HK1191981B - Methods for selecting and amplifying polynucleotides - Google Patents

Claims (11)

1. Verfahren zum Selektieren und Amplifizieren von Polynukleotiden auf einem festen Träger, das umfasst, dass

   a) eine Vielzahl an Amplifikationsoligonukleotiden bereitgestellt wird, die an einem festen Träger immobilisiert sind;

   b) eine Population von Oligonukleotidsonden an eine Untergruppe der Amplifikationsoligonukleotide hybridisiert wird, wobei jede der Oligonukleotidsonden einen ersten Teil, der komplementär zu den Amplifikationsoligonukleotiden ist, und einen zweiten Teil aufweist, der eine Sequenz eines ausgewählten Bereiches eines Matrizenpolynukleotids aufweist;

   c) eine Extensionsreaktion durchgeführt wird, um hybridisierte Amplifikationsoligonukleotide zu verlängern, um eine Population von Träger-gebundenen Fang-Oligonukleotiden zu erzeugen, wobei jedes Fang-Oligonukleotid in der Population eine Sequenz aufweist, die komplementär ist zu einem ausgewählten Bereich eines Matrizenpolynukleotids, wodurch ein fester Träger bereitgestellt wird, der die Population von Träger-gebundenen Fang-Oligonukleotiden, und eine Population von unverlängerten Amplifikationsoligonukleotiden aufweist;

   d) eine Population von Matrizenpolynukleotiden auf den festen Träger unter solchen Bedingungen aufgebracht wird, dass die Matrizenpolynukleotide an die Träger-gebundenen Fang-Oligonukleotide selektiv hybridisieren, wobei die Matrizenpolynukleotide eine Adaptersequenz am 5'-Ende aufweisen, wobei die Adaptersequenz die gleiche ist wie die Sequenz der unverlängerten Amplifikationsoligonukleotide;

   e) die Träger-gebundenen Fang-Oligonukleotide, die an die Matrizenpolynukleotide hybridisiert werden, verlängert werden, wodurch Extensionsprodukte erzeugt werden, wobei die Extensionsprodukte einen Teil haben, der komplementär zu den Matrizenpolynukleotiden ist, und einen Teil haben, der komplementär zu den unverlängerten Amplifikationsoligonukleotiden ist; und

   f) die Extensionsprodukte amplifiziert werden, wobei die Amplifikation umfasst, dass ein oder mehrere der unverlängerten Amplifikationsoligonukleotide an ein oder mehrere der Extensionsprodukte anlagern, wodurch ein Festphasen-Amplifikationsprodukt hergestellt wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1, das ferner umfasst, dass

   g) ein erster Strang des Festphasen-Amplifikationsprodukt aus Schritt f) sequenziert wird, um mindestens einen Teil der Nukleotidsequenz des Matrizenpolynukleotids zu erhalten.
3. Verfahren nach Anspruch 2, wobei die Festphasen-Amplifikationsprodukte eine Bindungsstelle für einen universellen Sequenzierungsprimer aufweisen.
4. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Fang-Oligonukleotide mindestens 10 unterschiedliche Fangsequenzen aufweisen.
5. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Amplifikationsoligonukleotide, die nicht mit einer Oligonukleotidsonde in Schritt b) von Anspruch 1 hybridisieren, während der Extension der Fang-Oligonukleotide reversibel blockiert sind.
6. Verfahren nach Anspruch 5, wobei reversible Blockierung durch eine chemische Spezies geschieht, die an einem 3'-Ende der Amplifikationsoligonukleotide befestigt ist.
7. Verfahren nach Anspruch 6, wobei die chemische Spezies eine Phosphatgruppe ist.
8. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Amplifikation isotherm ist.
9. Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Teil der Extensionsprodukte, der komplementär zu den unverlängerten Amplifikationsoligonukleotiden ist, eine Adaptersequenz aufweist.
10. Verfahren nach Anspruch 9, wobei die Matrizenpolynukleotide in der Nukleinsäureprobe verschiedene Sequenzen aufweisen, und die Adaptersequenz für jedes Matrizenpolynukleotid die gleiche ist.
11. Verfahren nach Anspruch 10, wobei die Vielzahl an Amplifikationsoligonukleotiden jeweils eine gemeinsame Sequenz aufweist, die komplementär zu der Adaptersequenz ist, die für jedes Matrizenpolynukleotid die gleiche ist.