为经皮冠状动脉内成形术(PTCA)的辅助正快速成为医护标准。抑制GPIIb/IIIa受体是抗血小板疗法的极有效的形式，抗血小板疗法可导致死亡和心肌梗死风险降低，但也可导致极危险的出血。出血潜力或达不到足够治疗水平的血小板抑制的原因是尽管有相当大的人与人之间的变化性但仍然使用的权重调节的血小板阻滞剂治疗算法。这是一个部分由于血小板计数的差异和每血小板GPIIb/IIIa受体的数目及其配体结合功能的变化性所引起的问题。为了临床有用性，血小板抑制测定必须在临床上提供有关受体阻断的快速可靠的信息，因此允许剂量修正以实现所需的抗血小板作用。

需要快速、可靠、定量、现场即时试验的方法和仪器，以连续地在从最初的血块形成到溶解的整个止血过程中监测治疗性血小板阻断和测量抗血小板药的功效。

发明概述

本发明的特征在于监测含水样品的流变变化的方法，其通过：(i)测量代表样品中水的NMR弛豫率特征的信号以得到NMR弛豫数据；(ii)根据NMR弛豫数据，确定代表样品中的流变变化特征的磁共振参数值或值集；和(iii)将步骤(ii)的结果与预定阈值进行比较。

在相关方面，本发明的特征在于监测含水样品的流变变化的方法，所述方法包括：(i)对样品中的水进行一系列磁共振弛豫率测量；(ii)应用区分样品中的两个或更多个可观察得到的水群体(water population)的算法变换测量，其中各个可观察得到的水群体在流变变化期间的一个或多个时间点上具有截然不同的弛豫率和截然不同的信号强度；和(iii)根据两个或更多个可观察得到的水群体的至少一个的弛豫率或信号强度，监测样品的流变变化。

本发明的特征还在于监测含水样品的流变变化的方法，所述方法包括：(i)对样品中的水进行一系列测量，其中所述测量区分得出样品内两个或更多个可观察得到的水群体，且各个可观察得到的水群体在流变变化期间的一个或多个时间点上具有截然不同的信号和/或信号强度；和(ii)根据两个或更多个可观察得到的水群体的至少一个所观察到的信号和/或信号强度，监测样品的流变变化。测量可为核磁共振测量、电子顺磁共振、微波波谱测量或本领域已知的用于测量水的性质的任何其它技术。在具体的实施方案中，含水样品中的水是放射性标记的(例如用氘或氚标记)。

一方面，本发明的特征在于监测第一血液样品中的凝固或溶解过程的方法，所述方法包括：(i)对第一血样中的水进行一系列磁共振弛豫率测量；(ii)应用区分第一血样内两个或更多个独立的水群体的算法变换测量，其中各个独立水群体的特征在于具有一个或多个值的一个或多个磁共振参数；和(iii)根据步骤(ii)的结果，监测该过程。血样可为血浆样品、贫血小板血浆样品、富血小板血浆样品、包括分离和洗涤的血小板的血样、全血样品、凝血样品或本文所述任何类型的血样。在该方法的某些实施方案中，在步骤(i)之前，向第一血样中加入血纤蛋白原(例如1 ± 0.25、2 ± 0.5、3 ± 0.75、4 ± 1、6 ± 2或8 ±2 mg/mL)。在该方法的具体实施方案中，在步骤(i)之前，向第一血样中加入凝固引发剂或凝固抑制剂。凝固引发剂/抑制剂可选自RF (蛇毒凝血酶和因子XIII)、AA (花生四烯酸)、ADP (腺苷二磷酸)、CK (高岭土)、TRAP (凝血酶受体激活肽)、凝血酶、血小板聚集抑制剂或本文描述的任何凝固引发剂或凝固抑制剂。在该方法的另外其它的实施方案中，在步骤(i)之前，向第一血样中加入组织纤溶酶原激活物(TPA)。该方法还可包括以下步骤：(iv)对来自受试者的第二血样中的水进行一系列第二弛豫率测量；(v)应用区分第二血样内的两个或更多个独立水群体的算法变换第二弛豫率测量，其中各个独立水群体的特征在于一个或多个磁共振参数，其中各个磁共振参数具有一个或多个值；和(vi)根据步骤(ii)和步骤(v)的结果，监测该过程。例如，第一血样可为血浆样品，第二血样可为全血样品；第一血样可为富血小板血浆样品，第二血样可为全血样品；第一血样可为贫血小板血浆样品，第二血样可为全血样品；第一血样可包括分离和洗涤的血小板，第二血样可为全血样品或本文描述的任何其它类的比较样品。在具体的实施方案中，在步骤(i)之前，向第一血样中加入血小板抑制剂，且无血小板抑制剂加入第二血样中；在步骤(i)之前，向第一血样中加入血小板激活剂，且无血小板激活剂加入第二血样中；或在步骤(i)之前，向第一血样中加入选自RF、AA和CK的凝固引发剂；和在步骤(iv)之前，向第二血样中加入选自ADP和凝血酶的凝固引发剂。在该方法的某些实施方案中，在步骤(i)之前，向第一血样中加入血纤蛋白原(例如1 ± 0.25、2 ± 0.5、3 ± 0.75、4 ± 1、6 ± 2或8 ± 2 mg/mL)；和在步骤(iv)之前，向第二血样中加入血纤蛋白原(例如1 ± 0.25、2 ± 0.5、3 ± 0.75、4 ± 1、6 ± 2或8 ±2 mg/mL)。

在上述方法中，磁共振参数值可表示血样中功能性血纤蛋白原相关水分子的特征。在具体的实施方案中，两个或更多个独立水群体的至少一个与血小板活化、血小板抑制、凝固时间、血小板相关血块强度、血细胞比容或血纤蛋白原相关血块强度正相关。在另外的其它实施方案中，磁共振参数值表明低血小板活性、高血小板活性、高功能性血纤蛋白原活性或低功能性血纤蛋白原活性。

在任一种上述方法中，算法可包括选自以下的算法：多指数算法、双指数算法、三指数算法、指数衰减算法、拉普拉斯变换(Laplace transform)、拟合优度算法、SSE算法、最小平方算法、非负最小平方算法或本文描述的任何算法。在具体的实施方案中，算法是拉普拉斯逆变换(inverse Laplace transform)。

在任一种上述方法中，弛豫率可选自T1、T2、T1/T2混杂、T_1rho、T_2rho和T₂ ^*。在一个具体的实施方案中，弛豫率测量包括T2测量，该测量提供衰减曲线。

在另一个具体的实施方案中，两个或更多个水群体包括具有血清相关T2信号的水群体和具有血块相关T2信号的水群体。方法可包括(i)计算在包括红细胞的血样中引发血块形成之前血清相关水的T2值，并根据T2值，确定血样的血细胞比容。方法还可包括(a)计算正进行凝固过程的血样的血清相关T2信号和血块相关T2信号间的差异；和(b)根据差异，确定血样中形成的血块的强度。方法可包括(a)计算包括血小板并正进行凝固过程的血样的血清相关T2信号和血块相关T2信号间的差异；和(b)根据差异，确定血样中血小板的活性。在一个实施方案中，方法还包括(a)在血样中引发凝固过程之后，测量初始检测血块相关T2信号之前的时段；和(b)根据该时段，测定血样的凝固时间。在其它实施方案中，方法还包括(a)在血样中引发凝固过程之后，计算血清相关T2信号的T2时间曲线；(b)计算T2时间曲线二阶导数的最大值；和(c)根据步骤(b)的结果，计算代表凝固时间的值。在另外的其它实施方案中，方法包括，在血样中引发凝固过程之后，根据血清相关T2信号和血块相关T2信号，确定血样是否凝固性过高、凝固性过低或正常。

在任何上述方法的一个实施方案中，方法还包括自衰减曲线计算引发凝固或溶解过程之后预定时间点的T2弛豫谱。方法还可包括在血样中引发凝固或溶解过程之后，(a)对该过程期间的血样进行大量弛豫率测量以制成多个衰减曲线，和(b)自多个衰减曲线计算多个T2弛豫谱。任选方法还包括自多个T2弛豫谱计算三维数据集，其描述血样中两个或更多个水群体的(a) T2弛豫时间和(b) T2信号强度随在血样中引发凝固或溶解过程之后的时间而变化。

在具体的实施方案中，方法还包括(i)将三维数据集划分为稳定数据和过渡数据和(ii)根据稳定数据和过渡数据，确定血样是否凝固性过高、凝固性过低或正常，或者确定血样是否显示低血小板活性、高血小板活性、高功能性血纤蛋白原活性或低功能性血纤蛋白原活性。在某些实施方案中，方法还包括(i)自三维数据集计算在该过程中预定时间内针对血样中两个或更多个水群体的每一个所观察到的信号的相对容积，和(ii)根据信号的相对容积，确定血样是否凝固性过高、凝固性过低或正常，或者确定血样是否显示低血小板活性、高血小板活性、高功能性血纤蛋白原活性或低功能性血纤蛋白原活性。

在任何上述方法的另一个具体的实施方案中，算法是拉普拉斯逆变换，其包括1-50 ms (例如1-10、1-20、1-30、5-50、5-30或10-50 ms)的T2时间常数的下界和1000-4000ms (例如1000-2000、2500-4000、1000-3000、1500-4000、2000-4000或2000-4000 ms)的T2时间常数的上界。例如，血样可为血浆、贫血小板血浆或富血小板血浆，且T2时间常数的上界为2500-4000 ms (例如2500-3500、2500-3000、3000-4000或3500-4000 ms)。在其它实施方案中，血样为全血样品、包括红细胞的样品或包括磁性颗粒的样品，且T2时间常数的上界为1000-2000 ms (例如1500-2000、1000-1500或1000-1200 ms)。在任何上述方法的又一具体的实施方案中，算法是拉普拉斯逆变换，其包括范围为约1.0e-10-约4.0e0的正则化参数(α)。

本发明的特征还在于用于评价受试者的止血状况的方法，方法包括：(i)提供自受试者中抽取的血液以产生血样；(ii)对血样中的水进行一系列磁共振弛豫率测量；(iii)按照本发明的方法，应用区分血样内两个或更多个独立水群体的算法变换测量，得到一个或多个磁共振参数值；和(iv)根据步骤(iii)的结果，确定受试者是否是正常、有出血状况或有促血栓形成状况。

在相关方面，本发明的特征在于评价血小板活性的方法，所述方法包括：(i)提供分离和洗涤的血小板；(ii)将分离和洗涤的血小板与包括预定的最低水平的血纤蛋白原的贫血小板血浆混合以形成试验样品；(iii)通过将凝固引发剂加入试验样品以引发凝固过程；(iv)对试验样品中的水进行一系列磁共振弛豫率测量；(v)应用区分试验样品内的两个或更多个独立水群体的算法变换测量，其中各个独立水群体的特征在于具有一个或多个值的一个或多个磁共振参数；和(vi)根据步骤(v)的结果，评价血小板活性。在具体的实施方案中，凝固引发剂是RF和AA的组合。在另外的其它实施方案中，方法还包括(a)在血小板激活剂存在时和在血小板激活剂不存在时测量试验样品。

本发明的特征还在于评价全血样品中的血小板活性的方法，所述方法包括：(i)提供全血样品；(ii)将分离和洗涤的血小板与包括预定的最低水平的血纤蛋白原的贫血小板血浆混合以形成试验样品；(iii)通过将凝固引发剂加入试验样品中以引发凝固过程；(iv)对试验样品中的水进行一系列磁共振弛豫率测量；(v)应用区分试验样品内的两个或更多个独立水群体的算法变换测量，其中各个独立水群体的特征在于具有一个或多个值的一个或多个磁共振参数；和(vi)根据步骤(v)的结果，评价血小板活性。在具体的实施方案中，凝固引发剂是RF和AA的组合。在另外的其它实施方案中，方法还包括(a)在血小板激活剂存在时和在血小板激活剂不存在时测量试验样品。

另一方面，本发明的特征在于通过测量代表正进行凝固或溶解的样品中水的NMR弛豫率特征的信号以得到NMR弛豫数据并自NMR弛豫数据确定代表样品中凝固或溶解过程特征的磁共振参数值或值集，来监测凝固过程或溶解过程的方法。

在相关方面，本发明的特征在于通过测量代表具有一个或多个水群体的血样中水的NMR弛豫特征的信号以得到NMR弛豫数据，并自NMR弛豫数据确定与血样中至少一个水群体关联的磁共振参数值或值集，监测凝固过程或溶解过程的方法，其中磁共振参数值或值集代表凝固或溶解过程的特征。血样可包括至少2个水群体或至少3个水群体。在具体的实施方案中，磁共振参数值代表血样中血小板相关水分子的特征。在另外的其它实施方案中，磁共振参数值代表血样中功能性血纤蛋白原相关水分子的特征。在要求保护的方法的具体实施方案中，方法包括测量血小板相关的功能性血纤蛋白原的相对浓度。

在某些实施方案中，方法包括根据自受试者抽取的单一血样的凝固行为评价受试者的止血状况(例如用于正进行手术的患者的凝血管理、鉴定患者的血栓性并发症的风险、鉴定抵抗抗血小板疗法的患者、监测患者的抗凝疗法、监测患者的抗血小板疗法和/或监测患者的促凝血疗法)。

在本发明另外的其它实施方案中，方法包括评价自样品采集初始NMR弛豫率信号的3分钟、5分钟、6分钟、10分钟、15分钟、20分钟、30分钟、45分钟或60分钟内受试者的止血状况。

在相关方面，本发明的特征在于通过以下方面监测血液凝固过程或溶解过程的方法：(i)对血样中的水进行一系列弛豫率测量；(ii)应用区分血样内两个或更多个独立水群体的算法变换测量，其中各个独立水群体的特征在于具有一个或多个值的一个或多个磁共振参数；和(iii)根据步骤(ii)的结果，监测血样的血液凝固过程。

本发明的特征在于监测血小板活性的方法，所述方法包括：(i)对血样中的水进行一系列弛豫率测量；(ii)应用区分血样内两个或更多个独立水群体的算法变换测量，其中各个独立水群体的特征在于具有一个或多个值的一个或多个磁共振参数；和(iii)根据步骤(ii)的结果，监测血样的血小板活性。

本发明的特征还在于监测血小板抑制的方法，所述方法包括：(i)对血样中的水进行一系列弛豫率测量；(ii)应用区分血样内两个或更多个独立水群体的算法变换测量，其中各个独立水群体的特征在于具有一个或多个值的一个或多个磁共振参数；和(iii)根据步骤(ii)的结果，监测血样的血小板抑制。在具体的实施方案中，方法还包括：(iv)在血小板抑制剂存在时对第二血样中的水进行一系列弛豫率测量；(v)应用区分第二血样内的两个或更多个独立水群体的算法变换测量，其中各个独立水群体的特征在于具有一个或多个值的一个或多个磁共振参数；和(vi)根据步骤(ii)和(v)的结果，监测血样的血小板抑制。

本发明的特征还在于通过以下方面评价受试者的止血状况的方法：(i)对来自受试者的血样中的水进行一系列弛豫率测量；(ii)应用区分血样内两个或更多个独立水群体的算法变换测量，其中各个独立水群体的特征在于具有一个或多个值的一个或多个磁共振参数；和(iii)根据步骤(ii)的结果，评价受试者的止血状况。

算法可选自但不限于多指数算法、双指数算法、三指数算法、指数衰减算法、拉普拉斯变换、拟合优度算法、SSE算法、最小平方算法、非负最小平方算法和本文描述的任何其它算法。在具体的实施方案中，算法是拉普拉斯逆变换或由以下方程式(1) (即用于双指数拟合)或(2) (即用于三指数拟合)给出的算法。

在方程式(1)和(2)中，I为测量值T2的强度；t为时间；Amp_A为提取系数，表明指数项exp^(-t/T2A)贡献给测量的T2强度的程度；Amp_B为提取系数，表明指数项exp^(-t/T2B)贡献给测量的T2强度的程度；Amp_C为提取系数，表明指数项exp^(-t/T2C)贡献给测量的T2强度的程度；T2A为提取弛豫时间(extracted relaxation time)，表明水群体A对测量的T2强度的贡献；T2B为提取弛豫时间，表明水群体B对测量的T2强度的贡献；T2C为提取弛豫时间，表明水群体C对测量的T2强度的贡献；O为偏移常数(offset constant)。在任一种上述方法中，弛豫率测量可包括T2测量。磁共振参数值可包括T2参数值和/或振幅参数值。

对于进行流变转换的样品，水群体可随样品的组分和/或复杂性变化。在异质样品(例如全血)中，有不同的水群体，例如血浆水、区室化水即细胞(红细胞、白细胞和血小板)水和与全血处理例如凝血(例如血清)或血块溶解的功能特征有关的水。本发明的方法允许监测样品中各种水群体的变化，不论位置、区室或样品内发生的变化。方法可用来检查给定样品的流变学的变化或计算给定样品的一个或多个分析值(aPPT、PT-INR、血细胞比容、血小板活性)。

在任一种上述方法中，样品中的水可包括第一水群体和第二水群体，且与给定的水群体有关的NMR参数可与流变变化相关。例如，第二水群体的NMR参数值可与血小板活化正相关。类似地，第一水群体的T2参数值可与凝血时间相关。

在任一种上述方法中，磁共振参数值可包括介于250和500毫秒之间的第一水群体的T2值。

在任一种上述方法中，磁共振参数值可包括介于100和300毫秒之间的第二水群体的T2值。

在任一种上述方法中，样品还可包括T2值介于1和10毫秒的第三水群体。

在任一种上述方法中，信号产生于监测水中的质子或监测水中的氢原子。或者，在任一种上述方法中，信号产生于监测水中的质子或监测水中的氧原子。

在本发明的一些实施方案中，血样含有第四水群体和第五水群体，其中第四水群体与收缩的血块有关，第五水群体与收缩的血块周围的血清有关。第四和/或第五水群体的存在并非意味着本文定义的第一、第二或第三水群体存在或者需要其存在。

在任一种上述方法中，方法还可包括，根据磁共振参数值或值集，评价样品是否凝固性过高、凝固性过低或正常。

在任一种上述方法中，磁共振参数可代表受试者的止血状况(例如出血状况或促血栓形成病况)特征。例如，磁共振参数可表明低血小板活性；表明高血小板活性；表明高功能性血纤蛋白原活性；或表明低功能性血纤蛋白原活性。

在本发明的具体实施方案中，在测量代表NMR弛豫参数特征的信号之前，将顺磁剂(例如锰、锰络合物、钆、钆络合物或磁性颗粒)加入血样中。在一个优选的实施方案中为超顺磁颗粒。顺磁剂可以是平均直径介于3和40纳米之间、介于30和70纳米之间、介于70和100纳米之间、介于100和500纳米之间或介于500和1000纳米之间的超顺磁颗粒。在具体的实施方案中，在存在或不存在顺磁剂两种情况下，对来自单一患者的血样进行本发明的方法。

在本发明方法的另一个实施方案中，待分析的样品具有介于2 µL和400 µL之间(例如2 µL-10 µL、10 µL-20 µL、15 µL-50 µL、50 µL-100 µL、100 µL-250 µL或200 µL-500 µL)的体积。在另外的其它实施方案中，待分析的样品具有介于400 µL和4000 µL之间的体积。

在任一种上述方法中，NMR弛豫数据选自T1、T2、T1/T2混杂、T_1rho、T_2rho和T₂ ^*数据。另外，可测定和评价表观扩散系数(ADC) (参见Vidmar等. NMR in BioMedicine, 2009；以及Vidmar等, Eur J Biophys J. 2008)。另外，本发明的方法可利用脉冲场梯度(即随梯度强度的平方而变化的回波衰减的测量)、Hahn回波序列、自旋回波序列和/或FID信号比。

本发明的特征在于用于监测血液凝固过程的磁共振装置，其中该装置包括具有区分血样内两个或更多个独立水群体的算法的微处理器，其中各个独立水群体的特征在于磁共振参数值或值集。算法可选自但不限于多指数算法、双指数算法、三指数算法、指数衰减算法、拉普拉斯变换、拟合优度算法、SSE算法、最小平方算法、非负最小平方算法和本文描述的任何其它算法。

在相关方面，本发明的特征在于用于监测血块溶解的方法，所述方法包括：(i)提供凝血样品；(ii)使凝血样品与组织纤溶酶原因子(TPA)混合；(iii)对凝血样品中水进行一系列弛豫率测量；(iv)应用区分血样内两个或更多个独立水群体的算法变换测量，其中各个独立水群体的特征在于具有一个或多个值的一个或多个磁共振参数；和(v)根据步骤(iv)的结果，监测凝血的溶解。

在某些实施方案中，根据自受试者中抽取的血样的血液凝固行为，评价受试者的止血状况。凝固行为的实例包括凝固时间(R)、血块强度(MA)、血小板相关血块强度(MA_血小板)、功能性血纤蛋白原相关血块强度(MA_FF)和MA后30分钟的溶解百分比(LY30)。止血状况的实例包括促血栓形成状况、出血状况和正常状况。凝固行为或止血状况可在收集初始NMR弛豫数据后的某一时帧内(例如在10、6或3分钟内)建立。此外，在建立凝固行为时，可将一种或多种添加剂(例如血纤蛋白原或TPA)加入样品中。

