HK1185622B - Axl抗体 - Google Patents

Description

AXL抗体

本申请是申请日为2008年11月12日、申请号为200880123225.9的同名申请的分案申请。

描述

本发明涉及结合AXL受体酪氨酸激酶的细胞外结构域并且至少部分地抑制AXL活性的抗体，特别地单克隆抗体。

背景

AXL(Ark、UFO、Tyro-7)受体酪氨酸激酶是激酶的Tyro-3家族的成员，该家族其他成员是Mer(Eyk、Nyk、Tyro-12)和Sky(Rse、Tyro-3、Dtk、Etk、Brt、Tif)。其可通过嗜异性配体Gas6（与抗凝血因子蛋白S同源的70-kDa蛋白）的结合来激活。与其他受体酪氨酸激酶相反，AXL酪氨酸磷酸化还可通过嗜同性结合（homophilic binding）诱导。AXL激活导致通过PI-3-激酶/Akt(Franke等人，Oncogene22:8983-8998，2003)和其他主要途径如Ras/Erk和β-联蛋白/TCF(Goruppi等人，Mol.Cell Biol.21:902-915，2001)的信号转导。

AXL在许多正常组织包括脑、心脏、骨骼肌、几种其他器官的器官囊和结缔组织中以及在单核细胞但非淋巴细胞中微弱地表达。已在成纤维细胞(Goruppi等人，Mol Cell Biol17:4442-44531997)、内皮细胞(Hasanbasic等人，Am J Physiol Heart Circ Physiol，2004)、血管平滑肌细胞(Melaragno等人，J.Mol.Cell Cardiol.37:881-887，2004)和神经元(Allen等人，Mol.Endocrinol.13:191-2011999)的存活中描述了由AXL诱导的Akt磷酸化。此外，AXL在细胞粘着和趋化性中起着重要作用。AXL的敲除展示削弱的血小板聚集稳定作用和血栓形成（由于减少的血小板整联蛋白IIb3的激活）。

已在不同癌症类型例如乳腺癌(Meric等人，Clin.Cancer Res.8:361-367，2002;Berclaz等人，Ann.Oncol.12:819-824，2001)、结肠癌(Chen等人，Int.J.Cancer 83:579-584，1999;Craven等人，Int.J.Cancer 60:791-797，1995)、前列腺癌(Jacob等人，Cancer Detect.Prev.23:325-332，1999)、肺癌(Wimmel等人，EurJ Cancer 37:2264-2274，2001)、胃癌(Wu等人，Anticancer Res 22:1071-1078，2002)、卵巢癌(Sun等人，Oncology66:450-457，2004)、子宫内膜癌(Sun等人，Ann.Oncol.14:898-906，2003)、肾癌(Chung等人，DNA Cell Biol.22:533-540，2003)、肝细胞癌(Tsou等人，Genomics50:331-340，1998)、甲状腺癌(Ito等人，Thyroid12:971-975，2002;Ito等人，Thyroid9:563-567，1999)和食管癌(Nemoto等人，1997)中，此外在CML(Janssen等人，A novel putative tyrosinekinase receptor with oncogenic potential.Oncogene，6:2113-2120，1991;Braunger等人，Oncogene14:2619-2631 1997;O'Bryan等人，Mol Cell Biol 11:5016-5031,1991)、AML(Rochlitz等人，Leukemia 13:1352-1358，1999)、骨肉瘤(Nakano等人，J.Biol.Chem.270:5702-5705，2003)、黑素瘤(van Ginkel等人,.Cancer Res64:128-134，2004)中和在头颈鳞状细胞癌(Green等人，Br J Cancer.2006 94:1446-5，2006)中证实了AXL的过表达。

此外，AXL被鉴定为与非侵袭性细胞相比在侵袭性乳腺癌细胞系中上调的转移相关基因。在体外，发现AXL活性是迁移和侵袭所必需的，并且该活性可通过抗体处理来抑制(WO04008147)。类似地，通过AXL的显性负形式（dominant negative version）的表达(Vajkoczy，P.,等人，Proc.Natl.Acad.Science U.S.A.103:5799-5804.2005)或通过AXL的siRNA介导的下调(Holland等人，Cancer Res.65:9294-9303，2005)产生的体内AXL活性的消除在鼠异种移植实验中阻止了皮下和同位（orthotopic）细胞生长。

到目前为止，已描述了结合AXL并且具有生物学活性的两种抗体。一种抗体能够减少AXL介导的细胞侵袭(WO04008147)，而另一种抗体据报导减少AXL/配体相互作用。然而两种抗体都是多克隆抗体，这使得它们不适合于治疗施用。

因此，鉴于AXL的治疗潜能，存在对有效并且特异性地阻断AXL介导的信号转导并且适合于治疗性处理的单克隆AXL抗体、其抗体片段或衍生物的高度需要。

因此本发明的第一方面涉及结合AXL（特别地人AXL）的细胞外结构域并且至少部分抑制AXL活性的单克隆抗体，包括其片段或衍生物。

优选，本发明的抗体还具有至少一个或多个下列特性：减少或阻断AXL介导的信号转导的能力、减少或阻断AXL磷酸化的能力、减少或阻断细胞增殖的能力、减少或阻断血管生成的能力、减少或阻断细胞迁移的能力、减少或阻断肿瘤转移的能力、减少或阻断AXL介导的PI3K信号转导的能力和减少或阻断AXL介导的抗细胞凋亡的能力，从而增加例如细胞对使用抗肿瘤剂的治疗的敏感性。此外，本发明的抗体可展示对AXL，特别地人AXL的高特异性并且不显著识别其他Tyro-3家族成员，例如MER和/或SKY和/或哺乳动物非灵长类AXL，例如鼠AXL。抗体特异性可通过测量交叉反应性来确定，如实施例中描述的。

术语“活性”是指影响细胞的表型，特别地但不限于癌症表型例如细胞凋亡的逃脱、生长信号的自足、细胞增殖、组织侵袭和/或转移、对抗生长信号的不敏感（抗细胞凋亡）和/或持续的血管生成的AXL的生物学功能。

术语“AXL介导的信号转导”意指通过AXL与第二信使分子的直接或间接相互作用触发的第二信使途径的激活。

术语“AXL磷酸化”是指氨基酸残基，优选酪氨酸残基被第二AXL蛋白（转磷酸作用）或被另一种具有蛋白质激酶活性的蛋白质磷酸化。

术语“细胞增殖”是指引起人细胞特别地但不限于人癌细胞的增殖的所有牵涉AXL的过程。它们促成或导致细胞DNA的复制、复制的DNA至两个同等大小的染色体组的分离以及整个细胞的物理分裂(称为胞质分裂)，并且受AXL的非催化或催化活性（优选包括AXL磷酸化和/或AXL介导的信号转导）刺激或介导。

术语“血管生成”是指促成从现有血管生长新血管，特别地但不限于新肿瘤供应血管的所有牵涉AXL的过程。这些过程包括多个细胞事件例如血管内皮细胞的增殖、存活、迁移和出芽（sprouting）、周细胞的吸引和迁移以及用于血管稳定的基底膜形成、血管灌流、或基质或赘生性细胞的血管生成因子的分泌，并且受AXL的非催化或催化活性（优选包括AXL磷酸化和/或AXL介导的信号转导）刺激或介导。

术语“转移”是指支持癌细胞从原发性肿瘤扩散，渗入淋巴管和/或血管、通过血流循环，并且在身体的其他部位的正常组织中的远距离病灶(转移灶)中生长的所有牵涉AXL的过程。特别地，其是指引起转移并且由AXL的非催化或催化活性（优选包括AXL磷酸化和/或AXL介导的信号转导）刺激或介导的肿瘤细胞的细胞事件例如增殖、迁移、锚定不依赖性、细胞凋亡的逃脱或血管生成因子的分泌。

术语“AXL介导的抗细胞凋亡”是指阻止人细胞，优选但不限于人癌细胞程序化细胞死亡（细胞凋亡）的所有牵涉AXL的过程。特别地，其指使人细胞，优选但不限于人癌细胞免受因生长因子的撤离、缺氧、对化疗剂或辐射的暴露或Fas/Apo-1受体介导的信号转导的起始而诱导的细胞凋亡，并且受AXL的非催化或催化活性（优选包括AXL磷酸化和/或AXL介导的信号转导）刺激或介导的过程。

此外，本发明包括其对AXL的结合活性为KD=10^-5M或更低，优选KD=10^-7M或更低，最优选KD=10^-9M或更低的抗体。本发明的抗体对AXL的结合活性是不是KD=10^-5M或更低可通过本领域技术人员已知的方法来测定。例如，活性可利用Biacore，使用表面等离子共振和/或通过ELISA(酶联免疫吸附测定)、EIA(酶免疫测定)、RIA(放射免疫测定)或荧光抗体技术例如FACS来测定。

在第二方面，抗体可具有至少一个抗原结合部位，例如，1或2个抗原结合部位。此外，抗体优选包含至少一条免疫球蛋白重链和至少一条免疫球蛋白轻链。免疫球蛋白链包含可变结构域和任选地恒定结构域。可变结构域可包含互补决定区(CDR)，例如CDR1、CDR2和/或CDR3区，以及构架区。术语“互补决定区”(CDR)在本领域内已有明确定义（参见，例如，Harlow和Lane，"Antibodies，a LaboratoryManual"，CSH Press，Cold Spring Harbour，1988)，其是指抗体的可变区内主要与抗原接触的氨基酸区段。

本发明的另外的方面涉及结合AXL的细胞外结构域的抗体，包括其片段或衍生物，所述抗体包含至少一个含有至少一个选自下述的CDR的重链氨基酸序列：

(a)SEQ ID NOs:16，22，28中显示的CDRH1，或与其相异1或2个氨基酸的CDRH1序列,

(b)SEQ ID NOs:17，23，29中显示的CDRH2，或与其相异1或2个氨基酸的CDRH2序列，和

(c)SEQ ID NOs:18，24，30中显示的CDRH3，或与其相异1或2个氨基酸的CDRH3序列，

和/或至少：

一个含有至少一个选自下述的CDR的轻链氨基酸序列：

(d)SEQ ID NOs:13，19，25中显示的CDRL1，或与其相异1或2个氨基酸的CDRL1序列，

(e)SEQ ID NOs:14，20，26中显示的CDRL2，或与其相异1或2个氨基酸的CDRL2序列，和

(f)SEQ ID NOs:15，21，27中显示的CDRL3，或与其相异1或2个氨基酸的CDRL3序列，

或识别AXL的细胞外结构域上的相同表位的单克隆抗体。

在优选的实施方案中，抗体包含含有至少一个选自下述的CDR的重链：

(a)SEQ ID NO:16中显示的CDRH1，或与其相异1或2个氨基酸的CDRH1序列，

(b)SEQ ID NO:17中显示的CDRH2，或与其相异1或2个氨基酸的CDRH2序列，和

(c)SEQ ID NO:18中显示的CDRH3，或与其相异1或2个氨基酸的CDRH3序列，

和/或包含至少一个选自下述的CDR的轻链：

(d)SEQ ID NO:13中显示的CDRL1，或与其相异1或2个氨基酸的CDRL1序列，

(e)SEQ ID NO:14中显示的CDRL2，或与其相异1或2个氨基酸的CDRL2序列，和

(f)SEQ ID NO:15中显示的CDRL3，或与其相异1或2个氨基酸的CDRL3序列，

或识别AXL的细胞外结构域上的相同表位的单克隆抗体。

在另外的优选实施方案中，抗体包含含有至少一个选自下述的CDR的重链：

(a)SEQ ID NO:22中显示的CDRH1，或与其相异1或2个氨基酸的CDRH1序列，

(b)SEQ ID NO:23中显示的CDRH2，或与其相异1或2个氨基酸的CDRH2序列，和

(c)SEQ ID NO:24中显示的CDRH3，或与其相异1或2个氨基酸的CDRH3序列，

和/或包含至少一个选自下述的CDR的轻链：

(d)SEQ ID NO:19中显示的CDRL1，或与其相异1或2个氨基酸的CDRL1序列，

(e)SEQ ID NO:20中显示的CDRL2，或与其相异1或2个氨基酸的CDRL2序列，和

(f)SEQ ID NO:21中显示的CDRL3，或与其相异1或2个氨基酸的CDRL3序列，

或识别AXL的细胞外结构域上的相同表位的单克隆抗体。

在另外的优选实施方案中，抗体包含含有至少一个选自下述的CDR的重链：

(a)SEQ ID NO:28中显示的CDRH1，或与其相异1或2个氨基酸的CDRH1序列，

(b)SEQ ID NO:29中显示的CDRH2，或与其相异1或2个氨基酸的CDRH2序列，和

(c)SEQ ID NO:30中显示的CDRH3，或与其相异1或2个氨基酸的CDRH3序列，

和/或包含至少一个选自下述的CDR的轻链：

(d)SEQ ID NO:25中显示的CDRL1，或与其相异1或2个氨基酸的CDRL1序列，

(e)SEQ ID NO:26中显示的CDRL2，或与其相异1或2个氨基酸的CDRL2序列，和

(f)SEQ ID NO:27中显示的CDRL3，或与其相异1或2个氨基酸的CDRL3序列，

或识别AXL的细胞外结构域上的相同表位的单克隆抗体。

在另一个实施方案中，本发明明涉及包含选自SEQ ID NOs:8，10，12的重链氨基酸序列或至少其可变结构域或与其具有至少90%的序列同一性的氨基酸序列和/或选自SEQ ID NOs:7，9，11的轻链氨基酸序列或至少其可变结构域或与其具有至少90%的序列同一性的氨基酸序列的抗体或识别AXL的细胞外结构域上的相同表位的抗体。

如本文中所使用的，两个多肽序列之间的“序列同一性”是指序列之间相同的氨基酸的百分比。本发明的优选的多肽序列具有至少90%的序列同一性。

在特别优选的实施方案中，抗体选自11B7、11D5、10D12或识别AXL的细胞外结构域上的相同表位的抗体。

抗体可以是天然和/或合成来源的任何抗体，例如哺乳动物来源的抗体。优选，恒定结构域--如果存在--是人恒定结构域。可变结构域优选是哺乳动物可变结构域，例如人源化的或人可变结构域。更优选，抗体是嵌合抗体、人源化抗体或人抗体。

本发明的抗体可以是IgA、IgD、IgE、IgG或IgM类型，优选IgG或IgM类型，包括但不限于IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM1和IgM2类型。在最优选的实施方案中，抗体是人IgG1、IgG2或IgG4类型。

如所论述的（同上），存在许多抗体的同种型。应理解，所产生的抗体不必一开始就具有这样的同种型，相反，所产生的抗体可具有任何同种型，并且可通过使用本领域内熟知的常规分子生物学技术将分子克隆的V区基因或克隆的恒定区基因或cDNA用于合适的表达载体，然后使用本领域内已知的技术在宿主细胞中表达抗体来对抗体进行同种型转换。

术语抗体包括具有至少一个抗体的抗原结合部位的“片段”或“衍生物”。抗体片段包括Fab片段、Fab'片段、F(ab')₂片段以及Fv片段。抗体的衍生物包括单链抗体、纳米抗体（nanobody）和双价抗体（diabody）。抗体的衍生物还包括具有结合AXL的抗体样结合活性的支架蛋白。

在本发明的说明书中，术语“支架蛋白”，如本文中所使用的，意指具有其中氨基酸插入、置换或缺失是高度可耐受的暴露的表面区域的多肽或蛋白质。可根据本发明使用的支架蛋白的实例是来自金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）的蛋白A、来自大菜粉蝶（Pierisbrassicae）的后胆色素结合蛋白或其他脂质运载蛋白（lipocalin）、锚蛋白重复序列蛋白（ankyrin repeat protein）和人纤连蛋白(综述于Binz和Plückthun，Curr Opin Biotechnol,16:459-69，2005中)。支架蛋白的工程改造可被认为是将亲和力功能移植或整合至或入稳定折叠的蛋白质的结构构架。亲和力功能根据本发明是指蛋白质结合亲和力。支架在结构上可以与赋予结合特异性的氨基酸序列分离。一般地，表现适合于开发此类人工亲和力试剂的蛋白质可通过合理的，或最常见地，组合蛋白质工程技术例如针对AXL（纯化的蛋白质或在细胞表面上展示的蛋白质）淘选体外展示的人工支架文库中的结合剂（本领域内已知的技术）来获得(Skerra，J.Mol.Recog.，Biochim BiophysActa，1482:337-350，2000;Binz和Plückthun，Curr OpinBiotechnol，16:459-69，2005)。此外，具有抗体样结合活性的支架蛋白可来源于含有支架结构域的受体多肽（可向其移植供体多肽的结合结构域以将供体多肽的结合特异性赋予含有支架结构域的受体多肽）。插入的结合结构域可包括例如抗AXL抗体的至少一个CDR，优选至少一个选自SEQ ID NOs:13-30的CDR。可通过本领域技术人员已知的各种方法，包括例如多肽合成、编码氨基酸的核酸的合成以及通过本领域技术人员熟知的各种形式的重组方法来实现插入。

如已在上文中指出的，抗体、抗体片段或其衍生物的特异性在于CDR的氨基酸序列。抗体的可变结构域（重链VH和轻链VL）优选包含3个互补决定区（有时称为高变区），其侧翼连接4个相对保守的构架区或“FR”。通常，抗体的特异性由或主要由CDR例如VH链的CDR或多个CDR决定。本领域技术人员将容易地理解，抗体的可变结构域、具有上述CDR的其抗体片段或衍生物可用于具有进一步提高的特异性和生物学功能的抗体的构建。因此，本发明包括包含上述可变结构域的至少一个CDR并且有利地具有与所附实施例中描述的抗体基本上相同、相似或提高的结合特性的抗体、其抗体片段或衍生物。通过始于包含至少一个所附序列表中引述的和本发明的实施方案所需的CDR的抗体，本领域技术人员可就增强的特异性和/或亲和力组合来自最初鉴定的单克隆抗体或不同抗体的另外的CDR。CDR移植在本领域内是熟知的，其还可用于微调本发明的抗体、其片段或衍生物的特异性亲和力和其他特性，只要最初的特异性得到保持即可。有利地抗体、其片段或衍生物包含原始供体抗体的至少2个、更优选至少3个、更优选至少4个或至少5个以及特别优选所有6个CDR。在本发明的另外的备选实施方案中，可在新抗体实体中组合来自不同的最初鉴定的单克隆抗体的CDR。在这些情况下，优选重链的3个CDR源自相同抗体，而轻链的3个CDR全部源自不同抗体(但全部源于相同抗体)。本发明的抗体或它们相应的免疫球蛋白链还可使用本领域内已知的常规技术，例如通过单独地或组合地使用氨基酸缺失、插入、置换、添加和/或重组和/或本领域内已知的任何其他修饰来进行修饰。用于将此类修饰导入编码免疫球蛋白链的氨基酸序列的DNA序列的方法对于本领域技术人员来说是熟知的；参见，例如，Sambrook，Molecular Cloning ALaboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory(1989)N.Y。

任选地对抗体、抗体片段或其衍生物进行去免疫化(deimmunized)以用于治疗目的。去免疫化抗体是不具有或具有减少的可被T辅助淋巴细胞识别的表位的蛋白质。鉴定所述表位的方法的实例示于Tangri等人，(J Immunol.174:3187-96，2005)中。可如美国专利6,054,297，5,886,152和5,877,293中所述进行去免疫化抗体片段或其衍生物的制备。

在一个实施方案中，本文中的抗体特别地包括其中重链和/或轻链的一部分与来源于特定物种或属于特定抗体种类或亚类的抗体中的相应序列同一或同源，而链的其余部分与来源于另一物种或属于另一抗体种类或亚类的抗体中的相应序列同一或同源的“嵌合”抗体（免疫球蛋白）以及此类抗体的片段，只要它们展示期望的生物学活性(美国专利4,816,567;Morrison等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，81:6851-6855(1984))。嵌合抗体的产生描述于例如WO 89/09622中。

优选，本发明涉及嵌合抗体或识别AXL的细胞外结构域上的相同表位的抗体，所述嵌合抗体包含选自SEQ ID NOs:38，39，41，42的重链氨基酸序列或至少其可变结构域或与其具有至少90%的序列同一性的氨基酸序列和/或选自SEQ ID NOs:37，40的轻链氨基酸序列或至少其可变结构域或与其具有至少90%的序列同一性的氨基酸序列。

