HK1180545B - 适用於脐带组织衍生干细胞的脐带组织冷冻保存 - Google Patents

Description

适用于脐带组织衍生干细胞的脐带组织冷冻保存

技术领域

本发明是关于干细胞，特别是关于脐带组织衍生干细胞。

本申请主张2011年9月1日提出申请的台湾专利申请第100131519号的优先权，该申请的整体内容在此以引用的方式并入本申请。

背景技术

前人已提出保存婴儿脐带血的潜在好处，现在，科学家则要进一步保存实际的脐带组织。此想法是要保存出生时的一段脐带与其内的所有细胞，并将脐带组织冷冻在低温储槽内以利长期保存。未来如果需要婴儿的细胞做为治疗之用，即可以当时最先进的技术处理脐带组织，进而撷取出细胞。

脐带(脐带组织)内的华通氏胶富含多能间质干细胞(MSC)，其于再生医学上具有巨大潜力。MSC可分化为骨骼、软骨、神经、脂肪、心脏、平滑肌、肝脏与皮肤细胞。

然而，无论就保存或后续的细胞培养而言，以上所述均属相当新颖的技术领域，尚须建立一套有效率的作业流程。

发明内容

在一个实施方式中，本发明是关于一种保存脐带的方法。该方法包括：获取一段脐带；将脐带切碎成脐带组织块，其中各脐带组织块的尺寸不大于2毫米(mm)；将脐带组织块与冷冻组合物混合以形成混合物，其中冷冻组合物包括冷冻保护剂与蛋白质；摇晃该混合物，且摇晃的时间不少于28分钟但亦不超过32分钟；然后冷冻保存该混合物。

在另一个实施方式中，本发明是关于一种保存脐带的方法，其包括：获取一段脐带；将脐带切碎成脐带组织块；将脐带组织块与冷冻组合物混合以形成混合物，其中冷冻组合物包括冷冻保护剂与蛋白质；摇晃该混合物，且摇晃的时间不少于20分钟但亦不超过40分钟；然后冷冻保存该混合物。

在另一个实施方式中，本发明是关于一种从一段脐带中获取脐带组织衍生干细胞的方法，其包括：获取一段脐带；将脐带切碎成脐带组织块；将脐带组织块与冷冻组合物混合以形成混合物，其中冷冻组合物包括冷冻保护剂与蛋白质；摇晃该混合物，且摇晃的时间不少于20分钟但亦不超过40分钟；冷冻保存该混合物；将该混合物解冻，并去除冷冻组合物；然后在培养介质中培养脐带组织块，以获得脐带衍生干细胞。

在另一个实施方式中，本发明是关于一种冷冻组合物，其包括：a)血清白蛋白或人类血清；与b)冷冻保护剂，其中组合物不含非人类动物衍生组分。

在另一个实施方式中，本发明是关于一种冷冻组合物，其包括30％至50％的人类脐带血血清或2.5％至25％的血清白蛋白；5.5％至55％的二甲基亚砜(DMSO)；与0.5％至5％的葡聚糖。

在参阅以下较佳实施例的说明及附图后，即可清楚了解上述与其它实施方式。本领域的技术人员可提出变化例与修正例而不脱离本案新颖概念的实质与范围。

附图显示本发明一个以上的实施例，图式的作用是与书面说明共同解释本发明的原理。在可能情况下，所有图式均以相同的参考标号表示同一实施例中相同或类似的组件。

附图说明

图1A至1E为显微照片，分别显示仅以酶处理而未经冷冻保存、冷冻保存前先以酶处理、未以酶处理也未经冷冻保存、冷冻保存后以酶处理，以及仅冷冻保存而未以酶处理的切碎脐带组织块衍生细胞。

图2A至2C显示荧光激活细胞分选法(Fluorescence Activated Cell Sortingor flow cytometry,FACS)或流动式细胞测量法的分析结果，其分析对象分别为冷冻保存前先以酶处理、冷冻保存后以酶处理，以及仅冷冻保存而未以酶处理的切碎脐带组织块衍生细胞。