在其它实施方案中，自受试者中抽取的血液的血液凝固过程通过以下方面监测：(i)对受试者第一血样(例如用添加剂处理的样品)的水进行一系列第一弛豫率测量；(ii)应用区分第一血样内两个或更多个独立水群体的算法，变换第一弛豫率测量；(iii)对受试者第二血样(例如未处理样品)的水进行一系列第二弛豫率测量；(iv)应用区分第二血样内的两个或更多个独立水群体的算法，变换第二弛豫率测量，其中各个独立水群体的特征在于一个或多个磁共振参数，其中各个磁共振参数具有一个或多个值；和(v)根据步骤(iv)的结果，监测受试者血液的凝固过程。样品之一(例如第一样品)可含有添加剂，例如血纤蛋白原或组织纤溶酶原激活物。在一些实施方案中，根据监测过程的结果评价或诊断受试者的止血状况(例如在10、6或3分钟内评价止血状况)。

在其它实施方案中，本发明的特征在于通过以下方面诊断受试者的止血状况的方法：(i)提供受试者的血样；(ii)测量代表血样中水的NMR弛豫率特征的信号以得到磁共振参数的一个或多个值；和(iii)根据步骤(ii)的结果对受试者进行诊断。诊断可根据磁共振参数值(或多个值)与预定阈值(或多个值)的比较进行。预定阈值可代表某种止血状况(例如正常、促血栓形成或出血)。可在采集初始NMR弛豫率信号的一定时间(例如在10、6或3分钟内)内评价止血状况。

在某些实施方案中，采用严格定义的数据提取方法评价凝固行为。可通过以下方面自所采集的NMR弛豫率数据集评价样品的凝固时间(R)：(i)计算第一水群体的T2时间曲线；(ii)计算T2时间曲线二阶导数的最大值；和(iii)根据步骤(ii)的结果，计算代表凝固时间特征的值(R)。可通过以下方面评价样品的血小板相关血块强度(MA_血小板)：(i)计算第一水群体的T2时间曲线；(ii)计算连接T2曲线上T2的起始值和T2曲线上T2的最大值的连线的斜率；和(iii)根据步骤(ii)的结果，计算代表样品的血小板相关血块强度(MA_血小板)特征的值。可通过以下方面评价样品的功能性血纤蛋白原相关血块强度(MA_FF)：(i)计算已用血纤蛋白原处理的第一样品中第一水群体的第一振幅时间曲线；(ii)计算第二未处理样品中第一水群体的第二振幅时间曲线；(iii)计算第一振幅时间曲线和第二振幅时间曲线之间的差异；和(iv)根据步骤(iii)的结果，计算代表样品的功能性血纤蛋白原相关血块强度(MA_FF)特征的值。可按以下方面评价样品的MA后30分钟的溶解百分比(LY30)：(i)计算已用TPA处理的第一样品中第二水群体的第一T2时间曲线；(ii)计算第二未处理样品中第二水群体的第二T2时间曲线；(iii)计算第一T2时间曲线和第二T2时间曲线之间的差异；和(iv)根据步骤(iii)的结果，计算代表样品的MA后30分钟的溶解百分比(LY30)特征的值。

在其它实施方案中，通过以下方面利用T2特征(signature)曲线评价或诊断受试者的止血状况：(i)测量代表自受试者抽取的血样中水的NMR弛豫特征的信号以得到NMR弛豫数据；和(ii)自NMR弛豫数据确定代表受试者的止血状况特征的T2特征。可将T2特征与标准曲线或标准曲线集进行比较以确立受试者的止血状况。

在其它实施方案中，本发明的特征在于通过以下方面监测含水材料的方法：(i)提供能够从液体流态转换成凝胶状态的含水材料；(ii)测量代表该物质中水的NMR弛豫特征的一系列信号以得到NMR弛豫数据；和(iii)自NMR弛豫数据确定代表含水材料特征的时间曲线。在一些实施方案中，时间曲线是T2弛豫曲线以外的弛豫曲线，例如T1时间曲线、T2时间曲线或杂化T1/T2时间曲线。在相关的实施方案中，含水材料是全血、聚丙烯酰胺水凝胶、聚乙烯吡咯烷酮水凝胶、聚乙二醇水凝胶、聚乙烯醇水凝胶、聚丙烯酸水凝胶、角叉菜胶、海藻胶或明胶。在一个优选的实施方案中，含水材料是丙烯酰胺水凝胶。

另一方面，本发明的特征在于通过以下方面评价血液监测装置的校准状态的方法：(i)提供能够从液体流态转换成凝胶状态的含水材料；(ii)采用血液监测装置测量含水材料的特征；和(iii)通过将步骤(ii)中得到的特征与预定阈值进行比较，来评价血液监测装置的校准状态。在优选的实施方案中，含水材料是丙烯酰胺凝胶，血液监测装置是T2读数器(T2reader)或凝血弹性描记法(TEG)分析仪。在特定的实施方案中，在分析前，将顺磁剂(例如锰、锰络合物、钆、钆络合物或超顺磁颗粒)加入样品中。顺磁剂可以是平均直径介于3和40纳米之间、介于30和70纳米之间、介于70和100纳米之间、介于100和500纳米之间或介于500和1000纳米之间的超顺磁颗粒。

在某些实施方案中，使用自血样的一系列NMR弛豫率测量来产生代表血样中某种水群体特征的一系列磁共振参数值(例如T2或振幅值)。可将一系列的磁共振参数值作为时间的函数作图以产生同样代表该水群体特征的时间曲线。例如，在样品进行凝固时，可对血样中某一水群体的T2时间曲线(或者振幅曲线)作图。这些时间曲线还可用来产生其它曲线。例如，可对T2时间曲线的第一或第二时间导数制图。时间曲线可用作评价血样的凝固行为或对其抽取血样的受试者的止血状况的基础。类似地，从获自相同受试者的两个不同样品(例如处理样品和未处理样品)产生的曲线可用作评价受试者血液的凝固行为或受试者的止血状况的基础。

在其它实施方案中，可根据将与样品或受试者有关的磁共振参数或时间曲线的值与预定的阈值进行比较，来评价样品的凝固行为或受试者的止血状况。可以多种不同的方法确立预定阈值。例如，预定阈值可以代表止血状况(例如正常、促血栓形成或出血状况)特征。阈值可从平均值或自正常和异常受试者抽取的血液所观察的值的范围确定。或者，阈值可从当用于本发明的基于NMR的方法时一贯提供相同参数或曲线的标准样品来确定(例如以特定方式处理以凝固的血样或丙烯酰胺凝胶)。

另一方面，本发明的特征在于通过以下方面评价受试者的止血状况的方法：(i)对自受试者抽取的血样中的水进行一系列弛豫率测量(例如T2弛豫率测量)，其中血样正在进行凝固过程或溶解过程，且其中测量提供两个或更多个衰减曲线，其中各衰减曲线代表该过程的时间点特征；(ii)将数学变换(例如拉普拉斯逆变换)应用于两个或更多个衰减曲线以鉴定在所述过程中在两个或更多个时间点上的血样中的两个或更多个水群体(例如具有血清相关T2信号的水群体和具有血块相关T2信号的水群体)，产生具有两个或更多个信号强度的两个或更多个磁共振参数值，其中各水群体具有特征性磁共振参数值和磁共振参数值的信号强度特有的浓度；(iii)自(a)两个或更多个时间点；(b)两个或更多个磁共振参数值；和(c)两个或更多个信号强度，生成3D数据集；(iv)自3D数据集提取代表受试者止血状况特征的一个或多个凝固行为(例如凝固时间(R)、血纤蛋白溶解行为、血块强度(MA)、血块动力学行为、血小板相关血块强度(MA_血小板)、功能性血纤蛋白原相关血块强度(MA_FF)、MA后30分钟的溶解百分比(LY30)或血细胞比容)；和(v)根据一个或多个凝固行为评价受试者的止血状况。

在某些实施方案中，本发明的特征在于将抗血小板抗体或Fab片段(例如阿昔单抗)加入正进行凝固过程或溶解过程的样品(例如全血样品)中。在其它实施方案中，本发明的特征在于将凝固激活剂或血小板抑制剂加入正进行凝固过程或溶解过程的样品(例如全血样品)中。

另一方面，本发明的特征在于通过以下方面评价血块的强度或血块的血小板活性的方法：(i)对血块中的水进行T2弛豫率测量，其中该测量提供衰减曲线；(ii)将数学变换(例如拉普拉斯逆变换)应用于衰减曲线以鉴定血块中水群体的信号强度，其中水群体相当于收缩血块水环境或血清水环境；和(iii)根据水群体的信号强度，评价血块的强度或血块的血小板活性。

另一方面，本发明的特征在于通过以下方面评价受试者的止血状况的方法：(i)提供来自受试者的血样；(ii)对样品中的水进行T2弛豫率测量，其中该测量提供衰减曲线；(iii)将数学变换(例如拉普拉斯逆变换)应用于衰减曲线以鉴定血清相关T2信号和血块相关T2信号；和(iv)根据血清相关T2信号和血块相关T2信号之间的差异或血块相关T2信号的外观评价受试者的止血状况。

另一方面，本发明的特征在于通过以下方面诊断受试者的止血状况的方法：(i)对自受试者抽取的血样中的水进行一系列NMR弛豫率测量；(ii)传送NMR弛豫率测量或是NMR弛豫率测量特有的数据用于处理，所述处理包括本文描述的任何方法；和(iii)接收步骤(ii)的结果，并根据结果诊断受试者。

本发明的特征还在于用于降低配备心脏辅助装置的受试者的出血或凝血的风险的方法，所述方法包括：(i)采用上述方法评价受试者的止血状况；和(ii)根据步骤(i)，调节心脏辅助装置的操作参数(例如速度、强度、压力、流速、泵容量或充填容量)以降低受试者的出血或凝血的风险。在具体的实施方案中，心脏辅助装置选自体外心脏分流机(extracorporeal cardiac bypass machines)和植入式血泵，例如左心室辅助装置。

本发明的特征还在于用于降低配备心脏辅助装置的受试者的出血或凝血的风险的方法，所述方法包括：(i)采用本文所述方法评价受试者的止血状况；和(ii)根据步骤(i)，将抗凝疗法、抗血小板疗法和/或促凝血疗法给予受试者以降低受试者的出血或凝血的风险。在具体的实施方案中，心脏辅助装置选自体外心脏分流机和植入式血泵，例如左心室辅助装置。

另一方面，本发明的特征在于将采用本发明基于NMR的技术测量的样品的凝固或溶解行为与采用本领域已知系统在等同样品中测量的流变变化或凝固或溶解进行比较的方法。

可采用本发明的方法对样品的多个参数进行同时测量(例如同时测量与样品凝固或受试者的止血状况相关的参数)。

在任一种上述方法中，方法可包括以下步骤：(i)将全血或其组分加至装入一种或多种添加剂(例如肝素、柠檬酸盐、纳米颗粒制剂(nanoparticle formulation)、顺磁剂、血纤蛋白原、组织纤溶酶原激活物(TPA)、抗血栓药例如阿昔单抗或本文所述的任何其它添加剂)的管中，和(ii)将内容物混合以引发凝固过程。在具体的实施方案中，一种或多种添加剂是可在全血或其组分中复溶的干燥添加剂。例如，可用样品管底部小颗粒胶原引起全血或其组分原位凝固。在具体的实施方案中，样品管的至少一部分用胶原包覆以引发凝固。在另外的其它实施方案中，样品管的局部区域用凝固引发剂(例如胶原或本文描述的另一种凝固引发剂)包覆以允许血块形成的空间控制。

在任一种上述方法中，方法可包括使用T2读数器测量样品的T2信号的步骤。例如，可采用利用长的总回波时间的CPMG脉冲序列进行血液(全血、稀释血液、PRP等)的定量T2测量，其总回波时间为约5 × T2 (例如τ通常大于62.5 µs和小于1000 µs)。在具体的实施方案中，在引发凝固过程之前，使用T2读数器将样品预温育至所需温度。

对于含有未凝固血的样品，要了解，未凝固血可沉淀以产生具有大于1的T2值的样品，但是这种沉淀的时间量程通常长于血块形成的时间量程。

本发明的方法涉及原始NMR数据的分析以产生有关正进行凝固或溶解过程的样品的两个或更多个水群体的信息。实例为数据的拉普拉斯逆变换以鉴定产生自样品内同时观察到的不同水群体的信号强度。或者，可采用本领域已知的数据采集和数据操作技术，获得有关样品中的两个或更多个水群体的信息，例如(i)使用Hahn回波脉冲序列的弛豫测量；(ii)基于初始90度脉冲后在固定时间延迟下FID信号振幅和随后180度脉冲后在固定延迟下的振幅间的差异的差异测量；(iii)在根据其弛豫性质配置以减弱特定水群体由此突出显示其它水群体的脉冲场梯度存在下T2值和回波衰减的测量；和(iv)差异测量(即针对(a)单次90度脉冲后的FID、(b) CPMG弛豫曲线、(c)通过一系列Hahn回波或自旋回波获得的弛豫曲线或(d) CP弛豫曲线，在两个或更多个不同时间点上的信号强度间的差异)。可在本文描述的任何方法中采用备选方法。

本文所用术语“3D数据集”是指经测量和/或推导的数据点的集合，其可被汇编成代表在一段时间内正进行凝固过程或溶解过程的样品中变化特征的3D图。自3D数据集导出的3D图可描述样品内不同水群体的出现和/或消失，并量化这些水群体在特定时间点上或时间范围内的强度和弛豫时间(例如T2弛豫时间)。

本文所用术语“第一水群体”是指其特征在于未凝固血的初始振幅随凝固而降低的全血样品的水群体。第一水群体也可指本申请其它部分称为A群的水群体。从第一水群体提取的振幅和T2数据分别称为Amp_A和T2A。

本文所用术语“第二水群体”是指其特征在于未凝固血的初始振幅随凝固而增加的全血样品的水群体。第二水群体可能与血块的血小板浓度有关。第二水群体也可指本申请其它部分称为B群的水群体。从第二水群体提取的振幅和T2数据分别称为Amp_B和T2B。

本文所用术语“第三水群体”是指其特征在于在凝固过程中振幅大致恒定的全血样品的水群体。第三水群体可能与结合红细胞内的生物分子的水有关。第三水群体也可指本申请其它部分称为C群的水群体。从第三水群体提取的振幅和T2数据分别称为Amp_C和T2C。

本文所用术语“第四水群体”是指其特征在于范围约400毫秒-约2,200毫秒的T2值宽泛分布的全血样品的水群体。与第四水群体有关的T2值的范围可取决于用于收集数据的硬件和材料(例如样品管)。第四水群体可能与收缩血块周围的血清有关，并且在血样中加入抗血小板聚集药(例如阿昔单抗)时与第五水群体合并。第四水群体的特征可能与血小板活性和/或血块强度一致。

本文所用术语“血清水环境”是指存在于未凝固血样品中的水环境，或保持未凝固的血样的部分。“血清相关T2信号”是指产生于血清水环境的信号(例如与收缩血块周围的血清有关的凝固血样品内的相应T2信号)。血清相关T2信号通常存在于含有收缩血块的样品和已从中取出收缩血块的凝固样品两者中。血清相关T2信号含有其T2值高于血块相关T2信号的T2值的解析峰。血清水环境可能与上文所述第四水群体有关。

本文所用术语“第五水群体”是指特征为范围为约80毫秒-约500毫秒的T2值分布的全血样品的水群体。与第五水群体有关的T2值的范围可取决于用于收集数据的硬件和材料(例如样品管)。第五水群体可能与收缩血块有关。第五水群体的特征可能与凝固时间和/或血纤蛋白溶解活性一致。

本文所用术语“收缩血块水环境”是指存在于收缩血块且是血块形成特有的水环境。“血块相关T2信号”是指产生于收缩血块水环境的信号(不论在测量时血块是否被收缩)。血块相关T2信号存在于含有收缩血块的凝固的全血样品和含有已从中取出周围血清的收缩血块的样品两者中。血块相关T2信号含有其T2值低于血清相关T2信号的T2值的解析峰。收缩血块水环境可能与上述第五水群体有关。

本文所用术语“算法”是指用于处理或变换数据的数学程序。

本文所用术语“测定法”是指监测血液凝固行为的方法。

本文所用术语“凝固行为”是指与血块、形成血块或进行溶解的血块有关的参数(例如凝固时间(R)、血纤蛋白溶解行为、血块强度(MA)、血块动力学行为、血小板相关血块强度(MA_血小板)、功能性血纤蛋白原相关血块强度(MA_FF)、MA后30分钟的溶解百分比(LY30)等)。

本文所用术语“凝固过程”是指液体中导致样品内溶剂水分子局部空间变化且特征在于水性液体内溶剂水分子NMR弛豫率变化的过程。水性液体可能具有多于一个群体的溶剂水分子，各群体的特征在于随含水样品进行凝固过程而变化的NMR弛豫参数。本发明的方法可用来监测含有凝胶形成组分的水性溶液中的凝固过程，所述凝胶形成组分包括而不限于蛋白质性溶液(尤其例如血液、血浆或明胶)和非蛋白质性水凝胶。

本文所用术语“溶解过程”是指液体中导致样品内溶剂水分子局部空间变化且特征在于水性液体内溶剂水分子NMR弛豫率变化的过程。水性液体可具有多于一个群体的溶剂水分子，各群体的特征在于随含水样品进行溶解过程而变化的NMR弛豫参数。本发明的方法可用来监测含有凝胶形成组分的水性溶液的溶解过程，所述凝胶形成组分包括而不限于蛋白质性溶液(尤其例如血液、血浆或明胶)和非蛋白质性水凝胶。

本文所用术语“功能性血纤蛋白原”是指血块中有助于血块强度的血纤蛋白原。

本文所用术语“凝胶状态”是指包括水和固体的分散体，其中水分子的移动性与液体流态的水分子的移动性相比降低。凝胶状态可自聚合物和/或蛋白质(例如自凝血、明胶或本文所述任何凝胶形成材料)形成。

本文所用术语“开始测定后的给定时间”是指可在涉及监测血液凝固行为的测定开始之后测定凝固行为的时间。开始测定后的给定时间的实例包括60分钟、35分钟、45分钟、10分钟、5分钟、2分钟和1分钟。

本文所用术语“心脏辅助装置”包括但不限于体外心脏分流机和植入式血泵，例如左心室辅助装置。

本文所用术语“血细胞比容”是指以全血样品中红细胞按体积计的百分比。

本文所用术语“止血状况”是指以受试者血液的凝固行为特征的受试者的状况。止血状况可以是促血栓形成的(血块形成的风险增加)、出血的(自发出血的风险增加)或正常的(既非促血栓形成又非出血)。止血状况也可指特定的血栓性病症(例如C蛋白缺乏症、S蛋白缺乏症、Z蛋白缺乏症、抗凝血酶缺乏症、抗磷脂抗体综合征、抗凝疗法抵抗或高同型半胱氨酸血症)。在其它情况下，止血状况可由对受试者的生理病况作出反应或为了防止受试者的生理病况发生而给予受试者的抗凝血药引起。这类生理病况包括心房颤动、心肌梗死、不稳定心绞痛、深静脉血栓形成、肺栓塞和急性缺血性中风。同样地，止血状况可通过将抗凝血药给予进行侵入性外科手术(例如关节置换、手术置换机械心脏瓣膜或植入机体的其它装置)的受试者而引起。可通过测定自受试者抽取的一个或多个血样的一种或多种凝固行为来评价受试者的止血状况。

本文所用术语“磁共振参数”是指从NMR弛豫率测量提取的弛豫率或振幅。

本文所用术语“NMR弛豫率”是指样品中以下的任一个：T1、T2、T_1rho、T_2rho和T₂ ^*。NMR弛豫率可采用T1/T2混杂检测方法测量和/或表示。另外，可测定或评价表观扩散系数(ADC)(Vidmar等NMR in BioMedicine，2009；以及Vidmar等，Eur J Biophys J. 2008)。

本文所用术语“血小板”是指有助于血块形成的细胞部件。

本文所用术语“预定阈值”是指由本发明的方法推导的且代表特定流变状态特征或代表正常或异常结果特征(例如代表正常受试者的血液特征，或代表患有异常止血状况的受试者的血液特征)的标准参数值或值集、标准时间曲线或标准特征曲线。可通过测量例如自正常和/或异常受试者群体抽取的血样的NMR参数值，来获得预定阈值。可选择预定阈值以区分样品的两个或更多个不同的可能的流变状态。例如，当样品为血样时，可采用预定阈值诊断受试者的止血状况。

本文所用术语“读数器”或“T2读数器”是指用于检测凝血相关活化(包括样品的凝固和血纤蛋白溶解)的装置。一般可使用T2读数器来表征样品(例如生物样品例如血液或非生物样品例如丙烯酰胺凝胶)的性质。这类装置描述于例如国际公布号WO2010/051362，其通过引用结合到本文中。

本文所用术语“相对浓度”是指一个水群体相对于另一个(例如第二或第三)水群体的比较浓度或体积分数。例如，水群体A的相对浓度可以是水群体B的浓度的2倍(或5倍或10倍)。

本文所用术语“水群体的信号强度”是指针对样品中特定水群体的弛豫率测量的强度，其作为(i)代表特定水群体特征的峰高或(ii)代表特定水群体特征的一个或多个峰的积分被测量。

本文所用术语“处理的样品”是指含有添加剂的血样，所述添加剂的浓度大于在凝固引发剂(例如氯化钙)不存在时防止正常样品凝固所必需的浓度。

本文所用术语“未处理的样品”是指不含大于在凝固引发剂(例如氯化钙)不存在时防止正常样品凝固所必需浓度的浓度的添加剂的血样。

本文所用术语“全血”是指受试者的包括红细胞在内的血液。全血包括通过处理步骤改变或通过加入添加剂(例如肝素、柠檬酸盐、纳米颗粒制剂、血纤蛋白原、组织纤溶酶原激活物(TPA)、胶原、抗血栓药例如阿昔单抗或其它添加剂)改良的血液。