在另外的实施方案中，本发明的抗体是人源化抗体或完全人抗体。可按照本领域内已知的方法例如嵌合化或CDR移植来产生抗体的人源化形式。用于产生人源化抗体的备选方法在本领域内是熟知的并且描述于例如EP-A1 0 239 400和WO90/07861中。通常，人源化抗体具有一个或多个导入其中的来自非人来源的氨基酸残基。此类非人氨基酸残基通常称为“输入”残基，其通常获自“输入”可变结构域。人源化可以例如按照Winter和同事的方法(Jones等人，Nature，321:522-525(1986);Riechmann等人，Nature，332:323-327(1988);Verhoeyen等人，Science，239:1534-1536(1988))，通过用非人来源的CDR或CDR序列置换人抗体的相应序列来进行。因此，此类“人源化”抗体是嵌合抗体(美国专利4,816,567)，其中大体上比完整人可变结构域小的部分被来自非人物种的相应序列置换。实际上，人源化抗体通常是其中一些CDR残基和可能地一些FR残基被来自非人抗体中类似位点的残基置换的人抗体。

优选，本发明涉及人源化抗体或识别AXL的细胞外结构域上的相同表位的抗体，所述人源化抗体包含选自SEQ ID NOs:44，46的重链氨基酸序列或至少其可变结构域或与其具有至少90%的序列同一性的氨基酸序列和/或选自SEQ ID NOs:43，45的轻链氨基酸序列或至少其可变结构域或与其具有至少90%的序列同一性的氨基酸序列。

用于产生完全人抗体的一个方法是使用已经历工程改造从而包含多至但低于1000kb大小的人重链基因座和κ轻链基因座的种系配置片段（germline configured fragment）的小鼠的品系。参见，Mendez等人，(Nature Genetics 15:146-1561997)，以及Green和Jakobovits,(J.Exp.Med.188:483-495，1998)。品系可从AMGEN，Inc.(以前为ABGENIX，Fremont，CA)获得。

小鼠的品系的产生论述和描述于1990年1月12日提交的美国专利申请系列案07/466,008，1990年11月8日提交的07/610,515，1992年7月24日提交的07/919,297，1992年7月30日提交的07/922,649，1993年3月15日提交的08/031,801，1993年8月27日提交的08/112,848，1994年4月28日提交的08/234,145，1995年1月20日提交的08/376,279，1995年4月27日提交的08/430,938，1995年6月5日提交的08/464,584，1995年6月5日提交的08/464,582，1995年6月5日提交的08/463,191，1995年6月5日提交的08/462,837，1995年6月5日提交的08/486,853，1995年6月5日提交的08/486,857，1995年6月5日提交的08/486,859，1995年6月5日提交的08/462,513，1996年10月2日提交的08/724,752，1996年12月3日提交的08/759,620，2001年11月30日提交的美国公开案2003/0093820和美国专利6,162,963、6,150,584、6,114,598、6,075,181和5,939,598以及日本专利3 068180 B2、3 068 506 B2和3 068 507 B2。也参见1996年6月12日授权公开的欧洲专利EP 0 463 151 B1，1994年2月3日公开的国际专利申请案WO9402602，1996年10月31日公开的国际专利申请案WO9634096，1998年6月11日公开的WO9824893，2000年12月21日公开的WO0076310。上述专利、申请和参考文献各自的公开内容以其全文通过引用合并入本文。

在备选方法中，其他公司，包括GenPharm International，Inc.，已使用“微小基因座（minilocus）”方法。在微小基因座方法中，通过包含来自Ig基因座的片段（单独的基因）来模拟外源Ig基因座。因此，将一个或多个VH基因、一个或多个DH基因、一个或多个JH基因、μ恒定区和通常第二恒定区（优选γ恒定区）组成为用于插入动物的构建体。该方法描述于属于Surani等人的美国专利5,545,807和各自属于Lonberg和Kay的美国专利5,545,806、5,625,825、5,625,126、5,633,425、5,661,016、5,770,429、5,789,650、5,814,318、5,877,397、5,874,299和6,255,458，属于Krimpenfort和Berns的美国专利5,591,669和6,023,010，属于Berns等人的美国专利5,612,205、5,721,367和5,789,215，和属于Choi和Dunn的美国专利5,643,763，和1990年8月29日提交的GenPharm国际美国专利申请系列07/574,748，1990年8月31日提交的07/575,962，1991年12月17日提交的07/810,279，1992年3月18日提交的07/853,408，1992年6月23日提交的07/904,068，1992年12月16日提交的07/990,860，1993年4月26日提交的08/053,131，1993年7月22日提交的08/096,762，1993年11月18日提交的08/155,301，1993年12月3日提交的08/161,739，1993年12月10日提交的08/165,699，1994年3月9日提交的08/209,741，其公开内容通过引用合并入本文。也参见，欧洲专利0 546 073 B1、国际专利申请WO9203918、WO9222645、WO9222647、WO9222670、WO9312227、WO9400569、WO9425585、WO9614436、WO9713852和WO9824884以及美国专利5,981,175、其公开内容以其全文通过引用合并入本文。

Kirin也已证明可从其中已通过微细胞(microcell)融合导入了染色体的大片段或完整染色体的小鼠产生人抗体。参见，欧洲专利申请773288和843961，其公开内容通过引用合并入本文。此外，已产生作为Kirin's Tc小鼠与Medarex's minilocus(Humab)小鼠的杂交育种的结果的KMTM小鼠。此类小鼠具有Kirin小鼠的人IgH转染色体和Genpharm小鼠的κ链转基因(Ishida等人，Cloning Stem Cells4:91-102，2002)。

人抗体还可通过体外方法产生。合适的实例包括但不限于噬菌体展示(CAT，Morphosys，Dyax，Biosite/Medarex，Xoma，Symphogen，Alexion(以前为Proliferon)，Affimed)、核糖体展示(CAT)、酵母展示等。

对于治疗目的，可用治疗效应物基团例如放射性基团或细胞毒性基团（cytotoxic group）缀合抗体。

对于诊断目的，可标记抗体。合适的标记包括放射性标记、荧光标记或酶标记。

根据本发明使用的另外的抗体是所谓的异种抗体（xenogenicantibody）。用于在小鼠中产生异种抗体例如人抗体的一般原理描述于例如WO9110741、WO 9402602、WO 9634096和WO 9633735中。

如上所论述的，除了完整抗体外，本发明的抗体还可以以多种形式存在，包括例如Fv、Fab'和F(ab')₂以及以单链形式存在；参见例如W08809344。

需要时，可在重链和/或轻链的可变结构域中突变本发明的抗体以改变抗体的结合性质。例如，可在一个或多个CDR区中产生突变以增加或减少抗体对于AXL的Kd或改变抗体的结合特异性。定点诱变技术在本领域内是熟知的。参见，例如，Sambrook等人和Ausubel等人，同上。此外，可在AXL抗体的可变区中对已知将发生改变（与种系相比）的氨基酸残基进行突变。在另一个方面，可将突变导入一个或多个构架区。可在构架区或恒定结构域中产生突变以增加AXL抗体的半衰期。参见，例如，WO0009560。还可在构架区或恒定结构域中进行突变以改变抗体的免疫原性，以提供用于与另一个分子共价或非共价结合的位点，或以改变性质如补体结合（complement fixation）。可在单个突变抗体的每一个构架区、恒定结构域和可变区中产生突变。备选地，可以只在单个突变抗体的构架区、可变区或恒定结构域中的一个区域中产生突变。

在另外的方面，抗体可具有拥有效应子功能的恒定结构域，由此已在细胞表面上结合抗体、其抗体片段或衍生物的表达AXL的细胞可被免疫系统功能攻击。例如，抗体可能能够结合补体和参与补体依赖性细胞毒性(CDC)。此外，抗体可能能够结合效应子细胞例如单核细胞和天然杀伤（NK）细胞上的Fc受体，并参与抗体依赖性细胞毒性(ADCC)。

在另一个方面，本发明的抗体可用于治疗性治疗，优选用于治疗过度增殖性疾病、心血管疾病，特别地动脉粥样硬化和血栓形成、糖尿病相关疾病，特别地肾小球肥大或糖尿病性肾病，和特别地与AXL表达、过表达或极度活跃相关、与其相伴或由其引起的病症。过度增殖性疾病优选选自与AXL表达、过表达或极度活跃相关、与其相伴或由其引起的病症，例如癌症，例如乳腺癌、结肠癌、肺癌、肾癌、滤泡性淋巴瘤、髓性白血病、皮肤癌/黑色素瘤、胶质母细胞瘤、卵巢癌、前列腺癌、胰腺癌、巴雷特食管（Barrett's esophagus）和食管癌、胃癌、膀胱癌、宫颈癌、肝癌、甲状腺癌和头颈癌，或增生性和赘生性疾病或其他表达或过表达AXL的过度增殖性疾病。

在另一个方面，本发明的抗体可用于与抗肿瘤剂共施用以治疗上述病症之一。

如本文中使用的，共施用包括将本发明的抗体与抗肿瘤剂，优选诱导细胞凋亡的抗肿瘤剂一起施用。术语共施用还包括以单一组合物的形式或以两个或更多个不同组合物的形式施用本发明的抗体和抗肿瘤剂，优选诱导细胞凋亡的抗肿瘤剂。共施用包括同时（即，在相同的时间）或相继（即，以一定的间隔）施用本发明的抗体与抗肿瘤剂，优选诱导细胞凋亡的抗肿瘤剂。

本发明还涉及编码本发明的抗体、抗体片段或其衍生物的核酸分子。编码上述抗体、抗体片段或其衍生物的本发明的核酸分子可以是例如DNA、cDNA、RNA或合成产生的DNA或RNA或重组产生的嵌合核酸分子（其单独地或组合地包含任何此类核酸分子）。核酸分子还可以是相应于完整基因或其大部分或相应于其片段和衍生物的基因组DNA。核苷酸序列可以相应于天然发生的核苷酸序列或可包含单个或多个核苷酸置换、缺失或添加。在本发明的特别优选的实施方案中，核酸分子是cDNA分子。

优选，本发明涉及分离的核酸分子，其选自:

(a)编码SEQ ID NOs:7-12，13-30，37-42，43-46的多肽的核酸序列

(b)SEQ ID NOs:1-6，31-36中显示的核酸序列

(c)与(a)或(b)中的任一序列互补的核酸;和

(d)在严格条件下能够与(a)、(b)或(c)杂交的核酸序列。

术语“在严格条件下杂交”意指两个核酸片段在如例如Sambrook等人，"Expression of cloned genes in E.coli"in MolecularCloning:A laboratory manual(1989)，Cold Spring HarborLaboratory Press，New York，USA中描述的标准杂交条件下彼此杂交。此类条件例如在大约45℃下于6.0xSSC中杂交，然后在50℃下使用2.0xSSC，优选在65℃下使用2.0xSSC，或在50℃下使用0.2xSSC，优选在65℃下使用0.2xSSC进行清洗步骤。

本发明还涉及包含本发明的核酸分子的载体。所述载体可以是例如，噬菌体、质粒、病毒或逆转录病毒载体。逆转录病毒载体可以是有复制能力或复制缺陷型载体。在后一种情况下，病毒繁殖通常只在互补宿主细胞（complementing host cell）中发生。

可将本发明的核酸分子与包含选择标记的载体连接以在宿主中进行扩增。通常，以沉淀例如磷酸钙沉淀或氯化铷沉淀的形式，或以与带电荷的脂质的复合物的形式或以碳基簇（carbon-based cluster）例如富勒烯（fulleren）的形式导入质粒载体。如果载体是病毒，那么其在应用于宿主细胞之前可使用合适的包装细胞系进行体外包装。

优选，本发明的载体是其中核酸分子有效地连接至一个或多个控制序列（从而允许在原核和/或真核宿主细胞中转录和任选地表达）的表达载体。所述核酸分子的表达包括核酸分子的转录（优选至可翻译的mRNA）。确保在真核细胞，优选哺乳动物细胞中表达的调控元件对于本领域技术人员来说是熟知的。它们通常包括确保转录的起始的调控序列和任选地确保转录终止和转录物稳定的poly-A信号。另外的调控元件可包括转录和翻译增强子。允许在原核宿主细胞中表达的可能的调控元件包括大肠杆菌（E.coli）中的lac、trp或tac启动子，允许在真核宿主细胞中表达的调控元件的实例是酵母中的AOXI或GAL1启动子或哺乳动物和其他动物细胞中的CMV启动子、SV40启动子、RSV(劳斯肉瘤病毒)启动子、CMV增强子、SV40增强子或珠蛋白内含子。除了负责转录起始的元件以外，此类调控元件还可包括多核苷酸下游的转录终止信号例如SV40-poly-A位点或tk-poly-A位点。在本说明书中，合适的表达载体在本领域内是已知的，例如Okayama-Berg cDNA表达载体pcDV1(Pharmacia)、pCDM8、pRc/CMV、pcDNA1、pcDNA3(Invitrogen)或pSPORTI(GIBCO BRL)。优选，所述载体是表达载体和/或基因转移或靶向性载体。源自病毒例如逆转录病毒、痘苗病毒、腺伴随病毒、疱疹病毒或牛乳头瘤病毒的表达载体可用于将本发明的多核苷酸或载体递送入靶向的细胞群体。本领域技术人员熟知的方法可用于构建重组病毒载体；参见，例如，Sambrook，Molecular CloningA Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory(2001，第3版)N.Y.和Ausubel，Current Protocols in Molecular Biology，Green Publishing Associates and Wiley Interscience，N.Y.(1994)中描述的技术。备选地，可将本发明的核酸分子重构入脂质体以递送至靶细胞。

本发明还涉及包含本发明的载体的宿主。所述宿主可以是原核或真核细胞或非人转基因动物。可将存在于宿主中的本发明的多核苷酸或载体整合入宿主的基因组或其可以保持在染色体外。在该方面，还应理解，本发明的核酸分子可用于“基因打靶”和/或“基因替代”，以恢复突变基因或通过同源重组产生突变基因；参见例如Mouellic，Proc.Nat!.Acad.Sci.USA，87(1990)，4712-4716;Joyner，GeneTargeting，A Practical Approach，Oxford University Press。

宿主可以是任何原核或真核细胞，例如细菌细胞、昆虫细胞、真菌细胞、植物细胞、动物细胞、哺乳动物细胞或优选，人细胞。优选的真菌细胞是例如酵母菌属（Saccharomyces）的真菌细胞，特别地酿酒酵母（S.cerevisiae）的真菌细胞。术语“原核的”意欲包括可用多核苷酸转化或转染以表达本发明的变异多肽的所有细菌。原核宿主可包括革兰氏阴性以及革兰氏阳性细菌，例如大肠杆菌、鼠伤寒沙门氏菌（S.typhimurium）、粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)和枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）。可使用本领域技术人员公知的任何技术将编码本发明的变异多肽的突变形式的多核苷酸用于转化或转染宿主。用于制备融合的，有效连接的基因和在细菌或动物细胞中表达它们的方法在本领域内是熟知的(Sambrook，Molecular Cloning ALaboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory(2001，第3版)。本文中描述的基因构建体和方法可用于在例如原核宿主中表达本发明的变异抗体、其抗体片段或衍生物。通常，结合宿主，使用包含促进插入的核酸分子的有效转录的启动子序列的表达载体。表达载体通常包含复制起点、启动子和终止子以及能够提供转化的细胞的表型选择的特定基因。可按照本领域内已知的技术在发酵罐中生长和培养转化的原核宿主以获得最佳的细胞生长。然后可从生长培养基、细胞裂解物或细胞膜级分分离本发明的抗体、抗体片段或其衍生物。可通过任何常规方法例如制备型色谱分离和免疫分离例如包括单克隆或多克隆抗体的使用的那些来分离和纯化微生物或其他生物表达的本发明的抗体、抗体片段或其衍生物。

在本发明的优选实施方案中，宿主是细菌、真菌、植物、两栖动物或动物细胞。优选的动物细胞包括但不限于中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、幼仓鼠肾(BHK)细胞、猴肾细胞(COS)、3T3细胞、NSO细胞和许多其他细胞系包括人细胞，例如Per.C6。在另一个优选实施方案中，所述动物细胞是昆虫细胞。优选的昆虫细胞包括但不限于SF9细胞系细胞。

在本发明的更优选实施方案中，所述宿主是人细胞或人细胞系。所述人细胞包括但不限于人胚肾细胞(HEK293、293T、293freestyle)。此外，所述人细胞系包括但不限于HeLa细胞、人肝细胞癌细胞(例如，Hep G2)、A549细胞。

本发明还提供了转基因非人动物，其包含一个或多个可用于产生本发明的抗体的本发明的核酸分子。可在山羊、牛、马、猪、大鼠、小鼠、兔子、仓鼠或其他哺乳动物的组织或体液例如奶、血液或尿中产生和回收抗体。参见，例如，美国专利5,827,690;5,756,687;5,750,172;和5,741,957。如上所述，可通过用AXL或其部分进行免疫来产生包含人免疫球蛋白基因座的非人转基因动物。

本发明还涉及用于制备抗体的方法，其包括在允许所述抗体合成的条件下培养本发明的宿主和从所述培养物回收所述抗体。

可按照本领域内已知的技术在发酵罐中生长和培养转化的宿主以获得最佳细胞生长。在表达后，可按照本领域内的标准方法包括硫酸铵沉淀、亲和柱、柱层析、凝胶电泳等纯化本发明的完整抗体、它们的二聚体、单独的轻链和重链或其他免疫球蛋白形式；参见，Scopes，"Protein Purification"，Springer-Verlag，N.Y.(1982)。然后可从生长培养基、细胞裂解物或细胞膜级分分离本发明的抗体或其相应的免疫球蛋白链。可以通过任何常规方法例如制备型色谱分离和免疫分离，例如包括抗例如本发明的抗体的恒定区的单克隆或多克隆抗体的使用的那些分离和纯化例如微生物表达的本发明的抗体或免疫球蛋白链。

对于本领域技术人员来说很显然的是，还可将本发明的抗体偶联至其他部分以进行例如药物靶向和成像应用。可在抗体或抗原表达后通过化学方法进行至附着位点的偶联，或在DNA水平上将偶联产物工程改造至本发明的抗体或抗原中。然后在合适的宿主系统中表达DNA，以及，需要时收集和使表达的蛋白质复性。

在本发明的优选实施方案中，将抗体偶联至效应物例如放射性同位素或毒性化疗剂。优选，此类抗体缀合物用于靶向表达AXL的细胞，例如癌细胞，以消除其。本发明的抗体/抗体片段与放射性同位素的连接例如为肿瘤的治疗提供了有利方面。与化学疗法和其他形式的癌症疗法不同，放射免疫疗法或放射性同位素-抗体组合的施用直接靶向癌细胞而对周围的正常、健康组织的损害最小。优选的放射性同位素包括例如³H、¹⁴C、¹⁵N、³⁵S、⁹⁰Y、⁹⁹Tc、¹¹¹In、¹²⁵I、¹³¹I。

此外，当用毒性化疗药物例如格尔德霉素(Mandler等人，J.Natl.Cancer Inst.，92(19)，1549-51(2000))和美登素例如美坦生类(maytansinoid)药物DM1(Liu等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.93:8618-8623(1996)和auristatin-E或monomethylauristatin-E(Doronina等人，Nat.Biotechnol.21:778-784(2003)或卡奇霉素（calicheamicit）)缀合时，本发明的抗体可用于治疗癌症；将在酸性或还原条件下或当暴露于特定的蛋白酶时释放药物的不同连接体用于该技术。可如本领域中所述缀合本发明的抗体。

本发明还涉及包含本发明的抗体、核酸分子、载体、宿主或通过本发明的方法获得的抗体的药物组合物。

术语“组合物”，如本文中所使用的，包含至少一种本发明的化合物。优选，这样的组合物是药物组合物或诊断组合物。

优选，所述药物组合物包含可药用载体和/或稀释剂。本文中公开的药物组合物可部分地用于治疗与AXL表达、过表达或过度活跃相关、与其相伴或由其引起的病症，例如过度增殖性疾病、心血管疾病，特别地动脉粥样硬化和血栓形成、糖尿病相关疾病，特别地肾小球肥大或糖尿病性肾病。所述病症包括但不限于癌症例如乳腺癌、结肠癌、肺癌、肾癌、滤泡性淋巴瘤、髓性白血病、皮肤癌/黑色素瘤、胶质母细胞瘤、卵巢癌、前列腺癌、胰腺癌、巴雷特食管和食管癌、胃癌、膀胱癌、宫颈癌、肝癌、甲状腺癌和头颈癌、或其他增生性疾病或赘生性疾病或其他AXL表达或过表达的疾病。

术语“极度活跃”在本文中是指可由负调控的缺乏和/或功能障碍引起的不受控制的AXL信号转导。例如，负调控包括蛋白质的去磷酸化、降解和/或内吞作用。此外，不受控制的AXL信号转导可以是遗传改变（体细胞或种系）的结果，所述遗传改变导致AXL氨基酸序列的变化。