图3显示衍生自切碎脐带组织块的细胞数量，其中切碎脐带组织块分别为未接受酶处理，及在冷冻保存之前或之后接受酶处理。

图4显示切碎脐带组织块衍生细胞未经过冷冻保存及经过冷冻保存之后的倍增时间。

图5为显微照片，分别显示切碎脐带组织块(左图)与滤液(右图)的细胞培养物。

图6A与6B分别显示衍生自切碎脐带组织块与非切碎脐带组织块的群落数量与细胞数量。

图7显示干细胞标记基因的RT-PCR分析结果。

图8A为显微照片，显示切碎脐带衍生干细胞与造血干细胞共同培养物中的鹅卵石构造。

图8B显示RT-PCR的分析结果，其分析对象为脐带组织衍生干细胞上与细胞增殖相关的信号途径。

图9A至9C为显微照片，分别显示从切碎脐带组织衍生干细胞分化而成的脂肪细胞、软骨细胞与血管内皮细胞。

图10A至10F显示细胞在接受血管生成诱导前(图10A至10C)、后(图10D至10F)的荧光激活细胞分选法(FACS)或流动式细胞测量法的分析结果。

图11显示干细胞群落形成单位的数量与脐带组织以冷冻保护剂溶液培养的时间长短的关系。

具体实施方式

定义

本申请说明书所使用的术语在本发明范围内及各术语的特定上下文中大致具有其相关领域中的通常涵义。本说明书中用以描述本发明的特定用语将在下文中或在本说明书的他处加以说明，以利业界人士了解本发明的相关叙述。为便于阅读，某些术语可能会以斜体及/或引号等格式加以凸显，但使用这些凸显格式并不影响术语的范围与意义。同一术语在相同上下文中的范围与意义皆相同，此与是否采用凸显格式无关。此外，同一件事的表示方法不止一种。因此，本文所讨论的术语均可以替代用语及同义词取代，且一术语是否在本文中经详细说明或讨论，并无任何特别意义。本文提供某些术语的同义词，但使用某一或多个同义词并不表示排除其它同义词。本说明书所提供的范例，包括此处所讨论的术语范例，仅供说明之用，而非用于局限本发明或任何例示术语的范围与意义。同样的，本发明并不限于本说明书所列举的各种实施例。

除非另有定义，否则本文中所有技术与科学术语的含义均与本领域技术人员所普遍了解者相同。若有相互冲突之处，则以本说明书及其所提供的定义为解释依据。

在本文中，「左右」、「约」或「大约」均指已知数值或范围的20％以内，较佳者为10％以内，更佳者则为5％以内。本文所列的数量为约略值，亦即纵使未明白写出「左右」、「约」或「大约」等词，仍带有该等用词的含义。

在本文中，「脐带组织块」与「切碎的脐带组织」两词可以互换。切碎的脐带组织块是指一块尺寸小于0.5厘米(cm)的脐带组织。在本文中，脐带组织块的尺寸不超过0.4厘米，或不超过0.3厘米，或不超过0.2厘米。脐带组织块的尺寸不超过0.2厘米是指该脐带组织块可通过筛孔大小为2毫米(mm)的细胞过滤器。

在本文中，「一段脐带组织」是指脐带的一部分，其长度为0.5厘米或超过0.5厘米。一段脐带组织可为0.5、1、2或3厘米，甚至超过3厘米。

「冷冻保存法」或「冷冻保存」均指同一方法，其中是将细胞或整个组织冷却至零度以下的低温，通常为77K或零下196℃(液态氮的沸点)，借以达到保存细胞或整个组织的目的。在此等低温下，任何生物活性，包括会导致细胞死亡的生化反应，皆能得到有效遏制。然而，若不使用冷冻保护剂溶液，则被保存的细胞往往会在接近低温或回暖至室温的过程中因冷冻而受损。

「冷冻」与「冷冻保存」两词可以互换。

「冷冻组合物」、「冷冻溶液」、「冷冻保存组合物」与「抗冻溶液」等词可以互换。

除非另有规定，否则「脐带组织衍生细胞」、「脐带组织块衍生细胞」、「脐带组织衍生干细胞」与「脐带组织衍生MSC」等词可以互换。

「倍增时间」是指尺寸或数值增加一倍所需的时间。

在一个实施方式中，本发明是关于一种保存脐带的方法。该方法包括：获取一段脐带；将脐带切碎成脐带组织块，其中各脐带组织块的尺寸不大于2毫米；将脐带组织块与冷冻组合物混合成混合物，其中冷冻组合物包括冷冻保护剂与蛋白质；摇晃该混合物，且摇晃的时间不少于28分钟但亦不超过32分钟；然后冷冻保存该混合物。