本文所用术语“合并的全血血小板”是指富含血小板的血液或血液制品(例如血浆)。合并的全血血小板包括通过处理步骤改变或通过加入添加剂改良的样品。

本文所用术语“T1/T2混杂”是指综合了T1和T2测量的任何检测方法。例如，T1/T2混杂的值可以是通过两个或更多个不同T1和T2测量间的比率或差异的组合获得的复合信号。T1/T2混杂可通过例如采用脉冲序列获得，其中以交叉方式交替测量或获取T1和T2。另外，可用测量由T1和T2弛豫率或机制两者组成的弛豫率的脉冲序列获取T1/T2混杂信号。

本文所用术语“T2特征”是指通过将数学变换(例如拉普拉斯变换或拉普拉斯逆变换)应用于在流变事件期间在离散时间点上或在规定持续时间内与弛豫率参数有关的衰减曲线而建立的曲线。T2特征曲线提供有关血块中多个水群体的相对丰度的信息。在凝固或血纤蛋白溶解进行时，T2特征曲线反映血块内的变化。可有利地利用T2特征实时评价受试者的经区分的止血状况。另外，T2特征可为二维图像(强度相对于T2值或T2值相对于时间)或三维图像(强度相对于T2值相对于时间)。二维或三维图像中的T2值可被其它NMR信号(例如T1、T1/T2混杂、T_1rho、T_2rho和T₂ ^*)替换或与其它NMR信号比较。

根据下列详细描述、附图和随附权利要求书，本发明的其它特征和优势将是显而易见的。

附图简述

图1A-1C表示用于鉴定来自单一FID的样品内的多个水群体的NMR弛豫率的示图和方程式及用于从代表样品的凝固状态特征的弛豫率提取特征的方法。图1A是表示说明CK样品的三次指数曲线拟合(运用方程式2)的示图。图1B显示说明初始快速相截断后CK样品二次指数曲线拟合(运用方程式1)的示图。图1C是用来由NMR弛豫率测量鉴定血液凝固行为的算法的示图描述。

图2表示两个曲线图，显示进行凝固的单一CK血样中不同水群体所观察到的T2弛豫值(T2A和T2B)的变化。该图说明了可随时间的变化监测独立水群体的弛豫率。在凝固过程中，水群体A的T2值最初下降，然后升高，然后到平稳期；在凝固过程中，水群体B的T2值最初升高，达到峰值，然后下降。进行凝固或溶解过程的血样中水群体T2值的变化可代表血样的凝固性过高或凝固性过低。

图3是一系列曲线图，表示进行凝固的CK血样中不同水群体的振幅值(AmpA和AmpB)的变化。从符合献血标准且未接受抗凝血药的4名不同健康受试者中采取血样。进行凝固或溶解过程的血样中水群体振幅值的变化可代表血样的凝固性过高或凝固性过低。

图4是CK (高岭土)相对于ADP (腺苷二磷酸) + RF (蛇毒凝血酶和因子XIII)相对于来自2名不同患者的A活化样品的AmpA和AmpB的系列图(对于不同活化途径的描述参见实施例1和表1)。在2个样品中，高岭土活化样品显示在血块形成期间AmpB显著增加。在2个受试者样品中，A活化样品不显示在血块形成期间AmpB显著增加。激活剂RF激活血纤蛋白形成。当使用ADP + RF激活剂时，来自一名受试者的样品不显示在血块形成期间AmpB明显变化，而来自另一名受试者的样品显示在血块形成期间AmpB明显变化。在不同条件下(即在不同凝固引发剂或凝固抑制剂存在时)进行凝固或溶解过程的血样中水群体NMR参数值的变化性可代表血样的凝固性过高或凝固性过低和/或代表从中采取样品的受试者的止血状况。

图5是单个患者的一组示例性经处理的T2凝血曲线。顶行显示原始的T2A、T2B和AmpB曲线。中间行表示曲线的一阶导数，底行表示曲线的二阶导数。

图6表示其中计算T2A + pT2B曲线的方式：(a)显示加入pT2B将如何影响T2A曲线的形状的T2A曲线图；(b)显示如何通过在达到最大T2B值后的全部时间点上取最大T2B值和实际T2B值间的差异来计算pT2B的T2B曲线图；和(c)以相同的计时器通过将T2B曲线中的阴影部分加于T2A曲线中形成的T2A + pT2B曲线图。

图7是其中对提取的数据进行数据移位和镜射以模拟TEG描迹图的T2凝血曲线。该图说明水探测揭示了微观次序的早期变化，这可允许在观察到凝固时间R之前收集额外的信息。

图8a和8b表示显示未凝固血的T2信号随血细胞比容水平逆向变化的曲线图。未凝固血的T2信号随血细胞比容(HCT)水平逆向变化。如图8a中所示，跨越大范围HCT参考值的不同患者样品大体上证实了这一点。图8b中所表示的将校准方法应用于横跨一定范围HCT稀释的单个患者样品，显示对HCT的线性依赖。

图9表示CK运行的T2 R和TEG R之间的关联图；实线表示由关联图计算的回归线。

图10显示T2凝血特征“T2A起始斜率”和相当于血小板相关血块强度(MA_血小板)的TEG项(MA_凝血酶 – MA_A)的关系。

图11显示自50%柠檬酸盐全血中的功能性血纤蛋白原滴定的T2凝血结果。两条T2凝血振幅曲线显示相同强度标上的AmpA和AmpB；(a)是未加入血纤蛋白原的50%柠檬酸盐全血；(b)是加入1.25 mg/mL血纤蛋白原的50%柠檬酸盐全血；和(c)显示对患者样品进行的血纤蛋白原滴定的关联图。

图12表示对血纤蛋白溶解的T2凝血敏感性。(a)和(b)中显示2名不同患者的T2A曲线；(c)和(d)中显示了相同的2名不同患者的T2B曲线。实线显示缺乏血纤蛋白溶解的高岭土曲线，短划线显示存在血纤蛋白溶解的高岭土曲线。

图13表示健康样品和血纤蛋白溶解样品的T2凝血和TEG间的关联图。实线圆内的数据点是健康K运行。虚线圆内的数据点是血纤蛋白溶解K运行。两个圆以外的数据点是部分地血纤蛋白溶解运行。

图14A-D表示比较本发明的方法与现有分析方式的关联图。使用用于T2MR的促凝血酶原激酶试剂(Thrombotest，Axis Shield)和1:5稀释的全血及用于Stago Start系统的标准试剂和血浆方案，表明对于PT/INR与Stago初步相关(参见图14A)。透过>40个正常患者样品获得与TEG凝固时间的相关性，其非优化R2相关性>0.8。(参见图14B)。还发现PT时间对于血浆与Stago的相关性(参见图14D)和对于全血与Hemochron的相关性(参见图14C)。参见实施例7。

图15表示T2衰减曲线和相应的T2特征曲线，其T2特征曲线上的特征可能随样品组成的变化而变化。

图16表示对应于患者样品KP 29476的T2数据的拉普拉斯逆变换和获自分离后血清和收缩血块的T2数据的各拉普拉斯逆变换。曲线图显示牢固血块的形成导致两个不同的水群体(即血块中的水群体和血清中的水群体)。较长T2时间的信号对应于血清相关T2信号，较短T2时间的信号对应于血块相关T2信号。

图17表示从相同患者抽取的两个不同样品的2个重叠T2弛豫谱和TEG血块强度(MA)。与含有较强血块(MA = 65；258毫秒)的样品相比，含有较弱血块(MA = 19.2)的样品显示血块相关信号和血清相关信号间的差异值较低(182毫秒)。图17中所示光谱在T2读数器上收集。

图18表示使血块强度(MA值)与血块相关信号和血清相关信号间的差异(△T2)关联的两名患者的曲线图。数据显示递增血块强度与△T2正相关。

图19表示在2个不同时间点上在T2读数器上收集的患者样品的2个T2弛豫谱。该谱显示对应于样品中的血液的在时间0时的初始有效峰。在20分钟时，两个有效峰是明显的。具有较短T2时间(约200-300毫秒)的峰对应于T2血块水环境，较长T2时间(约450-580毫秒)的峰对应于T2血清水环境。

图20表示患者样品29328和29350的3D图。针于样品29328和29350测量的TEG MA值分别为68.4和61.9。

图21表示如实施例14所述含有4种不同浓度的阿昔单抗的4个样品的3D图。数据在Bruker minispec中收集。

图22表示如实施例14所述在0.1分钟时含有不同浓度的阿昔单抗的5个血样的T2弛豫率谱。数据在Bruker minispec中收集。

图23表示如实施例14所述在20分钟时含有不同浓度的阿昔单抗的4个血样的T2弛豫谱。4个T2弛豫谱间的差异说明抗血小板药对在凝固期间水分布到样品内的离散群中的作用。这些差异与如通过TEG测量的血块强度的差异一致，当水群体在较高浓度的阿昔单抗下合并时其血块强度下降。数据在Bruker minispec中收集。

图24表示自使用T2读数器收集的3D数据集制作的3D图。3D图显示强度快速下降的初始有效水群体。在介于8和10分钟的时间内，出现两个不同的水群体。具有较低T2值的水群体(对应于血块相关T2信号的群体)的出现与凝固时间一致。

图25表示对于(a)未加入Reopro®的天然样品和(b)具有用8 µg/mL Reopro®抑制的血小板的样品，由使用T2读数器收集的3D数据集制作的2个3D图。3D图显示强度快速下降的初始有效水群体。在6.3和8.5分钟之间的时间内，(a)中的天然样品出现两个不同的水群体。血小板抑制降低血块相关信号的信号强度，并且使血清相关信号移位至较低的T2值。

图26A-C表示含和不含不同大小的顺磁剂的血样的T2弛豫曲线的变化。在不含磁性颗粒(参见图26A)、含有CLIO纳米颗粒(30nm大小；约0.05ng) (参见图26B)和含有Seramag超顺磁颗粒(730nm大小；约0.05ng) (参见图26C)的情况下运行样品。在典型的柠檬酸盐化高岭土实验中加入30nm纳米颗粒消除血块信号(在T2=200毫秒下)，在T2约100毫秒时仅存在1个峰。加入730nm超顺磁颗粒不妨碍观察2个峰的能力。参见实施例4。

图27A-C显示T2MR表面对全血血纤蛋白溶解敏感。为了对此进行评价，用组织纤溶酶原激活物(TPA)掺入健康供体样品。证实了对血纤蛋白溶解结果的高敏感性和快速时间。参见实施例19。

发明详述

本发明的方法和装置可用于评价血栓性事件的风险和发生，血栓性事件包括患有或疑似患有血管疾病的患者、特别是已经历经皮介入和可能有例如支架血栓形成、血管再狭窄、心肌梗死或中风等急性风险的患者的心肌缺血事件。例如，本发明的方法和装置可用于评价血小板反应性(即血块中血小板相关水分子的相对浓度)、凝固动力学、血块强度、血块稳定性和至血纤蛋白形成的时间(即R)，作为独立于对药物疗法的响应性的血栓性事件(例如心肌缺血)风险的指标(例如在给予抗血小板药物例如氯吡格雷后通过血小板反应性的变化进行评价)。这些指标还可用于防止由手术和经皮血管程序(例如支架放置或球囊血管成形术)所致的并发症，例如支架血栓形成或再狭窄。此外，可采用本发明的方法和装置鉴定对有血栓性事件风险或进行手术程序的患者安全有效的疗法(尤其例如剂量、方案、抗血小板疗法)。

可采用本发明的方法和装置监测在超过一个位置或区室中具有水的复杂样品(即具有大于一个水群体的样品)。例如异质样品(即全血)有各种水群体，例如血浆水、区室化水即细胞(红细胞、白细胞和血小板)水和与全血过程例如凝血(例如血清、血块)或血块溶解的功能特征有关的水。类似地，在正经历流变转换的样品中，一般有一个以上水群体；例如与凝胶状态有关的水，与凝胶状态无关的水，并且在某些情况下，与样品的特定区室有关的水(即细胞水)。本发明的方法允许通过同时观察样品中存在的各种水群体的变化来监测样品的变化。变化可包括新的水群体的形成或既有水群体相对信号的变化，这两种可代表在流变学变化之前、期间或之后样品的基础物理性质特征(例如样品中结构的有序化或无序化)。

凝固引发

对于执行本发明的方法，可采用各种技术引发凝固。柠檬酸盐化高岭土(CK)是aPTT (活化部分促凝血酶原激酶时间)和全血凝固时间的普通公用的引发剂。为了开始凝固过程，将氯化钙和高岭土与柠檬酸盐血样混合。CK活化样品的特征在于血块形成，其中血小板和血纤蛋白有助于血块产生。或者，在加入或不加入血小板激活剂(例如TRAP、AA或ADP)时，可以使用激活剂RF以引发凝固。活化样品的特征在于血块形成，其中血纤蛋白而非血小板主要促成血块产生。或者可以使用ADP以激活血块。ADP活化样品的特征在于血块形成，其中血纤蛋白主要促成血块产生，而血小板产生较低程度的作用。在不同活化条件下观察到的信号反应可诊断受试者的止血状况。

可用于本发明方法的其它血液凝固激活剂包括胶原、肾上腺素、瑞斯托菌素、凝血酶、钙、组织因子、促凝血酶原激酶、高岭土、5-羟色胺、血小板活化因子(PAF)、血栓烷A2(TXA2)、血纤蛋白原、冯维勒布兰德因子(VFW)、弹性蛋白、纤连蛋白(fibrinonectin)、层粘连蛋白、玻连蛋白、血小板反应蛋白和镧系元素离子(例如镧、铕、镱等)。例如，可以使用激活剂的组合以助于鉴定导致受试者血样为凝固性过低的基础止血状况。

信号采集和处理

用于测定核共振参数的标准射频脉冲序列是本领域已知的，例如，如果要测定驰豫常数T₂，则传统上使用Carr-Purcell-Meiboom-Gill (CPMG)。射频脉冲序列的优化，包括序列中射频脉冲频率的选择、脉冲功率和脉冲宽度，取决于研究中的系统，并使用本领域已知的程序进行。

采用本发明的方法可获得的核磁共振参数包括但不限于T1、T2、T1/T2混杂、T_1rho、T_2rho和T₂ ^*。通常，采用本发明的方法获得的一个或多个核共振参数的至少一个是自旋-自旋驰豫常数T2。

如同其它诊断剂和分析仪器一样，基于NMR的诊断剂的目的是从样品中提取信息，并将高置信度结果传送给用户。当信息从样品流向用户时，通常进行若干变换以使信息满足特定用户的要求。可采用本发明的方法和装置获得有关受试者的止血状况的诊断信息。这通过将NMR弛豫信号处理成一个或多个系列的组分信号来实现，所述组分信号代表存在于例如正在凝固或已凝固的血样中的不同水分子群体。例如NMR弛豫数据，例如T2，可拟合至由下列方程式定义的指数衰减曲线：

　　(3)，

其中f(t)为随时间t变化的信号强度，A_i为第i组分的振幅系数，(T)_i为第i组分的衰减常数(例如T2)。对于本文论述的弛豫现象，检出信号是组分(i=1、2、3、4…n)的离散数的和。这个函数分别被称为一指数、双指数、三指数、四指数或多指数的。由于在科学和工程学中用于分析多指数过程的广泛需要，对于各系数，有若干用于快速获得A_i和(T)_i估值的已确立的数学方法。已成功应用和可应用于处理采用本发明方法获取的原始数据的方法包括拉普拉斯变换、代数解法、图像分析、非线性最小平方(其中存在许多flavor)、微分法、模式函数的方法、积分法、矩量法、有理函数逼近、帕德-拉普拉斯变换和最大熵法(参见Istratov, A. A.和Vyvenko, O. F. Rev. Sci. Inst. 70:1233 (1999))。针对低场NMR被明确证实的其它方法包括奇异值分解(Lupu, M.和Todor, D. Chemometrics andIntelligent Laboratory Systems 29:11 (1995))和因子分析。

存在可获得的利用这些指数拟合方法的一种或多种的若干软件程序和算法。指数拟合程序最广泛引用的来源之一是由Stephen Provencher编写和提供的称为“DISCRETE”和“CONTIN”的那些(Provencher, S. W.和Vogel, R. H. Math. Biosci. 50:251 (1980)；Provencher, S. W. Comp. Phys. Comm. 27:213 (1982))。Discrete是解析多元件指数曲线中的多达9个分立元件的算法。CONTIN是利用拉普拉斯逆变换解析具有弛豫时间分布的样品的算法。利用多指数分析的商业应用运用这些算法或类似算法。实际上，对于它们分析中的一些，Bruker minispec运用可公开获取的CONTIN算法。对于本文所述发明，预期弛豫时间是对各个样品唯一的且不是连接分布的离散值，因此不需要像CONTIN一样的程序，尽管它们可被采用。许多其它指数拟合方法的代码是一般可获得的(Istratov, A. A. &Vyvenko, O. F. Rev. Sci. Inst. 70:1233 (1999))，并可用来按照本发明的方法获得医学诊断信息。可获得信噪比和总采样时间如何与可测定的最大项数、可达到的最大分辨率和可拟合的衰减常数范围有关的信息。对于约10⁴的信噪比，有关独立于该分析方法的所测量的2个衰减常数的分辨率的理论极限值是>1.2的分辨率δ=(T_i/T_i+1) (Istratov, A. A和Vyvenko, O. F. Rev. Sci. Inst. 70:1233 (1999))。因此认为可分辨的衰减常数间的差异可用其量值度量，其不完全是直观的且与借助光学检测的分辨率不同。了解最大分辨率和分辨率对信噪比的依赖将有助于评价拟合算法的性能。

可将本发明的方法与本领域已知的系统和装置(例如TEG®、ROTEM®或SONOCLOT®或测量流变变化的其它装置)进行比较。本发明的方法还可用于台式NMR张弛测量器、台式时域系统或NMR分析仪(例如ACT、Bruker、CEM Corporation、Exstrom Laboratories、Quantum Magnetics、GE Security division、Halliburton、HTS-111 MagneticSolutions、MR Resources、NanoMR、NMR Petrophysics、Oxford Instruments、Process NMRAssociates、Qualion NMR Analyzers、SPINLOCK Magnetic Resonance Solutions或Stelar、Resonance Systems)。

用于用T2读数器采集数据的CPMG脉冲序列经设计以检测样品的固有T2弛豫时间。通常，这通过一个值指定，但对于含有复杂的混合状态的样品(例如进行凝固过程或溶解过程的样品)，可观察到T2值的分布。在这种情况下，用CPMG序列获得的信号是指数的和。用于自T2读数器输出提取弛豫信息的一个解法是以最小平方方式拟合指数的和。实际上，这需要有关拟合多少函数的既往信息。第二种解法是应用拉普拉斯逆变换(ILT)以解出构成所观察到的指数信号的T2值的分布。此外，CPMG序列S(t)的结果假定为指数的和：

　　(4)，

其中A_i是对应于弛豫时间常数T2_i的振幅。如果代替指数的离散和，信号假定为T2值的分布，则各状态的和可被表示为：

　　(5)

这具有与ILT相同的函数形式：

　　(6)，

并且可按原样处理。指数函数的ILT需要约束求解。可用来强加约束的几种方法是CONTIN、有限混合建模(FMM)和神经网络(NN)。拉普拉斯逆变换还可用于生成3D数据集。可如下生成3D数据集：通过收集T2衰减曲线的时间序列，并将拉普拉斯逆变换应用于各衰减曲线以形成3D数据集。或者，可将2D拉普拉斯逆变换应用于预先汇编的3D数据集以生成描述T2时间分布的转换的3D数据集。

在含有两相的异质环境中，几个不同的交换方案可起作用。在具有两个水群体(a和b)的这类环境中，r_a和r_b相当于这两种群体中水的弛豫率；f_a和f_b相当于在各相中的核分数；τ_a和τ_b相当于在各相中的滞留时间；α= (1/τ_a) + (1/τ_b)相当于化学交换速率。交换方案可指定为：(1)慢交换：如果相对弛豫率r_a和r_b，两个群体是静态的或缓慢交换的，则信号含有两个单独的组分，以时间常数T_2a和T_2b衰减；(2)快交换：如果与r_a和r_b相比，两个环境间水分子交换的速率是快速的，则总群体遵循单指数衰减，具有由各自群体弛豫率的加权和给定的平均弛豫率(r_av)；和(3)中间交换：在一般情况下，其中有两个弛豫率r₁和r₂其在慢交换极限r_a< r_b中r₁等于r_a，Amp₁ + Amp₂ = 1，且在快交换极限中r_1,2转向平均弛豫率，可应用方程式7、8、9和10：

　　(7)

　　8)

　　(9)

　　(10)

本发明的特征还在于在收集弛豫率数据时利用脉冲场梯度或固定场梯度。本发明的特征还在于采用Vidmar等(Vidmar等, NMR Biomed. 23: 34-40 (2010), 其通过引用结合到本文中)描述的扩散加权成像(DWI)技术，或用于多孔介质NMR的任何方法(参见例如Bergman等, Phys. Rev. E 51: 3393-3400 (1995)，其通过引用结合到本文中)。

或者，当本发明的方法采用T2*或自由感应衰减而非T2的测量进行时，可采用偏共振辐射(即非精确地在拉莫尔旋进频率下的辐射)产生例如样品中水质子的特定类别的弛豫性质。输出可呈用T2测量脉冲序列而非完整回波序列获得的单一回波的高度的形式。相比之下，正常T2测量利用许多回波的衰减高度以确定T2。T2*方法可包括使外加磁场的频率或强度移位和测量水质子吸收峰的宽度的步骤，其中较宽的峰或能量吸收与T2的较高值相关。