合适的药物载体、赋形剂和/或稀释剂的实例在本领域内是熟知的，包括磷酸缓冲盐溶液、水、乳剂例如油/水乳剂、各种类型的湿润剂、无菌溶液等。包含此类载体的组合物可通过熟知的常规方法来配制。可以以合适的剂量给受试者施用此类药物组合物。可通过不同的方法，例如通过静脉内、腹膜内、皮下、肌内、局部、皮内、鼻内或支气管内施用进行合适的组合物的施用。还可将本发明的组合物直接施用至靶部位，例如通过基因枪（biolistic）递送至外部或内部靶部位如脑。给药方案将由主治医生和临床因素决定。如在医疗领域内是熟知的，用于任何一个患者的剂量取决于许多因素，包括患者的尺寸大小、身体表面积、年龄、待施用的特定化合物、性别、施用的时间和途径、总体健康状况和其他同时施用的药物。蛋白质性质的药物活性物质可以以1μg至100mg/kg体重/剂的量存在；然而，预期使用低于或高于该示例性范围的剂量，特别地在考虑到上述因素的情况下。如果方案是连续输注，其还应当在1pg至100mg/千克体重/分钟的范围内。

可通过定期评估来监控进展。可局部或全身性施用本发明的组合物。用于胃肠外施用的制剂包括无菌水性或非水性溶液、悬浮液和乳剂。非水性溶剂的实例是丙二醇、聚乙二醇、植物油例如橄榄油和可注射有机酯例如油酸乙酯。水性载体包括水、醇/水性溶液、乳剂或悬浮液，包括盐水和缓冲的介质。胃肠外媒介物包括氯化钠溶液、林格氏葡萄糖（Ringer's dextrose）、葡萄糖和氯化钠、乳酸林格氏或不挥发油。静脉内媒介物包括液体和营养补充剂、电解质补充剂(例如基于林格氏葡萄糖的那些)等。还可存在防腐剂和其他添加剂例如，抗微生物剂、抗氧化剂、螯合剂和惰性气体等。此外，取决于药物组合物的期望的用途，本发明的药物组合物还可包含另外的试剂。特别优选，药物组合物包含另外的活性剂如例如另外的抗肿瘤剂、小分子抑制剂、抗肿瘤试剂或化疗剂。

本发明还涉及包含抗AXL抗体的药物组合物，其优选是与至少一种另外的抗肿瘤剂组合的本发明的抗体。所述组合在例如抑制异常细胞生长中是有效的。

许多抗肿瘤剂目前在本领域内中是已知的。一般地，该术语包括能够预防、减轻和/或治疗过度增殖性病症的所有试剂。在一个实施方案中，抗肿瘤剂选自治疗性蛋白，包括但不限于抗体或免疫调节蛋白。在另一个实施方案中，抗肿瘤剂选自小分子抑制剂或化疗剂，其由有丝分裂抑制剂、激酶抑制剂、烷基化试剂、抗代谢药、嵌入抗生素（intercalating antibiotics）、生长因子抑制剂、细胞周期抑制剂、酶、拓扑异构酶抑制剂、组蛋白脱乙酰基酶抑制剂、抗存活剂（anti-survival agent）、生物学应答调节剂、抗激素例如抗雄激素和抗血管生成剂组成。

可与本文中提供的抗体组合使用的抗肿瘤剂的特定实例包括例如吉非替尼、拉帕替尼、舒尼替尼、培美曲塞、贝伐珠单抗、西妥昔单抗、伊马替尼、曲妥珠单抗、阿仑珠单抗、利妥昔单抗、厄洛替尼、硼替佐米等。用于本文中描述的和要求保护的组合物的其他特定抗肿瘤剂包括例如化疗剂例如卡培他滨、柔红霉素、道诺霉素、放线菌素D、多柔比星、表柔比星、伊达比星、依索比星、博来霉素、马磷酰胺、异环磷酰胺、阿糖胞苷、双氯乙基亚硝脲、白消安、丝裂霉素C、放线菌素D、普卡霉素、泼尼松、羟孕酮、睾酮、他莫昔芬、达卡巴嗪、丙卡巴肼、六甲蜜胺、五甲蜜胺、米托蒽醌、安吖啶、苯丁酸氮芥、甲基环己基亚硝基脲、氮芥、美法仑、环磷酰胺、6-巯嘌呤、6-硫鸟嘌呤、阿糖胞苷(CA)、5-氮杂胞苷、羟基脲、脱氧助间型霉素、4-羟基过氧环磷酰胺、5-氟尿嘧啶(5-FU)、5-氟脱氧尿苷(5-FUdR)、甲氨喋呤(MTX)、秋水仙碱、泰素（taxol）、长春新碱、长春碱、依托泊苷、三甲曲沙、替尼泊苷、顺铂和己烯雌酚(DES)。通常参见，The MerckManual of Diagnosis and Therapy，第15版1987，pp.1206-1228，Berkow等人，eds.，Rahway，N.J。特别优选的是诱导细胞凋亡的此类抗肿瘤剂。

当与所述AXL抗体一起使用时，此类抗肿瘤剂可单独地(例如，5-FU和抗体)、相继地(例如，5-FU和抗体进行一段时间，然后施用MTX和抗体)或与一种或多种其他此类抗肿瘤剂组合（例如，5-FU、MTX和抗体，或5-FU、放射疗法和抗体)使用。

术语抗肿瘤剂还可包括治疗方法，例如辐射或放射疗法。

本发明的药物组合物可用于人医疗，还可用于兽医目的。

此外，本发明涉及本发明的抗体、本发明的核酸分子、载体、宿主或通过本发明的方法获得的抗体用于制备药物组合物的用途，所述药物组合物用于诊断、预防或治疗过度增殖性疾病、心血管疾病，特别地动脉粥样硬化和血栓形成、糖尿病相关疾病，特别地肾小球肥大或糖尿病性肾病，和特别地与AXL表达、过表达或极度活跃相关、与其相伴或由其引起的病症。

上述过度增殖性疾病包括任何瘤形成，即任何异常和/或不受控制的新的组织生长。术语“不受控制的新的组织生长”，如本文中所使用的，可依赖于生长调控的功能障碍和/或丧失。过度增殖性疾病包括肿瘤疾病和/或癌症，例如转移或侵袭性癌症。

在本发明的用途的优选实施方案中，所述过度增殖性疾病特别地是乳腺癌、结肠癌、肺癌、肾癌、滤泡性淋巴瘤、髓性白血病、皮肤癌/黑色素瘤、胶质母细胞瘤、卵巢癌、前列腺癌、胰腺癌、巴雷特食管和食管癌、胃癌、膀胱癌、宫颈癌、肝癌、甲状腺癌和头颈癌、或增生性或赘生性疾病或其他表达或过表达AXL的过度增殖性疾病。

在另一个实施方案中，本发明涉及抗AXL抗体(优选本发明的抗体)用于制备药物的用途，所述药物用于与治疗上述病症之一的抗肿瘤剂共施用。

根据另外的优选实施方案，本发明涉及抗AXL抗体用于制造用于治疗抗药性癌症的药物组合物的用途。在特别优选的实施方案中，抗AXL抗体是权利要求1至22中所定义的单克隆抗体。

本发明还涉及包含本发明的抗体、本发明的核酸分子、载体、宿主或通过本发明的方法获得的抗体和任选地可药用的载体的诊断组合物。

本发明的诊断组合物可用于检测不同细胞、组织或另一个合适的样品中哺乳动物AXL的不期望的表达、过表达或过度活跃，包括将样品与本发明的抗体接触，和检测AXL在样品中的存在。因此，本发明的诊断组合物可用于评估过度增殖性疾病的起始或疾病状态。

此外，可用本发明的抗体靶向恶性细胞例如表达AXL的癌细胞。因此已结合本发明的抗体的细胞可能受到免疫系统功能例如补体系统或受到细胞介导的细胞毒性的攻击，从而减少癌细胞的数目或根除癌细胞。这些考虑同样地用于治疗转移和再发性肿瘤。

在本发明的另一个方面，将本发明的抗体偶联至标记基团。此类抗体特别适合于诊断应用。如本文中所使用的，术语“标记基团”是指可检测的标志物，例如放射性标记的氨基酸或可通过标记的抗生物素蛋白检测的生物素基部分。用于标记多肽或糖蛋白例如抗体的各种方法在本领域内是已知的并且可用于进行本发明。合适的标记基团的实例包括但不限于下列：放射性同位素或放射性核素(例如³H、¹⁴C、¹⁵N、³⁵S、⁹⁰Y、⁹⁹Tc、¹¹¹In、¹²⁵I、¹³¹I)、荧光基团(例如FITC、罗丹明、镧系元素（lanthanide）、磷光体（phosphor）)、酶基团(例如辣根过氧化物酶、β-半乳糖苷酶、萤光素酶、碱性磷酸酶)、化学发光基团、生物素基团或预先确定的被第二报告分子识别的多肽表位（例如亮氨酸拉链对序列、二抗的结合部位、金属结合结构域、表位标签)。

在某些方面，可能期望通过不同长度的间隔臂连接标记基团以减少潜在的位阻。

在另一个实施方案中，本发明涉及评估表达AXL的细胞的存在的方法，包括将本发明的抗体与怀疑在它们/它的表面具有AXL的细胞或组织接触。用于检测样品中的AXL表达的合适方法可以是酶联免疫吸附测定(ELISA)或免疫组织化学(IHC)。

可在微量滴定板版式中进行ELISA测定，其中例如微量滴定板的孔吸附有AXL抗体。漂洗板，并且用封闭剂例如乳蛋白或白蛋白进行处理以阻止分析物的非特异性吸附。然后用测试样品处理孔。在漂洗掉测试样品或标准后，用标记的第二AXL抗体（例如通过生物素缀合）处理孔。在清洗掉过量第二抗体后，用例如抗生物素蛋白缀合的辣根过氧化物酶(HRP)和合适的生色底物检测标记。通过与由标准样品产生的标准曲线比较来测定测试样品中AXL抗原的浓度。

关于IHC，可使用石蜡包埋的组织，其中例如将组织首先在二甲苯中脱蜡，然后例如用乙醇脱水，和在蒸馏水中漂洗。可通过表位暴露（epitope unmasking）、酶促降解或皂苷来暴露被甲醛固定和石蜡包埋掩蔽的抗原表位。关于表位暴露，可在蒸气发生器、水浴或微波炉中于表位修复液(epitope retrieval solution)例如2N HCl溶液(pH1.0)中加热石蜡切片，进行20至40分钟。在酶促降解的情况下，可将组织切片在不同的酶溶液例如蛋白酶K、胰蛋白酶、链霉蛋白酶、胃蛋白酶等中于37℃下温育10至30分钟。

在漂洗掉表位修复液或过量的酶后，用封闭缓冲液处理组织切片以防止非特异性相互作用。以合适的浓度加入第一AXL抗体。漂洗掉过量的一抗，将切片在室温下于过氧化物酶封闭液中温育10分钟。在进行另一个清洗步骤后，将组织切片与第二标记抗体（例如用可用作酶的锚的基团标记）一起温育。因此，实例是被偶联至辣根过氧化物酶的链霉抗生物素蛋白识别的生物素标记的二抗。通过与合适的生色底物一起温育进行抗体/酶复合物的检测。

在另外的实施方案中，本发明涉及阻断AXL功能的方法，其包括将本发明的抗体与怀疑在它们/其表面上具有AXL的细胞或组织在其中抗体能够阻断AXL功能的条件下接触。接触可以是体外或体内的。

本发明还涉及治疗过度增殖性疾病、心血管疾病，特别地动脉粥样硬化和血栓形成、糖尿病相关疾病，特别地肾小球肥大或糖尿病性肾病的方法，其包括给有此需要的患者施用合适剂量的本发明的抗体或抗体片段或其衍生物。过度增殖性疾病优选选自与AXL表达、过表达或过度活跃相关、与其相伴或由其引起的病症，例如癌症，例如乳腺癌、结肠癌、肺癌、肾癌、滤泡性淋巴瘤、髓性白血病、皮肤癌/黑色素瘤、胶质母细胞瘤、卵巢癌、前列腺癌、胰腺癌、巴雷特食管和食管癌、胃癌、膀胱癌、宫颈癌、肝癌、甲状腺癌和头颈癌或增生性疾病或赘生性疾病或其他表达或过表达AXL的过度增殖性疾病。

根据本发发明的另一个优选实施方案，待治疗的癌症是抗药性癌症。

本发明还涉及治疗疾病的方法，其中给哺乳动物施用本发明的抗体并且其中所述疾病与AXL的异常水平的表达或活性直接或间接相关。

最后，本发明涉及包括抗AXL抗体，优选本发明的抗体、抗体片段或其衍生物、编码所述组分的核酸分子和/或本发明的载体的试剂盒。

包括本文中公开的化合物的所有实施方案可用作单个化合物或组合地用于药物的制备。

附图概述

图1.Ratl-模拟和Ratl-AXL cl.2成纤维细胞中细胞表面AXL的流式细胞术分析。收集通过分别用pLXSN和pLXSN-hAXL亲嗜性病毒（ecotrophic virus）感染Ratl成纤维细胞产生的多克隆Ratl-模拟和克隆性Ratl-AXL cl.2细胞，并用3μg/ml的小鼠对照抗体72A1(左图)或小鼠抗AXL MAB154一抗(右图)以及PE-缀合的抗小鼠二抗染色。关于详细内容参见正文。Ratl-AXL cl.2细胞的染色导致3个数量级的偏移，并证明AXL在这些细胞的表面上过表达。

图2.NIH3T3-模拟和NIH3T3-AXL cl.7成纤维细胞中细胞表面AXL的流式细胞术分析。收集通过分别用pLXSN和pLXSN-AXL亲嗜性病毒感染NIH3T3成纤维细胞产生的多克隆NIH3T3-模拟和克隆性NIH3T3-AXL cl.7细胞，并用3μg/ml的小鼠对照抗体72A1(左图)或小鼠抗AXL MAB154一抗(右图)以及PE-缀合的抗小鼠二抗染色。关于详细内容参见正文。NIH3T3-AXL cl.7细胞的染色导致2个数量级的偏移，并证明AXL在这些细胞的表面上过表达。

图3.大鼠抗AXL抗体与小鼠和食蟹猴AXL以及人Mer和Sky的交叉反应性的流式细胞术分析。用pcDNA3、pcDNA3-hAXL、pcDNA3mAXL、pcDNA3-cyAXL、pcDNA3-hMer或pcDNA3-hSky瞬时转染HEK293T成纤维细胞。收集细胞，然后用10μg/ml抗AXL1D5、11D5、11B7、10D12、6E7、2A1、11D7或12B7一抗和/或PE缀合的驴抗大鼠二抗或PE缀合的驴抗小鼠二抗（只用于对照）染色。关于详细内容参见正文。除了显示与小鼠AXL以及人Mer和Sky的中度交叉反应性的12B7外，无抗AXL抗体与这些分子交叉反应。相反地，所有测试的抗AXL抗体与食蟹猴AXL交叉反应。

图4.研究大鼠抗AXL抗体对AXL受体磷酸化的作用的ELISA实验。饥饿NIH3T3-AXL cl.7成纤维细胞(A)和NCI-H292肺癌细胞(B)，用10μg/ml的小鼠对照抗体72A1以及大鼠抗AXL抗体2A1、11D7、11D5、11B7、6E7或10D12进行预温育，用或不用400ng/ml mGas6进行处理，然后进行裂解。将裂解物转移至抗磷酸-酪氨酸抗体4G10包被的Maxi-Sorp 96孔板，然后清洗板，用0.5μg/ml生物素化的大鼠抗AXL抗体12B7、AP缀合的链霉抗生物素蛋白和AttoPhos底物溶液进行温育以收集荧光强度。关于详细内容参见正文。大鼠抗AXL抗体11B7、11D5、6E7和10D12能够阻断或减少配体介导的AXL激活（如通过减少的磷酸化显示的），因此被认为是拮抗型抗AXL抗体。相反地，大鼠抗AXL抗体2A1和11D7刺激基础AXL激活（如通过增加的磷酸化显示的），没有显著地减少配体介导的AXL激活，因此被认为是激动型抗AXL抗体。

图5.研究大鼠抗AXL抗体对p42/p44MAP激酶磷酸化的作用的ELISA实验。饥饿CaSki宫颈癌细胞，用10μg/ml的同种型对照抗体1D5以及大鼠抗AXL抗体11D5、11B7或2A1进行预温育，用或不用400ng/ml mGas6进行处理，然后用甲醛进行固定。清洗细胞，进行猝灭，然后用抗磷酸-p44/p42MAP激酶(Thr202/Tyr204)一抗、HRP缀合的抗兔二抗和四甲基联苯胺溶液进行温育以测量吸光度强度。关于详细内容参见正文。大鼠抗AXL抗体11B7和11D5能够减少配体介导的p42/p44 MAP激酶激活，如通过减少的磷酸化显示的，从而被认为是拮抗型抗AXL抗体。相反地，大鼠抗AXL抗体2A1刺激基础p42/p44MAP激酶激活（如通过增加的磷酸化显示的），不减少配体介导的p42/p44 MAP激酶激活，从而被认为是激动型抗AXL抗体。

图6.研究大鼠抗AXL抗体对Akt激酶磷酸化的作用的ELISA实验。饥饿NIH3T3-AXL cl.7成纤维细胞(A)和CaLu-1肺癌细胞(B)，用10μg/ml的同种型对照抗体1D5以及大鼠抗AXL抗体11D5、11B7或2A1进行预温育，用或不用400ng/ml mGas6处理，然后用甲醛进行固定。清洗细胞，进行猝灭，然后用抗磷酸-Akt(Ser473)一抗、HRP缀合的抗兔二抗和四甲基联苯胺溶液进行温育以测量吸光度强度。关于详细内容参见正文。大鼠抗AXL抗体11B7和11D5能够阻断或减少配体介导的Akt激酶激活，如通过减少的磷酸化显示的，从而被认为是拮抗型抗AXL抗体。相反地，大鼠抗AXL抗体2A1刺激基础Akt-激酶激活（如通过增加的磷酸化显示的），不减少配体介导的Akt激酶激活，从而被认为是激动型抗AXL抗体。

图7.比较大鼠和嵌合抗AXL抗体对Akt激酶磷酸化的作用的ELISA实验。饥饿NIH3T3-AXL cl.7成纤维细胞，用50ng/ml、100ng/ml、300ng/ml、500ng/ml和1μg/ml的大鼠抗AXL抗体11B7或嵌合抗AXL抗体ch11B7以及50ng/ml、100ng/ml、300ng/ml、500ng/ml、1μg/ml、5μg/ml和10μg/ml的大鼠抗AXL抗体11D5或嵌合抗AXL抗体ch11D5进行预温育，用或不用400ng/ml mGas6进行处理，然后用甲醛进行固定。清洗细胞，进行猝灭，用抗磷酸-Akt(Ser473)一抗、HRP缀合的抗兔二抗和四甲基联苯胺溶液进行温育以测量吸光度强度。关于详细内容参见正文。大鼠抗AXL抗体11B7和嵌合抗AXL抗体ch11B7以及大鼠抗AXL抗体11D5或嵌合抗AXL抗体ch11D5能够抑制配体介导的Akt激酶激活至相似的程度，如通过减少的磷酸化显示的。因此，与它们各自的大鼠对应物相比较，嵌合抗AXL抗体ch11B7和ch11D5保持活性。

图8.研究大鼠抗AXL抗体的结合特性的竞争ELISA实验。用1μg/ml人AXL-ECD包被96孔Maxi-Sorp板，然后用10μg/ml的未生物素化的同种型对照抗体1D5或大鼠抗AXL抗体11B7、11D5、6E7、10D12、11D7或2A1预温育该板。在用0.5μg/ml的生物素化的同种型对照抗体1D5或生物素化的大鼠抗AXL抗体11B7、11D5、6E7、10D12、11D7或2A1温育后，加入AP缀合的链霉抗生物素蛋白和AttoPhos底物溶液，收集荧光以测量结合的生物素化的抗体。关于详细内容参见正文。对照抗体1D5不结合AXL-ECD。拮抗型抗AXL抗体11B7、11D5、6E7和10D12彼此竞争相同的或结构上相邻的表位。激动型抗体11D7和2A1识别不同表位并且不与拮抗型抗体竞争对AXL-ECD的结合。