在另一个实施方式中，本发明是关于一种保存脐带的方法，其包括：获取一段脐带；将脐带切碎成脐带组织块；将脐带组织块与冷冻组合物混合成混合物，其中冷冻组合物包括冷冻保护剂与蛋白质；摇晃该混合物，且摇晃的时间不少于20分钟但亦不超过40分钟；然后冷冻保存该混合物。

在另一个实施方式中，本发明是关于一种从一段脐带中获取脐带组织衍生干细胞的方法，其包括：获取一段脐带；将脐带切碎成脐带组织块；将脐带组织块与冷冻组合物混合成混合物，其中冷冻组合物包括冷冻保护剂与蛋白质；摇晃该混合物，且摇晃的时间不少于20分钟但亦不超过40分钟；冷冻保存该混合物；将该混合物解冻，并去除冷冻组合物；然后在培养介质中培养该脐带组织块，以获得脐带衍生干细胞。

在本发明的一个实施例中，培养介质包括人类脐带血血清，或者，培养介质是由DMEM与人类脐带血血清组成。

在本发明的另一个实施例中，各脐带组织块的尺寸为2毫米或小于2毫米(亦即不超过2毫米)。

在本发明的另一个实施例中，上述方法包括持续摇晃所述混合物25至30分钟。

在本发明的另一个实施例中，摇晃步骤持续28至32分钟。所述摇晃步骤可持续30分钟。

在本发明的另一个实施例中，所述摇晃步骤是于低于15℃、或0℃与10℃之间，或不高于4℃的温度下进行。

在本发明的另一个实施例中，所述脐带组织块未经酶消化处理。

在本发明的另一个实施例中，所述脐带组织块在混合步骤前或在解冻步骤后接受酶消化处理。上述方法可进一步包括利用酶抑制剂抑制酶消化作用。

在另一个实施方式中，本发明是关于一种冷冻组合物，其包括：a)血清白蛋白或人类血清；与b)冷冻保护剂，其中该组合物不含非人类动物衍生组分。

在本发明的一个实施例中，冷冻保护剂是从二甲基亚砜(DMSO)、甘油、乙二醇与丙二醇中选出，且至少为其中之一。

在本发明的另一个实施例中，冷冻保存溶液包括DMEM或磷酸盐缓冲溶液，以及DMSO或甘油。

在本发明的另一个实施例中，冷冻保存溶液包括DMEM或磷酸盐缓冲溶液，以及DMSO或甘油，以及人类脐带血血清或胎牛血清。

在本发明的另一个实施例中，冷冻保存溶液包括DMEM或磷酸盐缓冲溶液，以及DMSO或甘油，以及血清白蛋白或血浆蛋白部分(PPF)。

或者，冷冻保存溶液是由DMEM、DMSO、葡聚糖，以及人类脐带血血清或血清白蛋白组成。

在本发明的另一个实施例中，蛋白质组分是从血清白蛋白、人类血清与血浆蛋白部分(PPF)中选出，且至少为其中之一。

在本发明的又一个实施例中，冷冻组合物不含非人类动物衍生组分与单糖。

而在另一个实施方式中，本发明是关于一种冷冻组合物，其包括30％至50％的人类脐带血血清或2.5％至25％的血清白蛋白；5.5％至55％的DMSO；与0.5％至5％的葡聚糖。

在本发明的一个实施例中，冷冻组合物包括40％的人类脐带血血清或2.5％至25％的血清白蛋白；5.5％至55％的DMSO；与0.5％至5％的葡聚糖。

实施例

以下仅为本发明实施例中的示范用设备、器材、方法及其相关结果，不应视为本发明的限制。请注意，各范例的标题或子标题仅为方便阅读之用，同样不应视为本发明的限制。此外，本文虽提出并披露若干理论，但只要本发明是依据其本身实施，而非依据特定理论或实行方案，则该等理论无论正确与否，均不应视为本发明的限制。

材料与方法

细胞培养介质

适合培养脐带衍生干细胞的市售介质包括但不限于RPMI、IMDM、DMEM、α-MEM、F12K、McCoy’s 5a与X-VIVO10。本发明的一个实施例是以DMEM(90％至70％)与人类血清(10％至30％)培养脐带衍生细胞。