顺磁剂

本发明的方法可在引发凝固前在例如加入到血液中的顺磁剂(例如锰、锰络合物、钆、钆络合物或超顺磁颗粒)存在下进行。顺磁剂可以是游离锰、锰络合物(例如锰的EDTA络合物)、游离钆、钆络合物(例如钆的DTPA或DOTA络合物)或超顺磁颗粒。顺磁剂可在引发凝固后的较早时间点上将凝固样品与未凝固样品区分开来(参见图46)。

可用于本发明方法的超顺磁颗粒包括例如在美国专利号7,564,245和美国专利申请公布号2003-0092029 (其每一个通过引用结合到本文中)中描述的超顺磁颗粒。超顺磁颗粒一般呈缀合物的形式，也就是说超顺磁颗粒用将颗粒与待测量的全血样品的组分特异性和非特异性结合降至最低的部分包覆。由于其铁、金属氧化物或其它铁磁或亚铁磁纳米材料的超顺磁性，因此颗粒具有高的弛豫性(relaxivity)。铁、钴和镍化合物及其合金、稀土元素(例如钆)和某些金属间化合物(例如金和钒)是可用来产生超顺磁颗粒的铁磁物质。超顺磁颗粒可以是单分散的(每个超顺磁颗粒一个磁性材料(例如金属氧化物，例如超顺磁氧化铁)的单晶)或多分散的(例如每个磁性颗粒多个晶体)。磁性金属氧化物还可包含钴、镁、锌或这些金属与铁的混合物。超顺磁颗粒通常包括每晶体直径为约1-25 nm、例如约3-10 nm或约5 nm的金属氧化物晶体。超顺磁颗粒还可包括呈例如厚约5-20 nm或更大的核心和/或涂层的形式的聚合物组分。超顺磁颗粒的总尺寸可以为例如20-50 nm、50-200 nm、100-300 nm、250-500 nm、400-600 nm、500-750 nm、700-1,200 nm、1,000-1,500 nm或1,500-2,000 nm。可通过调节反应条件，例如按美国专利号5,262,176中所述，通过在铁盐用碱中和期间使用低温，来控制超顺磁颗粒大小。还可按例如美国专利号5,492,814所述，采用离心、超滤或凝胶过滤对颗粒分级，以制备均匀粒度材料。超顺磁颗粒还可按照Molday(Molday, R. S.和D. MacKenzie, “Immunospecific ferromagnetic iron-dextranreagents for the labeling and magnetic separation of cells (用于细胞标记和磁性分离的免疫特异性铁磁性铁-葡聚糖试剂),” J. Immunol. Methods, 52:353 (1982))的方法合成，并用高碘酸盐处理以形成醛基。然后可使含醛超顺磁颗粒与二胺(例如乙二胺或己二胺)反应，这形成席夫碱(Schiff base)，接着用硼氢化钠或氰基硼氢化钠还原。超顺磁颗粒可由铁磁流体(即超顺磁颗粒的稳定胶悬体)形成。例如，超顺磁颗粒可以是多种金属氧化物晶体的复合材料，大小为几十个纳米数量级，并且分散在含有表面活性剂(其吸附到颗粒上并使之稳定)的流体中，或通过金属离子溶液在碱性介质中沉淀。适合的铁磁流体由Liquids Research Ltd.公司用以下参考号销售：WHKS1S9 (A、B或C)，其是基于水的铁磁流体，包含磁体(Fe₃O₄)，具有直径为10 nm的颗粒；WHJS1 (A、B或C)，其是基于异链烷烃的铁磁流体，包含直径为10 nm的磁体(Fe₃O₄)的颗粒；和BKS25葡聚糖，其是用葡聚糖稳定的基于水的铁磁流体，包含直径为9 nm的磁体(Fe₃O₄)的颗粒。用于本发明的系统和方法的其它适合的铁磁流体是可获自Ademtech的油酸稳定化铁磁流体，其包括约70%重量α-Fe₂O₃颗粒(直径约10 nm)、15%重量辛烷和15%重量油酸。超顺磁颗粒通常是复合材料，其包括多种金属氧化物晶体和有机基质并且具有被官能团(即胺基或羧基)修饰以将结合部分与超顺磁颗粒表面连接的表面。例如，可用于本发明的方法的超顺磁颗粒包括市购可获自Dynal、Seradyn、Kisker、Miltenyi Biotec、Chemicell、Anvil、Biopal、Estapor、Genovis、ThermoFisher Scientific、JSR micro、Invitrogen和Ademtech的超顺磁颗粒，以及美国专利号4,101,435、4,452,773、5,204,457、5,262,176、5,424,419、6,165,378、6,866,838、7,001,589和7,217,457 (其每一个通过引用结合到本文中)中描述的超顺磁颗粒。

对于需要高灵敏度的某些测定法，采用T2弛豫测定法的分析物检测可能需要选择合适的颗粒，使充分灵敏的磁场诱导聚集成为可能。可使用单个较大的聚合物基质或铁磁流体组件内含有多个超顺磁氧化铁核心(直径5-15 nm)的颗粒(总直径100 nm-1200 nm，例如平均直径为100 nm、200 nm、250 nm、300 nm、500 nm、800 nm或1000 nm的颗粒)，或通过使用具有较高密度的较高磁矩材料或颗粒，和/或具有较高含铁量的颗粒，可获得较高的灵敏度。不受理论的限制，假设因每个颗粒高得多的铁原子数所致，这些类型的颗粒提供超过100×的灵敏度增益，这被认为由于存在于测定溶液的颗粒数减少和可能较大量的受各个场诱导的聚集影响的超顺磁铁而导致灵敏度增加。

对于某些测定法，通过在测定中使用直径小于40 nm的颗粒，使超顺磁颗粒的场辅助聚集最小化，可能是合乎需要的。

特征曲线的数据库

在一个实施方案中，本发明的特征在于将原始弛豫NMR数据变换成提供止血状况特有的特征曲线的格式的数据处理工具。优选的变换包括拉普拉斯变换或拉普拉斯逆变换(ILT)。各T2测量的数据可将其中信号强度相对于时间作图的时间维度变换成“T2弛豫”维度。ILT不仅仅提供有关存在于样品中的不同弛豫率及其相对幅度的信息，而且还报告了所述信号分布的宽度。

每个获得的T2弛豫曲线具有相应的二维特征，其对所有不同的水群体或水在样品中遇到的不同T2弛豫环境作图。可通过在凝固时间维度的持续时间内堆积各图，对这些曲线进行编制以形成3D数据集。这可用于生成显示不同水群体如何随时间变化的3D表面。

在基础病理学不被现行技术辨别的情况下，T2特征可成为临床上相关联的。例如，常常对具有异常PT或aPTT值的患者进行额外的研究，其包括使用患者血液与正常血浆的1:1混合物(以排除因子缺乏)的PT、aPTT或PT和aPTT分析，结果可表明特定因子缺乏症或冯维勒布兰德因子缺乏症。然而，患有凝固因子缺乏症的患者通常患有多于一种的缺乏症或患有不平稳或不受限制的凝固级联。在这些患者中，一种因子缺乏症的单个试验将无法揭示整个功能障碍，并且临床医生必须依靠临床征候学(过度出血或凝固)，遗憾的是，时间可能导致有害结果。检测T2特征的能力(对于具有正常或异常止血状况的患者)将允许快速了解复杂的病理生理凝固级联状况，并且改善临床结果。

可使用由不同NMR参数生成的3D图呈现采用本发明的方法采集的数据。可通过查看特定的患者类型或凝固曲线类型，来增加其它维度。可采用数据简化方法使可获得的复杂信息简单化。可采用例如主要组分分析(PCA)、自动特征提取方法或其它数据处理方法等技术。理想的是，可针对各种临床条件生成特征、2D图和3D图库。例如，二维(强度相对于T2值或T2值相对于时间)或三维图像(强度相对于T2值相对于时间)。二维或三维图像的T2值可用例如T1、T1/T2混杂、T_1rho、T_2rho和T₂ ^*等其它NMR信号替换或与之比较。

在相关的实施方案中，通过由得自样品的一个或多个自由感应衰减(FID)信号提取的NMR参数，评价样品内的凝固或溶解过程。例如，可从FID的信噪比、从FID与预定的阈值的比较、从FID的积分或从使用不同FID点的比率计算，提取NMR参数。由该方法得到的NMR参数可用于表征各种凝固或溶解过程。在一个具体的实例中，由血样的一个或多个FID提取的值可用于计算血液凝固行为，例如凝固时间(R)、血纤蛋白溶解行为、血块强度(MA)、血块动力学行为、血小板相关血块强度(MA_血小板)、功能性血纤蛋白原相关血块强度(MA_FF)或MA后30分钟的溶解百分比(LY30)。同样地，由FID数据提取的数据可用于汇编特征曲线库。

3D数据图

可采用本发明的方法(例如实施例18所述方法)生成正进行凝固过程或溶解过程的样品中的T2数据的3D图像。在某些实施方案中，所生成的3D图的维度对应于弛豫时间(例如T2或1/T2)维度、强度或振幅维度和时间维度。时间维度表示已进行或正在进行的凝固过程的时间。获自凝血样品的3D图显示与样品内不同物理和/或化学环境中各个水群体一致的各种3D表面特征。可挖掘3D图和用于生成3D图的数据的与血样有关的指标或凝固行为(例如血细胞比容、血块强度(MA)、凝固时间(R)、血小板活性、血纤蛋白原活性、血纤蛋白溶解等)。3D图或用于生成3D数据图的数据还可用于发现新的指标。

在3D图中明显的包含在不同3D表面特征和水群体内的信息可与特定的指标和凝固行为相关联。可利用3D图生成特定参数或指数的定性、半定性和/或定性结果。例如，可从初始水群体的性质计算血样的血细胞比容，可从具有80-400毫秒T2时间的发散(diverging)水群体的性质计算凝固时间和血纤蛋白溶解行为，可从具有400-2200毫秒T2时间的第二发散水群体的性质计算血小板活性和血块强度。可采用各种方法从3D数据集提取指标或凝固行为。例如，3D图3D表面特征的斜率或曲率可与凝固行为关联。还可使用3D图的横截面来计算凝固行为。具体来讲，对于特定T2时间显示随时间变化的T2强度的横截面可用于计算凝固时间(R)和/或血纤蛋白溶解。在给定时间(T2弛豫谱)显示随强度变化的T2时间的3D图的横截面表示在给定时间存在于样品的各种水群体。可挖掘T2弛豫谱的特征的广泛凝固行为。例如，T2弛豫谱中两个信号间的差异可用来评价血块强度。特定3D表面特征(例如具体特征的体积)的积分，或来自3D图的横截面的曲线也可用于建立凝固行为(例如血块强度)。还可通过在序贯时间点或不同时间点收集的广泛T2弛豫谱的积分提取凝固行为。

或者，可采用3D图以鉴定血块行为特有的特征。特征可以是没有3D分析测量的特征，例如通过选择性监测在凝固引发后的特定时间上具有约400毫秒或1,000毫秒的平均T2弛豫率的水群体的脉冲序列。任选测量样品中排除其它水群体的水群体。

T2弛豫曲线的特征，包括与特定信号有关的T2值的范围可随用来收集数据的仪器(例如T2读数器或Bruker minispec)而变化。同样地，给定样品的T2值的范围可取决于用于构成在T2测量期间装有样品的管的材料(例如塑料或玻璃)。本发明包括任何磁共振仪器和任何样品容器在采集用于血样分析的3D数据集中的用途。

患者的管理

可使用本发明的方法和装置以提供患者的止血状况的现场即时评价(例如用于正进行手术的患者的凝血管理、鉴定有血栓性并发症风险的患者、鉴定抵抗抗血小板疗法的患者、监测患者的抗凝疗法、监测患者的抗血小板疗法和/或监测患者的促凝血疗法)。

存在对其需要凝血试验的医学情况，包括：1)找出异常出血或瘀伤的原因，2)在患自身免疫病的患者中，3)在患有基础性心血管病症的患者中，4)在其中出血太多可能是顾虑的手术或外科手术之前，5)监测抗凝血疗法，6)监测围手术期和创伤患者，和7)鉴定患脓毒症或脓毒性休克的患者。

因为心肺分流术(CPB)的抗凝与CPB后的止血间的平衡，所以进行心脏手术的患者的凝血管理是复杂的。此外，由于给予抗血小板药物所致，越来越多患者的基线血小板功能受损。在CPB期间，最适抗凝表明，凝血受拮抗，血小板受保护免于活化，使得血块无法形成。在手术后，可能出现凝血异常情况、血小板功能障碍和血纤蛋白溶解，造成必须恢复止血完整性的情况。通过以及时和精确的方式评价止血功能的本发明的方法和装置(现场即时试验)可以指导用肝素抗凝、用鱼精蛋白的拮抗作用和手术后止血疗法的复杂过程。

与肝功能差有关的问题(例如凝血因子合成和清除降低及血小板缺陷)可导致止血受损和纤溶亢进。全身并发症，例如脓毒症和弥散性血管内凝血，使先前存在的凝血病进一步复杂化。在无肝期和恰在器官再灌注后，原位肝移植中的止血出现显明变化，主要是一种纤溶亢进，其产生于因外源肝素和内源肝素样物质的肝清除不足和释放引起的组织纤溶酶原激活物蓄积。因此，进行肝手术、特别是原位肝移植的患者，可在其凝血中发生大紊乱，使本发明的方法和装置可用于监测该患者群。

本发明的方法和装置可用于指导肝素疗法，尤其抗凝疗法。例如，可用肝素酶进行本发明的方法以评价在没有肝素的抗凝作用下的凝血状态。另外，本发明的方法可用于评价鱼精蛋白疗法，即监测鱼精蛋白疗法后的凝血和治疗肝素或鱼精蛋白诱导的止血状况。类似地，分析可在手术前和手术后进行以测定手术患者的抗凝状态或止血状态。

本发明的方法和装置还可用来指导抗血小板疗法和鉴定对抗血小板疗法的抗性。抗血小板疗法越来越多地被处方用于心血管疾病的一级和二级预防以降低急性脑血管和心血管事件的发生率。抗血小板药物通常靶向抑制环加氧酶1/血栓烷A2受体(例如阿司匹林)、腺苷二磷酸受体(例如氯吡格雷)或GPIIb/IIIa受体(例如阿昔单抗、替罗非班)。虽然认为抗血小板药物主要通过降低血小板聚集起作用，但是它们也显示作为抗凝血药起作用。因为血小板在整体凝血中起关键作用，血小板功能(超过它们的数量)的评价在围手术期环境下是决定性的。

本发明的方法和装置还可用于监测和/或指导抗凝血疗法。可针对功效和顺应性监测抗凝血疗法(尤其例如利伐沙班、达比加群)，并且确保避免不良副作用和/或不良事件(例如出血事件)。在大量的随机研究中报告了这类疗法的剂量调节以控制出血。具体地说，给予抗凝血药，包括直接因子Xa抑制剂，可用来辅助治疗窗的维持并导致患者中心房颤动和深静脉血栓形成的中风风险降低。

本发明的方法和装置可用来鉴定对抗凝血疗法有抗性的患者。抗凝血疗法包括阿司匹林、波立维和普拉格雷，尤其抗凝血药。方法包括(i)将抗凝疗法给予受试者；(ii)采用本发明的方法评价受试者的止血状况；和(iii)如果发现受试者为促血栓形成，则鉴定受试者为对抗凝疗法无应答者。无应答者的鉴定可允许医师鉴定患者对其起反应的安全有效的抗凝血药，因此降低不良事件(即血栓形成和中风)的风险。

可采用本发明的方法和装置监测促凝血疗法。凝血管理的现代实践以特异性组分疗法的观念为基础，并需要快速诊断和监测促凝血疗法。例如，已表明冠状动脉旁路手术围手术期的血小板输注与严重不良事件风险增加有关。仅临床判断无法预测在急性围手术期环境下谁将获益于血小板输注。因此，优选应通过现场即时试验(例如由本发明的方法和装置提供的试验)指导凝血产品的输注。

本发明的方法和装置可用来提供伴随诊断分析或试验以监测治疗化合物在临床试验或医学用途中的作用。诊断分析可包括确定试验受试者或患者是否对疗法起反应或不对疗法起反应。

可使用本发明的方法和装置确定通过在如中风或心搏停搏的人中是有害的血块、高凝血、高凝固或凝固的灌注。

可采用本发明的方法和装置作为一组分析的部分。该组分析可包括(i)对参与凝血级联的蛋白质的免疫测定；(ii)检测血纤蛋白降解产物的免疫测定；(iii)检测抗磷脂抗体的免疫测定；(iv)检测肝素或华法林或其它抗凝血药以评价治疗浓度的测定；(v)监测血浆凝血酶原时间的PT或aPTT或PTT测定法；(vi)评价编码与以下有关的蛋白质的基因的多态性差异的遗传试验：(a)凝血酶的形成或溶解、(b)凝血级联、(c)肝素结合或(d)治疗活性。

可采用本发明的方法和装置管理对凝血病有影响的医学装置。一个实例是常常用作等候心脏移植患者的桥梁的心室辅助装置。由于该装置的功能，携带这类植入物的患者由于装置的功能可能在装置内外具有血块形成，并且这些血块可引起中风或其它血栓相关事件。还可能导致感染和出血事件。避免这些问题的一种方法是监测影响装置成功的多个诊断标志物。例如，PT-INR的例行测试可允许更密切地监测患者凝血状态，因此，对出血和凝血事件提供严密控制。

INR是患者的凝血酶原时间与正常(对照)样品的比率，其升至所用分析系统的国际敏感度指数值的乘方。高INR水平(例如INR=5)表明出血机会高，而如果INR=0.5，则具有血块的机会高。对于健康人正常INR的范围为0.9-1.3。对于接受华法林疗法的人，INR范围通常为2.0-3.0。在特殊情况下目标INR可能较高，例如对于带有机械心瓣膜的人或围手术期用低分子量肝素(例如依诺肝素(Lovenox))桥接华法林。

监测血小板功能、血纤蛋白溶解、血块强度和其它因素在改善结果中同样重要。了解这些因子的生理浓度或活性不仅对其与装置的相互作用是重要的，而且因为它们受经常在这些装置上处方给患者的许多不同疗法(尤其阿司匹林、利伐沙班、波立维、华法林)调节。与这些类型的装置一起使用的另一个度量是血细胞比容，其常被用于调节该装置的功能(速度、强度等)以保持心脏的功能。本发明的方法和装置将可能同时提供所有的这些结果(血细胞比容、血小板、PT、PT-INR等)，并且可提供有关血块形成和溶解的额外信息。上述标准度量可结合到鉴定患者的状态和装置的功效的指数或特征中。

本发明的方法和装置可以多种方式加以利用和配置。它们可用作实验室装置、现场即时系统或甚至可植入监测系统。例如，作为可植入监测系统，样品可由连续受监测的血液组成；装有全血、血清或血浆的真空采血管(vacutainer)；或手指采血针(finger stick)以及其它样品流体。

例如，本发明的方法和装置可用于监测围手术期和创伤患者(例如提供PT/INR、aPTT、ACT、Hct、血小板活性和血纤蛋白溶解的度量或替代度量)。这些患者群需要快速和有效地测定是否需要输血，因为患者可能表现出在死亡率、缺血事件、感染、并发症早期发作和ICU/住院延长上约6倍增加。具体地说，出血事件根本原因(凝血级联与血小板活化)的测定可导致迅速而集中的疗法。

不论其中使用本发明的方法和装置的情况如何，可使用本发明方法快速测量小体积，这对于血小板功能特别重要，血小板功能之前使用其它系统难以测量，因为在抽血部位引发凝血。

凝血机制

为了发生凝固，必须存在通过凝血酶对血纤蛋白原的作用在血纤蛋白沉积中达到顶峰的凝血级联的活化。凝血系统由蛋白水解级联组成，该级联用精致反馈调节机制放大初始刺激以保持整个过程处于控制与平衡中。存在两个互相联系的凝固活化途径：(i)接触活化(内部途径)；和(ii)组织因子活化(外部途径)。两个途径依赖于各种凝血因子。凝血酶原是凝血因子II，凝血酶是凝血因子IIa，血纤蛋白原是凝血因子I，血纤蛋白是凝血因子Ia。除凝血因子以外，血小板对于足够血块的诱导和形成两者是决定性的。血小板起磷脂表面的作用，凝血酶原酶复合物在磷脂表面上形成，并起用于产生血块的物理支架的作用。

内部凝血级联途径通常通过与来自受损血管的胶原接触而被激活，但是许多带负电荷的表面可刺激该途径。内部途径通常需要血小板活化，以装配包括因子VIIIa、IXa和X的tenase复合物。活化过程与肌醇三磷酸(IP3)途径相连，并包括脱粒和肌球蛋白1c激酶活化以改变血小板形状，最终允许粘附。

或者凝固可通过外部凝血级联途径被激活，该途径需要来自血管外细胞表面的组织因子。外部途径包括凝血因子V、VII和X的复合物形成。体内凝血的主要诱导物是组织因子(TF)，一种47 kDa糖蛋白。血流中能够表达TF的唯一细胞是内皮细胞和单核细胞。相比之下，血流外的许多细胞(包括外膜成纤维细胞)组成型表达TF，因此万一血管完整性被破坏，便形成能够引发凝血的“血管外包膜”。

级联的最后阶段在两个途径中是共同的，其包括tenase复合物这种激活复合物。Tenase是“十”和后缀“酶”的缩略词，表明该复合物通过切割其底物(无活性的因子X)使之激活。内部tenase复合物含有活化因子IX (IXa)、其辅因子因子VIII (VIIIa)、底物(因子X)，并且它们被带负电荷的表面(例如玻璃、活化血小板膜、有时单核细胞的细胞膜)激活。外部tenase复合物由组织因子、因子VII、底物(因子X)和作为活化离子的Ca²⁺组成。