图9.研究大鼠和嵌合抗AXL抗体对细胞迁移和增殖的作用的伤口愈合/划痕测定。在生长至汇合后，饥饿NCI-H292肺癌细胞，用移液器吸头划伤细胞。在10μg/ml的同种型对照抗体1D5、拮抗型大鼠抗AXL抗体11D5、11B7、6E7或10D12、嵌合抗AXL抗体chn11D5 IgG2和chn11B7 IgG2、激动型大鼠抗AXL抗体2A1和11D7以及10μg/ml的Erbitux或5μM Sutent存在的情况下，允许细胞重新进入清除的区域。24小时后，固定细胞并且染色，拍摄伤口的照片。关于详细内容参见正文。与同种型对照抗体1D5相比较，拮抗型大鼠抗AXL抗体11D5、11B7、6E7和10D12以及嵌合抗AXL抗体chn11D5 IgG2和chn11B7IgG2减少重新进入清除区域，然而激动型大鼠抗AXL抗体2A1和11D7导致完全的伤口闭合。

图10.研究大鼠抗AXL抗体对定向细胞迁移的作用的Boyden小室/transwell测定。用10μg/ml的大鼠抗AXL抗体4A6、11B7或2A1预温育血清饥饿的NIH3T3-AXL cl.7成纤维细胞，将其涂板在胶原I包被的FluoreBlock插入物的顶部，然后暴露于更低的区室中的具有或不具有Gas6的无血清培养基。7小时后，用钙黄绿素-AM对迁移细胞进行染色，测量各孔的荧光。关于详细内容参见正文。拮抗型抗AXL抗体11B7减少了NIH3T3-AXL cl.7成纤维细胞的基础和Gas6诱导的迁移，然而激动型大鼠抗AXL抗体2A1增加了NIH3T3-AXL cl.7的配体诱导的迁移和特别地基础迁移。抗体4A6不影响定向细胞迁移。

图11.研究大鼠抗AXL抗体对Gas6诱导的细胞增殖的作用的AlamarBlue^TM测定。用20μg/ml的小鼠对照抗体72A1、大鼠拮抗型抗AXL抗体11D5和11B7以及激动型抗AXL抗体2A1预温育血清饥饿的NIH3T3-AXL cl.7成纤维细胞，然后在400ng/ml Gas6不存在或存在的情况下生长。4天后，向细胞中加入AlamarBlue^TM，然后测量吸光度。关于详细内容参见正文。拮抗型抗AXL抗体11D5和11B7抑制Gas6诱导的NIH3T3-AXL cl.7成纤维细胞的增殖，然而激动型大鼠抗AXL抗体2A1增加NIH3T3-AXL cl.7细胞的配体诱导的增殖和特别地基础增殖。

图12.研究大鼠抗AXL抗体对Gas6介导的抗细胞凋亡的作用的胱天蛋白酶-3/7测定。用10μg/ml的同种型对照抗体1D5、拮抗型大鼠抗AXL抗体11B7和11D5或激动型大鼠抗AXL抗体11D7和2A1预温育血清饥饿的NIH3T3-AXL cl.7成纤维细胞，然后用或不用Gas6进行处理。加入Apo-ONE底物溶液，收集荧光以测量胱天蛋白酶-3/7活性。关于详细内容参见正文。与同种型对照抗体相比较，拮抗型大鼠抗AXL抗体11B7和11D5减少血清饥饿的NIH3T3-AXL cl.7成纤维细胞的Gas6介导的抗细胞凋亡，从而诱导细胞凋亡。相反地，无论Gas6存在与否，激动型大鼠抗AXL抗体2A1和11D7都诱导血清饥饿的NIH3T3-AXL cl.7细胞的抗细胞凋亡，从而抑制细胞凋亡。

图13.研究大鼠抗AXL抗体对VEGF-A诱导的内皮细胞出芽的作用的基于球状体的（Spheroid-based）细胞血管生成测定。将HUVEC球状体包埋在3D胶原凝胶中，用25ng/ml VEGF-A进行刺激，然后用指定浓度的拮抗型大鼠抗AXL抗体11B7(A)和11D5(B)处理24小时。每数据点分析10个随机选择的球状体的累积出芽长度的平均值±SEM（左图），测定抗体的相对抑制作用（右图）。用GraphPad Prism 4.03进行IC₅₀曲线的拟合和IC₅₀值的计算。关于详细内容参见正文。拮抗型大鼠抗AXL抗体11B7和11D5在基于球状体的血管生成测定中以剂量依赖性的方式抑制VEGF-A刺激的HUVEC出芽。然而使用最高浓度的11B7的处理使HUVEC出芽减少至基础水平，使用最高浓度的11D5的抑制作用不如前者有效(左图)。HUVEC出芽被抑制，对于11B7和11D5，IC₅₀值分别为9.8x10^-8M和7.0x10^-7M（右图）。

图14.研究大鼠抗AXL抗体对裸小鼠中人前列腺癌生长的作用的同位异种移植模型。将PC-3-LN前列腺癌细胞同位植入NMRI^-nu/nu小鼠的前列腺。动物被随机分入4个组，并且接受25mg/kg的同种型对照抗体1D5或拮抗型大鼠抗AXL抗体11B7，以及40mg/kg Sutent或12.5mg/kg Taxotere。在处理过程中，通过体内生物发光成像在第15天、第23天、第29天和第34天每周一次监控同位生长的PC-3-LN肿瘤以及外周转移灶的生长。关于详细内容参见正文。与同种型对照抗体1D5相比较，拮抗型大鼠抗AXL抗体11B7减少了裸小鼠中PC-3-LN前列腺肿瘤的总体生长。

图15.研究大鼠抗AXL抗体对裸小鼠中人前列腺癌转移的作用的同位异种移植模型。将PC-3-LN前列腺癌细胞同位植入NMRI^-nu/nu小鼠的前列腺。动物被随机分入4个组，并且接受25mg/kg的同种型对照抗体1D5或拮抗型大鼠抗AXL抗体11B7，以及40mg/kg Sutent或12.5mg/kg Taxotere。尸体剖检后，收集选择的器官（肝、脾、肺、股骨和部分的腰椎)并且通过生物发光成像分析转移的存在。关于详细内容参见正文。与同种型对照抗体1D5相比较，本发明的拮抗型大鼠抗AXL抗体11B7减少了脾转移的发生。值得注意的是，该实验中11B7的抗转移作用比Sutent更强。

图16.不同人恶性肿瘤中AXL表达的免疫组织化学分析。通过免疫组织化学就AXL表达分析17个人实体瘤类型，所述肿瘤类型各自由成对的肿瘤组织和匹配的非恶性组织代表。关于详细内容参见正文。概述了结果(A)，其中1的强度是指在超过25%的观察的细胞中存在微弱染色。展示了乳房肿瘤和胃的印戒细胞癌中观察到的最强染色的实例(B)。

图17.比较大鼠和嵌合抗AXL抗体对Axl磷酸化的作用的ELISA实验。饥饿CaSki宫颈癌细胞，用50ng/ml、100ng/ml、300ng/ml、750ng/ml、1μg/ml和10μg/ml的大鼠抗AXL抗体11B7(A)或嵌合抗AXL抗体ch11B7(B)预温育细胞，用或不用400ng/ml mGas6处理细胞，然后进行裂解。将裂解物转移至抗磷酸-酪氨酸抗体4G10包被的Maxi-Sorp 96孔板。之后，清洗板，用0.5μg/ml生物素化的大鼠抗AXL抗体12B7、AP缀合的链霉抗生物素蛋白和AttoPhos底物溶液进行温育以收集荧光强度。关于详细内容参见正文。如通过宫颈癌细胞系CaSki中相对Axl磷酸化的浓度依赖性减少所显示的，本发明的大鼠抗Axl抗体11B7(A)和嵌合抗Axl抗体ch11B7(B)能够阻止配体介导的受体酪氨酸激酶Axl的激活至相似的程度。

图18.比较大鼠和嵌合抗Axl抗体对Axl磷酸化的作用的ELISA实验。饥饿CaSki宫颈癌细胞，用50ng/ml、100ng/ml、300ng/ml、750ng/ml、1μg/ml和10μg/ml大鼠抗AXL抗体11B7(A)或嵌合抗Axl抗体ch11B7(B)进行预温育，用或不用400ng/ml mGas6进行处理，然后用甲醛进行固定。清洗细胞，进行猝灭，并用抗磷酸-p44/p42MAP激酶(Thr202/Tyr204)一抗、HRP缀合的抗兔二抗和四甲基联苯胺溶液进行温育以测量吸光度强度。关于详细内容参见正文。本发明的大鼠抗Axl抗体11B7(A)和嵌合抗Axl抗体ch11B7(B)能够在宫颈癌细胞中阻止Gas6诱导的p42/p44MAP激酶的激活至相似的程度，如通过相对p42/p44MAP激酶磷酸化的浓度依赖性减少所显示的。

图19.研究大鼠抗AXL抗体和化疗剂克服人卵巢癌细胞中的抗药性的组合作用的TUNEL染色。用10μg/ml的对照抗体或拮抗型抗Axl抗体11B7预温育人NCI/ADR-RES卵巢癌细胞，然后将其与终浓度为100μM、150μM或200μM的多柔比星共温育。通过使用可商购获得的试剂盒，进行TUNEL染色以显现和测定细胞凋亡。关于详细内容参见正文。对于用100μM多柔比星处理的NCI/ADR-RES卵巢癌细胞，无论将细胞与对照抗体还是与拮抗型抗Axl抗体11B7共温育，都没有观察到TUNEL染色，从而没有观察到细胞凋亡(上图)。然而，在150μM多柔比星的浓度上，在用对照抗体共处理的细胞中只检测到非常微弱的细胞凋亡，而与拮抗型抗Axl抗体11B7的共温育导致细胞凋亡的显著诱导（中图）。同样在200μM多柔比星存在的情况下，与和对照IgG抗体一起温育的细胞相比较，细胞与11B7的共温育显著增加了细胞凋亡比率（下图），这表明甚至多抗药性肿瘤细胞与化疗剂和本发明的拮抗型抗Axl抗体的共处理可适用于克服抗药性。

图20.研究大鼠抗AXL抗体和化疗剂对人黑色素瘤细胞的不依赖于锚定的生长的组合作用的软琼脂测定。人C-8161黑色素瘤细胞保持未处理或用大鼠拮抗型抗AXL抗体11B7以2.5μg/ml的终浓度进行处理。通过与指定浓度的顺铂组合，让琼脂包埋的细胞在0.7%的底部琼脂层的顶部生长，进行5天。用MTT染色，然后测量集落的面积。关于详细内容参见正文。显示反映集落的总体面积的绝对数目（A）和基于这些数据计算的相对生长抑制（B）。当与未处理的对照细胞相比较时，使用顺铂的温育以剂量依赖性方式导致集落生长迟滞。与在30%的范围内的单独的11B7的抑制作用相一致，与拮抗型抗Axl抗体11B7的组合导致显著增强的顺铂（特别地较低浓度的顺铂）对C-8161黑色素瘤细胞的软琼脂生长的抑制作用。

此外，本发明将通过下列实施例和附图来解释。

实施例

一般注释

下列实施例，包括进行的实验和获得的结果，仅用于举例说明目的并且不被解释为对本发明的限定。

实施例1作为免疫原的过表达AXL的Ratl成纤维细胞和作为实验模型系统的过表达AXL的NIH3T3成纤维细胞的产生

通过侧翼连接限制性核酸内切酶EcoRI和BamHI的识别元件将根据National Center for Biotechnology Information（NCBI）参照序列(NM_021913)的人受体酪氨酸激酶AXL转录物变体1的全长编码序列亚克隆入pLXSN，从而产生逆转录病毒表达载体pLXSN-hAXL。

为了产生特异性结合人受体酪氨酸激酶AXL的抗体，通过逆转录病毒基因转移产生稳定地过表达人AXL的Ratl成纤维细胞。简而言之，将3x10⁵个Phoenix-E细胞接种在60mm培养皿中，然后使用磷酸钙法用2μg/ml pLXSN载体或pLXSN-hAXL转染细胞。24小时后，用新鲜培养基替换培养基，并且将Phoenix-E细胞在其中温育4小时。收获释放pLXSN或pLXSN-hAXL亲嗜性病毒的Phoenix-E细胞的上清液，在聚凝胺(4mg/ml;Aldrich)存在的情况下将其用于温育亚汇合的Ratl细胞(2x10⁵个细胞/6cm皿)，进行3小时。同时，用新鲜培养基再温育Phoenix-E细胞，在进行另外3小时之后在聚凝胺(4mg/ml;Aldrich)存在的情况下将其用于Ratl成纤维细胞的第二次感染。同样地，进行第三个感染循环。在更换培养基后，开始用G418选择Ratl细胞。通常，在选择21天后挑选稳定的克隆。

繁殖一组稳定的克隆，并且通过FACS分析就膜定位的人AXL表达对其进行定量。具体地，用10mM的于PBS中的EDTA收获1x10⁵个细胞，用FACS缓冲液(PBS，3%FCS，0.4%叠氮化钠)清洗细胞一次，将其接种在96孔圆底板中。以1,000rpm将细胞离心3分钟以除去上清液，然后用小鼠抗AXL一抗MAB154(R&D Systems，3μg/ml)进行重悬浮。将细胞悬浮液在冰上温育1小时，用FACS缓冲液清洗2次，然后以100μl/孔重悬浮于以1:50稀释于FACS缓冲液中的PE-缀合的驴抗小鼠二抗(Jackson)中。将细胞悬浮液在冰上于黑暗中温育30分钟，用FACS缓冲液清洗2次，使用Epics XL-MCL流式细胞仪（BeckmanCoulter)进行分析。

图1显示用pLXSN空载体稳定感染的多克隆Ratl-模拟群体和用pLXSN-hAXL稳定感染的Ratl-AXL cl.2的FACS分析，并且证明AXL在该代表性克隆的细胞表面上过表达。

此外，为了产生用于实验目的合适的细胞模型系统，以类似于对于Ratl所描述的方法产生稳定地过表达AXL的NIH3T3成纤维细胞。简而言之，将3x10⁵个Phoenix-E细胞接种在60mm培养皿中，然后使用磷酸钙法用2μg/ml pLXSN载体或pLXSN-AXL cDNA转染细胞。24小时后，用新鲜培养基替换培养基，并将Phoenix-E细胞在其中温育4小时。收获释放pLXSN或pLXSN-hAXL亲嗜性病毒的Phoenix-E细胞的上清液，在聚凝胺(4mg/ml;Aldrich)存在的情况下将其用于温育亚汇合的NIH3T3细胞(2x10⁵个细胞/6cm皿)，进行3小时。同时，用新鲜培养基再温育Phoenix-E细胞，在进行另外3小时之后在聚凝胺(4mg/ml;Aldrich)存在的情况下将其用于NIH3T3成纤维细胞的第二次感染。同样地，进行第三个感染循环。在更换培养基后，开始用G418选择NIH3T3细胞。通常，在选择21天后挑选稳定的克隆。

繁殖一组稳定的克隆，并且通过FACS分析就膜定位的AXL表达对其进行定量。具体地，用10mM的在PBS中的EDTA收获1x10⁵个细胞，用FACS缓冲液(PBS，3%FCS，0.4%叠氮化钠)清洗细胞一次，将其接种在96孔圆底板中。以1,000rpm将细胞离心3分钟以除去上清液，然后用小鼠抗AXL一抗MAB154(R&D Systems，3μg/ml)进行重悬浮。将细胞悬浮液在冰上温育1小时，用FACS缓冲液清洗2次，然后以100μl/孔重悬浮于以1:50稀释于FACS缓冲液中的PE-缀合的驴抗小鼠二抗(Jackson)中。将细胞悬浮液在冰上于黑暗中温育30分钟，用FACS缓冲液清洗2次，使用Epics XL-MCL流式细胞仪（BeckmanCoulter)进行分析。

图2显示用pLXSN空载体稳定感染的多克隆NIH3T3-模拟群体和用pLXSN-hAXL稳定感染的NIH3T3-AXL cl.7的FACS分析，并且证明AXL在该代表性克隆的细胞表面上过表达。

实施例2.大鼠抗AXL单克隆抗体的产生

通过将大约10x10⁶个Ratl-AXL cl.2的冷冻细胞注射（腹膜内和皮下）入Lou/C或Long Evans大鼠来产生单克隆大鼠抗AXL抗体。在8周间隔后，在融合前3天腹膜内和皮下给予最终的加强。根据标准方法进行骨髓瘤细胞系P3X63-Ag8.653与大鼠免疫脾细胞的融合，产生105个杂交瘤。2周后，收集来自杂交瘤的第一悬浮液，并且就与NIH3T3-AXL cl.7成纤维细胞（对NIH3T3-模拟对照细胞）的结合在初步的FACS筛选中对其进行检测。进一步培养对于AXL结合呈阳性的克隆。从50ml这些克隆的上清液纯化抗体，并且就与NIH3T3-AXL cl.7成纤维细胞（对NIH3T3-模拟对照细胞）上的AXL的特异性结合对其进行再分析。在Akt-激酶磷酸化ELISA中进一步检测特异性结合NIH3T3-AXL cl.7成纤维细胞但不结合NIH3T3-模拟对照细胞的纯化的抗体，并进行确定同种型的ELISA。为了纯化大鼠抗体，以5,000g离心上清液20分钟，然后进行无菌过滤。加入500μl蛋白G琼脂糖（sepharose）FF，在4℃下于旋转轮（spinning wheel）上温育至少1小时。将琼脂糖离心，弃去上清液，在使用柠檬酸盐缓冲液(100mM)pH2.1进行蛋白质洗脱之前用PBS清洗蛋白G基质2次。立即通过加入1M Tris pH8.0将洗脱级分再缓冲至中性pH，然后对PBS进行透析。

在测试的寡克隆抗体中，91个特异性结合NIH3T3-AXL cl.7成纤维细胞但不结合NIH3T3-模拟对照细胞，9个在相同的细胞中抑制Gas6诱导的Akt磷酸化，然而71个刺激Akt磷酸化。冷冻保存（kryoconserve）和亚克隆4个拮抗型抗体(I11B7、I10D12、I6E7和III11D5，在下列实施例中分别称为11B7、10D12、6E7和11D5)、两个激动型抗体(I11D7和III2A1;在下列实施例中称为11D7和2A1)和1个对照抗体(III1D5;在下列实施例中称为1D5)。

实施例3.本发明的大鼠抗AXL抗体不与小鼠AXL或人AXL家族的其他成员Mer和Sky交叉反应

本实施例讨论了本发明的大鼠抗AXL抗体与小鼠和食蟹猴AXL以及与人AXL家族的其他成员人Mer和人Sky的交叉反应性。在将小鼠和猴AXL编码序列以及人Mer和Sky亚克隆入pcDNA3中后，将各表达构建体转染入HEK293T成纤维细胞。通过FACS分析检测本发明的大鼠抗AXL抗体结合此类蛋白质的能力。

3A.小鼠AXL的克隆

在本研究中，产生小鼠AXL表达构建体pcDNA3-mAXL。使用小鼠心脏cDNA(Ambion)（作为模板）和根据小鼠AXL的National Centerfor Biotechnology Information（NCBI）参照序列(NM_009465)的合适引物通过聚合酶链式反应（PCR）扩增小鼠AXL的全长编码序列。编码小鼠AXL的全长序列从而由两个交叠PCR片段5'-片段和3'-片段涵盖。用于扩增此类片段的引物如下：

用于5'-片段的具有EcoRI识别序列的正向引物MOUSE1：

5'-GCG AAT TCG CCA CCA TGG GCA GGG TCC CGC TGG CCT G-3'

用于5'-片段的反向引物MOUSE2：

5'-CAG CCG AGG TAT AGG CTG TCA CAG ACA CAG TCA G-3'

用于3'-片段的正向引物MOUSE3:

5'-GCA CCC TGT TAG GGT ACC GGC TGG CAT ATC-3'

用于3'-片段的具有NotI识别序列的反向引物MOUSE4:

5'-ATA AGA ATG CGG CCG CTC AGG CTC CGT CCT CCT GCC CTG-3'

使用EcoRI和BstEII降解5'-片段，使用BstEII和NotI降解3'-片段，用EcoRI和NotI切割pcDNA3。进行分离和纯化的片段的3因子连接，将其转化入DH5α细菌细胞。挑选单个集落，在氨苄青霉素存在的情况下进行培养。使用可商购获得的质粒纯化试剂盒(Qiagen)，纯化小鼠AXL表达载体pcDNA3-mAXL，并验证序列以用于随后瞬时转染入HEK293T细胞。

3B.食蟹猴AXL的克隆

在本研究中，产生食蟹猴AXL表达构建体pcDNA3-cyAXL。使用从食蟹猴脑组织制备的cDNA作为模板PCR扩增食蟹猴AXL的全长编码序列。因为食蟹猴AXL的核苷酸序列是不可获得的，通过假定与人AXL有显著同源性来设计各引物。编码食蟹猴AXL的全长序列从而由两个交叠PCR片段5'-片段和3'-片段涵盖。用于扩增此类片段的引物如下：