在某些实施例中，先以市售介质培养诸如HUVEC、MS-5或人类基质细胞系等细胞，以便取得含有该等细胞所分泌的因子的培养介质。收集此含有该等细胞所分泌的因子的介质，并于稀释后或以未稀释的状态使用，借以取代市售介质做为细胞培养之用。

在另一些实施例中，市售介质含有诸如FBS、FCS等细胞培养添加剂；人类外周血血清；人类脐带血血清；富含血小板的血浆(PRP)；诸如IL-3、IL-6、TPO、FltL-3、SCF、EGF、TGF-β、bFGF等细胞生长因子；丙酮酸钠；葡萄糖；麸胺酰胺与/或HEPES。

或者，用以培养脐带衍生干细胞的市售介质同时含有细胞培养添加剂与上述由细胞所分泌的因子。

脐带处理

以酒精(70％至75％)与磷酸盐缓冲溶液清洁脐带。将脐带切成适当小段，然后以机械工具将脐带小段切碎成更小的脐带组织块。所有工具均经过消毒。

酶处理

为评估酶消化作用对脐带组织衍生细胞生长状况的影响，发明人进行以下试验。部分脐带组织块未经酶处理，部分脐带组织块则在冷冻保存之前或之后以酶处理30分钟。试验时是以胰蛋白酶或以胰蛋白酶与胶原酶的混合物进行酶消化。其它可用的酶包括但不限于蛋白酶、gelatase、透明质酸酶与其任意组合。消化作用在人类血清(脐带血血清或非脐带血血清)或胎牛血清等酶抑制剂的作用下停止。可用以取代血清的其它酶抑制剂包括但不限于胰蛋白酶抑制剂、含血清(人类或非人类动物血清)介质，或含有EDTA的缓冲溶液。细胞以缓冲溶液或培养介质进一步清洗数次，借以将酶去除，然后在培养介质中培养7天，每隔3至7天更换一次介质。

冷冻保存

经过酶消化处理或未经酶消化处理的脐带组织块先以磷酸盐缓冲溶液清洗，再与冷冻组合物混合，接着以旋转器(摇动器)在诸如4℃的低温下连续摇晃30分钟，然后以搭配机器人式液态氮冷冻保存与储存系统，将其储存在零下196℃左右的温度至少一星期，以确保其长期生存力。冷冻溶液含有缓冲溶液或细胞培养介质，以及冷冻保护剂。冷冻保存溶液可视需要含有来自人类的血清(如人类脐带血血清或人类血清)与来自人类的蛋白质，蛋白质可为但不限于血清白蛋白或血浆蛋白部分(PPF)。缓冲溶液可为磷酸盐缓冲溶液。细胞培养介质可为DMEM。冷冻保护剂可为二甲基亚砜(DMSO)、甘油、乙二醇或丙二醇。冷冻保存溶液可进一步包括蔗糖、海藻糖或葡聚糖。

为评估冷冻储存对于来自脐带组织的脐带衍生细胞的培养与生长有何种影响，上述脐带组织块解冻后便放置在含有介质的培养皿中，并在37℃与5％二氧化碳的培养器内进行培养。

细胞计数

脐带组织块在培养介质中培养7天，更换新介质后再培养8至14天。收集细胞后，计算细胞数量。细胞群体倍增时间是按照下列公式计算：倍增时间＝培养小时数/Log2(细胞扩增倍数)。

脐带组织衍生细胞与造血干细胞(HSC)的共同培养

造血干细胞可来自人类脐带血或外周血。使用FICOLL-PAQUE^TMPLUS(GE医疗集团)从人类脐带血中分离出单核细胞后，以磁场激活细胞分选法(MACS)进行CD34+造血干细胞的纯化与分离。另一方面，将脐带组织块衍生干细胞(即MSC)接种到6孔板，然后在培养器内以37℃与95％的湿度培养数天。以含有生长因子的新介质取代介质后，将脐带组织块衍生干细胞与CD34+造血干细胞(HSC)共同培养一星期。每隔2至3天更换一次介质或添加更多生长因子。生长因子包括但不限于干细胞因子(SCF)、血小板生成素(TPO)与Flt3-配位基(Flt3-Ligand)。最后以台盼蓝(Trypan blue,Invitrogen公司)与血球细胞计数器进行细胞计数。

反转录聚合酶链锁反应(RT-PCR)