因子X通过外部或内部途径活化成为因子Xa，导致凝血酶原蛋白水解转化成凝血酶，凝血酶进而激活引发血块形成。因子VIII然后催化谷氨酰胺转移酶反应使血纤蛋白单体交联形成交联的网状结构。

血块中交联的血纤蛋白多聚体被纤维蛋白溶酶(一种丝氨酸蛋白酶)分解成为可溶性多肽。纤维蛋白溶酶可产生自其无活性的前体纤溶酶原，并以通过以下两种方式募集到血纤蛋白血块的部位：通过与血纤蛋白血块表面上的组织纤溶酶原激活物相互作用，以及通过与细胞表面上的尿激酶纤溶酶原激活物相互作用。第一机制似乎是负责血管内血块溶解的主要机制。第二种机制虽然能够介导血块溶解，但通常可在组织重建、细胞迁移和炎症中起主要作用。

血块溶解以两种方式受到调节。第一，有效的纤维蛋白溶酶活化和血纤蛋白溶解只发生在血块表面上形成的复合物中或细胞膜上；在血液中游离的蛋白质是低效催化剂，并且快速失活。第二，纤溶酶原激活物和纤维蛋白溶酶本身两者被特殊的丝氨酸蛋白酶抑制蛋白(与丝氨酸蛋白酶结合形成稳定的无酶活性的复合物的蛋白质)灭活。药理学上，使用血块(clot buster)组织纤溶酶原激活物(TPA)和链激酶或尿激酶以激活这种内部血纤蛋白溶解机制。

医学病况

本文描述的本发明的方法和装置可用于检测各种液体(特别是血样)的流变变化以诊断因以下疾病所引起的凝血、血栓性病症和血栓性病症：例如脓毒症和弥散性血管内凝血(DIC)、血友病A、血友病B、血友病C、其它凝血因子的先天性缺乏、因子XIII缺乏症、冯维勒布兰德病(Von Willebrand’s disease)、内在抗凝剂所致出血病症、去纤维蛋白综合征、获得性凝血因子缺乏症、其它凝血缺陷、紫癜和其它出血病况、变应性紫癜、诺赫－舍恩莱因紫癜(Henoch-Schönlein purpura)、血小板减少症、免疫性血小板减少性紫癜、特发性血小板减少性紫癜、继发性血小板减少症和非特异性出血病况。

心血管系统需要严密调节止血。过度凝固可引起静脉或动脉梗阻，而不能凝固则可引起过度出血；两种情况均导致有害的临床情况。在大多数人类受试者中，凝血平衡或多或少是静态的。然而，有许多不同的可改变止血并导致心血管机能障碍的临床参数(例如遗传性病症、疾病状态、治疗药物或药理学应激物)。

存在因无功能的凝血因子所引起的许多不同的已知凝血病症，例如血友病(因子VIII (血友病A)、IX (血友病B)、XI (血友病C))、亚历山大病(Alexander disease) (因子VII缺乏症)、凝血酶原缺乏症(因子II缺乏症)、奥伦病(Owren’s disease) (因子V缺乏症)、Stuart-Prower缺乏症(因子X缺乏症)、海氏因子缺乏症(Hageman factordeficiency) (因子XII缺乏症)、血纤蛋白原缺乏症(因子I缺乏症)和冯维勒布兰德病。

凝血级联的活化似乎是在终末期脓毒症中发生的多器官衰竭的发展中的必需组分。脓毒症的现行疗法特别靶向这些级联以调节终末期的进程并防止器官衰竭。

本发明的方法和装置可用于测定血样的血细胞比容。血细胞比容是受试者血液中红细胞所占据的体积百分比的度量，健康女性和男性的正常值分别为约36-44%和41-50%。血细胞比容取决于样品中红细胞的数目和红细胞的大小。血细胞比容的测量可用于确定受试者的各种生理病况。因此，本发明的方法可用于诊断与低于正常血细胞比容或高于正常血细胞比容有关的任何病况。低于正常血细胞比容可能表示有贫血、镰状细胞性贫血、内出血、红细胞丧失、营养不良、营养缺乏症(例如铁、维生素B12或叶酸缺乏症)或水中毒。高于正常血细胞比容可能表示有先天性心脏病、脱水、红细胞增多、肺纤维化、真性红细胞增多症或药物红细胞生成素滥用。

本发明的方法可用于监测与以下疾病、病症或功能障碍以及风险因子有关的因素和相关凝血病：疾病、病症或功能障碍例如癌症、自身免疫性病症、红斑狼疮、克罗恩病(Crohn’s disease)、多发性硬化、肌萎缩性侧索硬化、深静脉或动脉血栓形成、肥胖症、类风湿性关节炎、阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease)、糖尿病、心血管疾病、充血性心力衰竭、心肌梗死、冠状动脉疾病、心内膜炎、中风、栓子、肺炎、溃疡性结肠炎、炎性肠病、慢性阻塞性肺病、哮喘、感染、移植接受者、肝病、肝炎、胰腺疾病和病症、肾疾病和病症、内分泌疾病和病症、肥胖症、与血小板减少症有关的疾病或病症和医学(支架、植入物、大手术、关节置换、妊娠)或治疗(癌症化学疗法)诱发性凝血病；风险因子例如大量吸烟、大量酒精消费、久坐生活方式。本发明的方法还可用于评价影响凝血和血液性质的基因组和蛋白质组变化。

本发明的方法还可用于监测正在进行抗凝血疗法和/或抗血小板疗法的患者。采用本发明方法可监测的抗血栓药的实例(例如溶血栓药、抗凝血药和抗血小板药)包括而不限于维生素K拮抗剂例如醋硝香豆素(acenocoumarol)、氯茚二酮、双香豆素、二苯茚酮、双香豆乙酸乙酯、苯丙香豆素、苯茚二酮、噻氯香豆素和华法林；肝素类(血小板聚集抑制剂)，例如抗凝血酶III、贝米肝素、达肝素、达那肝素、依诺肝素、肝素、那屈肝素、帕肝素、瑞肝素、舒洛地昔和亭扎肝素；其它血小板聚集抑制剂，例如阿昔单抗、乙酰水杨酸(阿司匹林)、阿洛普令、贝前列素、地他唑、卡巴匹林钙、氯克罗孟、氯吡格雷、双嘧达莫、依前列醇、依替巴肽、吲哚布芬、伊洛前列素、吡考他胺、普拉格雷、噻氯匹定、替罗非班、曲前列尼和三氟柳；酶，例如阿替普酶、安克洛酶、阿尼普酶、纤维蛋白酶、屈曲克凝α、纤溶酶、C蛋白(procein C)、瑞替普酶、沙芦普酶、链激酶、替奈普酶和尿激酶；直接凝血酶抑制剂，例如阿加曲班、比伐卢定、地西卢定、来匹卢定、美拉加群和希美加群；其它抗血栓药，例如达比加群、去纤苷酸、硫酸皮肤素、磺达肝素和利伐沙班；和其它例如柠檬酸盐、EDTA和草酸盐。

脓毒症和弥散性血管内凝血

本发明的方法和装置可用于评价患有脓毒症或弥散性血管内凝血的受试者的止血状况。

在脓毒症中，压倒性的炎症反应造成宿主微循环广泛的间接损害。对内皮的损害暴露出组织因子，在脓毒症中这可大规模发生。组织因子进而与活化因子VII结合。所得复合物激活因子IX和X。因子X将凝血酶原转化成凝血酶，凝血酶将血纤蛋白原切割成血纤蛋白，诱导血块形成。同时，血纤蛋白溶解系统被抑制。细胞因子和凝血酶刺激纤溶酶原-激活剂抑制剂-1 (PAI-1)从血小板和内皮中释放出来。血块当在人体中形成时，最终被通过组织纤溶酶原激活物(TPA)激活的纤维蛋白溶酶分解。PAI-1抑制TPA。因此，患有重度脓毒症的受试者用抗凝血药例如C蛋白(血液凝血因子XIV)治疗。

弥散性血管内凝血(DIC)是复杂性全身性血栓出血性病症，涉及血管内血纤蛋白的形成和前凝血剂和血小板的消耗。所引起的临床病况的特征在于血管内凝血和出血。DIC本身不是疾病，而是并发症或其它疾病进程的结果，估计存在于高达1%的住院患者中。DIC对基础性病症总是继发性的，并与许多临床病况有关，一般涉及全身性炎症的活化。DIC具有几种一致组分，包括血管内凝血的活化、凝血因子的耗竭和终末器官损害。在重度脓毒症和脓毒性休克中最常观察到DIC。实际上，DIC的发展和严重程度与重度脓毒症的死亡率关联。虽然菌血症(包括革兰氏阳性和革兰氏阴性生物体两种)最常与DIC相关，但是其它感染包括病毒、真菌和寄生物感染也可引起DIC。创伤，尤其神经创伤，也常与DIC相关。在发生全身性炎性反应综合征的创伤患者中更常观察到DIC。有证据表明炎性细胞因子在创伤患者和脓毒性患者两者的DIC中起主要作用。实际上，脓毒性患者和创伤患者两者中，全身细胞因子概况几乎相同。

DIC以急性和慢性两种形式存在。当发生血液突然暴露于前凝血剂包括组织因子(组织促凝血酶原激酶)时，便急性发生DIC，产生血管内凝血。代偿性止血机制迅速占优势，因此，发生导致出血的重度消耗性凝血病。容易鉴定出血液凝固参数异常，并且在急性DIC下常出现器官衰竭。相比之下，慢性DIC反映了当血液持续或间歇地暴露于少量组织因子中时发生的补偿状态。在慢性DIC中，肝和骨髓中的代偿性机制不是压倒性的，并且可能几乎没有DIC存在的明显临床或实验室指征。更常在实体瘤和大的主动脉瘤中观察到慢性DIC。

组织因子暴露于循环中通过内皮破坏、组织损害或前凝血剂分子(包括组织因子)的炎性或肿瘤细胞表达而发生。组织因子通过涉及因子VIIa的外部途径激活凝血。因子VIIa作为脓毒症中血管内凝血的重要介体而牵连其中。阻断脓毒症中的因子VIIa途径显示防止DIC的发生，而中断替代途径对凝固不显示任何作用。组织因子-VIIa复合物因此供激活凝血酶，凝血酶进而将血纤蛋白原切割成为血纤蛋白，同时引起血小板聚集。证据表明在DIC中，内部(或接触)途径也被激活，其对血液动力不稳定性和低血压比对凝固的活化产生更多的促进作用。

抗凝血酶的水平降低与脓毒症患者死亡率升高关联。凝血酶产生通常受多个止血机制的严格调节。抗凝血酶功能是负责调节凝血酶水平的这样的一种机制。然而，由于多种因素所致，抗凝血酶活性在脓毒症患者中降低。首先，抗凝血酶被凝血的不断活化持续消耗。此外，通过活化的嗜中性粒细胞产生的弹性蛋白酶降解抗凝血酶以及其它蛋白质。因毛细血管渗漏失去更多的抗凝血酶。最后，抗凝血酶的产生受损，继而由灌注下和微血管凝血产生肝损害。

组织因子途径抑制剂(TFPI)耗尽是DIC受试者的证据。TFPI抑制组织因子-VIIa复合物。虽然TFPI的水平在脓毒症患者中正常，但在DIC中的相对不足是明显的。动物模型中TFPI耗尽使之易患DIC，并且TFPI在人中阻断内毒素的促凝血作用。由凝血酶产生的血管内血纤蛋白通常经由称为血纤蛋白溶解的过程清除。对炎症的初始反应表现出血纤蛋白溶解作用增加；然而，这种反应不久逆转，因为释放出血纤蛋白溶解的抑制剂。高水平的PAI-1先于DIC，并且预示临床结局差。血纤蛋白溶解无法与血纤蛋白形成增加同步，最后导致在血管系统中under-opposed血纤蛋白沉积。

C蛋白以及S蛋白，在抗凝血药代偿性机制中起作用。在正常情况下，C蛋白被凝血酶激活，并且在内皮细胞表面上与血栓调节蛋白形成复合物。活化的C蛋白通过因子Va和VIIIa的蛋白水解性切割对抗凝血。然而，脓毒症和其它全身性炎性状态中产生的细胞因子(例如肿瘤坏死因子α (TNF-α)和白介素1 (IL-1))主要使C蛋白途径丧失能力。炎性细胞因子减量调节内皮细胞表面上的血栓调节蛋白表达。通过消耗、血管外渗漏、肝产生减少以及通过自由循环的S蛋白的减少使C蛋白水平进一步降低。

炎症途径和凝血途径以实质性方式相互作用。DIC中产生的许多活化的凝血因子通过刺激促炎细胞因子的内皮细胞释放而促使炎症蔓延。因子Xa、凝血酶和组织因子-VIIa复合物各自表明诱导促炎作用。此外，考虑到活化C蛋白的抗炎作用，其在DIC中的损害进一步促使炎症调节异常。

DIC的组分包括：将血液暴露于促凝血物质；血纤蛋白在微血管系统中沉积；血纤蛋白溶解受损；凝血因子和血小板耗尽(消耗性凝血病)；器官损害和衰竭。DIC可发生在30-50%的脓毒症患者中。

本发明的方法和装置可用于监测患有以下各种DIC相关病况的受试者，例如：脓毒症/重度感染；创伤(神经创伤)；器官破坏；恶性肿瘤(实体恶性肿瘤和骨髓增殖性恶性肿瘤)；严重输液反应；风湿性疾病；产科并发症(羊水栓塞、胎盘早期脱离、溶血、滞留死胎综合征)；血管异常情况(卡-梅综合征、动脉瘤)；肝衰竭；毒性反应、输液反应和移植排斥。类似地，本发明可用于特征在于具有与以下有关的急性DIC的止血状况的受试者：细菌感染(例如革兰氏阴性脓毒症、革兰氏阳性感染或立克次氏体)、病毒感染(例如与HIV、巨细胞病毒、水痘或肝炎有关的感染)、真菌感染、寄生虫感染(例如疟疾)、恶性肿瘤(例如急性髓细胞白血病)、产科病况(例如子痫胎盘早剥或羊水栓塞)、创伤、烧伤、输注、溶血反应或移植排斥。

本发明的基于NMR的方法可用于监测任何和全部上述血液相关病况。时域弛豫测量(relaxometry)，特别是T2弛豫测量，可用来测量样品凝固状态的变化。这种测量依赖于测量对样品宏观凝固状态中的变化敏感的氢核的NMR参数。大多数氢核在主体(bulk)水溶剂中，但其可观部分在样品的生物大分子和细胞和血小板中。因此，可进行得自所有氢核的平均NMR信号的测量，使得当样品的凝固状态由于任何上述临床原因变化时，信号以可观的方式变化。NMR测量可以是T2弛豫测量，或“有效” T2弛豫测量(例如这样的T2弛豫测量，其中信号采集的参数使得将其设置用于凝血事件的最佳读出，而非设置用于T2弛豫值最精确的测量)。可应用其它“时域”弛豫测量方法以测量凝固行为的变化。除其它测量以外，这些可包括时域自由感应衰减分析。可以重复方式获取本文所述任何NMR时域测量，以得到随因样品的凝固或溶解性质发生变化的时程推移的NMR信号的动态读出。

具有正常和异常止血概况的受试者

本发明的方法可用来区分具有正常和异常止血概况的受试者。例如，可测定正常和异常止血概况特有的NMR弛豫参数值和/或T2特征，并将其用于受试者的差别诊断。异常止血概况可包括共有以下一种或多种的常见缺乏症的受试者概况：凝血因子、凝血辅因子和/或调节蛋白(尤其例如因子XII、因子XI、因子IX、因子VII、因子X、因子II、因子VIII、因子V、因子III (组织因子)、血纤蛋白原、因子I、因子XIII、冯维勒布兰德因子、C蛋白、S蛋白、血栓调节蛋白和抗凝血酶III)。

抗凝血酶的缺乏见于约2%的静脉血栓栓塞性疾病患者中。以常染色体显性性状发生遗传。普通人群中症状性抗凝血酶缺乏症发生率的范围为1/2000-1/5000。缺乏症由影响抗凝血酶的合成或稳定性的突变或影响抗凝血酶的蛋白酶和/或肝素结合部位的突变引起。本发明的方法可用于区分正常受试者和患有抗凝血酶缺乏症的受试者。

因子XI的缺乏赋予损伤相关性出血倾向。1953年鉴定出该缺乏症，最初称为血友病C。因子XI缺乏症在德系犹太人中极普遍，并以具有纯合性或化合物杂合性的常染色体病症遗传。本发明的方法可用于区分正常受试者和患有因子XI缺乏症的受试者。

冯维勒布兰德病(vWD)由遗传性冯维勒布兰德因子(vWF)缺乏症所致。vWD是人类最普遍的遗传性出血病症。vWF的缺乏导致血小板粘附缺陷，并引起继发性因子VIII缺乏。其结果是vWF缺乏症可引起表现出与由血小板功能障碍或血友病引起的出血相类似的出血。vWD是极异质性疾病，已被归类为几种主要亚型。1型vWD最常见，并以常染色体显性性状遗传。这种变体是由于全部vWF多聚体的单纯数量缺乏所致。还根据在与血小板结合的某些实验室试验中功能异常性蛋白质是否具有降低的功能或反常增加的功能，对2型vWD作进一步细分。3型vWD是临床上重度的，其特征在于隐性遗传和vWF的实际缺乏。本发明的方法可用于区分正常受试者和患有冯维勒布兰德因子缺乏症的受试者。

若干心血管风险因子与血纤蛋白原异常情况有关。在冠状动脉疾病、糖尿病、高血压、外周动脉疾病、高脂蛋白血症和高甘油三酯血症患者中观察到血浆血纤蛋白原水平升高。另外，妊娠、绝经、高胆固醇血症、使用口服避孕药和吸烟导致血浆血纤蛋白原水平升高。存在遗传性血纤蛋白原病症，包括无纤维蛋白原血症(完全缺乏血纤蛋白原)、血纤维蛋白原过少(血纤蛋白原水平降低)和异常纤维蛋白原血症(存在血纤蛋白原功能异常)。无纤维蛋白原血症的特征在于新生儿脐带出血、瘀斑、粘膜出血、内出血和习惯性流产。该病症以常染色体隐性方式遗传。血纤维蛋白原过少的特征在于血纤蛋白原水平低于100mg/dL(正常为250-350mg/dL)，并且可以是获得性或遗传的。本发明的方法可用于区分正常受试者和患有血纤蛋白原异常的受试者。

血小板监测

本发明的方法和装置可用来测定血小板功能，并与血小板集合度测定进行比较(参见例如Harris等，Thrombosis Research 120:323 (2007))。目前有两种检测方法用于具有FDA许可证的仪器以进行血小板集合度测定：光学测量和阻抗测量。例如，本发明的方法可用来在可通过血小板集合度测定法测量的受试者中鉴定任何血小板活性或诊断任何血小板功能障碍。血小板集合度测定是在全血或富血小板血浆样品中进行的功能测试。一般而言，血小板集合度测定方法包括将血小板激活剂加入样品中，并测量所诱导的血小板聚集。血小板集合度测定可通过将电极浸入待测血样中来进行。粘附在探头上的血小板形成稳定的单层。在加入激活剂时，在电极上形成血小板聚集体，并增加跨电极施压的电流的阻抗。仪器监测反映血小板聚集反应的电阻抗的变化。集合度测定方法还包括基于通过发光监测从正聚集的血小板中释放ATP的技术。血小板聚集的光学检测基于这样的观察，即在血小板聚集成大血块时，存在透光率提高。不同的聚集诱导剂刺激不同的活化途径，并且观察到不同的聚集模式。光学方法主要缺点的是通常在PRP上进行，需要从红细胞中分离血小板，并且调节血小板计数至额定值。

在血小板集合度测定中，本发明的方法可用于评价受试者血样的血小板计数或诊断受试者中血小板减少症(血小板计数< 150,000/μL)或血小板增多症(血小板计数> 400,000/μL)的病况。可利用这类诊断作为决定给受试者提供血小板输注或抗凝血药的基础。类似地，本发明的方法可用于评价受试者对血小板输注或抗凝血药的反应。

提供下列实施例，为本领域普通技术人员提供如何进行、制备和评价本文要求保护的方法和化合物的完整公开内容和描述，并且意指对本发明是完全说明性的，而且无意限制本发明人视为其发明的范围。

其它用途

本文所述的本发明的基于NMR的方法可用于其中物质或物质的混合物正在进行或已经进行凝固过程或溶解过程的各种应用。本发明的方法可用于获得有关正进行某一过程的材料的变化或有关已进行某一过程的材料的状态的信息。

在石油产品领域中，本发明的方法可用于监测柏油/沥青、沥青聚合物生产、锅炉、原油、煤灰、煤泥、裂化、蒸馏残液、工程、加稀释剂的沥青、高粘性油、炉油、润滑剂、混合燃油、油品添加剂、润滑油澄清器、调和油、油计数器(管道终端)、油磨耗控制、增塑溶胶、矿物油、石油添加剂生产、石油产品、管道计数器、沥青涂料、沥青稀释、Erika故障泵送、急冷油、燃油中的残渣转化、水、沉淀物和油的分离、特殊油料、合成橡胶、使用前的焦油控制、极重油和水煤泥。

在涂料和油漆领域，本发明的方法可用于监测汽车油漆、金属涂料、水性涂料、用于scraping game的特种油墨、用于铝或塑料表面的特种油墨、水性油墨、PTFE涂料、白纸涂料、特种纸涂料、墙纸、胶、清漆、汽车清漆、用于发动机的特种油漆、油墨生产、凹版印刷、染料、印制电路板清漆、磁性油墨、磁性清漆、光泽涂料、用于镜子的镀银、用于眼镜的特种清漆和珐琅粉。

