HK1191981B - Methods for selecting and amplifying polynucleotides - Google Patents

Claims (11)

1. Procédé de sélection et d'amplification de polynucléotides sur un support solide, comprenant :

   a) la fourniture d'une pluralité d'oligonucléotides d'amplification immobilisés sur un support solide ;

   b) l'hybridation d'une population de sondes oligonucléotidiques avec un sous-ensemble desdits oligonucléotides d'amplification, chacune desdites sondes oligonucléotidiques comprenant une première partie qui est complémentaire des oligonucléotides d'amplification et une deuxième partie qui comprend une séquence d'une région sélectionnée d'un polynucléotide de matrice ;

   c) la conduite d'une réaction d'extension pour étendre les oligonucléotides d'amplification hybridés afin de produire une population d'oligonucléotides de capture liée à un support, chaque oligonucléotide de capture dans ladite population comprenant une séquence qui est complémentaire d'une région sélectionnée d'un polynucléotide de matrice, de manière à fournir un support solide comprenant la population d'oligonucléotides de capture liés à un support, et une population d'oligonucléotides d'amplification non étendus ;

   d) l'application d'une population de polynucléotides de matrice au support solide dans des conditions telles que les polynucléotides de matrice s'hybrident sélectivement avec les oligonucléotides de capture liés au support, le polynucléotide de matrice comprenant une séquence d'adaptateur à l'extrémité 5' où la séquence d'adaptateur est la même que la séquence des oligonucléotides d'amplification non étendus ;

   e) l'extension des oligonucléotides de capture liés aux supports qui sont hybridés au polynucléotide de matrice de manière à générer des produits d'extension, le produit d'extension ayant une partie complémentaire des polynucléotides de matrice et une partie complémentaire des oligonucléotides d'amplification non étendus ; et

   f) l'amplification des produits d'extension, où l'amplification comprend l'hybridation d'un ou plusieurs des oligonucléotides d'amplification non étendus avec un ou plusieurs des produits d'extension, de manière à produire un produit d'amplification en phase solide.
2. Procédé de la revendication 1, comprenant en outre :

   g) le séquençage d'un premier brin du produit d'amplification en phase solide de l'étape f) pour obtenir au moins une partie de la séquence nucléotidique du polynucléotide de matrice.
3. Procédé de la revendication 2, dans lequel lesdits produits d'amplification en phase solide comprennent un site de liaison pour une amorce de séquençage universelle.
4. Procédé de la revendication 1, dans lequel les oligonucléotides de capture comprennent au moins 10 séquences de capture différentes.
5. Procédé de la revendication 1, dans lequel les oligonucléotides d'amplification, qui ne sont pas hybridés avec une sonde oligonucléotidique dans l'étape b) de la revendication 1, sont bloqués de façon réversible pendant l'extension des oligonucléotides de capture.
6. Procédé de la revendication 5, dans lequel le blocage réversible est effectué par une espèce chimique liée à une extrémité 3' des oligonucléotides d'amplification.
7. Procédé de la revendication 6, dans lequel l'espèce chimique est un groupe phosphate.
8. Procédé de la revendication 1, dans lequel l'amplification est isotherme.
9. Procédé de la revendication 1, dans lequel la partie des produits d'extension complémentaires des oligonucléotides d'amplification non étendus comprend une séquence d'adaptateur.
10. Procédé de la revendication 9, dans lequel les polynucléotides de matrice dans l'échantillon d'acide nucléique comprennent différentes séquences et la séquence d'adaptateur est la même pour chaque polynucléotide de matrice.
11. Procédé de la revendication 10, dans lequel la pluralité d'oligonucléotides d'amplification comprend chacun une séquence commune qui est complémentaire de la séquence d'adaptateur qui est la même pour chaque polynucléotide de matrice.