RT-PCR技术是用于检查干细胞早期标记基因的表达，并侦测细胞增殖相关信号通路内的基因的表达。试验时是使用迷你套组(Qiagen公司)，并依制造商手册所规定的方式从脐带组织衍生细胞中提取出总RNA。

脂肪细胞分化

切碎脐带组织衍生细胞在DMEM/血清介质中生长至100％融合后，在不含血清的培养介质中培养48小时，然后在脂肪细胞诱导介质中再培养4周。脂肪细胞诱导介质含有DMEM、血清、抗生素(链霉素与青霉素)、异丁基甲基黄嘌呤、地塞米松(dexamethasone)、胰岛素与吲哚美辛。为判别脂肪细胞诱导的效果，分化后的细胞以油红O(Oil red O)染色。正脂肪细胞在光学显微镜下染成红色。

软骨分化

收集以上述方式在DMEM/血清介质中生长的切碎脐带组织衍生细胞，然后在软骨细胞分化介质中培养2至3周，每隔3天更换一次新的诱导分化介质。软骨细胞分化介质包含DMEM/血清、抗生素(链霉素与青霉素)、地塞米松、丙酮酸钠、转化生长因子-β3(TGF-β3)。在为期14天的软骨细胞诱导过程中，细胞分泌出一种细胞外基质，基质内含第二型胶原蛋白、蛋白聚糖与阴离子蛋白多糖。分化后的软骨组织经冷冻、切片，并以醋酸溶液冲洗，然后以阿尔辛蓝(Alcian blue)染色。样本切片再以核固红(Nuclear fast red)进行对比染色。干细胞分化成软骨细胞的特征在于出现阿尔辛染色区。强酸性硫酸盐黏液物质是染成蓝色，原子核是染成粉红色至红色，细胞质则染成淡粉红色。

血管生成分化

将细胞接种在涂有基质胶或胶原蛋白的板上，然后在内皮生长介质-2(EGM-2)中培养，以便分化为血管内皮细胞。

脐带组织块培养于冷冻溶液的时间长度

为找出最佳的冷冻溶液培养时间长度，脐带组织块与冷冻溶液混合后便在细胞培养器内以旋转器轻轻摇晃，但摇晃时间各不相同。简言之，试验时共采集3位捐赠者的脐带，每条脐带各取14厘米。脐带组织均匀切碎成小块(≤2毫米)后，分为7个均等的样本。在60分钟内，每隔10分钟从各样本中取样一次，陆续加入15毫升的离心管内与冷冻溶液混合，并以旋转器摇晃。60分钟结束时，以标准冷冻保存法同时冷冻保存所有7个样本。7个样本在冷冻保存3天后同时解冻，并去除冷冻溶液，接着将脐带组织块培养10天。培养10天后，计算来自各样本的群落形成单位数与脐带组织衍生干细胞数。

结果

脐带组织块衍生细胞为间质干细胞(MSC)。图1A至1D分别显示脐带组织块于培养第7天时在细胞培养物上的脐带组织衍生细胞。该等细胞为纺锤状，且增殖快速。在进行细胞培养以获得脐带组织衍生细胞前，各脐带组织块或仅接受酶消化处理(图1A)，或既接受酶消化处理也接受冷冻保存处理(图1B)，或为未接受酶处理也未接受冷冻保存处理的新脐带组织块(图1C)，或先接受冷冻保存处理再接受酶消化处理(图1D)，或仅接受冷冻保存处理(图1E)。结果显示，冷冻保存与/或酶处理并不影响脐带组织块衍生细胞的形状。