用于5'-片段的具有EcoRI识别序列的正向引物CYNO1：

5'-CGG AAT TCG CCA CCA TGG CGT GGC GGT GCC CCA G-3'

用于5'-片段的反向引物CYNO2：

5'-CTC TGA CCT CGT GCA GAT GGC AAT CTT CAT C-3'

用于3'-片段的正向引物CYNO3:

5'-GTG GCC GCT GCC TGT GTC CTC ATC-3'

用于3'-片段的具有NotI识别序列的反向引物CYNO4:

5'-ATA AGA ATG C GG CCG CTC AGG CAC CAT CCT CCT GCC CTG-3'

使用EcoRI和DraIII降解5'-片段，使用DraIII和NotI降解3'-片段，用EcoRI和NotI切割pcDNA3。进行分离和纯化的片段的3因子连接，将其转化入DH5α细菌细胞。挑选单个集落，在氨苄青霉素存在的情况下进行培养。使用可商购获得的质粒纯化试剂盒(Qiagen)纯化食蟹猴AXL表达载体pcDNA3-cyAXL，并验证序列以随后瞬时转染入HEK293T细胞。食蟹猴的核苷酸和氨基酸序列如下：

核苷酸序列：

ATGGCGTGGCGGTGCCCCAGGATGGGCAGGGTCCCGCTGGCCTGGTGCTTGGCGCTGTGCGGCTGGGTGTGCATGGCCCCCAGGGGCACACAGGCTGAAGAAAGTCCTTTCGTGGGTAACCCAGGGAATATCACAGGTGCCCGGGGACTCACGGGCACCCTTCGGTGTCAGCTCCAGGTTCAGGGAGAGCCCCCCGAGGTACACTGGCTTCGGGACGGACAGATCCTGGAGCTCGCGGACAGTACCCAGACCGAGGTGCCCCTGGGTGAAGATGAGCAGGATGACTGGATAGTGGTCAGCCAGCTCAGAATCGCCTCCCTACAGCTTTCCGACGCGGGACAGTACCAGTGTTTGGTGTTTCTGGGACATCAGAACTTCGTGTCCCAGCCTGGCTACGTAGGGCTGGAGGGCTTACCTTACTTCCTGGAGGAGCCTGAGGACAGGACTGTGGCCGCCAACACCCCCTTCAACCTGAGCTGCCAAGCCCAGGGACCCCCAGAGCCCGTGGACCTACTCTGGCTCCAGGATGCTGTCCCCCTGGCCACAGCTCCAGGTCATGGTCCCCAGCGCAACCTGCATGTTCCAGGGCTGAACAAGACATCCTCTTTCTCCTGCGAAGCCCATAACGCCAAGGGAGTCACCACATCCCGCACGGCCACCATCACAGTGCTCCCCCAGCAGCCCCGTAACCTCCATCTGGTCTCCCGCCAACCCACGGAGCTGGAGGTGGCTTGGACTCCAGGCCTGAGCGGCATCTACCCCCTGACCCACTGCACCCTGCAGGCTGTGCTGTCAGACGATGGGATGGGCATCCAGGCGGGAGAACCAGACCCGCCAGAGGAGCCCCTCACCTTGCAAGCATCTGTGCCCCCCCACCAGCTTCGGCTGGGCAGCCTCCATCCTCACACCCCTTATCACATCCGTGTGGCATGCACCAGCAGCCAGGGCCCCTCATCCTGGACACACTGGCTTCCTGTGGAGACGCCGGAGGGAGTGCGCCTGGGCCCCCCTGAGAACATTAGTGCCACGCGGAATGGGAGCCAGGCCTTCGTGCATTGGCAGGAGCCCCGGGCGCCCCTGCAGGGTACCCTGTTAGGGTACCGGCTGGCGTATCAAGGCCAGGACACCCCAGAGGTGCTAATGGACATAGGGCTAAGGCAAGAGGTGACCCTGGAGCTGCAGGGGGACGGGTCTGTGTCCAATCTGACAGTGTGTGTGGCAGCCTACACTGCTGCTGGGGATGGACCCTGGAGCCTCCCAGTACCCCTGGAGGCCTGGCGCCCAGGGCAAGCACAGCCAGTCCACCAGCTGGTGAAGGAAACTTCAGCTCCTGCCTTCTCGTGGCCCTGGTGGTATATACTGCTAGGAGCAGTCGTGGCCGCTGCCTGTGTCCTCATCTTGGCTCTCTTCCTTGTCCACCGGCGAAAGAAGGAGACCCGTTATGGAGAAGTGTTCGAGCCAACAGTGGAAAGAGGTGAACTGGTAGTCAGGTACCGCGTGCGCAAGTCCTACAGTCGCCGGACCACTGAAGCTACCTTGAACAGCCTGGGCATCAGTGAAGAGCTGAAGGAGAAGCTGCGGGATGTGATGGTGGACCGGCACAAGGTGGCCCTGGGGAAGACTCTGGGAGAAGGAGAGTTTGGAGCCGTGATGGAAGGCCAGCTCAACCAGGACGACTCCATCCTCAAGGTGGCTGTGAAGACAATGAAGATTGCCATCTGCACAAGGTCAGAGCTGGAGGATTTCCTGAGTGAAGCAGTCTGCATGAAGGAATTCGACCATCCCAATGTCATGAGGCTCATCGGTGTCTGTTTCCAGGGTTCTGAACGAGAGAGCTTTCCAGCACCTGTGGTCATCTTACCTTTCATGAAGCATGGAGACCTACACAGCTTCCTCCTCTATTCCCGGCTTGGGGACCAGCCAGTGTACGTGCCCACTCAGATGCTAGTGAAGTTCATGGCGGACATCGCCAGTGGCATGGAATATCTGAGTACCAAGAGATTCATACACCGGGACCTGGCGGCCAGGAACTGCATGCTGAATGAGAACATGTCCGTGTGTGTGGCGGACTTCGGGCTCTCCAAGAAGATCTACAACGGGGACTACTACCGCCAGGGACGTATCGCCAAGATGCCAGTCAAGTGGATTGCGATTGAGAGTCTAGCTGACCGTGTCTACACGAGCAAGAGTGATGTGTGGTCCTTCGGGGTGACAATGTGGGAGATTGCCACAAGAGGCCAAACCCCATATCCAGGCGTGGAGAACAGCGAGATTTATGACTATCTGCGCGAGGGAAATCGCCTGAAGCAGCCTGCGGACTGTCTGGATGGACTGTATGCCTTGATGTCGCGGTGCTGGGAGCTAAATCCCCAGGACCGGCCAAGTTTTACAGAGCTGCGGGAAGATTTGGAGAACACACTGAAGGCCTTGCCTCCTGCCCAGGAGCCTGACGAAATCCTCTATGTCAACATGGATGAAGGTGGAGGTTATCCTGAACCTCCCGGCGCTGCTGGAGGAGCTGACCCCCCAACCCAGCTAGACCCTAAGGATTCCTGTAGCTGCCTCACTTCGGCTGAGGTCCATCCTGCTGGACGCTATGTCCTCTGCCCTTCCACAGCCCCTAGCCCCGCTCAGCCTGCTGATAGGGGCTCCCCAGCAGCCCCAGGGCAGGAGGATGGTGCC

氨基酸序列：

MAWRCPRMGRVPLAWCLALCGWVCMAPRGTQAEESPFVGNPGNITGARGLTGTLRCQLQVQGEPPEVHWLRDGQILELADSTQTQVPLGEDEQDDWIVVSQLRIASLQLSDAGQYQCLVFLGHQNFVSQPGYVGLEGLPYFLEEPEDRTVAANTPFNLSCQAQGPPEPVDLLWLQDAVPLATAPGHGPQRNLHVPGLNKTSSFSCEAHNAKGVTTSRTATITVLPQQPRNLHLVSRQPTELEVAWTPGLSGIYPLTHCTLQAVLSDDGMGIQAGEPDPPEEPLTLQASVPPHQLRLGSLHPHTPYHIRVACTSSQGPSSWTHWLPVETPEGVPLGPPENISATRNGSQAFVHWQEPRAPLQGTLLGYRLAYQGQDTPEVLMDIGLRQEVTLELQGDGSVSNLTVCVAAYTAAGDGPWSLPVPLEAWRPGQAQPVHQLVKETSAPAFSWPWWYILLGAVVAAACVLILALFLVHRRKKETRYGEVFEPTVERGELVVRYRVRKSYSRRTTEATLNSLGISEELKEKLRDVMVDRHKVALGKTLGEGEFGAVMEGQLNQDDSILKVAVKTMKIAICTRSELEDFLSEAVCMKEFDHPNVMRLIGVCFQGSERESFPAPVVILPFMKHGDLHSFLLYSRLGDQPVYLPTQMLVKFMADIASGMEYLSTKRFIHRDLAARNCMLNENMSVCVADFGLSKKIYNGDYYRQGRIAKMPVKWIAIESLADRVYTSKSDVWSFGVTMWEIATRGQTPYPGVENSEIYDYLRQGNRLKQPADCLDGLYALMSRCWELNPQDRPSFTELREDLENTLKALPPAQEPDEILYVNMDEGGGYPEPPGAAGGADPPTQLDPKDSCSCLTSAEVHPAGRYVLCPSTAPSPAQPADRGSPAAPGQEDGA

3C.人Mer的克隆

在本研究中，产生人Mer表达构建体pcDNA3-hMer。通过用EcoRI和XbaI切割载体pCMV6-XL4-人Mer（Origene#TC116132）获得人Mer的全长编码序列。在用相同的限制性内切核酸酶降解pcDNA3后，连接两个片段以产生pcDNA3-hMer。为了导入Kozak共有序列，使用根据人Mer的NCBI参照序列(NM_006343)的合适引物PCR扩增pcDNA3-hMer中人Mer编码序列的5'区域。用于扩增该片段的引物如下：

具有EcoRI识别序列和Kozak共有序列的正向引物MER1：

5'-CGG AAT TCG CCA CCA TGG GGC CGG CCC CGC TGC CGC-3'

用于5'-片段的反向引物MER2：

5'-TCG GCT GCC ATT CTG GCC AAC TTC C-3'

使用EcoRI和EcoRV降解PCR产物和pcDNA3-hMer，然后连接以产生pcDNA3-Kozak-hMer，其中全长人Mer编码序列之前为Kozak共有序列。转化入DH5α细菌细胞，挑选单个集落，在氨苄青霉素存在的情况下进行培养。使用可商购获得的质粒纯化试剂盒(Qiagen)纯化pcDNA3-Kozak-hMer表达载体，并验证序列以随后瞬时转染入HEK293T细胞。

3D.人Sky的克隆

在本研究中，产生人Sky表达构建体pcDNA3-hSky。使用载体pCMV6-XL4-人Sky(Origene#MG1044_A02)（作为模板）和根据人Sky的NCBI参照序列(NM_006293)的合适引物PCR扩增人Sky的全长编码序列。用于扩增的引物如下：

具有EcoRI识别序列的正向引物SKY1：

5'-CGG AAT TCG CCA CCA TGG CGC TGA GGC GGA GC-3'

具有XhoI识别序列的反向引物SKY2：

5'-GCC CTC GAG CTA ACA GCT ACT GTG TGG CAG TAG-3'

使用EcoRI和XhoI降解PCR产物和pcDNA3，然后连接以产生pcDNA3-hSky表达载体。转化入DH5α细菌细胞，挑选单个集落，在氨苄青霉素存在的情况下进行培养。使用可商购获得的质粒纯化试剂盒(Qiagen)，纯化pcDNA3-hSky表达载体，并验证序列以随后瞬时转染入HEK293T细胞。

3E.小鼠AXL、食蟹猴AXL、人Mer和人Sky的转染和表达

为了瞬时表达小鼠AXL、食蟹猴AXL、人Mer或人Sky，使用磷酸钙法用pcDNA3空载体、pcDNA3-hAXL、pcDNA3mAXL、pcDNA3-cyAXL、pcDNA3-hMer或pcDNA3-hSky瞬时转染HEK293T细胞。简而言之，在转染前，将3x10⁶个HEK293T细胞于16ml培养基中接种在15cm细胞组织培养皿上，在7%CO₂和37℃下培养30个小时。将32μg各表达构建体或空载体的DNA（于720μl的ddH₂O中）与2.5M CaCl₂和2xBBS(pH6.96)混合，在室温下保持10分钟。轻轻地向细胞培养物中加入溶液，在3%CO₂和37℃下温育8小时。然后用新鲜培养基替换培养基，将细胞在7%CO₂和37℃下培养24小时。

3F.就交叉反应性检测大鼠抗AXL抗体的FACS分析

为了进行FACS分析，使用10mM的于PBS中的EDTA收获2x10⁵个细胞，用FACS缓冲液(PBS,3%FCS,0.4%叠氮化钠)清洗1次，然后接种在96孔圆底板上。为了除去上清液，以1000rpm离心板3分钟，将细胞重悬浮于10μg/ml同种型对照抗体1D5以及抗AXL11D5、11B7、10D12、6E7、2A1、11D7和12B7一抗溶液(100μl/孔)中。在冰上温育1小时后，用冷冻的FACS缓冲液清洗细胞2次，用以1:50稀释于FACS缓冲液(100μl/孔)中的PE缀合的驴抗大鼠（Jackson)二抗或PE缀合的驴抗小鼠二抗（用于对照）重悬浮细胞。免受光照，将细胞在冰上温育30分钟，用FACS缓冲液清洗2次，然后使用EpicsXL-MCL流式细胞仪(Beckman Coulter)进行分析。

图3显示该实验的代表性结果。除了显示与小鼠AXL以及人Mer和Sky的中度交叉反应性的12B7外，本发明的其他抗AXL抗体没有一个与此类分子交叉反应。相反地，所有测试的本发明的大鼠抗AXL抗体与食蟹猴AXL交叉反应。

实施例4.本发明的大鼠抗AXL抗体体外抑制配体诱导的AXL磷酸化

进行ELISA实验以研究本发明的大鼠抗AXL抗体是否能够阻止配体Gas6-介导的AXL的激活。通过增加的受体酪氨酸磷酸化检测Gas6-介导的AXL激活。简而言之，在第1天，将3x10⁴个细胞/孔于正常生长培养基中接种在平底96孔板中。第二天，用无血清培养基替换生长培养基以饥饿细胞过夜，进行24小时。同样地，还在4℃下用2μg/ml的在PBS中的小鼠抗磷酸酪氨酸抗体4G10包被黑色Maxi-Sorp96孔板(Nunc)过夜。在第3天，除去4G10抗体溶液，用PBS，0.5%BSA在室温下封闭Maxi-Sorp孔，进行至少4小时。平行地，用10μg/ml的小鼠对照抗体72A1以及大鼠抗AXL抗体2A1、11D7、11D5、11B7、6E7和10D12在37℃下预温育细胞1小时，然后用或不用400ng/mlGas6(R&D Systems)在37℃下处理10分钟。然后弃去培养基，在冰上于补充有磷酸酶和蛋白酶抑制剂(10mM Na₄P₂O₇，1mM苯甲基磺酰氟，1mM原钒酸盐，1mM NaF和0,5%抑肽酶)的裂解缓冲液(50mMHEPES，pH7.5，150mM NaCl，1mM EDTA，10%甘油和1%Triton X-100)中裂解细胞30分钟。同时除去封闭缓冲液，在将裂解物转移和于4℃下温育过夜之前，用清洗缓冲液(PBS，0.05%Tween20)清洗Maxi-Sorp板6次。在第4天用清洗缓冲液清洗板6次后，在室温下用0.5μg/ml的在PBS中的生物素化的大鼠抗AXL抗体12B7温育孔，进行2小时。用清洗缓冲液清洗板6次，向各孔中加入以1:4,000稀释于PBS中的AP缀合的链霉抗生物素蛋白(Chemicon#SA110)，在室温下温育30分钟。之后，用清洗缓冲液清洗孔6次，加入AttoPhos底物溶液(Roche#11681982)。通过使用Victor板读取器(Perkin Elmer)，在430nm的激发波长和580nm的发射波长处收集各孔的荧光。

图4显示该实验对于NIH3T3-AXL cl.7成纤维细胞(A)和NCI-H292肺癌细胞(B)的代表性结果。本发明的大鼠抗AXL抗体11B7、11D5、6E7和10D12能够阻止或减少配体介导的AXL激活，如通过减少的磷酸化显示的，从而被认为是拮抗型抗AXL抗体。相反地，本发明的大鼠抗AXL抗体2A1和11D7刺激基础AXL激活（如通过增加的磷酸化显示的），没有显著减少配体介导的AXL激活，从而被认为是激动型抗AXL抗体。在肺癌细胞系CaLu-1和CaLu-6、乳腺癌细胞系Hs578T和MDA-MB-231、前列腺癌细胞系PC-3、胰腺癌细胞系PANC-1、黑色素瘤细胞系C-8161、卵巢癌细胞系SkOV-3和SkOV-8、胶质母细胞瘤细胞系SF-126、宫颈癌细胞系CaSki以及胃癌细胞系Hs746T和MKN-1中对于相同组的抗体观察到相似的作用。

实施例5.本发明的大鼠抗AXL抗体体外抑制配体诱导的p42/p44MAP-激酶磷酸化

然后，进行ELISA实验以研究本发明的大鼠抗AXL抗体是否能够阻止配体Gas6介导的p42/p44MAP-激酶的激活。通过增加的蛋白质(Thr202/Tyr204)磷酸化检测Gas6介导的p42/p44MAP-激酶的激活。简而言之，在第1天，将2x10⁴个细胞/孔接种在平底96孔板中。第二天，用无血清培养基替换正常生长培养基以饥饿细胞36小时。之后，用10μg/ml的同种型对照抗体1D5以及大鼠抗AXL抗体11D5、11B7和2A1在37℃下预温育细胞1小时，然后用或不用400ng/ml Gas6(R&DSystems)在37℃下处理10分钟。弃去培养基，用4%的在PBS(pH7.5)中的甲醛在室温下固定细胞30分钟。除去甲醛溶液，用清洗缓冲液（PBS，0.1%Tween20）清洗细胞2次。用1%H₂O₂，0.1%NaN₃（于清洗缓冲液中）猝灭细胞，在室温下温育20分钟。之后，除去猝灭溶液，用清洗缓冲液清洗细胞2次，然后用PBS，0.5%BSA在4℃下进行封闭，进行4小时。加入以1:500稀释于PBS，0.5%BSA，5mM EDTA中的抗磷酸-p42/p44MAP激酶(Thr202/Tyr204)一抗(多克隆兔;CellSignaling#9101)，在4℃下过夜。在第4天，除去抗体溶液，用清洗缓冲液清洗板3次。然后向各孔中加入以1:2,500稀释于PBS,0.5%BSA中的HRP缀合的抗兔二抗（Dianova#111-036-045），在室温下温育1.5小时。用清洗缓冲液清洗板3次，用PBS清洗2次，每次5分钟。加入四甲基联苯胺(TMB，Calbiochem)，在620nm处进行监控。通过加入100μl250nM HCl终止反应，使用Vmax板读取器(ThermoLab Systems)，在450nm处(620nm的参照波长)读取吸光度。

图5显示对于宫颈癌细胞系CaSki的该实验的代表性结果。本发明的大鼠抗AXL抗体11B7和11D5能够减少配体介导的p42/p44MAP-激酶的激活，如通过减少的磷酸化显示的，从而被认为是拮抗型抗AXL抗体。相反地，本发明的大鼠抗AXL抗体2A1刺激基础p42/p44MAP-激酶的激活（如通过增加的磷酸化显示的），不减少配体介导的p42/p44MAP激酶的激活，从而被认为是激动型抗AXL抗体。在乳腺癌细胞系Hs578T和肺癌细胞系NCI-H292中对于相同组的抗体观察到相似的作用。