在食品和饮料领域，本发明的方法可用于监测白色调味酱生产、面包生产、巧克力生产、生面团控制、发酵控制、鱼汁(蒸发控制)、新鲜干酪生产、明胶食品浓度、冰淇淋生产、果酱生产、人造黄油生产、蛋黄酱生产、熔化干酪生产、乳和干酪研究、石蜡涂料控制、蛋白质浓度控制、用于动物食品的蛋白质、海藻明胶、废油控制、蜜饯水果、熬糖锅(结晶控制)、糖混合机、鱼糜糊、合成香料、番茄酱、植物黄油和植物油、酵母、酸奶、啤酒/酵母控制、面包房的生面团、食品添加剂、明胶(蛋白质浓度)、乳雾化、酸奶、融化干酪、加糖果汁、色拉酱、食品增稠剂、食品添加剂、酶浓度控制、冷冻液压控制、人工食品香料、烟草浆、残余糖浆、工业汤(soup)、布丁、奶粉、宠物食品、牲畜食品、婴儿食品、炼乳、淀粉凝胶、果泥和果汁。

在工业化学领域，本发明的方法可用于监测用于涂料生产的基础树脂、聚合物、聚合物-沥青生产、聚合控制、聚碳酸酯、PVC生产、两组分树脂、纤维和聚合物、电缆树脂、环氧树脂、聚酰胺树脂、氯醛甲基树脂、PVC、羧甲基纤维素、盐酸、氨基甲酸乙酯胶、二异氰酸甲苯酯、MEK甲苯、塑料再循环、硅油、糊、胶、PBU、乙醇甲苯、聚碳酸酯、聚酯树脂生产、聚醚多元醇控制、聚异丁烯、聚合物树脂生产、聚合化乙烯基+甲苯、聚合工业、树脂聚合、硅油、不饱和聚酯树脂、脲-甲醛树脂、胶、聚酰胺树脂、尼龙、聚丙烯树脂、聚乙烯、环氧树脂、聚ephine蜡、乙酸二甲酯、酚类树脂、石膏、三聚氰胺和甲基丙烯酸甲酯。

本发明的方法还可用于监测生化产品、醋酸纤维素、织物软化剂、酶、凝胶涂料、药物胶囊、气雾剂、化学品生产(洗涤基料)、化妆品生产和控制、乳膏、美容机器工程、发酵控制、用于眼镜的玻璃、医药品、照相乳剂、洗发剂生产、牙膏、紫外敏感清漆、乳液粘度控制、维生素A、照相乳剂、录像带、凝胶、乳剂、精细化学、用于照明的荧光膏、液压油、乳胶雾化、紫外胶、热溶胶、钻探泥浆、增塑溶胶、酸浓度、汞、蓄电池酸、去污剂、陶瓷、泥浆、胶、粘性聚合物、碳酸钙、丙烯酸胶、石灰乳、氨+ MCB +油、高粘度燃料、原油计数、两种油的混合、润滑油、动物脂肪锅炉、燃油、废水浓度、泥浆浓度、酵母淤渣、油污染、溶剂污染、油遇险控制、急冷油、切削油和涉及沉淀塔的过程。

本发明的方法和装置可用作先导化合物和化合物验证发现工具。本发明的方法和装置可鉴定随凝血级联中被一种或多种候选化合物干预而变化的凝血级联的变动，或鉴定在响应候选化合物时凝血级联以外的变动(例如血小板形态)。本发明的方法和装置可用于筛选化合物文库以鉴定活性剂，以及准确指出用于疾病和治疗的新的机制。这些可能在凝血级联中，但是许多是级联中非平常所定义或鉴定的靶标。该方法还可用来鉴定与已知凝血病症有区分的疾病状态。

凝血系统是十分复杂的系统，并且用于研究该系统的可用工具受限于可提供给投身于药物研发的科学家的信息范围。许多现有的药物研发依靠基于靶标的筛选，而其它则依靠表型筛选。寻靶方法包括利用作用的分子方法，类似于基因表达或用某种测定法分离目标靶标的RNAi，然后利用该测定法寻找化合物。表型筛选鉴定因化合物或作用剂而发生的生物学变化，因此表征了有前景的先导化合物，因为它们在体内具有所需作用。对于靶标抑制的情况，可以使用靶标的野生型构建体。例如可采用靶标的活化，即靶标的遗传修饰形式。该方法克服了无法查找靶标或基质(例如全血)中靶标的活性的某些现行筛选方法的限制。对于止血和凝血中的靶标，由于血液中任何给定靶标可能进行的生物相互作用的复杂性质所致，这可能难以解决。潜在的筛选靶标包括蛋白质、肽、酶、血纤蛋白原、凝血酶、血小板、血小板受体、血小板的患病状态、凝血因子、任何这些靶标的患病状态。

本发明的方法和装置可产生自因加入特殊引发剂所致患者样品血液或血浆凝固所生成的信息丰富的数据集。可使用各种引发剂在不同的起点引发血液凝固。这些不同的引发剂可用来通过级联的选定点或分支的活化和/或级联的选定点或分支的抑制，分离或突出凝固级联的不同部分。对于指定的凝固反应，本发明的方法使得能够生成捕捉例如血细胞比容水平、凝固时间、血小板活性、血纤蛋白溶解和许多其它生理学和生物学参数等多个参数的3D表面数据集。因此，可使用特定的引发剂探索和分离特定的凝血途径。

在凝血途径或止血系统的特定部分上选择和寻找(hone in)的另一种方法是使用遗传修饰系统，例如敲除小鼠或大鼠。这些系统/模型可供产生代表患病状态(例如患病血小板)的靶标，并在候选化合物不存在和存在下将本发明的方法应用到的该系统/模型的血液中，以评价化合物改善疾病状态的有效性。T2MR的小样品体积需求对动物研究可能是有利的。常规血小板方法需要0.5-25 mL的血液，而本发明的方法可使用小得多的体积进行。

本发明的筛选方法的另一个优势是可获得多个特征以鉴定锚点，以及用于测量化合物对止血过程的作用的灵敏度特征。

提供下列实施例，为本领域普通技术人员提供如何进行、制备和评价本文要求保护的方法和化合物的完整公开内容和描述，并且意指对本发明是完全说明性的，而且无意限制本发明人视为其发明的范围。

实施例1：使用全血样品监测血液凝固过程

使用新鲜柠檬酸盐全血或肝素化全血样品监测凝固过程。研究了若干不同的活化途径。

对于高岭土活化途径(CK途径)，将1 mL柠檬酸盐血液加入高岭土小瓶(PlateletMapping测定试剂盒，Haemonetics)中。将小瓶倒转5次以混合样品。将34 µL血液/高岭土混合物转移到在37℃下预热的200 µL PCR管中。将2 µL 0.2M CaCl₂加入PCR管中，立即开始T2测量。

对于激活剂途径(A途径)，将1 µL新制备的激活剂溶液(A-P1，PlateletMapping测定试剂盒，Haemonetics，本文亦称为“RF”)加入在37℃下预热的200 µL PCR管中。将在肝素酶小瓶中收集的36 µL血液加入PCR管中，将样品用移液管头混合3-4次。立即开始T2测量。

对于激活剂(RF) + ADP途径，将1 µL新制备的激活剂溶液(A-P1，PlateletMapping测定试剂盒，Haemonetics)和1 µL新制备的血小板激动剂溶液(ADP-P2，PlateletMapping测定试剂盒，Haemonetics)加入在37℃下预热的200 µL PCR管中。将在肝素酶小瓶中收集的36 µL血液加入PCR管，将样品用移液管头混合3-4次。立即开始T2测量。

图4表示与3种不同活化途径有关的凝固行为的差异。

实施例2：应用用于解释样品中血液凝固的算法的数据提取

运用执行二次指数拟合、绘图和校验及特征提取的三步方法，对自实施例1的T2读数器输出的数据进行处理：

二次指数拟合

通过NDXClient登记读出时间。将复杂的y数据转换成量值并归一化。删除初始25毫秒的x和y。各弛豫曲线应用默认非线性最小平方法拟合。使用具有用于前5个时间点的固定种子值的AmpA、AmpB、T2A和T2B的起点(例如种子值)，使曲线拟合至二次指数方程式。自前5个时间点的平均值获得第6个时间点的种子值。一般而言，时间点以之前时间点的输出确定种子。对于参数不允许负值。或者，数据可以在时间序列中部起始拟合，类似地进行到最后。通过取拟合残差的平方和(称为SSE)，排除非负值，计算拟合优度项(参见图1A和1C)。将参数AmpA、AmpB、T2A和T2B分框进入其各自类别以生成文本文件。

绘图和校验

标记并删除无法满足SSE标准的拟合。执行基于应用加权LLS和1次多项式的局部回归的简单平滑函数，删除离群数据。将各拟合参数相对于时间(平滑和非平滑)作图。进行数据移位和镜射以模拟TEG描迹图，并制成T2凝血曲线。可通过将线性转换应用于提取的磁共振参数，制成T2凝血曲线。具体来讲，可通过从各数据点减去最小T2A值，并对各所得数据点取负值，以从T2A数据获得T2凝血曲线，有效地反映出关于x轴的曲线。同样地，通过从各数据点减去最大T2B值，并对各所得数据点取负值，以从T2B数据获得T2凝血曲线，有效地反映出关于x轴的曲线。可通过类似方法，将振幅数据AmpA和AmpB转换成T2凝血曲线。

提取特征

测量绘制的曲线以提取与凝固行为“R”、“MA”和“角”有关的值。数据提取可采用本领域已知的各种方法的任一种进行。例如，度量可自所得数据的曲线形状获得和/或自一个或多个NMR参数的值计算。

实施例3：测量凝固行为的毛细管方法的使用

使用毛细管自患者收集2-5 µL血样。使用刺针从手指收集血样，将样品收集到肝素化毛细管中，并用粘土封顶。或者在耐热玻璃管中收集血液，并用粘土封顶。或者在玻璃Dagan毛细管中收集血样，用粘土封顶，且不含激活剂。使用T2读数器从毛细管样品中记录T2 NMR弛豫率的数据。已确定所收集的数据是单指数的，且这可反映出与存在于标准CK曲线相比是不同的血块结构。据推测，毛细管的表面诱导血液凝固。

实施例4：血液用纳米颗粒处理

血液掺入超顺磁纳米颗粒导致血液中主体水的磁化率变化。之前使用过类似现象，通过将锰加入血液以改变主体水的T2值和使化学位移成为可能，所述化学异位能够交换红细胞内外的水的测量。根据实施例1提供的方案，将单个患者的血样用于实验。另外，血样用非功能化直径800 nm的纳米颗粒处理。测试了2种不同浓度的纳米颗粒。通过加入10 µL纳米颗粒或20 µL纳米颗粒，得到两种不同的浓度。使用T2读数器记录T2数据。所记录的T2数据应用实施例2中描述的算法处理。根据含有纳米颗粒的样品的AmpA和AmpB的一系列图，观察到纳米颗粒降低曲线中观察到噪音，允许更容易地区分AmpA和AmpB。根据含有纳米颗粒的样品的T2A和T2B的一系列图，观察到纳米颗粒在T2A中产生更大的变化。超顺磁纳米颗粒可用于本发明的方法以：(i)在响应样品中的流变变化时增加信号变化(或NMR参数值的变化)，和/或(ii)允许在正进行凝固或溶解过程的样品中更早地检出流变学的变化。

在一个独立的实验中，观察到超顺磁颗粒的大小对凝固血液中的T2MR的作用。通过将1 mL柠檬酸盐全血与1管来自(TEG)的高岭土试剂经倒置5次轻轻混合以混合在一起来制备血样。将34 µL血液/高岭土混合物放入PCR管(200 µL)中，在37℃下预热1分钟。通过加入2 µL 0.2M CaCl₂，引发凝固，将管放入T2读数器中。使样品在没有磁性颗粒(参见图26A)、有CLIO纳米颗粒(30nm大小；约0.05ng) (参见图26B)和有Seramag超顺磁颗粒(730nm大小；约0.05ng) (参见图26C)的情况下运行。

在典型的柠檬酸盐化高岭土实验中，加入30nm纳米颗粒消除血块信号(在T2=200毫秒时)，仅在T2约100毫秒时存在1个峰。加入730nm超顺磁颗粒不妨碍观察2个峰的能力。

实施例5：测定供体血样的磁共振参数值

使用获自供体的血样，获得数据提取所使用的磁共振参数。采用TEG方法和T2凝血方法评价血样。运行若干不同的类型的测定法。使用多种T2读数器之一，收集T2凝血数据。

全血凝固测定法

采用本发明的方法和TEG方法评价供体血样。如实施例1所述，采用多种不同的全血凝固测定法。表1中进一步概括了这些测定法。

表1 –全血凝固测定法和所测试的激活剂

K试验通过血小板活化和导致血纤蛋白形成的酶级联两者形成血块。这种血块避开任何类型的血小板抑制剂药物，并提供整体全血凝固的评价。认为TEG R值反映酶途径，而TEG MA值反映血块强度，这受血小板和酶途径的产物血纤蛋白网两者驱使。

RF、ADP和AA试验使用肝素抑制凝血酶途径以隔离各种具体激动剂激活的途径。ADP和AA激活血小板，并且通过血纤蛋白网的形成额外促进血块强度。RF运行不激活血小板，但却激活血纤蛋白网。因此，当将RF运行的MA从K、ADP或AA运行中减去时，可测定血小板对这些各自运行的MA的基值。值得注意的是这是血小板功能的间接度量。

对患者运行K和ADP血液凝固测定法可用来测定由抗血小板疗法(例如作为ADP血小板抑制剂的波立维、Ticlid和Effient)所致的患者中血小板抑制的量。对K和ADP运行的TEG MA值进行比较以确定该抑制。

运行K和AA血液凝固测定法可用来测定被抗血小板疗法(例如阿司匹林、ReoPro®、Aggrastat、Integrilin和非甾体抗炎药)抑制的血小板的百分比。这些药物全都抑制GPIIb/IIIa血小板受体，其是在AA中被激动剂激活的受体。这通过比较K和AA的MA值来进行。当血小板被激活时，GPIIb/IIIa受体在血小板表面上表达(Corporation，H., TEG®5000 System Guide to PlateletMapping® Assay 2010；Enriquez, L.J.和L. Shore-Lesserson, Point-of-care coagulation testing and transfusion algorithms (现场即时凝血测试和输注算法). Br J Anaesth, 2009. 103 增刊1: 第i14-22页；Kroll,M.H., Thromboelastography: Theory and Practice in Measuring Hemostatis (凝血弹性描记法：测量止血的理论与实践). Clinical Laboratory News, 2010: 第8-10页)。

FF试验排除血小板对凝固的贡献。从K MA中减去FF MA得到据推测是由血小板贡献所致的血块强度。这是血小板功能的间接度量。FF和K试验的MA与参考范围的比较可表明出血问题是来自低血小板活性还是低功能性血纤蛋白原活性，因此指导临床医生进行适当治疗。类似地，可用高血小板活性或高功能性血纤蛋白原活性或两者诊断促血栓形成患者。血纤蛋白原是原发性止血和继发性止血两者的重要组分，参与可逆的和不可逆的血小板聚集两者。在继发性止血中，血纤蛋白原被切割，并转化成血纤蛋白以形成血纤蛋白基质(Corporation，H. , Guide to Functional Fibrinogen. 2009)。

实施例6：特征提取的处理

完成了大量工作以确定T2凝血和TEG曲线之间的特征相关性。针对其寻找相关性的TEG曲线的两个主要特征是R和最大振幅(MA)。利用在涉及总曲线1/15或经每40个数据点平滑的T2A、T2B、AmpA和AmpB曲线进行全部特征提取。

特征搜索以T2凝血曲线的几个时间点为基础。曲线的全部特征自R的首位候选物构建，R的首位候选物通过简单的数值计算，通过T2A曲线的二阶导数达到最大值的时间确定。时间上的这个点称为“PossibleR”。还用于特征提取的是T2B在最小值或最大值处的时间和T2A在最小值或最大值处的时间。图5说明单个受试者具有T2凝血曲线的一阶导数和二阶导数的T2凝血曲线。

可能有假数据点，特别是在一阶导数和二阶导数中。因此最小值和最大值定义为最接近T2A达到最大二价导数的第一时间的极值点。在鉴定T2凝血曲线上和T2凝血曲线的一阶导数和二阶导数上的这些时间点后，从时间点、时间点的组合、数值导数和T2凝血曲线中的差异计算若干不同的特征。将这些特征与TEG R、MA和MA_血小板值进行比较。

应用标准回归分析以确定特征相关性的强度。使用两个项以有助于搜索特征，即皮尔逊积矩相关性(r)系数和测定(R²)项的系数。r项在挖掘有前景的相关性中用作一般指导，R²项用作相关性在实际上的良好程度的度量。

测试了90个特征。实例特征包括PossibleR处第一数值导数的值；T2A的最大加速度处T2A的斜率；T2B曲线上的最大值和最小值之间的差异；和最小T2A和最大T2A值间的斜率。

T2A + 部分T2B曲线

在一个特征提取的实例中，可将T2A和T2B曲线组合以得到T2A + 部分T2B曲线，其可用于搜索T2凝血曲线和TEG MA值之间的相关性。这种组合曲线称为“T2A + pT2B”，通过鉴定当T2B为最大的时间的点，并且生成由该T2B值和全部后续T2B值间的差异的绝对值组成的矢量来计算。然后将该矢量加至相同的时间记录器上的T2A。图6显示如何计算T2A +pT2B曲线的实例。T2A + pT2B曲线模拟TEG曲线的上半部。

如上所述生成的T2A + pT2B曲线，得到与TEG MA的潜在相关性。鉴定由在T2 R处的T2与T2A + pT2B曲线上最后50个点内的平均T2之间的T2信号的变化组成的特征。该特征遵循与MA逆相关，这与我们对MA相关性的最初印象一致(参见图7)。也就是说，T2A + pT2B曲线的最大T2变化与TEG高岭土MA值逆相关。透过大量样品，该特征得到与R²值的相关性介于0.39和0.55间。这些R²值可产生自对凝固的不同方面(例如血小板)敏感的，而非TEG对之所敏感的T2凝血T2A曲线。

凝固前T2A值

血样的血细胞比容可自凝固前样品中的单个初始水群体计算。在血块形成前，该单一水群体对应于采用实施例2中描述的二次指数拟合方法确立的T2A值。发现样品的初始T2A值与采用本领域已知标准方法测量的血细胞比容具有近似的逆线性相关性。通过使用从单一患者中抽取的血液，产生不同稀释度的一组4个标准品，来建立校准曲线。将引发凝固前针对水群体A观察到的血细胞比容和初始弛豫率针对彼此作图以得到校准曲线。从10名患者中抽取血样，根据校准曲线查询。发现未凝固血的T2信号与血细胞比容(HCT)水平相反变化。如图8a中所示，跨越大范围HCT参考值的不同患者样品大体上证实了这一点。如图8b中所述，将校准方法应用到跨越HCT范围稀释的单个患者样品中，显示对HCT的线性相关性。图8a和8b显示采用本发明的方法计算血样的血细胞比容是可能的。

实施例7：提取的磁共振参数和通过TEG测定的凝固行为之间的相关性

自测量的平均NMR弛豫率数据提取的磁共振参数可与通过TEG测定的凝固行为关联。表2说明提取的T2A值和使用TEG止血分析仪测量的凝固时间参数“R”之间的相关性。

TEG止血分析仪提供血块物理性质的定量和定性测量(Samara等, Thromb. Res.115:89-94, 2005)。在本实施例中，针对凝血酶形成的血块样品测量最大振幅(MA)和凝血时间(R)。MA是血块形成的黏弹性或血块强度的指标，并取决于血小板聚集和血纤蛋白形成和聚合。R是直到初始血纤蛋白形成的潜伏时段，并且与凝血酶形成的速度相关。

根据AmpA和AmpB测量、T2A测量和T2B测量的示图，发现提取数据曲线的早期部分可提供无法从相应TEG曲线获得的凝固行为(例如血纤蛋白溶解或LY30)的指示。

表2 –提取的磁共振参数和通过TEG测定的凝固行为之间的相关性(数据以分钟表示)

凝固时间(R)的T2凝血相关性

如上所述，根据自动方式获得T2A的二次数值导数(second numericalderivative)，开发了使凝固时间(R)与T2凝血特征关联的方法。透过25次运行，对于R (全血凝固时间)值，在T2和TEG之间观察到0.80的R² (图9)。用于该相关性的T2凝血曲线是高岭土运行，其中SSE ≥ 2。图9中突出显示3个离群运行，其T2A曲线在右边显示。在所有3种情况下，T2A曲线在R TEG时间之前达到最大加速度(T2A’’ = 0)。

血小板相关血块强度(MA_血小板)的T2凝血相关性

针对使TEG MA时间与T2凝血特征关联，使用高岭土运行，研究了几个特征。针对高岭土运行发现的最明显的相关性为时间零和最小T2值(正好在T2 R特征之前)之间的T2凝血特征。这在T2A曲线中是典型的初始降低。时间零和最小T2值之间T2A信号的斜率与TEGMA_血小板值关联。因为TEG无法直接测量血小板活性，因此通过从来自高岭土运行的MA项(亦称为MA_凝血酶)减去来自激活剂或A运行的MA项(MA_A)，来推导凝血酶诱导的血小板对血块强度的贡献。图10显示对于14个T2凝血运行和28个TEG运行，TEG项MA_凝血酶 – MA_A，或来减去来自A运行的MA的来自CK运行的MA之间的相关性。至于R相关性，使用SSE ≥ 2。为了用TEG得到MA_血小板项，必须获得两个不同的TEG曲线，并且用户必须进行手工运算以测定血小板对血块强度的贡献。然而，对于T2凝血，在更容易得多地设置的单次T2凝血运行的前6分钟内，便可获得该信息。