脐带组织衍生细胞的细胞类型是以FACS(荧光激活细胞分选法)或流动式细胞测量法加以评估。为分析细胞表面抗原，先收集脐带组织块衍生细胞，再以磷酸盐缓冲溶液冲洗，接着使细胞分别与抗体CD13、CD29、CD31、CD34、CD44、CD45、CD73、CD90、CD105、HLA-ABC、HLA-DR、7AAD或SSEA-4反应后，再与异硫氰酸荧光素(FITC)、藻红蛋白(PE)或藻红蛋白菁染料5(PE-Cy5)(BD生物科学公司)偶联。图2A至2C为细胞散点图。在进行脐带组织块植体培养前，细胞分别衍生自冷冻保存前(图2A)或后(图2B)接受酶消化处理、或仅接受冷冻保存处理而未经酶处理(图2C)的脐带组织块植体。每一点代表单一细胞，其位置则表示其前向散射(forwardscatter,FSC)强度值(细胞大小)与侧向散射(side scatter,SSC)强度值(细胞粒度)。前向散射与细胞直径大致成比例，而侧向散射则与细胞粒度成比例。结果显示，根据本发明的方法，以酶与冷冻保存法进行脐带组织块之前处理并不会对脐带组织块衍生细胞的纯度与属性造成影响。为分析细胞表面抗原，先收集脐带组织块衍生细胞，再以磷酸盐缓冲溶液冲洗，接着使细胞分别与抗体CD13、CD29、CD31、CD34、CD44、CD45、CD73、CD90、CD105、HLA-ABC、HLA-DR、7AAD或SSEA-4反应后，再与异硫氰酸荧光素(FITC)、藻红蛋白(PE)或藻红蛋白菁染料5(PE-Cy5)(BD生物科学公司)偶联。结果显示，无论细胞系衍生自冷冻保存前或后以酶处理的脐带组织块、或在冷冻保存前或后均未以酶处理的脐带组织块，细胞表面上所能辨别的抗原类型皆相同(相关数据恕未显示)。

发明人也评估脐带组织块冷冻保存前或后的酶处理对脐带组织衍生细胞数量的影响，试验数据是以相对细胞数(％)表示，其中100％是定义为先接受酶消化处理再冷冻保存的脐带组织块于解冻后所衍生出的细胞数量(如图3的“冷冻前酶处理”柱)。图3显示脐带组织块是否接受酶处理(如图3的“未经酶处理”柱)，或者脐带组织块是否在冷冻保存前或后以酶处理(如图3的“冷冻前酶处理”柱及“冷冻后酶处理”柱)的细胞数量。此外，以胰蛋白酶抑制剂取代血清做为停止酶消化作用的酶抑制剂也不致显著影响所收集的细胞数量(相关数据恕未显示)。在对照研究中，每一组实验仅使用一块脐带组织。

发明人亦评估冷冻保存对细胞倍增时间的影响，评估方法是比对脐带组织块在冷冻保存前(亦即在未接受冷冻保存处理的情况下)所衍生的细胞的倍增时间与脐带组织块冷冻保存一周后所衍生的细胞的倍增时间。结果显示，根据本发明，脐带组织块的冷冻保存对细胞倍增时间并无显著影响(图4)。因此，本发明的冷冻与储存过程并未对脐带组织块衍生MSC的产量造成不利影响。

发明人亦分析以血清白蛋白取代冷冻溶液中的血清是否会对脐带组织块衍生细胞的产量有所影响。结果显示，以血清白蛋白取代冷冻组合物中的血清时，细胞数量并无显著差异。此项发现的意义在于提供一种不含血清且可行的冷冻组合物。

图5的试验结果显示，组织培养板中所生长与增殖的细胞是从脐带组织块衍生而来，而非从脐带组织样本中的游离细胞衍生而来。脐带组织块与缓冲溶液混合后，是以网目大小为100微米的细胞滤器(Cell Strainer，BDFALCON^TM)过滤。通过网目的脐带组织块与缓冲溶液(即滤液或通过流体)分别在适用于脐带组织衍生细胞的培养介质中培养。结果显示，只有包含脐带组织块的培养出现细胞生长与迁移的现象，而仅含有滤液的培养皿则无。换言之，根据本发明，衍生自脐带组织块的细胞(亦即间质干细胞)并非来自四处游走的游离细胞，而是来自脐带组织内的干细胞。换言之，干细胞是由脐带组织块产生，并于培养条件下从组织植体向外迁移。

为评估切碎的动作是否对脐带组织衍生干细胞的生长有所影响，发明人将一段具有适当长度(约2厘米)且未切碎的脐带直接与冷冻溶液混合，然后以零下160℃冷冻保存5至7天，并于解冻后加以培养，期能长出脐带组织衍生细胞。为进行比对，另将一段同源脐带切碎，与冷冻溶液混合后再以相同条件冷冻保存，接着解冻与培养。两组试验均以显微镜观察细胞生长状况。结果显示，不论是否切碎脐带组织，两组试验皆生出细胞。