实施例6.本发明的大鼠抗AXL抗体体外抑制配体诱导的Akt磷酸化

此外，进行ELISA实验以研究本发明的大鼠抗AXL抗体是否能够阻止配体Gas6介导的Akt-激酶的激活。通过增加的蛋白质(Ser473)磷酸化检测Gas6介导的Akt-激酶的激活。简而言之，在第1天，将2x10⁴个细胞/孔接种在平底96孔板中。第二天，用低血清（对于NIH3T3-AXL cl.7成纤维细胞，使用DMEM，0.5%FCS）或无血清（对于癌细胞系）培养基替换正常生长培养基以饥饿细胞36小时。之后，用10μg/ml的同种型对照抗体1D5以及大鼠抗AXL抗体11D5、11B7和2A1在37℃下预温育细胞1小时，然后用或不用400ng/ml Gas6(R&DSystems)在37℃下处理10分钟。弃去培养基，用4%的在PBS(pH7.5)中的甲醛在室温下固定细胞30分钟。除去甲醛溶液，用清洗缓冲液（PBS，0.1%Tween20）清洗细胞2次。用1%H₂O₂，0.1%NaN₃（于清洗缓冲液中）猝灭细胞，在室温下温育20分钟。之后，除去猝灭溶液，用清洗缓冲液清洗细胞2次，然后用PBS，0.5%BSA在4℃下进行封闭，进行4小时。加入以1:500稀释于PBS，0.5%BSA，5mM EDTA中的抗磷酸-Akt(Ser473)一抗(多克隆兔;Cell Signaling#9271)，在4℃下过夜。在第4天，除去抗体溶液，用清洗缓冲液清洗板3次。然后向各孔中加入以1:2,500稀释于PBS，0.5%BSA中的HRP缀合的抗兔二抗（Dianova#111-036-045），在室温下温育1.5小时。用清洗缓冲液清洗板3次，用PBS清洗2次，每次5分钟。加入四甲基联苯胺(TMB，Calbiochem)，在620nm处进行监控。通过加入100μl250nM HCl终止反应，使用Vmax板读取器(Thermo Lab Systems)，在450nm处(620nm的参照波长)读取吸光度。

图6显示对于NIH3T3-AXL cl.7成纤维细胞（A）和CaLa-1肺癌细胞（B）的该实验的代表性结果。本发明的大鼠抗AXL抗体11B7和11D5能够阻止或减少配体介导的Akt-激酶的激活，如通过减少的磷酸化显示的，从而被认为是拮抗型抗AXL抗体。相反地，本发明的大鼠抗AXL抗体2A1刺激基础Akt-激酶的激活（如通过增加的磷酸化显示的），不减少配体介导的Akt-激酶的激活，从而被认为是激动型抗AXL抗体。在肺癌细胞系NCI-H292、乳腺癌细胞系Hs578T和MDA-MB-231、前列腺癌细胞系PC-3、胰腺癌细胞系PANC-1、黑色素瘤细胞系C-8161、卵巢癌细胞系SkOV-3和SkOV-8、膀胱癌细胞系TCC-Sup以及纤维肉瘤细胞系HT1080中对于相同组的抗体观察到相似的作用。

实施例7.本发明的大鼠和嵌合抗AXL抗体体外抑制配体诱导的Akt磷酸化至相似程度

作为本发明的部分，产生大鼠抗AXL抗体11B7和11D5的嵌合衍生物（参见下文）。为了研究本发明的大鼠抗AXL抗体和本发明的相应嵌合抗AXL抗体是否能够阻止NIH3T3-AXL cl.7成纤维素细胞中配体Gas6-介导的Akt-激酶的激活至相似的程度，进行ELISA实验。通过减少的蛋白质(Ser473)磷酸化检测抗体介导的Akt-激酶的抑制。简而言之，在第1天，将2x10⁴个细胞/孔接种在平底96孔板中。第二天，用低血清培养基（DMEM，0.5%FCS）替换正常生长培养基以饥饿细胞36小时。之后，用50ng/ml、100ng/ml、300ng/ml、500ng/ml和1μg/ml的大鼠抗AXL抗体11B7或嵌合抗AXL抗体ch11B7以及50ng/ml、100ng/ml、300ng/ml、500ng/ml、1μg/ml、5μg/ml和10μg/ml的大鼠抗AXL抗体11D5或嵌合抗AXL抗体ch11D5在37℃下预温育细胞1小时，然后用或不用400ng/ml Gas6(R&D Systems)在37℃下处理10分钟。弃去培养基，用4%的在PBS(pH7.5)中的甲醛在室温下固定细胞30分钟。除去甲醛溶液，用清洗缓冲液（PBS，0.1%Tween20）清洗细胞2次。用1%H₂O₂，0.1%NaN₃（于清洗缓冲液中）猝灭细胞，在室温下温育20分钟。之后，除去猝灭溶液，用清洗缓冲液清洗细胞2次，然后用PBS，0.5%BSA在4℃下进行封闭，进行4小时。加入以1:500稀释于PBS，0.5%BSA，5mM EDTA中的抗磷酸-Akt(Ser473)一抗(多克隆兔;Cell Signaling#9271)，在4℃下过夜。在第4天，除去抗体溶液，用清洗缓冲液清洗板3次。然后向各孔中加入以1:2,500稀释于PBS,0.5%BSA中的HRP缀合的抗兔二抗（Dianova#111-036-045），在室温下温育1.5小时。用清洗缓冲液清洗板3次，用PBS清洗2次，每次5分钟。加入四甲基联苯胺(TMB，Calbiochem)，在620nm处进行监控。通过加入100μl250nM HCl终止反应，使用Vmax板读取器(Thermo Lab Systems)，在450nm处（620nm的参照波长）读取吸光度。？

图7显示本发明的大鼠抗AXL抗体11B7和嵌合抗AXL抗体ch11B7以及本发明的大鼠抗AXL抗体11D5和嵌合抗AXL抗体ch11D5能够抑制配体介导的Akt激酶的激活至相似的程度，如通过减少的磷酸化显示的。因此，与它们各自的大鼠对应物相比，嵌合抗AXL抗体ch11B7和ch11D5保持活性。

实施例8.本发明的拮抗型大鼠抗AXL抗体彼此竞争相同的或结构上相关的表位并且不与本发明的激动型大鼠抗AXL抗体共有结合位点

检查本发明的抗AXL抗体以确定它们是否彼此竞争AXL-ECD结构域上的相似结合表位。因此在竞争ELISA中确定生物素化的抗AXL抗体与用抗AXL抗体预温育的AXL-ECD结构域包被的板的结合。简而言之，按照厂商的说明书用磺基-NHS-生物素(Pierce#21217)生物素化30μg的同种型对照抗体1D5以及大鼠抗AXL抗体11B7、11D5、6E7、10D12、11D7和2A1，然后使用Micro-BioSpin P6柱SSC(BIO-RAD#732-6200)进行纯化。在第1天，以100μl/孔用1μg/ml的在PBS中的人AXL-ECD(R&D Systems#154-AL)在4℃下包被黑色96孔Maxi-Sorp板(Nunc)过夜。在第2天，用封闭缓冲液(PBS，1%BSA 0.05%TWEEN-20)在室温下封闭包被的Maxi-Sorp板(250μl/孔)，进行2小时，然后用PBS或10μg/ml的在封闭缓冲液中的未生物素化的同种型对照抗体1D5以及未生物素化的大鼠抗AXL抗体11B7、11D5、6E7、10D12、11D7或2A1(100μl/孔)在室温下温育1小时。弃去抗体溶液，不进行清洗，以100μl/孔加入PBS或0.5μg/ml的在封闭缓冲液中的生物素化的同种型对照抗体1D5以及生物素化的大鼠抗AXL抗体11B7、11D5、6E7、10D12、11D7或2A1，在室温下温育15分钟。在用清洗缓冲液(PBS，0,1%TWEEN-20)清洗6次后，以80μl/孔加入以1:4,000稀释于封闭缓冲液中的AP缀合的链霉抗生物素蛋白(Chemicon#SA110)，在室温下温育20分钟，用清洗缓冲液再清洗6次，最后用PBS清洗1次。为了进行检测，以100μl/孔加入Attophos底物溶液(Roche#11681982)。使用Victor板读取器(Perkin Elmer)，在430nm的激发波长和580nm的发射波长处收集各孔的荧光。

图8显示该分析的代表性结果。本发明的拮抗型抗AXL抗体11B7、11D5、6E7和10D12彼此竞争相同的或结构上相邻的表位。本发明的两个激动型抗体11D7和2A1各自识别不同的表位，从而不相互排斥。此外，11D7和2A1不与拮抗型抗体竞争对AXL-ECD的结合。对照抗体1D5不结合AXL-ECD。

实施例9.本发明的大鼠和嵌合抗AXL抗体体外抑制肺癌细胞的迁移和增殖

为了检查不同细胞和培养条件的迁移和增殖率，体外伤口愈合/划痕测定已沿用多年。此类测定通常包括首先培养汇合细胞单层。然后破坏小区域，通过用例如移液器吸头划线穿过层来破坏一群细胞或使其移位。然后在一段时间内用显微镜检查缺口（细胞移入和填充被破坏的区域(“愈合”)）。简而言之，以1.5x10⁶个细胞/孔将NCI-H292肺癌细胞接种在12孔培养板上，并且在正常生长培养基(RPMI，10%FCS)中进行培养。8小时后，用PBS漂洗细胞，在低血清培养基(RPMI,0.5%FCS)中饥饿细胞过夜，进行24小时。使用无菌200μl移液器吸头划穿汇合的NCI-H292细胞单层，每孔产生3个分开的均一的伤口。用PBS轻轻地漂洗细胞，将其与不含添加物的、含有10μg/ml的同种型对照抗体1D5、拮抗型大鼠抗AXL抗体11D5、11B7、6E7或10D12、嵌合抗AXL抗体chn11D5IgG2和chn11B7IgG2、激动型大鼠抗AXL抗体2A1和11D7以及10μg/ml的Erbitux或5μM的Sutent的低血清培养基(RPMI，0.5%FCS)一起温育以进行比较。允许细胞迁移入被清除的区域，进行24小时，用PBS清洗1次，用冰冷的甲醇(100%)在-20℃下固定细胞。在用结晶紫(0.5%于20%甲醇中)对细胞染色后，用水漂洗，然后干燥过夜，拍摄伤口照片。

图9显示对于NCI-H292肺癌细胞的该实验的代表性结果。与同种型对照抗体相比较，本发明的拮抗型大鼠抗AXL抗体11D5、11B7、6E7和10D12以及本发明的嵌合抗AXL抗体chn11D5IgG2和chn11B7IgG2减少了被清除区域的重新进入，然而本发明的激动型大鼠抗AXL抗体2A1和11D7导致伤口的完全闭合。在卵巢癌细胞系SkOv-3或胃癌细胞系MKN-1中对于相同组的抗体观察到相似的结果。

实施例10.本发明的大鼠抗AXL抗体体外抑制配体诱导的NIH3T3-AXL cl.7成纤维细胞的迁移

进行移行实验（transmigration experiment）以研究本发明的抗体是否阻止细胞迁移。为此，在第1天的早晨，将NIH3T3-AXL cl.7细胞于正常生长培养基中接种在15cm培养皿上，在傍晚用低血清培养基(DMEM,0.5%FCS)更换所述培养基以饥饿细胞36小时。第2天，用10μg胶原I/ml 0.1M乙酸在37℃下包被FluoroBlock 96孔板(Becton Dickinson#351164，8μm孔大小)过夜。在第3天，用无血清培养基(DMEM，0%FCS，0.1%BSA)替换低血清培养基(DMEM，0.5%FCS)，进行另外4小时。使用10mM的在PBS中的EDTA收获细胞，以4x10⁵个细胞/ml的细胞密度和10μg/ml的抗体浓度用大鼠抗AXL抗体4A6、11B7或2A1预温育细胞，进行45分钟。然后将50μl细胞悬浮液(20,000个细胞)/孔置于FluoroBlock 96孔板的顶部小室中，在底部小室中每孔使用225μl具有或不具有400ng/ml小鼠Gas6(R&D Systems)的培养基(DMEM，0%FCS，0.1%BSA)。让细胞在37℃下迁移7小时，之后用4.2μM的在PBS，1mM CaCl₂，1mM MgCl₂中的钙黄绿素-AM(Molecular Probes#C3099)在37℃染色1小时。使用Victor板读取器(Perkin Elmer)，在530nm波长处测量各孔的荧光。

图10显示本发明的拮抗型抗AXL抗体11B7减少NIH3T3-AXL cl.7成纤维细胞的基础和Gas6诱导的迁移，然而本发明的激动型大鼠抗AXL抗体2A1增加NIH3T3-AXL cl.7细胞的配体诱导的迁移和特别地基础迁移。抗体4A6不影响细胞迁移。

实施例11.本发明的大鼠抗AXL抗体体外抑制配体诱导的NIH3T3-AXL cl.7成纤维细胞的增殖

进行体外实验以测定本发明的大鼠抗AXL抗体抑制Gas6诱导的细胞增殖的能力。为此，以2,500个细胞/孔将NIH3T3-AXL cl.7成纤维细胞于含有FCS的培养基中接种在96孔板上，进行过夜。第2天，在低血清培养基(DMEM,0.5%FCS)中饥饿细胞10小时，然后用在DMEM,0.5%FCS中的20μg/ml的小鼠对照抗体72A1、拮抗型大鼠抗AXL抗体11D5和11B7以及激动型抗体2A1在37℃下预温育细胞1小时。通过向抗体溶液中直接加入配体，用或不用400ng/ml小鼠Gas6(R&DSystems)处理细胞，然后让细胞生长96小时。加入AlamarBlue^TM(BIOSOURCE#DAL1100)，在黑暗中于37℃下进行温育。每30分钟在590nm处测量吸光度。在加入AlamarBlue^TM后4小时采集数据。

图11显示该实验的代表性结果。本发明的拮抗型抗AXL抗体11D5和11B7阻止Gas6诱导的NIH3T3-AXL cl.7成纤维细胞的增殖，然而本发明的激动型大鼠抗AXL抗体2A1增加NIH3T3-AXL cl.7细胞的配体诱导的增殖和特别地基础增殖。

实施例12.本发明的大鼠抗AXL抗体体外抑制配体介导的血清饥饿的NIH3T3-AXL cl.7成纤维细胞的抗细胞凋亡

细胞凋亡的诱导和胱天蛋白酶的激活可由于多种刺激（包括生长因子撤离、对化疗剂或辐射的暴露或Fas/Apo-1受体介导的细胞死亡过程的起始）而引起。已显示Gas6-AXL相互作用参与保护许多细胞类型免受细胞凋亡，包括血清饥饿的NIH3T3成纤维细胞(Goruppi等人，1996，Oncogene12，471-480)或肺内皮细胞(Healy等人，2001，Am.J.Physiol.，280，1273-1281)。在本实施例中，我们检查本发明的大鼠抗AXL抗体是否干扰Gas6介导的血清饥饿的NIH3T3-AXL cl.7成纤维细胞的抗细胞凋亡，从而诱导细胞凋亡。因此通过测量细胞胱天蛋白酶-3/7活性来测定细胞凋亡率。为此，将NIH3T3-AXL cl.7细胞以1.5x10³个细胞/孔的密度接种在黑色透明底96孔板(100μl/孔)中。第2天，用低血清培养基(DMEM，0.5%FCS)替代正常生长培养基以饥饿细胞过夜，进行24小时。次日，以80μg/ml在DMEM、0%FCS、0.01%BSA中制备同种型对照抗体1D5、拮抗型大鼠抗AXL抗体11B7和11D5以及激动型大鼠抗AXL抗体11D7和2A1的抗体溶液。用PBS清洗细胞，用60μl DMEM，0%FCS，0.01%BSA覆盖细胞，然后加入10μl各抗体溶液。在37℃下温育1小时后，加入10μl具有或不具有3.2μg/ml小鼠Gas6(R&D Systems)的DMEM，0%FCS，0.01%BSA(抗体和Gas6的终浓度分别为10μg/ml和400ng/ml)，将细胞在37℃下温育另外5小时。下列步骤是对Apo-ONE Homogenwous胱天蛋白酶-3/7测定(Promega，G7791)的技术揭示。简而言之，从培养箱中取出培养板，让其在室温下平衡20分钟。将60μl Apo-ONE底物和6ml缓冲液解冻，组合，然后加入至样品中(75μl/孔)。轻轻摇动孔的内容物进行30秒，并且保护其免受光照，在室温下温育1小时。使用Victor板读取器(Perkin Elmer)，在485nm的激发波长和530nm的发射波长处测量各孔的荧光。

图12显示该实验的代表性结果。与同种型对照抗体相比较，本发明的拮抗型大鼠抗AXL抗体11B7和11D5减少了Gas6介导的血清饥饿的NIH3T3-AXL cl.7成纤维细胞的抗细胞凋亡，从而诱导细胞凋亡。相反地，无论Gas6存在与否，本发明的激动型大鼠抗AXL抗体2A1和11D7都强烈地诱导血清饥饿的NIH3T3-AXL cl.7细胞的抗细胞凋亡，从而抑制细胞凋亡。

实施例13.本发明的大鼠抗AXL抗体体外抑制基于球状体的细胞血管生成

AXL是多种血管生成行为（包括内皮细胞迁移、增殖和体外管形成）的关键调节剂(Holland等人，Cancer Res:65，9294-9303，2005)。因此，就对VEGF-A诱导的HUVEC-球状体的血管出芽的抑制作用检测本发明的大鼠抗AXL单克隆抗体11B7和11D5。按照最初公开的方案(Korff和Augustin:J Cell Sci 112:3249-58，1999)的改进方案进行实验。简而言之，如所描述的(Korff和Augustin:J Cell Biol143:1341-52，1998)，通过用移液器将500个人脐静脉内皮细胞(HUVEC)于悬滴中转移至塑料皿上，让其球状聚集过夜来制备球状体。然后将50个HUVEC球状体接种于0.9ml的胶原溶液(2mg/ml)中，并用移液器转移至24孔板的单独的孔中以让其聚合。在聚合前将浓度不断减小的大鼠抗AXL抗体11B7和11D5(1x10^-6M、1x10^-7M、1x10^-8M、1x10^-9M、1x10^-10M)直接混合在胶原溶液中，然而在30分钟后，通过用移液器将100μl的10倍浓缩的工作稀释物转移至聚合的凝胶的顶部来加入生长因子VEGF-A(终浓度25ng/ml)。将板在37℃下温育24小时，然后加入4%的多聚甲醛进行固定。通过图像分析系统定量HUVEC球状体的出芽强度，所述图像分析系统使用倒置显微镜和数字成像软件Analysis 3.2(Soft imaging system，Munster，Germany)测定每球状体的累积出芽长度。分析10个随机选择的球状体的累积出芽长度的平均值，将其作为单个数据点。

图13显示该实验的结果。本发明的拮抗型大鼠抗AXL抗体11B7(A)和11D5(B)在基于球状体的血管生成测定中以剂量依赖性的方式抑制VEGF-A刺激的HUVEC出芽。使用最高浓度的11B7的处理将HUVEC出芽减少至基础水平，然而使用最高浓度的11D5的抑制不如前者有效(左图)。11B7和11D5分别以9.8x10^-8M和7.0x10^-7M的IC₅₀值抑制HUVEC出芽（右图）。

实施例14.本发明的大鼠抗AXL抗体在裸小鼠中减少人前列腺癌生长

通常在人异种移植肿瘤研究中评估治疗性抗体的抗肿瘤功效。在此类模型系统中，人肿瘤在免疫削弱的小鼠中生长为异种移植物，根据肿瘤生长抑制的程度来测量治疗功效。本研究的目的是评估本发明的拮抗型大鼠抗AXL抗体11B7在裸小鼠中是否干扰人前列腺癌细胞的肿瘤生长。简而言之，在第0天，以2l/分钟的氧流速用1.5-2.0体积百分比的异氟醚麻醉7至8周龄的雄性NMRI^-nu/nu小鼠（适应环境后的大致重量：30g），将25μl PBS中的1x10⁶个PC-3-LN细胞同位植入前列腺。PC-3-LN细胞来源于用编码萤光素酶-新霉素融合蛋白的逆转录病毒感染的PC-3前列腺癌细胞系。肿瘤生长的起始和肿瘤生长进展从而可通过体内生物发光成像来测量。为此，将萤光素腹膜内(i.p.)注射入小鼠，注射后10分钟使用NightOWL LB 981生物发光成像系统(Berthold Technologies，Germany)测量光的发射。在第一处理之前，将小鼠随机化，并且进行统计检验以确保处理组（每组10只动物）间起始肿瘤体积（平均值、中值和标准差）的一致性。在第8天，开始所有处理并且持续直至第34天，然后在第35天进行尸体剖检。每周3次(周一、周三、周五)分别将25mg/kg的同种型对照抗体1D5和拮抗型大鼠抗AXL抗体11B7腹膜内(i.p.)施用入组1和2的动物。组3的动物每天1次口服(p.o.)接受40mg/kg Sutent。组4的动物接受3次使用12.5mg/kg的Taxotere的静脉内(i.v.)注射(彼此间隔4天)。下面给出治疗组的概述。