功能性血纤蛋白原相关血块强度(MA_FF)的T2凝血相关性

通过在收集NRM弛豫数据之前在血样中包括添加剂，来测定凝固行为。可将血纤蛋白原加入样品中，以有效地滴定MA值的范围。图11显示用于功能性血纤蛋白原滴定的T2凝血曲线及FF运行的MA和来自T2凝血曲线的特征之间的相关性的明显证据。以初始和最终T2凝血AmpA值之间的差异(ΔAmpA)来计算该T2凝血特征。将3种不同浓度(0.63、1.25和2.5mg/mL)的血纤蛋白原加入样品中。如图11(c)中可见，与不含添加的血纤蛋白原的样品相比，这些功能性血纤蛋白原(FF) (MA_FF)运行的ΔAmpA和TEG MA之间有强相关。对2个其它患者样品进行了血纤蛋白原滴定，得到相关性高于0.9和高达0.98。在该方案中，将柠檬酸盐全血稀释至其原始浓度的50%。

MA后30分钟的溶解百分比(LY30)的T2凝血相关性

观察到用于检测血纤蛋白溶解的LY30项的相关性。5个不同的健康患者的样品用来测试T2凝血是否对血纤蛋白溶解敏感。通过将两种水平的组织纤溶酶原激活物(TPA)加入健康患者血液中，其添加被用来刺激血纤蛋白溶解。TPA在血纤蛋白形成时将其切割。观察到在T2凝血的10分钟内可检测出血纤蛋白溶解，这少于在TEG上检测所需时间的一半。对于所有5名患者，在健康和血纤蛋白溶解样品之间有明显差异。图12显示非血纤蛋白溶解(实线)样品和血纤蛋白溶解样品(虚线)的T2A和T2B曲线的T2凝血数据。

对于T2B信号的变化和来自TEG的LY30项有强相关，如图13中所示。存在几种可用于这种相关性的潜在特征。经研究的3个特征在以下之间有差异：(i)最小T2B值和最大T2B值(图13)，(ii) T2B曲线最后25分钟内T2B值的平均值，和(iii) 10分钟时的T2B值。所有都具有R²值介于0.72和0.79之间的相关性。相关性曲线图显示与TEG相比，T2凝血对血纤蛋白溶解有较高敏感性。这可通过对图13中的不同水平的血纤蛋白溶解的归类可见。健康患者样品用实线圈出。完全血纤蛋白溶解样品(含有118 ng/mL Cathflo®，由Genentech生产的重组阿替普酶)用虚线圈出，部分血纤蛋白溶解样品(含有60 ng/mL Cathflo®，由Genentech生产的重组阿替普酶)未圈出。T2凝血T2B项可在仅仅10分钟内检出，其比可检出的TEG LY30项快得多，表明了T2凝血信号对于更快速测量血纤蛋白溶解的实用性。

凝固时间、PT/INR和aPTT

血液和血浆中T2MR对血块形成的敏感性可用来测量凝固时间，例如PT/INR、aPTT和TEG R。

通过首先确立T2时间曲线的时间零T2值(即通过取第一点或某种平均值或线性拟合至前5-10个数据点)，其次确定当T2值发生变化达表明样品中有凝固的预定量(例如5%或10%)时T2时间曲线的时间点(即凝固时间或PT时间)，来通过T2MR测量凝固时间。根据所观察的PT凝固时间，采用Jan等, Clin. Chem. 35:840 (1989)描述的方法计算INR。

使用促凝血酶原激酶试剂(Thrombotest，Axis Shield)和用于T2MR的1:5稀释的全血和用于Stago Start系统的标准试剂和血浆方案，证实PT/INR与Stago的相关性(参见图14A)。针对通过20个正常样品确立的参考范围，对18个正常样品和24个异常样品进行测试。通过掺入递增水平的抗Xa抑制剂利伐沙班(Rivaroxiban) (10 ng/mL – 1000 ng/mL)，获得PT时间延长的异常样品。在涉及>40个正常患者样品中获得与TEG凝固时间的相关性，其非优化R2相关性>0.8。(参见图14B)。还发现对于血浆与Stago的PT时间的相关性(参见图14D)和对于全血与Hemochron的PT时间的相关性(参见图14C)。

实施例8：T1弛豫测量

除能够测定T2测量以处，可配置T2读数器以测定T1测量。T1测定样品中氢原子自旋系统的不同物理性质。因此，与T2数据相比，T1数据提供有关血液凝固的备选和补充信息。虽然常规T1测量由于获取T1信号的逐步性质所致是耗时的(2-3分钟)，但采用z-再聚焦回波(z-refocused echo, ZRE)方法以在小于5秒钟内获取T1。对天然和凝固全血T1弛豫曲线进行了测量，观察到T1对血液凝固的灵敏度(未凝固全血T1 = 787 ms；凝固全血T1 =860 ms)。

实施例9：T1/T2混杂检测方法

T1/T2混杂检测方法是本领域已知的(Edzes, J. Magn. Reson. 17: 301-313,1975；Sezginer等, J. Magn. Reson. 92: 504-527, 1991，其通过引用予以结合)。这些方法和相关方法可用于本发明以评价磁共振参数值和/或建立T2凝血曲线。

T1通常通过用反转-恢复序列(inversion-recovery sequence)采样。反转恢复序列可花几分钟获得，这取决于用户需要达到的所测弛豫时间的精度，这通过用于脉冲序列的数据测量数表示。本文将不描述反转恢复序列的详细情况，因为可在任何标准NMR教科书中查找。

T1ZRE脉冲序列允许测量磁化到完全弛豫所需时间内的T1 (约3-5 × T1)。这在通过测量其量值并用一系列脉冲将其返回其原始-z位置而磁化返回平稳的同时，通过用180°脉冲使磁化反转，然后使磁化变为脉冲信号来实现。

使磁化变为脉冲信号所花时间称为τ_c，脉冲调制间的时间为τ_r。τ_c开始后直到实际测量的时间为τ_m。所得弛豫常数为R₂和R₁的组合，称为R₁₂。通过方程式将3项联系起来：

　　(11)

其中p = τ_c/τ_r。根据此关系，可发现当p趋于0时，R12趋于R1。

τ_r将取决于点数和数和测量的总持续时间。对于T2凝血测量，对于100毫秒的τ_r，超过约3秒钟内为30个点。τ_c项可自脉冲序列计算，大致等于3×τ或750 μs。因此，p项等于0.0075，所测弛豫或杂合T1/T2 (hT12)项应主要为T1。Sezginer等提供一次方程以从hT12信号推导T1测量，其为

　　(12)

其中T₁ ^meas为hT12，T₁为T1，T_b为两次测量间的持续时间，t_cp为回波间衰减或τ的一半，T₂为所测量的T2时间。

以上描述仅仅说明如何可测量该杂化弛豫时间。存在可用于测量杂化弛豫常数和以快速方式推导T1的其它脉冲序列。

不论所使用的脉冲序列，本发明的构思涉及快速采集用于监测凝血(即血液凝固)的磁共振弛豫测量。可使用其它类型的磁共振脉冲序列监测凝血过程期间样品中的主体(bulk)氢信号。实例包括T2、T1、T1/T2混杂时间、其R2、R1、R12的倒数项和常用于张弛测量器中材料分析的脉冲NMR测量，例如基于自由感应衰减(FID)的分析、基于快速傅里叶变换的分析(FFT)。FID分析常区分快速衰减信号和慢速衰减信号。可比较这两种信号的强度，同样可比较它们的衰减常数。这些脉冲序列已常用于脂肪分析、脂肪含量和固体与液体比率、固体脂肪与液体比率、氢含量测定、油含量、固体含量和总脂肪含量测定、油水乳液及脂肪和水分测定。可用正进行凝血反应的样品中的那些NMR参数，进行类似的实时或动力学测量。

替代弛豫测量是有吸引力的，其提供：(1)凝固过程的更多信息；(2)未被T2测量捕捉的特定信息；和(3) T2和新参数两者对之敏感的因子的归一化。为了更多的描述第3点，例如，如果T1测量对患者与患者的变化敏感，但是T1不含凝血信息，则会有这样的算法，其使用T1曲线“扣除(subtract out)”产生于临床样品中非所需敏感性的T2信号的部分。所述非所需敏感性可为血细胞比容、血小板计数等的变化。

为了证实该构思，我们在Bruker minispec中测量了CK凝固曲线。实验以300 μL的样品体积并在玻璃NMR管内进行。该张弛测量器具有可以快速连续的方式测量T2和杂化T12(hT12)弛豫时间两者的脉冲序列。T1通过方程式12推导。

所得T2凝血曲线显示与在用于本发明的T2读数器上获得的T2凝血曲线非常相似的形状和特征。这是对其它T2凝血曲线的证实，因为所用Bruker minispec具有与T2读数器非常不同的检测线圈、磁体和曲线拟合算法。在所述脉冲序列条件下，T1/T2混杂主要为T1。在该实验中，以交叉方式获得T1/T2混杂信号。使用CPMG序列获得T2信号，然后使用T1ZRE序列获得T1/T2信号。信号可彼此组合以生成通过将T1/T2混杂(主要为T2)除以T2A计算的新的曲线，并可用于本发明的方法以评价血样的凝固性过高和/或凝固性过低。

实施例10：丙烯酰胺合成的凝固对照

丙烯酰胺凝胶聚合用作T2凝血测量的合成对照。按表3列出的量使用去离子水、40%丙烯酰胺、0.5 M Tris pH 6.8缓冲液和10%过硫酸铵以形成一组混合物，来制备一组丙烯酰胺凝胶。将混合物在室温下温育30分钟。36 μL各混合物存于一组单独的PCR管中用作对照。将2 μL四甲基乙二胺(TEMED)加入各混合物中。30分钟后，进行各对照和聚合反应的T2测量。

表3 –丙烯酰胺凝胶的组成

通过比较TEMED处理样品和相应的对照样品的T2值，计算T2的百分比变化。测量的数据见表4。

表4 –丙烯酰胺凝胶的T2时间的百分比变化

样品	对照，T2毫秒	聚合，T2毫秒	% T2变化
				3%	1386.3	1351.16	3
6%	1339.31	1107.84	17
				10%	1326.36	828.29	38
15%	1355.67	604.56	55
				20%	1235.29	450.85	64
40%	1200.66	145.87	88

15%、20%和40%丙烯酰胺凝胶表明最大% T2变化。这些反应被选出用于时程T2测量。按照表3制备15%、20%和40%丙烯酰胺凝胶。在加入TEMED时，立即将各样品放入T2 T2读数器中，并开始测量。时程数据显示T2的整体变化和反应的速度取决于丙烯酰胺百分比。这反映了这些不同反应的不同聚合物密度。T2对聚合物凝胶组成的敏感性可能是由于在单一T2测量的时程内T2对水扩散平均长度的变化的敏感性所致。

超顺磁纳米颗粒可与合成凝固反应(例如丙烯酰胺凝胶形成)一起使用。当40%丙烯酰胺凝胶在约800 nm羧基Sera-mag纳米颗粒(1 μg/mL纳米颗粒)存在下聚合时，T2时间曲线的初始部分变平。用于上述T2测量的CPMG参数如下：脉冲宽度= 6.8 μs；射频消隐宽度= 1 μs；90-180间距= 249.6 μs；num 180s = 7000；总激发= 3494.902 ms；重复(Tr) =1000 ms；接收器相= 0；90相= 0；和180相= 90。

该实施例说明正进行相变的样品中的NMR参数(例如T1或T2)如何变化。增加聚合物密度导致T2更快降低和T2的整体更大降低，这表明了T2信号对聚合物基质密度、孔径大小和凝胶的其它参数的依赖性。类似结果可用其它凝胶例如Κ角叉菜胶(加入钾离子的凝胶)、Ι角叉菜胶(加入钙离子的凝胶)、藻酸钙钠、明胶、尤其食物产品获得。

实施例11：细菌内毒素的检测

本发明的方法和装置用于检测细菌内毒素，即来自革兰氏阴性细菌的细胞壁物质。内毒素能够引起人发高烧，因此，常常测试接触血液的注射用药物和医学装置的内毒素的存在。用于检测内毒素的基于凝固的测定法依赖于细菌内毒素和测定中所用特定溶胞产物间的反应。来源于鲎Limulus polyphemus的循环阿米巴样细胞的溶胞产物是可使用的具体溶胞产物。在该测定中，将溶胞产物引入待测试内毒素存在的样品中。如果通过凝固过程形成凝胶，则认为存在内毒素。通过本文描述的任何基于NMR的方法监测这类凝胶的形成和性质。

实施例12：T2特征曲线

对NMR数据进行处理以生成显示代表血样内各水群体的清晰信号(即最大)的T2特征曲线。通过将数学变换(例如拉普拉斯变换或拉普拉斯逆变换)应用至与凝血事件期间某一时间点的T2有关的衰减曲线，来生成T2特征曲线。图15表示T2衰减曲线和相应的T2特征曲线。3个信号表示血样中的3个水群体。图15还表示其中信号可随时间变化的一个方式。

通过从周围血清分离收缩血块，并分别测量这两种组分的T2数据，来证实在NMR弛豫数据中观察到的水群体A和B与凝固样品组分的相关性(参见图16，凝固完成后的T2特征曲线)。在2个不同时间点上在T2读数器中收集的患者样品的2个T2弛豫谱(参见图18)。该谱显示与样品中的血液一致的时间0时的初始有效峰。在20分钟时，两个有效峰是明显的。具有较低T2时间(约200-300毫秒)的峰相当于T2血块水环境，具有较高T2时间(约450-580毫秒)的峰相当于T2血清水环境。

观察到T2A和T2B间的差异(△T2)与血块强度相关。图17表示从相同患者抽取的两个不同样品的2个重叠T2弛豫谱和TEG血块强度(MA)。含有较弱血块的样品(MA = 19.2)显示与含有较强血块的样品(MA = 65；258毫秒)相比，血块相关信号和血清相关信号(182毫秒)的差异值较低。数据显示增加血块强度与△T2正相关(R² = 0.8771，参见图18)。

实施例13：血块中水群体的3D图

从由健康患者抽取的CK血样中收集T2弛豫率数据。对于各样品，在50分钟时间内测量一系列T2衰减曲线。使用拉普拉斯逆变换(ILT CONTIN)分别对衰减曲线进行处理以提供显示T2强度随T2时间变化的一系列曲线。通过在凝固时间维度的持续时间内使拉普拉斯逆变换曲线重叠以生成显示样品内的不同水群体如何随时间变化的3D表面，来编辑这些曲线生成3D数据集。图20说明在Bruker minispec中收集的患者样品29328和29350的3D数据集。3D数据集显示具有相当于未凝固血的250-500毫秒T2时间的初始水群体。在5分钟和30分钟之间的时间内，单一水群体分为两个有效的水群体。这两种水群体相当于血块的两个组分，即收缩血块和收缩血块周围的血清。第一血块相关水群体具有80-400毫秒的T2时间，相当于收缩血块。第二血块相关水群体具有400-3000毫秒的较宽T2时间范围，相当于收缩血块周围的血清。对于某些样品，无法完全分辨这两个峰。通过将收缩血块和周围的血清分离，并且分别测量这两个组分的T2数据，来证实水群体和凝固样品的组分间的相关性。

实施例14：使用阿昔单抗抑制血小板活性

使用抗血栓药阿昔单抗(ReoPro®)干扰全血样品的凝固。阿昔单抗是人-鼠单克隆抗体的Fab片段，其与人血小板的IIb/IIIa受体结合并抑制血小板聚集。阿昔单抗用来抑制凝固过程中血块的收缩。

按照以下步骤并参照本申请和附图，以对应于单位为μg/mL的阿昔单抗浓度的数字，制备含有阿昔单抗的样品。

1. 从正常供体中抽血到6个柠檬酸盐管中。正常供体在过去2周内不得服用阿司匹林或任何抗血小板药物。

2. 合并6管血液，通过倒置8-10次轻轻混合。样品在收集2小时内使用。

3. 使用盐水作为稀释剂，以1:4的比率稀释阿昔单抗溶液(10 mg/5 mL)形成“溶液1”。

4. 按照表5，用溶液1和盐水掺入血液。

5. 使样品静置至少5分钟后，在T2读数器或Bruker minispec中在运行任何样品。

表5 –含有阿昔单抗的血样的制备

µl溶液1	µl盐水	µl血液	Reopro® (µg/ml)
				0	96	1904	0
2	62	1936	0.50
				4	60	1936	1
6	58	1936	1.5
				8	56	1936	2
10	54	1936	2.5
				12	52	1936	3
16	48	1936	4
				24	40	1936	6
32	32	1936	8

在第一个实验，在引发凝固过程前，用不同浓度的阿昔单抗(0、2、4和8 μg/mL)制备4个等分的患者样品29488。在血块形成过程中，测量4个样品的T2弛豫时间，并采用实施例13所述技术，确定相应的3D图。在4张3D图中明确趋势是显然的，其中较高浓度的阿昔单抗导致收缩血块水群体和血清水群体合并成单一水群体。在最高浓度的阿昔单抗下，在血块内不再有可见的两相。这种物理变化在相应的3D图得到证实和量化(图21)，表明在最高浓度的阿昔单抗下均匀样品内水的快速交换。

在第二实验中，在引发凝固过程前，用不同浓度(0、2、4、8和0 μg/mL)的阿昔单抗制备5个等分的患者样品29494。连续测量样品的T2弛豫时间，各组测量持续约50分钟。所测试的第一样品和所测试的最后样品不含添加的阿昔单抗。应用实施例18所述的拉普拉斯逆变换，对收集的T2衰减曲线进行处理。5个样品在0.1分钟时间内的数据见图22。曲线表明在阿昔单抗存在下，在血样存在的初始水群体内观察到较窄的T2信号分布。第一样品运行和最后样品运行(两者不含添加的阿昔单抗)之间曲线形状的差异，可表明样品时效(sampleage)对T2时间分布的作用。前4个样品在20分钟时间的数据见图23。这些样品相应的TEG测定的MA值分别为60.7、61.4、30.4和22.0。与形成较强血块和显示分辨差的T2峰(表明这些样品内的多个水群体和环境不均匀)的其它两个样品相比，具有最高浓度的阿昔单抗的两个样品形成较弱的血块(用TEG测量)，并且显示较窄、更能分辨的T2峰。该数据证实，本发明的基于NMR的方法可用于测量凝固样品内的血小板活性。图22和23显示，调节样品的凝固行为的添加剂(例如阿昔单抗)，可有利地用来确立TEG测定的指标(例如血块强度和血小板活性)和采用本发明的方法测定的NMR推导数据间的相关性。

图24显示由3D数据集制作的3D图如何可用来测定血样的凝固时间。图25显示，利用由3D数据集制作的3D图，血小板抑制如何降低血块相关信号的信号强度，并且使血清相关信号移位至较低的T2值。

实施例15：评价数据质量和拟合质量

单一样品的T2凝血数据由所观察的T2 CPMG弛豫曲线S合集组成，其中j=0，1，2，…,S为整个样品凝血/血块形成过程中的时间点，其j=0相当于凝固引发，j=S相当于样品进行了预期凝血事件后的点。T2凝血算法将该衰减函数合集变换成T2 ×凝固时域内的衰减常数位势(decay constant potential)的表面，然后从这些位势提取有关样品的有用信息。

可运用方程式(3)，将单一T2 CPMG弛豫数据模型化为加权指数衰减函数的有限和。通常由于样品复杂性所致，n颇大(例如n>300)。研发了许多算法以估计该模型的参数(参见Istratov等, Rev. Sci. Instrum. 70:1233 (1999))。例如，可在CONTIN (参见Provencher, Comput. Phys. Commun. 27:229 (1982))中执行Tikhonov正则化方法(参见Tikhonov Sov. Math. Dokl. 4:1035 (1963))以评价本发明方法收集的弛豫数据。正如常见的是(参见Davies, Inversion Problems in Scattering and Imaging (散射和成像中的反演问题), 由M. Bertero和E.R. Pike编辑(Adam Hilfer, Bristol, 1992), 第393页)，利用该T2凝血弛豫数据的反演方法可能需要应用特定修改或设置，例如下文提供的那些。

已知拉普拉斯逆变换是不适定计算，这意味着可从给定的复杂衰减数据集产生许多同样精确的解。这对最纯净数据是真实的，在复合衰减曲线变得较多噪音或自一次指数衰减函数之和显著移动时变坏。

CPMG数据质量

为了克服这个问题，在反演前，可对各T2 CPMG数据集进行测试，以确定数据和反演将会成功的总体可能性两者的质量。根据t=0时的CPGM强度与弛豫数据后期(即t接近T)观察到的变差相比，估算信噪比(SNR)。由起始信号降低引起的低SNR值与使数据不受考虑的仪器和操作人误差有关。低SNR还可生产于CPMG数据后期的变差增加，或者当衰减过程的观察持续时间过短时。后一情况表明给定数据集中的衰减常数比预期的大。由于Tikhonov正则化方法需要知道预期的最大T2值，因此T2算法通过提高最大预期T2值(CONTIN中的参数)迎合由CPMG曲线后期的线性趋势所致的低SNR的情况。

当少数极值点(相对于复合衰减假设)可存在于CPMG曲线尾部时，也引起变差增加。在用一次指数衰减函数拟合CPMG曲线的分段(0 < t1< t < t2 < T)后，在反演前删除存在于拟合残数分布的正或负尾部中的点。