于培养第10天时计算细胞培养物上的细胞群落数量。如图6A所示，从切碎的脐带组织块所衍生的细胞群落数量是从未切碎的脐带组织部分所衍生的细胞群落数量的20.5倍。计算细胞群落数量时是以出现干细胞外移现象的脐带组织块数量为依据。换言之，出现干细胞外移现象的脐带组织块数量即为细胞群落的数量。如图6B所示，从切碎的脐带组织块所衍生的细胞的相对细胞数量是从未切碎的脐带组织部分所衍生的细胞的相对细胞数量的11.17倍。结果显示，将脐带组织切碎成小块会影响脐带组织所产出的干细胞数量。因此，结果显示，脐带组织依本发明的方式切碎并冷冻保存后所能产出的脐带组织衍生干细胞远多于未切碎的脐带组织于冷冻保存后所能产出的脐带组织衍生干细胞。此项发现具有重要临床意义，因为必须在短时间内提供足量的干细胞才能将细胞治疗的风险降到最低。

上述脐带组织衍生细胞均表达出BMP4、Oct4、REX1、SOX2与Nanog等多能干细胞标记。如图7所示的琼脂凝胶带为RT-PCR的DNA产物，显示该等干细胞标记在从切碎的脐带组织所衍生的细胞内的基因表达。结果显示，依本发明的方式从切碎的脐带组织所衍生的干细胞为多能的初期干细胞。

根据本发明，从切碎的脐带组织所衍生的干细胞可做为饲养细胞，以支持造血干细胞(HSC)的成长与增殖。脐带组织衍生细胞与HSC的共同培养物可形成一鹅卵石结构(图8A)，其中每一鹅卵石皆为一HSC细胞团，其在相位差显微镜中呈现灰暗的鹅卵石状。形成鹅卵石结构的原理如下：松散浮动在饲养细胞上的HSC为球形，因而具有折射性，而位于饲养细胞下方的HSC则为扁平状，故不具有折射性。结果显示，将造血干细胞与脐带组织块衍生干细胞一同培养可促进造血干细胞的增长。

发明人也在依本发明而取得的脐带组织衍生干细胞中侦测与细胞增殖相关的信号途径。侦测得到的信号如图8B所示，包括：IGF-2信号途径，如IGF-2与IGFBP5；FGF信号途径，如FGF-1与FGF-2；间隙连接信号途径，如Panx-1、Panx-2；EMT途径，如α-SMA、骨桥蛋白、CK18、Twist、BMP-4、TGF-β1；早期基因，如Oct4、Rex1、SOX2；其它基因，如血管生成素类-2(Angptl-2)、dlk；Wnt信号途径，如Wnt5a、SFRP1、Dkk3；表面标记，如CD13；以及黏着分子，如N型钙黏素(N-cadherin)、β-连锁蛋白(β-catenin)。

衍生自切碎脐带组织的细胞为多能干细胞，其具有形成脂肪、软骨以及血管生成与血管新生的能力。图9A显示在脂肪介质中经过4周培养后、由脐带组织衍生干细胞分化而成且经油红染色的脂肪细胞。在软骨介质中培养2至3周可诱导脐带组织衍生干细胞分化成软骨细胞，其以阿尔辛蓝染色后呈现阳性(图9B)。内皮生长介质-2(EGM-2)则可诱导脐带组织衍生干细胞分化成血管内皮细胞(图9C)，其中分化后的细胞变为长形且相互连结，最后形成毛细管状网络。

在此利用流动式细胞测量法侦测细胞的尺寸(直径)、粒度与表面抗原在血管生成诱导前、后的变化。图10A与10D显示细胞尺寸与粒度皆产生变化。此外，诱导分化细胞以抗VEGF-R1与抗VE-Cad抗体染色后呈现阳性(图10B、10C、10E与10F)，显示分化细胞具有血管内皮细胞的特征。

冷冻保存的脐带组织块，其产生脐带衍生干细胞的能力乃受到脐带组织于冷冻溶液中培养的时间长短的影响。图11显示群落形成单位(CFU)的数量与冷冻溶液培养时间的关系。各样本以冷冻溶液分别培养不同时间后，将各样本的CFU与培养30分钟的样本比较。实验中共使用3个捐赠者样本(n＝3)。P值≦0.05者以星号标示。长条显示平均值±SEM。结果显示，以冷冻溶液持续培养的适当时间为20至40分钟，最佳培养时间则为30分钟。仅以冷冻溶液培养0至20分钟的脐带组织块并未充分贴附于培养皿的底面。脐带组织块若能贴附于培养皿底面，将使MSC更容易贴附在培养皿的底面以利增长。以冷冻溶液培养40至60分钟的脐带组织块，其脐带组织块衍生MSC的产量并不稳定，原因在于多次反复实验中的细胞数量差异颇大(相关数据恕未显示)。