图14显示该实验的结果。与同种型对照抗体1D5相比较，本发明的拮抗型大鼠抗AXL抗体11B7在裸小鼠中减少了PC-3-LN前列腺肿瘤的总体生长。

实施例15.本发明的大鼠抗AXL抗体抑制人前列腺癌的转移

在与在“本发明的大鼠抗AXL抗体在裸小鼠中减少人前列腺癌生长”下所描述的相同的实验中，在尸体剖检后分析PC-3-LN肿瘤细胞至其他器官内的再定位(转移)以评估本发明的拮抗型大鼠抗AXL抗体11B7的抗转移作用。为此，在尸体剖检后收集选择的器官(肝、脾、肺、股骨、部分的腰部脊柱)，将其匀浆，并且补充以萤光素。随后，使用NightOWL LB 981生物发光成像系统(Berthold Technologies，Germany)测量光的发射。

图15显示该实验对于脾的分析的结果。与同种型对照抗体1D5相比较，本发明的拮抗型大鼠抗AXL抗体11B7减少了脾转移的发生。值得注意的是，该实验中11B7的抗转移作用比Sutent的抗转移作用强。对于肝、肺、股骨和腰部脊柱转移获得相似的观察结果。

实施例16.AXL主要在肿瘤而非相邻正常组织中表达

在本研究中，以组织多阵列形式在福尔马林固定的石蜡包埋的组织上对17个不同人恶性肿瘤中的AXL表达进行免疫组织化学分析。对于各肿瘤类型，检查成对的肿瘤组织和匹配的非恶性组织。简而言之，将组织在4%的中性缓冲的福尔马林中固定16至20小时，然后包埋在石蜡中。为了构建60-核组织微阵列(TMA)，由病理学家选择各病例的一个穿孔的健康组织和一个穿孔的相应肿瘤组织。根据FDA指南产生具有正常对照组织穿孔(每一个组织类型3个)的96核TMA。各穿孔直径为1.5mm。

使用切片机，将选择的组织块切成2-4μm的切片，将切片置于硅烷化的载玻片(Sigma)上，然后在60℃下干燥30分钟和在38℃下干燥过夜。通过在二甲苯浴中温育5分钟2次，在丙酮中温育5分钟2次和最终在蒸馏水中温育5分钟来使切片脱蜡。在蒸气发生器中于10mM柠檬酸盐缓冲液，pH6.0中进行切片的热预处理，进行30分钟，然后在蒸馏水中进行清洗。通过在室温下用新制备的0.3%的在甲醇中的H₂O₂溶液温育20分钟来封闭内源过氧化物酶，然后用蒸馏水和PBS进行清洗，每次5分钟。用多克隆山羊抗人AXL抗体(Santa CruzSC-1096)(以1:20稀释于TBST中)在室温下温育切片，进行60分钟。在于TBST中清洗3次后，用生物素化的兔抗山羊二抗(Dianova,以1:200稀释于TBST中)在室温下温育切片45分钟。在如之前一样进行清洗后，用链霉抗生物素蛋白/HRP(DAKO，以1:300稀释于TBST中）在室温下温育切片30分钟，然后如之前一样进行清洗。用DAB溶液(DAKO;以1:50稀释于底物缓冲液中)在室温下染色10分钟。最后，用水漂洗载玻片，用Harris'苏木精进行复染，然后用载玻片覆盖。用山羊IgG对照抗体(R&D)而非抗AXL一抗温育对照切片。

图16概述了关于17个不同人实体瘤和相应非恶性组织中的AXL表达的该分析的结果（A）。在就各指征进行筛选的所有病例中，在滤泡性淋巴瘤、前列腺癌(除了单个细胞外)中和在肾癌中没有检测到明显的表达。黑色素瘤和Merkel细胞肿瘤显示非常低的AXL表达。在少数肺的肿瘤，主要地腺癌中观察到微弱的表达。食管和巴雷特肿瘤、卵巢、结肠和胰腺肿瘤以及肝肿瘤(肝细胞癌)在大约30%的病例中显示微弱的染色。头颈肿瘤在大约40%的肿瘤中显示微弱至中度的染色。在60%至100%的分析的乳腺、宫颈、膀胱、甲状腺和胃的肿瘤中检测到微弱至中度的染色。在乳房肿瘤和胃的印戒细胞癌中观察到最强的染色(B)。除了有时显示高于背景的微弱染色的肾小管外，非恶性组织大部分不显示特异性染色。

实施例17:抗AXL抗体的结构和特征

17A.大鼠抗体可变结构域的核苷酸序列

从杂交瘤细胞克隆大鼠抗AXL抗体可变结构域。使用RNA提取试剂盒RNeasy(RNeasy midi-kit，Qiagen)制备RNA。按照厂商的说明书使用5'RACE试剂盒(Invitrogen)制备编码抗体基因的cDNA。

简而言之，使用基因特异性GSP1引物和Superscript^TMII逆转录酶从总RNA合成第一链cDNA。在第一链cDNA合成后，通过用RNA酶混合物（RNase Mix）处理除去原始mRNA模板。然后向cDNA的3'末端添加同聚体尾。使用Taq DNA聚合酶、与位于cDNA分子内的位点退火的嵌套基因特异性引物(GSP2)和试剂盒提供的锚定引物进行PCR扩增。在扩增后，将5'RACE产物克隆入pLXSN-ESK载体以进行测序。为了促进克隆，锚定引物(AP)包含Sal I的识别序列，GSP2引物包含XhoI位点。

GSP1引物：

kappa_GSP1:GATGGATGCATTGGTGCAGC

new_kappa_GSP1：ATAGATACAGTTGGTGCAGC

heavy_GSP1:CAGGGTCACCATGGAGTTA

GSP2引物:

Xhol-hGSP2:CCGCTCGAGCGGGCCAGTGGATAGACAGATGG

XhOl-kGSP2:CCGCTCGAGCGGCCGTTTCAGCTCCAGCTTGG

将GSP引物用于大鼠抗AXL Mab克隆：

11B7:kappa GSP1；Xhol-kGSP2

heavy GSP1;Xhol-hGSP2

10D12:kappa_GSP1，new_kappa_GSP1;Xhol-kGSP2

heavy GSP1:Xhol-hGSP2

11D5：new_kappa_GSP1;Xhol-kGSP2

heavy GSP1;Xhol-hGSP2

17B.大鼠抗AXL抗体可变结构域的氨基酸序列

从克隆入pLXSN-ESK载体的经测序的基因翻译大鼠抗体可变结构域序列。给出的氨基酸序列始于可变结构域的位点1。根据Kabat(Kabat等人Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版.NIH Publication No.91-3242，1991)定义抗体特异性结合其靶所需的互补决定区（CDR）。Kabat定义基于可变结构域内的序列变异性。抗体的抗AXL特异性CDR区域列于SEQ ID NO:13-30中。单独的CDR包括下列位点：

CDR-L1:24-34

CDR-L2:50-56

CDR-L3:89-97

CDR-H1:31-35b

CDR-H2:50-65

CDR-H3:95-102

17C大鼠抗体的表达和纯化：

在Celline CL 1000生物反应器(Integra Biosciences)中使用DMEM（含有4.5g/L葡萄糖;1%谷氨酰胺，1%丙酮酸盐，1%青霉素/链霉素）在37℃，5-7%CO₂下培养杂交瘤。FCS补充物是用于营养小室的1%FCS和用于细胞小室的5%的低IgG FCS。每周2次进行收获和培养基更换。细胞分裂1/1->1/3取决于细胞生长。每周1次通过SDS-PAGE分析检测生产率。将上清液贮存于-20℃下直至进行纯化。每周1次进行工作培养物的支原体（Mycoplasma）检查。

通过Explorer100系统(GE-Healthcare)使用蛋白A或G琼脂糖FF(GE-Healthcare)纯化抗体。对于各纯化，单独地填充柱子。将柱子大小调整至各批次的预期的生产率和大小（通常50-500mg)。在可能的情况下将含有蛋白质的溶液保持在冰上或4℃下。在整个过程中使用无菌缓冲液和双蒸水。

将上清液解冻，用50mM TRIS pH8.5进行缓冲，离心，通过0.22μm膜过滤，然后将其装载至柱子上。在用8倍柱体积(CV)的50mM PO₄，pH8.5清洗后，将抗体洗脱在10CV 100mM甘氨酸，pH3.3中。立即通过加入1/5 1M Tris pH 8.0(1ml Tris/4ml洗脱级分)将洗脱级分再缓冲至中性pH，然后利用rSDS-PAGE进行分析。混合含有纯抗体的级分，在4℃下对PBS进行透析，然后无菌过滤。

根据各抗体的单独的性质调整缓冲系统的要求。特别地，将大鼠IgG2a抗体11D5结合至ProteinG4FF基质(GE-Healthcare)，在高盐(2M NaCl)条件下进行清洗。在根据11D5的高盐条件下通过rProteinA(GE-Healthcare)纯化大鼠抗体IgG1 11B7。在pH5.5下进行抗体洗脱。大鼠抗体纯化的流速必须保持较低以增加结合效率。

作为第二纯化步骤，可进行离子交换层析(在单独的、合适的条件下)或制备型尺寸排阻层析(PBS，pH7.4)。

用于纯化的抗体的质量控制的标准方案包括：

●rSDS-PAGE凝胶分析；考马斯染色或银染

●BCA检测(Pierce#23227 BCA Protein Assay Kit;大鼠IgG标准#31233)

●分析型尺寸排阻(Superdex 200 Tricorn 10/300GL，～250mg于250μl中;0.5ml/分钟，Explorer100)

●内毒素检测(LAL，CambrexChromogenic LALEndpoint Assay # US50-648U)

●基于细胞的活性测定(FACS结合;pAkt;pAXL)

取决于它们的稳定性，在无菌条件下在4℃或-20℃下将纯化的抗体贮存在PBS，pH7.4中。

17D.通过FACS scatchard进行的抗体亲和力测定

通过用10mM的在PBS中的EDTA温育来收获过表达人AXL的NIH3T3细胞，以6百万个细胞/ml将其重悬浮于FACS缓冲液(PBS pH7.4，3%FCS，0.1%NaN₃)中。在圆底微量滴定板中，向100μl的在FACS缓冲液中以40至0.002μg/ml(266至0.01nM)的浓度含有抗体11B7、11D5、ch11B7-IgG2或ch11D5-IgG2的抗体溶液中加入100μl细胞悬浮液。让抗体结合在冰上进行2小时。然后，用250μl FACS缓冲液/孔清洗细胞2次，将其重悬浮于200μl以1:50稀释于FACS缓冲液中的二抗(抗大鼠-PE;Jackson)中。在温育45分钟后，在FACS缓冲液中再清洗细胞2次，然后重悬浮于500ml PBS中以用于FACS分析。在Beckman-Coulter FACS FC500上进行分析。为了测定表观亲和常数K_Dapp，将平均荧光值针对平均荧光与相应抗体浓度([M])的比作图。由直线的斜率倒数（inverse slope）计算的K_Dapp列于下面：

克隆
		11B7	0.38
Ch11B7-IgG2	0.6

11D5	0.81
		Ch11D5-IgG2	0.9

18.大鼠抗AXL抗体的嵌合化（chimerization）：

如下所述从人志愿者的外周血单核细胞（PBMC）克隆人κ轻链和重链IgG 1/2基因：

从全血制备PBMC。将血液在室温下于具有10U/ml肝素的PBS/2mMEDTA中稀释1/2,5，在由膈膜（diaphragm）覆盖的15ml Biocoll溶液(35ml/管)[来自Biochrom#L6115的Biocoll]的上方分层。以400xg在室温下离心样品30分钟，弃去血清(大约15ml)。使用Pasteur移液器小心地回收含有PBMC的界面。将PBMC在PBS/2mM EDTA中清洗2次(第一次清洗100ml,第二次清洗50ml)，以300xg离心10分钟。将细胞沉淀重悬浮于RPMI/10%FCS(25ml)中，产生5.5x10⁷个PBMC。

根据厂商的说明书，使用来自Qiagen(#75142)的RNeasy试剂盒从PBMC制备RNA。将纯化的RNA(30μg)以等分在-80℃下贮存。

按照厂商说明书，使用下列引物，利用Superskript III逆转录酶(invitrogen#18080-93)通过RT-PCR从分离的RNA制备抗体IgGγ1和2以及κ链的cDNA：

1)RT-γ:GCG TGT AGT GGT TGT GCA GAG

2)RT-γ2:GGG CTT GCC GGC CGT G

3)RT-κ:TGG AAC TGA GGA GCA GGT GG

4)5'Blp:AGA TAA GCT TTG CTC AGC GTC CAC CAA GGG CCC ATCGGT

5)3'Bam(GAG):AGA TGG ATC CTC ATT TAC CCG GAG ACA GGG AGAG

6)5'Bsi:AGA TAA GCT TCG TAC GGT GGC TGC ACC ATC TGT CTTCAT

7)3'Bam(CTT):AGA TGG ATC CCT AAC ACT CTC CCC TGT TGA AGCTCT

将引物溶解为100μM。分别使用2pmol oligo RTγ和RTκ，加入1μg RNA，10mM dNTP混合物并且加热5分钟至65℃来进行RT-PCR反应。加入4μl第一链缓冲液，1μl 0.1M DTT，1μl RNA酶抑制剂(40U/μl Fermentas#EO0311)和2μl Superscript III RT，混合，然后在50℃下温育1小时，然后在70℃下进行热灭活步骤15分钟。

使用Taq聚合酶(Eurochrom#EME010001)将2μl的第一链反应物用于第二步骤PCR以产生抗体恒定结构域的双链DNA。使用下列PCR设置将引物5'Blp和3'Bam(GAG)用于扩增γ-链，且将5'Bsi和3'Bam(CTT)用于扩增κ-链恒定区：

κ-链扩增:

94℃ 120秒

94℃ 30秒

55℃ 30秒

72℃ 45秒，循环35次

72℃ 10分钟

γ-链扩增：

94℃ 120秒

94℃ 30秒

45℃ 30秒

72℃ 60秒，循环5次

94℃ 30秒

50℃ 30秒

72℃ 60秒，循环35次

72℃ 10分钟

在TAE缓冲的2%琼脂糖凝胶上分析PCR产物。发现大约350bp的单个条带（对于κ轻链）和大约1000bp的单个条带（对于重链γ1和γ2）。按照厂商的说明书，利用Qiagen凝胶提取试剂盒(QIAGEN，#28784)纯化PCR产物。为了将PCR片段克隆入pcDNA3载体(Invitrogen)的多克隆位点，用HindIII(5')和BamHI(3')限制性核酸内切酶降解pcDNA3载体和PCR片段。将限制性位点编码在PCR引物内。使用Qiagen PCR纯化试剂盒(QIAGEN，28104)纯化降解的片段，使用T4DNA连接酶在16℃下将编码γ1、γ2和κ链的DNA连接入pcDNA3载体，进行过夜。将连接酶在65℃下灭活10分钟。使用标准方案将连接的DNA质粒直接转化入CaCl₂感受态大肠杆菌，将其涂板至含有氨苄青霉素的LB平板上。在37℃下温育过夜后，挑选单个集落，将其悬浮于10μl H₂O中，并且通过PCR(5μl悬浮的细胞，Taq聚合酶，引物5Blp和3Bam(GAG)γ1/γ2以及5Bsi和3Bam(CTT)（对于κ集落）)就包含含有各抗体链的质粒验证所述集落：

94℃ 120秒

94℃ 30秒

55℃ 30秒

72℃ 60秒，循环35次

72℃ 10分钟

就PCR产物在1.5%琼脂糖凝胶上分析样品。选择含有抗体基因的集落以接种5ml LB/氨苄青霉素培养基。在37℃下温育过夜后，收获大肠杆菌，使用Qiagen miniprep试剂盒(QIAGEN，#12123)制备DNA。对照降解物(HindIII，BamHI)在预期的大小上显示所有κ和γ链基因插入物；通过在Medigenomix上测定DNA序列来验证序列。

通过PCR从pLXSN-ESK载体扩增大鼠可变结构域，然后将其克隆入g1/g2和k pcDNA3载体以产生嵌合的全长抗体。使用下列引物（其在5'末端包含HindIII和BsmI位点且在3'末端包含BsiWI位点）扩增可变VL结构域：

VL-11B7-5′：AGA TAA GCT TGT GCA TTC CGA CAT CCACAT GAC CCA GGC TCC

VL-11B7-3′：AGA TCG TAC GTT TCA GCT CCA GCT TGGTGC CTC

VL-11D5-5′：AGA TAA GCT TGT GCA TTC CGA CAT CCAGAT GAC CCA GTC TCC ATC

VL-11DS-3′：AGA TCG TAC GTT TCA GCT TGG TCC CAG

使用下列引物（其在5'末端包含HindIII和BsmI位点且在3'末端包含BlpI位点）扩增可变VH结构域：

VH-11B7/11D5-5′：AGA TAA GCT TGT GCA TTC CGA GGT GCAGCT TCA GGA GTC AGG

VH-11B7/11D5-3′：AGA TGC TGA GCT GAC AGT GAC CAT GACTCC TTG GCC

轻链的BsiWI和重链的BlpI是恒定区的5'末端上的单个位点，其使得能够与可变结构域基因的3'末端直接融合。

将融合至来源于pLNOH2载体(Norderhaug等人.J.Immunol.Methods 204，1997;Neuberger EMBO J.1983;2(8):1373-8,1983)的前导序列SEQ ID No:69的编码嵌合抗体链的基因克隆入pCEP载体系统以进行重组表达。将轻链基因在NheI(5')与XhoI(3')之间克隆入pCEP4(Invitrogen)，将重链基因在KpnI(5')与XhoI(3')之间克隆入pCEP-Pu(Kohfeld FEBS第414卷;(3)557ff，1997)。

使用标准CaPO₄转染法，用1μg/ml的编码轻链和重链基因的各质粒共转染接种在20x20cm平板中的HEK293细胞以进行瞬时表达。培养条件为37℃，5%CO₂于DMEM/F12高葡萄糖培养基（含有5%的低IgG FCS，1%丙酮酸，1%谷氨酰胺，1%青霉素/链霉素）中。转染后24小时，用新鲜培养基替换培养基。每2至3天收集上清液，进行大约3周。如对于大鼠抗体纯化所描述的，在标准缓冲液条件(装载:50mMTris;pH=8.5，清洗:50mM PO₄;pH=8.5，洗脱:100mM甘氨酸;pH3,3)下使用1ml Hitrap rProtein A柱子(GE-Healthcare)从大约600ml上清液纯化嵌合抗体。

实施例19.大鼠抗AXL抗体可变结构域的人源化

通过BLAST搜索免疫球蛋白结构域在蛋白质水平上将嵌合抗体的大鼠可变区与人抗体种系序列相比较。鉴定了V基因内最接近的人对应物，此外其具有相同的CDR环长度。在类似的方法中，根据它们与大鼠序列的同源性从V-BASE数据库(http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/)选择相关的D和J区段。

对于11B7和11D5抗体的大鼠可变结构域，发现下列最佳拟合的人种系序列(V、D和J区段)，并且将其定义为人构架：

VL11B7hum:Vκ1-O12+Jk1

VH11B7hum:VH4-59+D4-4(阅读框架3)+JH4

VL11D5hum:Vκ1-L1+Jκ4

VH11D5hum:VH4-59+D4-4(阅读框架3)+JH4

人源化的可变结构域的前导序列采用选择的相关种系V-基因序列。针对抗AXL特异性，将根据Kabat(Kabat等人，Sequences ofProteins of Immunological Interest，第5版.NIH Publication No.91-3242，1991)定义的大鼠抗AXL抗体的CDR残基移植入人种系构架以获得抗AXL抗体的最终的人源化形式hum11B7和hum11D5。

人源化的抗AXL抗体hum11B7和hum11D5的蛋白质序列如下：

将蛋白质序列回译成DNA序列。使用Kazusa-Codon-Usage数据库对DNA序列进行密码子最优化以在哺乳动物细胞中进行重组表达。所得的人源化的抗AXL抗体的DNA序列如下：

通过基于交叠寡核苷酸的PCR法合成编码人源化的抗AXL抗体的最优化的DNA序列。

使用嵌合抗体构建体pCEP4_ch11B7k1的质粒将VL基因克隆入pCEP4载体。克隆位点是NheI(5')和BsiWI(3')，其也包括在人源化的抗体的合成基因中。使用KpnI(5')和BlpI(3')作为限制性位点将VH基因克隆入相应的嵌合重链载体pCEP-PU_ch11B7g1内。在EurofinsMedigenomix GmbH，Martinsried，Germany上进行DNA最优化、基因合成、克隆和序列验证。