在T2 CPMG数据经过判定后，在当观察到衰减过程长得足以允许应用拟合的Jackknife试验的情况下，将CPMG数据随机分成两个子集训练和检验，使得训练具有不超过8,000个数据点，其余点分配到检验集。使训练数据反演，使用所得模型参数(其定义多指数衰减函数)评价对检验数据的拟合质量。检验数据的拟合质量给出拟合的独立度量，并用于T2凝血算法的特征提取阶段。

CONTIN参数值

若干CONTIN参数显著影响拉普拉斯逆变换的质量。表6记载了这些参数和通过T2凝血算法以最佳拟合T2 CPMG数据所采用的值。正则化值(α)在分辨两个或更多个T2峰的能力中起主要作用。当水分子亚群体开始区分自身和其它群体时，T2凝血算法需要窄峰来区分。表6中规定的α值的具体范围迫使CONTIN用允许这种亚群辨别的正则化权重搜索解。

表6 – CONTIN参数和用于T2凝血算法的值

最小T2值通常设置在1-50 ms的范围。这说明产生自样品容器中的塑料的CPMG时间常数。当最小值增加超过1 ms时，对其进行ILT的CPMG曲线数据必须截尾以排除不允许反演的那些短时间常数。例如，如果最小T2设置为40 ms，则在执行ILT前，应删除在40ms以前收集的CPMG数据。

最大T2值以下列方式随样品/测定类型和使用模式而变化。含有少量RBC的富血小板和贫血小板血浆样品，需要较大的最大T2值。PPP和PRP最大T2值设置在2500-3500 ms的范围。含RBC的样品具有1000-2000 ms范围的最大T2值。当样品中包括磁性颗粒时，最大T2值也可降低。对于其中没有预测的T2值的情况，最大T2值可设置在2500-4000 ms的范围，以在检查新的样品类型时允许潜在T2值的最宽泛范围。由于ILT拟合试图说明整个CPMG曲线，但却只在T2值有限范围内说明，因此在T2拟合边界可能出现假峰。为了适应这种情况，加入额外0.5- 1秒至所用的最大T2值。上文提供的范围包括该额外时间。

Tikhonov正则化方法包括控制跨越T2域的反演平滑的参数(α)。太小且峰宽，具有产生化合物峰的潜力，太大且峰窄，具有将单峰分成若干紧密定位的峰。在执行Tikhonov算法时，CONTIN能够搜索寻求这两个极端之间的折衷的正则化项。这通过执行CONTIN实现，所述CONTIN没有进程α网格检索，但在α值约1.0e-10和约4.0e0的范围内细网格检索(12次迭代)增强。

T2衰减常数潜在表面的构建

一旦进行各ILT，曲线合集便替换原有的CPMG曲线合集。对于给定的CPMG曲线，估计衰减常数使促进多指数分解(参见方程式13)：

　　(13)，

其中对于许多k，可为零。非零衰减常数及其对上述分解的促进随时间的变化相当于样品中的变化，并且T2凝血算法解释了这些值及其推导有关样品流变状态的信息或推导有关受试者的止血状况的信息的变化。在提取这些特征之前，分辨假峰和多峰(如下文所述)。

假峰鉴定和删除

一般而言，对于给定的j，ILT振幅值在其中值为非零的小(<6)区域附近的T2域群聚。理想的是，非零强度的这些岛是单峰的，并且远离对之进行反演的T2值范围的边界。不一定总是这种情况，因此要小心以正确解释

应用于的第一滤子是删除非零值，其中T2值与基于待分析样品的类型的既往期望值不一致。其实例包括T2 < 50ms，这产生自装有样品的塑料；如果预期样品具有高浓度的蛋白质，则为T2 < 100ms；在用于反演的最大T2范围处或附近的T2(其存在表明较大的最大T2)应用于反演样品的CPMG数据。

另外，在估计各时，Tikhonov正则化方法计算的标准误差。当接近零时，常见，它意味着大多数非零岛的边缘是模糊的，尽管在这一非零强度合集的平均附近的强信号。这些不被删除。或者，当在为局部最大的处时，整个非零岛被视为不可靠，并设置为零。

实施例16：干燥或冷冻试剂的使用

干燥或冷冻试剂可用于本发明的方法。下面的结果表明，将试剂干燥和将试剂冷冻对通过T2弛豫观察的凝血过程没有可分辨的影响。

管干燥的胶原作为血小板激活剂

胶原是血小板的有效激活剂，识别来自细胞基质的暴露胶原是血小板活化的体内信号之一。我们证实，在微管底部干燥的少量等分的胶原可在全血和RBC耗尽血浆两者中有效地形成T2MR凝血峰。为了制备管，将2微克(2 µL 1mg/ml溶液)沉积在微管底部，将管置于37℃下达2-5小时。按这种方式制备的管可保持在室温下或在37℃下数周。为了测量T2MR特征，将34 µL柠檬酸盐全血(或RBC耗尽血液)在37℃下加入管中；1分钟后，加入2 µL 0.2MCaCl₂，并将样品放入磁体用于弛豫测量和分析。

用于血小板ADP活化的冷冻一锅(one-pot)制剂

我们开发了用于柠檬酸盐全血中的血小板的ADP活化的标准制剂，其使用肝素添加以控制凝血酶活化，因此使通过凝血酶的血小板活化变化性降到最低。使用钙(以胜过柠檬酸盐)和蛇毒凝血酶/因子XIIIa (以替换凝血酶)的组合引发这类系统中的凝固。完全一锅活化混合物(其通过ADP激活血小板，因此可用于探测P2Y12 ADP受体的状态)含有肝素、蛇毒凝血酶、因子XIIIa、钙和ADP。

我们证实，这类混合物可以小批量制备，并以一次性使用的等分量冷冻(在-20℃下)，用于ADP诱导血小板活性测量的T2MR测量。该混合物的使用包括将预制备的装有适量试剂混合物的微管在室温下融化，加入34 µL柠檬酸盐全血，混合，并将样品放进读数器中用于弛豫测量分析。

干燥的高岭土测定法

高岭土运行允许分辨血清和血块信号。在患者样品间，这些运行可显示来自用户误差的绝对T2值的偏差。使用干燥试剂避免了移液误差，并降低通常在所有湿试剂实验中遇到的试剂添加偏差。另外，使用干燥试剂提供更简单得多的测定方案，其中将血液直接加入装有干燥试剂的管中，没有额外的移液步骤。

制备含有CaCl₂和高岭土的干的混合物。将24 µL 0.2M CaCl₂和10.8 µL高岭土(Haemonetics)混合，将等分试样分配到10个PCR管(2.9 µL制备的混合物进入各管)中。将各管的内容物在培养箱中于37℃敞开管盖干燥超过2小时。将各管盖上盖子，将管保存在2-25℃下。向含干燥CK试剂混合物的预热PCR管中加入36 µL预热的柠檬酸盐全血。通过用100µL移液管头上下吸放，将试剂和血液混合3次。给混合物盖上盖子，并将样品放入T2读数器中用于弛豫测量分析。还将湿试剂与柠檬酸盐全血混合作为对照。

实施例17：阿司匹林的作用

在该实验中，在通过AA + RF活化之前，通过离体将600 µM阿司匹林加入肝素血液中，监测血小板抑制(试验含或不含阿司匹林的样品)。观察到在掺入阿司匹林的样品存在时，血块相关T2信号显著降低或不存在。这些研究证实，血块特征依赖于血小板活性。还证实了T2MR特征对测量血小板抑制的实用性。

实施例18：2-硫甲基AMP (MeSAMP)的作用

在该实验中，通过使用离体掺入的MeSAMP (2-硫甲基AMP，一种不可逆的ADPP2Y12受体抑制剂)作为血小板活性波立维抑制的模拟物，测试了在血小板中P2Y12途径的抑制。

使用包括肝素、蛇毒凝血酶、因子XIIIa、钙和ADP在内的标准ADP活化制剂，以激活获自健康供体的柠檬酸盐全血中的血小板。在血小板活化抑制剂MeSAMP存在和不存在时测试样品。再次观察到血块特征依赖于血小板活性。观察到在掺入MeSAMP的样品存在时，血块相关T2信号显著降低或不存在。

实施例19：组织纤溶酶原激活物的作用

T2MR表面同样对全血血纤蛋白溶解敏感。为了对此进行评价，将健康供体样品掺入组织纤溶酶原激活物(TPA)。证实了对血纤蛋白溶解结果的高敏感性和快速时间。

将TPA以100 U/mL加入来自健康供体的血液中。在TPA不存在时(参见图27a)，在预期凝固时间形成两个稳定的峰。在有100 U/mL TPA的情况下(参见图27b)，血块在预期时间形成，但证明在20-30分钟后不稳定。不稳定性和最终T2峰间的距离两者表明对因TPA的存在诱导的血纤蛋白溶解的敏感性。

对血纤蛋白溶解的T2MR作用，以通过计算针对T2时间曲线中血块信号(或T2B)的最大和最小T2值间的差异获得的AU值(任意单位；参见图27c)表示。发现这种差异对样品中血纤蛋白溶解的程度是敏感的。

在5个含或不含TPA (100 U/mL)的患者血样中，通过T2磁共振(T2MR)监测血纤蛋白溶解(图27c)。1个样品27790，在不加入TPA时显示显著的血纤蛋白溶解。其它所有样品都需要加入TPA以诱导血纤蛋白溶解，如参考方法所证实的一样。

其它实施方案

本说明书中提及的所有出版物、专利和专利申请均通过引用结合到本文中，其程度与仿佛各独立出版物或专利申请被具体而单独指明通过引用予以结合一样。

虽然结合其实施方案对本发明进行了描述，但应了解能够进行进一步修改，并且本申请欲涵盖基本遵循本发明原理的本发明的任何变化、用途或改编，包括自属于本发明所属领域已知或例行实践内的本公开内容的这类偏离，并可应用于上文提供的基本特征并遵循权利要求书的范围。

其它实施方案落入权利要求书内。

相关申请的交叉引用

本申请要求2011年7月13日提交的美国临时申请号61/507,307、2011年9月21日提交的美国临时申请号61/537,396、2011年9月23日提交的美国临时申请号61/538,257、2011年11月17日提交的美国临时申请号61/560,920、2012年2月8日提交的美国临时申请号61/596,445和2012年4月18日提交的美国临时申请号61/625,945的权益，其全部通过引用予以结合。

Claims (32)

1.一种监测第一血样的凝固或溶解过程的方法，所述方法包括：

(i) 在所述第一血样中进行水的一系列磁共振弛豫率测量；

(ii) 应用区分所述第一血样内的两个或更多个独立水群体的算法变换所述测量，其中各个独立水群体的特征在于具有一个或多个值的一个或多个磁共振参数；和

(iii) 根据步骤(ii)的结果，监测所述过程，

其中所述方法不是疾病诊断的。

2.权利要求1的方法，其中所述第一血样是血浆样品、全血样品、或凝血样品；或包含分离和洗涤的血小板。

3.权利要求2的方法，其中在步骤(i)之前，向所述第一血样中加入血纤蛋白原。

4.权利要求1-3中任一项的方法，其中在步骤(i)之前，向所述第一血样中加入凝固引发剂或凝固抑制剂；任选选自RF、AA、ADP、CK、TRAP和凝血酶的凝固引发剂；血小板聚集抑制剂或组织纤溶酶原激活物(TPA)；或任选选自胶原、肾上腺素、瑞斯托菌素、钙、组织因子、促凝血酶原激酶、5-羟色胺、血小板活化因子(PAF)、血栓烷A2 (TXA2)、血纤蛋白原、冯维勒布兰德因子(VFW)、弹性蛋白、纤连蛋白、层粘连蛋白、玻连蛋白、血小板反应蛋白、镧系元素离子和肝素酶的凝固激活剂；或者任选选自肝素和柠檬酸盐的凝固抑制剂。

5.权利要求1的方法，所述方法还包括：

(iv) 在来自所述受试者的第二血样中进行水的一系列第二弛豫率测量；

(v) 应用区分第二血样内的两个或更多个独立水群体的算法变换所述第二弛豫率测量，其中各个独立水群体的特征在于一个或多个磁共振参数，其中各个磁共振参数具有一个或多个值；和

(vi) 根据步骤(ii)和步骤(v)的结果，监测所述过程。

6.权利要求5的方法，其中(a)所述第一血样是血浆样品并且所述第二血样是全血样品；或(b)所述第一血样是富血小板血浆样品并且所述第二血样是全血样品；或(c)所述第一血样是贫血小板血浆样品并且所述第二血样是全血样品；或(d)所述第一血样包含分离和洗涤的血小板并且所述第二血样是全血样品；或(e)其中在步骤(i)之前，向所述第一血样中加入血小板抑制剂，且无血小板抑制剂加入所述第二血样中；或(f)其中在步骤(i)之前，向所述第一血样中加入血小板激活剂，且无血小板激活剂加入所述第二血样中；或(g)其中在步骤(i)之前，向所述第一血样中加入选自RF、AA和CK的凝固引发剂，并且在步骤(iv)之前，向所述第二血样加入选自ADP和凝血酶的凝固引发剂；或者(h)其中在步骤(i)之前，向所述第一血样中加入血纤蛋白原，并且在步骤(iv)之前，向所述第二血样加入血纤蛋白原。

7.权利要求1的方法，其中所述磁共振参数值代表所述血样中的功能性血纤蛋白原相关水分子；或其中所述两个或更多个独立水群体的至少一个与血小板活化、血小板抑制、凝固时间、血小板相关血块强度、血细胞比容或血纤蛋白原相关血块强度正相关；或其中所述磁共振参数值表明低血小板活性、高血小板活性、高功能性血纤蛋白原活性或低功能性血纤蛋白原活性；或其中所述算法包括选自以下的算法：多指数算法、双指数算法、三指数算法、指数衰减算法、拉普拉斯变换、拟合优度算法、SSE算法、最小平方算法和非负最小平方算法；或者其中所述弛豫率选自T1、T2、T1/T2混杂、T_1rho、T_2rho和T₂ ^*。

8.权利要求1的方法，其中所述弛豫率测量包括T2测量，且其中所述测量提供衰减曲线，并且其中所述两个或更多个水群体包括具有血清相关T2信号的水群体和具有血块相关T2信号的水群体。

9.权利要求8的方法，所述方法还包括(a1)在含红细胞的血样中引发血块形成之前，计算血清相关水的T2值，并根据所述T2值，确定所述血样的血细胞比容；或(a2)计算正进行凝固过程的血样的所述血清相关T2信号和所述血块相关T2信号间的差异；和根据所述差异，确定所述血样中形成的血块的强度；或(a3)计算包含血小板并正进行凝固过程的血样的所述血清相关T2信号和所述血块相关T2信号之间的差异；和根据所述差异，确定所述血样中血小板的活性；或(a4)在血样中引发凝固过程之后，测量初始检测所述血块相关T2信号前的时段；和根据所述时段，确定所述血样的凝固时间；或(a5)在血样中引发凝固过程之后，计算所述血清相关T2信号的T2时间曲线，计算T2时间曲线二阶导数的最大值，和计算代表凝固时间的值；或(a6)其中在血样中引发凝固过程之后，根据所述血清相关T2信号和所述血块相关T2信号，确定所述血样是否凝固性过高、凝固性过低或正常。

10.权利要求1的方法，所述方法还包括在血样中引发凝固或溶解过程之后，(a)对所述过程期间的所述血样进行多种弛豫率测量以产生多个衰减曲线，和(b)自所述多个衰减曲线计算多个T2弛豫谱。

11.权利要求10的方法，所述方法还包括：

- 自所述多个T2弛豫谱计算描述以下的三维数据集：在所述血样中引发凝固或溶解过程后，所述血样中两个或更多个水群体随时间变化的(a) T2弛豫时间的变化，和(b) T2信号强度的变化；和任选地，将所述三维数据集划分为稳定数据和过渡数据，并根据所述稳定数据和所述过渡数据，确定所述血样是否凝固性过高、凝固性过低或正常；或者

- 确定所述血样是否显示低血小板活性、高血小板活性、高功能性血纤蛋白原活性或低功能性血纤蛋白原活性；或者

- 自三维数据集计算在所述过程中在预定的时间内所述血样中两个或更多个水群体的每个所观察到的信号的相对容积，并根据所述信号的相对容积，确定所述血样是否凝固性过高、凝固性过低或正常；或者

- 确定所述血样是否显示低血小板活性、高血小板活性、高功能性血纤蛋白原活性或低功能性血纤蛋白原活性。

12.权利要求10的方法，其中所述方法：

- 用于评价血小板活性，所述方法包括：(ai)提供分离和洗涤的血小板；(aii)将所述分离和洗涤的血小板与包含预定的最低水平的血纤蛋白原的贫血小板血浆混合形成试验样品；(aiii)通过将凝固引发剂加入所述试验样品中引发凝固过程；(aiv)对所述试验样品中的水进行一系列磁共振弛豫率测量；(av)应用区分所述试验样品内两个或更多个独立水群体的算法变换所述测量，其中各个独立水群体的特征在于具有一个或多个值的一个或多个磁共振参数；和(avi)根据步骤(av)的结果，评价所述血小板活性；或者

- 用于评价全血样品中的血小板活性，所述方法包括：(bi)提供全血样品；(bii)通过将凝固引发剂加入所述试验样品中引发凝固过程；(biii)对所述试验样品中的水进行一系列磁共振弛豫率测量；(biv)采用区分所述试验样品内两个或更多个独立水群体的算法变换所述测量，其中各个独立水群体的特征在于具有一个或多个值的一个或多个磁共振参数；和(bv)根据步骤(biv)的结果，评价所述血小板活性。

13.权利要求1的方法，还包括确定全血是否凝固性过高、凝固性过低或正常。

14.权利要求4的方法，其中在步骤(i)之前，向所述第一血样中加入凝固引发剂，其中所述凝固引发剂诱发通过接触活化途径或组织因子活化途径的凝固活化。

15.权利要求14的方法，其中所述凝固引发剂是组织因子。

16.一种评价血小板活性的方法，所述方法包括：

(i) 提供分离和洗涤的血小板；

(ii) 将所述分离和洗涤的血小板与包含预定的最低水平的血纤蛋白原的贫血小板血浆混合形成试验样品；

(iii) 通过将凝固引发剂加入所述试验样品中引发凝固过程；

(iv) 对所述试验样品中的水进行一系列磁共振弛豫率测量；

(v) 应用区分所述试验样品内两个或更多个独立水群体的算法变换所述测量，其中各个独立水群体的特征在于具有一个或多个值的一个或多个磁共振参数；和

(vi) 根据步骤(v)的结果，评价所述血小板活性，

其中所述方法不是疾病诊断的。

17.一种评价血块的强度的方法，所述方法包括以下步骤：

(i) 对血块中的水进行T2弛豫率测量，其中所述测量提供衰减曲线；

(ii) 将数学变换应用于所述衰减曲线以鉴定所述血块中的水群体的信号强度，所述水群体处于血清水环境或收缩血块水环境；和

(iii) 根据所述信号强度，评价所述血块的强度，

其中所述方法不是疾病诊断的。

18.一种评价血块的血小板活性的方法，所述方法包括以下步骤：

(i) 对血块中的水进行T2弛豫率测量，其中所述测量提供衰减曲线；

(ii) 将数学变换应用于所述衰减曲线以鉴定所述血块的水群体的信号强度，所述水群体处于血清水环境或收缩血块水环境；和

(iii) 根据所述信号强度，评价所述血块的血小板活性，

其中所述方法不是疾病诊断的。

19.一种用于监测血液凝固过程的磁共振装置，所述装置包含含有正进行凝固过程的血样和凝固引发剂，

其中在凝固过程开始后，所述装置被配置以在所述凝固过程中对所述血样进行多次弛豫率测量，以产生多个衰减曲线并由所述多个衰减曲线计算多个T2弛豫谱，和

其中所述装置包括带有由所述多个T2弛豫谱区分血样内两个或更多个独立水群体的算法的微处理器，其中各个独立水群体的特征在于磁共振参数值或值集。

20.权利要求19的装置，其中所述血样是血浆样品、全血样品、或凝血样品，或包括分离和洗涤的血小板。

21.权利要求19的装置，还包括用于以下的算法：(a)计算血清相关T2信号值和血块相关T2信号值之间的差异；和(b)根据差异，确定血样中血小板的活性。

22.权利要求19的装置，还包括用于测定在开始检测血块相关T2信号之前凝固过程的时段的算法。

23.权利要求19的装置，还包括用于以下的算法：(a)计算第一水群体的T2时间曲线；(b)计算T2时间曲线二阶导数的最大值；和(c)根据步骤(b)的结果，计算代表凝固时间的值。

24.权利要求19的装置，还包括用于以下的算法：(a)计算在引发血块形成之前血样的T2值，和(b)根据T2值，确定血样的血细胞比容。

25.权利要求19的装置，所述血样包括添加的纤维蛋白原。

26.权利要求19的装置，其中所述凝固引发剂是组织因子。

27.权利要求19的装置，其中所述血样具有介于2 µL和400 µL之间的体积。

28.权利要求27的装置，其中所述血样具有介于2 µL和250 µL之间的体积。

29.权利要求27的装置，其中所述血样具有介于2 µL和50 µL之间的体积。

30.权利要求19的装置，其中所述血样具有介于200 µL和500 µL之间的体积。

31.权利要求2的方法，其中所述第一血样是血浆样品，其为贫血小板血浆样品或富血小板血浆样品。

32.权利要求20的装置，其中所述血样是血浆样品，其为贫血小板血浆样品或富血小板血浆样品。