以上为本发明的实施范例，其作用仅在于说明，而非穷尽本发明的所有可能型态，且本发明的实施方式并不限于上述型态。依据以上教导，当可实现本发明的多种修改及变化。

以上实施例与范例的选择与描述，是为解释本发明的原理及其实际应用，使本领技术人员得以利用本发明及各种实施例，或依实际需要而以不同方式修改。本领技术人员可在不偏离本案实质与范围的情况下，容易想到多种替代实施例。因此，本发明的范围取决于后附申请权利要求范围，而非由以上叙述及其中所描述的实施范例加以定义。

在本发明的上述说明中曾引用若干参考文献，包括专利、专利申请案及多种出版物。之所以引用及/或讨论该些参考文献乃为阐明本发明的内容，而非承认该些参考文献为本发明的「背景技术」。本专利说明书所引用与讨论的所有参考文献，在此以引用的方式将其全文并入本文，且其并入的程度一如各参考文献是分别以引用的方式并入本文。

Claims (8)

1.一种保存脐带组织的方法，包括下列步骤：

获取一段脐带；

将脐带切碎成脐带组织块，其中各脐带组织块的尺寸为2毫米或小于2毫米；

将该脐带组织块与冷冻组合物混合，以形成混合物，其中冷冻组合物包括：

(a)30％至50％的人类脐带血血清或2.5％至25％的血清白蛋白；

(b)5.5％至55％的二甲基亚砜；以及

(c)0.5％至5％的葡聚糖；

摇晃该混合物，所述摇晃步骤是于低于15℃的温度下进行，且摇晃的时间不少于20分钟但亦不超过40分钟；以及

冷冻保存该混合物,

其中所述脐带组织块在混合步骤前接受酶消化处理。

2.如权利要求1所述的方法，包括摇晃所述混合物25至35分钟。

3.如权利要求1所述的方法，其中摇晃步骤是在介于0℃与10℃之间的温度下实施。

4.如权利要求1所述的方法，其中摇晃步骤是在不超过4℃的温度下实施。

5.如权利要求1所述的方法，其中摇晃步骤实施28至32分钟。

6.一种从一段脐带中获取脐带组织衍生干细胞的方法，其包括下列步骤：

获取一段脐带；

将脐带切碎成脐带组织块，其中各脐带组织块的尺寸为2毫米或小于2毫米；

将该脐带组织块与冷冻组合物混合，以形成混合物，其中冷冻组合物包括：

(a)30％至50％的人类脐带血血清或2.5％至25％的血清白蛋白；

(b)5.5％至55％的二甲基亚砜；以及

(c)0.5％至5％的葡聚糖；

摇晃该混合物，所述摇晃步骤是于低于15℃的温度下进行，且摇晃的时间不少于20分钟但亦不超过40分钟；

冷冻保存该混合物；

使该混合物解冻，并去除冷冻组合物；以及

在培养介质中培养该脐带组织块，以获得脐带组织衍生干细胞,

其中所述脐带组织块在混合步骤前接受酶消化处理。

7.如权利要求6所述的方法，包括摇晃该混合物25至35分钟。

8.一种从一段脐带中获取脐带组织衍生干细胞的方法，其包括下列步骤：

获取一段脐带；

将脐带切碎成脐带组织块，其中各脐带组织块的尺寸为2毫米或小于2毫米；

将该脐带组织块与冷冻组合物混合，以形成混合物，其中冷冻组合物包括：

(a)30％至50％的人类脐带血血清或2.5％至25％的血清白蛋白；

(b)5.5％至55％的二甲基亚砜；以及

(c)0.5％至5％的葡聚糖；

摇晃该混合物，所述摇晃步骤是于低于15℃的温度下进行，且摇晃的时间不少于20分钟但亦不超过40分钟；

冷冻保存该混合物；

使该混合物解冻，并去除冷冻组合物；以及

在培养介质中培养该脐带组织块，以获得脐带组织衍生干细胞，其中所述脐带组织块未经酶消化处理。