实施例20.本发明的大鼠和嵌合抗Axl抗体体外抑制配体诱导的Axl磷酸化至相似的程度

作为本发明的部分，产生大鼠抗Axl抗体11B7和11D5的嵌合衍生物（参见下文）。为了研究本发明的大鼠抗Axl抗体和本发明的相应的嵌合抗Axl抗体是否能够体外抑制配体Gas6介导的Axl激活至相似的程度，对CaSki宫颈癌细胞进行ELISA实验。从而通过增加的受体酪氨酸磷酸化检测Gas6介导的Axl激活。简而言之，在第1天，将3x10⁴个细胞/孔于正常生长培养基中接种在平底96孔板中。第二天，用无血清培养基替换生长培养基以饥饿细胞过夜，进行24小时。同样地，用2μg/ml的在PBS中的小鼠抗磷酸-酪氨酸抗体4G10在4℃下包被Maxi-Sorp 96孔板（Nunc），进行过夜。在第3天，除去4G10抗体溶液，用PBS，0.5%BSA在室温下封闭Maxi-Sorp孔，进行至少4小时。平行地，用50ng/ml、100ng/ml、300ng/ml、750ng/ml、1μg/ml和10μg/ml的大鼠抗Axl抗体11B7或嵌合抗Axl抗体ch11B7在37℃下预温育细胞1小时，然后用或不用400ng/ml Gas6(R&D Systems)在37℃下处理10分钟。然后弃去培养基，在冰上于补充有磷酸酶和蛋白酶抑制剂(10mM Na₄P₂O₇，1mM苯甲基磺酰氟，1mM原钒酸盐，1mM NaF和0.5%抑肽酶)的裂解缓冲液(50mM HEPES，pH7.5，150mM NaCl，1mM EDTA，10%甘油和1%Triton X-100)中裂解细胞30分钟。同时除去封闭缓冲液，在将裂解物转移和于4℃下温育过夜之前，用清洗缓冲液(PBS,0.05% Tween 20)清洗Maxi-Sorp板6次。在第4天用清洗缓冲液清洗板6次后，在室温下用0.5μg/ml的在PBS中的生物素化的大鼠抗Axl抗体12B7温育孔2小时。用清洗缓冲液清洗板6次，向各孔中加入以1:4,000稀释于PBS中的AP缀合的链霉抗生物素蛋白(Chemicon#SA110)，在室温下温育30分钟。之后，用清洗缓冲液清洗孔6次，加入AttoPhos底物溶液(Roche#11681982)。使用Victor板读取器(Perkin Elmer)，在430nm的激发波长和580nm的发射波长处收集各孔的荧光。

图17显示对于宫颈癌细胞系CaSki的本实验的代表性结果。如通过相对Axl磷酸化的浓度依赖性减少所证明的，本发明的大鼠抗Axl抗体11B7(A)和嵌合抗Axl抗体ch11B7(B)能够阻止配体诱导的受体酪氨酸激酶Axl的激活至相似的程度。对于黑色素瘤细胞系C-8161，使用相同的实验设置观察到相当的作用。

实施例21.本发明的大鼠和嵌合抗Axl抗体体外抑制配体诱导的p42/p44MAP-激酶磷酸化至相似的程度

为了另外地验证本发明的大鼠抗Axl抗体和本发明的相应嵌合抗Axl抗体是否也能够抑制CaSki宫颈癌细胞中Gas6诱导的p42/p44MAP-激酶的激活至相似的程度，进行ELISA实验。此处，通过增加的蛋白质(Thr202/Tyr204)磷酸化检测Gas6诱导的p42/p44MAP-激酶的激活。简而言之，在第1天，将2x10⁴个细胞/孔接种在平底96孔板中。第二天，用无血清培养基替换正常生长培养基以饥饿细胞24小时。之后，用50ng/ml、100ng/ml、300ng/ml、750ng/ml、1μg/ml和10μg/ml的大鼠抗Axl抗体11B7或嵌合抗Axl抗体ch11B7在37℃下预温育细胞1小时，然后用或不用400ng/ml Gas6(R&D Systems)在37℃下处理10分钟。弃去培养基，用4%的在PBS(pH7.5)中的甲醛在室温下固定细胞30分钟。除去甲醛溶液，用清洗缓冲液(PBS,0.1%Tween20)清洗细胞2次。用清洗缓冲液中的1%H₂O₂，0.1%NaN₃猝灭细胞，在室温下温育20分钟。之后，除去猝灭溶液，用清洗缓冲液清洗细胞2次，然后用PBS，0.5%BSA在室温下进行封闭，进行4小时。加入以1:1,000稀释于PBS，0.5%BSA，0.05%Tween20，5mM EDTA中的抗磷酸-p42/p44MAP激酶(Thr202/Tyr204)一抗(多克隆兔;CellSignaling #9101)，在4℃下过夜。在第4天，除去抗体溶液，用清洗缓冲液清洗板3次。然后向各孔中加入以1:2,500稀释于PBS，0.5%BSA，0.05%Tween20，5mM EDTA中的HRP缀合的抗兔二抗（Dianova#111-036-045），在室温下温育1.5小时。用清洗缓冲液清洗板3次，每次5分钟。加入四甲基联苯胺(TMB，Calbiochem)，在620nm处进行监控。通过加入100μl250nM HCl终止反应，使用Vmax板读取器(Thermo Lab Systems)，在450nm处(620nm的参照波长)读取吸光度。

图18显示本实验的代表性结果。本发明的大鼠抗Axl抗体11B7(A)和嵌合抗Axl抗体ch11B7(B)能够阻止CaSki宫颈癌细胞中Gas6诱导的p42/p44MAP-激酶的激活至相似程度，如通过相对p42/p44MAP-激酶的磷酸化的浓度依赖性减少所显示的。

实施例22.本发明的大鼠抗Axl抗体与化疗剂协同作用以在体外克服抗药性

由于本发明的大鼠抗Axl抗体本身干扰Gas6-介导的血清饥饿的NIH3T3-Axl cl.7成纤维细胞的抗细胞凋亡，因此产生了这样的问题：拮抗型抗Axl抗体是否与化疗剂协同诱导细胞凋亡，从而促进克服抗药性。在本实施例中，将NCI/ADR-RES(原先称为MCF-7/AdrR)细胞--展示高水平的对几种试剂包括多柔比星的抗性(Fairchild等人，1987，Cancer Research，47，5141-5148;Xu等人，2002，The Journalof Pharmacology and Experimental Therapeutics，302，963-971)的卵巢癌细胞系(Liscovitch和Ravid，2007，Cancer Letters，245，350-352)--与拮抗型抗Axl抗体11B7和/或多柔比星一起温育，并通过TUNEL染色测定细胞凋亡比率。简而言之，以3x10⁴个细胞/孔将NCI/ADR-RES细胞于正常生长培养基中接种在用相同培养基在37℃下预温育1小时的8室培养载玻片(BD Falcon，cat#354118)上。第2天早晨，除去正常生长培养基，用低血清(0.5%FCS)培养基清洗细胞并在其中进行培养。在傍晚，以各自10μg/ml的终浓度加入同种型对照抗体1D5或拮抗型抗AXL抗体11B7。在第3天的早晨，以100μM、150μM或200μM的终浓度加入柔比星，将细胞在37℃下进行温育。24小时后，用PBS漂洗细胞1次，用4%的在PBS(pH7.5)中的甲醛在室温下固定20分钟，风干5分钟，然后于-20℃下贮存。使用可商购获得的Fluorescein-FragEL^TM试剂盒(Oncogene，cat#QIA39，目前通过Merck-Calbiochem分销)，按照提供商的手册说明书(章节'Fluorescein-FragEL^TM of cell preparations fixed on slides'，第10页)进行TUNEL染色。应用荧光显微镜，分析细胞并且进行照相。

图19显示本实验的代表性结果。对于用100μM多柔比星处理的NCI/ADR-RES卵巢癌细胞，无论将细胞与对照抗体共温育还是与拮抗型抗Axl抗体11B7(上图)共温育，都没有观察到TUNEL染色，从而没有观察到细胞凋亡。然而，在150μM多柔比星的浓度上，在用对照抗体共处理的细胞中只检测到极弱的细胞凋亡，然而与拮抗型抗Axl抗体11B7的共温育导致细胞凋亡的显著诱导(中图)。同样,在200μM多柔比星存在的情况下，与和对照IgG抗体一起温育的细胞相比较，细胞与11B7的共温育也显著地增加细胞凋亡比率（下图），这表明用化疗剂和本发明的拮抗型抗Axl抗体共处理甚至多抗药性细胞可适用于克服抗药性。

实施例23.本发明的大鼠抗Axl抗体与化疗剂在体外协同减少锚定不依赖性集落的生长

进行软琼脂测定以研究本发明的抗Axl抗体单独地或与化疗剂组合地抑制锚定不依赖性细胞的生长的能力。软琼脂集落形成测定是检测转化的细胞的标准体外测定，因为只有转化的细胞才能够在软琼脂上生长。

简而言之，750个C-8161黑色素瘤细胞保持未处理或用15μg/ml的在IMDM培养基(Gibco)中的拮抗型大鼠抗Axl抗体11B7在37℃下预温育30分钟。然后，将细胞与Difco诺布尔琼脂溶液组合，从而产生50μl的顶层琼脂细胞悬浮液，琼脂、FCS和11B7的浓度分别为0.35%、0.2%和7.5μg/ml。将该细胞悬浮液涂板在50μl的含有20%FCS的0.7%的琼脂糖底层的顶部，最后用另外50μl滋养层溶液（其含有0.2%FCS及相应浓度的顺铂）覆盖。在总共150μl/样品中，11B7和顺铂的终浓度分别为2.5μg/ml和1.5μM、1.0μM、0.75μM、0.5μM或0.25μM。让集落形成5天，然后用50μl MTT(Sigma,1mg/ml于PBS中)在37℃下染色3小时。使用与HTS Bonit集落形成软件(Lemnatec，Wuerselen)组合的Scanalyzer HTS照相系统，以一式三份重复分析在顺铂不存在或存在的情况下拮抗型大鼠抗Axl抗体11B7的作用。

图20显示该实验的代表性结果。提供的数据是集落的总体面积并且反映测量的绝对数量(A)和由顺铂和/或拮抗型大鼠抗Axl抗体11B7产生的相对生长抑制(B)。与未处理的对照细胞相比较，与顺铂一起的温育以剂量依赖性的方式导致集落生长迟滞。与单独的11B7在30%的范围内的抑制作用相一致，与拮抗型抗Axl抗体11B7的组合导致显著增强的顺铂（特别地较低浓度的顺铂）对C-8161黑色素瘤细胞的软琼脂生长的抑制作用。

实施例24.本发明的大鼠抗Axl抗体与抗肿瘤剂协同减少肿瘤相关现象

在前述实施例中，关于在多抗药性癌细胞例如卵巢癌细胞系NCI/ADR-RES中诱导细胞凋亡和克服抗药性，已观察到本发明的拮抗型抗Axl抗体与多柔比星的共施用的协同作用。此外，使用黑色素瘤细胞系C-8161检测到本发明的拮抗型抗Axl抗体与顺铂在减少锚定不依赖性集落生长中的组合作用。因此，当将拮抗型抗Axl抗体与辐照和/或一种或多种另外的抗肿瘤剂组合治疗癌细胞或患有癌症疾病的患者时，预期在诱导肿瘤细胞的细胞凋亡和/或克服其抗药性、抑制肿瘤细胞存活、抑制肿瘤细胞生长和/或增殖、减少肿瘤细胞迁移、扩散和转移或削弱肿瘤血管生成中产生协同作用。特别地，当将拮抗型抗Axl抗体与辐照和/或任何另外的抗肿瘤剂（其优选但不限于顺铂、达卡巴嗪、替莫唑胺/temodal、武活龙（muphoran）/福莫司汀、紫杉醇或多西他赛）组合治疗黑色素瘤细胞或患有黑色素瘤的患者时，预期在诱导肿瘤细胞的细胞凋亡和/或克服其抗药性、抑制肿瘤细胞存活、抑制肿瘤细胞生长和/或增殖、减少肿瘤细胞迁移、扩散和转移或削弱肿瘤血管生成中产生协同作用。此外，当将拮抗型抗Axl抗体与辐照和/或任何另外的抗肿瘤剂（其优选但不限于多柔比星、顺铂、卡铂、紫杉醇、多西他赛、美法仑、六甲蜜胺(altretamine)、拓扑替康、异环磷酰胺、依托泊苷或5-氟尿嘧啶）组合治疗卵巢癌细胞或患有卵巢癌的患者时，预期在诱导肿瘤细胞的细胞凋亡和/或克服其抗药性、抑制肿瘤细胞存活、抑制肿瘤细胞生长和/或增殖、减少肿瘤细胞迁移、扩散和转移或削弱肿瘤血管生成中产生协同作用。此外，当将拮抗型抗Axl抗体与辐照和/或任何另外的抗肿瘤剂（其优选为但不限于米托蒽醌、多柔比星、紫杉醇、多西他赛或长春碱）组合治疗前列腺癌细胞或患有前列腺癌的患者时，预期在诱导肿瘤细胞的细胞凋亡和/或克服其抗药性、抑制肿瘤细胞存活、抑制肿瘤细胞生长和/或增殖、减少肿瘤细胞迁移、扩散和转移或削弱肿瘤血管生成中产生协同作用。此外，当将拮抗型抗Axl抗体与辐照和/或任何另外的抗肿瘤剂（其优选但不限于5-氟尿嘧啶、丝裂霉素C、顺铂、多柔比星、甲氨喋呤、依托泊苷、亚叶酸钙（leucovorin）、表柔比星、紫杉醇、多西他赛或伊立替康）组合治疗胃部/胃癌细胞或患有胃部/胃癌的患者时，预期在诱导肿瘤细胞的细胞凋亡和/或克服其抗药性、抑制肿瘤细胞存活、抑制肿瘤细胞生长和/或增殖、减少肿瘤细胞迁移、扩散和转移或削弱肿瘤血管生成中产生协同作用。此外，当将拮抗型抗Axl抗体与辐照和/或任何另外的抗肿瘤剂（其优选但不限于多柔比星、表柔比星、紫杉醇、多西他赛、环磷酰胺、5-氟尿嘧啶、吉西他滨、卡培他滨、长春瑞滨或曲妥珠单抗）组合治疗乳腺癌细胞或患有乳腺癌的患者时，预期在诱导肿瘤细胞的细胞凋亡和/或克服其抗药性、抑制肿瘤细胞存活、抑制肿瘤细胞生长和/或增殖、减少肿瘤细胞迁移、扩散和转移或削弱肿瘤血管生成中产生协同作用。此外，当将拮抗型抗Axl抗体与辐照和/或任何另外的抗肿瘤剂（其优选但不限于顺铂、异环磷酰胺、伊立替康、5-氟尿嘧啶、紫杉醇、多西他赛、吉西他滨或拓扑替康）组合治疗宫颈癌细胞或患有宫颈癌的患者时，预期在诱导肿瘤细胞的细胞凋亡和/或克服其抗药性、抑制肿瘤细胞存活、抑制肿瘤细胞生长和/或增殖、减少肿瘤细胞迁移、扩散和转移或削弱肿瘤血管生成中产生协同作用。此外，当将拮抗型抗Axl抗体与辐照和/或任何另外的抗肿瘤剂（其优选但不限于吉西他滨、卡培他滨或5-氟尿嘧啶）组合治疗胰腺癌细胞或患有胰腺癌的患者时，预期在诱导肿瘤细胞的细胞凋亡和/或克服其抗药性、抑制肿瘤细胞存活、抑制肿瘤细胞生长和/或增殖、减少肿瘤细胞迁移、扩散和转移或削弱肿瘤血管生成中产生协同作用。最后，但不排除其他癌症类型，当将拮抗型抗Axl抗体与辐照和/或任何另外的抗肿瘤剂（其优选但不限于顺铂、卡铂、多柔比星、紫杉醇、多西他赛、依托泊苷、长春瑞滨、长春新碱、异环磷酰胺、吉西他滨、甲氨蝶呤、环磷酰胺、洛莫司汀或拓扑替康）组合治疗肺癌细胞或患有肺癌的患者时，预期在诱导肿瘤细胞的细胞凋亡和/或克服其抗药性、抑制肿瘤细胞存活、抑制肿瘤细胞生长和/或增殖、减少肿瘤细胞迁移、扩散和转移或削弱肿瘤血管生成中产生协同作用。

Claims (35)

1.结合AXL的细胞外结构域并且至少部分地抑制AXL活性的单克隆抗体，其重链包含：

(a)SEQ ID NO:16中显示的CDRH1，

(b)SEQ ID NO:17中显示的CDRH2，和

(c)SEQ ID NO:18中显示的CDRH3，

且其轻链包含：

(d)SEQ ID NO:13中显示的CDRL1，

(e)SEQ ID NO:14中显示的CDRL2，和

(f)SEQ ID NO:15中显示的CDRL3。

2.权利要求1的单克隆抗体，其减少和/或阻断AXL介导的信号转导。

3.权利要求1的单克隆抗体，其减少和/或阻断AXL磷酸化。

4.权利要求1的单克隆抗体，其减少和/或阻断细胞增殖。

5.权利要求1的单克隆抗体，其减少和/或阻断血管生成。

6.权利要求1的单克隆抗体，其减少和/或阻断细胞迁移。

7.权利要求1的单克隆抗体，其减少和/或阻断肿瘤转移。

8.权利要求1的单克隆抗体，其减少和/或阻断AXL介导的抗细胞凋亡。

9.权利要求1的单克隆抗体，其减少和/或阻断AXL介导的PI3K信号转导。

10.权利要求1的单克隆抗体，其为重组抗体。

11.权利要求1的单克隆抗体，其为人源化抗体、嵌合抗体、多特异性抗体或抗体片段，所述抗体片段为Fab片段、Fab'片段、F(ab')₂片段或Fv片段。

12.权利要求11的单克隆抗体，其是嵌合抗体，并且包含选自SEQID NOs:38，39的重链氨基酸序列，和SEQ ID NO:37的轻链氨基酸序列。

13.权利要求11的单克隆抗体，其为人源化抗体，并且包含SEQ IDNO:44的重链氨基酸序列，和SEQ ID NO:43的轻链氨基酸序列。

14.权利要求1的单克隆抗体，其为Fab片段、Fab'片段、F(ab')片段、Fv片段、双价抗体或单链抗体分子。

15.权利要求1的单克隆抗体，其为IgG1、IgG2、IgG3或IgG4类型。

16.权利要求1的单克隆抗体，其偶联至标记基团。

17.权利要求1的单克隆抗体，其偶联至效应子基团。

18.权利要求1的单克隆抗体，其是支架蛋白。

19.权利要求1的单克隆抗体，其包含SEQ ID NO:8的重链氨基酸序列，和SEQ ID NO:7的轻链氨基酸序列。

20.一种分离的核酸分子，其选自：

编码权利要求1至19的任一项的单克隆抗体、其抗体片段或衍生物的核酸序列，其中所述抗体片段为Fab片段、Fab'片段、F(ab')₂片段或Fv片段，并且所述衍生物为单链抗体，纳米抗体或双价抗体。

21.包含权利要求20的核酸序列的载体。

22.权利要求21的载体，其是表达载体并且所述核酸序列有效地连接至控制序列。

23.包含权利要求21或22的载体的宿主，其是原核或真核细胞。

24.制备权利要求1至19的任一项的单克隆抗体的方法，其包括从权利要求23的宿主获得所述单克隆抗体的步骤。

25.一种药物组合物，其包含权利要求1至19的任一项的单克隆抗体、权利要求20的分离的核酸分子、权利要求21或22的载体、权利要求23的宿主或由权利要求24的方法产生的单克隆抗体。

26.权利要求25的药物组合物，其包含可药用的载体、稀释剂和/或佐剂。

27.权利要求25或26的药物组合物，其包含另外的活性剂。

28.权利要求25或26的药物组合物，其用于过度增殖性疾病的诊断、预防或治疗。

29.权利要求28的药物组合物，其中所述过度增殖性疾病与AXL表达和/或过度活跃相关。

30.权利要求29的药物组合物，其中所述过度增殖性疾病与AXL过表达和/或过度活跃相关。

31.权利要求28的药物组合物，其中所述过度增殖性疾病选自乳腺癌、肺癌和其他表达AXL的癌症以及肿瘤转移的形成。

32.权利要求31的药物组合物，其中所述表达AXL的癌症是过表达AXL的癌症。

33.权利要求1至19的任一项的单克隆抗体，其用于过度增殖性疾病的诊断、预防或治疗。

34.包括权利要求1至19的任一项的单克隆抗体、权利要求20的核酸序列或权利要求21或22的载体的试剂盒。

35.权利要求34的试剂盒，其还包括另外的抗肿瘤剂。